JPH0665280B2

JPH0665280B2 - タンパクゲル化剤及びそれを用いるタンパクのゲル化方法

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Publication number: JPH0665280B2
Application number: JP62165067A
Authority: JP
Inventors: 正雄本木; 敦沖山; 雅彦野中; 晴生田中; 良輔内尾; 明松浦; 裕康安藤; 幸一梅田
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1987-03-04
Filing date: 1987-07-01
Publication date: 1994-08-24
Anticipated expiration: 2009-08-24
Also published as: EP0379606B2; JPS6427471A; US5156956A; EP0379606B1; EP0379606A1

Description

【発明の詳細な説明】［利用分野］本発明は新規なトランスグルタミナーゼ及びこれを用い
るタンパクゲル化物の製造法に関する。

トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖内にあるグルタ
ミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を
触媒する酵素である。

このトランスグルタミナーゼは、アシル受容体としてタ
ンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が作用すると、
分子内及び分子間にε−（γ−Glu）−Lys架橋結合が形
成される。また水がアシル受容体として機能するとき
は、グルタミン残基が脱アミド化されグルタミン酸残基
になる反応を進行させる酵素である。

また、この新規トランスグルタミナーゼを利用して製造
される本発明のゲル化物は、従来のゲル状食品、ゲル状
化粧料をはじめとしてヨーグルト、ゼリー、チーズ、ゲ
ル状化粧料などとして用いられる。

更に、本発明に係るゲル化物は、未加熱で製造でき、熱
に安定なゲルであるため、マイクロカプセルの素材、固
定化酵素等の担体などとしても広範囲に用いることがで
きるものである。

［従来技術］トランスグルタミナーゼはこれまで動物由来のものが知
られている。例えばモルモットの肝臓［Connellan et a
l.,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Journal of Biological Chemistry）246巻４号1093〜
1098頁（1971）］及び哺乳動物の臓器、血液に広く分布
し［Folk et al.,アドバンセス・イン・エンザイモロジ
ー（Advances in Enzymology）38巻109〜191頁（197
3）、Folk et al.,アドバンセス・イン・プロテイン・
ケミストリー（Advances in Protein Chemistry）31巻
１〜133頁（1977）］、その酵素の特徴も研究されてい
る。

しかし、現時点では微生物由来のトランスグルタミナー
ゼについては報告されていない。また、動物由来のトラ
ンスグルタミナーゼを用いるタンパク質のゲル化物の製
造法については本発明者等が既に研究を行なっている
（特開昭58-149645号）。

しかし、この動物由来のトランスグルタミナーゼの産業
への利用、特にタンパク質のゲル化物の製造法には以下
に述べるような欠点を有する。

動物由来のトランスグルタミナーゼは安価にまた大量に
入手するのが困難である。また、ゲル化させるのには、
この高価な酵素が基質タンパク質1gにあたり、１ユニッ
ト以上必要でかつ、基質タンパク濃度が2.0重量％以上
必要であるという制限があること、更には、この動物由
来のトランスグルタミナーゼはカルシウム（Ca²⁺）依存
性である為に用途が制限される。

以上のような欠点を有する為に、動物由来のトランスグ
ルタミナーゼを用いるゲル化物の製造についての実用化
は困難であるのが現状である。

［発明が解決しようとする課題］従来トランスグルタミナーゼの供給は動物に由来してい
るため実用性を考慮した場合、供給量、供給費用、保存
費用、精製の困難さ等の種々の面から不利でありこのま
までは産業上の利用への可能性はほとんど考えられなか
った。

従って、本発明の課題は供給量、コストの面、精製の容
易さ等のいずれの面からも問題はなく、しかも反応にCa
²⁺を必要としない点等、実用性の高い微生物由来の新規
トランスグルタミナーゼ及び本酵素を作用させて得られ
るタンパクゲル化物の製造法の提供である。

［問題点を解決するための手段］これまで動物由来の酵素が検討されてきたが実用性に欠
けるため、本発明者等は給源を微生物に求め広く検索を
行った結果、ストレプトベルチシリウム属の菌について
Ca²⁺非存在下でもペプチド鎖内のグルタミン残基のγ−
カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する従来に
ない新規トランスグルタミナーゼ産性能があることが分
かった。また、この酵素を用いることにより、タンパク
質濃度1.0重量％以上のタンパク含有溶液又はスラリー
をゲル化させてタンパクゲル化物を製造できることを見
い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、Ca²⁺非依存性の、ペプチド鎖内の
グルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移
反応を触媒する新規トランスグルタミナーゼ及びCa²⁺非
依存性の、ペプチド鎖内のグルタミン残基のγ−カルボ
キシアミド基のアシル転移反応を触媒する新規トランス
グルタミナーゼの作用により、タンパク質濃度１重量％
以上のタンパク含有溶液又はスラリーをゲル化させるこ
とを特徴とするタンパクゲル化物の製造法に関する。

ストレプトベルチシリウム属の菌を具体的に示すと、ス
トレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム（Strept
overticillium griseocarneum）IFO 12776,ストレプト
ベルチシリウム・シナモネウム・サブ・エスピー・シナ
モネウム（Strepto-verticillium cinnamoneum sub sp.
cinnamoneum）IFO 12852,ストレプトベルチシリウム・
モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）IFO
13819等があげられる。

これら微生物を培養し、トランスグルタミナーゼ（尚、
以後BTGaseと記す）を取得するための培養法及び精製法
等について述べる。

本発明を実施するにあたり、その培養形態としては液体
培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的には深部
通気攪拌培養を行うのが有利である。

又、使用する栄養培地の培養源としては一般に微生物培
養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他の微
量栄養源の他、ストレプトベルチシリウム属に属する微
生物の利用出来る栄養源であれば全て使用出来る。培地
の炭素源としてはブドウ糖、ショ糖、可溶性デンプン
「ラスターゲン」（商品名）、グリセリン、デキストリ
ン、澱粉等の他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独で又
は組合せて用いられる。窒素源としては無機窒素源、有
機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄養源として
は硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ソ
ーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。又、有機窒素
源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦などの粉、
糠、脱脂粕をはじめコーンスティープリカー、ペプト
ン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス等が挙
げられる。無機塩及び微量栄養素としてはリン酸、マグ
ネシウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の
他ビタミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等の菌の生育
やBTGaseの生産を促進するものであれば必要に応じて使
用出来る。

培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育しBTGaseが産
生する範囲であれば良く、好ましくは25〜35℃である。
培養時間は条件により異なるがBTGaseが最も産生される
時間まで培養すれば良く、通常２〜４日程度である。

BTGaseは液体培養では培養液中に溶解されており、培養
終了後培養液より固形分を除いた培養ろ液より採取され
る。培養ろ液よりBTGaseを精製するには通常酵素精製に
用いられるあらゆる方法が使用出来る。

例えば、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコー
ル等の有機溶媒による処理、硫安、食塩等による塩析、
透析、限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフィー、吸
着クロマトグラフィー、ゲルろ過、吸着剤、等電点分画
等の方法が使用出来る。又、これらの方法を適当に組合
せる事によりBTGaseの精製度が上る場合は適宜組合せて
行う事が出来る。

こうしてこれらの方法によって得られた酵素液に安定化
剤として各種の塩類、糖類、蛋白質、脂質、界面活性剤
等を加え或いは加えることなく、限外ろ過濃縮、逆浸透
濃縮、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥の方法を施すこと
により液状又は固形の精製BTGaseを得ることが出来る。

BTGaseの活性測定はベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グ
ルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質として
Ca²⁺非存在下で反応を行い、生成したヒドロキサム酸を
トリクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成させ、525nmの吸
収を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求め活性
を算出する。

BTGase活性は特に記載しないかぎり以下に記載する方法
により測定した。

＜活性測定法＞試薬Ａ 0.2Mトリス塩酸緩衝液（pH6.0） 0.1Mヒドロキシルアミン 0.01M還元型クルタチオン 0.03Mベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグ
リシン試薬Ｂ 3N塩酸 12％トリクロロ酢酸５％FeCl₃・6H₂O （0.1N−HClに溶解）上記溶液の1:1:1の混合液を試薬Ｂとする。

酵素液の0.05mlに試薬A0.5mlを加えて混合し37℃で10分
間反応後、試薬B0.5mlを加えて反応停止とFe錯体の形成
を行った後525nmの吸光度を測定する。対照としてあら
かじめ熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたも
のの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別
に酵素液のかわりにＬ−グルタミン酸γ−モノヒドロキ
サム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成
されたヒドロキサム酸の量を求め、１分間に１μモルの
ヒドロキサム酸を生成する酵素活性を１単位とした。

このようにして得られる生成BTGaseの酵素化学的性質を
以下に述べる。尚、ストレプトベルチシリウム属内の菌
株の種類によりBTGaseの酵素化学的性質について若干の
相違点がみられるので、それぞれの菌株の生産するBTGa
se、即ちストレプトベルチシリウム・モバラエンス（St
reptoverticillium mobaraense）IFO 13819のトランス
グルタミナーゼ（BTG−１と命名）、ストレプトベルチ
シリウム・グリセオカルネウム（Streptoverticillium
griseocarneum）IFO 12776のトランスグルタミナーゼ
（BTG−２と命名）、ストレプトベルチシリウム・シナ
モネウム・サブ・エスピー・シナモネウム（Streptover
ticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum）IFO 128
52のトランスグルタミナーゼ（BTG−３と命名）につい
ての酵素化学的性質を記載するとともに、それを包含し
たものをBTGaseの酵素化学的性質とする。

ａ）至適pH:6〜７基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニ
ルグリシンとヒドロキシルアミンを使用し、37℃、10分
反応で作用至適pH範囲を求めた。尚、BTG−１の至適pH
は６〜７にあり、BTG−２の至適pHは６〜７付近にあ
り、BTG−３の至適pHは６〜７付近にある（第１図、第
５図、及び第９図参照）。

ｂ）至適温度:45〜55℃ 基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニ
ルグリシンとヒドロキシルアミンを使用し、pH6、10分
反応での作用至適温度範囲を求めた。尚、BTG−１の至
適温度は55℃付近であり、BTG−２の至適温度は45℃付
近であり、BTG−３の至適温度は45℃付近にある（第２
図、第６図、及び第10図参照）。

ｃ）pH安定性:pH5〜９ 37℃、10分間処理でのpH安定性を求めた。尚、BTG−１
はpH5〜９で安定であり、BTG−２はpH5〜９で安定であ
り、BTG−３はpH6〜９で安定である（第３図、第７図及
び第11図参照）。

ｄ）温度安定性 pH7で10分間処理での温度安定範囲を求めた。40℃では8
0％以上、50℃では50〜80％の活性がそれぞれ残存し
た。尚、BTG−１は40℃では88％活性が残存し、50℃で
は74％活性が残存し、BTG−２は40℃では86％活性が残
存し、50℃では56％活性が残存し、BTG−３は40℃で80
％活性が残存し、50℃では53％活性が残存する（第４
図、第８図、及び第12図参照）。

ｅ）基質特異性 BTGaseの各種合成基質とヒドロキシルアミンとの反応を
調べた。

合成基質がベンジルオキシカルボニルアスパラギニルグ
リシン、ベンジルオキシカルボニルグルタミン、グリシ
ルグルタミニルグリシンの場合反応しない。

しかし、合成基質がベンジルオキシカルボニルグルタミ
ニルグリシンの場合の反応性は最も高い。この時の各種
合成基質濃度は5mMとした。

結果は表−１に示される。なお、表−１中のCBZはベン
ジルオキシカルボニル基の略であり、Glnはグルタミル
基の略であり、Glyはグリシル基の略であり、Asnはアス
パラギニル基の略である。

ｆ）金属イオンの影響活性測定系に1mM濃度になるように各種金属イオンを加
えて影響を調べた。

結果は表−２に示される。BTGaseはCu²⁺,Zn²⁺により活
性が阻害される。

ｇ）阻害剤の影響各阻害剤を1mMになるように加え、25℃、30分放置後、
活性を測定した。

結果は表−３に示される。BTGaseはパラクロロマーキュ
リー安息香酸（PCMBと略する）、Ｎ−エチルマレイミド
（NEMと略する）、モノヨード酢酸により活性が阻害さ
れる。

表−３中PMSFHはフェニルメチルスルホニルフルオライ
ドの略である。

ｈ）等電点:8.9〜9.9 アンホライン等電点電気泳動により求めた。尚、BTG−
１の等電点（pI）は９付近であり、BTG−２の等電点（p
I）は9.7付近であり、BTG−３の等電点（pI）は9.8付近
である。

ｉ）分子量：約38,000〜約41,000 SDSディスク電気泳動法より求めた。尚、BTG−１の分子
量は約38,000であり、BTG−２の分子量は約41,000であ
り、BTG−３の分子量は約41,000である。

次に、BTGaseとモルモット肝由来のトランスグルタミナ
ーゼ（以後MTGaseと記す）との性質を比較する。尚、MT
Gaseは特開昭58−149645号に記載された方法で調製し
た。

表−４には各酵素化学的性質の比較を、表−５にはCa²⁺
の活性に及ぼす影響を示す。表−４及び表−５より明ら
かのように従来主として研究されているMTGaseとストレ
プトベルチシリウム属由来のBTGaseとでは酵素化学的性
質において種々の差が見られ、特に温度安定性、分子
量、等電点、基質特異性に差が見られる。また、Ca²⁺の
存在下及び非存在下のいずれにおいても本発明のBTGase
は作用する点等でも明らかな差が見られる。従って、本
発明のBTGaseはMTGaseとはその性質を明らかに異にする
ものであり、新規トランスグルタミナーゼである。

次にBTGaseを有効成分とするタンパクゲル化剤及びそれ
を用いるタンパクゲル化物の製法（タンパクのゲル化方
法）について述べる。

本発明のタンパクゲル化剤の調製法には、有効成分とし
て先に説明した新規トランスグルタミナーゼを使用する
ことを除いては特別の制限はなく、従って、既に知られ
ている同種の酵素製剤の調製手段を適宜採用して本発明
のタンパクゲル化剤を調製することができる。例えば、
本発明のトランスグルタミナーゼにデキストリン、炭酸
カルシウム、乳糖、ソルビトール、マルチトールなどの
賦形剤、希釈剤等を適宜添加配合して粉体、顆粒などの
固体状に、また液体状に製剤化できる。

次に、BTGaseを用いて行なうタンパクゲル化方法につい
て説明する。

まず、基質となるタンパク質は、リジン残基及びグルタ
ミン残基を有し、上述の酵素の触媒をうけるものであれ
ば、その起源、性状に制約されるものではなく、植物性
タンパク質、動物性タンパク質、微生物タンパク質、藻
類タンパク質などいかなるものでも使用できる。植物性
タンパク質としては特にその種類は限定しないが、例え
ば油糧種子の脱脂物及びそれらより分離したタンパク質
などを挙げることができる。また、動物性タンパク質と
しては、特にその種類は限定しないが、たとえば乳タン
パク、ゼラチン、コラーゲン、血清アルブミン等を例示
することができる。

また、本発明に用いる蛋白質としては前記以外にもプロ
テアーゼなどで部分的に切断したタンパク質、合成ペプ
チドおよび各種の化学修飾したタンパク質でも、グルタ
ミン残基、リジン残基を有する条件が満たされれば、こ
の酵素の基質とすることができる。

これらのタンパク質の１重量％以上、好ましくは３重量
％以上の液体又はスラリーであれば、BTGaseの添加によ
り高粘性物、あるいはゲル状物が形成され、１重量％以
下であれば、溶液状又は沈殿状の架橋高分子化物が得ら
れる。BTGaseはタンパク1gに対して0.01〜2000ユニット
添加、好ましくは0.1〜200ユニット添加、反応溶液のpH
は４〜10、好ましくは５〜８に調整し、５〜80℃、好ま
しくは40〜60℃で10秒〜24時間、好ましくは10分〜２時
間インキュベートすると架橋高分子化物ないしはゲル状
物を得ることができる。このように、本発明のBTGaseは
低い酵素濃度でゲル化できる（基質タンパク質1gあたり
0.01ユニット以上あればよい）、及び低い基質濃度で使
用できる（基質タンパク質濃度１重量％以上であればよ
い）等の特徴を有する新規な酵素である。

このBTGase処理により十分なゲル化物が得られるが、更
に必要により反応終了後のゲル化物を60〜200℃で１分
間〜24時間加熱処理することにより更に強固なゲル化物
が得られる。このタンパク含有溶液は単にタンパクと水
との混合物に限らず、タンパク、水および油脂を混合し
た水中油型又は油中水型エマルジョンであってもよく、
各種塩類、澱粉、少糖類、多糖類、香料、保湿剤、着色
料などもBTGaseによる架橋高分子化及びゲル化を阻害し
ない範囲で適宜選択して添加することができる。

またタンパク質の種類と量を調整することによって架橋
高分子化物の架橋度を変えることができ、これにより、
生成するゲルの物性及び含水量を目的と用途に応じて変
えることができる。

以下に本発明の実施例について述べる。

実施例１ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Streptover
ticillium mobaraense）IFO 13819を培地組成ポリペプ
トン0.2％、グルコース0.5％、リン酸二カリウム0.2
％、硫酸マグネシウム0.1％からなる水性培地（pH7）20
0mlに接種し30℃、48時間培養し、得られた種培養液を
ポリペプトン2.0％、「ラスターゲン」2.0％、リン酸二
カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.1％、酵母エキス0.
2％、消泡剤としてポリオキシアルキレングリコールの
「アデカノール」（商品名、旭電化社製品）0.05％から
なる培地20（pH7）に加え30℃で３日間培養後ろ過
し、培養液18.5得た。このものの活性は0.35ユニット
／mlであった。

培養液を塩酸でpH6.5に調製し、予め0.05Mリン酸緩衝液
（pH6.5）で平衡化しておいたメタアクリル酸系ポーラ
ス型陽イオン交換樹脂の「アンバーライトCG−50」（商
品名、ローム・アンド・ハース社製品）のカラムに通し
た。この操作でトランスグルタミナーゼは吸着された。
さらに同緩衝液で不純蛋白質を洗い流した後、さらに0.
05〜0.5Mの同緩衝液の濃度勾配をつくり、通液して溶出
液を分画回収し、比活性の高い分画を集めた。

電導度を10ms以下になるように希釈後「ブルーセファロ
ースCL−6B」（商品名、ファルマシア・ファインケミカ
ル社製）のカラムに通した。この操作でトランスグルタ
ミナーゼは吸着された。更に0.05Mリン酸緩衝液（pH7）
で不純蛋白質を洗い流した後、０〜1Mの食塩濃度勾配を
つくり通液して溶出液を回収し比活性の高い画分を集め
た。

限外濾過膜の「AIL1010」（商品名、旭化成工業（株）
製）を使い濃縮し、0.5Mの食塩を含む0.05Mリン酸緩衝
液（pH7）を用いて平衡化させた。

得られた濃縮液を同緩衝液で予め平衡化しておいた「セ
ファデックスＧ−75」（商品名、ファルマシア・ファイ
ンケミカル社製）を含むカラムに通し、同緩衝液を流し
て溶出液を分画した。

この結果活性画分は単一のピークとして溶出された。こ
のものの比活性は培養ろ液に対し625倍であり、回収率
は47％であった。

実施例２実施例１と同様にしてストレプトベルチシリウム・グリ
セオカルネウム（Streptoverticillium griseocarneu
m）IFO 12776を30℃で３日間培養後ろ過し培養液19を
得た。このものの活性は0.28u／mlであった実施例１と同様な方法で酵素を生成してSDSディスク電
気泳動で単一の酵素を得た。

実施例３実施例１と同様にしてストレプトベルチシリウム・シナ
モネウム・サブ・エスピー・シナモネウム（Streptover
ticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum）IFO 128
52を30℃で３日培養後ろ過し、培養液18.5を得た。こ
のものの酵素活性は0.5u／mlであった。

実施例１と同様な方法で酵素を精製してSDSディスク電
気泳動で単一の酵素を得た。

実施例４（１）特開昭58-149645号の実施例１に記載された方法
により調製または購入した食品タンパク類、すなわち
α_S1−カゼイン、Na−カゼイネート、大豆11Sグロ
ブリン、大豆7Sグロブリン、分離状大豆タンパク
「アジプロンＳ−２」（商品名、味の素（株）製）、
水抽出大豆タンパク、酸沈澱大豆タンパク、大豆タ
ンパク粒子、大豆タンパクミセル、ゼラチンの各5,
10重量％の水溶液または懸濁液5mlに、実施例１で調製
したBTGase（凍結乾燥品、比活性2.50u／mg protein）
をタンパク1mg当り0.02u加え、55℃、１時間振盪インキ
ュベートした。

室温放置後、サンプルの入った試験管を倒置し、流れ落
ちるかどうかでゲル化を判定した。結果は表−６に示し
た。

（２）BTGaseの基質とするためウサギミオシンを次のよ
うに調製した。

Perryの方法（Perry, S.V. （1975）, “Methods in En
zymology" vol.2,pp.582-588, Academic Press, New Yo
rk）に従い、ウサギの骨格筋25gより３倍量の0.45M KC
l、5mM ATP−MgCl₂、50mMリン酸緩衝液（pH6.4）中で
０℃、30分間ミオシンを抽出し、以下希釈沈殿によって
集め0.5M KCl、20mM Tris-maleate（pH7.5）溶液に透
析し、10⁵×ｇで60分間遠心分離した上清を精製ミオシ
ンとして使用した。

タンパク濃度は1.5％であった。これに上記（１）と同
様の条件でBTGaseを添加しゲル化能を調べた。結果は表
−６に示した。

（３）BTGaseの基質とするためエビミオシンを次のよう
に調製した。

新鮮（生）甘えび（体長約5cm）の皮をむきエビ屈曲筋
肉をとり出し、ミンチ後、氷水洗浄し、更に冷却下0.1m
M DTT、0.1mM PMSF存在下でホモジナイズし、遠心分離
でアクトミオシンを抽出分離した。更に10⁵×ｇで60分
間超遠心操作によりアクチンを除きミオシンに富んだ画
分を得た。更に希釈沈殿／超遠心操作を繰り返し、エビ
精製ミオシンを得た。この精製ミオシンはCa−ATPase活
性がなくアクチンとの結合能も消失していることから、
変性ミオシンであることがわかった。

このタンパク濃度3.6％の変性エビミオシン溶液5ml（緩
衝液、0.5M KCl、5mM CaCl₂、25mM Tris-HCl（pH7.
5）5mM DTT）に対し3.6uのBTGase（実施例１と同様の
方法で調製）を添加し、35℃の水浴中に浸漬することに
よって反応を開始し、最大35分間反応させた。

以上のゲル化能の実験結果をまとめると表−６のように
なった。

尚、比較例として、MTGaseによるゲル化能試験結果も示
した。尚、MTGaseの添加量は基質たんぱく質1mg当り0.1
uとした。

実施例５ゼラチン（新田ゼラチン製）に5.10重量％溶液となるよ
うに0.1Mトリス−HCl buffer（pH7.6）を加え、60℃、
３分で完全にゼラチンを溶解し、実施例４（１）におけ
ると同じBTGaseを0.02u／mgタンパク質加えよく攪拌後3
7℃、１時間反応させた後、沸とう水浴中に10分間加熱
した直後の状態を観察した。

尚、BTGaseを添加しない以外は全く同一の処理をしたも
のを対照とした。結果は表−７に示した。

実施例６ BTGaseの基質とするため、絹蛋白質水溶液を以下の方法
で調製した。脱脂ずみの絹糸2.33gを9.3M臭化リチウム
（LiBr）溶液100mlに加え、40℃で一晩攪拌すると絹糸
は可溶化した。この溶液に対し吸引濾過、対水透析を行
い粗絹蛋白質水溶液（約２重量％）を得た。

予め試験管内に最終濃度が0.01u、0.02u、0.04u／mgタ
ンパク質となるように実施例４（１）におけると同じBT
Gaseを入れておき、シェアリングによるゲル化をさける
ため静かに絹蛋白質水溶液を加えた。対照としてBTGase
未添加のものも用意した。

各々の試験管を室温で一晩放置後試験管内の試料の状態
を観察し表−８の結果を得た。

実施例７市販牛乳（粗タンパク2.9％）を約５倍（粗タンパク14.
5％）に減圧濃縮して得た濃縮牛乳１に対して、実施
例４（１）に示したと同じBTGaseを2u加えて攪拌し、55
℃、30分インキュベートした。生じたゲル状物を80〜95
℃、20分加温し残存酵素を失活させた後、冷却するとプ
リン状のゲル食品を得た。

要すれば、10％程度まで砂糖を添加しても同様のゲル状
物を得ることができた。

実施例８市販牛乳（粗タンパク2.9％、油脂3.2％、水分89％）を
約５倍に減圧濃縮し、濃縮牛乳（約10）とし、これに
30％のグルコノデルタラクトン溶液100mlを加え、速や
かに混合した後、pH6.0以上であることを確認してか
ら、実施例４（１）に示したと同じBTGaseを100u加え
て、攪拌し、45℃、45分間インキュベーター中に静置し
てゲル化させた。かかる後にゲルを壊わさないようにゲ
ルを80〜95℃迄加熱し、BTGaseの失活とグルコノデルタ
ラクトンのグルコン酸への分解を行ない、ゲルのpHを４
〜５に調整した。そして冷却後、カード状のゲルを約8c
m角にカッティングし、酸塩法で２％程度の塩濃度にし
てPen. caseicolum（ペニシリウム・カゼイコラム）の
スターターを接種し、15℃、３週間、RH85％で熟成さ
せ、チーズを得た。

尚、グルコノデルタラクトンを用いない場合は、乳酸菌
（Lactobacillus acidphillus,ラクトバチルス・アシド
フィラス）を添加し、BTGaseでゲル化後、40℃で２〜５
時間発酵させても同じようなチーズが得られた。

本法で得られるチーズは、高価な子牛のレンネットを使
用せずに製造することができ、またその物性は、かなり
しなやかな弾性をもつ品質の良いものであった。

実施例９実施例８の濃縮乳（１）を５℃前後に冷却して、Stre
ptococuss thermophillus（ストレプトコッカス・サー
モフィラス）からなるスターター（５％程度）をすばや
く添加混合し、更に実施例４（１）におけると同様のBT
Gaseを1u（約0.01u／ｇタンパク質に相当）加えて攪拌
し、35℃、１時間インキュベーターの中で静置ゲル化さ
せた。次にゲル温度を50℃とし、この温度に40分間保持
し、S.thermophillusによって酸を生成せしめかつフレ
ーバーを増加せしめた後、更に75〜85℃に加温せしめBT
Gaseを失活させた。

冷却すると軽い酸味を持つ品質の優れたヨーグルト様食
品が得られた。

実施例10 市販豆乳（明治乳業（株）製「サングロー豆乳」、粗タ
ンパク3.1％）を約2.5倍に減圧濃縮し、更に20℃以下に
冷却して得られた濃縮豆乳（粗タンパク7.75％）１に
対し、実施例４（１）に示したと同様のBTGaseを4u（0.
05u／ｇタンパク質に相当）加えてプラスチック容器に
充填し、フタをしシールした後、55℃の湯浴中で30分加
温し、酵素反応させゲル化した。しかる後に高周波誘電
加熱装置（電子レンジ、2450メガヘルツ、波長12cm）を
用いて加熱した。

通常の絹ごし豆腐、木綿豆腐と比較するとしなやかで、
型くずれしない品質の良い豆腐様ゲルができた。

実施例11 丸大豆6.5kgを20kg位の水に浸漬し、常温で１晩充分吸
水膨潤させたものを、水を加えながら磨砕機ですりつぶ
し「ご」を得た。これに更に水を25kg加え、ごを薄め少
量の消泡剤を添加し煮釜に移し、スチームを吹き込んで
加熱した。加熱条件は５分かけて100℃まで上げ、３〜
５分保つ方法がよい。煮込み後おから絞り機でおからを
除き濃厚豆乳（粗タンパク7.0％、油分8.1％、水分75
％）30kg得た。

これに実施例４（１）に示したと同じBTGaseを200u（0.
1u／ｇタンパク質に相当）加えて直ちにケーシングチュ
ーブ（塩化ビニリデンチューブ）に充填し、37℃、30分
湯浴中で加熱した。次に90℃以上の湯浴中に移し、加熱
（30〜60分）し、流水中で豆腐様ゲルを得た。

実施例12 表−９のレシピーでカマボコを試作し、レオメーター
（不動工業（株）製）による物性測定と官能評価（ｎ＝
10）を実施した。なお、BTGaseは実施例４（１）におけ
ると同様のものを使用したが、その添加量はすり身乾物
1gに対して20uであり、酵素反応はBTGase無添加のコン
トロールのすわり工程と同様に34℃、２時間とし、反応
終了後85℃、30分間加熱して製品とした。

物性測定および官能評価の結果を表−10および11に示
す。

以上のようにBTGaseを添加して試作したカマボコは筋原
線維蛋白質の間にε−（γ−Glu）Lys架橋が生成するた
めコントロールに比べて破断強度が増し、好ましい食感
となることがわかった。

実施例13 表−12のレシピーでソーセージを試作し、レオナー
（（株）山電製）による物性測定と官能評価（ｎ＝10）
を実施した。なお、BTGaseは実施例４（１）におけると
同様のものを使用したが、その添加量は豚肉乾物1gに対
して1uであり、酵素反応は55℃、２時間とし、反応終了
後、80℃、30分間加熱して製品とした。尚、BTGaseを添
加しないものをコントロールとした。

物性測定および官能評価の結果を表−13及び14に示す。

以上のようにBTGaseを添加して試作したソーセージは、
BTGaseのゲル形成能によりコントロールに比べて粘弾性
に富んだ歯ごたえの好ましい食感となることがわかっ
た。

実施例14 表−15のレシピーでホイッピング・クリームを試作し、
絞り出し特性を評価した。なお、BTGaseは実施例４
（１）におけると同様のものを使用したが、その添加量
はカゼイン・ナトリウム乾物1gに対して1uであり、ホイ
ップ操作は万能混合攪拌機（（株）三栄製作所製）を用
い、７〜９℃で実施した。尚、BTGase無添加のものをコ
ントロールとした。

それぞれのホイッピング・クリームを用いてガラス板上
に花柄を描いて状態を観察したところ、BTGaseを添加し
たホイッピング・クリームでは画線の鋭い造花が可能と
なった。

実施例15 表−16のレシピーでアイスクリームを試作し室温に置い
た時の形態変化を観察し、メルトダウン耐性を評価し
た。

なお、BTGaseは実施例４（１）におけると同様のものを
使用したが、その添加量は脱脂粉乳乾物1gに対して25u
であり、酵素反応はアイスクリームミックスの殺菌工程
（68℃、30分間）で実施した。殺菌後、５℃で一晩エー
ジングさせたアイスクリームミックスをアイスクフリー
ザー（三菱重工（株）製）を用い、品温−２〜４℃でオ
ーバーラン90％までフリージングを行い、コーンに充填
後、−40℃で硬化させ製品とした。

尚、BTGaseを添加しない以外は全く同様の操作を行って
試作したアイスクリームをコントロールとした。

コントロールは室温静置後15分で形崩れしてしまった
が、BTGaseを添加したアイスクリームは30分以上も形崩
れを起こさず、しかもコントロールと同様、滑らかな口
ざわりをしていた。

実施例16 試験管内に所要量の牛皮由来アテロコラーゲン粉末（高
研（株）製）をとり、0.1M Tris−HClバッファー（pH7.
5）2mlを加え、55℃の水浴中に１分間保持した後攪拌す
ることにより３〜10％アテロコラーゲン溶液を調製し
た。高濃度溶液が冷却によるゲル化をおこさないうちに
実施例４（１）におけると同様のBTGaseを0.05u／mgタ
ンパク質となるよう添加し、55℃で60分間インキュベー
トした。全体のコントロールとしてBTGaseを添加しない
10％アテロコラーゲン溶液についても同様にインキュベ
ートした。インキュベート終了直後、室温で60分放置
後、更にその後100℃の水浴中に15分保持後に試験管内
の様子を観察した。

その結果を表−17に示した。

実施例17 生オキアミ凍結肉（大洋漁業（株）製）1kgをフローズ
ンカッターにより細砕し、これに食塩30g、ソルビトー
ル（味の素（株）製）100g、新ねり味（味の素（株）
製）50g、みりん40g、黒レイショ澱粉50gを加えさらに2
000uのBTGase（実施例４（１）におけると同様のもの）
を300mlの冷水に可溶化後加えて、ステファン社製カッ
ターにて約６分混練した。混練直後の温度は５〜６℃に
制御した。

このオキアミ肉ペーストを塩化ビニリデン製のケーシン
グチューブ（クレハ化学（株）製）に充填し、50℃に
て、１時間インキュベート後、沸とう湯浴中で25時間加
熱した。加熱後流水中で冷却した後、物性測定をした。
即ちサンプルを厚さ3cmに切断し、直径7mmの球形プラン
ジャーを使用して、不動工業社製レオメーターにて測定
を行ない、破断強度を求めた。尚、コントロールは、BT
Gaseを予め、高温加熱変性して失活せしめたものを用
い、同様の方法で調製した。

その経過を表−18に示した。

すなわち、BTGaseを加えたオキシアミ肉のかまぼこ試作
品はBTGaseを予め失活したコントロール区よりも格段に
高い破断強度を示すことが認められた。

実施例18 表−19のレシピーでうどんを作り、官能評価（ｎ＝15）
と物性測定を実施した。

BTGaseは実施例４（１）におけると同様のものを使用し
たが、その添加量はタンパク質1g当たり1uとし、室温で
２時間酵素反応を行なった後、製麺した。

官能評価および物性測定は12分間ゆでたうどんで行なっ
た。物性測定に用いた麺の長さは7cm、レオメーター
（不動工業社製）を用いて引張り試験を行ない破断強度
と破断するまでの伸びを測定した。結果を表−20及び21
に示した。

官能評価、物性測定の結果はよく一致しており、BTGase
を添加することにより、グルテン分子の間に架橋構造が
生成し、シコシコした讃岐うどんに近い食感の麺が出来
ることが明らかになった。

実施例19 表−22のレシピーでスパゲティを作り、官能評価（ｎ＝
15）と物性測定を実施した。

BTGaseは実施例４（１）におけると同様のものを使用し
たが、その添加量は蛋白質1g当たり1uとし、室温で２時
間酵素反応を行なった後、パスタマシン（ラッキーコー
ヒーメーカー社製）で製麺した。

官能評価および物性測定は５分30秒ゆでた麺で行なっ
た。物性測定に用いた麺の長さは7cm、レオメーター
（不動工業製）を用いて引張り試験を行ない、破断強度
と破断するまでの伸びを測定した。結果を表−23及び24
に示した。

BTGaseをスパゲティに作用させても表−23のように食感
に大きな変化は生じなかったが、製造工程でミキシング
した粉がサラサラしており、スクリューへのフィーディ
ングがスムーズでシリンダー内の発熱が少ないなど作業
性が大幅に改善された。

［発明の効果］本発明の微生物由来のBTGaseは安価に供給され、かつ精
製も容易であるので実用性が大である。

また、BTGaseを用いることにより、カルシウム非存在下
で又カルシウム存在下でも酸素（BTGase）濃度及び基質
濃度が非常に低いところで品質の優れたゲル化物を製造
できるという利点もある。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図は本願発明のBTG−
１の至適pH曲線、至適温度曲線、pH安定曲線及び温度安
定曲線を示すものであり、第５図、第６図、第７図及び
第８図は本願発明のBTG−２の至適pH曲線、至適温度曲
線、pH安定曲線及び温度安定曲線を示すものであり、第
９図、第10図、第11図及び第12図は、本願発明のBTG−
３の至適pH曲線、至適温度曲線、pH安定曲線及び温度安
定曲線を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者野中雅彦神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者田中晴生神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者内尾良輔東京都中央区京橋１−５−８味の素株式会社内 (72)発明者松浦明愛知県春日井市松本町539−２ (72)発明者安藤裕康愛知県江南市古知野町千丸221 (72)発明者梅田幸一岐阜県羽島郡笠松町北及字北山1984−25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ca²⁺非依存性の、ペプチド鎖内のグルタミ
ン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触
媒する新規トランスグルタミナーゼを有効成分とするこ
とを特徴とするタンパクゲル化剤。
【請求項２】Ca²⁺非依存性の、ペプチド鎖内のグルタミ
ン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触
媒する新規トランスグルタミナーゼを添加使用して作用
せしめることにより、タンパク質濃度１重量％以上のタ
ンパク含有溶液又はスラリーをゲル化させることを特徴
とするタンパクのゲル化方法。
【請求項３】新規トランスグルタミナーゼがタンパク含
有溶液又はスラリー中のタンパク質1gに対して0.01〜20
00ユニット添加使用することを特徴とする特許請求の範
囲第２項記載の方法。