PT2771037T

PT2771037T - Agentes terapêuticos e utilizações dos mesmos

Info

Publication number: PT2771037T
Application number: PT127987923T
Authority: PT
Inventors: Strand Sven-Erik; Thuy Tran Amanda; Anders Axelsson Sven-Niklas
Original assignee: Fredax Ab
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2016-11-08
Also published as: WO2013061083A2; JP6101274B2; RU2606773C2; US20260048159A1; HK1201454A1; AU2012328173A1; ES2601459T3; BR112014010739A2; CA2853669C; MX2014005143A; JP2014530898A; EP2771037B1; DK2771037T3; EP2771037A2; KR102232811B1; KR20210036987A; AU2012328173B2; MX353964B; US9345782B2; US20160317683A1

Description

DESCRIÇÃO AGENTES TERAPÊUTICOS E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS Campo da Invenção

Esta invenção pertence em geral ao campo de agentes terapêuticos e métodos, particularmente no campo do cancro da próstata.

Antecedentes A lista ou descrição de um documento aparentemente publicado anteriormente nesta memória descritiva não deve ser necessariamente considerada como um reconhecimento de que o documento faz parte do estado da técnica ou é conhecimento geral comum.

Atualmente, o cancro da próstata é a forma mais comum de cancro entre os homens. A próstata é uma glândula do tamanho de uma noz nos homens que produz fluido que é um componente no sémen. A próstata tem dois ou mais lóbulos, ou secções, circundados por uma camada exterior de tecido. A próstata encontra-se à frente do reto e mesmo por baixo da bexiga, e circunda a uretra. A ocorrência de cancro da próstata é mais elevada na parte noroeste da Europa e nos Estados Unidos. 0 crescimento do tumor é habitualmente um processo que ocorre durante um longo período de tempo. 0 cancro da próstata é normalmente uma forma suave de cancro. Na realidade, a maioria dos homens diagnosticados com cancro da próstata sobrevive, e apenas uma minoria dos homens encontra uma forma mais agressiva de cancro da próstata, que desenvolve metãstases num estádio inicial. Esta forma de cancro da próstata apenas pode ser curável se o mesmo for diagnosticado num estádio inicial, antes de o cancro se espalhar para o tecido extracapsular.

Atualmente, o diagnóstico e a monitorização do cancro da próstata podem ser efetuados através da medição da concentração de um antigénio específico da próstata (PSA) no sangue do paciente. Se a concentração de PSA for nitidamente elevada em diversas medições consecutivas, efetuadas em diferentes alturas, a avaliação indica que existe uma probabilidade de cancro da próstata. Nesta altura, pode ser efetuada uma biopsia para verificar o cancro da próstata. 0 PSA (igualmente conhecido como calicreína III) é uma proteína constituída por uma única cadeia de 2%7 aminoãcidos, que é produzida nas células secretoras da próstata. Estas células secretoras podem ser encontradas em toda a glândula da próstata. 0 PSA é um marcador bem estabelecido e cuidadosamente investigado relativamente ao cancro da próstata. Em comparação com células saudáveis, a produção de PSA é inferior nas células malignas e superior nas células hiperplãsicas. Por conseguinte, é contraditório que na realidade a concentração de PSA seja superior no sangue de homens que sofrem de cancro da próstata. Contudo, uma explicação pode ser o facto de as células malignas terem uma estrutura de células deteriorada, e serem por isso mais permeáveis ao PSA.

Outra protéase de serina importante, que pode ser adequada para terapia futura de cancro da próstata, é a calicreína glandular humana 2 (hK2). A hK2 de codificação de genes encontra-se no cromossoma 19, juntamente com a codificação de genes para PSA. A hK2 é expressada sobretudo no tecido da próstata, mesmo como PSA. Na próstata, o PSA está presente como uma pró-forma inativa e é ativado através da ação de peptidase de hK2. A investigação imuno-histoquímica relativamente a hK2 mostrou que hK2 é expressada em relação ao nível de diferenciação. Isto significa que hK2 é expressada numa produção superior no tecido de baixa diferenciação, tal como tecido sujeito a cancro da próstata, e numa produção inferior no tecido de alta diferenciação, tal como tecido sujeito a hiperplasia benigna da próstata (ΒΡΗ), que é outro problema comum da próstata.

As terapias atuais de cancro da próstata sâo a cirurgia (p. ex. , prostatectomia radical), radioterapia (incluindo, braquiterapia e radioterapia de feixe externo, ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU), quimioterapia, fãrmacos quimioterapêuticos orais, criocirurgia (congelação do tumor), terapia hormonal (tal como terapia antiandrogénica), castração ou combinações dos anteriores.

Contudo, a maioria destas terapias (cirurgia e terapia de radiação externa) é apenas (ou essencialmente) útil para o tratamento de tumores primários e grandes metástases. A quimioterapia é utilizada para o cancro disseminado, mas para a maioria destes pacientes e um efeito paliativo e/ou uma sobrevivência prolongada. Outras modalidades de tratamento ou modalidades complementares são por isso necessárias para alcançar melhoramentos consideráveis das doenças malignas disseminadas, particularmente em casos de micrometástases. A terapia, tal como imunoterapia ou radioimunoterapia, que utiliza moléculas-alvo, tais como anticorpos e fragmentos, pode dar a possibilidade de terapia da doença disseminada.

Deste modo, são necessários novos agentes terapêuticos e métodos para o tratamento do cancro da próstata, em particular nos casos de doença disseminada, metástases e micrometástases.

Um dos presentes inventores publicou um anúncio para bolsas de estudo em outubro de 2010 ("Doktorandplats i Medicinsk strálningsfysik", citação da Internet, 5 de outubro de 2015, páginas 1 e 2, XP007921819), que descreve uma ideia geral de um projeto de investigação no campo da terapia de radionuclídeos para o cancro da próstata utilizando anticorpos anti-hK2.

Sumário da Invenção

Em conformidade, a presente invenção procura mitigar, aliviar ou eliminar uma ou mais das deficiências identificadas acima na técnica e as desvantagens isoladamente ou qualquer combinação, e resolve pelo menos os problemas mencionados acima fornecendo um método de terapia de acordo com as reivindicações de patente em anexo.

Num primeiro aspeto, a presente invenção fornece um agente compreendendo ou consistindo (a) num anticorpo ou fragmento de união ao antigénio do mesmo com especificidade para proteína calicreína humana (hK2) e (b) numa metade citotóxica para a utilização no tratamento do cancro da próstata.

Por outras palavras, o primeiro aspeto da presente invenção refere-se à utilização de um agente conforme descrito acima no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro da próstata.

Em conformidade, o primeiro aspeto fornece igualmente um método para o tratamento de cancro da próstata num paciente, o método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente conforme descrito acima.

Deste modo, os agentes da presente invenção compreendem uma metade de união na forma de um anticorpo anti-hK2 ou fragmento de união ao antigénio do mesmo. 0 termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo substancialmente intactas, bem como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos (em que pelo menos um aminoácido é mutante em relação aos anticorpos humanos que ocorrem naturalmente), anticorpos de cadeia única, diacorpos, anticorpos biespecíficos, cadeias pesadas de anticorpo, cadeias leves de anticorpo, homodímeros e heterodímeros de cadeias pesadas e/ou leves de anticorpo, e fragmentos de união ao antigénio e derivados dos mesmos. 0 termo "fragmento de união ao antigénio" significa um fragmento funcional de um anticorpo que é capaz da união a uma proteína calicreína. A afinidade de união dos diferentes derivados de anticorpo mencionados acima pode ser determinada com o método de Scatchard utilizando uma concentração fixa de fragmento de anticorpo imobilizado e concentrações variáveis de indicador Eu-PSA. Em alternativa, a afinidade de união pode ser determinada através da utilização da tecnologia de Ressonância de P de Superfície (SPR) num instrumento Biacore. Os métodos de análise são ainda descritos no Exemplo 8.

Em particular, o fragmento de união ao antigénio é selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos Fv (p. ex. , Fv de cadeia única e Fv unido por dissulfureto) , fragmentos tipo Fab (p. ex., fragmentos Fab, fragmentos Fab' e fragmentos F(ab)2)/ domínios de variável única (p. ex. domínios VH e VL) e anticorpos de domínio (dAbs, incluindo formatos únicos e duplos [isto é, dAb-ligante-dAb]).

As vantagens da utilização de fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros, são imensas. 0 tamanho mais pequeno dos fragmentos pode originar melhores propriedades farmacológicas, tal como melhor penetração de tecido sólido e/ou uma eliminação sanguínea mais rápida, o que pode permitir relações terapêuticas mais elevadas. Além disso, os fragmentos de união ao antigénio, tais como fragmentos de anticorpo Fab, Fv, ScFv e dAb, podem ser expressados nos micro-organismos e segregados a partir dos mesmos, tais como E. coli, permitindo assim a produção simplista de grandes quantidades dos referidos fragmentos.

Igualmente incluídas no âmbito da invenção estão as versões modificadas de anticorpos e fragmentos de união ao antigénio dos mesmos, p. ex. modificadas pela ligação covalente de polietilenoglicol ou outro polímero adequado (consulte abaixo).

Os métodos de geração de anticorpos e fragmentos de anticorpo são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser gerados através de qualquer um dos diversos métodos que utilizam a indução de produção inâvivo de moléculas de anticorpo, o rastreio de bibliotecas de imunoglobulina (Qrlandi. etâal, 1989. Proc. â Natl. â Acad. â Sei. E.U.A. 86:%8%% a %8%7± Winter etâal., 1991, Nature %4 9:2 9% a 2 99) ou a geração de moléculas de anticorpo monoclonal através de linhas celulares na cultura. Estes incluem, mas sem limitação, a técnica de hibridoma, a técnica de hibridoma de célula B humana e a técnica de hibridoma por vírus de Epstein-Barr (EBV) (Kohler etâal., 1975. Nature 256:4950497+ Kozbor etâal., 1985. J.âlmmunol.â Methods 81: %1 a 42+ Cote etâal., 198%. Proc. âNatl. â Acad. â Scí. E.U.A. 80:2026 a 20%0+ Cole etâal., 1984. Mol.âCell.â Biol. 62 :109 a 120) .

Os anticorpos monoclonais adequados para antigénios selecionados podem ser preparados através de técnicas conhecidas, por exemplo, as divulgadas em "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRCâ Press, 1988) e em "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRCâPress, 1982) .

Igualmente, os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos utilizando métodos bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Coldâ Springã Harborâ Laboratory, Nova Iorque). Por exemplo, os fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser preparados através de hidrólise proteolítica do anticorpo ou através de expressão em E. coliã ou células de mamífero (p. ex. , cultura de células de ovário de hamster chinês ou outros sistemas de expressão de proteínas) do ADN que codifica o fragmento. Em alternativa, os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos através de pepsina ou digestão com papaína de anticorpos inteiros através de métodos convencionais.

Será entendido pelos peritos na técnica que para diagnósticos ou terapia humanos, podem ser utilizados anticorpos humanos ou humanizados. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (p. ex. , murinos) são anticorpos quiméricos geneticamente manipulados ou fragmentos de anticorpo com porções mínimas derivadas de anticorpos não humanos. Os anticorpos humanizados incluem anticorpos nos quais as regiões determinantes complementares de um anticorpo humano (anticorpo recetor) são substituídas pelos resíduos de uma região determinante complementar de uma espécie não humana (anticorpo dador) , tal como ratinho, rato ou coelho, com a funcionalidade desejada. Em alguns casos, os resíduos de estrutura Fv do anticorpo humano são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem igualmente compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recetor nem na região determinante de complementaridade importada ou nas sequências de estruturas. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente a totalidade de pelo menos um e habitualmente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões determinantes de complementaridade correspondem às de um anticorpo não humano, e todas ou substancialmente todas as regiões de estrutura correspondem às de uma sequência de consenso humano relevante. Os anticorpos humanizados também incluem otimamente pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo, tal como uma região Fc, habitualmente derivada de um anticorpo humano (consulte, por exemplo, Jones etâal., 1986. Nature %21:522 a 525 + Riechmann etãal., 1988, Nature %%2:%2% a %29± Presta, 1992, Curr,âOp,âStruct.âBiol. 2:59% a 596).

Os métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, o anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoãcido não humanos, muitas vezes referidos como resíduos importados, são habitualmente retirados de um domínio variável importado. A humanização pode ser essencialmente efetuada conforme descrito (consulte, por exemplo, Jones etâal., 1986, Nature %21:522 a 525± Reichmann etâ ai., 1988. Nature %%2:%2% a %27+

Verhoeyen etâ al., 1988, Science 2%9:15%4 a 15%61± US 4.816.567) substituindo regiões determinantes de complementaridade humanas por regiões determinantes de complementaridade de roedor correspondentes. Em conformidade, esses anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos, em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados podem ser habitualmente anticorpos humanos, nos quais alguns resíduos de região determinante de complementaridade e possivelmente alguns resíduos de estrutura são substituídos por resíduos de sítios análogos nos anticorpos de roedores.

Os anticorpos humanos podem igualmente ser identificados utilizando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de visualização de fagos (Phageâ Display) (consulte, por exemplo, Hoogenboom &

Winter, 1991, J.âMol.âBiol. 227:%S1± Marks etâal., 1991, J.â Mol. Biol. 222:581+ Cole etâ al., 1985, Em: Monoclonalâ antibodiesâ andâ Cancerâ Therapy, â Alan R. Liss, pág. 77 + Boerner etâal., 1991. J.âlmmunol. 147:86 a 95).

Depois de obtidos anticorpos adequados, os mesmos podem ser testados relativamente à atividade, por exemplo através de ELISA.

Numa forma de realização alternativa do primeiro aspeto da invenção, a metade de união compreende ou consiste numa metade de união de não-imunoglobulina, por exemplo conforme descrito em Skerra, CurrOpinâBiotechnol. agosto de 2007+ 18(4):295 a %04.

Em conformidade, a metade de união presente no agente de acordo com o primeiro aspeto da presente invenção une-se com especificidade a uma proteína calicreína. Neste contexto, a expressão "une-se com especificidade" significa que a metade de união se une seletivamente à proteína calicreína-alvo preferencialmente em relação a outras proteínas, opcionalmente incluindo outras proteínas calicreína. 0 perito na técnica conhece bem os diversos métodos para a avaliação da especificidade de união de uma molécula de união a um alvo. Por exemplo, quando a molécula de união é, ou se baseia em, um anticorpo, a respetiva capacidade de se unir especificamente a uma proteína calicreína pode ser avaliada através de um imunoensaio, tal como um ELISA, radioimunoensaio ou afins.

Numa forma de realização, pode dizer-se que a metade de união se une com especificidade a uma proteína calicreína se a mesma se unir à proteína calicreína num imunoensaio e/ou em condições fisiológicas (tais como condições encontradas na próstata ou noutros sítios para o tratamento conforme aqui descrito) com uma afinidade de união superior a lxlO5, 1x10s, IxlO7, 2xl07, lxlO8, 2xl08, lxlO9, 2xl09, IxlO10, 2xi010, %x!010, lxlO1* ou mais, tal como dentro da variação de IxlO5 a %xl010, ou mais. A metade de união conforme utilizada no primeiro aspeto da presente invenção tem especificidade relativamente a uma proteína calicreína humana. Uma proteína calicreína humana é uma protéase de serina que pertence à família de genes calicreína de tecido humano que mostrou consistir em pelo menos 15 membros (Hsieh ML, Cancerâ Res 1997± 57± 2651 a 6). As calicreínas são glicoproteínas termoestáveis com uma única cadeia de polipéptidos, com um Mw que varia entre 27 e 40 kDa.

Especificamente, a metade de união conforme utilizado no primeiro aspeto da presente invenção tem especificidade relativamente à calicreína glandular humana (hK2).

Numa forma de realização, a metade de união tem especificidade para PSA. 0 termo PSA pretende incluir cada forma conhecida de PSA, tal como PSA livre, formas precursoras de PSA, formas internamente abertas de PSA, PSA livre de baixo peso molecular, PSA livre de peso padrão, PSA maduro inativo, formas truncadas de PSA, variantes de glicosilação de PSA, BPSA, pró-PSA inativo e cada complexo de PSA, tal como PSA ligado a oíl-antiquimotripsina (ACT) , inibidor αΐ-protéase (API) e a2-macroglobulina (AMG). Um aminoácido primário de exemplo de PSA é fornecido na Fig. 14 (consulte SEQ ID NO:16). 0 PSA segregado de células cancerígenas encontra-se num estado mais ativo em comparação com o PSA segregado do tecido BPH. No fluido extracelular, o PSA pode ser submetido a degradação proteolítica, originando assim perda de atividade e formação de complexos. Deste modo, faz igualmente parte do âmbito da presente invenção a marcação de compostos ou entidades, tais como ACT, API e AMG, unidos ou complexados a/com PSA.

Numa forma de realização preferida, a metade de união tem especificidade para a isoforma livre (ou seja, não complexada) de PSA em comparação com a isoforma complexada de PSA. As metades de união com especificidade para a isoforma livre de PSA podem ter especificidade de união para um epítopo que é exposto na isoforma livre de PSA, mas não é exposto na isoforma complexada de PSA, tal como um epítopo de conformação (ou seja, não linear). Um exemplo de um epítopo de conformação assim é formado a partir de resíduos de aminoácido que fazem parte do ciclo de calicreína que circunda a fenda catalítica de PSA, e pode incluir a tríade de sítio ativo de His41, Asn96 e Serl89). Consulte Leinonen etaal., ClinicalâChemistry 48:12, 2208 a 2216 (2002) para mais descrição e divulgação dos numerosos epítopos adequados no PSA, que são aqui incorporados a título de referência.

Quando a metade de união conforme utilizado no primeiro aspeto da presente invenção tem especificidade para PSA, a metade de união pode competir pela união ao PSA (tal como a isoforma livre de PSA) , ou um péptido compreendendo o epítopo reativo de PSA conforme ligado pela metade de união, com um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em PSA%0, 4D4, 5C% e 5A10, e um fragmento de união ao antigénio do mesmo. É possível encontrar mais descrição desses anticorpos em Pettersson etâ al. , Clín. Chem, 41:10, 1480 a 1488 (1995)+ Nilsson etâal., Brit.âJ.â Cancer, 75:6, 789 a 7 97 (19 97)+ Leinonen etâal.,

ClinicalâChemistry 48:12, 2208 a 2216 (2002)+ Váisánen etâ al., Anal. Chem., 78:7809 a 7815 (2006)+ Evans-Axelsson etâ al. , CancerâBiother.âRadiopharm. 27:4, 24% a 51, EP 1 %20 756 B1+ e US 2004/101914, cujos conteúdos de cada são aqui incorporados a título de referência.

Tal como é bem estabelecido na técnica, os anticorpos completos compreendem seis CDRs, três das quais encontram-se presentes na mudança de cadeia leve variável (VL), e as outras três encontram-se presentes na cadeia pesada variável (VH) . É bem conhecido na técnica que três ou menos regiões CDR (em alguns casos, mesmo só uma única CDR ou uma parte da mesma) são capazes de reter a atividade de união ao antigénio do anticorpo a partir do qual a(s) CDR(s) é(são) derivada(s):

Laune etâal. (1997), JBC, 272:%09%7 a 44 - demonstra que uma variação de hexapéptidos derivou de uma atividade de união ao antigénio de visualização CDR (consulte o resumo) e nota que os péptidos sintéticos de uma CDR única completa apresentam uma forte atividade de união (consulte a página %0 942, coluna direita).

Monnet etâal. (1999), JBC, 274:%789 a 96 - mostra que uma variação de 12-mer péptidos e regiões de estrutura associadas têm atividade de união ao antigénio (consulte o resumo) e comenta que um péptido tipo CDR% sozinho é capaz da união ao antigénio (consulte a página %785, coluna esquerda).

Qiu etâal. (2007), Natureâ Biotechnology, 25:921 a 9 - demonstra que uma molécula que consiste em duas CDRs ligadas é capaz da união ao antigénio (consulte o resumo e a página 926, coluna direita).

Ladner etâal.â (2007), NatureâBiotechnology, 25:875 a 7 -é um artigo de revisão que apresenta Qiu etâal. (acima) e comenta que as moléculas que contêm duas CDRs são capazes de reter atividade de união ao antigénio (consulte a página 875, coluna direita).

Heap etâal. (2005), J. â Gen. â Virol. , 86:1791 a 1800 - relata que um "micro-anticorpo" (uma molécula que contém uma única CDR) é capaz da união ao antigénio (consulte o resumo e a página 1791, coluna esquerda) e mostra que um péptido cíclico de um anticorpo anti-HIV tem função e atividade de união ao antigénio.

Nicaise etâal. (2004) Proteinâ Science, 1% :1882 a 91 - mostra que uma única CDR pode conferir afinidade e atividade de união ao antigénio para o respetivo antigénio de lisozima.

Vaughan e Sollazzo (2001), CombinatorialâChemistryâ&âHighâ Throughputâ Screening, 4:417 a 4%0 é um artigo de revisão que descreve minicorpos que contêm menos de três regiões CDR. Por exemplo, na página 418 (coluna direita -% A Nossa Estratégia de Conceção), é descrito um minicorpo que inclui apenas as regiões hipervariáveis CDR Hl e H2 intercaladas dentro das regiões de estrutura. 0 minicorpo é descrito como sendo capaz da união a um alvo. Quiocho (199%), Nature, %62:29% a 4 - é mais um artigo de tipo revisão que fornece um resumo de tecnologia de minicorpo (isto é, anticorpos miniaturizados - neste caso com menos de três CDRs).

Pessi etâal. (199%), Nature, %62:%67 a 9 e Bianchi etâal. (1994), J. â Mol. â Biol. , 2%6:649 a 59 - são documentos referenciados na crítica de Vaughan e Sollazzo e descrevem o minicorpo Hl e H2 e as respetivas propriedades em mais detalhe.

Gao etâ al. (1994), J. â Biol. â Chem. , 269:%2%89 a 9% que descreve toda uma cadeia VL (incluindo a totalidade das três CDRs) com alta afinidade para o respetivo substrato, o péptido intestinal vasoativo, como prova de que não é necessário ter ambas as cadeias VH e VL.

Estes documentos foram publicados antes da data de prioridade do presente pedido e, por conseguinte, estariam disponíveis para o perito na técnica na implementação da presente invenção. Os mesmos fornecem uma prova clara de que as moléculas que têm menos de seis CDRs são capazes de reter as propriedades de união ao antigénio dos anticorpos para os quais são derivados. 0 termo hK2 pretende incluir todas as formas isoméricas de hK2, e qualquer molécula ou proteína no complexo com hK2. É descrita uma sequência hK2 de exemplo como a Transcrição: KLK2-201 (ENST00000%25%21) , um produto de gene ENSG00000167751, tal como fornecido na base de dados de conjunto que pode ser encontrada no seguinte endereço world-wide-web em:

ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein?g=EN SG00000167 751±r=19:51%76689-51%8%822±t=ENST000QQ%25%21 e tem a seguinte sequência:

MWDLVLSIAL SVGC7GAVPL IQSRSVGGWE CEKHSQPWQV AVYSHGWAHC GGVLVHPQWV LTAAHCLKKN SQVWLGRHNL FEPEDTGQRV PVSHSFPHPL YNMSLLKHQS LRPDEDSSHD LMLLRLSEPA KITDWKVLG LPTQEPALGT TCYASGWGSÍ EPEEFLRPRS LGCVSLHLLS NDMCARAYSE KYTEFMLCAG LWTGGKDTCG GDSGGPLVCN GVLQGÍTSWG PEPCALPEKP AVYTKWHYR KWIKDTfAAN P [SEQ SD NO:31 A maioria da hK2 encontrada no plasma seminal é inativa e complexada com o inibidor de proteína C (PCI). É igualmente possível que hK2 forme complexos com outros inibidores de protéase extracelular. Os estudos inãvitroâ mostram que hK2 pode unir-se a «2-antiplasmina (oc2-AP), ACT, AMG, anti-trombina III (ATUI), Cl-inativador e inibidor-1 de ativador do plasminogénio (PAI-1).

Deste modo, faz igualmente parte do âmbito da presente invenção a marcação de compostos, moléculas, proteínas ou qualquer outra entidade, tal como PCI, «2-antiplasmina (oí2-AP) , ACT, AMG, anti-trombina III (ATUI), Cl-inativador e inibidor-! de ativador do plasminogénio (PAI-i), unido ou complexado a/com hK2.

Numa forma de realização, a metade de união pode ter especificidade para a isoforma livre (ou seja, não complexada) de hK2 em comparação com isoforma complexada de hK2. As metades de união com especificidade para a isoforma livre de hK2 podem ter especificidade de união para um epítopo que é exposto na isoforma livre de hK2, mas não é exposto na isoforma complexada de hK2, e isto pode ser um epítopo linear ou de conformação (ou seja, não linear). Por exemplo, a metade de união pode ter especificidade para um epítopo que inclui um ou mais resíduos de aminoãcido que fazem parte da fenda catalítica de hK2 que é exposta na liK2 livre e não é exposta numa isoforma complexada, tal como a forma presente no fluido seminal quando hK2 é complexada para PCI. 0 mapeamento de epítopos de liK2 é descrito em Váisânen etâ al., Clinicalâ Chemistry 50:9, 1607 a 1617 (2004), cujas divulgações são aqui incorporadas a título de referência.

Quando a metade de união conforme utilizado no primeiro aspeto da presente invenção tem especificidade para hK2, a metade de união pode competir pela união à hK2, ou a um péptido compreendendo o epítopo reativo de li2K conforme ligado pela metade de união, com um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 11 B6 e 7G1. É possível encontrar mais descrição desses anticorpos em Vãisãnen etâ al. , Clinicalâ Chemistry, 50:9, 1607 a 1617 (2004)+ e Vãisãnen etâ al. , Anal. Chem., 78:7809 a 7815 (2006), cujos conteúdos de cada são aqui incorporados a título de referência, A sequência de aminoãcidos das cadeias pesadas e leves constituintes do anticorpo anti-hK2 11 B6 de exemplo é ilustrada abaixo (na qual as sequências CDR se encontram sublinhadas).

CadeiaâpesadaâllB6â

D VQLQ ESGPGLVKPSQSf SITCTVT GN S ST SDYAW NW 1 KQ FPGNRLE W MG Y1SYSGSTT YS

FStKSR FSS TRPTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGPWGQGTLVTVSSÍSEQ SO mm

CadeiaâleveâllB6â

GVPARFSSSGSGTDFSUMiQFVEEPPFSMYFCQQTRKVFYTFGGGTKLElK |SiQ 10 NO:5J

Neste contexto, o termo "compete" inclui o significado de que a presença do agente compreendendo a metade de união num ensaio competitivo juntamente com um anticorpo de referência selecionado a partir de 11 B6 e 7G1 pode reduzir o nível de união detetável do anticorpo de referência para hK2 em 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 100 % (por exemplo, quando o agente e o anticorpo de referência se encontram presentes no teste em quantidades equimolares, e opcionalmente quando o teste é efetuado em condições fisiológicas). Essa análise pode ser efetuada através de um ensaio imunorradiométrico (IRMA) conforme descrito no Exemplo 9.

Quando a metade de união conforme utilizado no primeiro aspeto da presente invenção tem especificidade para hK2, a metade de união pode compreender uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 1!B6 e 7G1 (conforme ilustrado pelas sequências sublinhadas nas SEQ ID NOS: 10 a 1% acima). Não é necessário que as moléculas de união contenham a totalidade das seis CDRs de qualquer um destes anticorpos de modo a reter a atividade de união ao antigénio, embora numa forma de realização a molécula de união possa compreender a totalidade das seis CDRs de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 11 B6 e 7G1.

Em alternativa, a metade de união pode compreender menos de seis CDRs, tal como: ® cinco CDRs (isto é, CDRs da região VH ou VL, 2 CDRs da outra região variável)± ® quatro CDRs (isto é, % CDRs da região VH ou VL, 1 CDR da outra região variável± ou 2 CDRs de cada uma das regiões VH e VL)± • três CDRs (isto é, a totalidade das três CDRs de uma das regiões VH ou VL, e nenhuma da outra± ou 2 CDRs da região VH ou VL, 1 CDR da outra região variável)± • duas CDRs (isto é, duas CDRs de uma das regiões VH ou VL, e nenhuma da out.ra± ou 1 CDR de cada uma das regiões VH e VL) ± ou • uma CDR de uma das regiões VH ou VL, de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 11 B6 e 7G1.

Numa forma de realização preferida, quando a metade de união conforme utilizado no primeiro aspeto da presente invenção tem especificidade para hK2, a metade de união corresponde a um anticorpo, ou fragmento de união ao antigénio ou derivado do mesmo, compreendendo as seis CDRs do anticorpo anti-hK2 11 B6 de exemplo (consulte as sequências sublinhadas das SEQ ID NOs: 4 e 5).

Numa forma de realização alternativa, quando a metade de união conforme utilizado no primeiro aspeto da presente invenção tem especificidade para hK2, a metade de união pode compreender ou consiste num anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 11B6 e 7G1, e fragmentos de união ao antigénio dos mesmos. 0 agente utilizado no primeiro aspeto da presente invenção compreende ainda uma metade terapêutica (citotóxica). A metade de união pode ser ligada direta ou indiretamente à metade terapêutica.

No caso de o agente poder compreender ou consistir numa metade de união conforme descrito acima e numa metade terapêutica, o agente pode apresentar características de absorção do tumor, por exemplo conforme testado nas condições utilizadas nos exemplos abaixo, substancialmente equivalentes às características de absorção do tumor de um agente que consiste na metade de união sozinha. Neste contexto, substancialmente equivalente inclui o significado de superior a 10 ã, 20 ã, %Q ã, 40 ã, 50 ã, 60 á, 70 ã, 80 á, 90 ã, 95 á, 99 ã ou substancialmente 100 á. É possível utilizar qualquer metade terapêutica adequada. Uma metade terapêutica adequada é uma que seja capaz de reduzir ou inibir o crescimento, ou em particular matar, uma célula de cancro da próstata. Especificamente, o agente terapêutico é uma metade citotóxica. Uma metade citotóxica pode compreender ou consistir num ou em mais radioisótopos. Por exemplo, um ou mais radioisótopos podem ser independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em emissores beta, emissores Auger, emissores de eletrão de conversão, emissores alfa e emissores de baixa energia de fotões. Pode ser desejado que um ou mais radioisótopos tenham independentemente um padrão de emissão de energia localmente absorvida que crie uma elevada dose absorvida nas proximidades do agente. Os radioisótopos de exemplo podem incluir emissores beta de longo alcance, tais como 90Y, %2P, 186Re/l88Re± i65Ho, 76As/7'As, 89Sr, 15%Sm± emissores beta de médio alcance, tais como 1%1I, 177Lu 67Cu l0lTb, i0bRh± emissores beta de baixa energia, tais como 45Ca ou %5S± emissores Auger ou de conversão, tais como 5iCr, S7Ga, 99Tcm, li:LIn, ll4mln, 12%I, 125I, 201TI+ e emissores alfa, tais como 212Bi, 21%Bi, 22%Ac, 225Ac, 212Pb, 255Fm, 22%Ra, 149Tb e 22iAt. Outros exemplos de radionuclídeos terapêuticos podem ser observados na Fig. 9. Outros radionuclídeos encontram-se disponíveis e poderão ser utilizados para a terapia. Noutra forma de realização, pode ser desejado que a metade terapêutica ou metade citotóxica não seja uma metade conforme divulgado como um "indicador" no documento WO 2006/087%74 AI, em particular na página 11, linhas 7 a 15 do mesmo.

Numa forma de realização preferida, a metade terapêutica corresponde a 17''Lu. Por exemplo, o agente pode ser uma forma marcada por 17,Lu do anticorpo anti-hK2 11 B6, ou de um fragmento de união ao antigénio ou derivado do mesmo.

Em alternativa, a metade terapêutica compreende ou consiste num ou em mais fármacos terapêuticos (tais como citotõxicos), por exemplo, um fármaco citostãtico± um fármaco antiandrogénico± cortisona e derivados da mesma± um fosfonato± um inibidor de testost.erona-5-a-redutase± uma adenda de boro± uma citocina± tapsigargina e respetivos metabolitos± uma toxina (tal como saporina ou caliquiamicina)± um agente quimioterapêutico (tal como um antimetabolito)± ou qualquer outro fármaco terapêutico ou citotóxico útil no tratamento de carcinoma da próstata.

Os fármacos terapêuticos/citotóxicos de exemplo podem, por exemplo, incluir: ® citostáticos, em particular os que têm efeitos secundários limitativos de dose, incluindo, mas não se limitando a, ciclofosamida, clorambucil, ifosfamida, bussulfano, lomustina, taxanos, fosfato de estramustina e outras mostardas de azoto, antibióticos (incluindo doxorubicina, caliquiamicinas e esperamicina), alcaloides da vinca, azaridinas, compostos que contêm platina, endostatina, sulfonatos de alquilo, nitrosureias, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, enzimas, ureia substituída, derivados de metil-hidrazina, daunorrubicina, aminas anfipãticas+ • anti-androgénios, tais como flutamida e bicalutamida e metabolitos dos mesmos± • cortisona e derivados da mesma± ® fosfonatos, tais como difofonato e bufosfonato± ® inibidores de testosterona-5-a-redutase± • adendas de boro± • citocinas± ® tapsigargina e respetivos metabolitos± ® outros agentes utilizados no tratamento de carcinoma da próstata.

Em alternativa, a metade citotóxica compreende ou consiste numa ou em mais metades adequadas para a utilização na terapia de ativação, tais como terapia de ativação de fotões, terapia de ativação de neutrões, terapia de eletrões de Auger induzida por neutrões, terapia de irradiação de sincrotrão ou terapia de ativação de fotões de raios X de baixa energia.

Por exemplo, com os agentes de direcionamento ao tumor de acordo com a presente invenção, existirá o potencial de utilização de radiação de sincrotrão (ou raios X de baixa energia) para o progresso da radioterapia, concentrando-se essencialmente na chamada radioterapia de ativação de fotões (PAT), na qual a deposição de energia local da irradiação de raios X externa é melhorada no tecido cancerígeno através da interação com um agente de direcionamento ao tumor de Z elevado previamente administrado, consulte a Fig. 10. A modalidade de tratamento PAT utiliza raios X monocromáticos de uma fonte de sincrotrão, tal como fornecido pela linha de luz biomédica ID17 na European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) em Grenoble, e conforme antecipado como estando disponível em outras instalações no futuro, tal como a nova instalação de sincrotrão sueca, Max-IV.

Como uma outra potencial modalidade de tratamento, a investigação sobre "terapia de tumor de eletrões de Auger induzida" ê a próxima European Spallation Source (ESS) em Lund, e esperançosamente uma estação experimental médica. Há muito tempo que são utilizados neutrões térmicos e semitérmicos produzidos no reator para a Terapia de Captura de Boro-Neutrão (BNCT), tanto para experiências pré-clínicas como para o tratamento de tumores cerebrais com as partículas alfa induzidas e o núcleo de recuo ('L) que fornecem uma energia elevada absorvida localmente. Uma abordagem semelhante é a utilização de neutrões e moléculas de direcionamento ao tumor adequadas marcadas com núcleos estáveis com uma elevada secção para neutrões. Os anticorpos ou os péptidos podem, por exemplo, ser marcados com Gadolínio estável (i57Gd) e agir como a molécula-alvo para os neutrões que são capturados pelo núcleo Gd, a chamada GadoliniumâNeutronâCaptureâTherapyâ(GdNCT).âAtravés das técnicas de Monte Carlo, a distribuição de doses no tumor e nos tecidos circundantes é calculada à medida que resulta de y-fotões, neutrões, recuos nucleares, bem como raios X característicos, conversão interna e eletrões de Auger de gadolínio ou outros potenciais elementos.

Como descrito acima, a metade terapêutica (metade citotóxica) pode ser ligada direta ou indiretamente à metade de união (tal como um anticorpo ou fragmento do mesmo). Os ligantes adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, grupos proféticos, ligantes não fenólicos (derivados de N-succimidil-benzoatos± dodecaborato), metades de quelação dos quelantes macrocíclicos e acíclicos, tais como derivados de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10,tetraacético (DOTA), derivados de ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA), derivados de ácido S-2-(4-Isotiocianatobenzil)-1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) e derivados de ácido 1,4,8,11-tetraazaciclodocedan-1,4,8,11- tetraacético (TETA) e outras metades de quelação. A utilização desses ligantes pode ser particularmente apropriada em circunstâncias em que o agente compreende ou consiste num anticorpo ou fragmento do mesmo como a metade de união ligada, através de um ligante, a um radioisõtopo como a metade terapêutica.

Um ligante preferido é DTPA, por exemplo conforme utilizado em 1 /7Lu-DTPA- 11B6 .

Opcionalmente, o agente utilizado no primeiro aspeto da presente invenção pode (ou pode não) compreender ainda uma metade detetável. Por exemplo, uma metade detetável pode compreender ou consistir num radioisõtopo, tal como um radioisõtopo selecionado a partir do grupo que consiste em: Tecnécio-99m± índio-lll± Gãlio-67± Gálio-68± Arsénio-72± Zircónio-89± Iodo-12%, Iodo-124, Iodo-125± Tálio-201.

Opcionalmente, o agente pode compreender um par de radionuclídeos detetáveis e citotõxicos, tais como 85Y,/90Y ou 124I/211At. Em alternativa, o agente pode compreender um radioisõtopo que seja capaz de agir simultaneamente de uma maneira multimodal como uma metade detetável e igualmente como uma metade citotóxica para fornecer o chamado "Teragnóstico de multimodalidade". As metades de união podem assim ser acopladas a nanopartículas que têm a capacidade de imagens múltiplas (por exemplo, SPECT, PET, MRI, Ótica ou Ultrassom) juntamente com a capacidade terapêutica utilizando fármacos citotõxicos, tais como radionuclídeos ou agentes de quimioterapia. Igualmente incluída na presente invenção é a possibilidade de tratamento através de hipertermia utilizando campos magnéticos alternados de frequência elevada e imagens de ultrassom acompanhadas. Por exemplo, consulte a Fig. 11.

Em alternativa, a metade detetável pode compreender ou consistir num isótopo paramagnético, tal como um isótopo paramagnético selecionado a partir do grupo que consiste em: gadolínio-157+ manganésio-55, disprósio-162, crómio-52± ferro-56.

No caso de o agente utilizado no primeiro aspeto da presente invenção compreender uma metade detetável, a metade detetável pode ser detetável através de uma técnica de imagens, tal como SPECT, PET, MRI, Ótica ou imagens de ultrassom.

As metades terapêuticas e detetáveis podem ser conjugadas ou então combinadas com a metade de união utilizando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, a terapia de imunoconjugado existente, gentuzumab ozogamicina [nome comercial: Mylotarg®], compreende um anticorpo monoclonal ligado à caliqueamicina de citotoxina).

Numa outra forma de realizaçao, o agente utilizado de acordo com o primeiro aspeto da invenção é utilizado para tratar o cancro da próstata na forma de uma formulação compreendendo uma população de moléculas de agente. Numa opção, todas (ou substancialmente todas, tais como mais de 90 IS3 , 95 0 , 99 0 , 99,9 0 ou mais em peso) as molásude agente na população utilizada para o tratamento compreendem a mesma metade terapêutica. Noutra opção, a população compreende uma mistura de outros agentes com diferentes metades terapêuticas. Esta opção permitirá melhorar os efeitos da terapia de radionuclrdeos direcionada utilizando vários agentes, tais como agentes de quimioterapia, agentes de terapia hormonal ou outra combinação de terapias na qual o agente de direcionamento não só distribui radionuclídeos terapeuticamente ativos a antigénios associados ao tumor, como também radiossensibiliza simultaneamente as células de tumor direcionadas acionando uma cascata de sinalização intracelular. Esta opção é igualmente útil no tratamento do cancro da próstata com uma mistura de agentes citotóxicos, por exemplo, utilizando uma mistura de emissores alfa e diferentes alcances de emissores beta, ou uma mistura de radionuclídeos com um alcance diferente, LET (Linear Energy-Transfer - Transferência de Energia linear) e RBE (Relative Biological Effect - Efeito Biológico Relativo), para o tratamento combinado de grandes tumores, micrometástases e células tumorais únicas. Numa forma de realização, os emissores de longo alcance podem ser utilizados para o tratamento de grandes tumores, e os emissores de curto alcance podem ser utilizados para o tratamento de tumores mais pequenos, tais como micrometástases e células tumorais únicas.

Opcionalmente, o agente utilizado no primeiro aspeto da presente invenção pode (ou pode não) compreender ainda uma metade para aumentar a semivida inâvivoâdo agente. As metades de exemplo para aumentar a semivida inâ vivoâ do agente podem incluir polietilenoglicol (PEG), soralbumina humana, grupos de glicosilação, ácidos gordos e dextrano. 0 PEG pode ser particularmente contemplado.

Numa forma de realização da invenção, os agentes que compreendem um agente de união (p. ex. , anticorpo ou fragmento do mesmo) que são específicos para uma proteína calicreína, tal como PSA ou hK2, e um agente terapêutico são depois injetados/colocados em infusão no corpo. Em seguida, o agente une-se a tecidos que produzem antigénios correspondentes, tais como PSA ou hK2. As estruturas biológicas, às quais o agente se une, podem ser subsequentemente tratadas com um agente adequado e podem ser utilizados dosimetria e/ou métodos de imagens de avaliação de terapia incluindo PET/SPECT/CT/MR/Õtica/Ultrassom.

Em algumas circunstâncias, as variações na extensão da atenuação das células do cancro da próstata através do agente podem corresponder diretamente às relações de produção e concentração da calicreína-alvo (tal como PSA e hK2) nas células de cancro da próstata do paciente. Estas variações podem ser determinadas, por exemplo, através dos métodos do documento WO 2006/087%4, métodos esses que são aqui incorporados a título de referência, e utilizados para obter informações terapêuticas.

Por exemplo, as visualizações de pré-terapia de uniões de anticorpo PSA e hK2, obtidas a partir dos métodos de imagens mencionados acima, podem ser combinadas com os métodos e as utilizações da presente invenção. A partir da medição das atenuações, é possível determinar diretamente se o tecido investigado é ou não produtor de PSA, produtor de hK2 ou ambos. Tendo em consideração esta determinação, sera possrvel adaptar a terapia para ser mais eficaz. Deste modo, a terapia de paciente individualizada pode ser alcançada com planeamento de dose pré-terapia. A orientação para a terapia de paciente individualizada pode ser retirada das terapias conhecidas na técnica, tais como as descritas em (1) Garkavij, etâal. (2010) Cancer, 116:1084 a 1092+ (2) Linden, etâal. (1999) Clin.CancerâRes., 5:%287s a %291s± (%) Ljungberg, etâ al. (200%) Cancerâ

Blotter.Radiopharm., 18:99 al07± (4) Minarik, etâ al., (2010) J.Nucl.Med. , 51:1974 a 1978± (5) Sjogreen-Gleisner, etâal. (2011) Q.âJ.âNucl.âMed.âMol.âlmaging, 55:126 a 154+ e (6) Sjogreen, etâal. (2005) CancerâBiother.Radiopharm. , 20:92 a 97+ cujos conteúdos década são aqui incorporados a título de referência.

Em conformidade, numa forma de realização, o primeiro aspeto da invenção envolve o tratamento de um paciente determinado para possuir células de cancro da próstata produtoras de PSA com um agente de acordo com o primeiro aspeto da presente invenção que tem especificidade para PS A.

Noutra forma de realização, o primeiro aspeto da invenção envolve o tratamento de um paciente determinado para possuir células de cancro da próstata produtoras de hK2 com um agente de acordo com o primeiro aspeto da presente invenção que tem especificidade para calicreína glandular humana (hK2).

Noutra forma de realização, o primeiro aspeto da invenção envolve o tratamento de um paciente determinado para possuir células de cancro da próstata que sejam produtoras de PSA e produtoras de hK2 com um agente de acordo com o primeiro aspeto da presente invenção que tenha especificidade para a calicreína glandular humana (hK2) e PSA, ou uma combinação de agentes, em que um dos quais possui especificidade para PSA e o outro possui especificidade para hK2. No caso da terapia de combinação, os agentes podem ser administrados ao paciente separadamente, sequencialmente, simultaneamente ou formulados como uma mistura na mesma composição farmacêutica. A administração de um agente de acordo com o primeiro aspeto da presente invenção a um paciente com cancro da próstata pode assim resultar 11a união de uma proteína calicreína, tal como antigénio específico da próstata (PSA+ hk%, gene de calicreína humana %) e/ou calicreína glandular humana (hK2), presente nas células de cancro da próstata, e resultar na inibição do crescimento e/ou na morte das células de cancro da próstata no paciente. Por exemplo, o agente pode reduzir o crescimento da taxa, e/ou a presença, das células de cancro da próstata no paciente em pelo menos 10 á, em particular pelo menos 20 á, %0 ã, 40 ã, 50 ã, 60 I , 70 I , 80 I ou 90 0 , e mais particularmente ei0 EG em comparação com a taxa observada de crescimento, e/ou presença, das células de cancro da prostata no paciente antes do tratamento. Os métodos de medição da taxa de crescimento, e/ou presença, das células de cancro da próstata num sujeito são conhecidas na técnica.

Deste modo, a invenção fornece métodos para o tratamento do cancro da próstata. 0 termo "tratamento" inclui o tratamento terapêutico e profilático do paciente. 0 termo "profilático" é utilizado para abranger a utilização de um agente, ou formulação do mesmo, conforme aqui descrito, o que previne ou reduz a probabilidade de cancro da próstata, ou a propagação, a disseminação ou a metástase do cancro da próstata localizado num paciente ou sujeito. 0 termo "profilático" abrange igualmente a utilização de um agente, ou formulação do mesmo, conforme aqui descrito para prevenir a recorrência do cancro da próstata num paciente que foi anteriormente tratado relativamente ao cancro da próstata. 0 cancro da próstata a ser tratado pelo primeiro aspeto da presente invenção pode localizar-se na próstata, ou pode ser um cancro da próstata não localizado (ou seja, disseminado). 0 cancro da próstata localizado na próstata pode, por exemplo, ser classificado como cancro TI ou T2 clínico de acordo com o sistema TNM (abreviatura de Tumor/Nós/Metástases), ao passo que o cancro da próstata não localizado/disseminado pode, por exemplo, ser classificado como cancro T% ou T4 clínico. 0 cancro da próstata a ser tratado pelo primeiro aspeto da presente invenção pode ser cancro da próstata metastático. A metástase refere-se à propagação de um cancro a partir da respetiva localização original para outros sítios no corpo. Por exemplo, o cancro da próstata metastático a ser tratado pode ser uma metástase presente no sistema linfático± no osso (incluindo coluna vertebral, vértebras, pélvis, costelas)± metãstase na pélvis, no reto, na bexiga ou na uretra. As metãstases presentes noutras localizações menos comuns podem igualmente ser tratadas com a presente invenção. As metãstases podem ser micrometãstases. As micrometástases são uma forma de metãstases nas quais os tumores recentemente formados são geralmente demasiado pequenos para serem detetados, ou são detetados com dificuldade. Por exemplo, a presente invenção fornece ao perito na técnica meios para tratar células de cancro únicas ou agrupamentos de células, mesmo que a presença dessas células ou desses agrupamentos não seja possível de diagnosticar, mas exista, por exemplo, como doença disseminada oculta.

Em conformidade, prevê-se que uma vantagem técnica particularmente importante do tratamento fornecido pela presente invenção em comparação com os tratamentos do estado da técnica do cancro da próstata é a eficácia melhorada no tratamento de cancro da próstata disseminado e/ou metastãtico (incluindo micrometastãtico).

Deste modo, numa forma de realização, a invenção fornece agentes e métodos para a prevenção ou o tratamento de metãstase de um tumor de próstata primário. 0 cancro da próstata tem tendência para se desenvolver nos homens com cerca de cinquenta anos de idade, mais geralmente nos homens com mais de 60, 6 5 ou 70 anos, e embora seja um dos tipos de cancro mais predominantes nos homens, muitos nunca tiveram sintomas, não foram submetidos a nenhuma terapia e eventualmente morreram de outras causas. Isto deve-se ao facto de o cancro da próstata ser, na maioria dos casos, de crescimento lento e sem sintomas, e uma vez que os homens com esta condição são mais velhos, muitas vezes morrem de causas não relacionadas com o cancro da próstata, tais como doença cardíaca/circulatõria, pneumonia, outros cancros sem relação ou velhice. Cerca de dois terços dos casos de cancro da próstata são de crescimento lento, o outro terço é mais agressivo e de desenvolvimento rápido.

Em conformidade, o desenvolvimento de tratamentos eficazes de cancro da próstata é particularmente importante para a gestão de formas mais agressivas e de desenvolvimento rápido do cancro, particularmente num paciente mais jovem. Em conformidade, numa forma de realização, o primeiro aspeto da invenção refere-se ao tratamento do cancro da próstata num paciente com menos de 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 ou menos anos de idade na altura do diagnóstico do cancro da próstata e/ou na altura do tratamento.

Parte-se do princípio de que os homens que têm um parente em primeiro grau (pai ou irmão) com cancro da próstata têm o dobro do risco de desenvolver cancro da próstata, e parte-se do princípio de que os que têm dois parentes em primeiro grau afetados têm um risco cinco vezes maior em comparação com os homens sem histórico familiar. Em conformidade, o primeiro aspeto da invenção pode relacionar-se com o tratamento de cancro da próstata num paciente que seja caracterizado por um, dois ou mais membros da família, em particular membros da família em primeira grau (tal como o pai ou um irmão) , terem sido anteriormente diagnosticados com cancro da próstata. 0 primeiro aspeto da invenção refere-se igualmente ao tratamento do cancro da próstata num paciente, em que o cancro da próstata a ser tratado é cancro da próstata resistente à castração (CRPC). 0 CRPC pode ser caracterizado por se tornar habitualmente refratário ao tratamento hormonal após um a três anos, e por retomar o crescimento apesar da terapia hormonal. A presente invenção fornece igualmente uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente conforme definido acima relativamente ao primeiro aspeto da presente invenção e um diluente, portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Os compostos adicionais podem igualmente ser incluídos nas composições farmacêuticas, incluindo, agentes de quelação, tais como EDTA, citrato, EGTA ou glutationa.

As composições farmacêuticas podem ser preparadas de uma maneira conhecida na técnica que seja suficientemente estável em termos de armazenamento e adequada para a administração a seres humanos e animais. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser liofilizadas, p. ex., através de liofilização, secagem por pulverização, arrefecimento por pulverização ou através da utilização de formação de partículas a partir da formação de partículas supercrítica. A expressão "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não diminui a eficácia da atividade de união à proteína calicreína do agente da invenção. Esses tampões, portadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (consulte "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a edição, A.R Gennaro, Ed., MackâPublishingâCompany (1990) e "handbook of Pharmaceutical Excipients", %a edição, A. Kibbe, Ed., Pharmaceuticalâ Press (2000), cujas divulgações são aqui incorporadas a título de referência). 0 termo "tampão" pretende significar uma solução aquosa que contém uma mistura à base de ácido com o propósito de estabilizar o pH. Os exemplos de tampões são Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, acido imidazol-latico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO e TES. 0 termo "diluente" pretende significar uma solução aquosa ou não aquosa com o propósito de diluir o agente na preparação farmacêutica. 0 diluente pode ser um ou mais entre soro fisiológico, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, etanol ou óleos (tais como óleo de cãrtamo, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de algodão ou óleo de sésamo), 0 termo "adjuvante" pretende significar qualquer composto adicionado à formulação para aumentar o efeito biológico do agente da invenção. 0 adjuvante pode ser um ou mais entre sais de zinco, cobre ou prata com aniões diferentes, por exemplo, mas não se limitando a, fluoreto, cloreto, brometo, iodeto, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato e acetatos de diferente composição de acilo. 0 adjuvante pode igualmente corresponder a polímeros catiónicos, tais como éteres de celulose catiónicos, ésteres de celulose catiónicos, ácido hialurónico deacetilado, quitosana, dendrímeros catiónicos, polímeros sintéticos catiónicos, tais como poli(vinil-imidazol), e polipeptidos catiónicos, tais como polihistidina, polilisina, poliarginina e péptidos que contêm estes aminoãcidos. 0 excipiente pode ser um ou mais entre hidratos de carbono, polímeros, lípidos e minerais. Os exemplos de hidratos de carbono incluem lactose, glicose, sacarose, manitol e ciclodextrinas, que são adicionados à composição, p. ex., para facilitar a liofilização. Os exemplos de polímeros são amido, éteres de celulose, celulose, carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxieti1celulose, etilhidroxietilcelulose, alginatos, carrageninas, ácido hialurónico e derivados do mesmo, ácido poliacrílico, polissulfonato, óxido de polietilenoglicol/polietileno, copolímeros de óxido de polietileno/polipropileno, polivinilálcool/polivinilacetato de grau diferente de hidrólise e polivinilpirrolidona, todos de peso molecular diferente, que são adicionados à composição, p. ex., para controlo de viscosidade, para alcançar bioadesão, ou para proteger o lípido contra a degradação química e proteolítica. Os exemplos de lípidos são ácidos gordos, fosfolípidos, mono-, di- e triglicéridos, ceramidas, esfingolípidos e glicolípidos, todos de saturação e comprimento de cadeia de acilo diferentes, lecitina de ovo, lecitina de soja, lecitina de ovo e soja hidrogenada, que são adicionados à composição por motivos semelhantes aos dos polímeros. Os exemplos de minerais são talco, óxido de magnésio, óxido de zinco e óxido de titânio, que são adicionados à composição para obter benefícios, tais como a redução de acumulação de líquido ou propriedades de pigmento vantajosas.

Os agentes da invenção podem ser formulados em qualquer tipo de composição farmacêutica conhecida na técnica para ser adequada para a distribuição da mesma.

Numa forma de realização, as composições farmacêuticas da invenção podem encontrar-se na forma de um lipossoma, no qual o agente é combinado, além de outros portadores farmaceuticamente aceitáveis, com agentes anfipáticos, tais como lípidos, que existem em formas agregadas como micelas, monocamadas insolúveis e cristais líquidos. Os lípidos adequados para a formulação de lipossomas incluem, sem limitação, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatídeos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares e afins. Os lípidos adequados incluem igualmente os lípidos acima modificados por poli(etilenoglicol) no grupo principal polar para prolongar o tempo de circulação da corrente sanguínea. A preparação dessas formulações de lipossomas pode ser encontrada por exemplo no documento US 4.2%5.871, cujas divulgações são aqui incorporadas a título de referência.

As composições farmacêuticas da invenção podem igualmente encontrar-se na forma de microesferas biodegradáveis. Os poliésteres alifáticos, tais como poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímeros de PLA e PGA (PLGA) ou poli(carprolactona) (PCL) e polianidridos, foram amplamente utilizados como polímeros biodegradáveis na produção de microesferas. As preparações dessas microesferas podem ser encontradas nos documentos US 5.851.451 e EP 0 21% %0%, cujas divulgações são aqui incorporadas a título de referência.

Numa outra forma de realização, as composições farmacêuticas da invenção são fornecidas na forma de geles de polímero, em que os polímeros, tais como amido, éteres de celulose, celulose, carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, etilhidroxietilcelulose, alginatos, carrageninas, ácido hialurónico e derivados do mesmo, ácido poliacrílico, polivinilimidazol, polissulfonato, óxido de polietilenoglicol/polietileno, copolímeros de óxido de polietileno/polipropileno, polivinilálcool/polivinilacetato de grau diferente de hidrólise e polivinilpirrolidona, são utilizados para o espessamento da solução que contém o agente. Os polímeros podem igualmente compreender gelatina ou colagénio.

Em alternativa, os agentes podem simplesmente ser dissolvidos em soro fisiológico, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, etanol ou óleos (tais como óleo de cártamo, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de algodão ou óleo de sésamo), goma tragacanto e/ou vários tampões.

Será entendido que as composições farmacêuticas da invenção podem incluir iões e um pH definido para a potenciação de ação do agente ativo. Adicionalmente, as composições podem ser submetidas a operações farmacêuticas convencionais, tais como esterilização e/ou podem conter adjuvantes convencionais, tais como conservantes, estabilizadores, agentes de humedecimento, emulsionantes, tampões, enchimentos, etc.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser administradas através de qualquer via adequada conhecida dos peritos na técnica. Deste modo, as vias possíveis de administração incluem parentérica (intravenosa, subcutânea e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, parentérica e retal. Ê igualmente possível a administração a partir de implantes. A infusão pode ser uma via desejada por causa da citotoxicidade potencialmente elevada do agente administrado.

Numa forma de realização, as composições farmacêuticas são administradas parenteralmente, por exemplo, por via intravenosa, intracerebroventricular, intra-articular, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrasternal, intracraniana, intramuscular ou subcutânea, ou podem ser administradas através de técnicas de infusão. As mesmas são convenientemente utilizadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou glicose suficientes para tornar a solução isotónica com sangue. As soluções aquosas devem ser adequadamente tamponadas (por exemplo, para um pH de % a 9), se necessário. A preparação de formulações parentéricas adequadas em condições estéreis é facilmente realizada através de técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas dos peritos na técnica.

As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, agentes bacteriostãticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recetor pretendido± e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessamento. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de unidose ou dose múltipla, por exemplo ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas numa condição congelada a vácuo (liofilizada) que necessita apenas da adição do portador de líquido estéril, por exemplo água para injeções, imediatamente antes da utilização. As suspensões e soluções de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo anteriormente descrito.

Deste modo, as composições farmacêuticas da invenção são particularmente adequadas para administração parentérica, p. ex. intravenosa.

Em alternativa, as composições farmacêuticas podem ser administradas por via intranasal ou por inalação (por exemplo, na forma de uma apresentação de pulverização por aerossol a partir de um recipiente pressurizado, uma bomba, um pulverizador ou um nebulizador com a utilização de um propulsor adequado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluoro-metano, diclorotetrafluoro-etano, um hidrofluoroalcano, tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 1%4A% ou 1,1,1,2,%,%,%-heptafluoropropano (HFA 227EA%), dióxido de carbono ou outro gás adequado) . No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada através do fornecimento de uma válvula para distribuir uma quantidade medida. 0 recipiente pressurizado, a bomba, o pulverizador ou o nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do polipéptido ativo, p. ex., utilizando uma mistura de etanol e o propulsor como o solvente, que pode adicionalmente conter um lubrificante, p. ex., trioleato de sorbitano. As cápsulas e os cartuchos (feitos, por exemplo, de gelatina) para a utilização num inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura em pó de um composto da invenção e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido.

As composições farmacêuticas serão administradas num paciente numa dose farmaceuticamente eficaz. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz", ou "quantidade eficaz" ou "terapeuticamente eficaz", como aqui utilizado, refere-se a essa quantidade que fornece um efeito terapêutico para uma determinada condição e um regime de administração. Isto é uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir um efeito terapêutico desejado com a colaboração do aditivo e diluente necessários, isto é, um portador ou veículo de administração. Além disso, pretende significar uma quantidade suficiente para reduzir e/ou prevenir um défice clinicamente significativo na atividade, função e resposta do hospedeiro. Em alternativa, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para causar um melhoramento numa condição clinicamente significativa num hospedeiro. Tal como é entendido pelos peritos na técnica, a quantidade de um composto pode variar dependendo da respetiva atividade específica. As quantidades de dosagem adequadas podem conter uma quantidade predeterminada de composição ativa calculada para produzir o efeito terapêutico desejado com a colaboração do diluente necessário. Nos métodos e na utilização para o fabrico de composições da invenção, é fornecida uma quantidade terapeuticamente eficaz do componente ativo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada pelo assistente médico perito na técnica com base nas características do paciente, tais como idade, peso, sexo, condição, complicações, outras doenças, etc., tal como é bem conhecido na técnica. A administração da dose farmaceuticamente eficaz pode ser realizada através de administração única na forma de uma dose unitária individual ou então diversas doses unitárias mais pequenas, e igualmente através de múltiplas administrações de doses subdivididas em intervalos específicos. Em alternativa, a dose pode ser fornecida como uma infusão contínua durante um período de tempo prolongado. 0 agente definido acima relativamente ao primeiro aspeto da presente invenção pode ser formulado em várias concentrações, dependendo da eficácia/toxicidade do composto que está a ser utilizado. A formulação pode compreender o agente ativo numa concentração entre 0,1 μΜ e 1 μΜ, entre 1 μΜ e 500 μΜ, entre 500 μΜ e 1 μΜ, entre %00 μΜ e 700 μΜ, entre 1 μΜ e 100 μΜ, entre 100 μΜ e 200 μΜ, entre 200 μΜ e %00 μΜ, entre %00 μΜ e 400 μΜ, entre 400 μΜ e 500 μΜ e cerca de 500 μΜ.

Será entendido pelos peritos na técnica que as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas sozinhas ou em conjunto com outros agentes terapêuticos utilizados no tratamento de um cancro da próstata, ou antes, depois ou ao mesmo tempo do tratamento do paciente com outras modalidades terapêuticas para o tratamento do cancro da próstata, tais como cirurgia (p. ex. , prostatectomia radical), radioterapia, braquiterapia, radioterapia de feixe externo, ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU), quimioterapia, fármacos quimioterapêuticos orais, criocirurgia (congelação do tumor), terapia hormonal (tal como terapia antiandrogénica), castração ou combinações dos anteriores. A presente invenção fornece igualmente um kit compreendendo um agente conforme definido acima relativamente ao primeiro aspeto da presente invenção ou uma composição farmacêutica conforme definido acima. A presente invenção fornece igualmente um agente para a utilização no medicamento substancialmente conforme aqui descrito. A presente invenção fornece igualmente uma composição farmacêutica substancialmente conforme aqui descrito. A presente invenção permite igualmente a utilização de um agente substancialmente conforme aqui descrito. A presente invenção fornece igualmente um método de tratamento substancialmente conforme aqui descrito. A presente invenção fornece igualmente um kit substancialmente conforme aqui definido.

De acordo com um aspeto da invenção, é fornecido um método terapêutico, em que o método trata o cancro da próstata primário e disseminado com um agente conforme definido acima.

De acordo com outro aspeto da invenção, é fornecido um método de terapia, em que o método pode ser utilizado para tratar a metãstase, tal como a metãstase da glândula linfática e/ou metástases ósseas, incluindo micrometãstases.

De acordo com outro aspeto ainda da invenção, é fornecido um método terapêutico, em que o método pode ser utilizado juntamente com, ou após, tratamentos de radioterapia externa, citostáticos e de androgénios, ou outros tratamentos não acoplados a anticorpos/fragmentos terapêuticos de direcionamento ao tumor.

De acordo com aspetos específicos da invenção, são fornecidos anticorpos marcados para terapia, que são específicos para PSA e/ou hK2, em que os anticorpos marcados são utilizados para tratar o cancro da próstata, isto é, tecido produtor de PSA e/ou hK2.

De acordo com outro aspeto da invenção, são fornecidas utilizações dos referidos métodos. 0 método de terapia de acordo com a presente invenção tem a vantagem em relação ao estado da técnica de permitir a terapia do cancro da próstata, e o referido método de terapia pode igualmente ser utilizado para tratar a metãstase, incluindo micrometãstases, tais como a metástase da glândula linfática, ou qualquer uma das outras formas de metãstase conforme descrito acima, e ser utilizado juntamente com, ou após, o procedimento pós-operatório, e durante ou após o tratamento por radiação, citostãtico e de androgénios. A descrição anterior concentra-se nas formas de realização da presente invenção aplicáveis a um método terapêutico de cancro da próstata. Contudo, será entendido que a invenção não é limitada a este pedido, mas pode ser aplicada 3. muitas outras combinações de terapia, incluindo por exemplo a metástase, os exames pós-operatórios e os exames durante ou após os tratamentos por radiação, citostãticos e de androgénios. Em relação à terapia de metástase, as metãstases serão tratadas nas glândulas linfáticas.

Noutra forma de realização, podem ser utilizadas a Cirurgia Guiada Por Rádio (RGS) ou Cirurgia Guiada Por Imagem (IGS) para identificar metades de união específicas anticalicreína marcadas com indicador conforme descrito acima (tais como anticorpos hK2 e/ou PSA) durante e/ou antes da cirurgia. Deste modo, um agente compreendendo uma metade de união e uma metade detetável conforme descrito acima pode ser administrado durante e/ou antes da cirurgia. Nesta forma de realização, o agente, tal como um anticorpo anti-hK2 e/ou anti-PSA marcado com indicador, pode ser colocado em infusão primeiro. Em seguida, RGS/IGS podem ser utilizadas para identificar tecido produtor de PSA/hK2 com um instrumento de deteção sensível à metade detetável, durante ou antes da cirurgia. A metade detetável pode, por exemplo, ser uma metade detetável emissora de radiação ou sensível magneticamente+ pode, por exemplo, ser um emissor de radiação Cherenkov e/ou Bremsstrahlung+ pode ser uma etiqueta fluorescente e/ou uma etiqueta magnética ou magnetizãvel. Em conformidade, as RGS/IGS de acordo com a presente invenção podem, por exemplo, corresponder a um método que se baseia na deteção de radiação ótica, Cherenkov, Bremsstrahlung ou beta± na deteção de uma etiqueta de radionuclídeos, e/ou podem envolver magnetometria. A RGS é bem conhecida do perito na técnica como uma técnica cirúrgica que permite ao cirurgião identificar tecido "marcado" pela metade detetável.

As visualizações obtidas de acordo com o apresentado acima podem ser combinadas com outros métodos de visualização radiológica, tais como SPECT/PET, tomografia computorizada (TC), ultrassom (US) e tomografia de ressonância magnética (TRM).

Em conformidade, num segundo aspeto, a presente invenção fornece igualmente um agente compreendendo ou consistindo numa metade de união com especificidade para uma proteína calicreína (tal como descrito acima em relação ao primeiro aspeto da presente invenção) e uma metade detetável conforme descrito acima em relação ao primeiro aspeto da presente invenção para a utilização no medicamento através da administração a um paciente com cancro da próstata antes ou durante a cirurgia, tal como Cirurgia Guiada Por Rádio ou Guiada Por Imagem.

Deste modo, o segundo aspeto permite igualmente a utilização de um agente compreendendo ou consistindo numa metade de união com especificidade para uma proteína calicreína e numa metade detetável no fabrico de um medicamento para a administração num paciente com cancro da próstata antes ou durante a cirurgia, tal como Cirurgia Guiada Por Rádio ou Guiada por Imagem. 0 segundo aspeto da presente invenção fornece igualmente um método de cirurgia, tal como Cirurgia Guiada Por Rádio ou Guiada por Imagem, que é efetuado num paciente com cancro da próstata, o método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de um agente compreendendo ou consistindo numa metade de união com especificidade para uma proteína calicreína e numa metade detetável para o paciente antes ou durante a cirurgia. É contemplado que qualquer método, agente ou composição aqui descrito pode ser implementado em relação a qualquer outro método, agente ou composição aqui descrito. A palavra "um" quando utilizada em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e./ou na memória descritiva pode significar "um", mas é igualmente consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais de um".

Estas e outras formas de realização da invenção serão melhor entendidas e compreendidas quando consideradas em conjunto com a descrição acima e as figuras em anexo. Contudo, deve ser compreendido que a descrição acima, embora indicando várias formas de realização da invenção e numerosos detalhes específicos da mesma, é fornecida como ilustração e não como limitação. Muitas substituições, modificações, adições e/ou novas disposições podem ser efetuadas no âmbito da invenção sem sair do espírito da mesma, e a invenção inclui todas essas substituições, modificações, adições e/ou novas disposições.

As figuras seguintes fazem parte da presente memória descritiva e são incluídas para demonstrar ainda determinados aspetos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida fazendo referência a uma ou mais destas figuras em conjunto com a descrição detalhada de formas de realização específicas aqui apresentadas. A Fig. 1 ilustra a cinética de anticorpo PSA%0 marcado com 1ζ5Ι em vários tecidos após a administração intravenosa em ratinhos normais. A Fig. 2 ilustra a cinética de anticorpo PSA%0 marcado com 1ζ5Ι em vários tecidos após a administração intravenosa em ratinhos implantados com um xenoenxerto de células de tumor da próstata metastático, e isto ilustra que as células de tumor da próstata metastático mostram uma forte absorção do anticorpo PSA%0. A Fig. 3 ilustra relações de Tumor para Órgãos de l25I-PSA%0 após a injeção intravenosa em ratinhos nus portadores de tumores subcutâneos baseados em LNCaP em vários momentos após a injeção (n=%4). Os valores de relação mais elevados indicam uma maior especificidade de absorção no tumor em comparação com o tecido identificado.

As Figs. 4A a H ilustram os resultados da autorradiografia digital: absorção individualmente normalizada de l25I-PSA%G (Fig. 4A) e 18F-colina (Fig. 4B) , 48 h após injeção de 125I-PSA%0 mais 1 h após injeção de colina marcada, na mesma secção de tumor separada por isótopo. A análise histológica através de H&E (Fig. 4C, Figs. 4E e F) e a expressão de PSA utilizando anticorpo PSA total 2E9 (Fig. 4D, Figs. 4G e H) foram verificadas utilizando secções adjacentes. Não existe nenhuma associação direta entre áreas de elevada absorção mAb PSA%0 e elevada absorção de colina. Nota: este ratinho pôde movimentar-se livremente após a injeção de 18F-colina. 209 x 297 mm (%00 x %00 DPI). A Fig. 5 ilustra a cinética de anticorpo 5A10 marcado com ~25I em vários tecidos após a administração intravenosa em ratinhos normais. A Fig. 6 ilustra a cinética de anticorpo 11 B6 marcado com 125I em vários tecidos após a administração intravenosa em ratinhos normais. A Fig. 7 ilustra a cinética de anticorpo 11 B6 marcado com 1ζ5Ι em vários tecidos após a administração intravenosa em ratinhos implantados com xenoenxerto de células de tumor da próstata metastático. A absorção do órgão foi expressada como 0 de IA/g ao longo do tepo. A Fig. 8 ilustra a biodistribuição de li:LIn-llB6 em xenoenxertos LnCAP. A acumulação de radioatividade atingiu o máximo após 48 h interinamente com 16,4 + 1,92 0 de IA/g (percentagem de atividade injetada por gama). A absorção nos órgãos normais (fígado, baço, rins, osso, próstata, testículos) encontra-se num nível inferior. Foi observada uma absorção um pouco elevada nas glândulas salivares, provavelmente devido a uma certa expressão normal de expressão de hK2. A Fig. 9 ilustra exemplos de alguns radionuclídeos terapêuticos. A Fig. 10 mostra uma ilustração do princípio de PAT. Na presença de radiação externa de dose baixa, um agente de direcionamento ao tumor de Z elevado produz um grande melhoramento de dose absorvida local nas células de tumor direcionado. A Fig. 11 ilustra um exemplo de como as nanopartícuias podem ser utilizadas para terapia e imagens de multimodalidade através da ligação aos agentes de direcionamento ao tumor como anticorpos. A Fig. 12 ilustra as relações de tumor/sangue. A relação aumenta ao longo do tempo, indicando um direcionamento ativo de hK2 com 11:LIn- 11B6 em tumores LnCAP. A Fig, 13 ilustra a biodistribuição comparativa de 11:LIn-11B6 em xenoenxertos de expressão de hK2 (LnCAP) e xenoenxertos de hK2 negativo (DU145) em 48 h interinamente. Os resultados mostraram uma diferença estatística significativa (p<0,005) entre os dois xenoenxertos na acumulação de tumor, enquanto a acumulação de radioatividade na maioria dos órgãos normais permaneceu no mesmo nível. LnCAP tinha uma absorção de tumor superior mais de % vezes a DU145. Isto indica que 11:LIn-llB6 é específico de hK2. A Fig. 14 ilustra a sequência de aminoãcidos e estrutura de epítopos de PSA, de acordo com Leinonen, J. etâ al.

ClinâChem 2002+48:2208 a 2216. A Fig. 15 ilustra um gráfico de Scatchard de um 5A10-Fab de exemplo. A Fig. 16 ilustra a cinética de marcação de 177Lu-11B6. A Fig. 17 ilustra a estabilidade inâvitro de 1 ,7Lu-11B6 em PBS e EDTA. A Fig. 18 ilustra imagens SPECT representativas de i7?Lu-11Β6 em xenoenxertos LnCAP. A Fig. 19 ilustra a biodistribuição de 17/Lu-11B6 em xenoenxertos LnCAP. A Fig. 20 ilustra a biodistribuição detalhada em 72 h interinamente de 177Lu-llB6 em xenoenxertos LnCAP. A Fig. 21 ilustra a biocinética inâvivo de 177Lu-llB6 em xenoenxertos LnCAP. A Fig. 22 ilustra fotografias representativas do tamanho do tumor antes (imagem esquerda) e depois (imagem direita) do tratamento com 1/;Lu-llB6. A Fig. 23 ilustra um resumo do efeito de (a) i77Lu-llB6 de dose única, (b) 177Lu-11B6 de dose dupla e (c) tratamento de controlo no tamanho do tumor em xenoenxertos LnCAP. A Fig. 24 ilustra (a) dados de crescimento do tumor e (b) uma imagem SPECT para um ratinho de xenoenxertos LnCAP tratado com um 177Lu-11B6 de dose única.

Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar formas de realização específicas da invenção. Deve ser entendido pelos peritos na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos seguintes representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionarem bem na prática da invenção, e deste modo podem ser consideradas como constituindo modos específicos para a respetiva prática. Contudo, os peritos na técnica devem, considerando a presente divulgação, entender que podem ser efetuadas muitas alterações nas formas de realização específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou semelhante sem sair do espírito e do âmbito da invenção. Exemplo 1 - Biodistribuição de 125I-PSã30 e 125I-11B6 â Materialâ eâ Método:â os anticorpos PSA%0 e 11Β6 foram marcados com 125I (PerkinElmer, E.U.A.), utilizando o método de iodogénio. Resumidamente, foi utilizado um tubo de teste revestido com 150 pg de 1,%,4,6-tetracloro-%α,6oí- dif enilglicoluril para a marcação de 200 pg de PSA%0. Depois de a mistura ter sido incubada durante 15 min à temperatura ambiente, os componentes de baixo peso molecular foram removidos através de filtração em gel (coluna PD-10, GE Healthcare, Reino Unido). A pureza radioquímica era de 95 % após a filtração em gel. â Resultadosâ eâ descrição :â consulte as Figs. 2 e %. Os tumores LNCaP tiveram uma absorção mais elevada em comparação com outros órgãos investigados na maioria dos momentos e atingiram o máximo (4,%2 0 de IA/g) em ã h após a injeção intravenosa de formulações de 125I-PSA%0. Em oposição a todos os outros órgãos que ilustram uma diminuição de atividade, os tumores LNCaP mostraram um nítido aumento de atividade (em %2 ã) durante as primeiras 24 horas após a injeção. Em comparação com os ratinhos sem tumor, a acumulação de tiroide aumentou bastante. A absorção de mAb 125I-PSA%0 em tumores LNCaP atinge o máximo em 24 h após a injeção, com uma subsequente diminuição acentuada na absorção de tumor notada em 72 h após a injeção. Essencialmente, neste mesmo momento, existe um aumento acentuado na absorção de tiroide. Esta correlação inversa é um provável indicador de que ocorreu um efeito de desalogenação. Em conclusão, 125I-PSA%0 pode visar efetivamente fPSA nos ratinhos de xenoenxerto à base de LNCaP.

Exemplo 2 — Biodistribuição de 111 In-DTPA- 11B6 â Materialâ eâ Método:â as experiências em animais foram efetuadas de acordo com a legislação nacional sobre a proteção dos animais de laboratório. 0 estudo em animais foi aprovado pelo Comité de Ética em Pesquisa em Animais local. Para este estudo foram utilizados machos de ratinhos nus imunodeficientes (6 a 8 semanas de idade) adquiridos em Taconic Europe (Bomholt, Dinamarca). Os xenoenxertos de células de carcinoma da próstata LnCAP de expressão de hK2 foram subcutaneamente implantados no flanco direito. Para colocação de xenoenxertos, células LNCaP, 5,2 x 106 células/ratinho em 100 pL de meio de células e 100 pL de Matrigel (BD Sciences, Bedford, E.U.A.). As células DU145 (uma linha celular de hK2 negativo) , 1 a 2 x 106, foram implantadas subcutaneamente no flanco direito para servir como um controlo negativo. Três a seis semanas após a injeção de células LNCaP, 5 grupos de ratinhos (4 a 5 animais/grupo) transportando xenoenxertos LNCaP e 1 grupo (% animais/grupo) transportando xenoenxertos DU145 foram, cada um deles, injetados de modo intravenoso com 100 μΐ de 11:LIn-DTPA - 11B6 (-200 kBq em 100 μΐ e 22,5 μ9 de proteína). Os animais foram ensacados num momento diferente, 4 h, 24 h, 48 h, 72 h ou 168 h interinamente e o grupo de controlo às 48 h interinamente. Os órgãos de interesse (consulte a tabela) foram colocados em frascos de 20 ml para a contagem de cintilação (Zinsser Analytic, Frankfurt, Alemanha), pesados e medidos num contador gama automatizado com um detetor Nal(TI) de % polegadas (1480 Wizard OY, Wallac, Turku, Finlândia). Todos os órgãos foram medidos duas vezes após a dissecação e após o último momento. A medição de radioatividade foi efetuada como um protocolo normal abaixo. â MediçãoâdeâRaáioatividade: foi utilizado um protocolo normal para a medição de um radionuclídeo. Foram utilizadas contagens por minuto corrigidas com nível de base para a avaliação. 0 valor de absorção de tecido, expressado como percentagem de dose injetada por grama de tecido (0 de ID/g) foi calculado como: % de IB/g = (radioatividade de tecido/radioatividade injetada)/peso do órgão x 100 em que para as injeções intravenosas:

Radioatividade injetada = Radioatividade média nas seringas de controlo - radioatividade na seringa utilizada - radioatividade na cauda

Resultadosâeâdescrição:ãconsulteâasâFigs.â8,âl2âeâl3. Os resultados preliminares mostraram que existiu uma acumulação eficaz de 11:LIn-ll B6 no tumor ao longo do tempo, atingindo o máximo em 48 h interinamente com 16,4 ± 1,92 0 de IA/g (percentagem de atividade injetada por grama). A absorção de radioatividade nos órgãos normais (fígado, baço, rins, osso, próstata, testículos) encontra-se num nível inferior. Foi observada uma absorção um pouco elevada nas glândulas salivares, provavelmente devido a uma certa expressão normal de hK2 (Fig. 8) . Isto será mais investigado nos estudos futuros. Além disso, o 111In-DTPA-11B6 era específico de hK2, uma vez que existiu uma absorção significativamente inferior nos xenoenxertos de controlo negativo DU145 (Fig. 1%) . A relação de tumor/sangue aumentou ao longo do tempo, indicando uma absorção cada vez maior de 11:LIn-DTPA-llB6 no tumor (Fig. 12) . Em conclusão, os dados de biodistribuição de i:L1In-llB6 mostram propriedades promissoras de direcionamento ao tumor no cancro da próstata, indicando potencial para terapia de carcinoma da próstata através da utilização de outros radionuclídeos.

Exemplo 3 - Imagens de autorradiografia digital â Materiaisâ eâ métodos: foi efetuado DAR em animais injetados com 125I-PSA e lsF-colina. Os animais foram eutanasiados uma hora após a injeção de sondas metabólicas e os tumores foram imediatamente removidos, salvaguardados em Cryomount (Produtos HistoLab AB, Suécia), rapidamente congelados em azoto líquido e cortados em secções de 100 pm para DAR ou secções de 20 pm para histopatologia e análise imuno-histoquímica (IHC). Um sistema baseado em detetor de tira de silício (Gerador de Imagens Biomolex 700+ Bimolex AS, Oslo) foi utilizado para representar a distribuição de radioatividade por meio de imagens dentro das secções maiores. As diferenças tanto nos espetros de emissão como na taxa de declínio foram utilizadas para produzir imagens separadas de cada radionuclídeo em animais injetados com mais de um radionuclídeo, neste caso, 1251 e 1SF. â Resultadosâ eâ descrição:â consulteâ osâ resultadosâ nasâ Figs ,â4AâaâH. Com base nestes dados, é demonstrado que a absorção de mAb PSA%0 nos tumores excisados atingiu o máximo em 24 horas após a injeção intravenosa, e é mantida no tumor em comparação com tecidos normais. As relações T/0 relativamente baixas (consulte a Tabela na Fig. %) podem ser atribuídas a fatores+ tais como: uma barreira de sítio de união, observada quando uma baixa dose de anticorpo é saturada pelos antigénios fPSA no espaço perivascular, impedindo assim uma penetração mais profunda no tumor sólido± permeabilidade vascular insuficiente dentro do tumor± ou deiodinação do anticorpo (conforme sugerido pela elevada acumulação de iodo na tiroide). Duas formas de melhorar as relações T/0 seriam aumentar a dose de anticorpo e testar diferentes radioetiquetas. Apesar desta desvantagem, foi encontrada uma acumulação de atividade de 125I-PSA%0 no tecido tumoral. a Tiuutio ~ hi s tognuii oaa ea hj.sto]patQloc[iaa (coTisu.ltea osa resultadosâ nasâ Figs.â 4Aâ aa H) . Para estudar PSA, foram examinados 20 μηι de criossecções de tumor (congeladas e salvaguardadas conforme descrito acima) utilizando IHC. A imunorreatividade contra PSA ou hK2 foi visualizada através da utilização do kit de sistema DAKO Envision Flex/HRP (Dako Corporation). As secções de tumor adjacentes foram igualmente coloridas com hematoxilina (coloração de núcleos) e eosina (coloração citoplásmica) (H&E), e a morfologia geral foi analisada num microscópio de transiluminação normal. Como a coloração H&E, as regiões viáveis das secções de tumor e áreas necrõticas foram coloridas. Como um controlo positivo, as secções de tumor LNCaP foram incubadas com PSA tnAb 2E9 numa diluição de 1:1000 e visualizadas conforme descrito acima. Como um controlo negativo, a secção de tumor de um ratinho que recebeu uma injeção intravenosa de PSA%0 foi visualizada sem incubação de um anticorpo secundário, mas incluindo todas as outras etapas de IHC. As secções coloridas foram digitalizadas utilizando um digitalizador de microscópio Carl Zeiss MIRAX Scan e observadas com o software MIRAX Viewer (Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH, Alemanha).

Exemplo 4 - Radiomarcação â IodinaçãoâDiretaâ (12bI/124I/13± 1/) : as proteínas (10 μΐ, 1 mg/ml em PBS) foram misturadas com 1“5I como solução Nal (4 MBq) utilizando o método Cloramina-T (CAT, Sigma St. Louis, MO, E.U.A.). A reação foi iniciada adicionando CAT em PBS (10 μΐ, 2 mg/ml) e a mesma foi incubada durante 1 min com agitação vigorosa e depois terminada adicionando metabissulfito de sódio (20 ul, 2 mg/ml) . As proteínas marcadas foram separadas dos componentes de reação de baixo peso molecular e l2bI sem reação através de cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna NAP-5 (Sephadex G-25, GE Healthcare) pré-equilibrada com PBS. â lodinaçãoâindiretaâ (125I/124I/131I/2llAt) : o precursor de marcação, N-succinimidil p-(trimetilstanil)benzoato (SPMB), foi preparado de acordo com Orlova etâal. em NuclâMedâBiol 27:827 a 8%5 (2000), e foram adicionados 5 \ig de SPMB a 5 MBq ou i25I ou 211 At numa solução de 5 ã de ácido acético. Para iniciar a reação, foram adicionados 40 pg de cloramina-T (Sigma, St. Louis, Mo.) na solução aquosa. A mistura de reação foi agitada durante 5 min, e foram adicionados 80 pg de sódio-meta-bissulfato (Aldrich, Steinheim, Alemanha) na solução aquosa para parar a reação. 0 precursor radiomarcado foi adicionado a 40 pg de solução de proteína em 0,07 M de tampão de borato, pH 9,2. A reação de acoplamento foi efetuada à temperatura ambiente durante 45 min com agitação contínua. As variantes de proteína marcada foram separadas dos produtos de baixo peso molecular utilizando uma coluna de exclusão de tamanho NAP™-5 (GE, Healthcare) equilibrada com PBS. As variantes de proteína radiomarcada foram depois analisadas num teste IRMA (de acordo com Evans etâal., submetido a CBR) para verificar se o procedimento de marcação não afetou a afinidade de união em relação ao respetivo alvo. â Radiomarcaçãoâcomâ177Lu: a conjugação de isotiocianato-benzil-CHX-A"-DTPA (1%0 nM) com proteína (60 nM) foi efetuada em 220 uL, 0,7 M de tampão de borato e pH 9,2 durante a noite num banho de água a %7 °C. A proteína CHX conjugada foi purificada numa coluna de exclusão de tamanho NAP-5 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia), utilizando 0,2 M de tampão de acetato de sódio e pH 5,5 como eluente, e depois dividida em dez lotes que foram posteriormente utilizados para a quelação. 0 tempo de quelação foi otimizado através de amostragem de um processo de quelação em curso e de verificação da pureza do quelato em placas SG de cromatografia em camada fina instantânea (ITLC) (Biodex) com 0,2 M de tampão contínuo de citrato. As placas foram analisadas num Cyclone Phosphorimager (Perkin Elmer,

Wellesley, MA, E.U.A.). Verificou-se que a quelação foi concluída após %0 min à temperatura ambiente. A quantidade de lutécio radioativo variou dependendo das necessidades das experiências individuais.

Para testar relativamente à presença de i77Lu debilmente quelado, foram efetuados desafios EDTA. As amostras triplicadas do produto quelado foram contestadas com 200:1 ou 1000:1 de excesso molar de EDTA versus quelador numa incubação durante a noite de %7 °C. A concentração EDTA foi calculada partindo do princípio de que a conjugação foi quantitativa, produzindo assim um valor médio de duas moléculas CHX-A-DTPA por anticorpo. As amostras das soluções foram depois analisadas por ITLC conforme apresentado acima. Como um controlo, as amostras triplicadas de proteína [i77Lu] foram igualmente mantidas em PBS a%7 °C ou 4 °C durante a noite.

Exemplo 5 -ãEstabilidade in vivo

Para analisar a estabilidade inâvivoâ dos conjugados radiomarcados, os ratinhos normais foram injetados de modo intravenoso com radioetiquetas e eutanasiados após momentos diferentes. Em seguida, o sangue é recolhido e centrifugado em 5000 g. As amostras de sangue são depois separadas em colunas NAP-5 (corte, 5 kDa) equilibradas com PBS, e é determinada a quantidade relativa de radioatividade presente na fração molecular elevada.

Exemplo 6 - Sobrevivências das células para a monitorização de efeitos de terapia

As células são semeadas em placas de Petri (diâmetro 6 cm, aproximadamente 2 x 105células/placa) . Após 48 horas, as proteínas radiomarcadas (57 ng/placa, ou 287 ng/placa, correspondentes aproximadamente a 1:1 e 5:1 de anticorpos por antigénio) são adicionadas às células. Para determinar o efeito de 12ΐ3/1%1Ι/1?^η nos meios, algumas das placas foram previamente incubadas com uma quantidade em excesso de proteína nâo marcada (29 pg/placa). As placas adicionais são utilizadas para a estimativa do número de declínios por célula (DPC). Nestas placas, a absorção celular de proteína radiomarcada é medida em seis momentos durante a incubação de 24 horas. As células foram depois lavadas seis vezes com meio sem soro frio, e a incubação é continuada no meio de cultura fresco. As células foram contadas aproximadamente uma vez por semana, e foram novamente semeadas a cada duas semanas. 0 DPC é estimado calculando a área sob a curva de absorção para as duas concentrações de anticorpo, bem como para as placas bloqueadas. Para a concentração de proteína radiomarcada mais baixa, as células recebem aproximadamente 56 DPC, e para a mais elevada aproximadamente 150 DPC, ao passo que as células bloqueadas recebem cerca de 2 DPC. Os resultados obtidos são analisados através de regressão não linear (crescimento exponencial), utilizando 1/Y2 como o fator de ponderação.

Exemplo 7 -âEstudos in vivo São utilizados os seguintes modelos de xenoenxerto: modelos de tumor LnCAP, DU145, PC-%. 0 PSA é expressado pela totalidade das três linhas celulares, enquanto hK2 é expressado por LnCAP e não expressado em DU145 ou PC-%.

Para a colocação de xenoenxertos, as células LNCaP, DIJ145 ou PC-% (2 a 10 milhões de células), colhidas em 0,02 E de tripsina/PBS foram novamente suspensas nos mecbs e injetadas subcutaneamente no flanco direito com 200 uL de suspensão de células que contém um quantidade igual de Matrigen (BD Biosciences, Bedford, MA). A formação do tumor foi monitorizada visualmente ou por palpação, â ExperiênciaâdeâBloqueio:âa experiência de bloqueio na

Experiência de Biodistribuição I foi efetuada para estabelecer se a absorção de proteínas radiomarcadas nos tumores era específica de hK2 ou não. Antes da maior injeção de modo intravenoso de proteína radiomarcada, foram injetados de modo intravenoso 0,8 a %,0 mg de proteína não marcada no grupo de ratinhos bloqueado. Foi comparada a absorção de radioatividade em 24 a 72 h após a injeção entre os grupos bloqueados e não bloqueados. â Otimizaçãoâdeâatividadeâespecífica: esta experiência é realizada para determinar a influência de atividade especifica (isto e, a dose de proteína injetada do conjugado radiomarcado) na absorção de tumor. Foi preparada uma série de proteína marcada com ~'7Lu com várias atividades específicas predeterminadas. Uma alíquota de proteína marcada com 177Lu é diluída com uma solução-mãe de proteína não marcada para fornecer doses de injeção que variam de 10 pg a 500 pg por ratinho portador de LnCAP. Dois a três dias após a injeção, os animais foram eutanasiados. Os órgãos e os tumores foram excisados e medidos relativamente à absorção de radioatividade. A atividade específica que fornece a absorção de tumor mais ideal é ainda considerada para dosimetria. â Exemploã deâ determinaçãoã deâ dosimetria:â os ratinhos portadores de LnCAP (4 ratinhos/grupos) foram injetados com proteína marcada com i77Lu, Os animais foram eutanasiados 4 h interinamente a 2 semanas após as injeções. A dose absorvida para diferentes órgãos foi calculada utilizando o esquema MIRD. As curvas de tempo-atividade serão obtidas para todos os tecidos de órgãos de interesse no corpo (animal). Os estudos irão basear-se nas imagens quantitativas de SPECT e/ou PET. A integração das curvas irá fornecer atividade acumulada. 0 formalismo MIRD baseado nos próprios valores S calculados (baseado nas geometrias específicas e técnicas Monte Cario para frações absorvidas) será utilizado para converter atividade acumulada em dose absorvida. Em muitos casos, a dose cruzada tem de ser cuidadosamente calculada, o que significa que os cálculos de dosimetria baseados em Monte Cario serão efetuados (Hindorf, etâ al. (2004) J. â Nuc. ã Med. , 45:1960 a 1965 +

Larsson, etâ al. (2007) Cancerâ Biotherapyâ &â Radiopharmaceuticals, 22:4%8 a 442+ Larsson, etãal. (2011) ActaãOncol., 50:97% a 980). â Exemploâ deâ imagensâ SPECTâ eâ PET: as imagens PET-CT e SPECT-CT são uma parte integrante da terapia de radionuclídeos. As mesmas dão uma ideia da extensão até à qual o material radioativo se acumula nos tecidos e ajuda a fornecer uma estimativa da dose terapêutica necessária e os respetivos efeitos. Para obter bons resultados de tratamento, tem de ser distribuída uma dose suficiente de radiação ao tumor. Isto é confirmado por imagens, conforme descrito nas referências mencionadas acima relativamente ao planeamento de doses, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência. â Radiobiologia:â os métodos de dosimetria específicos baseados em geometrias de animal de laboratório/paciente individual serão utilizados para uma dosimetria apropriada e podem ser relacionados com efeitos biológicos e fornecer a possibilidade de correlação com efeitos radiobiológicos e para terapia otimizada de pacientes individuais.

Exemplo 8 - Determinação de afinidade de união Método de Scatchard A afinidade de união (Kd) das variantes de anticorpo produzidas foi determinada utilizando um método de Scatchard de acordo com Scatchard, AnnâNâYAcadâSci 51:660 a 72 (1949).

Resumindo, foram utilizadas uma concentração fixa de anticorpo (ou, neste caso, um fragmento de anticorpo Fab) e concentrações variadas de indicadores PSA marcados com Eu%+.

Ressonância de plasma de superfície A cinética de ligação e a afinidade das variantes de anticorpo podem igualmente ser determinadas através de análise de interação bioespecífica em tempo real num instrumento Biacore. Em resumo, PSA ou hK2 é imobilizado num chip de sensor CM5 através de acoplamento de amina e os níveis de imobilização atingem 1000 a 2000 unidades de resposta. Os diferentes derivados de anticorpo anti-PSA ou anti-hK2 (mAb e Fab) são diluídos em concentrações que variam de 0,1 a 10 nM no tampão HBS-EP. A cinética de união é estudada numa fase de associação de 5 min e numa fase de dissociação de %0 min com uma taxa de fluxo de 50 pL/min, seguida da regeneração. As constantes cinéticas são calculadas utilizando um modelo de união 1:1 Langmuir com correção para transferência de massa.

Exemplo 9 - Ensaios imunorradiométricos (IRMA)

Os ensaios imunorradiométricos baseados em anticorpo monoclonal (IRMA) para o mAb radiomarcado ou a qualidade de união de Fab foram realizados em triplicado como um ensaio em sanduíche de quatro etapas com etapas de lavagem entre incubações (tampão de lavagem: 10 mM de Tris-HCL, pH 8,0, 0,15 M de NaCl, 0,05 ã de Tween 20). 0 ensaio foi construído e otimizado de acordo com recomendações estabelecidas. As placas de microtítulo separadas foram revestidas com H117 (0,2 pg/poço), um anticorpo monoclonal que reconhece PSA livre ou total e calicreína humana 2 (hK2) com a mesma afinidade, %0 foram diluídas no tampão de revestimento (75 mM de carbonato de sódio, pH 9,6) e incubadas durante a noite a 4 °C. Os poços foram depois incubados com 0,2 pg/poço de tampão de arrefecimento (% ã de gelatina de peixe no tampão de lavagem) durante duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, os poços foram revestidos com 200 pl de plasma (fêmea) contendo % ng/pL de fPSA e incubados durante duas horas à temperatura ambiente. Os PSA%0 radiomarcados e não marcados foram depois misturados em conjunto no tampão de ensaio (50 mM de Tris- HC1, pH 7,5, 0,1 M de NaCl, 5 mM de EDTA, 0,2 5 á de BSA e 0,05 ã de Tween 20) nas concentrações descendentes e adicionados aos poços (volume total: 50 pL/poço). A percentagem de anticorpo marcado por poço foi conforme apresentado em seguida: 100, 92, 84, 68, 50, %0 e 0 por cento. As placas foram incubadas durante duas horas à temperatura ambiente, lavadas e medidas num contador de poços Nal(TI) (1282 Compugamma CS+ LKB Wallac, Turku, Finlândia). Uma diferença na capacidade de deteção de <25 ã em relação ao desvio teórico foi aceite para mais aplicação. As estimativas de qualidade de deteção pós marcação mostraram que o anticorpo radiomarcado manteve 70 a 90 ã da capacidade de afinidade/união do anticorpo 0 não marcado.

Exemplo 10 - Radioimunoterapia com 177Lu-mllB6 num modelo de ratinho com cancro da próstata 0 cancro da próstata é o cancro mais geralmente diagnosticado entre os homens no mundo ocidental, representando 25 ã de todos os novos casos de cancro e 14 ã de mortes de cancro (2270044%) . As atuais estratégias de tratamento curativo (cirurgia e irradiação) apenas são bem-sucedidas quando a malignidade se situa na glândula da próstata. A estratégia terapêutica no caso de doença disseminada é limitada à castração, o que muitas vezes apenas suprime o crescimento durante 12 a 18 meses antes de se tornar refratária, apesar do meio privado da hormona (Scher Hl etâal., Cancerâofâtheâprostate. Em: DeVita VT Jr, Heilman S, Rosenberg SA, eds. 7a ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins± 2005). Devido à falta de terapias que mostraram ter um efeito para além de uma resposta transitória, são urgentemente necessárias novas terapias molecularmente direcionadas. Uma vez que o cancro da próstata é radiossensível, o mesmo apresenta um alvo ideal para a radioimunoterapia. Igualmente, a radioimunoterapia distribui habitualmente níveis elevados de anticorpos em circulação à medula óssea e aos gânglios linfáticos, sítios para os quais o cancro geralmente se propaga. Adicionalmente, a radioimunoterapia utiliza um "efeito de fogo cruzado", que, dependendo da variação de partículas emitida do radioisótopo escolhido, pode matar as células espetadoras de antigénio negativo circundantes sem a união direta do anticorpo (16029058) . A calicreína humana 2 (hK2) é uma enzima acionada por androgénio que é apenas expressada, em concentrações muito elevadas, em tecido da próstata saudável e maligno. Uma vez que hK2 mostrou clivar a forma zimogénica do Antigénio Específico da Próstata (PSA), parte-se do princípio de que uma das respetivas funções fisiológicas é agir como um regulador dessa enzima. Consideradas em conjunto, estas funcionalidades biológicas tornam hK2 um ótimo alvo num sistema teragnõstico (terapia e diagnóstico). 0 objetivo deste estudo era confirmar a utilidade de 11 B6, um mAb que visa especificamente um epítopo dentro da fenda catalítica de hK2 como um veículo para distribuir radionuclídeos altamente tóxicos especificamente para os sítios de crescimento de cancro da próstata. Nesta prova de estudo de conceito, foi escolhida a marcação do mAb com 177Lu, uma partícula beta de baixa energia que utiliza igualmente a emissão gama, permitindo a realização das imagens SPECT.

Materiais e Métodos Materiaisâ 177Lu foi adquirido em Mallinkrodt Medical BV, Petten, Holanda. 0 Sistema de Fósforo de Armazenamento Cyclone™ e o software de análise de imagens OptiQuant™ (Perkin Elmer, Wellesley, MA, E.U.A.) foram utilizados para medir a radioatividade nas tiras de ITLC (cromatografia em camada fina instantânea) (Biodex, US) para a determinação de cinética de marcação e pureza radioquímica. Todas as substâncias químicas foram obtidas a partir de Sigma

Alchrich e os tampões foram preparados no interior utilizando água de qualidade analítica, salvo indicação em contrário. 0 mAb 11 B6 é um anticorpo específico para a calicreína humana 2 com uma afinidade para este antigénio de cerca de 1,2 nM± consulte as SEQ ID NOs: 4 e 5 acima (obtidas a partir da University of Turku, Finlândia). Para os estudos inâvivo, foram utilizadas as linhas celulares de carcinoma da próstata LNCaP que expressam hK2 (ATCC, Manassas, VA, E.U.A.). As células foram cultivadas no meio RPMI 1640 completado com 10 0 de soro fetal bovinoe PEST (100 IU/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina). As células foram mantidas a %7 °C numa incubadora humidificada com 5 0 de CQ e foram separadas com solução de tripsina-EDTA (0,25 0 de tripsina, 0,02 E de EDTA no tampão Thermo Scientific).

Conjugaçãoâeâradiomarcaçãoâ â ConjugaçãoâdeâCHX-A"-DTPAâcomâllB6:âuma solução do mAb 11B6 no PBS foi ajustada para pH 9,2 utilizando 0,07 M de tampão de borato de sódio. A amostra foi concentrada num filtro centrífugo Ultra-2 Amicon (2 ml, 100 K) . A solução de proteína foi conjugada com o quelador CHX-A"-DTPA (Macrocyclics, E.U.A.) numa relação molar de %:1 de

quelador para anticorpo a uma temperatura de 4 0 °C. A reação foi terminada após 4 h, e CHX-A"-DTPA-11 B6, doravante denominado DTPA-11 B6, foi separado do quelato livre através da cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna NAP-5 (GE Healthcare) equilibrada com 20 ml, 0,2 M de tampão de acetato de amónio, pH 5,5. 0 conjugado 11 B6 e 5A10 foi eluído com 1 ml de tampão de acetato de amónio, ã RadiomarcaçãoâdeâDTPA-llB6 :â o DTPA-11B6 no tampão de acetato de amónio, pH 5,5, foi misturado com uma quantidade predeterminada de 1,7LuC1%. Após a incubação à temperatura ambiente durante 2 h, a marcação foi terminada e purificada numa coluna NAP-5, equilibrada com PBS. A eficiência da marcação e a cinética de marcação foram monitorizadas com tiras ITLC, eluídas com 0,2 M de ácido cítrico. Neste sistema, o conjugado radiomarcado permanece na linha de origem, enquanto o Lu-177 livre migra com a frente do solvente. A distribuição de radioatividade foi determinada com um sistema Phosphorlmager (Perkin Elmer, Wellesley, MA, E.U.A.) utilizando o Optiquant como software de quantificação (Perkin Elmer, Wellesley, MA, E.U.A,). Ressonância de Plasma de Superfície A proteína hk2 (Department of Biotechnology, Turku, Finlândia) em 10 mM de tampão NaAc, pH 4,0, foi imobilizada num chip de grau de investigação CM4 adquirido em Biacore através de acoplamento de amino utilizando N-

Hidroxisuccinimida (NHS), cloridrato de l-Etil-%-(%- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e 1 M de cloridrato de etanolamina-NaOH, pH 8,5 num sistema Biacore 2000. 0 tnAb 11B6, o respetivo conjugado DTPA-11B6 e Herceptin como um mAb de referência não específico, todos no tampão Biacore, foram colocados em circulação em duas células de fluxo em cinco concentrações diferentes (0,5 nM, 5 nm, 10 nM, 50 nM e 100 nM) para detetar uma eventual união. Uma das duas células de fluxo continha hK2 imobilizada e a outra era uma referência em branco. 0 chip foi regenerado utilizando 25 mM de tampão de Glicina, pH 2,7.

Estudos de estabilidade in vitro A estabilidade dos conjugados marcados foi testada em PBS e num excesso de EDTA, 500 x mais de EDTA e depois DTPA conjugado em mllB6, incubados a 4o durante 1 semana e 2 semanas e foram analisados utilizando tiras ITLC, consulte acima.

Estudos em animais

Todas as experiências em animais foram efetuadas de acordo com a legislação nacional sobre a proteção dos animais de laboratório. 0 estudo em animais foi aprovado pelo Comité de Ética em Pesquisa em Animais local. Para este estudo foram utilizados machos de ratinhos nus imunodeficientes, NMRI, (6 a 8 semanas de idade) adquiridos em Taconic Europe (Bomholt, Dinamarca).

Os xenoenxertos de células de carcinoma da próstata LnCAP de expressão de hK2 foram subcutaneamente implantados no flanco direito e/'ou flanco esquerdo em cerca de 10*106 células por injeção.

Os animais que desenvolveram tumores LNCaP foram divididos em grupos e injetados com o agente terapêutico 177Lu-DTP-ll B6 ou com um controlo, consulte a Tabela 1 abaixo:

Tabela 1

Todos os animais incluídos foram continuamente medidos e pesados dentro de um intervalo de % a 4 dias.

Inicialmente, alguns animais obtiveram uma atividade inferior (8 MBq) de 177Lu-DTPA-11B6 para a investigação da localização do agente terapêutico utilizando SPECT, Um ratinho do grupo 8 foi igualmente estudado com SPECT. Os respetivos órgãos destes animais foram removidos, e foi utilizado um contador de poços Nal(TI) automatizado com um detetor Nal (TI) de % polegadas (1480 WIZARD, Wallac Oy, Turku, Finlândia) para quantificar a radioatividade nestas amostras de tecido.

Para estudar o efeito na medula óssea, foram recolhidas amostras de sangue (10 pL) regularmente. As amostras de sangue foram recolhidas duas vezes por semana durante 8 semanas após injeção, e as contagens WBC, as contagens RBC e as contagens de plaquetas foram analisadas num Medonic Cell Analyzer-Vet CA5%0 Vet (Boule Medical, Stockholm, Suécia). No momento da amostragem de sangue, foram monitorizados o peso e a condição física dos animais. A toxicidade foi avaliada através da monitorização de animais relativamente à perda de peso corporal, ao declínio na condição geral e à toxicidade hematológica. 0 volume do tumor foi medido com um calibrador. 0 comprimento I, a largura w e a espessura t foram medidos e o volume foi calculado.

Farmacocinéticaâ

Para o estudo biocinético de HlIn-mllB6, os ratinhos foram injetados numa veia da cauda com radionuclídeo marcado para 25 pg de anticorpo mllB6. Os animais foram sacrificados em intervalos de tempo regulares.

Em resumo, o mAb 11B6 de ratinho foi conjugado com CHX-A" -DTPA e marcado com 111 In formando 1:L1In-CHXA"-DTPA-11B6 (i:LiIn-DTPA- 11B6) . Os estudos de biodistribuição foram efetuados num modelo de xenoenxerto PCa de hK2 e AR positivo (LNCaP). Os xenoenxertos DU-145 (hK2 e AR negativo) foram utilizados como um controlo. Os animais, NMRI, nus foram eutanasiados em intervalos de tempo designados, dissecados e os respetivos órgãos removidos para a medição de atividade. Foram efetuadas imagens Micro-SPECT. Os tumores foram seccionados, coloridos e foi efetuada a autorradiografia. Alguns animais foram injetados com mAb 11 B6 de ratinho frio antes da injeção de 11:LIn-DTPA-11B6 para bloquear a absorção de 11 B6 radiomarcado. A biocinética de 177Lu-mllB6 foi obtida da mesma forma relativamente ao estudo de iliIn-mllB6. Aquisíçãoâdeâdadosâeâdosimetriaâ

Para determinar a dose absorvida para os diferentes órgãos-alvo, o esquema MIRD (1) foi aplicado juntamente com fatores S específicos de ratinho. 0 número de desintegrações (atividade acumulada) foi derivado dos dados cinéticos com i:LiInmllB6. As funções biexponenciais foram adaptadas aos pontos de dados através de um algoritmo de mínimos quadrados, e os números de desintegrações foram calculados como o número integral destas expressões multiplicado pelo fator de declínio. A atividade acumulada para a medula óssea baseou-se no método de sangue (2) , em que é suposto a concentração de atividade na medula vermelha ser proporcional em relação à concentração de atividade no sangue. Foi sugerido que esta relação de medula vermelha para sangue (RMBLR) fosse de 0,%6 (2), o que foi igualmente utilizado neste estudo.

Para determinar os fatores S específicos de ratinho, foi utilizada uma versão da ilusão MOBY (%) na qual os tamanhos dos órgãos podem ser especificados. 0 peso médio dos órgãos dissecados do estudo cinético foi especificado juntamente com o peso total médio. A representação das superfícies NURBS flexíveis depois gera uma ilusão específica da estirpe. A ilusão é colocada em voxels em 160*160*400 voxels. Um tumor subcutâneo foi adicionado no flanco esquerdo, através da representação de uma esfera fora do contorno de pele normal, mas como um elipsoide com um eixo curto a meio do raio da esfera perpendicular ao contorno da pele, e o eixo longo sendo o raio da esfera. A glândula salivar e a glândula da próstata foram manualmente adicionadas à ilusão e representadas como esferas com raios correlacionados com os pesos médios dos órgãos. A ilusão depois funcionou como entrada para simulações Monte Cario de fatores S para 177Lu e 11:LIn com o código MCNPX 2.6 conforme descrito no trabalho anterior (4). PlaneamentoâdeâTerapiaâ

Com base na relação entre dose absorvida e efeito biológico na medula óssea nos ratos submetidos a Radioimunoterapia com 90Y e 17 7Lu (Larsson etâ al. , 2012,

Med.âPhys. %9(7):44%4 a 4%), pode estimar-se que o LD50 para a medula óssea seria na ordem de 12 Gy. Na literatura, o LD50 para irradiação aguda de ratos e ratinhos é o mesmo, cerca de 9 Gy (por exemplo, consulte Radiobiologyâ fora thea radiologist,âHall & Giacca (Eds), 2006, 6a edição).

As terapias foram depois concebidas a partir do pressuposto de uma dose absorvida tolerável de 12 Gy para a medula óssea. Em seguida, a partir dos cálculos de dosimetria, foi calculada a atividade correspondente a esta dose absorvida. Os grupos de terapia foram depois concebidos como fornecendo aos mesmos A/4, A/2, A, 2xA e %xA. As atividades correspondentes foram utilizadas para os controlos.

Resultados

Radiomarcaçãoãdeâ177Lu-DTPA~mllB6â

Os resultados da cinética de marcação na Figura 16 mostram que a eficiência de marcação é muito elevada, atingindo 90 0 após 2 horas de incubação. Isto garate uma probabilidade de excelente eficácia de terapia com efeitos menores de 177Lu não conjugado.

Os resultados da estabilidade inâvitroâem PBS e EDTA mostram uma boa estabilidade ao longo do tempo com praticamente nenhuma alteração ao longo de duas semanas (consulte a Figura 17). Igualmente, não é possível observar nenhuma diferença entre a incubação PBS e EDTA, o que indica uma química de conjugação muito boa garantindo estabilidade inâvivoâcom tempos de retenção e circulação longos .

Imagensa

As imagens SPECT na Figura 18 mostram a distribuição de 17,Lu-DTPA-mllB6 em ratinhos nus com xenoenxerto, (injetados com 8 MBq).

As imagens diferentes da Figura 18 são conforme explicado na Tabela 2.

Tabela 2

A primeira coluna para ratinho SI mostra a excelente absorção no tumor no ratinho SI com uma maior absorção com o tempo 48, 72 e 168 h interinamente. A segunda coluna mostra o ratinho S2 em 72 e 168 h com a mesma absorção de tumor elevada. A coluna %, linha 2, mostra o ratinho S% em 72 h interinamente com uma absorção de tumor elevada semelhante. A linha %, coluna %, mostra o ratinho S8 em 168 h interinamente com nenhuma absorção de tumor após o bloqueio com anticorpos frios que ilustram a especificidade de milB6 para direcionamento ao tumor. Resultados semelhantes para o ratinho S9 na coluna 4, linha %. Finalmente, o ratinho Sll na coluna 4, linha 2, não mostra nenhuma absorção no tumor da linha celular DU 145 não específica para o anticorpo mllB6.

Estes resultados demonstram a elevada especificidade de mllB6 resultando numa acumulação de tumor elevada. Biodistribuiçãoâ

Os resultados do estudo biocinético do HlIn-mllB6 são descritos no Exemplo 2 acima. É observada uma acumulação no tecido tumoral com um máximo de 16 % de IA/g em 4 8 horas± todos os outros órgãos mostram um declínio de atividade exceto as glândulas salivares (consulte a Figura 8). Deste modo, é obtida uma relação elevada de tumor para órgão normal, que é um pré-requisito para uma elevada eficácia de terapia.

Os dados de biodistribuição para 177Lu-mllB6 (em 72 h e 168 h) sâo ilustrados na Figura 19. Aqui, é possível observar uma acumulação muito maior de atividade em comparação com HlIn-mllB6, com quase %0 0 de IA/gem 168 h. Isto realça ainda a possibilidade de uma elevada eficácia terapêutica com o anticorpo 11 B6 radiomarcado.

Os resultados detalhados em 72 h interinamente de bloqueio juntamente com a utilização da linha celular de tumor DU-145 são ilustrados na Figura 20. Neste caso, são fornecidos a distribuição do 1/7Lu-DTPA-mllB6 a partir do estudo SPECT ilustrado acima nos ratinhos com LnCaP ou DU-145 e o bloqueio do Ag hK2 com pré-injeção de 11 B6 não conjugado. Conforme observado em detalhe, o bloqueio e a linha celular de tumor DU-145 não resultam em nenhuma absorção nos tumores que ilustram a elevada especificidade de mllB6.

Dosimetriaâ A Figura 21 ilustra os resultados do estudo biocinético de HlIn-mllB6 utilizado para os cálculos de dosimetria. Em cada gráfico na figura composta, a linha tracejada superior representa os resultados do estudo cinético com um desvio padrão, a curva sólida é uma função biexponencial adaptada e a curva tracejada inferior corresponde a quando é considerado o declínio de lllln. A área sob a curva tracejada inferior corresponde à atividade acumulada utilizada nos cálculos de dosimetria.

Com base na biocinética conforme ilustrado na Figura 21, foram calculadas as atividades acumuladas. Utilizando os valores S lllln, foi depois calculada a dose absorvida por unidade de atividade (Gy/MBq). A Tabela % abaixo apresenta os resultados para lllln.

Com base no pressuposto de que pode ser utilizada a mesma biocinética para 177Lu-mllB6, as atividades acumuladas correspondentes foram calculadas com o respetivo meio tempo físico. Ao utilizar os valores S para 177Lu, foi calculada a dose absorvida por unidade de atividade. 0 pressuposto de biocinética semelhante é justificado pelos resultados da absorção de 177Lu-mllB6 que ilustram valores de absorção semelhantes relativamente a HlIn-mllB6 (consulte as Figuras 8 e 19).

Tabela 3

Dose absorvida (Gy/MBq) da terapia com 111 177

In- e Lu-11B6

Com base num valor LD50 de 12 Gy de medula óssea, pode ser injetada uma dose de 26,7 MBq. Isto significa uma dose absorvida para o tumor de 60 Gy. O novo cálculo da dose absorvida de tumor (assumindo que a cinética lll-In-mllB6 é igual para 177LumllB6) e a alteração dos valores de absorção em 72 h interinamente (16 % de IA/g a 20 % de IA/g) e em 168 h interinamente (15 % de IA/g a 28 % de IA/g) resultam nas doses absorvidas conforme apresentado na Tabela 4 abaixo. Em seguida, é possível verificar que a dose absorvida para o tumor irá aumentar de 60 Gy para 120 Gy.

Tabela 4

Os cálculos de dosimetria acima baseiam-se num modelo de dosimetria apropriado± a biocinética revela que uma dose absorvida terapêutica pode ser distribuída aos tumores dentro de limites seguros para a toxicidade de medula óssea.

Reduçãoâdoâtumorâanimalâ A Figura 22 ilustra como o tumor num dos ratinhos (visível no flanco do animal, por baixo da pele) diminui em termos de volume a seguir ao tratamento.

Resultadosãdaãradioimunoterapiaâ A Figura 2% ilustra os resultados para os grupos de estudo com atividades administradas (a) D, (b) 2 x D e (c) um grupo de controlo (em que D = 26,7 MBq).

Existe uma clara tendência de diminuição do volume de tumor em ambos os grupos de tratamento. 0 início da redução do tumor é logo observado alguns dias após a injeção de 177Lu-mllB6. No grupo de controlo existe um aumento de volume do tumor após a injeção de solução Nal. A Figura 24 (a) ilustra os resultados para um dos ratinhos no grupo injetado com atividade A. Neste caso, o tumor cresce regularmente desde o primeiro dia até ao sexto dia quando é administrada a atividade A de 177Lu-mllB6. A seguir ao tratamento, é observada uma descida rápida no volume do tumor.

No estudo SPECT (8 d interinamente), o volume do tumor é ilustrado com atividade tranquila presenter consulte a Figura 24(b).

Conclusão 0 presente estudo com anticorpo 177Lu-mll B6 de exemplo demonstra claramente uma eficácia terapêutica contra os tumores de cancro da próstata inâvivo.

Tanto os cálculos teóricos baseados no modelo de dosimetria especial como a biocinética medida inâ vivoâ mostram a dosimetria favorável fornecendo uma elevada relação terapêutica. Isto é depois verificado no estudo animal com bons resultados de terapia que ilustram uma rápida redução do volume do tumor.

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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

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EvaluateMeans to Improve Radioimmunotherapy. Clinâ Cancerâ Res,ã2005, vol. 11, 7104s-7108s [0206]

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um agente compreendendo ou consistindo (a) num anticorpo ou fragmento de união ao antigénio do mesmo com especificidade para calicreína glandular humana (hK2) e (b) numa metade citotóxica para a utilização no tratamento do cancro da próstata,
2. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de união ao antigénio do mesmo com especificidade para hK2 compete pela união a hK2 com anticorpo 11 B6, em que o anticorpo 11 B6 compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 4 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 5. %. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo ou fragmento de união ao antigénio do mesmo com especificidade para hK2 compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade do anticorpo 11 B6, em que o anticorpo 11 B6 compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 4 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 5.
4. Um agente para a utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o agente compreende ou consiste no anticorpo 11 B6 ou num fragmento de união ao antigénio do mesmo, em que o anticorpo 11 B6 compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 4 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 5.
5. Um agente para a utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo ou fragmento de união ao antigénio do mesmo com especificidade para hK2 é ligado indiretamente à metade citotóxica.
6. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de união ao antigénio do mesmo com especificidade para hK2 é ligado diretamente à metade citotóxica.
7. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 5 ou 6, em que o agente apresenta características de absorção do tumor substancialmente equivalentes às características de absorção do tumor do anticorpo ou fragmento de união ao antigénio do mesmo com especificidade para hK2 sozinha.
8. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 5 a 7, em que a metade citotóxica compreende ou consiste num ou em mais radioisótopos.
9. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 8, em que um ou mais radioisótopos são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em emissores beta, emissores Auger, emissores de eletrão de conversão, emissores alfa e emissores de baixa energia de fotões.
10. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 8 ou 9, em que um ou mais radioisótopos têm independentemente um padrão de emissão de energia localmente absorvida que cria uma elevada absorvância de dose nas proximidades do agente.
11. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 a 10, em que um ou mais radioisótopos são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em emissores beta de longo alcance, tais como 9CIY, %2P, 186Re± 16dHo , 7faAs/77As, 89Sr, 15%Sm± emissores beta de médio alcance, tais como 1%1I, 177Lu, S7Cu, lslTb, 105Rh+ emissores beta de baixa energia, tais como 45Ca ou %5S± emissores Auger ou de conversão, tais como 3lCr, D7Ga, 99Tcm, 11:LIn, 114mIn, 12%I 125I 201TI± e emissores alfa, tais como 212Bi 2i%Bi ^aC , 225Ac, 212Pb 255Fm 22%Ra, 149Tb e 221At.
12. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações, em que a metade citotõxica compreende ou consiste num ou em mais fãrmacos citotóxicos, 1%. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 12, em que um ou mais fármacos citotóxicos são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste num fãrmaco citostático± num fãrmaco antiandrogénico± em cortisona e derivados da mesma± num fosfonato± num inibidor de test.osterona-5-a-redutase± numa adenda de boro± numa citocina+ em tapsigargina e respetivos metabolitosf numa toxina (tal como saporina ou caliquiamicina)+ num agente quimioterapêutico (tal como um antimetabolito)± ou em qualquer outro fãrmaco citotõxico útil no tratamento de carcinoma da próstata.
14. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a metade citotóxica compreende ou consiste numa ou em mais metades adequadas para a utilização na terapia de ativação, tais como a terapia de ativação de fotões, terapia de ativação de neutrões, terapia de eletrões de Auger induzida por neutrões, terapia de irradiação de sincrotrão ou terapia de ativação de fotões de raios X de baixa energia.
15. Um agente para a utilização de acordo com as Reivindicações 8 a 11, em que o radioisótopo é capaz de simultaneamente agir de uma maneira multimodal como uma metade detetável e igualmente como uma metade citotõxica.
16. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o agente compreende ainda uma metade para o aumento da semivida ínâ vivoâ do agente.
17. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 16, em que a metade para o aumento da semivida inâ vivoâ é selecionada a partir do grupo que consiste num polietilenoglicol (PEG), numa soroalbumina humana, em grupos de glicosilação, ácidos gordos e dextrano.
18. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o cancro da próstata a ser tratado é um cancro da próstata não localizado (isto é, disseminado).
19. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o cancro da próstata a ser tratado é um cancro da próstata metastático, opcionalmente cancro da próstata micrometastático.
20. Um agente para a utilização de acordo com a Reivindicação 19, em que o cancro da próstata metastático a ser tratado corresponde a metástases do sistema linfático± metástases do osso (incluindo coluna vertebral, vértebras, pélvis e/ou costelas)± metástase na pélvis, no reto, na bexiga e/ou na uretra.
21. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o paciente tem cancro da próstata e tem menos de 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 ou menos anos de idade na altura do diagnóstico do cancro da próstata e/ou na altura do tratamento.
22. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o paciente é caracterizado por um membro da família, tal como o pai ou um irmão, ter sido anteriormente diagnosticado com cancro da próstata. 2%. Um agente para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o cancro da próstata a ser tratado é um cancro da próstata resistente à castração (CRPC).