MX2014005143A

MX2014005143A - Agentes terapeuticos y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2014005143A
Application number: MX2014005143A
Authority: MX
Inventors: Amanda Thuy Tran; Sven-Niklas Anders Axelsson
Original assignee: Fredax Ab
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2014-11-25
Also published as: IL232262A0; WO2013061083A2; RU2606773C2; US20220125961A1; PT2771037T; EP2771037B1; DK2771037T3; KR102362358B1; RU2014121499A; ZA201403372B; US20140286862A1; EP2771037A2; US20160317683A1; HK1201454A1; KR20210036987A; CA2853669C; LT2771037T; CA2853669A1; CN104159618A; IL232262A

Abstract

La presente solicitud provee un agente que comprende o que consiste en una porción de unión con especificidad por una proteína de calicreína (por ejemplo, el PSA o la hK2), para su uso en el tratamiento de cáncer de próstata, y un método para el tratamiento de cáncer de próstata en un paciente, el método comprendido el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que comprende o consiste en una porción de unión con especificidad por una proteína de calicreína al paciente.

Description

AGENTES TERAPÉUTICOS Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención pertenece en general al campo de agentes y métodos terapéuticos, en particular al campo del cáncer de próstata.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El listado o la discusión de un documento en esta especificación aparentemente previamente publicado, no necesariamente debe considerarse como un reconocimiento de que el documento forma parte del estado de la técnica o es conocimiento general común.

El cáncer de próstata es en el momento actual la forma más común de cáncer entre los hombres. La próstata es una glándula del tamaño de una nuez en los hombres que produce fluido que es un componente en el semen. La próstata tiene dos, o más, lóbulos o secciones, encerrados por una capa exterior de tejido. La próstata se localiza enfrente del recto y apenas abajo de la vejiga urinaria, y rodea a la uretra.

La ocurrencia del cáncer de próstata es más alta en la parte noroeste de Europa y en los Estados Unidos. El crecimiento del tumor es usualmente un proceso que ocurre durante un largo período. El cáncer de próstata es normalmente una forma leve de cáncer. De hecho, la mayoría de los hombres diagnosticados con cáncer de próstata sobreviven, y sólo una minoría de los hombres encuentra una forma más agresiva del cáncer de próstata, la cual sufre metástasis en una etapa temprana. Esta forma de cáncer de próstata sólo puede ser curable si se diagnostica en una etapa temprana, antes de que el cáncer se haya extendido hacia el tejido extracapsular.

Hoy en día, el diagnóstico y el monitoreo del cáncer de próstata pueden llevarse a cabo midiendo la concentración de un antígeno específico de la próstata (PSA) en la sangre del paciente. Si la concentración del PSA es notablemente alta en varias mediciones consecutivas, realizadas en diferentes puntos de tiempo, la evaluación es que existe una probabilidad de cáncer de próstata. En este punto de tiempo, una biopsia puede llevarse a cabo para verificar el cáncer de próstata.

El PSA (conocido también como calicreína III) es una proteína, constituida de una cadena sencilla de 237 aminoácidos, que se produce en las células secretorias de la próstata. Estas células secretorias pueden encontrarse en la glándula prostética entera. El PSA está bien establecido y es un marcador completamente investigado con respecto al cáncer de próstata. Mediante la comparación con células sanas, la producción del PSA es menor en las células malignas y mayor en las células hiperplásicas. Es por lo tanto contradictorio que de hecho la concentración del PSA sea mayor en la sangre de los hombres que sufren de cáncer de próstata. Sin embargo, una explicación puede ser que las células malignas tienen una estructura celular deteriorada, y son por lo tanto más permeables al PSA.

Otra serina proteasa importante, la cual puede ser adecuada para la terapia futura del cáncer de próstata, es la calicreína glandular humana 2 (hK2). El gen que codifica para la hK2 se localiza en el cromosoma 19, junto con el gen que codifica para el PSA. La hK2 es expresada principalmente en el tejido de la próstata, tal como el PSA. En la próstata, el PSA está presente como una pro-forma inactiva, y es activada a través de la acción de peptidasa de la hK2. La investigación inmunohistoquímica con respecto a la hK2 ha mostrado que la hK2 es expresada con relación al nivel de diferenciación. Esto significa que la hK2 es expresada en un rendimiento mayor en el tejido de baja diferenciación, tal como el tejido sometido al cáncer de próstata, y en un menor rendimiento en el tejido de alta diferenciación, tal como el tejido sometido a hiperplasia prostática benigna (BPH), la cual es otro problema común de la próstata.

Las terapias de hoy en día para el cáncer de próstata son la cirugía (por ejemplo, la prostatectomía radical), la radioterapia (que incluye la braquiterapia y la radioterapia con haz externo), el ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU), la quimioterapia, los fármacos quimioterapéuticos orales, la criocirugía (congelación del tumor), la terapia hormonal (tal como la terapia antiandrógenos), la castración, o combinaciones de lo anterior.

La mayoría de estas terapias (cirugía y radioterapia externa) son, sin embargo, sólo (o principalmente) útiles para el tratamiento de tumores primarios y grandes metástasis. La quimioterapia se usa para el cáncer diseminado, pero para la mayoría de estos pacientes, es un efecto paliativo y/o representa supervivencia prolongada. Otras modalidades de tratamiento o modalidades de tratamiento complementarias, son por lo tanto necesarias para lograr mejoras considerables de las enfermedades malignas diseminadas, en particular en los casos de micrometástasis.

La terapia, tal como la inmunoterapia o la radioinmunoterapia, usando moléculas de focalización tales como anticuerpos y fragmentos, podría dar la posibilidad de la terapia de la enfermedad diseminada.

De esta manera, existe la necesidad por nuevos agentes y métodos terapéuticos para tratar el cáncer de próstata, en particular en los casos de enfermedad diseminada, metástasis y micrometástasis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, la presente invención busca mitigar, aliviar o eliminar una o más de las deficiencias identificadas anteriormente en la técnica, y desventajas individualmente o en cualquier combinación, y resuelve por lo menos los problemas mencionados anteriormente proveyendo un método de terapia de conformidad con las reivindicaciones de patente anexas.

En un primer aspecto, la presente invención provee un agente que comprende o que consiste de una porción de unión con especificidad por una proteína calicreína para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata.

Dicho de otra manera, el primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un agente que comprende o que consiste de una porción de unión con especificidad por una proteína calicreína, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata.

Por consiguiente, el primer aspecto provee también un método para el tratamiento del cáncer de próstata en un paciente, el método comprendiendo el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que comprende o que consiste de una porción de unión con especificidad por una proteína calicreína.

Por la "porción de unión" se entiende todos los tipos de entidad química (por ejemplo, oligonucleótidos, polinucleótidos, polipéptidos, peptidomiméticos y pequeños compuestos), los cuales son capaces de unirse específicamente a una proteína calicreína. En forma ventajosa, la porción de unión es capaz de unirse selectivamente (es decir, de preferencia) a una proteína calicreína bajo condiciones fisiológicas.

Como se indicó anteriormente, los agentes de la invención pueden comprender o consistir de cualquier entidad química adecuada que constituya una porción de unión con especificidad por una proteína calicreína.

Métodos adecuados para detectar interacciones entre una entidad química de prueba y una proteína calicreína, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse ultrafiltración con métodos de espectroscopia de masa-aspersión de iones/CLAR u otros métodos físicos y analíticos. Además, pueden usarse métodos de transferencia de resonancia de energía de fluorescencia (FRET) en los cuales la unión de dos entidades marcadas fluorescentes puede medirse midiendo la interacción de las marcas fluorescentes cuando están en estrecha proximidad entre sí.

Métodos alternativos para detectar la unión de una proteína calicreína a macromoléculas, por ejemplo, ADN, ARN, proteínas y fosfolípidos, incluyen una prueba de resonancia de plasmones de superficie, por ejemplo, como se describe en Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348. Dichos métodos pueden hacer uso de un polipéptido que es marcado, por ejemplo, con una marca radiactiva o fluorescente.

Otro método para identificar una entidad química que es capaz de unirse a una proteína calicreína, es uno en donde la proteína calicreína es expuesta al compuesto, y cualquier unión del compuesto a dicha proteína calicreína se detecta y/o se mide. Puede determinarse la constante de unión para la unión del compuesto a la proteína calicreína. Métodos adecuados para detectar y/o medir (cuantificar) la unión de un compuesto a una proteína calicreína son bien conocidos por los expertos en la técnica, y pueden llevarse a cabo, por ejemplo, usando un método capaz de mostrar operación de alto rendimiento, por ejemplo, un método basado en chips. Una nueva tecnología, denominada VLSIPS™, ha permitido la producción de chips extremadamente pequeños que contienen cientos de miles o más de diferentes sondas moleculares. Estos chips biológicos tienen sondas dispuestas en disposiciones, cada sonda asignada a un sitio específico. Se han producido chips biológicos en los cuales cada sitio tiene una escala de, por ejemplo, diez mieras. Los chips pueden usarse para determinar si las moléculas objetivo interactúan con cualquiera de las sondas en el chip. Después de que se expone la disposición a moléculas objetivo bajo condiciones de prueba seleccionadas, dispositivos de exploración pueden examinar cada sitio en la disposición y determinar si una molécula objetivo ha interactuado con la sonda en ese sitio.

Otro método para identificar compuestos con afinidad de unión por una proteína calicreina, es el sistema de dos híbridos de levadura, en donde los polipéptidos de la invención pueden usarse para "capturar" proteínas que se unen a la proteína calicreina. El sistema de dos híbridos de levadura se describe en Fields y Song, Nature 340: 245-246 (1989).

En una modalidad, la porción de unión puede comprender o consistir de un polipéptido.

Por ejemplo, la porción de unión puede comprender o consistir de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad de unión por una proteína calicreina, o una variante, fusión o derivado de dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, o una fusión de dicha variante o derivado del mismo, el cual retiene la especificidad de unión por la proteína calicreína.

De esta manera, en una modalidad del primer aspecto de la presente invención, la porción de unión puede ser un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.

Por el término "anticuerpo" se entienden moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas, así como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos (en donde por lo menos un aminoácido ha mutado respecto a los anticuerpos humanos de ocurrencia natural), anticuerpos de cadena sencilla, cuerpos bivalentes, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodímeros y heterodímeros de las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo, y fragmentos de unión al antígeno y derivados de los mismos.

Por el término "fragmento de unión al antígeno", se entiende un fragmento funcional de un anticuerpo que es capaz de unirse a una proteína calicreína. La afinidad de unión de los diferentes derivados de anticuerpo mencionados anteriormente puede determinarse con el método de Scatchard usando una concentración fija de fragmentos de anticuerpo inmovilizados y concentraciones variables del trazador Eu-PSA. En forma alternativa, la afinidad de unión puede determinarse usando la tecnología de la resonancia de plasmones de superficie (SPR) en un instrumento Biacore. Los métodos de análisis se describen adicionalmente en el ejemplo 8.

En particular, el fragmento de unión al antígeno se selecciona del grupo que consiste de fragmentos Fv (por ejemplo, Fv de cadena sencilla y Fv unido por enlaces disulfuro), fragmentos tipo Fab (por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos F(ab)2>, dominios variables sencillos (por ejemplo, dominios VH y VL) y anticuerpos de dominio (dAbs, que incluyen los formatos sencillo y doble [es decir, dAb-enlazador-dAb]).

Las ventajas de usar fragmentos de anticuerpo, más que anticuerpos enteros, son varias. El tamaño más pequeño de los fragmentos puede llevar a propiedades farmacológicas mejoradas, tales como mejor penetración del tejido sólido y/o depuración más rápida de la sangre, lo cual puede permitir mayores relaciones terapéuticas. Además, los fragmentos de unión al antígeno tales como los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb, pueden ser expresados en y secretados de microorganismos, tales como E. col¡, permitiendo de esta manera la producción fácil de grandes cantidades de dichos fragmentos.

Incluidas también dentro del alcance de la invención, son las versiones modificadas de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, por ejemplo, modificadas por la unión covalente de polietilenglicol u otro polímero adecuado (véase más adelante).

Métodos para generar anticuerpos y fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos por medio de cualquiera de varios métodos que usan la inducción de la producción in vivo de moléculas de anticuerpo, la selección de colecciones de inmunoglobulinas (Orlandi er a/., 1989. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86: 3833-3837; Winter et al., 1991 , Nature 349: 293-299) o la generación de moléculas de anticuerpo monoclonales por líneas de células en cultivo. Estos incluyen, pero no están limitados a, la técnica de hibridomas, la técnica de hibridomas de células B humanas, la técnica de hibridomas del virus de Epstein-Barr (EBV) (Kohler et al., 1975. Nature 256: 4950497; Kozbor et al., 1985, J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote et al., 1983. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; Colé et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62: 109-120).

Anticuerpos monoclonales adecuados para antígenos seleccionados pueden prepararse mediante técnicas conocidas, por ejemplo, las descritas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982).

Asimismo, pueden obtenerse fragmentos de anticuerpo usando métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manuaf , Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo de conformidad con la presente invención pueden prepararse mediante la hidrólisis proteolítica del anticuerpo o mediante la expresión en E. coli o células de mamífero (por ejemplo, cultivo de células de ovario de hámster chino u otros sistemas de expresión de proteínas) de ADN que codifica para el fragmento. En forma alternativa, pueden obtenerse fragmentos de anticuerpo mediante la digestión con pepsina o papaína de anticuerpos enteros, mediante métodos convencionales.

Los expertos en la técnica apreciarán que para la terapia o el diagnóstico en humanos, pueden usarse anticuerpos humanos o humanizados. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son anticuerpos quiméricos genéticamente diseñados o fragmentos de anticuerpo que tienen porciones mínimas derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos en los cuales regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo humano (anticuerpo receptor) son reemplazadas por residuos de una región determinante de complementariedad de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tenga la funcionalidad deseada. En algunos casos, los residuos de estructura Fv del anticuerpo humano son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la región determinante de complementariedad importada o secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones determinantes de complementariedad corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano y todas, o sustancialmente todas, las regiones de estructura, corresponden a aquellas de una secuencia consenso humana relevante. Los anticuerpos humanizados incluyen también óptimamente por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo, tal como una región Fe, derivada típicamente de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986. Nature 321 : 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596).

Métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, el anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos, referidos con frecuencia como residuos importados, se toman típicamente de un dominio variable importado. La humanización puede llevarse a cabo esencialmente como se describe (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321 : 522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536; documento US 4,816,567), sustituyendo regiones determinantes de complementariedad humanas con regiones determinantes de complementariedad de roedor correspondientes. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en donde sustancialmente menos que un dominio variable intacto de humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados pueden ser típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la región determinante de complementariedad y posiblemente algunos residuos de estructura, son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

Pueden identificarse también anticuerpos humanos usando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo colecciones de exhibición de fagos (véase, por ejemplo, Hoogenboom y Winter, 1991 , J. Mol. Biol. 227: 381 ; Marks et al., 1991 , J. Mol. Biol. 222: 581 ; Colé et al., 1985, en: Monoclonal antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; y Boerner et al., 1991 , J. Immunol. 147: 86-95).

Una vez que se obtienen anticuerpos adecuados, pueden ponerse a prueba para actividad, por ejemplo, mediante ELISA.

En una modalidad alternativa del primer aspecto de la invención, la porción de unión comprende o consiste de una porción de unión no de inmunoglobulina, por ejemplo, como se describe en Skerra, Curr Opin Biotechnol. Agosto de 2007; 18(4): 295-304.

En otra modalidad alternativa, la porción de unión comprende o consiste de un aptámero. Por ejemplo, el agente puede comprender o consistir de un aptámero de péptido o un aptámero de ácido nucleico (véase Hoppe-Seyler y Butz, 2000, J Mol Med. 78 (8): 426-30; Bunka DH y Stockiey PG, 2006, Nat Rev Microbiol. 4 (8): 588-96 y Drabovich et al., 2006, Anal Chem. 78 (9): 3171-8).

En otra modalidad alternativa, la porción de unión comprende o consiste de una pequeña entidad química. Dichas entidades con proteínas de unión a calicreína pueden identificarse seleccionando colecciones comerciales de pequeños compuestos (por ejemplo, como está disponible de ChemBridge Corporation, San Diego, USA).

Por consiguiente, la porción de unión presente en el agente de conformidad con el primer aspecto de la presente invención se une con especificidad a una proteína calicreína. En este contexto, la frase "se une con especificidad" significa que la porción de unión se une selectivamente a la proteína calicreína objetivo de preferencia a otras proteínas, incluyendo opcionalmente otras proteínas calicreína. El experto en la técnica está al tanto de numerosos métodos para evaluar la especificidad de unión de una molécula de unión a un objetivo. Por ejemplo, en donde la molécula de unión es, o se basa en, un anticuerpo, su capacidad para unirse específicamente a una proteína calicreína puede evaluarse mediante un inmunoensayo, tal como una ELISA, radioinmunoensayo, o similares.

En una modalidad, puede decirse que la porción de unión se une con especificidad a una proteína calicreína, si se une a la proteína calicreína en un inmunoensayo y/o bajo condiciones fisiológicas (tales como las condiciones encontradas en la próstata u otros sitios de tratamiento como se discute en la presente) con una afinidad de unión de más de 1x105, 1x106, 1x107, 2x107, 1x108, 2x108, 1x109, 2x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 1x1011 o más, tal como dentro de la escala de 1x105 a 3x1010, o más.

La porción de unión, como se usa en el primer aspecto de la presente invención, puede tener especificidad por una proteína calicreína humana. Una proteína calicreína humana es una serina proteasa que pertenece a la familia de genes de calicreína de tejidos humanos que se encontró consiste de por lo menos 15 miembros (Hsieh ML, Cáncer Res 1997; 57; 2651-6). Las calicreínas son glucoproteínas termoestables con una sola cadena de polipéptidos, con un peso molecular que varía entre 27 y 40 kDa.

La porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención puede tener especificidad por una proteína calicreína seleccionada del grupo que consiste de antígeno específico de próstata (PSA; hk3, calicreína humana 3) y calicreína glandular humana (hK2).

En una modalidad, la porción de unión tiene especificidad por el PSA. Se pretende que el término PSA incluya cualquier forma conocida de PSA, tal como PSA libre, formas precursoras de PSA, formas internamente melladas de PSA, PSA libre de bajo peso molecular, PSA libre de peso estándar, PSA maduro inactivo, formas truncadas de PSA, variantes de glucosilación de PSA, BPSA, pro-PSA inactivo, y cualquier complejo de PSA, tal como PSA unido a a1-antiqu¡motripsina (ACT), inhibidor de a1 -proteasa (API) y a2-macroglobulina (AMG). Un ejemplo de aminoácido primario de PSA se provee en la figura 13 (véase SEQ ID NO: 16).

El PSA secretado de las células cancerosas, está en un estado más activo en comparación con el PSA secretado de tejido con BPH. En el fluido extracelular, el PSA puede estar sujeto a degradación proteolítica, llevando de esta manera a pérdida de actividad y formación de complejos. De esta manera, está también dentro del alcance de la presente invención marcar compuestos o entidades, tales como ACT, API y AMG, unidos o complejados a/con PSA.

En una modalidad preferida, la porción de unión tiene especificidad por la isoforma libre (es decir, no complejada) del PSA en comparación con la isoforma complejada del PSA. Las porciones de unión con especificidad por la isoforma libre del PSA pueden tener especificidad de unión por un epítope que está expuesto en la isoforma libre del PSA, pero no está expuesto en la isoforma complejada del PSA, tal como un epítope conformacional (es decir, no lineal). Un ejemplo de dicho epítope conformacional se forma de residuos de aminoácido que son parte del bucle de calicreína que rodea a la hendidura catalítica del PSA, y puede incluir la tríada del sitio activo de His41 , Asn96 y Ser189. Véase Leinonen ef al., Clinical Chemistry 48: 12, 2208-2216 (2002) para más discusión y descripción de numerosos epítopes adecuados en el PSA, los cuales se incorporan en la presente como referencia.

En donde la porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención tiene especificidad por el PSA, entonces la porción de unión puede competir por la unión al PSA (tal como la isoforma libre del PSA), o un péptido que comprende el epítope reactivo del PSA unido por la porción de unión, con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de PSA30, 4D4, 5C3 y 5A10, y un fragmento de unión al antígeno del mismo. Más discusión de dichos anticuerpos pueden encontrarse en Pettersson et al., Clin. Chem, 41 : 10, 1480-1488 (1995); Nilsson et al., Brit. J. Cáncer, 75: 6, 789-797 (1997); Leinonen et al., Clinical Chemistry 48: 12, 2208-2216 (2002); Váisánen et al., Anal. Chem., 78: 7809-7815 (2006); Evans-Axelsson et al., Cáncer Biother. Radiopharm. 27: 4, 243-51 , documento EP 1 320 756 B1 ; y documento US 2004/101914, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia.

La secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera constituyentes del ejemplo de anticuerpo anti-PSA 5A10, se muestra a continuación (en la cual las secuencias de la CDR están subrayadas).

Cadena pesada de 5A10 E-VQLVESGPGiLQPSQT ^LTCSFSGFSLSTrG GVSWtRQPSGKGLEWLAHLYVVDED KRYNPSLKSRLTISEDSSRNQVFLKITSVGPADSATYYCARKGYYGYFDYWGQGTALTV SS [SEQ ID NO:1] Cadena ligera de 5A10 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVS CKASQNVNTDVAVWQQKPGQSPKALIPSTSYRSSG VPORFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYSNYPLTFGAGTKVDLISI [SEQ ID NO:2] En este contexto, el término "compite" incluye el significado de que la presencia del agente que comprende la porción de unión en una prueba competitiva junto con un anticuerpo de referencia seleccionado de PSA30, 4D4, 5C3 y 5A10, puede reducir el nivel de la unión detectable del anticuerpo de referencia al PSA (tal como el PSA libre), por 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% (por ejemplo, cuando el agente y el anticuerpo de referencia están presentes en la prueba en cantidades equimolares, y opcionalmente en donde la prueba se lleva a cabo bajo condiciones fisiológicas). Dicho análisis puede llevarse a cabo mediante una prueba inmuno-radiométrica (IRMA) como se describe en el ejemplo 9.

En donde la porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención tiene especificidad por el PSA, entonces la porción de unión puede comprender una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de PSA30, 4D4, 5C3 y 5A10 (como se muestra mediante las secuencias subrayadas en las SEQ ID NOS: 1 a 8 anteriores).

Como está bien establecido en la técnica, los anticuerpos completos comprenden seis CDRs, tres de las cuales están presentes en la cadena ligera variable (VL), y las otras tres están presentes en la cadena pesada variable (VH).

No es necesario que las moléculas de unión que contienen las seis CDRs de cualquiera de estos anticuerpos retengan la actividad de unión al antígeno, aunque en una modalidad, la molécula de unión puede comprender las seis CDRs de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de PSA30, 4D4, 5C3 y 5A10.

En forma alternativa, la porción de unión puede comprender menos de seis de las CDRs, tales como: • cinco CDRs (es decir, 3 CDRs de la región VH o VL, 2 CDRs de la otra región variable); • cuatro CDRs (es decir, 3 CDRs de la región VH o VL, 1 CDR de la otra región variable; o 2 CDRs de cada una de las regiones VH y VL); • tres CDRs (es decir, las tres CDRs de una de las regiones VH o VL, y ninguna de las otras; o 2 CDRs de la región VH O VL, 1 CDR de la otra región variable); • dos CDRs (es decir, dos CDRs de una de las regiones VH o VL, y ninguna de las otras; o 1 CDR de cada una de las regiones VH y VL); o • una CDR de cualquiera de las regiones VH o VL, de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de PSA30, 4D4, 5C3 y 5A10.

Es bien sabido en la técnica que tres o menos CDRs (en algunos casos, incluso sólo una CDR o una parte de la misma) son capaces de retener la actividad de unión al antígeno del anticuerpo del cual las CDRs se derivan; Laune et al. (1997), JBC, 272: 30937-44 - demuestran que una gama de hexapéptidos derivados de una CDR exhiben actividad de unión al antígeno (véase resumen), y observan que los péptidos sintéticos de una CDR individual completa exhiben fuerte actividad de unión (véase la página 30942, columna de la derecha).

Monnet et al. (1999), JBC, 274: 3789-96 - muestran que una gama de péptidos de 12 elementos y regiones de estructura asociadas tienen actividad de unión al antígeno (véase resumen), y comentan que un péptido tipo CDR3 solo es capaz de unirse al antígeno (véase la página 3785, columna de la izquierda).

Qiu et al. (2007), Nature Biotechnology, 25: 921-9 - demuestran que una molécula que consiste de dos CDRs enlazadas es capaz de unirse al antígeno (véase el resumen y la página 926, columna de la derecha).

Ladner et al. (2007), Nature Biotechnology, 25: 875-7 - es un artículo de revisión que reportan Qiu et al. (véase anteriormente), y comentan que moléculas que contienen dos CDRs son capaces de retener la actividad de unión al antígeno (véase la página 875, columna de la derecha).

Heap et al. (2005), J. Gen. Virol., 86: 1791-1800 - reportan que un "microanticuerpo" (una molécula que contiene una sola CDR) es capaz de unirse al antígeno (véase el resumen y la página 1791 , columna de la izquierda), y muestran que un péptido cíclico de un anticuerpo anti-VIH tiene actividad y función de unión al antígeno.

Nicaise et al. (2004) Protein Science, 13: 1882-91 - muestran que una sola CDR puede conferir actividad de unión al antígeno y afinidad por su antígeno de lisozima.

Vaughan y Sollazzo (2001), Combinatoríal Chemistry & High Throughput Screening, 4: 417-430 - es un artículo de revisión que describe minicuerpos que contienen menos de tres CDRs. Por ejemplo, en la página 418 (columna de la derecha - 3 de la estrategia de los inventores para el diseño), se describe un minicuerpo que incluye sólo las regiones hipervariables de CDR H1 y H2 entremezcladas dentro de regiones de estructura. Se describe que el minicuerpo es capaz de unirse a un objetivo.

Quiocho (1993), Nature, 362: 293-4 - es otro artículo tipo revisión que provee un resumen de la tecnología de minicuerpos (es decir, anticuerpos miniaturizados - en este caso con menos de tres CDRs).

Pessi et al. (1993), Nature, 362: 367-9 y Bianchi et al. (1994), J. Mol. Biol., 236: 649-59 - son artículos referidos en la revisión de Vaughan y Sollazzo, y describen el minicuerpo H1 y H2 y sus propiedades en más detalle.

Gao et al. (1994), J. Biol. Chem., 269: 32389-93 describen una cadena VL entera (incluyendo las tres CDRs) que tienen alta afinidad por su substrato, el péptido intestinal vasoactivo, como evidencia de que no es necesario tener las cadenas VH y VL.

Estos documentos se publicaron antes de la fecha de prioridad de la presente solicitud, y por lo tanto no habrían estado disponibles para el experto en la técnica cuando se implementa la presente invención. Proveen clara evidencia de que moléculas que tienen menos de seis CDRs pueden ser capaces de retener las propiedades de unión al antígeno de los anticuerpos para los cuales se derivan.

En una modalidad preferida, en donde la porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención tiene especificidad por el PSA, entonces la porción de unión es un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno o derivado del mismo, que comprende las seis CDRs del ejemplo de anticuerpo anti-PSA 5A10.

En una modalidad alternativa, en donde la porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención tiene especificidad por el PSA, entonces la porción de unión puede comprender o consistir de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de PSA30, 4D4, 5C3 y 5A10, y fragmentos de unión al antígeno del mismo.

En otra modalidad del primer aspecto de la presente invención, la porción de unión tiene especificidad por la calicreína glandular humana (hK2).

Se pretende que el término hK2 incluya todas las formas isoméricas de la hK2, y cualquier molécula o proteína en complejo con la hK2. Un ejemplo de secuencia de hK2 se describe como el transcrito: KLK2-201 (ENST00000325321), un producto del gen ENSG00000167751 , como se da en la base de datos del ensamble que puede encontrarse en la siguiente dirección en la world-wide-web como: er^mbl.org Homo_sap®nsfTramcflpt^ r=19:51376689-51383822;t=ENST00000325321 y tiene la siguiente secuencia: WDLVLSIAL SVGCTGAVPL IQSRtVGGWE CEKHSQPWQV AVYSHGWAHC GGVLVHPQWV LTAAHCLKKN SQVWLGRHNL FEPEDTGQRV PVSHSFPHPL YN SLLKHQS LRPDEDSSHD LMLLRLSEPA KITDWKVLG LPTQEPALGT TCYASGWGSÍ EPEEFLRPRS LQCVSLHLLS ND CARAYSE KvTEFMLCAG LWTGGKDTCG GDSGGPLVCN GVLQGITSWG PEPCALPEKP AVYTKWHYR KWIKDTÍAAN P [SEQ ID NO:3] La mayor parte de la hK2 encontrada en el plasma seminal es inactiva y complejada con el inhibidor de la proteína C (PCI). También es posible que la hK2 forme complejos con otros inhibidores de proteasa extracelulares. Estudios in vitro muestran que la hK2 puede unirse a a2- antiplasmina (a2-AP), ACT, AMG, anti-trombina III (ATIII), inactivador C1 e inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI-1).

De esta manera, está también dentro del alcance de la presente invención marcar compuestos, moléculas, proteínas o cualquier otra entidad, tales como PCI, a2-antiplasmina (a2-AP), ACT, AMG, anti-trombina III (ATIII), inactivador C1 e inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI-1), unidos o complejados a/con la hK2.

En una modalidad, la porción de unión puede tener especificidad por la ¡soforma libre (es decir, no complejada) de la hK2, en comparación con la isoforma complejada de la hK2. Las porciones de unión con especificidad por la isoforma libre de la hK2 pueden tener especificidad de unión por un epítope que está expuesto en la isoforma libre de la hK2, pero no está expuesto en la isoforma complejada de la hK2, y este puede ser un epítope lineal o un epítope conformacional (es decir, no lineal). Por ejemplo, la porción de unión puede tener especificidad por un epítope que incluya uno o más residuos de aminoácido que sean parte de la hendidura catalítica de la hK2 que está expuesta en la hK2 libre y no expuesta en una isoforma complejada, tal como la forma presente en el fluido seminal cuando la hK2 está complejada con el PCI. El mapeo de epítopes de la hK2 se describe en Váisánen ef al., Clinical Chemistry 50: 9, 1607-1617 (2004), cuya descripción se incorpora en la presente como referencia.

En donde la porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención tiene especificidad por la hK2, entonces la porción de unión puede completar la unión con la hK2, o un péptido que comprende el epítope reactivo de la hK2 unido por la porción de unión, con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de 11 B6 y 7G1. Más discusión de dichos anticuerpos puede encontrarse en Váisánen et al., Clinical Chemistry, 50: 9, 1607-1617 (2004); y Váisánen et al., Anal. Chem., 78: 7809-7815 (2006), cuyo contenido de cada una de estas citas se incorpora en la presente como referencia.

La secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera constituyentes del ejemplo de anticuerpo anti-hK2 11 B6, se muestra a continuación (en la cual las secuencias de la CDR están subrayadas).

Cadena pesada de 11 B6 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAW WIRQFPeN LEWMGYISYSGST TYSPSU^SRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:4] Cadena ligera de 1 1 B6 DIVlTQSPAS VSLGQRATISCRASESVEYFGTSL HVVYROKPGQPP LLtYA^NVgS GVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGT LEIK [SEQ 10 N0:5] En este contexto, el término "compite" incluye el significado de que la presencia del agente que comprende la porción de unión en una prueba competitiva junto con un anticuerpo de referencia seleccionado de 11 B6 y 7G1 , puede reducir el nivel de la unión detectable del anticuerpo de referencia a la hK2, por 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% (por ejemplo, cuando el agente y el anticuerpo de referencia están presentes en la prueba en cantidades equimolares, y opcionalmente en donde la prueba se lleva a cabo bajo condiciones fisiológicas). Dicho análisis puede llevarse a cabo mediante una prueba inmuno-radiométrica (IRMA) como se describe en el ejemplo 9.

En donde la porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención tiene especificidad por la hK2, entonces la porción de unión puede comprender una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de 11 B6 y 7G1 (como se muestra mediante las secuencias subrayadas en las SEQ ID NOS: 10 a 13 anteriores).

No es necesario que las moléculas de unión que contienen las seis CDRs de cualquiera de estos anticuerpos retengan la actividad de unión al antígeno, aunque en una modalidad, la molécula de unión puede comprender las seis CDRs de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de 11 B6 y 7G1.

En forma alternativa, la porción de unión puede comprender menos de seis de las CDRs, tales como: • cinco CDRs (es decir, 3 CDRs de la región VH o VL, 2 CDRs de la otra región variable); • cuatro CDRs (es decir, 3 CDRs de la región VH o VL, 1 CDR de la otra región variable; o 2 CDRs de cada una de las regiones VH y VL); • tres CDRs (es decir, las tres CDRs de una de las regiones VH o VL, y ninguna de las otras; o 2 CDRs de la región VH o VL, 1 CDR de la otra región variable); • dos CDRs (es decir, dos CDRs de una de las regiones VH o VL, y ninguna de las otras; o 1 CDR de cada una de las regiones VH y VL); o • una CDR de cualquiera de las regiones VH O VL, de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de 11 B6 y 7G1.

En una modalidad preferida, en donde la porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención tiene especificidad por la hK2, entonces la porción de unión es un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno o derivado del mismo, que comprende las seis CDRs del ejemplo de anticuerpo anti-hK2 1 1 B6 (véase las secuencias subrayadas de SEQ ID NOs: 4 y 5).

En una modalidad alternativa, en donde la porción de unión como se usa en el primer aspecto de la presente invención tiene especificidad por la hK2, entonces la porción de unión puede comprender o consistir de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de 11 B6 y 7G1 , y fragmentos de unión al antígeno del mismo.

Opcionalmente, el agente usado en el primer aspecto de la presente invención puede comprender además una porción terapéutica. Por consiguiente, el agente puede comprender, o consistir, de una porción de unión como se describió anteriormente y una porción terapéutica. La porción de unión puede ser enlazada directamente, o indirectamente, a la porción terapéutica.

En caso de que el agente pueda comprender, o consista, de una porción de unión como se describió anteriormente y una porción terapéutica, entonces el agente puede exhibir características de captación de tumores, por ejemplo, como se pone a prueba bajo las condiciones usadas en los ejemplos más adelante, sustancialmente equivalentes a las características de captación de tumores de un agente que consiste de la porción de unión sola. En este contexto, la expresión sustancialmente equivalente incluye el significado de más de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o sustancialmente 100%.

Puede usarse cualquier porción terapéutica adecuada. Una porción terapéutica adecuada es una que es capaz de reducir o inhibir el crecimiento, o en particular de destruir, una célula de cáncer de próstata. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser una porción citotóxica. Una porción citotóxica puede comprender o consistir de uno o más radioisótopos. Por ejemplo, cada uno de los uno o más radioisótopos puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste de emisores beta, emisores Auger, emisores de electrones de conversión, emisores alfa, y emisores de baja energía de fotones. Puede desearse que los uno o más radioisótopos tengan cada uno independientemente, o tengan un patrón de emisión de energía localmente absorbida, que crea una alta dosis absorbida en la vecindad del agente. Ejemplos de radioisótopos pueden incluir emisores beta de largo alcance, tales como 90Y, 32P, 186Re/188Re; 166Ho, 76As/77As, 89Sr, 153Sm; emisores beta de alcance medio, tales como 1311, 177Lu, 67Cu, 161Tb, 105Rh; emisores beta de baja energía, tales como 45Ca o 35S; emisores Auger o de conversión, tales como 5 Cr, 67Ga, 99Tcm, 11ln, 114mln, 23l, 125l, 201TI; y emisores alfa, tales como 2 2Bi, 213Bi, 2 3Ac, 225Ac, 21 Pb, 55Fm, 223Ra, 1 9Tb y 221At. Otros ejemplos de radionúclidos terapéuticos pueden verse en la figura 8. Otros radionúclídos están disponibles y será posible usarlos para terapia. En otra modalidad, puede desearse que la porción terapéutica o porción citotóxica no sea una porción que se describe como un "trazador" en el documento WO 2006/087374 A1 , en particular en la página 11 , renglones 7 a 15 del mismo.

En una modalidad preferida, la porción terapéutica es 177Lu. Por ejemplo, el agente puede ser una forma marcada con 77Lu del anticuerpo anti-hK2 11 B6, o de un fragmento de unión al antígeno o derivado del mismo.

En forma alternativa, la porción terapéutica comprende o consiste de uno o más fármacos terapéuticos (tales como fármacos citotóxicos), por ejemplo, un fármaco citostático; un fármaco antiandrógenos; cortisona y derivados de la misma; un fosfonato; un inhibidor de testosterona-5-a-reductasa; un adendo de boro; una citocina; tapsigargina y sus metabolitos; una toxina (tal como saporina o caliqueamicina); un agente quimioterapéutico (tal como un antimetabolito); o cualquier otro fármaco terapéutico o citotóxico útil en el tratamiento del carcinoma prostético.

Ejemplos de fármacos terapéuticos/citotóxicos pueden incluir, por ejemplo: • Citostáticos, en particular aquellos con efectos secundarios limitativos de la dosis que incluyen, pero no están limitados a, ciclofosamida, clorambucilo, ifosfamida, busulfán, lomustina, taxanos, fosfato de estramustina y otras mostazas de nitrógeno, antibióticos (que incluyen doxorrubicina, conformidad con la presente invención, habrá el potencial del uso de la radiación sincrotrónica (o rayos X de baja energía) para el adelanto de la radioterapia, enfocándose principalmente en la denominada radioterapia de foto-activación (PAT), en la cual la deposición de energía local de la irradiación de rayos X externa es aumentada en el tejido canceroso por la interacción con un agente de focalización tumoral de alto Z pre-administrado; véase la figura 9.

La modalidad de tratamiento con PAT utiliza rayos X monocromáticos de una fuente de sincrotrones, tal como la provista por la ID17 Biomedical Beamline en la European Synchrotron Radiation Facility, ESRF (Instalación de Radiación Sincrotrónica Europea), en Grenoble, y como se anticipa estará disponible en otras instalaciones en el futuro, tales como la nueva Instalación Sincrotrónica Sueca, Max-IV.

Como otra modalidad de tratamiento potencial, la investigación sobre la "terapia de tumores con electrones Auger inducidos", es la venidera European Spallation Source (ESS) en Lund, y esperanzadamente una estación médica experimental. Neutrones térmicos y semi-térmicos producidos por un reactor se han usado desde hace tiempo para la Boron-Neutron-Capture-Therapy, BNCT (Terapia con Captura de Neutrotes de Boro), tanto para experimentos pre-clínicos como para el tratamiento de tumores de cerebro con las partículas alfa inducidas y el retroceso del núcleo (7L), que dan una alta energía localmente absorbida. Un procedimiento similar es usar caliqueamicinas y esperamicina), alcaloides de vincapervinca, azaridinas, compuestos que contienen platino, endostatina, alquilsulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, enzimas, urea sustituida, derivados de metil-hidrazina, daunorrubicina, aminas antipáticas; • Antiandrógenos tales como flutamida y bikalutamida y metabolitos de las mismas; • Cortisona y derivados de la misma; • Fosfonatos tales como difosfonato y bufosfonato; • Inhibidores de testosterona-5-a-reductasa; • Adendos de boro; • Citocinas; • Tapsigargina y sus metabolitos; • Otros agentes usados en el tratamiento del carcinoma prostético.

En forma alternativa, la porción citotóxica comprende o consiste de una o más porciones adecuadas para su uso en la terapia de activación, tales como la terapia de activación por fotones, terapia de activación por neutrones, terapia con electrones Auger inducidos por neutrones, terapia con irradiación sincrotrónica o terapia de activación por fotones - rayos X de baja energía.

Por ejemplo, con los agentes de focalización tumoral de neutrones y moléculas de focalización tumoral adecuadas marcadas con núcleos estables con alta sección transversal para neutrones. Anticuerpos o péptidos pueden ser marcados, por ejemplo, con gadolinio estable ( 57Gd), y actúan como la molécula objetivo para los neutrones que son capturados por el núcleo de Gd, denominada también Gadolinium Neutrón Capture Therapy, GdNCT (Terapia con Captura de Neutrotes de Gadolinio). Mediante técnicas Monte Cario, la distribución de la dosis en el tumor y los tejidos circundantes se calcula como resulta de fotones gamma, neutrones y retrocesos del núcleo, asi como rayos X característicos, y electrones Auger y de conversión interna de gadolinio u otros elementos potenciales.

Como se discutió anteriormente, la porción terapéutica (tal como un radioisótopo, porción citotóxica o similares) puede ser enlazada directamente, o indirectamente, a la porción de unión (tal como un anticuerpo o fragmento del mismo). Enlazadores adecuados se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, grupos prostéticos, enlazadores no fenólicos (derivados de benzoatos de N-succimidilo; dodecaborato), porciones quelantes de quelantes acíclicos y macrocíclicos, tales como derivados de ácido 1 ,4,7,10-tetraazaciclododecano-1 ,4,7,10,tetraacético (DOTA), derivados de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), derivados de ácido S-2-(4-lsotiocianatobencil)-1 ,4,7-triazaciclononano-1 ,4,7-triacético (NOTA) y derivados de ácido 1 ,4,8,11-tetraazaciclodocedan-1 ,4,8,1 1-tetraacético (TETA) y otras porciones quelantes. El uso de dichos enlazadores puede ser particularmente apropiado en circunstancias en donde el agente comprende o consiste de un anticuerpo o fragmento del mismo como la porción de unión enlazada, por medio de un enlazador, a un radioisótopo como la porción terapéutica.

Un enlazador preferido es DTPA, como se usa, por ejemplo, en DTPA-11B6 marcado con 177Lu.

Opcionalmente, el agente usado en el primer aspecto de la presente invención puede (o puede no) comprender además una porción detectable. Por ejemplo, una porción detectable puede comprender o consistir de un radioisótopo, tal como un radioisótopo seleccionado del grupo que consiste de: Tecnecio-99m; lndio-111 ; Galio-67; Galio-68; Arsénico-72; Zirconio-89; Yodo-123, Yodo-124, Yodo-125; Talio-201. Opcionalmente, el agente puede comprender un par de radionúclidos detectables y citotóxicos, tales como ^?/9^ 0 124l/211At. En forma alternativa, el agente puede comprender un radioisótopo que sea capaz de actuar simultáneamente en una manera multimodal como una porción detectable, y también como una porción citotóxica, para proveer los denominados "teragnósticos multimodalidad". Las porciones de unión pueden ser acopladas de esta manera a nanopartículas que tengan la capacidad de formación de imágenes múltiples (por ejemplo, SPECT, PET, MRI, óptica o ultrasonido) junto con la capacidad terapéutica usando fármacos citotóxicos, tales como radionúclidos o agentes de quimioterapia. Incluida también con la presente invención, es la posibilidad de tratamiento mediante hipertermia usando campos magnéticos alternos de alta frecuencia y formación de imágenes de ultrasonido acompañada. Véase, por ejemplo, la figura 10.

En forma alternativa, la porción detectable puede comprender o consistir de un isótopo paramagnético, tal como un isótopo paramagnético que se selecciona del grupo que consiste de gadolinio-157, manganeso-55, disprosio-162, cromo-52 y hierro-56.

En caso de que el agente usado en el primer aspecto de la presente invención comprenda una porción detectable, entonces la porción detectable puede ser detectable mediante una técnica de formación de imágenes, tal como SPECT, PET, MRI, o formación de imágenes óptica o por ultrasonido.

Las porciones terapéuticas y detectables pueden ser conjugadas o de otra manera combinadas con la porción de unión usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, la terapia de inmunoconjugados existente, gemtuzumab ozogamicina [nombre comercial: Mylotarg®)], comprende un anticuerpo monoclonal enlazado a la citotoxina caliqueamicina).

En otra modalidad, el agente usado de conformidad con el primer aspecto de la invención se usa para tratar el cáncer de próstata en la forma de una formulación que comprende una población de moléculas del agente. En una opción, la totalidad (o sustancialmente la totalidad de las moléculas, tal como más de 90%, 95%, 99%, 99.9% o más, en peso) de las moléculas del agente en la población usadas para el tratamiento, comprenden la misma porción terapéutica. En otra opción, la población comprende una mezcla de otros agentes con diferentes porciones terapéuticas. Esta opción dará posibilidades para aumentar los efectos de la terapia con radionúclidos elegidos como objetivo (focalizados) usando varios agentes tales como agentes de quimioterapia, agentes de terapia hormonal u otra combinación de terapias en las cuales el agente de focalización no sólo suministra radionúclidos terapéuticamente activos hacia antígenos asociados con tumores, sino también radiosensibiliza simultáneamente las células tumorales focalizadas desencadenando una cascada de señalización intracelular. Esta opción es también útil en el tratamiento del cáncer de próstata con una mezcla de agentes citotoxicos, por ejemplo, usando un coctel de emisores alfa y diferentes alcances de emisores beta, o un coctel de radionúclidos con diferente alcance, LET (transferencia de energía lineal) y RBE (efecto biológico relativo), para el tratamiento combinado de grandes tumores, micrometástasis y células tumorales individuales. En una modalidad, pueden usarse emisores de largo alcance para el tratamiento de grandes tumores, y pueden usarse emisores de corto alcance para el tratamiento de tumores más pequeños tales como micrometástasis y células tumorales individuales.

Opcionalmente, el agente usado en el primer aspecto de la presente invención puede (o puede no) comprender además una porción para incrementar la vida media in vivo del agente. Ejemplos de porciones para incrementar la vida media in vivo del agente pueden incluir polietilenglicol (PEG), albúmina de suero humano, grupos de glucosilación, ácidos grasos y dextrán. Puede contemplarse particularmente el PEG.

En una modalidad de la invención, agentes que comprenden un agente de unión (por ejemplo, anticuerpo o fragmento del mismo) que son específicos para una proteína calicreína, tal como PSA o hK2, y un agente terapéutico, son entonces inyectados/infundidos en el cuerpo. Entonces, el agente se une a los tejidos que producen antígenos correspondientes, tales como PSA o hK2. Las estructuras biológicas, a las cuales el agente llega a ser unido, pueden tratarse posteriormente con un agente adecuado, y/o pueden usarse dosimetría y/o métodos de formación de imágenes de evaluación de terapia que incluyen PET/SPECT/CT/MR/óptica/ultrasonido.

En algunas circunstancias, las variaciones en el grado de atenuación de las células de cáncer de próstata por el agente pueden corresponder directamente a relaciones de producción y concentración de la calicreína objetivo (tales como PSA y hK2) en las células de cáncer de próstata del paciente. Estas variaciones pueden determinarse, por ejemplo, mediante los métodos del documento WO 2006/08734, cuyos métodos se incorporan en la presente como referencia, y se usan para obtener información terapéutica.

Por ejemplo, las visualizaciones pre-terapia de las uniones a anticuerpos de PSA y hK2, obtenidas de los métodos de formación de imágenes mencionados anteriormente, pueden combinarse con los métodos y usos de la presente invención. A partir de la medición de las atenuaciones, es posible determinar directamente si el tejido investigado está produciendo PSA, está produciendo hK2, o ambos. A la luz de esta determinación, será posible adaptar la terapia para que sea más eficiente. De esta manera, puede lograrse la terapia individualizada del paciente con la planeación de la dosis pre-terapia. La guía para la terapia individualizada del paciente puede tomarse de terapias conocidas en la técnica, tales como las discutidas en (1) Garkavij, et al. (2010) Cáncer, 116: 1084-1092; (2) Linden, et al. (1999) Clin. Cáncer Res., 5: 3287s-3291s; (3) Ljungberg, et al. (2003) Cáncer Biother. Radiopharm., 18: 99-107; (4) Minarik, et al. (2010) J. Nucí. Med., 51 : 1974-1978; (5) Sjogreen-Gleisner, et al. (2011) Q. J. Nucí. Med. Mol. Imaging, 55: 126-154; y (6) Sjogreen, et al. (2005) Cáncer Biother. Radiopharm., 20: 92-97; cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia.

Por consiguiente, en una modalidad, el primer aspecto de la invención implica tratar a un paciente que se ha determinado posee células de cáncer de próstata que producen PSA, con un agente de conformidad con el primer aspecto de la presente invención que tiene especificidad por el PSA.

En otra modalidad, el primer aspecto de la invención implica tratar a un paciente que se ha determinado posee células de cáncer de próstata que producen hK2, con un agente de conformidad con el primer aspecto de la presente invención que tiene especificidad por la calicreína glandular humana (hK2).

En otra modalidad, el primer aspecto de la invención implica tratar a un paciente que se ha determinado posee células de cáncer de próstata que están produciendo PSA y que están produciendo hK2, con un agente de conformidad con el primer aspecto de la presente invención que tiene especificidad por el PSA y la calicreína glandular humana (hK2), o una combinación de agentes uno de los cuales posee especificidad por el PSA y el otro posee especificidad por la hK2. En el caso de la terapia de combinación, los agentes pueden administrarse al paciente por separado, secuencialmente o simultáneamente, o pueden formularse como una mezcla en la misma composición farmacéutica.

La administración de un agente de conformidad con el primer aspecto de la presente invención a un paciente con cáncer de próstata, puede dar como resultado de esta manera en la unión de una proteína calicreína, tal como el antígeno específico de próstata (PSA; hK3, gen de calicreína humana 3) y/o la calicreína glandular humana (hK2), presente sobre o en las células de cáncer de próstata, y da como resultado la inhibición del crecimiento y/o la muerte de las células de cáncer de próstata en el paciente. Por ejemplo, el agente puede reducir la tasa de crecimiento, y/o la presencia, de células de cáncer de próstata en el paciente por cuando menos 10%, en particular por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, y más particularmente por 100% en comparación con la tasa de crecimiento observada, y/o la presencia, de células de cáncer de próstata en el paciente antes del tratamiento. Métodos para medir la tasa de crecimiento, y/o la presencia, de células de cáncer de próstata en un sujeto, se conocen en la técnica.

De esta manera, la invención provee métodos para el tratamiento del cáncer de próstata.

Por el término "tratamiento", se entiende el tratamiento terapéutico y profiláctico del paciente. El término "profiláctico" se usa para abarcar el uso de un agente, o formulación del mismo, como se describe en la presente, el cual previene o reduce la probabilidad del cáncer de próstata, o la propagación, diseminación o metástasis del cáncer de próstata localizado en un paciente o sujeto. El término "profiláctico" abarca también el uso de un agente, o formulación del mismo, como se describe en la presente, para prevenir la recurrencia del cáncer de próstata en un paciente quien ha sido tratado previamente por cáncer de próstata.

El cáncer de próstata que se va a tratar mediante el primer aspecto de la presente invención puede ser localizado hacia la próstata, o puede ser un cáncer de próstata no localizado (es decir, diseminado). El cáncer de próstata localizado hacia la próstata puede clasificarse, por ejemplo, como cánceres clínicos T1 o T2 de acuerdo con el sistema TNM (abreviado de tumor/nódulos/metástasis), mientras que el cáncer de próstata no localizado/diseminado puede clasificarse, por ejemplo, como cánceres clínicos T3 o T4.

El cáncer de próstata que se va a tratar mediante el primer aspecto de la presente invención puede ser cáncer de próstata metastásico. El término metástasis se refiere a la propagación de un cáncer de su sitio original hacia otros sitios en el cuerpo. Por ejemplo, el cáncer de próstata metastásico que se va a tratar puede ser una metástasis presente en el sistema linfático; en el hueso (incluyendo espina dorsal, vértebras, pelvis, costillas); metástasis dentro de la pelvis, el recto, la vejiga o la uretra. Las metástasis presentes en otros sitios menos comunes pueden tratarse también con la presente invención. Las metástasis pueden ser micrometástasis. La micrometástasis es una forma de metástasis en la cual los tumores recién formados son generalmente demasiado pequeños para ser detectados, o detectados con dificultad. Por ejemplo, la presente invención provee al experto en la técnica con medios para tratar células cancerosas individuales o grupos de células, incluso si la presencia de dichas células o grupos de células no son posibles de diagnosticar pero existen, por ejemplo, como enfermedad diseminada oculta.

Por consiguiente, se anticipa que una ventaja técnica particularmente importante del tratamiento provisto mediante la presente invención en comparación con los tratamientos de la técnica anterior del cáncer de próstata, es la eficacia mejorada en el tratamiento del cáncer de próstata diseminado y/o metastásico (incluyendo micrometastásico).

De esta manera, en una modalidad, la invención provee agentes y métodos para prevenir o tratar la metástasis de un tumor de próstata primario.

El cáncer de próstata tiende a desarrollarse en los hombres de más de cincuenta años de edad, más comúnmente en los hombres de más de 60, 65 o 70 años de edad, y aunque es uno de los tipos más frecuentes de cáncer en los hombres, muchos nunca tienen síntomas, no sufren terapia, y finalmente mueren de otras causas. Esto es porque el cáncer de la próstata es, en la mayoría de los casos, de crecimiento lento, libre de síntomas, y puesto que los hombres con la condición son más maduros, mueren con frecuencia de causas no relacionadas con el cáncer de próstata, tales como enfermedad cardiaca/circulatoria, neumonía, otros cánceres no relacionados, o vejez. Aproximadamente dos terceras partes de los casos de cáncer de próstata son de crecimiento lento, y la otra tercera parte es más agresiva y de desarrollo rápido.

Por consiguiente, el desarrollo de tratamientos efectivos del cáncer de próstata es particularmente importante para el manejo de las formas más agresivas y de desarrollo rápido del cáncer, en particular en el paciente más joven. Por consiguiente, en una modalidad, el primer aspecto de la invención se refiere al tratamiento del cáncer de próstata en un paciente que tiene menos de 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 o menos años de edad al momento del diagnóstico del cáncer de próstata y/o al momento del tratamiento.

Se piensa que los hombres que tienen un pariente de primer grado (padre o hermano) con cáncer de próstata, tienen el doble de riesgo de que desarrollen cáncer de próstata, y se piensa que aquellos con dos parientes de primer grado afectados, tienen un riesgo cinco veces mayor en comparación con los hombres sin historia familiar. Por consiguiente, el primer aspecto de la invención se refiere al tratamiento del cáncer de próstata en un paciente que se caracteriza porque uno, dos, o más, miembros de la familia, en particular miembros de la familia de primer grado (tales como un padre o hermano), han sido diagnosticados previamente con cáncer de próstata.

El primer aspecto de la invención se refiere también al tratamiento del cáncer de próstata en un paciente, en donde el cáncer de próstata que se va a tratar es cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). El CRPC puede caracterizarse porque típicamente se vuelve refractario al tratamiento hormonal después de uno a tres años, y reanuda el crecimiento a pesar de la terapia hormonal.

La presente invención provee también una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente como se definió anteriormente con respecto al primer aspecto de la presente invención y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Compuestos adicionales pueden incluirse también en las composiciones farmacéuticas, incluyendo agentes quelantes tales como EDTA, citrato, EGTA o glutatión.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse en una manera conocida en la técnica que sea suficientemente estable en almacenamiento y adecuada para administración a humanos y animales. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden ser liofilizadas, por ejemplo, a través de liofilización, secado por aspersión, enfriamiento por aspersión, o a través del uso de la formación de partículas a partir de la formación de partículas supercríticas.

Por el término "farmacéuticamente aceptable", se entiende un material no tóxico que no disminuye la efectividad de la actividad de unión a la proteína calicreína del agente de la invención. Dichos reguladores de pH, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoctava edición, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990), y Handbook of Pharmaceutical Excipiente, 3a. edición, A. Kibbe, ed., Pharmaceutical Press (2000), cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia).

Se pretende que el término "regulador de pH" se refiera a una solución acuosa que contiene una mezcla de ácido-base con el propósito de estabilizar el pH. Ejemplos de reguladores de pH son Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, OE3S, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazololáctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.

Se pretende que el término "diluyente" signifique una solución acuosa o no acuosa con el propósito de diluir el agente en la preparación farmacéutica. El diluyente puede ser uno o más de solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón o aceite de ajonjolí).

Se pretende que el término "adyuvante" indique cualquier compuesto añadido a la formulación para incrementar el efecto biológico del agente de la invención. El adyuvante puede ser uno o más de sales de zinc, cobre o plata con diferentes aniones, por ejemplo, pero no limitados a, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato y acetatos de diferente composición de acilo. El adyuvante puede ser también polímeros catiónicos tales como éteres de celulosa catiónicos, ésteres de celulosa catiónicos, ácido hialurónico desacetilado, quitosán, dendrímeros catiónicos, polímeros sintéticos catiónicos tales como poli(vinil imidazol), y polipéptidos catiónicos tales como polihistidina, polilisina, poliarginina y péptidos que contienen estos aminoácidos.

El excipiente puede ser uno o más de carbohidratos, polímeros, lípidos y minerales. Ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, glucosa, sacarosa, manitol y ciclodextrinas, los cuales se añaden a la composición, por ejemplo, para facilitar la liofilización. Ejemplos de polímeros son almidón, éteres de celulosa, celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carrageninas, ácido hialurónico y derivados del mismo, ácido poliacrílico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copollmeros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, alcohol polivinílico/acetato de polivinilo de diferente grado de hidrólisis, y polivínilpirrolidona, todos de diferente peso molecular, los cuales se añaden a la composición, por ejemplo, para el control de la viscosidad, para lograr bioadhesión, o para proteger el lípido de la degradación química y proteolítica. Ejemplos de lípidos son ácidos grasos, fosfolípidos, mono-, di- y tri-glicéridos, ceramidas, esfingolípidos y glucolípidos, todos de diferente longitud de cadena de acilo y saturación, lecitina de huevo, lecitina de soya, lecitina hidrogenada de huevo y soya, los cuales se añaden a la composición por razones similares a las de los polímeros. Ejemplos de minerales son talco, óxido de magnesio, óxido de zinc y óxido de titanio, los cuales se añaden a la composición para obtener beneficios tales como reducción de la acumulación de líquido o propiedades de pigmento ventajosas.

Los agentes de la invención pueden formularse en cualquier tipo de composición farmacéutica conocida en la técnica como adecuada para el suministro de los mismos.

En una modalidad, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en la forma de un liposoma, en el cual el agente se combina, además de otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como lípidos, los cuales existen en formas agregadas como micelas, monocapas insolubles y cristales líquidos. Lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. Lípidos adecuados incluyen también los lípidos modificados anteriormente por poli(etilenglicol) en el grupo de cabeza polar para prolongar el tiempo de circulación en el torrente sanguíneo. La preparación de dichas formulaciones liposomales puede encontrarse, por ejemplo, en el documento US 4,235,871 , cuya descripción se incorpora en la presente como referencia.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar también en la forma de microesferas biodegradables. Poliésteres alifáticos tales como ácido poli(láctico) (PLA), ácido poli(glicólico) (PGA), copolímeros de PLA y PGA (PLGA) o poli(caprolactona) (PCL) y polianhídridos, se han usado ampliamente como polímeros biodegradables en la producción de microesferas. Preparaciones de dichas microesferas pueden encontrarse en los documentos US 5,851 ,451 y EP 0 213 303, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia.

En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas de la invención se proveen en la forma de geles de polímero, en donde polímeros tales como almidón, éteres de celulosa, celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carrageninas, ácido hialurónico y derivados del mismo, ácido poliacrílico, polivinilimidazol, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, alcohol polivinílico/acetato de polivinilo de diferente grado de hidrólisis y polivinilpirrolidona, se usan para espesar la solución que contiene al agente. Los polímeros pueden comprender también gelatina o colágena.

En forma alternativa, los agentes pueden simplemente disolverse en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón o aceite de ajonjolí), goma de tragacanto, y/o varios reguladores de pH.

Se apreciará que las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir iones y un pH definido para la potenciación de la acción del agente activo. Además, las composiciones pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización, y/o pueden contener adyuvantes convencionales tales como conservadores, estabilizadores, agentes mojantes, emulsificantes, reguladores de pH, llenadores, etc.

Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la invención pueden administrarse por medio de cualquier vía adecuada conocida por los expertos en la técnica. De esta manera, vías de administración posibles incluyen las vías parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, parenteral y rectal. También es posible la administración a partir de implantes. La infusión puede ser una vía deseada debido a la citotoxicidad potencialmente alta del agente administrado.

En una modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por la vía parenteral, por ejemplo, por la vía intravenosa, intracerebroventricular, intraarticular, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea, o pueden administrarse mediante técnicas de infusión. Se usan convenientemente en la forma de una solución acuosa estéril la cual puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben ser convenientemente reguladas en su pH (por ejemplo, a un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas bajo condiciones estériles se logra fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, bacterióstatos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en contendores de dosis unitaria o de dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas y viales sellados, y pueden almacenarse en una condición liofilizada que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Suspensiones y soluciones para la inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo descrito previamente.

De esta manera, las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, intravenosa.

En forma alternativa, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse intranasalmente o por inhalación (por ejemplo, en la forma de una presentación de aerosol a partir de un contenedor, bomba, atomizador o nebulizador sometido a presión con el uso de un propelente adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluoro-metano, diclorotetrafluoro-etano, un hidrofluoroalcano tal como 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 o 1 ,1 ,1 ,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol sometido a presión, la unidad de dosificación puede determinarse proveyendo una válvula que suministre una cantidad dosificada. El contenedor, bomba, atomizador o nebulizador sometido a presión puede contener una solución o suspensión del polipéptido activo, por ejemplo, usando una mezcla de etanol y el propelente como el solvente, el cual puede contener además un lubricante, por ejemplo, trioleato de sorbitán. Cápsulas y cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador, pueden formularse para que contengan una mezcla pulverizada de un compuesto de la invención y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Las composiciones farmacéuticas se administrarán a un paciente en una dosis farmacéuticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva", o "cantidad efectiva" o "terapéuticamente efectiva", como se usa en la presente, se refiere a aquella cantidad que provee un efecto terapéutico para una condición y régimen de administración dados. Esta es una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir un efecto terapéutico deseado en asociación con el aditivo y diluyente requerido, es decir, un portador o vehículo de administración. Además, se pretende que signifique una cantidad suficiente para reducir y/o prevenir un déficit clínicamente significativo en la actividad, función y respuesta del hospedero. En forma alternativa, una cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para causar una mejora en una condición clínicamente significativa en un hospedero. Como los expertos en la técnica apreciarán, la cantidad de un compuesto puede variar, dependiendo de su actividad específica. Cantidades de dosificación adecuadas pueden contener una cantidad predeterminada de composición activa calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido. En los métodos y el uso para la fabricación de las composiciones de la invención, se provee una cantidad terapéuticamente efectiva del componente activo. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser determinada por el médico experto con base en las características del paciente, tales como la edad, el peso, el sexo, la condición, las complicaciones, otras enfermedades, etc., como es bien sabido en la técnica. La administración de la dosis farmacéuticamente efectiva puede llevarse a cabo mediante la administración individual en la forma de una unidad de dosis individual o también varias unidades de dosis más pequeñas, y también mediante administraciones múltiples de dosis subdivididas a intervalos específicos. En forma alternativa, la dosis puede proveerse como una infusión continua durante un período prolongado.

El agente definido anteriormente con respecto al primer aspecto de la presente invención puede formularse a varias concentraciones, dependiendo de la eficacia/toxicidad del compuesto que está siendo usado. La formulación puede comprender el agente activo a una concentración de entre 0.1 µ? y 1 mM, entre 1 µ? y 500 µ?, entre 500 µ? y 1 Mm, entre 300 µ? y 700 µ?, entre 1 µ? y 100 µ?, entre 100 µ? y 200 µ?, entre 200 µ? y 300 µ?, entre 300 µ? y 400 µ?, entre 400 µ? y 500 µ? y aproximadamente 500 µ?.

Los expertos en la técnica apreciarán que las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos usados en el tratamiento de un cáncer de próstata, o antes, después o al mismo tiempo que el tratamiento del paciente con otras modalidades terapéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata, tales como cirugía (por ejemplo, prostatectomía radical), radioterapia, braquiterapia, radioterapia con haz externo, ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU), quimioterapia, fármacos quimioterapéuticos orales, criocirugía (congelación del tumor), terapia hormonal (tal como terapia antiandrógenos), castración, o combinaciones de los anteriores.

La presente invención provee también un kit que comprende un agente como se definió anteriormente con respecto al primer aspecto de la presente invención o una composición farmacéutica como se definió anteriormente.

La presente invención provee también un agente para su uso en medicina sustancialmente como se describe en la presente.

La presente invención provee también una composición farmacéutica sustancialmente como se describe en la presente.

La presente invención provee también el uso de un agente sustancialmente como se describe en la presente.

La presente invención provee también un método de tratamiento sustancialmente como se describe en la presente.

La presente invención provee también un kit sustancialmente como se define en la presente.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método terapéutico, cuyo método trata el cáncer de próstata primario y diseminado, con un agente como se definió anteriormente.

De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee un método de terapia, cuyo método puede usarse para tratar metástasis, tales como metástasis de glándulas linfáticas y/o metástasis óseas, que incluyen micrometástasis.

De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee un método terapéutico, cuyo método puede usarse en conjunto con o después de radioterapia externa, tratamientos citostáticos y antiandrógenos, u otros tratamientos no acoplados con anticuerpos/fragmentos terapéuticos de focalización tumoral.

De conformidad con aspectos específicos de la invención, se proveen anticuerpos marcados para terapia, que son específicos para PSA y/o hK2, cuyos anticuerpos marcados se usan para tratar el cáncer de próstata, es decir, tejido que produce PSA y/o hK2.

De conformidad con otro aspecto de la invención, se proveen los usos de dichos métodos.

El método de terapia de conformidad con la presente invención tiene la ventaja sobre la técnica anterior que permite la terapia del cáncer de próstata, y dicho método de terapia puede usarse también para tratar metástasis, que incluyen micrometástasis, tales como metástasis de glándulas linfáticas, o cualquiera de las otras formas de metástasis como se describieron anteriormente, y puede usarse junto con o después de un procedimiento postoperatorio, y durante o después de radiación, o tratamientos citostáticos o antiandrógenos.

La descripción anterior se enfoca en modalidades de la presente invención aplicables a un método terapéutico del cáncer de próstata. Sin embargo, se apreciará que la invención no se limita a esta aplicación, pero puede aplicarse a muchas otras combinaciones de terapia que incluyen, por ejemplo, metástasis, exámenes post-operatorios y exámenes durante o después de radiación, tratamientos citostáticos y antiandrógenos. Con respecto a la terapia de las metástasis, las metástasis se tratarán en las glándulas linfáticas.

En otra modalidad, puede usarse cirugía radioguiada (RGS) o cirugía guiada por imágenes (IGS), para identificar porciones de unión específicas anti-calicreína marcadas con trazadores como se describió anteriormente (tales como anticuerpos del PSA y/o la h 2) durante y/o antes de la cirugía. De esta manera, un agente que comprende una porción de unión y una porción detectable como se discutió anteriormente pueden administrarse durante y/o antes de la cirugía. En esta modalidad, el agente, tal como un anticuerpo anti-PSA y/o anti-hK2 marcado con trazadores, puede ser infundido primero. Después, puede usarse RGS/IGS para identificar al tejido que produce PSA/hK2 con un instrumento de detección sensible a la porción detectable, durante o antes de la cirugía. La porción detectable puede ser, por ejemplo, una porción detectable que emite radiación o sensible a un campo magnético; puede ser, por ejemplo, un emisor de radiación Cerenkov y/o Bremsstrahlung; puede ser una marca fluorescente y/o una marca magnética o magnetizable. Por consiguiente, la RGS/IGS de conformidad con la presente invención puede ser, por ejemplo, un método que se basa en la detección de radiación óptica, Cerenkov, Bremsstrahlung o beta; la detección de una marca de radionúclido; y/o puede implicar magnetometría. La RGS es bien conocida por los expertos en la técnica como una técnica quirúrgica que permite al cirujano identificar tejido "marcado" por la porción detectable.

Las visualizaciones obtenidas de acuerdo con lo anterior pueden combinarse con otros métodos de visualización radiológicos, tales como SPECT/PET, tomografía computada (CT), ultrasonido (US) y tomografía de resonancia magnética (MRT).

Por consiguiente, en un segundo aspecto, la presente invención provee también un agente que comprende o que consiste de una porción de unión con especificidad por una proteína calicreína (tal como se describió anteriormente con respecto al primer aspecto de la presente invención) y una porción detectable como se discutió anteriormente con respecto al primer aspecto de la presente invención, para su uso en medicina mediante la administración a un paciente con cáncer de próstata antes o durante la cirugía, tal como cirugía radioguiada o cirugía guiada por imágenes.

De esta manera, el segundo aspecto provee también el uso de un agente que comprende o que consiste de una porción de unión con especificidad por una proteína calicreína y una porción detectable, en la fabricación de un medicamento para administración a un paciente con cáncer de próstata antes o durante la cirugía, tal como cirugía radioguiada o cirugía guiada por imágenes.

El segundo aspecto de la presente invención provee también un método de cirugía, tal como cirugía radioguiada o cirugía guiada por imágenes, que se lleva a cabo en un paciente con cáncer de próstata, el método comprendiendo el paso de administrar una cantidad efectiva de un agente que comprende o que consiste de una porción de unión con especificidad por una proteína calicreína y una porción detectable al paciente antes o durante la cirugía.

Se contempla que cualquier método, agente o composición que se describe en la presente puede implementarse con respecto a cualquier otro método, agente o composición descrito en la presente.

El uso del término "un" o "una" cuando se usa en conjunto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la especificación, puede significar "uno", pero es también consistente con el significado de "uno o más", "por lo menos uno" y "uno o más de uno".

Estas y otras modalidades de la invención se apreciarán y entenderán mejor cuando se consideren en conjunto con la descripción anterior y los dibujos acompañantes. Sin embargo, debe entenderse que la descripción anterior, mientras que indica varias modalidades de la invención y numerosos detalles específicos de la misma, se da a manera de ilustración y no de limitación. Muchas sustituciones, modificaciones, adiciones y/o reordenamientos pueden hacerse dentro del alcance de la invención sin que se aparten del espíritu de la misma, y la invención incluye la totalidad de dichas sustituciones, modificaciones, adiciones y/o reordenamientos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las descripciones de los dibujos forman parte de la presente especificación, y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente.

La figura 1 muestra la cinética del anticuerpo PSA30 marcado con 125l en varios tejidos después de la administración intravenosa en ratones normales.

La figura 2 muestra la cinética del anticuerpo PSA30 marcado con 25l en varios tejidos después de la administración intravenosa en ratones implantados con el xenoinjerto de células tumorales metastásicas de próstata, y esto muestra que las células tumorales metastásicas de próstata muestran una fuerte captación del anticuerpo PSA30.

Las figuras 3A-3H muestran los resultados de la autorradiografía digital: Captación individualmente normalizada de PSA30 marcado con 125l (figura 3A) y colina marcada con 18F (figura 3B), 48 horas post-inyección de PSA30 marcado con 25l más 1 hora post-inyección de colina marcada, en la misma sección del tumor separada por el isótopo. El análisis histológico por medio de la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (figura 3C, figuras 3E-3F) y la expresión del PSA usando 2E9 de anticuerpo de PSA total (figura 3D, figuras 3G-3H) se verificaron usando secciones adyacentes. No existe asociación directa entre las áreas de alta captación del mAb PSA30 y alta captación de colina. Nota: se dejó que este ratón tuviera movimiento libre después de la inyección de colina marcada con 18F. 209x297 mm (300 x 300 DPI).

La figura 4 muestra la cinética del anticuerpo 5A10 marcado con 125l en varios tejidos después de la administración intravenosa en ratones normales.

La figura 5 muestra la cinética del anticuerpo 11B6 marcado con 125l en varios tejidos después de la administración intravenosa en ratones normales.

La figura 6 muestra la cinética del anticuerpo 11B6 marcado con 125l en varios tejidos después de la administración intravenosa en ratones implantados con el xenoinjerto de células tumorales metastásicas de próstata.

Captación por el órgano expresada como % de ??/g con el tiempo.

La figura 7 muestra la biodistribución de 11B6 marcado con 111ln en xenoinjertos LnCAP. La acumulación de la radiactividad alcanzó un pico después de 48 hpi con 16.4 ±1.92% de ??/g (por ciento de actividad inyectada por gramo). La captación en órganos normales (hígado, bazo, ríñones, hueso, próstata, testículos) está a un menor nivel. Se observó captación un poco elevada en las glándulas salivales, debido probablemente a una cierta expresión normal de la expresión de la hK2.

La figura 8 muestra ejemplos de algunos radionúclidos terapéuticos.

La figura 9 muestra una ilustración del principio de la PAT. En presencia de radiación externa de baja dosis, un agente de focalización tumoral de alto Z produce un gran aumento de la dosis absorbida local en las células tumorales focalizadas.

La figura 10 muestra un ejemplo de cómo pueden usarse nanopartículas para la formación de imágenes multimodalidad y la terapia por la unión a agentes de focalización tumoral como anticuerpos.

La figura 11 muestra las relaciones de tumor/sangre. La relación se incrementa con el tiempo, indicando una focalización activa de la hK2 con 1 B6 marcado con 111ln en tumores LnCAP.

La figura 12 muestra la biodistribución comparativa de 11B6 marcado con 111ln en xenoinjertos que expresan la hK2 (LnCAP) y xenoinjertos negativos para la hK2 (DU145) a 48 hpi. Los resultados mostraron una diferencia estadística significativa (p<0.005) entre los dos xenoinjertos en la acumulación de tumores, mientras que la acumulación de la radiactividad en la mayoría de los órganos normales se mantuvo al mismo nivel. LnCAP tuvo más de 3 veces más captación de tumores que DU145. Esto indica que el anticuerpo 11 B6 marcado con 1 1ln es específico de la hK2.

La figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos y la estructura de epítopes del PSA, de acuerdo con Leinonen, J. et al. Clin Chem 2002; 48: 2208-2216.

La figura 14A-14B muestra una gráfica de Scatchard de un ejemplo de 5A10-Fab.

La figura 15 muestra la cinética de marcación de 11 B6 marcado con 77Lu.

La figura 16 muestra la estabilidad ¡n vitro de 11 B6 marcado con 177Lu en PBS y EDTA.

La figura 17 muestra imágenes de SPECT representativas de 11 B6 marcado con 177Lu en xenoinjertos LnCAP.

La figura 18 muestra la biodistribución de 11 B6 marcado con 177Lu en xenoinjertos LnCAP.

La figura 19 muestra la biodistribución detallada a 72 h pi de 11 B6 marcado con 77Lu en xenoinjertos LnCAP.

La figura 20 muestra la biocinética in vivo de 11B6 marcado con Lu en xenoinjertos LnCAP.

La figura 21 muestra fotografías representativas del tamaño del tumor antes del tratamiento (imagen de la izquierda) y después del tratamiento (imagen de la derecha) con 1 B6 marcado con 177Lu.

La figura 22A-22C muestra un resumen del efecto de (22A) una sola dosis de 11 B6 marcado con 177Lu, (22B) doble dosis de 11B6 marcado con 177Lu, y (22C) tratamiento control sobre el tamaño del tumor en xenoinjertos LnCAP.

La figura 23A-23B muestra (23A) datos del crecimiento del tumor, y (23B) una imagen de SPECT para un ratón con xenoinjertos LnCAP tratado con una sola dosis de 11B6 marcado con 177Lu.

El cuadro A muestra las relaciones de tumor a órganos de PSA30 marcado con 25l después de la inyección intravenosa en ratones desnudos que poseen tumores subcutáneos basados en LNCaP en varios tiempos después de la inyección (n=34). Los mayores valores de la relación indican una mayor especificidad de la captación en el tumor que en el tejido identificado.

CUADRO A Relaciones de tumor a órgano (n = 34) Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades particulares de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y de esta manera puede considerarse que constituyen modos específicos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y que obtienen aún un resultado igual o similar sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Biodistribución de PSA30 marcado con 125l v 11B6 marcado con 25l Materiales y métodos: El PSA30 y el anticuerpo 11 B6 fueron marcados con 125l (PerkinElmer, USA), usando el método de yodogen. En resumen, un tubo de prueba recubierto con 150 pg de 1 ,3,4,6-tetracloro-3a,6a-difenil glucolurilo se usó para la marcación de 200 pg de PSA30. Después de que la mezcla se había incubado por 15 minutos a temperatura ambiente, se removieron los componentes de bajo peso molecular mediante filtración en gel (columna PD-10, GE Healthcare, Reino Unido). La pureza radioquímica fue de 95% después de la filtración en gel.

Resultados y discusión: Véase la figura 2 y el cuadro A. Los tumores LNCaP tuvieron mayor captación en comparación con otros órganos investigados en la mayoría de los puntos de tiempo, y alcanzaron un pico (4.32% de ??/g) a 24 h después de la inyección intravenosa de formulaciones de PSA30 marcado con 125l. En contraste con todos los demás órganos que muestran una disminución de actividad, los tumores LNCaP mostraron un incremento notable de actividad (alrededor de 32%) durante las primeras 24 horas después de la inyección. En comparación con los ratones que no poseen tumores, la acumulación en la tiroides fue ampliamente aumentada. La captación del mAb PSA30 marcado con 125l en los tumores LNCaP alcanzó un pico a 24 horas post-inyección, con una disminución aguda subsiguiente en la captación de tumores observada alrededor de 72 horas post-inyección. De modo importante, en este mismo punto de tiempo, existe un incremento agudo en la captación en la tiroides. Esta correlación inversa es un indicador probable de que ha ocurrido un efecto de deshalogenación. En conclusión, el PSA30 marcado con 125l puede focalizar efectivamente al fPSA en ratones con xenoinjertos basados en LNCaP.

EJEMPLO 2 Biodistribución de DTPA-11B6 marcado con 111ln Materiales y métodos: Los experimentos en animales se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación nacional sobre la protección de animales de laboratorio. El estudio en animales ha sido aprobado por el Comité de Ética local para la Investigación en Animales. Ratones machos desnudos inmunodeficientes (de 6 a 8 semanas) adquiridos de Taconic Europe (Bomholt, Dinamarca), se usaron para este estudio. Xenoinjertos de células de carcinoma de próstata LnCAP que expresan la hK2 fueron implantados subcutáneamente en el flanco derecho. Para el xenoinjerto, células LNCaP, 5.2 x 106 células/ratón en 100 pL de medio de células y 100 pL de Matrigel (BD Sciences, Bedford, USA), células DU145 (una línea de células negativa para hK2), 1-2 x 106, fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho para servir como control negativo. Tres a seis semanas post- inyección de las células LNCaP, 5 grupos de ratones (4 a 5 animales/grupo) que poseen xenoinjertos LNCaP, y 1 grupo (3 animales/grupo) que posee xenoinjertos DU145, fueron cada uno inyectados vía intravenosa con 100 µ? de DTPA-11 B6 marcado con 111ln (~200 kBq en 100 µ? y 22.5 pg de proteína). Los animales fueron retirados en un diferente punto de tiempo, 4h, 24h, 48h, 72h o 168h p.i., y el grupo control a 48h p.i. Los órganos de interés (véase el cuadro) fueron puestos en viales de 20 mi para el conteo de la escintilación (Zinsser Analytic, Frankfurt, Alemania), pesados y medidos en un contador gamma automatizado con detector de 7.62 cm Nal(TI) (1480 Wizard OY, Wallac, Turku, Finlandia). Todos los órganos fueron medidos dos veces después de la disección y después del último punto de tiempo. La medición de la radiactividad se llevó a cabo como un protocolo estándar a continuación.

Medición de la radiactividad: Se usó un protocolo estándar para la medición de un radionúclido. Los conteos por minuto corregidos con el nivel de fondo se usaron para la evaluación. El valor de la captación en el tejido, expresado como por ciento de dosis inyectada por gramo de tejido (% de ID/g), se calculó como: % de ID/g = (radiactividad en el tejido/radiactividad inyectada)/peso del órgano x 100, en donde para las inyecciones iv: Radiactividad inyectada: radiactividad promedio en jeringas control - radiactividad en la jeringa usada - radiactividad en la cola.

Resultados y discusión: Véase las figuras 7, 11 y 12: Los resultados preliminares mostraron que 11 B6 marcado con 111ln fue acumulado efectivamente en el tumor con el tiempo, alcanzando un pico a 48 hpi con 16.4 ±1.92% de ??/g (por ciento de actividad inyectada por gramo). La captación de la radiactividad en órganos normales (hígado, bazo, ríñones, hueso, próstata, testículos) está a un menor nivel. Se observó captación un poco elevada en las glándulas salivales, debido probablemente a una cierta expresión normal de la expresión de la hK2 (figura 7). Esto se investigará adicionalmente en estudios futuros. Además, DTPA-11B6 marcado con 1 In fue específico de la hK2, puesto que fue significativamente menos captado en los xenoinjertos control negativos DU145 (figura 12). La relación tumor/sangre se incrementó con el tiempo, indicando que más y más de DTPA-11B6 marcado con 111ln fue captado en el tumor (figura 11). En conclusión, los datos de la biodistribución de DTPA-11B6 marcado con 1 1ln muestran propiedades prometedoras de focalización tumoral en el cáncer de próstata, indicando potencial para la terapia del carcinoma de próstata usando otros radionúclidos.

EJEMPLO 3 Formación de imágenes de autorradiografía digital Materiales y métodos: Se llevó a cabo DAR en animales inyectados con PSA marcado con 125l y colina marcada con 18F. Los animales fueron sometidos a eutanasia una hora post-inyección de sondas metabólicas, y los tumores fueron inmediatamente removidos, asegurados en Cryomount (HistoLab products AB, Suecia), rápidamente congelados en nitrógeno líquido y cortados en secciones de 100 pm para DAR, o secciones de 20 µ?? para análisis de histopatología e inmunohistoquímica (IHC). Un sistema basado en un detector de tira de silicio (Biomolex 700 Imager; Bimolex AS, Oslo) se usó para representar la distribución de la radiactividad dentro de las secciones más gruesas. Las diferencias en los espectros de emisión y la tasa de descomposición se usaron para producir imágenes separadas de cada radionúclido en los animales inyectados con más de un radionúclido, en este caso, 125l y 18F.

Resultados y discusión: Véase los resultados en las figuras 3A-3H. Con base en estos datos, se demuestra que la captación del mAb PSA30 en los tumores extirpados alcanzó un pico a 24 horas post-inyección intravenosa, y es retenido en el tumor en comparación con los tejidos normales. Las relaciones T/O relativamente bajas (véase el cuadro A) pueden atribuirse a factores tales como: Una barrera para el sitio de unión, vista cuando una baja dosis de anticuerpo es saturada por los antígenos fPSA en el espacio perivascular, previniendo de esta manera la penetración más profunda en el tumor sólido; permeabilidad vascular insuficiente dentro del tumor; o desyodación del anticuerpo (como es sugerido por la alta acumulación de yodo en la tiroides). Dos maneras de mejorar las relaciones T/O sería incrementar la dosis del anticuerpo y poner a prueba diferentes marcas radiactivas. A pesar de este inconveniente, se encontró una acumulación de la actividad de PSA30 marcado con 125l en el tejido tumoral.

Inmunohistoquímica e histopatología (véase los resultados en las figuras 3A-3H). Para estudiar el PSA, criosecciones del tumor de 20 µ?? (congeladas y aseguradas como se describió anteriormente) fueron examinadas usando IHC. La inmunorreactividad contra el PSA o la hK2 se visualizó mediante el uso del kit del sistema DAKO EnVision Flex/HRP (Dako Corporation). Secciones de tumor adyacentes fueron teñidas también con hematoxilina (colorante para los núcleos) y eosina (colorante citoplásmico), y la morfología general se analizó bajo un microscopio de transiluminación estándar. Con la tinción con hematoxilina y eosina, se tiñeron regiones viables de las secciones y áreas necróticas del tumor. Como control positivo, secciones de tumores LNCaP fueron incubadas con 2E9 de mAb PSA a una dilución de 1 :1000 y visualizadas como se describió anteriormente. Como control negativo, la sección del tumor de un ratón que recibió una inyección intravenosa de PSA30 se visualizó sin la incubación de un anticuerpo secundario, pero incluyendo todos los demás pasos de la IHC. Las secciones teñidas fueron exploradas usando el escáner de un microscopio Cari Zeiss MIRAX Sean, y vistas con el software MIRAX Viewer (Cari Zeiss Imaging Solutions GmbH, Alemania).

EJEMPLO 4 Radiomarcación Yodación directa (125l/124l/131l): Se mezclaron proteínas (10 µ?, 1 mg/ml en PBS) con 125l como solución de Nal (4 MBq) usando el método de cloramina-T (CAT, Sigma St. Louis, MO, USA). La reacción se inició añadiendo CAT en PBS (10 µ?, 2 mg/ml) y se incubó por 1 minuto con agitación vigorosa, y entonces concluyó añadiendo metabisulfito de sodio (20 µ?, 2 mg/ml). Las proteínas marcadas fueron separadas del 125l sin reaccionar, y los componentes de la reacción de bajo peso molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna NAP-5 (Sephadex G-25, GE Healthcare) pre-equilibrada con PBS.

Yodación indirecta (125l/124l/13 l/211At): El precursor de marcación, p-(trimetilestanil)benzoato de N-succinimidilo (SPMB), se preparó de acuerdo con Orlova et al., en Nucí Med Biol 27: 827-835 (2000), y se añadieron 5 pg de SPMB a 5 MBq de 125l o 211At en una solución de ácido acético a 5%. Para iniciar la reacción, se añadieron 40 µg de cloramina-T (Sigma, St. Louis, Mo.) en solución acuosa. La mezcla de reacción se agitó por 5 minutos, y se añadieron 80 µg de metabisulfito de sodio (Aldrich, Steinheim, Alemania) en solución acuosa para detener la reacción. El precursor radiomarcado se añadió a 40 µg de solución de proteína en regulador de pH de borato 0.07 M, pH 9.2. La reacción de acoplamiento se llevó a cabo a temperatura ambiente por 45 minutos con agitación continua. Las variantes de proteína marcadas se separaron de los productos de bajo peso molecular usando una columna de exclusión por tamaño NAP™-5 (GE, Healthcare) equilibrada con PBS. Las variantes de proteína radiomarcadas se analizaron entonces mediante una prueba de IRMA (de acuerdo con Evans et al., referido a CBR), para verificar que el procedimiento de marcación no hubiese afectado la afinidad de unión hacia su objetivo.

Radiomarcación con 177Lu: Se llevó a cabo conjugación de isotiocianato-bencil-CHX-A"-DTPA (130 nM) con proteína (60 nM) en 220 pL de regulador de pH de borato 0.7 M, pH 9.2 durante la noche en un baño de agua a 37°C. El conjugado de CHX-proteína se purificó en una columna de exclusión por tamaño NAP-5 (GE Healthcare, Uppsala, Suiza), usando regulador de pH de acetato de sodio 0.2 M, pH 5.5 como eluyente, y entonces se dividió en diez lotes los cuales se usaron después para quelación. El tiempo de quelación se optimizó muestreando un procedimiento de quelación en curso y verificando la pureza del quelato en placas SG para cromatografía en capa delgada instantánea (ITLC) (Biodex) con regulador de pH corriente de citrato 0.2 M. Las placas se analizaron en un Cyclone Phosphorimager (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA). Se encontró que la quelación concluye después de 30 minutos a temperatura ambiente. La cantidad de lutecio radiactivo se hizo variar dependiendo de las necesidades de los experimentos individuales.

Para poner a prueba la presencia de 177Lu débilmente quelado, se llevaron a cabo desafíos con EDTA. Muestras por triplicado del producto quelado fueron desafiadas con 200: 1 o 1 ,000:1 de exceso molar de EDTA contra quelante en una incubación durante la noche a 37°C. La concentración de EDTA se calculó con base en la suposición de que la conjugación fue cuantitativa, dando de esta manera un valor medio de dos moléculas de CHX-A-DTPA por anticuerpo. Las muestras de las soluciones se analizaron entonces mediante ITLC como se hizo anteriormente. Como control, muestras por triplicado de proteína marcada con 177Lu se mantuvieron también en PBS a 37°C o 4°C durante la noche.

EJEMPLO 5 Estabilidad in vivo Para analizar la estabilidad in vivo de los conjugados radiomarcados, ratones normales son inyectados i.v. con marcas radiactivas, y sometidos a eutanasia después de diferentes puntos de tiempo. La sangre es entonces colectada, y centrifugada a 5,000 g. Muestras de sangre se separan entonces en columnas NAP-5 (límite, 5 kDa) equilibradas con PBS, y se determina la cantidad relativa de la radiactividad presente en la fracción de alto peso molecular.

EJEMPLO 6 Supervivencia de células para el monitoreo de los efectos de la terapia Se siembran células en cajas de Petri (6 cm de diámetro, aproximadamente 2 x 105células/caja). Después de 48 horas, proteínas radiomarcadas (57 ng/caja o 287 ng/caja, que corresponden a aproximadamente 1:1 y 5:1 anticuerpos por antígeno) se añaden a las células. Para determinar el efecto de 25 131 l/177Lu en el medio, algunas de las cajas se preincuban con una cantidad excesiva de proteína no marcada (29 g/caja). Se usan cajas extra para la estimación del número de descomposiciones por célula (DPC). En estas cajas, la captación celular de la proteína radiomarcada se mide en seis puntos de tiempo durante la incubación de 24 horas. Las células se lavan entonces seis veces con medio frío libre de suero, y la incubación se continúa en medio de cultivo fresco. Se hace el conteo de las células aproximadamente una vez por semana, y se resiembran cada dos semanas. Las DPC se estiman calculando el área bajo la curva de captación para las dos concentraciones de anticuerpo, así como para las cajas bloqueadas. Para la concentración más baja de proteína radiomarcada, las células reciben aproximadamente 56 DPC, y para la más alta aproximadamente 150 DPC, mientras que las células bloqueadas reciben aproximadamente 2 DPC. Los resultados obtenidos se analizan mediante regresión no lineal (crecimiento exponencial), usando 1/Y2 como el factor de ponderación.

EJEMPLO 7 Estudios in vivo Se usan los siguientes modelos de xenoinjerto: modelos de tumores LnCAP, DU145, PC-3. El PSA es expresado por las tres líneas de células, mientras que la hK2 es expresada por LnCAP y no expresada en DU145 o PC-3.

Para el xenoinjerto, células LNCaP, DU145 o PC-3 (2 a 10 millones de células), cosechadas en tripsina a 0.02%/PBS se resuspendieron en el medio y se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho con 200 µ? de la suspensión de células que contenía una cantidad igual de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Se monitoreó la formación de tumores visualmente o mediante palpación.

Experimento de bloqueo: El experimento de bloqueo en el experimento de biodistribución I se llevó a cabo para establecer si la captación de las proteínas radiomarcadas en los tumores era o no específica de la hK2. Antes de la inyección iv mayor de la proteína radiomarcada, se inyectaron iv 0.8 a 3.0 mg de la proteína no marcada en el grupo de ratones bloqueados. Se comparó la captación de la radiactividad a 24 a 72 horas post-inyección entre los grupos bloqueados y no bloqueados.

Optimización de la actividad específica: Este experimento se llevó a cabo para determinar la influencia de la actividad específica (es decir, la dosis de proteína inyectada del conjugado radiomarcado) sobre la captación del tumor. Se preparó una serie de proteína marcada con 177Lu con varias actividades específicas predeterminadas. Una alícuota de proteína marcada con 177Lu se diluye con una solución de repuesto de proteína no marcada para proveer dosis de inyección que varían de 10 pg a 500 pg por ratón que posee LnCAP. Dos a tres días después de la inyección, se somete a los animales a eutanasia. Los órganos y tumores se extirpan y se miden para captación de la radiactividad. La actividad específica que provee la captación más óptima de tumores se considera adicionalmente para la dosimetría.

Ejemplo de determinación de la dosimetría: Se inyecta a ratones que poseen LnCAP (4 ratones/grupo) con proteína marcada con 177Lu. Se somete a los animales a eutanasia 4 h pi - 2 semanas post-inyecciones. La dosis absorbida por los diferentes órganos se calcula usando el esquema MIRD. Se obtienen curvas de tiempo-actividad para los tejidos de los órganos de interés en el cuerpo (animal). Los estudios se basan en la formación de imágenes cuantitativas de SPECT y/o PET. La integración de las curvas da la actividad acumulada. Mediante el uso del formalismo MIRD se usan valores S (basados en geometrías específicas y técnicas Monte Cario para las fracciones absorbidas) para convertir la actividad acumulada en dosis absorbida. En muchos casos, la dosis cruzada tiene que calcularse cuidadosamente, significando que se hacen cálculos de la dosimetría basados en Monte Cario (Hindorf, et al. (2004) J. Nuc. Med., 45: 1960-1965; Larsson, et al. (2007) Cáncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 22: 438-442; Larsson, er a/. (2001) Acta Oncol., 50: 973-980).

Ejemplo de formación de imágenes de SPECT y PET: La formación de imágenes de PET-CT y SPECT-CT es una parte integral de la terapia con radionúclidos. Da una idea del grado al cual el material radiactivo se acumula en los tejidos, y ayuda a proveer una estimación de la dosis terapéutica requerida y sus efectos. Para buenos resultados del tratamiento, debe suministrarse una dosis suficiente de radiación al tumor. Esto se confirma mediante la formación de imágenes, como se discute en las referencias mencionadas anteriormente con respecto a la planeación de la dosis, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia.

Radiobiología: Los métodos de dosimetría específicos basados en geometrías de animales de laboratorio/pacientes individuales se usarán para una dosimetría apropiada, y pueden relacionarse con efectos biológicos y dan la posibilidad de correlación con efectos radiobiológicos y para la terapia optimizada de los pacientes individuales.

EJEMPLO 8 Determinación de la afinidad de unión Método de Scatchard La afinidad de unión (Kd) de las variantes de anticuerpo producidas se determinó usando un método de Scatchard de acuerdo con Scatchard, Ann N YAcad Sci 51 : 660-72 (1949).

En resumen, se usó una concentración fija de anticuerpo (o, en este caso, un fragmento de anticuerpo Fab), y concentraciones variables de trazadores de PSA marcados con Eu3+".

Resonancia de plasmones de superficie La cinética de la unión y la afinidad de las variantes de anticuerpo pueden determinarse también mediante el análisis de la interacción bioespecífica en tiempo real en un instrumento Biacore. En resumen, el PSA o la hK2 son inmovilizados en un chip sensor CM5 mediante acoplamiento de amina, y los niveles de inmovilización alcanzaron 000 a 2000 unidades de respuesta. Los diferentes derivados de anticuerpo anti-PSA o anti-hK2 (mAb y Fab) se diluyen en concentraciones que varían de 0.1 a 10 nM en regulador de pH de HBS-EP. La cinética de la unión se estudia en una fase de asociación de 5 minutos y una fase de disociación de 30 minutos con una magnitud de flujo de 50 L/min, seguida de regeneración. Las constantes de la cinética se calculan usando un modelo de unión de Langmuir 1 :1 con corrección para transferencia de masa.

EJEMPLO 9 Pruebas inmuno-radiométricas (IRMA) Pruebas inmuno-radiométricas (IRMA) basadas en anticuerpos monoclonales para la calidad de la unión del Fab o el mAb radiomarcado se llevaron a cabo por triplicado como una prueba en sandwich de cuatro pasos con pasos de lavado entre las incubaciones (regulador de pH de lavado: Tris-HC1 10 mM, pH 8.0, NaCI 0.15 M, Tween 20 a 0.05%). La prueba se construyó y se optimizó de acuerdo con recomendaciones establecidas. Placas de microtítulo Breakapart fueron recubiertas con H117 (0.2 pg/cavidad), un anticuerpo monoclonal que reconoce al PSA libre o total y la calicreína humana 2 (hK2) con la misma afinidad, diluidas en regulador de pH de recubrimiento (carbonato de sodio 75 mM, pH 9.6), e incubadas durante la noche a 4°C. Las cavidades se incubaron entonces con 0.2 pg/cavidad de regulador de pH de extinción (gelatina de pescado a 3% en regulador de pH de lavado) por dos horas a temperatura ambiente. Después, las células fueron recubiertas con 200 µ? de plasma (femenino) que contenía 3 ng/pL de fPSA, y se incubaron por dos horas a temperatura ambiente. El PSA30 radiomarcado y el PSA30 no marcado se mezclaron entonces en regulador de pH de prueba (Tris-HCI 50 mM, pH 7.5, NaCI 0.1 M, EDTA 5 mM, BSA a 0.25% y Tween 20 a 0.05%) a concentraciones decrecientes, y se añadieron a las cavidades (volumen total: 50 pL/cavidad). El porcentaje de anticuerpo marcado por cavidad fue el siguiente: 100, 92, 84, 68, 50, 30 y 0 por ciento. Las placas se incubaron por dos horas a temperatura ambiente, se lavaron y se midieron en un contador de cavidades Nal(TI) (1282 Compugamma CS; LKB Wallac, Turku, Finlandia). Una diferencia en la capacidad de detección menor de 25% con relación a la desviación teórica se aceptó para más aplicación. Las estimaciones de la calidad de la detección post-marcación mostraron que el anticuerpo radiomarcado mantuvo 70 a 90% de la afinidad/capacidad de unión del anticuerpo 0 no marcado.

EJEMPLO 10 Radioinmunoterapia con m1 B6 marcado con 177Lu en un modelo de ratón con cáncer de próstata El cáncer de próstata es el cáncer más comúnmente diagnosticado entre los hombres en el mundo occidental, dando razón de 25% de todos los nuevos casos de cáncer, y 14% de las muertes por cáncer (22700443). Las estrategias de tratamiento curativo actuales (cirugía e irradiación), son sólo exitosas cuando la malignidad se localiza hacia la glándula prostática. La estrategia terapéutica en caso de enfermedad diseminada se limita a la castración, la cual sólo suprime con frecuencia el crecimiento por 12 a 18 meses antes de que se vuelva refractaria, a pesar del ambiente privado de hormonas (Scher Hl et al., Cáncer of the prostate, en: DeVita VT Jr., Hellman S, Rosenberg SA, eds. 7a. ed. Filadelfia, PA: Lippincott Williams & Wilkins; 2005). Debido a la falta de terapias que se ha demostrado tienen un efecto más allá de una respuesta transitoria, se necesitan urgentemente terapias novedosas molecularmente focalizadas. Debido a que el cáncer de próstata es radiosensible, presenta un objetivo ideal para la radioinmunoterapia. Asimismo, la radioinmunoterapia suministra típicamente altos niveles de anticuerpos circulantes hacia la médula ósea y los nodulos linfáticos, sitios hacia los cuales el cáncer se extiende típicamente. Además, la radioinmunoterapia usa un "efecto de fuego cruzado" el cual, dependiendo del alcance de las partículas emitidas del radioisótopo elegido, puede destruir a las células espectadoras circundantes negativas para el antígeno sin unión directa del anticuerpo (16029058).

La calicreína humana 2 (hK2) es una enzima dirigida por andrógenos que es solamente expresada , a concentraciones muy altas, en el tejido prostático sano y maligno. Puesto que se ha mostrado que la hK2 separa la forma de cimógeno del antígeno específico de próstata (PSA), se cree que una de sus funciones fisio'iógicas es actuar como un regulador de esa enzima. Consideradas en conjunto, estas características biológicas hacen de la hK2 un objetivo óptimo en un sistema teragnóstico (terapia y diagnóstico).

El propósito de este estudio fue confirmar la utilidad de 11 B6, un mAb que focaliza específicamente un epítope dentro de la hendidura catalítica de la hK2, como un vehículo que suministra radionúclidos altamente tóxicos específicamente hacia los sitios de crecimiento del cáncer de próstata. En esta prueba de estudio de concepto, se eligió marcar el mAb con 77Lu, una partícula beta de baja energía que usa también emisión gamma, permitiendo que se lleve a cabo la formación de imágenes por SPECT.

Materiales y métodos Materiales Se adquirió 177Lu de Mallinkrodt Medical BV, Petten, Holanda. El sistema Cyclone™ Storage Phosphor y el software de análisis de imágenes OptiQuant™ (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA) se usaron para medir la radiactividad en las tiras de ITLC (cromatografía en capa delgada instantánea) (Biodex, US), para determinar la cinética de la marcación y la pureza radioquímica. Todos los agentes químicos se obtuvieron de Sigma Aldrich, y los reguladores de pH se prepararon internamente usando agua de grado analítico si no se observaba de otra manera. El mAb 11B6 es un anticuerpo específico para la calicreína humana 2 con una afinidad por este antígeno de aproximadamente 1.2 nM; véase las SEQ ID NOs: 4 y 5 anteriores (obtenidas de la Universidad de Turku, Finlandia). Para los estudios ¡n vivo, se usaron líneas de células de carcinoma de próstata LNCaP que expresan la hK2 (ATCC, Manassas, VA, USA). Las células se cultivaron en medio del RPMI 1640 complementado con suero de bovino fetal a 10% y PEST (100 Ul/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina). Las células se mantuvieron a 37°C en una incubadora humidificada con CO2 a 5%, y se separaron con solución de tripsina-EDTA (tripsina a 0.25%, EDTA a 0.02% en regulador de pH, Thermo Scientific).

Conjugación v radiomarcación Conjugación de CHX-A"-DTPA con 11B6: Una solución del mAb 11 B6 en PBS se ajustó a pH 9.2 usando regulador de pH de borato de sodio 0.07 M. La muestra se concentró en un filtro centrífugo Ultra-2 de Amicon (2 mi, 100 K). La solución de proteína se conjugó con el quelante CHX-A"-DTPA (Macrocyclics, USA) a una relación molar de 3:1 de quelante a anticuerpo a 40°C. La reacción concluyó después de 4 horas y CHX-A"-DTPA-11 B6, ahora denominado DTPA-11B6, se separó del quelato libre mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna NAP-5 (GE Healthcare) equilibrada con 20 mi de regulador de pH de acetato de amonio 0.2 M, pH 5.5. El mAb 11B6 y 5A10 conjugados se eluyeron con 1 mi de regulador de pH de acetato de amonio.

Radiomarcación de DTPA-11 B6: DTPA-11 B6 en regulador de pH de acetato de amonio pH 5.5 se mezcló con una cantidad predeterminada de 177LuCI3. Después de incubación a temperatura ambiente por 2 horas, la marcación concluyó y se purificó en una columna NAP-5, equilibrada con PBS. La eficiencia de la marcación y la cinética de la marcación se monitorearon con tiras de ITLC, eluidas con ácido cítrico 0.2 M. En este sistema, el conjugado radiomarcado permanece en la línea de origen, mientras que el 177Lu libre migra con el frente del solvente. Se determinó la distribución de la radiactividad con un sistema Phosphorlmager (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA) usando Optiquant como software de cuantificación (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA).

Resonancia de plasmones de superficie La proteína hk2 (Department of Biotechnology, Turku, Finlandia) en regulador de pH de NaAc 10 mM, pH 4.0, fue inmovilizada en un chip de grado investigación CM4 adquirido de Biacore mediante acoplamiento de amino usando N-hidroxisuccinimida (NHS), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y clorhidrato de etanolamina 1 M -NaOH pH 8.5 en un sistema Biacore 2000. El mAb 11B6, su conjugado DTPA-11B6 y Herceptin como un mAb de referencia no específico, todos en regulador de pH de Biacore, se hicieron fluir sobre dos células de flujo en cinco diferentes concentraciones (0.5 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM y 100 nM) para detectar la unión final. Una de las dos células de flujo contenía hK2 inmovilizada, y la otra era un blanco de referencia. El chip se regeneró usando regulador de pH de glicina 25 mM, pH 2.7.

Estudios de estabilidad in vitro La estabilidad de los conjugados marcados se puso a prueba en PBS en un exceso de EDTA, 500x más EDTA, entonces DTPA conjugado en m11B6, incubado a 4°C por 1 semana y 2 semanas, y se analizaron usando tiras de ITLC (véase anteriormente).

Estudios en animales Todos los experimentos en animales se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación nacional sobre la protección de los animales de laboratorio. El estudio en animales ha sido aprobado por el Comité de Ética local para Investigación en Animales. Para este estudio, se usaron ratones machos desnudos inmunodeficientes, NMRI (de 6 a 8 semanas), adquiridos de Taconic Europe (Bomholt, Dinamarca).

Xenoinjertos de células de carcinoma de próstata LnCAP que expresan hK2 fueron implantados subcutáneamente en el flanco derecho y/o el flanco izquierdo a aproximadamente 10x106 células por inyección.

Los animales que desarrollaron tumores LNCaP fueron divididos en grupos e inyectados con el agente terapéutico DTP-11B6 marcado con Lu o con un control; véase el cuadro 1 siguiente: CUADRO 1 Todos los animales incluidos fueron continuamente medidos y pesados dentro de un intervalo de 3 a 4 días.

Inicialmente, algunos animales mostraron una menor actividad (8 MBq) de DTPA-11 B6 marcado con 77Lu para la investigación de la localización del agente terapéutico usando SPECT. Un ratón del grupo 8 se estudió también con SPECT. Se removieron los órganos de estos animales, y se usó un contador de cavidades Nal(TI) automatizado con un detector de Nal (TI) de 7.62 cm (1480 WIZARD, Wallac Oy, Turku, Finlandia) para cuantificar la radiactividad en estas muestras de tejido.

Para estudiar el efecto sobre la médula ósea, se tomaron regularmente muestras de sangre (10 µ?_). Se colectaron muestras de sangre dos veces por semana por 8 semanas post-inyección, y se analizaron los conteos de glóbulos blancos, conteos de glóbulos rojos y conteos de plaquetas en un analizador de células Medonic Vet CA530 Vet (Boule Medical, Estocolmo, Suecia). Al momento de la toma de muestras de sangre, se monitorearon el peso y la condición física de los animales. Se evaluó la toxicidad monitoreando a los animales para pérdida de peso corporal, deterioro en la condición general y toxicidad hematológica.

Se midió el volumen del tumor con un calibre. Se midieron la longitud I, con peso w y espesor t, y se calculó el volumen.

Farmacocinética Para el estudio de biocinética de m11B6 marcado con 111ln, se inyectó a los ratones en la vena de la cola con un radionúclido marcado para 25 pg de anticuerpo m11B6. Se sacrificó a los animales a intervalos de tiempo regulares.

En resumen, el mAb 11B6 de ratón fue conjugado con CHX-A"-DTPA y marcado con 11 ln formando 111ln-CHX-A"-DTPA-11B6 (DTPA-11B6 marcado con 1 In). Se llevaron a cabo estudios de biodistribución en un modelo de xenoinjerto PCa positivo para hK2 y AR (LNCaP). Se usaron xenoinjertos DU-145 (negativos para hK2 y AR) como control. Animales desnudos NMRI fueron sometidos a eutanasia a intervalos de tiempo designados, disectados, y se removieron sus órganos para medición de la actividad. Se llevó a cabo la formación de imágenes Micro-SPECT. Los tumores fueron seccionados y teñidos, y se llevó a cabo autorradiografía. Algunos animales fueron inyectados con el mAb 11 B6 frío de ratón antes de la inyección de DTPA-11B6 marcado con 111ln para bloquear la captación del mAb 11 B6 radiomarcado.

La biocinética de m11B6 marcado con 77Lu se obtuvo de la misma manera que para el estudio de m11 B6 marcado con 111ln.

Adquisición de datos y dosimetría Para determinar la dosis absorbida por los diferentes órganos objetivo, se aplicó el esquema MIRD (1) junto con factores S específicos de ratón. El número de desintegraciones (actividad acumulada) se derivó de los datos de la cinética con m11B6 marcado con 11 ln. Las funciones bi-exponenciales fueron ajustadas a los puntos de datos mediante un algoritmo de mínimos cuadrados, y se calculó el número de desintegraciones como la integral de estas expresiones multiplicada por el factor de descomposición. La actividad acumulada para la médula ósea se basó en el método de la sangre (2), en donde se supone que la concentración de la actividad en la médula ósea es proporcional a la concentración de la actividad en la sangre. Se ha sugerido que esta relación de médula ósea a sangre (RMBLR) es de 0.36 (2), la cual se usó también en este estudio.

Para determinar los factores S específicos de ratón, se usó una versión del fantasma de MOBY (3), en la cual pudo especificarse el tamaño de los órganos. El peso promedio de los órganos disectados del estudio de la cinética se especificó junto con el peso total promedio. El hacer que las superficies de NURBS sean flexibles, genera entonces un fantasma específico de la deformación. El fantasma es voxelizado en 160*160*400 voxels. Se añadió un tumor subcutáneo en el flanco izquierdo, mediante la representación de una esfera fuera del contorno normal de la piel, pero como un elipsoide con un eje corto a la mitad hacia el radio de la esfera perpendicular al contorno de la piel, y el eje largo siendo como el radio de la esfera. La glándula salival y la glándula prostática se añadieron manualmente al fantasma y se representaron como esferas con radio correlacionado con el peso promedio de los órganos.

El fantasma actuó entonces como aporte para las simulaciones Monte Cario de los factores S para 77Lu y 111ln con el código MCNPX 2.6 como se describió en un primer trabajo (4).

Planeación de la terapia Con base en la relación entre la dosis absorbida y el efecto biológico sobre la médula ósea en ratas que sufren radioinmunoterapia con 90Y y 177Lu (Larsson et al., 2012, Med. Phys. 39(7): 4434-43), pudo estimarse que la LD50 para la médula ósea estaría en el orden de 12 Gy. En la literatura, la LD50 para la irradiación aguda de ratas y ratones es la misma; aproximadamente 9 Gy (véase, por ejemplo, Radiobiology for the radiologist, Hall & Giacca (eds.), 2006, 6a. edición).

Las terapias se planearon entonces a partir de la suposición de una dosis absorbida tolerable de 12 Gy por la médula ósea. Entonces, a partir de los cálculos de la dosimetría, se calculó la actividad que corresponde a esta dosis absorbida. Los grupos de la terapia se diseñaron entonces, dándoles la designación A 4, A/2, A, 2xA y 3xA. Se usaron actividades correspondientes para los controles.

Resultados Radiomarcación de DTPA-m 1 B6 marcado con Lu Los resultados de la cinética de la marcación en la figura 15 muestran que la eficiencia de la marcación es muy alta, alcanzando 90% después de 2 horas de incubación. Esto garantiza una probabilidad de eficacia excelente de la terapia con efectos menores del 177Lu no conjugado.

Los resultados de la estabilidad in vitro en PBS y EDTA muestran buena estabilidad con el tiempo con casi ningún cambio con el tiempo dentro de dos semanas (véase la figura 16). Asimismo, ninguna diferencia puede verse entre la incubación con PBS y EDTA, indicando una química de conjugación muy buena que garantiza la estabilidad in vivo con retención y tiempos de circulación largos.

Formación de imágenes Las imágenes de SPECT en la figura 17 muestran la distribución de DTPA-m11 B6 marcado con 1777Lu en ratones desnudos xenoinjertados (8 MBq inyectados).

Las diferentes imágenes de la figura 17 son como se explican en el cuadro 2.

CUADRO 2 La primera columna para el ratón S1 muestra la captación excelente en el tumor en el ratón S1 con una captación incrementada con el tiempo 48, 72 y 168 h pi. La segunda columna muestra el ratón S2 a 72 y 168 h con la misma alta captación del tumor. La columna 3, hilera 2, muestra el ratón S3 a 72 h pi con similar alta captación del tumor. La hilera 3, columna 3, muestra el ratón S8 a 168 h pi sin captación del tumor después del bloqueo con anticuerpos fríos que muestran la especificidad de m11 B6 por la focalización del tumor. Se observan resultados similares para el ratón S9 en la columna 4, hilera 3. Por último, el ratón S11 en la columna 4, hilera 2, no muestra captación del tumor en la línea de células DU145 no específica para el anticuerpo m11B6.

Estos resultados demuestran la alta especificidad de m11 B6, que da como resultado alta acumulación de tumores.

Biodistribución Los resultados del estudio de biocinética del m11B6 marcado con 111ln se discutieron en el ejemplo 2 anterior. Una acumulación se observa en el tejido del tumor con un máximo de 16% de ??/g a 48 horas; todos los demás órganos muestran una disminución de la actividad, salvo las glándulas salivales (véase la figura 7). De esta manera, se obtiene una alta relación de tumor a órgano normal, lo cual es un prerrequisito para la alta eficacia de la terapia.

Los datos de la biodistribución para m11 B6 marcado con 177Lu (a 72 h y 168 h) se muestran en la figura 18. Aquí, puede verse una acumulación de actividad mucho mayor en comparación con m11 B6 marcado con 111ln, con casi 30% de ??/g a 168 h. Esto subraya adicionalmente la viabilidad de la alta eficacia terapéutica con el anticuerpo 11 B6 radiomarcado.

Los resultados detallados a 72 h pi del bloqueo junto con el uso de la línea de células tumorales DU-145, se muestran en la figura 19. Aquí, se dan la distribución de DTPA-m11B6 marcado con 77Lu del estudio de SPECT mostrado anteriormente en ratones con LnCaP o DU-145 y el bloqueo del antígeno hK2 con la pre-inyección de 1 B6 no conjugado. Como se ve en detalle, el bloqueo y la línea de células tumorales DU-145 no dan como resultado captación en los tumores, mostrando la alta especificidad de m11 B6.

Dosimetría La figura 20 muestra los resultados del estudio de la biocinética de m11 B6 marcado con 111ln usado para los cálculos de la dosimetría. En cada gráfica dentro de la figura mixta, la línea punteada superior representa los resultados del estudio de la cinética con una desviación estándar, la curva continua es una función bi-exponencial adaptada, y la curva punteada inferior es cuando se considera la descomposición de 111ln. El área bajo la curva punteada inferior es la actividad acumulada usada en los cálculos de la dosimetría.

Con base en la biocinética como se muestra en la figura 20, se calcularon las actividades acumuladas. Mediante el uso de los valores S de 111ln, se calculó entonces la dosis absorbida por unidad de actividad (Gy/MBq). En el cuadro 3 siguiente, se dan los resultados para In.

Con base en la suposición de que la misma biocinética puede usarse para m11B6 marcado con 177Lu, se calcularon las actividades acumuladas correspondientes con su medio tiempo físico. Cuando se usaron los valores S para Lu, se calculó la dosis absorbida por unidad de actividad. La suposición de una biocinética similar se justifica por los resultados de la captación de m11B6 marcado con 177Lu, mostrando valores de captación similares que para m11B6 marcado con 111ln (véase las figuras 7 y 18).

CUADRO 3 Dosis absorbida (Gy/MBq) de la terapia con 11B6 marcado con 111ln y 177Lu Órgano 11ln 1 Lu Dosis propia Dosis total Dosis propia Dosis total Remanente 0.072 0.081 0.504 0.516 Sangre 0.195 0.235 1.207 1.283 Corazón 0.076 0.133 0.442 0.622 Pulmón 0.059 0.106 0.396 0.532 Hígado 0.102 0.130 0.636 0.666 Bazo 0.082 0.115 0.670 0.716 Tracto Gl 0.041 0.073 0.246 0.298 Riñon 0.088 0.122 0.491 0.525 Tiroides 0.001 0.041 0.006 0.094 Hueso 0.020 0.086 0.131 0.267 Cerebro 0.003 0.025 0.017 0.039 Próstata 0.036 0.075 0.236 0.295 Testículos 0.031 0.061 0.246 0.294 Glándulas 0.223 0.249 1.885 1.926 salivales Tumor 0.294 0.312 2.236 2.252 Médula ósea 0.063 0.092 0.386 0.452 Con base en un valor de LD50 de 12 Gy de la médula ósea, puede inyectarse una dosis de 26.7 MBq. Esto significa una dosis absorbida por el tumor de 60 Gy.

Volviendo a calcular la dosis absorbida por el tumor (asumiendo que la cinética de m11 B6 marcado con 11ln es la misma que para m11 B6 marcado con 177Lu), y cambiando los valores de captación a 72 h pi (16% de ??/g hasta 20% de ??/g) y a 168 h pi (15% de ??/g a 28% de ??/g), se obtienen las dosis absorbidas como se dan en el cuadro 4 siguiente. Puede verse entonces que la dosis absorbida por el tumor se incrementará de 60 Gy a 120 Gy.

CUADRO 4 Órgano Dosis propia Dosis absorbida total Remanente 0.494456 0.507415 Sangre 1.20655 1.28288 Corazón 0.441901 0.621222 Pulmón 0.396110 0.530831 Hígado 0.636344 0.665149 Bazo 0.669825 0.715375 Tracto Gl 0.245824 0.297540 Riñon 0.490722 0.524355 Tiroides 0.00649596 0.0923319 Hueso 0.131186 0.266107 Cerebro 0.0170275 0.0386855 Próstata 0.236380 0.293902 Testículos 0.246161 0.293579 Saliva 1.88491 1.92563 Tumor 4.48777 4.50278 Médula ósea 0.386496 0.451228 Los cálculos de la dosimetría anteriores se basan en un modelo de dosimetría apropiado; la biocinética revela que una dosis absorbida terapéutica puede suministrarse hacia los tumores dentro de límites seguros para la toxicidad de la médula ósea.

Contracción del tumor en animales La figura 21 muestra cómo el tumor en uno de los ratones (visible en el flanco del animal, bajo la piel) disminuye en volumen después del tratamiento.

Resultados de la radioinmunoterapia La figura 22A-22C muestra los resultados para los grupos de estudio con actividades administradas (22A) D, (22B) 2 x D, y (22C) grupo control (en donde D = 26.7 MBq).

Existe una clara tendencia de disminución del volumen del tumor en ambos grupos de tratamiento. El inicio de la contracción del tumor se ve ya algunos días después de la inyección de m11B6 marcado con 177Lu. En el grupo control, existe un incremento en el volumen del tumor después de la inyección de la solución de Nal.

La figura 23A muestra los resultados para uno de los ratones en el grupo inyectado con la actividad A. Aquí, el tumor crece rápidamente desde el día uno hasta el día seis cuando se administra la actividad A de m11 B6 marcado con 17 Lu. Después del tratamiento, se observa una rápida disminución en el volumen del tumor.

En el estudio de SPECT (8 d pi), el volumen del tumor se muestra con aún actividad presente; véase la figura 23B.

Conclusión El presente estudio con el ejemplo de anticuerpo m11B6 marcado con 77Lu, demuestra claramente una eficacia terapéutica contra los tumores del cáncer de próstata in vivo.

Los cálculos teóricos basados en el modelo de dosimetría especial y la biocinética medida in vivo, muestran una dosimetría favorable que da una alta relación terapéutica. Esto se verifica entonces en el estudio en animales con buenos resultados de la terapia que muestran rápida contracción del volumen del tumor.

Claims

REFERENCIAS

1. Bolch WE, Eckerman KF, Sgouros G, Thomas SR. MIRD, panfleto No. 21 : a generalized scheme for radiopharmaceutical dosimetry-standardizaron of nomenclature. J Nucí Med. 2009; 50: 477-484. 2. Sgouros G. Bone marrow dosimetry for radioimmunotherapy: theoretical considerations. J Nucí Med. 1993; 34: 689-694. 3. Segars WP, Tsui BM, Frey EC, Johnson GA, Berr SS. Development of a 4-D digital mouse phantom for molecular imaging research. Mol Imaging Biol. 2004; 6: 149-159. 4. Larsson E, Strand SE, Ljungberg M, Jónsson BA. Mouse S-factors based on Monte Cario simulations in the anatomical realistic Moby phantom for internal dosimetry. Cáncer Biother Radiopharm. 2007; 22: 438-442. 5. Erik Larsson, Michael Ljungberg, Linda Mártensson, Ruñe Nilsson y Jan Tennvall, Sven-Erik Strand and Bo-Anders Jonsson Use of Monte Cario simulations with a realistic rat phantom for examining the correlation between hematopoietic system response and red marrow absorbed dose in Brown Norway rats undergoing radionuclide therapy with 177Lu- and 90Y-BR96 mAbs Medical. 6. Linda Mártensson, Zhongmin Wang, Ruñe Nilsson, Tomas Ohlsson, Peter Senter, Hans-Olov Sjógren, Sven-Erik Strand, Jan Tennvall, Determining Maximal Tolerable Dose of the Monoclonal Antibody BR96 Labeled with 90Y or 177Lu in Rats: Establishment of a Syngeneic Tumor Model to Evalúate Means to Improve Radioimmunotherapy. Clin Cáncer Res 2005; 11 : 7104S-7108s. 2005. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un agente que comprende o que consiste de (a) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad por la calicreína glandular humana (hK2) y (b) una porción citotóxica, para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata.

2. - El uso de un agente que comprende o que consiste de (a) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad por la calicreína glandular humana (hK2) y (b) una porción citotóxica, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata.

3. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad por la hK2 compite por la unión a la hK2 con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de 1 B6 y 7G1.

4. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad por la hK2 comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de 11 B6 y 7G1.

5. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad por la hK2 comprende o consiste de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de 11 B6 y 7G1 , y fragmentos de unión al antígeno del mismo.

6. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad por la hK2 es enlazado indirectamente a la porción citotóxica.

7. - El agente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad por la hK2 es enlazado directamente a la porción citotóxica.

8. - El agente o uso de la reivindicación 6 o 7, en donde el agente exhibe características de captación del tumor sustancialmente equivalentes a las características de captación del tumor del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con especificidad por la hK2 sola.

9.- El agente o uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado además porque la porción citotóxica comprende o consiste de uno o más radioisótopos.

10. - El agente o uso de la reivindicación 9, en donde los uno o más radioisótopos se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de emisores beta, emisores Auger, emisores de electrones de conversión, emisores alfa y emisores de baja energía de fotones.

11. - El agente o uso de la reivindicación 9 o 10, en donde uno o más radioisótopos tienen cada uno independientemente un patrón de emisión de energía localmente absorbida que crea una alta dosis de absorbancia en la vecindad del agente.

12. - El agente o uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , en donde uno o más radioisótopos se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de emisores beta de largo alcance, tales como 90Y, 32P, 186Re, 166Ho, 76As/77As, 89Sr o 53Sm; emisores beta de alcance medio, tales como 131l, 177Lu, 67Cu, 61Tb o 105Rh; emisores beta de baja energía, tales como 45Ca o 35S; emisores Auger o de conversión, tales como 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111ln, 114mln, 123l, 25l o 201TI; y emisores alfa, tales como 212Bi, 213B¡, 2 3Ac, 225Ac, 212Pb, 255Fm, 223Ra, 149Tb y 221 At.

13. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la porción citotóxica comprende o consiste de uno o más fármacos citotóxicos.

14.- El agente o uso de la reivindicación 13, en donde los uno o más fármacos citotóxicos se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de un fármaco citostático; un fármaco antiandrógenos; cortisona y derivados de la misma; un fosfonato; un inhibidor de testosterona-5-a-reductasa; un adendo de boro; una citocina; tapsigargina y sus metabolitos; una toxina (tal como saporina o caliqueamicina); un agente quimioterapéutico (tal como un antimetabolito); o cualquier otro fármaco citotóxico útil en el tratamiento del carcinoma prostático.

15. - El agente o uso cualquier reivindicación anterior, en donde la porción citotóxica comprende o consiste de una o más porciones adecuadas para terapia de activación, tales como terapias de activación con fotones, terapia de activación con neutrones, terapia con electrones Auger inducidos por neutrones, terapia con irradiación sincrotrónica, o terapia de activación con fotones - rayos X de baja energía.

16. - El agente o uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde el radioisótopo es capaz de actuar simultáneamente en una manera multimodal como una porción detectable y también como una porción citotóxica.

17. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el agente comprende adicionalmente una porción para incrementar la vida media in vivo del agente.

18 - El agente o uso de la reivindicación 17, en donde la porción para incrementar la vida media in vivo se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol (PEG), albúmina de suero humano, grupos de glucosilación, ácidos grasos y dextrán.

19. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el cáncer de próstata que se va a tratar es cáncer de próstata no localizado (es decir, diseminado).

20. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el cáncer de próstata que se va a tratar es cáncer de próstata metastásico, opcionalmente cáncer de próstata micrometastásico.

21. - El agente o uso de la reivindicación 20, en donde el cáncer de próstata metastásico que se va a tratar es metástasis del sistema linfático; metástasis del hueso (incluyendo espina dorsal, vértebras, pelvis, costillas); o metástasis dentro de la pelvis, el recto, la vejiga y la uretra.

22. - El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el paciente tiene cáncer de próstata y tiene menos de 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 o menos años de edad al momento del diagnóstico del cáncer de próstata y/o al momento del tratamiento.

23.- El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el paciente se caracteriza porque un miembro de la familia, tal como un padre o hermano, ha sido diagnosticado previamente con cáncer de próstata.

24.- El agente o uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el cáncer de próstata que se va a tratar es cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC).

25 - Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 26.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25, caraceterizada además porque la composición farmacéutica está adaptada para ser administrada parenteralmente, intravenosamente, subcutáneamente o intramuscularmente o suministro mediante inyección. 27.- Un kit que comprende un agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, o una composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 25 o

26.