MX2014005128A

MX2014005128A - Una formulacion enzimatica liquida y un proceso para su preparacion.

Info

Publication number: MX2014005128A
Application number: MX2014005128A
Authority: MX
Inventors: Päivi Myllärinen; Kirsi Rajakari; Kai Hotakainen
Original assignee: Valio Ltd
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2014-07-09
Also published as: CN108676782A; IL232356A0; RU2014121318A; ES2697675T3; FI20116074L; BR112014010222A2; EP2773753B1; JP2014532421A; KR20140096090A; RU2668396C2; WO2013064736A1; FI126442B; CL2014001100A1; IN2014MN00968A; KR101998182B1; JP6297979B2; US20140287098A1; PL2773753T3; BR112014010222A8; AU2012331034A1

Abstract

El presente invento se refiere a una formulación enzimática líquida, en particular a una formulación líquida y estable que comprende una enzima para el entrecruzamiento y/o una enzima modificadora de proteínas de origen lácteo. En particular el presente invento se refiere a una formulación de transglutaminasa líquida y estable. Además, el presente invento se refiere a un método para preparar una formulación de enzima líquida.

Description

UNA FORMULACION ENZIMÁTICA LÍQUIDA Y UN PROCESO PARA SU PREPARACION DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN El presente invento se refiere a una formulación enzimática liquida, en particular a una formulación liquida y estable que comprende una enzima para el entrecruzamiento o reticulado y/o una enzima modificadora de proteínas de origen lácteo. En particular, el presente invento se refiere a una formulación de transglutaminasa líquida y estable. Además, el presente invento se refiere a un método para preparar una formulación enzimática líquida.

Las formulaciones enzimáticas que comprenden una enzima para el entrecruzamiento o reticulado y una enzima modificadora de proteínas lácteas, tales como lacasa, tirosinasa, peroxidasa, sulfhidrilo oxidasa o glucosa oxidasa están disponibles en el comercio, tanto en polvo como en formulaciones líquidas. Sin embargo, los productos de transglutaminasa y proteína glutaminasa están disponibles actualmente en el comercio sólo en forma de polvo. El uso de un producto enzimático en polvo no tiene aceptación general debido a la formación de polvo en todas las plantas de producción. Los riesgos sanitarios resultantes del desempolvado preocupan especialmente a los traba adores.

En la Patente Europea N° 0 379 606 Bl se ha divulgado una transglutaminasa derivada de la cepa Streptoverticillium mobaraense y un proceso para su preparación. Además, en la Patente Europea N° 0 777 726 Bl se ha divulgado un método para la producción de una transglutaminasa usando un gen aislado de la cepa Stremtomyces lydicus.

Uno de los problemas asociados a la formulación de una enzima, tal como una transglutaminasa, en forma liquida, es la falta de estabilidad de la formulación. Además, una de las desventajas asociadas con las formulaciones enzimáticas liquidas actuales es que contienen por lo menos un conservante .

LA INVENCIÓN Un objeto del presente invento es, por consiguiente, proporcionar una formulación enzimática liquida que comprenda transglutaminasa y/u otra enzima para el entrecruzamiento o modificación de proteínas lácteas tales como lacasa, peroxidasa, sulfhidrilo oxidasa, glucosa oxidasa o proteina glutaminasa, que sea estable y pueda ser almacenada durante un período requerido por una formulación comercial a temperatura ambiente o a temperaturas de un refrigerador y/o congelador. - Otro objeto del presente invento es proporcionar una formulación líquida que comprende una transglutaminasa que sea estable y puede ser almacenada durante un período requerido por una formulación comercial a temperatura ambiente o a temperaturas de un refrigerador y/o congelador.

Otro objeto más del presente invento es proporcionar un método para la preparación de una formulación enzimática líquida estable, que comprende transglutaminasa y/u otra enzima para el entrecruzamiento o modificación de proteínas lácteas Un objeto más aún, del presente invento es proporcionar un método para la preparación de una formulación enzimática líquida estable que comprende una transglutaminasa .

Los objetos del invento se logran mediante las formulaciones y métodos expuestos en las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas del invento se describen en las reivindicaciones dependientes.

Otros objetos, detalles y ventajas del presente invento serán evidentes de la descripción detallada y ej emplos que siguen.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO Las enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas de origen lácteo tales como transglutaminasa, lacasa, tirosinasa, peroxidasa, sulfhidrilo oxidasa y proteína glutaminasa catalizan modificaciones de proteínas lácteas. Parece existir sinergia en la acción de estas enzimas y adicionalmente, con la acción de glucosa oxidasa. Sin sentirse restringido por ninguna teoría en particular, glucosa oxidasa y/o peroxidasa parecen catalizar reacciones donde el oxígeno es liberado a través de la formación de peróxido de hidrógeno. El oxigeno puede catalizar entonces (oxidar) el entrecruzamiento de tirosinasa .

Las enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas tales como transglutaminasa, lacasa, tirosinasa, peroxidasa, sulfhidrilo oxidasa y proteína glutaminasa, opcionalmente junto con glucosa oxidasa, se usan en la elaboración de productos procesados de pescado, carne y huevos, pastas y patés, frutas, bayas y hortalizas, productos de soya, productos de cereales, productos de pan y pastelería.

Las enzimas para entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas que siguen, son todas relevantes en el procesamiento de categorías de lechería u otros alimentos.

Las transglutaminasas son una familia de enzimas (EC 2.3.2.13) que catalizan la generación de enlaces covalentes entre residuos de aminoácidos de lisina y glutamina presentes en las moléculas proteicas. Cuando se forman enlaces, se libera amoníaco.

Las lacasas (EC 1.10.3.2) derivadas de hongos y bacterias tales como el hongo Trametes hirsute, catalizan el entrecruzamiento entre carbohidratos y proteínas (oxidación de compuestos aromáticos y cisteína) con aplicaciones en el procesamiento de alimentos para la reducción de alergenicidad, por ejemplo.

Las tirosinasas (EC 1.14.18.1) son enzimas que catalizan la oxidación de fenoles tales como tirosina, con aplicaciones en el procesamiento de alimentos para disminuir la alergenicidad, por ejemplo.

Las peroxidasas (EC 1.11.1.7) son una familia de enzimas que catalizan la oxidación de compuestos aromáticos con aplicaciones en el procesamiento de alimentos para disminuir la alergenicidad, por ejemplo.

Sulfhidrilo oxidasa (EC 1.8.3.3) cataliza la formación de enlaces disulfuro, oxidación de glutatión.

Proteina glutaminasa cataliza la desamidación de glutamina enlazada a proteína, y la glutamina es convertida en ácido glutámico.

Glucosa oxidasa cataliza la formación de enlaces entrecruzados y gelificación oxidativa de pentosanos.

Las enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas tales como transglutaminasa, lacasa, tirosinasa, peroxidasa, sulfhidrilo oxidasa y proteína glutaminasa se usan en la industria lechera para estabilizar la estructura de los productos a base de leche. Además de la industria lechera, estas enzimas se usan en la elaboración de productos procesados de pescado, carne y huevos, pastas y patés, frutas, bayas y hortalizas, productos de soya, productos de cereales, productos de pan y pastelería, por ejemplo. En consecuencia, el uso de una preparación enzimática líquida es apropiado para la elaboración de productos de lechería, pescado procesado, carne, huevos, pastas y patés, frutas y bayas y hortalizas, soya, cereal, pan y productos de pastelería, por ejemplo. El uso de una preparación enzimática líquida sería más práctico y conveniente que el uso de formulación en polvo, especialmente en la elaboración a escala industrial.

Las transglutaminasas tienen una actividad máxima en un margen de pH de 5.2 a 8. Cuando se almacena transaminasa licuada con un pH de 5.2 o un pH de 8, la enzima pierde rápidamente su actividad. Después de almacenar una transglutaminasa con un valor de pH 5.2 durante 7 días a temperatura ambiente a la temperatura de un refrigerador, sólo queda la mitad de la actividad.

El invento se basa en el descubrimiento de que cuando una transglutaminasa, tirosinasa o proteína glutaminasa es almacenada en una suspensión de un poliol, tal como glicerol o sorbitol, y agua en un margen de pH de 4.4 a 5.1, su actividad sigue siendo moderada durante el almacenamiento a temperatura ambiente y excelente durante el almacenamiento a las temperaturas de un refrigerador y/o congelador. Además, el invento se basa en el descubrimiento de que cuando una transglutaminasa junto con una proteína glutaminasa fue almacenada en una suspensión de glicerol y agua con un pH de 4.6, la actividad de las enzimas siguió siendo moderada durante el almacenamiento a temperatura ambiente y excelente durante el almacenamiento a las temperaturas de un refrigerador y/o congelador. Además, el invento se basa en el descubrimiento de que cuando una transglutaminasa con una proteina glutaminasa y tirosinasa fue almacenada en una suspensión de glicerol y agua con un pH de 4.6, la actividad de las enzimas siguió siendo moderada durante el almacenamiento a temperatura ambiente y excelente durante el almacenamiento a las temperaturas de un refrigerador y/o congelador. Además, las preparaciones liquidas del presente invento son también microbiológicamente estables durante el almacenamiento a temperatura ambiente y a las temperaturas de un refrigerador y/o congelador. Además se descubrió inesperadamente que la formulación de enzima liquida del presente invento mantenía su actividad enzimática y pureza microbiológica (sin desarrollo microbiano) sin conservantes en la formulación a las temperaturas de un refrigerador y/o congelador.

En una realización, la formulación de enzima líquida en suspensión de poliol-agua tiene un valor de pH en el margen de 4.4 a 5.1. En otra realización del presente invento, el pH de la formulación enzimática está dentro del margen de 4.4 a 4.8. En una realización del presente invento, el pH de la formulación enzimática es 4.4. En otra realización del presente invento, el pH de la formulación enzimática es 4.6. En otra realización más del presente invento, el pH de la formulación enzimática es 4.8. En otra realización más aún, del presente invento, el pH de la formulación enzimática es 5.1.

En la formulación enzimática liquida del presente invento se pueden usar polioles, tales como glicerol, sorbitol xilitol y/o manitol . Las mezclas de polioles, tales como mezclas de glicerol y los otros polioles son también factibles .

La suspensión de un poliol y agua o una mezcla de dos o más polioles y agua apropiados para formular la preparación enzimática del presente invento puede contener el (los) poliol (es), tales como glicerol, sorbitol, xilitol, y/o manitol desde 25% hasta 100%, de preferencia de 50% hasta 100% (p/p%). En una realización del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 25% poliol/75% agua (p/p) . En otra realización del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 50% de poliol/50% de agua (p/p) . En otra realización más del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 75% de poliol/25% agua (p/p) .

La suspensión de glicerol y agua apropiada para formular la preparación de enzima del presente invento puede contener glicerol desde 25% hasta 100%, de preferencia desde 50% hasta 100%. En una realización del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 25% de glicerol/75% agua. En otra realización del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 50% de glicerol/50% agua. En otra realización más del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 75% de glicerol/25% de agua. Además, la suspensión de sorbitol y agua apropiada para formular la preparación de enzimas del presente invento puede contener sorbitol desde 25% hasta 100%, de preferencia desde 50% hasta 100%. En una realización del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 25% de sorbitol/75% agua. En otra realización del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 50% de sorbitol/50% de agua (p/p) · En otra realización más del presente invento, la enzima es disuelta en una suspensión de 75% de sorbitol/25% agua.

Se puede ajustar el pH de la suspensión al limite deseado empleando un ácido aprobado para el consumo humano, tal como, ácido láctico, GDL (gluconodeltalactona) , ácido cítrico, ácido acético, ácido oxálico, ácido málico, ácido pantoténico, ácido propiónico y/o ácido clorhídrico, o cualesquier mezclas /combinaciones de los mismos en la forma de ácido o sal. En una realización del presente invento, se usa ácido láctico para ajustar el pH.

La preparación enzimática líquida del presente invento puede contener también un conservante tal como Na-benzoato. En una realización, la preparación enzimática líquida del presente invento no contiene ningún conservante adicional, es decir, la formulación carece de conservantes. En otra realización, la preparación enzimática líquida del presente invento contiene un conservante adicional. En otra realización, la preparación enzimática liquida del presente invento contiene a-benzoato como conservante. En otra realización más aún. La preparación enzimática liquida del presente invento contiene Na-benzoato en una cantidad de 0.1 a 1%, de preferencia en una cantidad de 0.7% como conservante .

La preparación enzimática liquida del presente invento mantiene su actividad a temperatura ambiente durante alrededor de dos semanas, en un refrigerador desde alrededor de 1.5 a seis meses, por lo menos, y en congelador desde un mínimo de 5 meses hasta 24 meses.

En una realización del invento, la formulación líquida comprende una enzima para el entrecruzamiento y/o una enzima modificadora de proteínas lácteas. En otra realización del invento la formulación líquida comprende dos o más enzimas para el entrecruzamiento y/o enzimas modificadoras de proteínas lácteas. En una realización, la enzima para el entrecruzamiento y/o la enzima modificadora de proteínas lácteas en la formulación del presente invento es transglutaminasa . En otra realización, la enzima para el entrecruzamiento y/o la enzima modificadora de proteínas lácteas en la formulación del presente invento es tirosinasa. En otra realización, la enzima para el entrecruzamiento y/o la enzima modificadora de proteínas lácteas en la formulación del presente invento es proteína glutaminasa. En otra realización, las enzimas para el entrecruzamiento y/o enzimas modificadoras de proteínas lácteas en la formulación del presente invento son transglutaminasa y proteína glutaminasa. En otra realización, las enzimas para el entrecruzamiento y/o enzimas modificadoras de proteínas lácteas en la formulación del presente invento son transglutaminasa y tirosinasa. En otra realización, las enzimas para el entrecruzamiento y/o enzimas modificadoras de proteínas lácteas en la formulación del presente invento son transglutaminasa y lacasa. En otra realización más, las enzimas para el entrecruzamiento y/o enzimas modificadoras de proteínas lácteas en la formulación del presente invento son transglutaminasa, proteína glutaminasa y lacasa. En otra realización más aún, las enzimas para el entrecruzamiento y/o enzimas modificadoras de proteínas lácteas en la formulación del presente invento son transglutaminasa, proteína glutaminasa y tirosinasa.

El presente invento se refiere también a un método para preparar una formulación enzimática líguida donde se agrega una enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas a una suspensión de poliol-agua con un valor de pH en el margen de 4.4 a 5.1. En una realización del presente invento, el pH de la suspensión de poliol-agua es ajustado a un valor dentro del margen de 4.4 a 5.1. En una realización del presente invento, el pH de la suspensión de poliol-agua es ajustado a un valor en el margen de 4.4 a 4.8. En una realización del presente invento, el pH de la suspensión de poliol-agua es ajustado a un pH de 4.4. En otra realización del presente invento, el pH de la suspensión de poliol-agua es ajustado a un valor de pH de 4.6. En otra realización más del presente invento, el pH de la suspensión de poliol-agua es ajustado a un valor de pH de 4.8. En otra realización más del presente invento, el pH de la formulación enzimática es ajustado a pH 5.1.

La suspensión de poliol y agua apropiada para el método del presente invento puede contener poliol desde 25% hasta 100% (p/%) . En una realización del presente invento la enzima es disuelta en una suspensión de 25% de poliol-agua. En otra realización del presente invento la enzima es disuelta en una suspensión de 50% de poliol-agua. En una realización adicional del presente invento la enzima es disuelta en una suspensión de 75% de poliol-agua. En una realización del invento el poliol es glicerol. En otra realización del invento, el poliol es sorbitol.

En el método presente, el pH de la suspensión puede ser ajustado al limite deseado con un ácido aprobado para el consumo humano ( (para uso alimentario, GRAS (por sus ¦ siglas en inglés, Generally Recognized As Safe) , tal como ácido láctico, GDL, ácido cítrico, ácido acético, ácido oxálico, ácido málico, ácido pantoténico, ácido propiónico y/o ácido clorhídrico o cualesquier mezclas o combinaciones de los mismos en forma de ácido o sal. En una realización, en el método del presente invento se usa ácido láctico para el ajuste del pH.

En el método del presente invento, puede incluirse también opcionalmente un conservante tal como Na-benzoato en la formulación enzimática liquida. En una realización, el método del presente invento no incluye la adición de un conservante. En otra realización comprende la adición de un conservante. En otra realización más, el método del presente invento comprende la adición de Na-benzoato como conservante. En otra realización más aún, el método del presente invento comprende la adición de Na-benzoato, en una cantidad de 0.1 a 1%, de preferencia en una cantidad de 0.7% como conservante.

En una realización, el método del presente invento comprende los pasos siguientes: a) se ajusta el pH de una suspensión poliol-agua con ácido (s) apto(s) para el consumo humano a un valor dentro de escala de 4.4 a 5.1; b) se agrega a la suspensión una enzima para el entrecruzamiento y/o una enzima modificadora de proteínas lácteas ; c) se agrega opcionalmente un conservante.

En otra realización, el método del presente invento comprende los pasos siguientes: a) se agrega una enzima para el entrecruzamiento y/o una enzima modificadora de proteínas lácteas a una suspensión de poliol-agua; b) se ajusta el pH de la suspensión con ácido (s) apto(s) para el consumo humano a un valor de pH en la escala de 4.4 a 5.1; c) se agrega opcionalmente un conservante.

En una realización del presente invento, se agrega a la suspensión una enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas. En otra realización del presente invento, se agregan a la suspensión dos o más enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas. En una realización, la enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas es transglutaminasa . En otra realización, la enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas es tirosinasa. En otra realización, la enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas es proteína glutaminasa En otra realización, las enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas son transglutaminasa y proteína glutaminasa. En otra realización, las enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas son transglutaminasa y tirosinasa. En otra realización, las enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas son transglutaminasa y lacasa. En otra realización más, las enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas son transglutaminasa, proteína glutaminasa y lacasa. En otra realización más aún, las enzimas para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas son transglutaminasa, proteína glutaminasa y tirosinasa.

El invento será descrito con mayor detalle mediante los ejemplos siguientes. Los ejemplos no deben ser considerados en modo alguno como limitantes de las reivindicaciones .

EJEMPLOS EJEMPLO COMPARATIVO 1 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en suspensión de glicerol-agua con un pH de 5.2 a 4°C La transglutaminasa derivada de la cepa Streptoverticillíum mobaraense con una actividad de 16.300 nanokatal/g (Activa@ TG, Ajinomoto), fue disuelta en actividad de 274 nanokatal/g en una suspensión de 50% glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado a 5,2 con ácido láctico. La actividad enzimática fue monitoreada durante 7 días. La pureza microbiológica de la preparación fue monitoreada adicionalmente .

El día 7, sólo restaba el 50% de la actividad de la transglutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 7 días.

EJEMPLO COMPARATIVO 2 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en agua con un valor de pH de 5.2 a 4°C La transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) fue disuelta en actividad de 274 nanokatal/g en agua con un valor de pH de 5.2 ajustado con ácido láctico. La suspensión contenia también 01% Na-benzoato como conservante .

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 días. La pureza microbiológica de la preparación fue monitoreada adicionalmente .

El día 50, sólo restaba 43% de la actividad de la transglutaminasa . No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 días.

EJEMPLO 1 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) : en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.6 a 4°C La transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) fue disuelta en actividad de 274 nanokatal/g en una suspensión de 50% glicerol-agua (p/p) con un valor de pH 4.6 ajustado con ácido láctico.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 7 días La pureza microbiológica de la preparación fue monitoreada adicionalmente.

El día 7 restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de siete días.

EJEMPLO 2 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.6 a 4 ° C La transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) fue disuelta en actividad de 326 nanokatal/g en una suspensión de 50% glicerol-agua (p/p) con un valor de pH de 4,6 ajustado con ácido láctico La suspensión contenia también 0.7% Na-benzoato como conservante.

El día 50 restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 días.

EJEMPLO 3 Preparación de transglutaminasa Activa® TG-YG (Ajinomoto) en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.6 a 4°C La formulación de transglutaminasa liquida fue preparada disolviendo una preparación de transglutaminasa Activa® TG-YG (Ajinomoto), que contenia una transglutaminasa derivada de la cepa de Streptoverticillium mobaraense y glutationa en una suspensión de 50% glicerol-agua (p/p) con un pH de 4,6 ajustado con ácido láctico.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 días La pureza microbiológica de la preparación fue monitoreada adicionalmente.

El día 50, restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa . No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 dias .

EJEMPLO 4 Preparación de transglutaminasa Activa TG (Ajinomoto) en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.4 a 4°C La preparación de transglutaminasa liquida fue preparada disolviendo transglutaminasa Artiva® TG (Ajinomoto) en actividad de 274 nanokatal/g en una suspensión de 50% glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 4.4.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 dias. La pureza microbiológica de la preparación fue monitoreada adicionalmente .

El dia 50 restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 dias.

EJEMPLO 5 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.8 a 4°C La preparación de transglutaminasa líquida fue preparada disolviendo transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en actividad de 274 nanokatal/g en una suspensión de 50% glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a un valor de pH de 4.8.

El día 50 restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 dias.

EJEMPLO 6 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 5.1 a 4°C La preparación de transglutaminasa liquida fue preparada disolviendo transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en actividad de 274 nanokatal/g en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 5.1 a 4°C.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 dias. La pureza microbiológica de la preparación fue monitoreada adicionalmente.

El día 50, restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa. .No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 dias.

EJEMPLO 7 Preparación de transglutaminasa Saprona TG (Yiming Biological Products Co, China) en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.6 a 4°C La preparación de transglutaminasa liquida fue preparada disolviendo transglutaminasa Yiming Saprona TG derivada de la cepa Streptoverticillium mobaraense en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 4.6.

El día 50, restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 días.

EJEMPLO 8 Preparación de transglutaminasa Reactyn CL 1000 TG (Campus SpA, Italia) en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.6 a 4 °C La preparación de transglutaminasa liquida fue preparada disolviendo transglutaminasa Campus Reactyn CL 1000 TG en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 4.6 La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 días La pureza microbiológica de - la preparación fue monitoreada adicionalmente.

El día 50, restaba 100% de la actividad de transglutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 días.

EJEMPLO 9 Preparación de transglutaminasa TG-PG (Ajinomoto) en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.6 a 4°C La preparación liquida fue preparada disolviendo en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p) con un pH de 4.6 ajustado con ácido láctico, una preparación de enzima TG—PG (Ajinomoto) . La preparación TG—PG (Ajinomoto) contiene una transglutaminasa derivada de la cepa de Streptoverticillium mobaraense y una proteina glutaminasa derivada de Chryseobacterium proteolyticum.

La actividad de transglutaminasa de la preparación liquida fue 100 U/g y la actividad de la proteina glutaminasa de la preparación liquida fue 100 U/g.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 días Adicionalmente, se monitoreó la pureza microbiológica de la preparación.

El dia 50, restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa y 100% de la actividad de proteina glutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 días.

EJEMPLO 10 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en una suspensión de 75% glicerol/25% agua con un valor de pH de 4.6 a 4 °C La transglutaminasa Activa© TG (Ajinomoto) fue disuelta en actividad de 326 nanokatal/g en una suspensión de 75% glicerol/25% agua (p/p) con un valor de pH de 4.6 ajustado con ácido láctico.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 días a la temperatura de 4°C. La pureza microbiológica de la preparación fue monitoreada adicionalmente.

El día 50 restaba 100% de la actividad de la transglutaminasa . No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación.

EJEMPLO 11 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en una suspensión de 25% glicerol/75% agua con un valor de pH de 4.6 a 4°C La transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) fue disuelta en actividad de 326 nanokatal/g en una suspensión de 25% glicerol-75% agua (p/p) con un valor de pH de 4.6 ajustado con ácido láctico.

El día 50, restaba 72% de la actividad de transglutaminasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación.

EJEMPLO 12 Preparación de transglutaminasa Activa TG (Ajinomoto) en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4,4 - 4.48 a 22 °C Las preparaciones de transglutaminasa liquida fueron preparadas disolviendo transglutaminasa Activa®' TG (Ajinomoto) en actividad de 2789 nanokatal/g en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a un valor de pH 4.4 - 4.8.

La actividad enzimática de las preparaciones fue monitoreada durante 13 semanas a la temperatura de 22 °C. Adicionalmente, se monitoreó la pureza microbiologica de las preparaciones .

Después de dos semanas de almacenamiento, comenzó a disminuir la actividad de la enzima en las preparaciones. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación .

EJEMPLO 13 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en suspensiones de glicerol-agua con valores de pH de 4.4 - 4.8 a 4°C Las preparaciones de transglutaminasa liquida fueron preparadas por disolución de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en actividad de 2789 nanokatal/g en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 4.4 - 4.8.

La actividad enzimática de las preparaciones fue monitoreada durante 26 semanas a la temperatura de 4°C. Adicionalmente, se monitoreó la pureza microbiologica de las preparaciones .

Después de 26 semanas de almacenamiento, quedó 89% de la actividad de la enzima. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación.

EJEMPLO 14 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) : suspensiones de glicerol/agua con un valor de pH de 4.4 - 4.8 a 20° C Las preparaciones de transglutaminasa liquida fueron preparadas por disolución de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en actividad de 2789 nanokatal/g en suspensión de 50% glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 4.4 - 4.8.

La actividad enzimática de las preparaciones fue monitoreada durante 26 semanas a la temperatura de -20 °C Adicionalmente se monitoreó la pureza microbiologica de las preparaciones .

Después de 26 semanas de almacenamiento, quedó 97% de la actividad de la enzima. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación.

EJEMPLO 15 Preparación de tirosinasa en una suspensión de glicerol-agua con un pH de 4.6 a 4°C La enzima tirosinasa fue disuelta en actividad de 100 U/g en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 4.6.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 días. Adicionalmente, se monitoreó la pureza raicrobiológica de la preparación.

Después de 50 días de almacenamiento, quedó 97% de la actividad de la tirosinasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 días.

EJEMPLO 16 Preparación de proteina glutaminasa en una suspensión de glicerol-agua con un pH de 4.6 a 4°C La proteína glutaminasa fue disuelta en actividad de 100 U/g en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p-) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 4.6.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 días. La pureza microbiológica de la preparación fue monitoreada adicionalmente.

Después de 50 días de almacenamiento, quedó 96% de la actividad de la proteína glutaminasa líquida. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación .

EJEMPLO 17 Preparación de transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en suspensión de sorbitol-agua con un pH de 4.6 a 4°C La preparación de transglutaminasa líquida fue preparada disolviendo transglutaminasa Activa® TG (Ajinomoto) en actividad de 274 nanokatal/g en una suspensión de 50% de sorbitol-agua (p/p) cuyo pH fue ajustado con ácido láctico a pH 4.6.

La actividad enzimática fue monitoreada durante 50 días. Adicionalmente, se monitoreó la pureza microbiana de la preparación.

El día 50, quedó 100% de la actividad de la transglutaminasa . No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación de 50 días.

EJEMPLO 18 Preparación enzimática liquida con TG-PG (Ajinomoto) y tirosinasa en una suspensión de glicerol-agua con un valor de pH de 4.6 a 4 °C La preparación líquida fue preparada disolviendo en una suspensión de 50% de glicerol-agua (p/p) con un valor de pH 4.6 ajustado con ácido láctico, una preparación enzimática TG-PG (Ajinomoto) y tirosinasa. La actividad de transglutaminasa de la preparación líquida fue 100 U/g, la actividad de la proteína glutaminasa de la preparación líquida fue 100 U/g y la actividad de tirosinasa de la preparación líquida fue 100 U/g.

El día 50, quedaba 100% de la actividad de la transglutaminasa, 100% de la actividad de proteína glutaminasa y 98% de la actividad de tirosinasa. No se detectó desarrollo microbiano durante el ensayo de conservación .

Será evidente para un perito en la especialidad que a medida que progresa la tecnología, el concepto inventivo puede ser implementado en diversas formas. El invento y sus realizaciones no se limitan a los ejemplos descritos anteriormente y pueden variar dentro del campo de acción de las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación enzimática liquida CARACTERIZADA porque comprende por lo menos una enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas en suspensión de poliol- agua que comprende desde 25% a 100% (p/p) de poliol y que tiene un valor de pH dentro de la escala de 4.4 a 5.1

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque la suspensión de poliol-agua comprende de 50% a 75% de poliol.

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 o 2, CARACTERIZADA porque el poliol es glicerol o sorbitol.

4. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, CARACTERIZADA porque el pH es 4.6.

5. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADA porque la formulación comprende transglutaminasa, tirosinasa o proteína glutaminasa .

6. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 CARACTERIZADA porque la formulación comprende transglutaminasa y proteina glutaminasa .

7. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 5 o la reivindicación 6 CARACTERIZADA porque la formulación comprende también lacasa y/o tirosinasa .

8. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 CARACTERIZADA porque la formulación carece de conservantes.

9. Un método para preparar una formulación enzimática liquida CARACTERIZADO porque por lo menos una enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas es agregada a la suspensión de poliol-agua que comprende desde 25% a 100% (p/p) de poliol y que tiene un valor de pH en la escala de 4.4 a 5.1.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque el método comprende los pasos siguientes : a) el pH de la suspensión de poliol-agua es ajustado con un ácido apto para el consumo humano a un valor en la escala desde 4.4 a 5.1; b) se agrega a la suspensión por lo menos una enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas; c) opcionalmente, se agrega un conservante.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque el método comprende los pasos siguientes : a) se agrega por lo menos una enzima para el entrecruzamiento y/o modificación de proteínas lácteas a una suspensión de poliol-agua que comprende desde 25% a 100% de poliol; b) se ajusta el pH de la suspensión con ácido (s) apto(s) para el consumo humano a un valor en la escala desde 4.4 a 5.1; C) opcionalmente, se agrega un conservante.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, CARACTERIZADO porque la suspensión de poliol-agua comprende desde 50% a 75% de poliol.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 CARACTERIZADO porque el pH de la suspensión de poliol-agua es 4.6.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, CARACTERIZADO porque el poliol es glicerol o sorbitol .

15 El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 CARACTERIZADO porque la enzima es transglutaminasa, tirosinasa o proteína glutaminasa.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 CARACTERIZADO porque las enzimas son transglutaminasa y proteina glutaminasa.

17. El método de conformidad con la reivindicación 15 o 16 CARACTERIZADO porque se agrega también lacasa y/o tirosinasa a la suspensión.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17 CARACTERIZADO porque el método no incluye la adición de un conservante.