MX2014009706A - Histidil-arnt sintetasas para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias. - Google Patents

Histidil-arnt sintetasas para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

Info

Publication number
MX2014009706A
MX2014009706A MX2014009706A MX2014009706A MX2014009706A MX 2014009706 A MX2014009706 A MX 2014009706A MX 2014009706 A MX2014009706 A MX 2014009706A MX 2014009706 A MX2014009706 A MX 2014009706A MX 2014009706 A MX2014009706 A MX 2014009706A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
hrs
hrs polypeptide
polypeptide
composition according
composition
Prior art date
Application number
MX2014009706A
Other languages
English (en)
Other versions
MX356107B (es
Inventor
Kyle P Chiang
Elisabeth Gardiner
Ching Fun Lau
Wing-Sze Lo
Jeffrey Greve
Melissa Ashlock
John D Mendlein
Original Assignee
Atyr Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Atyr Pharma Inc filed Critical Atyr Pharma Inc
Publication of MX2014009706A publication Critical patent/MX2014009706A/es
Publication of MX356107B publication Critical patent/MX356107B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/53—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)
    • C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)
    • C12Y601/01021—Histidine-tRNA ligase (6.1.1.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

La presente invención se relaciona de manera general con composiciones y métodos que comprenden polipéptidos de histidil-ARNt sintetasa u otros agentes bloqueadores específicos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y otras enfermedades inflamatorias, que incluye aquellas relacionadas con los anticuerpos Jo-1.

Description

HISTIDIL-ARNt SI TETASAS PARA TRATAR ENFERMEDADES AUTOINMUNES E INFLAMATORIAS CAMPO DE LA INVENCION Las modalidades de la presente invención se relacionan de manera general con polipéptidos de histidil-ARNt sintetasa (HRS, por sus siglas en inglés) que tienen características mejoradas, composiciones que comprenden los polipéptidos de HRS y métodos relacionados con el uso de los polipéptidos de HRS o composiciones para tratar diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunes, que incluye métodos para tratar enfermedades inflamatorias y autoinmunes relacionadas con el anticuerpo anti-Jo-1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las fisiocrinas son dominios de proteína que se encuentran de modo natural, generalmente pequeños, que se encuentra en la familia del gen para las aminoacil-AR t sintetasas (AARS, por sus siglas en inglés) de organismos superiores las cuales no se requieren para el papel bien establecido de las aminoacil-ARNt sintetasas en síntesis de proteínas. Hasta que se descubrió el paradigma fisiocrino, las aminoacil-ARNt sintetasas, una familia de aproximadamente 20 enzimas, se conocían únicamente por su expresión ubicua en todos las células vivas y su papel esencial en el proceso de síntesis de proteínas. No obstante hallazgos científicos más Ref . : 250230 recientes ahora sugieren que las aminoacil-ARNt sintetasas tienen papeles adicionales que sobrepasan la síntesis de proteína y de hecho han evolucionado en organismos multicelulares para jugar papeles homeostáticos importantes en la fisiología del tejido y las enfermedades.
Las pruebas de la existencia de una función no canónica de las AARS incluye comparaciones de secuencias bien definidas que establecen que durante la evolución a partir de organismos unicelulares sencillos a formas de vida más complejas, las AARS han evolucionado para ser estructuralmente más complejas mediante la adición de dominios que se les agregan, sin perder la capacidad de facilitar la síntesis de proteínas.
Concordante con esta hipótesis, se han encontrado en eucariotas superiores un conjunto rico y diverso de funciones expandidas para las AARS y en particular para las ARt sintetasas humanas. Estos datos, los cuales se basan tanto en el análisis directo de dominios individuales así como el descubrimiento de mutaciones en genes para las ARNt sintetasas que se relacionan causalmente con enfermedades, no afectan la aminoacilación o la actividad de síntesis de proteínas, lo que sugiere que estos dominios nuevos que se han agregado, o las fisiocrinas, son centrales para las funciones no canónicas recién adquiridas de las AARS.
Adicionalmente , ahora hay un reconocimiento cada vez mayor de que las ARNt sintetasas específicas tales como la histidil-AR t sintetasas (HARS, HRS o HisRS) se puede liberar o secretar de células vivas y pueden proporcionar señales de acción localmente importantes con, por ejemplo, propiedades inmunomoduladoras , quimiotácticas y angiogénicas . La confirmación directa del papel de AARS como moléculas de señalización extracelular se ha obtenido mediante estudios que muestran que la secreción y liberación extracelular de AR t sintetasas específicas así como la demostración directa de que la adición de fragmentos de las ARNt sintetasas que comprenden los dominios agregados nuevos (fisiocrinas) , pero no otros fragmentos que carecen de estos dominios, son activas en el ámbito de las vías de señalización extracelular. Estas fisiocrinas, las cuales incluyen aquellas derivadas de HRS representan una oportunidad nueva y previamente no descubierta para desarrollar proteínas terapéuticas nuevas, primeras en su clase, para tratar enfermedades humanas .
Investigaciones recientes también han establecido que algunas ARNt sintetasas incluyen elementos genéticos reguladores novedosos que incluyen elementos ALU (Rudinger-Thirion et al., PNAS USA. 108 (40) : E794 -E802 , 2011) que proporcionan expresión específica de tipo de célula aumentado o empalme alternativo de ARNt sintetasas específicas en tejidos específicos o en el contexto de enfermedades específicas. Además, algunas fisiocrinas se producen proteolíticamente en respuesta a estímulos particulares en un ámbito específico de tipo de célula. De manera concordante con la expresión excesiva específica de tipo de célula y la liberación extracelular de fisiocrinas, diversas enfermedades autoinmunes (denominadas generalmente como síndromes anti sintetasa) se asocia con la producción de anticuerpos a un grupo definido de ARNt sintetasas (Tzioufas Orphanet (2001) 1-5; Park et al., Rheumatol . Int. 31:529-532, 2011).
Los trastornos autoinmunes surgen cuando el sistema inmunitario reacciona contra los tejidos propios. Las enfermedades autoinmunes con frecuencia se clasifican en base en si está involucrado un solo órgano o tejido o si están involucrados órganos o tejidos múltiples. Las enfermedades autoinmunes generalizadas o sistémicas tales como lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés) , caracterizado por la relación de órganos y tejidos múltiples, con frecuencia se asocia con la presencia de autoanticuerpos para componentes celulares fundamentales. Otras enfermedades autoinmunes están caracterizadas por autoanticuerpos a antígenos asociados con un órgano o tejido único.
Las enfermedades autoinmunes sistémicas típicamente se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos. Algunos de los autoanticuerpos asociados con la enfermedad particular pueden ser específicos de enfermedad y otros pueden ser comunes a muchas enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, el SLE, la cual es un trastorno inmunitario prototípico, se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos que son detectables en otras enfermedades autoinmunes, tales como anticuerpos anti-ADN de cadena sencilla, anticuerpos anti -histonas y anticuerpos anti-partículas ribonucleares (R P, por sus siglas en inglés) y también por la presencia de autoanticuerpos que son específicos de SLE tales como anticuerpos anti-ADN de cadena doble. Otros trastornos autoinmunes sistémicos tales como artritis reumatoide y miopatías inflamatorias (idiopáticas) también están caracterizados por la presencia de autoanticuerpos en los sueros de pacientes que reaccionan con componentes intracelulares nucleares y citoplásmicos fundamentales. Al igual que con SLE, algunos de estos anticuerpos se asocian con otros trastornos autoinmunes y algunos se asocian específicamente con miositis autoinmune .
Las miopatías inflamatorias (idiopáticas) polimiositis, dermatomiositis y los trastornos relacionados tales como la superposición polimiositis-escleroderma son miopatías inflamatorias que se caracterizan por inflamación muscular crónica y debilidad muscular proximal . La inflamación muscular provoca percepción anormal de dolor, debilidad muscular y finalmente atrofia muscular y fibrosis como se describe por Plotz et al., Annals of Internal Med. 111:143-157, 1989; y Wallace et al., J. Musculoskelat Med. 27 (12) 470-479, 2010. También asociados con la inflamación muscular se encuentran niveles séricos elevados de aldolasa, creatina cinasa, transaminasas (tales como alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa) y deshidrogenasa láctica. Otros sistemas además del músculo se pueden alterar por estas condiciones lo que resulta en artritis, fenómeno de aynaud y enfermedad pulmonar intersticial. Clínicamente, la polimiositis y dermatomiositis se diferencian por la presencia de exantema característico en pacientes con dermatomiositis. Las diferencias en la miositis de estas condiciones se puede diferenciar en algunos estudios de patología muscular.
La enfermedad de pulmón intersticial (ILD, por sus siglas en inglés) comprende un grupo heterogéneo de trastornos en los cuales se produce fibrosis e inflamación dentro de las paredes alveolares o en tejidos sueltos que rodean las vainas peribroncovasculares , los tabiques interlobulares y la pleura visceral. Se conocen diferentes formas de ILD las cuales comprenden o se asocian con diversas enfermedades autoinmunes además de miositis que incluyen, por ejemplo, neumonitis con hipersensibilidad, escleroderma, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Churg-Strauss , granulomatosis de Wegener y síndrome de Good-pasture.
La enfermedad de músculo inflamatorio (I D, por sus siglas en inglés) y la enfermedad de pulmón intersticial (ILD) son enfermedades autoinmunes crónicas que potencialmente ponen en peligro la vida, para las cuales la norma actual de cuidado incluye medicamentos antiinflamatorios no específicos tales como corticosteroides con los efectos secundarios potenciales e importantes. La causa del inicio de estas enfermedades aún no se ha establecido bien, aunque se pueden detectar autoanticuerpos en aproximadamente 90% de pacientes con polimiositis y dermatomiositis de acuerdo con Reichlin y Arnett, Arthritis and Rheum. 27:1150-1156, 1984. Los sueros de aproximadamente 60% de estos pacientes forman precipitados con timo bovino o extractos de bazo humano en la inmunodifusión (ID, por sus siglas en inglés) de Ouchterlony, mientras que los sueros de aproximadamente 80% de estos pacientes tiñen sustratos de cultivo de tejido tales como células HEp-2 por inmunofluorescencia indirecta (IIF, por sus siglas en inglés) (Targoff and Reichlin, Arthitis and Rheum. 28:796-803, 1985; Nishikai and Reichlin, Arthitis and Rheum. 23:881-888 1980; y Reichlin et al., J. Clin. Imunol. 4:40-44, 1984). Existen numerosas especificidades de autoanticuerpo precipitantes en pacientes con miositis pero cada anticuerpo individual se presenta de manera específica en solo una fracción de los pacientes.
Muchos autoanticuerpos asociados con miositis o síndrome de superposición de miositis se han definido y en algunos casos los anticuerpos se han identificado (véase la patente US número 6,610,823, antígenos asociados con polimiositis y con dermatomiositis) . Estos incluyen anticuerpos que están presentes en otros trastornos y también anticuerpos específicos de enfermedad como se describe por Targoff y Reichlin, Mt . Sinai J. of Med. 55:487-493, 1988.
Por ejemplo, se ha identificado un grupo de autoanticuerpos asociados a miositis los cuales se dirigen a proteínas citoplásmicas que están relacionadas con AR t y síntesis de proteínas, particularmente aminoacil -ARNt sintetasas. Estos incluyen a anti-Jo-1, el cual se dirige contra histidil-ARNt sintetasa y es el autoanticuerpo más común asociado con trastornos autoinmunes de miositis (aproximadamente 20 a 40% de los pacientes de acuerdo con Nishikai and Reichlin, Arthritis Rheum. 23:881.888, 1980), anti-PL-7, el cual se dirige contra treonil-ARNt sintetasa; anti-PL-12, el cual se dirige contra alanil-ARNt sintetasa, anti-OJ, el cual se dirige contra isoleucil-ARNt sintetasa, anti-EJ, el cual se dirige contra glicil-ARNt sintetasa, anti-KS el cual se dirige contra asparaginil-ARNt sintetasa (véase de manera general, Targoff, Curr. Opin, Rheumatol . 12 475-481, 2000) y contra fenilalanina-ARNt sintetasa (Betteridge et al., Rheumat . 46 1005-1008, 2007). Un grupo característico de rasgos se asocia con frecuencia con anti-sintetasas (Love et al., Medicine. 70:360-374, 1991).
El anti-Ul RNP, el cual se encuentra frecuentemente en pacientes con SLE también se ha encontrado en enfermedad de tejido conectivo mixto, síndromes de superposición que involucra miositis o en algunos casos de miositis única. Este anticuerpo reacciona con proteínas que están presentes de modo único sobre la ribonucleoproteína nuclear pequeña Ul, una de las R P nucleares que están involucradas en el empalme de ARNm. Los autoanticuerpos que están asociados con otras condiciones algunas veces se encuentran en pacientes con síndrome de superposición tal como anti-Sm, anti-Ro/SSA y anti-La/SSB. Se ha encontrado anti-Ku en el síndrome de superposición de miositis-escleroderma y en SLE. El antígeno Ku es un complejo de proteína que une ADN con dos componentes polipeptídicos , ambos los cuales han sido clonados. Anti-Jo-1 y otras anti-sintetasas son específicas de enfermedad. Otros anticuerpos asociados a miositis son anti-PM-Scl, el cual está presente en aproximadamente 5-10% de los pacientes con miositis, muchos de quienes presentan superposición de polimiositis-escleroderma, anti-Mi-2, el cual está presente en aproximadamente 8% de pacientes con miositis, casi exclusivamente en dermatomiositis . Anti-Mi-2 se encuentra en un título alto en aproximadamente 20% de todos los pacientes con dermatomiositis y con un título bajo, por ELISA únicamente, en menos de 5% de los pacientes con polimiositis (Targoff and Reichlin, Mt . Sinai J. of Med. 55:487-493, 1988) .
Típicamente, los pacientes con enfermedad de músculo inflamatorio (IMD, por sus siglas en inglés) y enfermedad de pulmón intersticial (ILD, por sus siglas en inglés) presentes cuando son relativamente jóvenes y de otra manera en buen estado de salud, desafortunadamente, en un subgrupo de pacientes el progreso puede resultar en inhabilitación significativa y alta morbilidad. Además, actualmente no hay medicamentos aprobados específicamente para el tratamiento de la población general de IMD e ILD. La norma actual de cuidado, es administrar medicamentos antiinflamatorios no específicos y moduladores inmunitarios tales como metotrexato o azatioprina y si los síntomas no ceden, ciclosporina (Wallace et al., J. Musculoskelat Med. 27:470-479, 2010). Estos medicamentos presentan un riesgo sustantivo de efectos secundarios que pueden ser graves con administración crónica. En enfermedad progresiva grave, los individuos pueden ser tratados con globulina inmune intravenosa (IVIG, por sus siglas en inglés) . La carga y costo de cuidado de tratamiento de pacientes con IVIG es alto (tan grande como $10,000 dolares por paciente por mes de tratamiento) y una fracción significativa de pacientes no realizan el tratamiento y mueren.
En consecuencia, aún permanece una necesidad no satisfecha significativa por métodos mejorados de tratamiento de enfermedades musculares inflamatorias y condiciones relacionadas que sea tanto terapéutico como rentable.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la presente invención se basan, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que el bloqueo específico de la actividad, unión o producción de anticuerpos anti-Jo-1, de otra manera patogénicos (también denominados anticuerpos Jo-1) , por ejemplo con polipéptidos HRS u otros agentes bloqueadores específicos de anticuerpo, pueden ser útiles para tratar a sujetos con enfermedades inflamatorias o autoinmunes y pueden evitar o retardar de modo significativo el progreso de la enfermedad. Una ventaja de este descubrimiento es que el impacto negativo de los anticuerpos anti-Jo-1 se puede superar con poca o nula debilitación del sistema inmunitario del sujeto lo que resulta en perfiles de efectos secundarios reducidos de modo significativo. Además, el enfoque es aplicable ampliamente a otras enfermedades que incluyen enfermedades inflamatorias y trastornos relacionados en donde existe una insuficiencia local o temporal de histidil-ARNt sintetasa.
En consecuencia, algunas modalidades se relacionan con composiciones terapéuticas que comprenden un polipéptido de histidil-ARNt sintetasa (HRS, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 20 a 90 aminoácidos de longitud y que es por lo menos 90% idéntico a la SEC ID NO: 1, en donde la composición/polipéptido HRS es: (a) por lo menos aproximadamente 95% pura; (b) menos de aproximadamente 5% agregada; y (c) sustancialmente libre de endotoxina . En algunas modalidades, por lo menos 20 aminoácidos del polipéptido de HRS están desde la región definida por los residuos 1 a 67 de la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, por lo menos 40 aminoácidos del polipéptido de HRS donde la región definida por los residuos 1 a 67 de la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, por lo menos 60 aminoácidos del polipéptido de HRS son de la región definida por los residuos 1 a 67 de la SEC ID NO: 1.
También se incluyen composiciones terapéuticas que comprenden un polipéptido de histidil-ARNt sintetasa (HRS) de por lo menos aproximadamente 400 aminoácidos de longitud que comprende 80 o más aminoácidos contiguos que son por lo menos 90% idénticos a la SEC ID NO: 1, en donde la composición/polipéptido de HRS es: a) por lo menos aproximadamente 95% pura; b) menos de aproximadamente 5% agregada; y c) sustancialmente libre de endotoxina. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende 200 o más aminoácidos que son por lo menos 90% idénticos a la SEC ID NO : 1. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende 400 o más aminoácidos que son por lo menos 90% idénticos a la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS es por lo menos de 500 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende la secuencia de HRS humano de longitud completa (SEC ID NO: 1) . En algunas modalidades, el polipéptido de HRS está truncado en los residuos 505 (HRS (1-505)) o 506 (1-506) de la SEC ID NO : 1.
Algunas modalidades se relacionan con composiciones terapéuticas que comprenden el polipéptido histidil-ARNt sintetasa (HRS) de por lo menos aproximadamente 400 aminoácidos de longitud que es por lo menos 90% idéntico a la SEC ID NO: 1, en donde la composición/polipéptido de HRS es: a) por lo menos aproximadamente 95% pura; b) menos de aproximadamente 5% agregada; y c) sustancialmente libre de endotoxinas . En algunas modalidades, el polipéptido de HRS es de por lo menos aproximadamente 500 aminoácidos de longitud con por lo menos 90% idéntico a la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS comprende la secuencia de la SEC ID NO: 1 (HRS humana de longitud completa) . En algunas modalidades, el polipéptido de HRS está truncado en el residuo 505 (HRS(l-505)) o 506 (HRS (1-506) ) de la SEC ID NO: 1.
También se incluyen composiciones terapéuticas que comprenden un polipéptido de histidil-ARNt sintetasa (HRS) de 500-506 aminoácidos de longitud que es por lo menos 90% idéntica a la SEC ID NO: 70 (HRS(l-506)) y que carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO: 1, en donde la composición/polipéptido de HRS es: a) por lo menos aproximadamente 95% pura; b) menos de aproximadamente 5% agregada; y c) sustancialmente libre de endotoxinas. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS es de 505-506 aminoácidos de longitud y es por lo menos 90% idéntico a la SEC ID NO: 70. En algunas modalidades, el polipéptido HRS es de 506 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende la SEC ID NO: 70. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS consiste esencialmente de la SEC ID NO: 70. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS consiste de la SEC ID NO: 70. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una longitud de 505 aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende los residuos 2-506 de la SEC ID NO: 70 (HRS (2-506) ) . En algunas modalidades, el polipéptido de HRS consiste esencialmente de los residuos 2-506 de la SEC ID NO: 70 (HRS(2-506). En modalidades específicas, el polipéptido de HRS consiste de los residuos 2-506 de la SEC ID NO: 70 (HRS (2-506) ) .
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una mutación de por lo menos un residuo cisteína. En ciertas modalidades, por lo menos un residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235 y Cys455.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS (por ejemplo, que carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO: 1) tiene actividad biológica aumentada, estabilidad y/u homogeneidad en relación a un polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS humano de longitud completa) bajo condiciones comparables que varían de aproximadamente 4-40°C y un pH de aproximadamente 6.0-8.0. En algunas modalidades, la condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 20-25°C (temperatura ambiente) y un pH de aproximadamente 7.0-7.5, opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días. En ciertas modalidades, las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 37°C y un pH de aproximadamente 7.0-7.5, opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7 días.
En algunas modalidades, la actividad aumentada comprende un incremento absoluto en una actividad biológica no canónica de por lo menos aproximadamente 10%. En algunas modalidades, la actividad no canónica es una actividad antiinflamatoria o unión específica a un anticuerpo anti-Jo-1. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una formación disulfuro intercadena reducida bajo condiciones reductoras en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS de longitud completa) . En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una heterogeneidad (carga) reducida en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS de longitud completa) . En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una formación reducida de agregados de peso molecular alto en solución, en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS de longitud completa) . En ciertas modalidades, la homogeneidad aumentada comprende por lo menos un incremento de 10% en la monodispersión del polipéptido de HRS en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene un rendimiento aumentado de proteína soluble sobre la producción recombinante en E. coli en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS de longitud completa) .
En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS está fusionado a un asociado de fusión heterólogo, opcionalmente un ligando de linfocito T. En modalidades particulares, el polipéptido de HRS comprende por lo menos un D-aminoácido .
En algunas modalidades, la composición terapéutica comprende un amortiguador en una concentración que varía de aproximadamente 0.03 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas modalidades, la composición terapéutica comprende un amortiguador en una concentración que varía de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. En ciertas modalidades, la composición terapéutica comprende un amortiguador en una concentración que varía de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM. En ciertas modalidades, la composición terapéutica comprende un amortiguador en una concentración que varía de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 55 mM. En algunas modalidades, la composición terapéutica comprende un amortiguador en una concentración de aproximadamente 50 mM. En algunas modalidades, el amortiguador es un amortiguador de histidina, un amortiguador de citrato o un amortiguador de fosfato .
En ciertas modalidades, el amortiguador es un amortiguador de histidina y en donde el polipéptido de HRS tiene estabilidad aumentada en relación al polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable sin el amortiguador de histidina, bajo condiciones comparables, que varían de aproximadamente 4-40°C y un pH de aproximadamente 7.0-7.5.
En ciertas modalidades, el amortiguador es un amortiguador de citrato y en donde el polipéptido de HRS tiene estabilidad aumentada en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable sin el amortiguador de citrato, bajo condiciones comparables, que varían de aproximadamente 4-40°C y un pH de aproximadamente 6.5-7.5.
En ciertas modalidades, el amortiguador es un amortiguador de fosfato y en donde el polipéptido de HRS tiene estabilidad aumentada en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable sin el amortiguador de fosfato, bajo condiciones comparables, que varían de aproximadamente 4-40°C y un pH de aproximadamente 7.0-7.5.
En algunas modalidades, las condiciones (por ejemplo, para comparación) incluyen una temperatura de aproximadamente 5°C, opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días. En algunas modalidades, las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 20-25°C (temperatura ambiente) opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7 días. En ciertas modalidades, las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 37°C, opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días.
En algunas modalidades, la estabilidad aumentada comprende estabilidad térmica, en donde la temperatura de fusión (Tm) del polipéptido de HRS es de por lo menos aproximadamente 5°C mayor que la del polipéptido de HRS correspondiente en la composición sin el amortiguador y/o fuera del intervalo de pH. En algunas modalidades, la estabilidad aumentada comprende estabilidad térmica, en donde la temperatura de fusión del polipéptido de HRS se desnaturaliza a una velocidad que es por lo menos 10% menor que la de un polipéptido de HRS correspondiente en la composición sin el amortiguador y/o fuera del intervalo de pH.
En ciertas modalidades, la composición tiene una agregación y/o precipitación reducidas en relación a una composición sin el amortiguador y/o fuera del intervalo de pH, bajo condiciones que de otra manera son comparables. En algunas modalidades, la agregación se reduce en por lo menos aproximadamente 10%, medido por la absorbancia a A340. En ciertas modalidades, la composición tiene agregados de peso molecular alto reducidos en relación a una composición sin el amortiguador y/o fuera del intervalo de pH, bajo condiciones que de otra manera son comparables.
En algunas modalidades, el amortiguador es un amortiguador de histidina y el polipéptido de HRS es por lo menos 90% idéntico a los residuos 1-506 o 2-506 de la SEC ID NO: 1 y carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO : 1. En ciertas modalidades, el amortiguador es un amortiguador de citrato y el polipéptido de HRS es por lo menos 90% idéntico a los residuos 1-506 o 2-506 de la SEC ID NO: 1 y carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO : 1. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS es HRS (1-506) o HRS (2-506) .
En algunas modalidades, la composición comprende cloruro de sodio (NaCl) , en una concentración que varía de aproximadamente 100-300 mM, opcionalmente a aproximadamente 140 mM-240 mM, u opcionalmente a aproximadamente 140 mM. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS es por lo menos 90% idéntico a los residuos 1-506 o 2-506 de la SEC ID NO: 1 y carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO: 1, opcionalmente en donde el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) de por lo menos aproximadamente 60°C. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS es HRS(l-506) o HRS(2-506), opcionalmente en donde el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) de por lo menos aproximadamente 60°C.
En algunas modalidades, la composición comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
En algunas modalidades, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables se seleccionan de sacarosa, manitol, trehalosa, sorbitol, arginina, glicina y glicerol. En algunas modalidades, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables están en una concentración que varía de aproximadamente 0.2 a 5.0%. En algunas modalidades, el excipiente farmacéuticamente aceptable es sacarosa aproximadamente 1 a 3%, opcionalmente sacarosa aproximadamente 2%. En algunas modalidades, el excipiente farmacéuticamente aceptable es trehalosa aproximadamente 1 a 3%, opcionalmente trehalosa aproximadamente 2%.
En algunas modalidades, la composición comprende uno o más tensioactivos . En algunas modalidades, el tensioactivo es un polisorbato o un poloxámero. En algunas modalidades, el polisorbato es polisorbato 20 (PS20) , polisorbato 40 (PS40) , polisorbato 60 (PS60) o polisorbato 80 (PS80) . En ciertas modalidades, el polisorbato es PS20. En ciertas modalidades, el poloxámero es Pluronic F68. En algunas modalidades el tensioactivo está presente en un intervalo de aproximadamente 0.1 a 5.0% (p/v) . En algunas modalidades, es aproximadamente 0.05% (p/v) de PS20.
En ciertas modalidades, la composición comprende uno o más compuestos antioxidantes o agentes reductores. En algunas modalidades el compuesto antioxidante o agente reductor se selecciona de cisteína, metionina y N-acetilcisteína (NAC) . En algunas modalidades, el compuesto antioxidante o agente reductor está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1-5.0 mM.
En ciertas modalidades, la composición comprende uno o más agentes quelantes. En algunas modalidades el agente quelante es etilendiaminotetraacetato (EDTA, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades, el agente quelante está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1-2.0 mM.
En ciertas composiciones, el polipéptido de HRS está presente en una concentración de por lo menos aproximadamente 10 mg/ml. En algunas composiciones, el polipéptido de HRS está presente en una concentración de por lo menos aproximadamente 25 mg/ml. En algunas composiciones, el polipéptido de HRS está presente en una concentración de por lo menos aproximadamente 50 mg/ml.
En ciertas modalidades, la composición tiene una turbidez de menos de aproximadamente 0.5 medida por absorbancia a A340. En algunas modalidades, la absorbancia a 0 A340 se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a 37°C. En algunas modalidades, la absorbancia a A340 se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7 días de incubación a temperatura ambiente. En ciertas modalidades, la ¡- absorbancia a A340 se mide después de congelamiento-recalentamiento de la composición por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 veces.
En algunas modalidades, la composición tiene una opalescencia de menos de aproximadamente 0.6 medida por absorbancia a A580. En algunas modalidades, la absorbancia a A580 se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a 37°C. En algunas modalidades, la absorbancia a A580 se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7 días de incubación a temperatura ambiente. En ciertas modalidades, la absorbancia a A580 se mide después de congelamiento-recalentamiento de la composición por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 veces.
En algunas modalidades, la composición tiene menos de aproximadamente 3% de agregados de peso molecular alto. En algunas modalidades, la agregación de peso molecular alto (HMW, por sus siglas en inglés) se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a 37°C. En ciertas modalidades, la agregación de peso molecular alto (HMW) se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a temperatura ambiente. En algunas modalidades, la agregación de peso molecular alto se mide después de congelamiento-recalentamiento de la composición por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 veces.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) en la composición de por lo menos aproximadamente 50°C. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) en la composición de por lo menos aproximadamente 55 °C. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) en la composición de por lo menos aproximadamente 60°C.
En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS está por lo menos aproximadamente 90% o 95% monodisperso .
En algunas modalidades, la composición comprende L-histidina aproximadamente 50 mM NaCl aproximadamente 140 mM, trehalosa aproximadamente 2%, polisorbato 20 (PS20) aproximadamente 0.05% y tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.4. En algunas modalidades, la composición comprende L-histidina aproximadamente 50 mM, NaCl aproximadamente 140 mM, sacarosa aproximadamente 2%, polisorbato 20 (PS20) , aproximadamente 0.05% y tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.4. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS es HRS (1-506) o HRS (2-506) y tiene una temperatura de fusión (Tm) (en la composición de por lo menos aproximadamente 60 °C. En ciertas modalidades la composición tiene una turbidez de menos de aproximadamente 0.1 o menor de aproximadamente 0.05, medida por absorbancia a A340. En algunas modalidades, la composición tiene opalescencia de menos de aproximadamente 0.1, o menor de aproximadamente 0.05, medida por absorbancia a A580. En ciertas modalidades, la composición tiene menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% de agregados de peso molecular alto.
En ciertas modalidades, la presente invención 5 incluye una composición médicamente útil que comprende un polipéptido de entre aproximadamente 20 y 90 aminoácidos con por lo menos 90% de identidad con HRS humana (SEC ID NO: 1) . En algunas modalidades, por lo menos 20-40 aminoácidos están dentro de los aminoácidos 1-67 de HRS humana (SEC ID NO: 1) .
LO En modalidades particulares, por lo menos un aminoácido es un D-aminoácido . En algunos aspectos, el polipéptido es: a) por lo menos aproximadamente 95% puro; b) menos de aproximadamente 5% agregado; y c) sustancialmente libre de endoto ina .
L5 En otra modalidad, la presente invención incluye una composición médicamente útil que comprende un polipéptido de por lo menos aproximadamente 400 aminoácidos de un polipéptido de HRS; en donde el polipéptido es: a) por lo ?Q menos aproximadamente 95% puro; b) menos de aproximadamente 5% agregado; y c) sustancialmente libre de endotoxinas .
En otra modalidad, la presente invención incluye una composición médicamente útil que comprende un polipéptido de por lo menos aproximadamente 400 aminoácidos; en donde el ?t- polipéptido es: a) por lo menos 80% idéntico a HRS humana (SEC ID NO: 1) ; b) por lo menos aproximadamente 95% puro, c) menos de aproximadamente 5% agregado; y d) sustancialmente libre de endotoxinas .
En algunos aspectos, de cualquiera de estas composiciones médicamente útiles o terapéuticas, el polipéptido comprende al polipéptido de HRS de longitud completa. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS está truncado en aproximadamente el residuo 505 o 506. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene por lo menos una mutación en un residuo cisteína. En algunos aspectos, el residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 y Cys509. En algunos aspectos, el polipéptido comprende por lo menos un D-aminoácido . En algunos aspectos, el polipéptido comprende un dominio HEP. En algunos aspectos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 y 176-182 o una secuencia de aminoácidos incluida en o derivable de cualquiera de las tablas 1 a 9. En algunos aspectos, el polipéptido está fusionado a una proteína heteróloga. En algunos aspectos, la proteína heteróloga comprende un ligando de linfocito T. En algunos aspectos, la composición está formulada para suministro por administración vía oral, intranasal, pulmonar o parenteral .
En algunos aspectos, la composición médicamente útil o terapéutica es para usarse en el tratamiento de una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste de enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, miopatías inflamatorias que incluyen miopatías inflamatorias (idiopáticas) , polimiositis, dermatomiositis y trastornos relacionados, superposición de polimiositis-escleroderma, miositis de cuerpos de inclusión (IBM, por sus siglas en inglés) , síndrome anti-sintetasa, enfermedad de pulmón intersticial, artritis, fenómeno de Reynaud, síndrome de Perrault y síndrome de Usher. En algunos aspectos, el epítopo es un epítopo inmunodominante reconocido por anticuerpos en sueros de los sujetos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS se une a una molécula clase I o clase II del complejo de histocompatibilidad humano (CPH) . En algunos aspectos, el ácido nucleico está acoplado operativamente a secuencias de control de expresión, y en donde la expresión del ácido nucleico genera tolerancia. En algunos aspectos, la composición terapéutica comprende un vehículo de suministro que se selecciona del grupo que consiste de liposomas, micelas, emulsiones y células.
En otra modalidad la presente invención incluye una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con una insuficiencia de histidil ARNt sintetasa, que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS es capaz de sustituir por lo menos una función canónica o no canónica de la histidil AR t sintetasa. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por la unión de autoanticuerpo asociado a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 5 x 10"7 M.
En otra modalidad la presente invención incluye una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil ARNt sintetasa que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde el polipéptido de HRS es capaz de generar tolerancia.
En otra modalidad la presente invención incluye una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil ARNt sintetasa, la composición comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para el polipéptido de HRS de mamífero, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde el ácido nucleico está acoplado operativamente a secuencias de control de expresión y en donde la expresión del ácido nucleico genera tolerancia.
En otra modalidad la presente invención incluye una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil AR t sintetasa, la composición comprende una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo que comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde el ácido nucleico está acoplado operativamente a secuencias de control de expresión para permitir la expresión de HRS en la célula hospedadora.
En otra modalidad la presente invención incluye una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil ARNt sintetasa, la composición comprende un anticuerpo o proteína de unión específica para el autoanticuerpo, en donde el anticuerpo o la proteína de unión bloquea la unión del autoanticuerpo a histidil ARNt sintetasa nativa .
Algunas modalidades se relacionan con composiciones terapéuticas para usarse en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS tiene por lo menos una actividad no canónica.
También se incluyen composiciones terapéuticas para usarse en el tratamiento de distrofia muscular que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS tiene por lo menos una actividad no canónica. En algunos aspectos, la distrofia muscular se selecciona de distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de anillo óseo, distrofia muscular facioescapulohumeral , distrofia miotónica, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular distal y distrofia muscular congénita.
Ciertas modalidades incluyen composiciones terapéuticas para usarse en el tratamiento de rabdomiolisis , agotamiento muscular, caquexia, inflamación muscular o daño muscular que comprende por lo menos un polipéptido de HRS en donde el polipéptido de HRS tiene por lo menos una actividad no canónica.
En otra modalidad la presente invención incluye el uso de un polipéptido de HRS en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o autoinmune. En otra modalidad, la presente invención incluye el uso de un polipéptido de HRS en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con una insuficiencia de histidil AR t sintetasa .
En algunos aspectos, de cualquiera de estas composiciones terapéuticas o usos, el polipéptido de HRS induce tolerancia. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 60 a aproximadamente 120 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 120 a aproximadamente 200 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS es de longitud completa. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS está truncado en aproximadamente el residuo 505 o 506. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene por lo menos una mutación en un residuo cisteína. En algunos aspectos, el residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 y Cys509. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende por lo menos un D-aminoácido . En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende un dominio WHEP. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182 o una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las secuencias en las tablas DI, D3 a D6 o D8. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS se fusiona a una proteína heteróloga. En algunos aspectos, la proteína heteróloga comprende un ligando de linfocito T. En algunos aspectos, la composición se formula para suministro por medio de administración oral, intranasal, pulmonar o parenteral . En algunos aspectos, la composición terapéutica comprende un vehículo de suministro que se selecciona del grupo que consiste de liposomas, micelas, emulsiones y células.
También se incluyen métodos de tratamiento de una enfermedad asociada con un autoanticuerpo que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende uno o más de a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterologo, c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo, o d) un anticuerpo o una proteína de unión específica para el autoanticuerpo .
En algunos aspectos, la composición terapéutica se administra a un sujeto antes de la aparición de los síntomas de enfermedad. En algunos aspectos, el autoanticuerpo es específico para histidil ARNt sintetasa. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo de histidil ARNt sintetasa reconocido por el autoanticuerpo específico de la enfermedad. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS bloquea la unión del autoanticuerpo a histidil ARNt sintetasa nativa. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS provoca la supresión clonal de linfocitos T auto-reactivos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS provoca inactivación funcional de los linfocitos T involucrados en la respuesta autoinmune . En algunos aspectos, el polipéptido de HRS resulta en inflamación reducida en músculo o pulmón. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS induce tolerancia. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS es de una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 60 a aproximadamente 120 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 120 a aproximadamente 200 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS es de longitud completa. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS está truncado en aproximadamente el residuo 506 ó 506. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene por lo menos una mutación en un residuo cisteína. En algunos aspectos, el residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 y Cys509. En algunos aspectos, los residuos 507, 508 y 509 correspondientes a HRS de longitud completa (SEC ID NO: 1) están suprimidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende por lo menos un D-aminoácido . En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende un dominio WHEP. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182 o una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las secuencias en las tablas DI, D3 a D6 o D8.
En algunos aspectos, el polipéptido de HRS se fusiona a una proteína heteróloga. En algunos aspectos, la proteína heteróloga comprende un ligando de linfocito T. En algunos aspectos, la composición se formula para suministro por medio de administración oral, intranasal, pulmonar o parenteral .
En algunos aspectos, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de miopatías inflamatorias que incluyen miopatías inflamatorias, polimiositis , dermatomiotisis y trastornos relacionados, superposición de polimiositis-escleroderma, miositos de cuerpos de inclusión (IBM, por sus siglas en inglés) , síndrome de anti-sintetasa, enfermedad de pulmón intersticial, artritis, fenómeno de Reynaud, entre otras enfermedades o condiciones descritas en la presente. En algunos aspectos, el epítopo es un epítopo inmunodominante reconocido por anticuerpos en sueros de los sujetos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS se une a una molécula clase II del complejo de histocompatibilidad humano (CPH) . En algunos aspectos, el ácido nucleico está acoplado operativamente a las secuencias de control de expresión y en donde la expresión del ácido nucleico genera tolerancia. En algunos aspectos, la composición terapéutica comprende un vehículo de suministro que se selecciona del grupo que consiste de liposomas, micelas, emulsiones y células.
También se incluyen métodos para reducir la inflamación de tejido que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora predominante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo. En algunos aspectos, el tejido se selecciona de músculo, pulmón y piel.
Algunas modalidades se relacionan con métodos para reducir inflamación muscular o pulmonar, el método comprende administrar a un sujeto una composición terapéutica que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo.
También se incluyen métodos para tratar una distrofia muscular que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo. En algunos aspectos, la distrofia muscular se selecciona de distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery-Dreifuss , distrofia muscular de anillo óseo, distrofia muscular facioescapulohumeral , distrofia miotónica, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular distal y distrofia muscular congénita .
Algunas modalidades se relacionan con métodos para tratar rabdomiolisis , agotamiento muscular, caquexia, inflamación muscular o daño muscular que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterologo, o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo.
Ciertas modalidades incluyen métodos para inducir tolerancia a un autoantígeno de histidil AR t sintetasa (HisRS) , el método comprende administrar a un sujeto una composición terapéutica que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterologo; o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde la administración de la composición genera tolerancia al autoantígeno.
Algunas modalidades incluyen métodos para eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T involucrados en una respuesta autoinmune a un autoantígeno de histidil ARNt sintetasa (HisRS) , el método comprende administrar a un sujeto una composición terapéutica de uno o más de: a) un polipéptido de HRS; b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo; o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde la administración de la composición produce supresión clonal de linfocitos T auto-reactivos.
También se incluyen métodos para inducir anergia en linfocitos T involucrados en una respuesta autoinmune a un autoantígeno de histidil ARNt sintetasa (HisRS) , el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS; b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo; o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo, y en donde la administración de la composición provoca inactivación funcional de los linfocitos T involucrados en la respuesta autoinmune .
Algunas modalidades implican tratamientos de sustitución para tratar una enfermedad asociada con una insuficiencia de histidil ARNt sintetasa comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma una composición terapéutica que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS; b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo; c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo; o d) un anticuerpo o proteína de unión específica para el autoanticuerpo; en donde el polipéptido de HRS compensa funcionalmente la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa.
También se incluyen métodos para tratar una enfermedad inflamatoria o autoinmune que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende por lo menos un polipéptido de HRS.
En algunos aspectos, el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por el autoanticuerpo asociado a la enfermedad que se une a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 5 x 10"7M.
En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 60 a aproximadamente 120 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 120 a aproximadamente 200 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 400 a aproximadamente 500 aminoácidos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS es de longitud completa. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS está truncado en aproximadamente el residuo 505 o 506. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS tiene por lo menos una mutación en un residuo cisteína. En algunos aspectos, el residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 y Cys509. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende por lo menos un D-aminoácido . En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende un dominio WHEP. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 y 176-182 o una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las secuencias en las tablas DI, D3 a D6 o D8. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS está fusionado a una proteína heteróloga. En algunos aspectos, la proteína heteróloga comprende un ligando de linfocito T. En algunos aspectos, la composición está formulada para suministro por administración vía oral, intranasal, pulmonar o parenteral . En algunos aspectos, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de miopatías inflamatorias que incluyen miopatías inflamatorias, polimiositis , dermatomiositis y trastornos relacionados, superposición de polimiositis-escleroderma, miositis de cuerpos de inclusión (IBM) , síndrome de anti-sintetasa, enfermedad pulmonar intersticial, artritis y fenómeno de Reynaud. En algunos aspectos, el epítopo es un epítopo inmunodominante reconocido por anticuerpos en sueros de los sujetos. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS se une a una molécula clase II del complejo de histocompatibilidad humano (CPH) . En algunos aspectos, el ácido nucleico está acoplado operativamente a secuencias de control de expresión y en donde la expresión del ácido nucleico produce tolerancia. En algunos aspectos, la composición terapéutica comprende un vehículo de suministro que se selecciona del grupo que consiste de liposomas, micelas, emulsiones y células.
También se incluyen métodos para determinar la presencia de niveles de un polipéptido de HRS, o un fragmento del mismo en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con uno o más agentes de unión que se unen específicamente al polipéptido de HRS, y detectar la presencia o ausencia del agente de unión y de esta manera determinar la presencia de los niveles del polipéptido de HRS .
Algunas modalidades incluyen métodos de determinación de la especificidad de epítopo de un anticuerpo anti-polipéptido de HRS a un polipéptido de HRS específico, el método comprende poner en contacto el anticuerpo con uno o más polipéptidos de HRS y detectar la presencia o ausencia del agente de unión, y de esta manera determinar la especificidad de epítopo del anticuerpo. En algunos aspectos de este método, el polipéptido de HRS es de una longitud de hasta aproximadamente 80 aminoácidos y comprende el dominio WHEP.
Algunas modalidades incluyen métodos para tratar enfermedades asociadas con un anticuerpo específico para histidil AR t sintetasa, el método comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por la unión a auto-anticuerpo asociada a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 1 x 10"7M.
En otro aspecto de la invención, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para elaborar perfiles de pacientes para identificar su carga de enfermedad de anticuerpo Jo-1.
Estos perfiles permiten la selección de pacientes en subpoblaciones que se beneficiarían del tratamiento con polipéptido de HRS, elaboración de pronósticos de la probabilidad del resultado terapéutico y/o identificación de uno o varios polipéptidos de HRS más adecuados para usarse como agentes terapéuticos.
En consecuencia, algunas modalidades se relacionan con métodos para identificar a un sujeto humano en riesgo de presentar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS, que comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil AR t sintetasa en el sujeto; y b) identificar al sujeto que se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene anticuerpos detectables a histidil ARNt sintetasa, o el polipéptido de HRS. En algunos aspectos, el sujeto puede ser identificado que se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos de histidil ARNt sintetasa en su suero de más de aproximadamente 2 micromolar. En algunos aspectos, el sujeto puede ser identificado que se encuentra en riesgo elevado de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos de histidil ARNt sintetasa en su suero de más de aproximadamente 4 micromolar.
También se incluyen métodos para seleccionar un polipéptido de HRS para tratar a un sujeto humano con una condición autoinmune o inflamatoria, que comprende: 5 a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil ARNt sintetasa en el sujeto; y b) seleccionar un polipéptido de HRS que tenga afinidad reducida por el anticuerpo anti-histidil ARNt sintetasa en comparación con la histidil ARNt sintetasa 10 natural .
Algunas modalidades se relacionan con métodos para pronosticar el progreso de enfermedad en un sujeto humano que comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil ARNt sintetasa en el sujeto; y b) identificar al sujeto que se encuentra en riesgo de desarrollar enfermedad más grave si el sujeto presenta anticuerpos detectables a histidil ARNt sintetasa o al polipéptido de HRS. 20 También se incluyen métodos para predecir las respuestas del sujeto a la administración del polipéptido de HRS que comprende a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil ARNt sintetasa en el sujeto; y b) identificar al sujeto como -JE- adecuado para administración del polipéptido de HRS si el sujeto no tiene anticuerpos detectables a histidil ARNt sintetasa o al polipéptido de HRS.
En algunos aspectos, el sujeto puede ser identificado como adecuado para administración del polipéptido de HRS si el sujeto presenta una concentración de anticuerpos para histidil ARNt sintetasa en su suero menor de aproximadamente 1 micromolar.
En algunos aspectos, el sujeto puede ser identificado como adecuado para administración del polipéptido de HRS si el sujeto presenta una concentración de anticuerpos para histidil ARNt sintetasa en su suero menor de aproximadamente 0.1 micromolar.
En algunos aspectos, al sujeto se le puede identificar que es adecuado para la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histidil ARNt sintetasa en su suero más de aproximadamente 0.01 micromolar.
También se incluyen los métodos para inmunoadsorción extracorporal de anticuerpos anti -histidil ARNt sintetasa (HRS) a partir de un fluido del cuerpo extracelular, que comprende: (a) proporcionar el fluido de cuerpo extracelular el cual ha sido obtenido de un sujeto, poner en contacto el fluido de cuerpo extracelular con un soporte sólido biocompatible que tenga por lo menos un polipéptido de histidil -ARNt sintetasa unido al mismo, para de esta manera capturar los anticuerpos anti-HRS sobre el soporte sólido, y (c) volver a suministrar por infusión el fluido corporal extracelular de la etapa (b) dentro del sujeto. En algunos aspectos, los anticuerpos anti-HRS incluyen un anticuerpo anti-Jo-1.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra las propiedades antiinflamatorias potenciales de polipéptidos derivados de HRS ejemplares en un modelo de colitis inducido por TNBS. Los estudios se realizaron en ratones BDF-1 macho con 12 ratones/grupo; se agregó TNBS y budesonida a 5 mg/kg al agua. Se administró resokina (HisRSN4; HRS(l-60)) diariamente por inyección IV, comenzando 3 días antes del tratamiento con TNBS en una concentración de 1 a 5 mg/kg.
La figura 2 muestra un análisis de SDS-PAGE de HRS de longitud completa y HRS (1-506) bajo condiciones no reducidas y reducidas. Los geles muestran que HRS de longitud completa es una mezcla -50:50 de un dímero no covalente y unido SS bajo condiciones normales y reducidas y que HRS (1-506) muestra formación reducida significativamente de dímero unido SS, homogenicidad aumentada y monodispersibidad en relación a la proteína de longitud completa.
La figura 3 muestra la competencia del anticuerpo anti-Jo-1 que contiene suero con HRS de longitud completa por medio de un análisis de ELISA en el cual HisRS natural de longitud completa se une a la superficie y una placa de 96 pozos. La figura muestra datos de tres diluciones de sueros obtenidos de muestras de suero humano.
La figura 4 muestra la competencia de anticuerpo anti-Jo-1 que contiene el suero con resocina (HisRSN4; HRS(l-60)), en comparación con HisRS humano de longitud completa (FL-hu HisRS, por sus siglas en inglés) por medio de un análisis de ELISA en el cual HisRS natural de longitud completa se une a la superficie de una placa de 96 pozos. Los datos muestran que resocina no compite de modo significativo por unión a anticuerpo con HisRS de longitud completa hasta que está presente en concentraciones mayores de aproximadamente 1 x 107M, cuando la histidil-AR t sintetasa de longitud completa se une a la superficie de la placa.
La figura 5 muestra la competencia de suero que contiene anticuerpo anti-Jo-1 con HisRSN8 (HRS (1-506)) en comparación con HisRS humana de longitud completa por medio de un análisis de ELISA en el cual HisRS natural humana de longitud completa se une a la superficie de una placa de 96 pozos. Los datos muestran que HisRSN8 y HisRS de longitud completa comparten curvas de unión por competencia virtualmente idénticas a anticuerpos anti-Jo-1.
La figura 6 muestra una prueba de ELISA de titulación estándar de anticuerpos anti-Jo-1 utilizando HARS esencialmente de longitud completa o HisRSN4 (HRS (1-60)) unido a la superficie de la placa. Los datos muestran que cuando el análisis se realiza bajo estas condiciones los títulos aparentes para anticuerpos para HisRS^ en suero que contiene anticuerpo anti-Jo-1 es comparable con HisRS de longitud completa.
La figura 7 muestra una representación esquemática de la variante de empalme HRS y otras construcciones de HRS utilizadas en estudios de elaboración de mapa de epítopo.
La figura 8 muestra los resultados de los estudios de elaboración de mapa de epítopo y muestra la selectividad de anticuerpo de una gama de muestras de anticuerpo positivas a Jo-1 con respecto a la unión al dominio HEP (HisRSN4,- SV9; o HRS (1-60)), o una construcción HisRS suprimida (que comprende los aminoácidos 54 a 506 de la SEC ID NO: 1) (dWHEP) que carece del dominio WHEP.
La figura 9 muestra los resultados de estudios de inmunosupresión utilizando HRS de longitud completa y HRS (1-506). Los resultados muestran que tanto HARS de longitud completa como HRS (1-506) son eficaces en inmunosuprimir anticuerpos Jo-1 de muestras de suero humano y que HRS (1-506) es capaz de remover hasta 99% de los anticuerpos Jo-1 detectables.
La figura 10A muestra el esquema de la estrategia de dosificación utilizada para evaluar los efectos de HRS (1-506) (o ATYR1940) en un modelo en rata de miositis inducida por estatina. La figura 10B muestra los efectos de HRS (1-506) para reducir los niveles de troponina en músculo en modelo en rata de miositis inducida por estatina.
Las figuras 11A y 11B muestran los efectos de HRS (1-506) sobre los niveles de CK en el modelo en rata de miositis inducida por estatina.
La figura 12 muestra que los niveles de HRS séricos endógenos se elevan en ratas tratadas con estatina en relación con ratas no tratadas. Estos resultados sugieren que la liberación de HRS endógena puede jugar un papel en la regulación de la inflamación muscular.
La figura 13 muestra la tinción por H&E de hisquiotibial en el modelo en rata de miositis inducida por estatina. Estos resultados muestran degeneración muscular/necrosis reducida y las calificaciones de inflamación en ratas inducidas por estatina que fueron tratados con 1 mg/kg y 3 mg/kg de HRS (1-506) en relación a los tratados con vehículo y ratas tratadas con HRS (1-506), 0.3 mg/kg.
La figura 14 muestra los resultados de elaboración de perfiles de ARN realizados en músculos hisquiotibiales de ratas inducidas por estatina, las cuales se tratan con cantidades en aumento de HRS (1-506). Estos resultados demuestran que la totalidad de los 13 genes que estaban elevados más de cinco veces en respuesta al tratamiento con estatina se redujeron por tratamiento con HRS (1-506) .
La figura 15A muestra los resultados de elaboración de perfil de ARN realizados en músculos hisquiotibiales de ratas inducidas por estatina, y la figura 15B muestra los resultados de ratas inducidas con estatina, con HRS (1-506).
La figura 16 muestra la elaboración de perfil transcripcional de hisquiotibiales de ratas inducidas con estatina. Estos resultados muestran que la expresión de 10 genes relacionados con diabetes/síndrome metabólico y varios genes intrínsecos (datos no mostrados) no fueron impactados de modo significativo por el tratamiento con HRS (1-506).
La figura 17 muestra la elaboración de perfil transcripcional de hisquiotibiales de ratas inducidas con estatina. Estos resultados muestran que la expresión de numerosos genes marcadores de células se reducen por el tratamiento con HRS (1-506) .
Las figuras 18A a 18D muestran que el tratamiento con HRS (1-506) reduce la expresión de genes marcadores de células inmunitarias ITGAL (CDlla) (figura 18A) , CDllb (figura 18B) , CD8a (figura 18C) , CD8b (figura 18D) .
Las figuras 19A a 19C muestran que el tratamiento con HRS (1-506) reduce la expresión de genes marcadores de células inmunes CD18 (figura 19A) , CCR5 (figura 19B) y PTPPC (CD45R) (figura 19C) .
La figura 20 muestra que la elaboración de perfiles transcripcionales de hisquiotibiales de ratas inducidas por estatina. Estos resultados muestran que la expresión de numerosos genes marcadores inflamatorios se reducen por el tratamiento con HRS (1-506).
Las figuras 21A a 21D muestran que el tratamiento con HRS (1-506) reduce la expresión de genes marcadores inflamatorios IL-6 (figura 21A) , MCP1 (figura 21B) , IL-10 (figura 21C) e INF-gamma (figura 21D) .
Las figuras 22 y 23 muestran la elaboración de perfiles transcripcionales de hisquiotibiales de ratas inducidas con estatina. Estos resultados muestran que la expresión de diversos genes de adhesión, de desarrollo y relacionados con fibrosis están alterados por el tratamiento con HRS (1-506) .
Las figuras 24A - 25 muestran la elaboración de perfiles transcripcionales de hisquiotibiales de ratas inducidas con estatina. Estos resultados muestran que la expresión de diversos genes asociados con agotamiento muscular, atrofia y miogénesis están alterados por el tratamiento con HRS (1-506). La figura 24B muestra los resultados para MMP3 y la figura 24C muestra los resultados para MMP9.
Las figuras 26A -26C muestra los efectos de HRS(1-506) en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne (DMD, por sus siglas en inglés) . Se observaron reducciones en CK sérica (figura 26A) , AST (figura 26B) y LDH (figura 26C) en ratones tratados con HRS (1-506) o dexametasona, en relación con los controles tratados con vehículo .
La figura 27A a la figura 27B muestra los efectos de inmunización en ratones SJL/J con HRS de ratón de longitud completa (mHRS) . Estos ratones presentan una supresión en marco de 171 pares de bases en la unión del empalme 3' de exón 45 de disferlina y desarrollan miopatía espontánea que se asocia con inflamación muscular. Los ratones proporcionaron un modelo genético de miopatías deficientes en disferlina en humanos, tal como la distrofia muscular de anillo óseo tipo 2B (LGMD2B) . La figura 27A muestra que los ratones SJL/J inmunizados con mHisRS generan subcutáneamente una respuesta de anticuerpo robusto a HisRS de longitud completa. Como se muestra en la figura 27B, el tejido de músculo de ratones inmunizados con HisRS muestra regiones de infiltración celular y miositis, y concuerda con esta histopatologí , dos ratones inmunizados mostraron signos de miositis .
La figura 28A y la figura 28B muestran análisis de fluorimetría de exploración diferencial (DSF, por sus siglas en inglés) de HRS de longitud completa y HRS (1-506). La figura 28A muestra que existen dos transiciones térmicas para HRS de longitud completa al incubar a pH 7-7.5; la primera transición se presenta a 48 °C como se indica por la flecha y la transición principal se produce a ~54°C. La figura 28B muestra la estabilidad térmica o temperatura de fusión de HRS (1-506) sobre un intervalo de concentraciones de amortiguador de histidina. Los resultados demuestran que el amortiguador de histidina es capaz de estabilizar de modo significativo la conformación de los polipéptidos de HRS tales como HRS (1-506).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique específicamente en contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la habilidad en la técnica, muchas de las cuales se describen a continuación con el propósito de ilustración. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (tercera edición, 2000) ; DNA Cloning: A Practical Approach, vol . I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis .- Methods and Applications (P. Herdewijn, ed. , 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds . , 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed. , 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, quinta edición. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (tercera edición, 2010) ; Farrell, R., RNA Methodologies : A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (tercera edición, 2005) . Poly (ethylene glycol) , Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, 1997; Veronese, F. , and J.M. Harris, Eds . , Peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews, 54(4) 453-609 (2002); Zalipsky, S., et al., "Use of functionalized Poly (Ethylene Glycols) for modification of polypeptides" en Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications. Las publicaciones mencionadas en lo anterior se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en las mismas se debe considerar como admisión de que la invención no está capacitada para antefechar la descripción en virtud de la invención previa.
DEFINICIONES A menos que se defina en otro sentido, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado al entendido habitualmente por aquellos comúnmente expertos en el ámbito a la cual pertenece la invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los que aquí se describen se pueden utilizar en la práctica o en la prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos son los que se describen.
Para los propósitos de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos.
Los artículos "un" y "uno" se utilizan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) de los objetos gramaticales del artículo.
A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Mediante el término "aproximadamente" se quiere indicar una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 4, 2 ó 1% respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia .
El término "anergia" se refiere a la inactivación 3 funcional de una respuesta de linfocitos T o de linfocitos B a la reestimulación por antígeno.
Como se utiliza en la presente, el término "aminoácido" se pretende que signifique aminoácidos tanto como se encuentran de modo natural así como los que no se encuentran de modo natural e igualmente análogos y miméticos de aminoácidos. Los aminoácidos como se encuentran de manera natural incluyen los 20 (L) -aminoácidos utilizados durante la biosíntesis de proteínas así como otros tales como 4 -hidroxiprolina , hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína , citrulina y ornitina, por ejemplo. Los aminoácidos que no se encuentran de modo natural incluyen, por ejemplo, los (D) -aminoácidos , norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina y similares, los cuales son conocidos por una persona experta en el ámbito. Los análogos de aminoácidos incluyen formas modificadas de aminoácidos como se encuentran de manera natural o como no se encuentran de manera natural. Estas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, sustitución o reemplazo de grupos químicos y porciones en el aminoácido o por formación de derivados del aminoácido. Los miméticos de aminoácidos incluyen, por ejemplo, estructuras orgánicas las cuales presentan propiedades funcionalmente similares tales como carga y características de separación de carga del aminoácido de referencia. Por ejemplo, una estructura orgánica la cual imita arginina (Arg o R) puede tener una porción de carga positiva localizada en un espacio molecular similar y tener el mismo grado de movilidad que el grupo e-amino de la cadena lateral del aminoácido Arg como se encuentra de modo natural . Los miméticos también incluyen estructuras limitadas de manera que se mantenga la separación óptima y las interacciones de carga del aminoácido o de los grupos funcionales de aminoácidos. Los expertos en la técnica conocen o pueden determinar que estructuras constituyen análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos funcionalmente equivalentes.
Como se utiliza en la presente, el término "en riesgo" de desarrollar una enfermedad o una reacción adversa puede o no tener una enfermedad detectable o síntomas de enfermedad y puede o no tener una enfermedad detectable o síntomas de enfermedad presentados antes de los métodos de tratamiento descritos en la presente. El término "en riesgo" indica que un sujeto tiene uno o más factores de riesgo los cuales son parámetros mensurables que se correlacionan con el desarrollo de una enfermedad, como se describe en la presente y como se conoce en el ámbito. Un sujeto que tiene uno o más de estos factores de riesgo presenta una mayor probabilidad de desarrollar una enfermedad o una reacción adversa que un sujeto sin uno o más de estos factores de riesgo.
Una "enfermedad autoinmune" como se utiliza en la presente, es una enfermedad o trastorno que surge de y que se dirige contra los tejidos propios de un individuo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a respuestas inflamatorias tales como enfermedades cutáneas inflamatorias que incluyen psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica) , escleroderma sistémico y esclerosis; respuestas asociadas con enfermedad de intestino inflamatorio (tal como enfermedad de Crhon y colitis ulcerativa) ; síndrome de malestar respiratorio (que incluye síndrome de malestar respiratorio adulto; ARDS, por sus siglas en inglés); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis ; condiciones alérgicas tales como eczema y asma y otras condiciones que involucra infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis ; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés) ; diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina) ; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil y respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguada y retardada mediada por citocinas y linfocitos T típicamente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis , miopatías inflamatorias, enfermedad de pulmón intersticial, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison) ; enfermedades que involucran diapedesis de leucocitos; trastornos inflamatorios del sistema nervioso central (SNC) ; síndrome de daño de órganos múltiples; anemia hemolítica (que incluye pero que no se limita a crioglobinemia o anemia de Coombs positivo); miastenia grave; enfermedades mediadas por complejo antígeno-anticuerpo; enfermedad de membrana basal anti-glomerular; síndrome antifosfolipídico ; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigoide buloso; pénfigo, poliendocrinopatías autoinmunes ; enfermedad de Reiter; síndrome de hombre rígido; enfermedad de Behcet; artritis de células gigantes; nefritis de complejo inmunitario; nefropatía por IgA; polineuropatías por IgM; púrpura trombocitopénica inmune (ITP, por sus siglas en inglés) o trombocitopenia autoinmune, etc.
El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas debido, por ejemplo, a interacciones covalentes, electrostáticas, hidrofóbicas y iónicas y/o de unión de hidrógeno, que incluyen interacciones tales como puentes salinos y puentes acuosos. Las proteínas de unión incluyen, por ejemplo, anticuerpos y alternativas de anticuerpo que incluyen agentes de unión, como se describe en la presente.
El término "supresión clonal" se refiere a la supresión (por ejemplo pérdida o muerte) de linfocitos T auto-reactivos. La supresión clonal se puede llevar a cabo centralmente en el timo o en la periferia o en ambos lugares.
En esta descripción, a menos que el contexto lo indique en otro sentido, las palabras "comprende", "que comprende" y "comprendido" se entenderá que implica la inclusión de una etapa establecida o elemento o un grupo de etapas o elementos pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupos de etapas o elementos. Mediante el término "que consiste de" se quiere indicar que incluya, y que está limitado, si sigue la frase "que consiste de".
De esta manera, la frase "consistente en" indica que los elementos que se enumeran son necesarios u obligatorios y que pueden no estar presentes otros elementos. Mediante el término "que consiste esencialmente de" se quiere indicar que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase y que se limita a otros elementos que no interfieran con o que contribuyan a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos enumerados. De esta manera, la frase "que consiste esencialmente de" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios pero que otros elementos son opcionales o pueden o no estar presentes, dependiendo de si afectan o no materialmente la actividad o acción de los elementos enumerados.
Mediante el término "proceso continuo" se quiere indicar un proceso que se puede definir por una función constante que es aplicada en un punto de tiempo inicial del proceso y que finaliza en un punto final del proceso. De este modo, en el presente contexto, un ejemplo típico de un proceso continuo es un procedimiento en el cual cierto tipo de fluido corporal, habitualmente sangre, es extraído a un flujo constante (es decir, un flujo sustancialmente ininterrumpido) de un paciente y también reintroducido al paciente con un flujo constante similar. Este procedimiento debe entenderse que contrasta con cualquier otro procedimiento "discontinuo" en donde el fluido corporal es extraído del paciente en un procedimiento independiente en algún momento, opcionalmente almacenado y puesto en contacto con adsorbente de una manera por lotes en otro momento y reintroducido en el paciente en otro momento diferente, que se seleccionan de manera muy independiente de los dos primeros procedimientos.
El término "libre de endotoxinas" o " sustancialmente libre de endotoxinas" se relaciona de manera general con composiciones, disolventes y/o recipientes que contienen como máximo cantidades en trazas (por ejemplo, cantidades que no tienen efectos fisiológicos clínicamente adversos en un sujeto) de endotoxina, y de manera preferible cantidades indetectables de endotoxina. Las endotoxinas son toxinas asociadas con ciertos microorganismos, tales como bacterias, típicamente bacterias gramnegativas , aunque las endotoxinas se pueden encontrar en bacterias grampositivas tal como histeria monocytogen.es. Las endotoxinas más prevalentes son lipopolisacáridos (LPS) o lipooligosacáridos (LOS) encontrados en la membrana exterior de diversas bacterias gramnegativas y los cuales representan un rasgo patogénico central en la capacidad de estas bacterias para provocar enfermedades . Cantidades pequeñas de endotoxina en los humanos pueden producir fiebre, una disminución de la presión sanguínea y activación de inflamación y coagulación, entre otros efectos fisiológicos adversos.
Por lo tanto, en la producción farmacéutica, con frecuencia es deseable remover la mayor parte o todas las trazas de endotoxina de los productos de fármaco y/o los recipientes de fármaco debido a que incluso cantidades pequeñas pueden provocar efectos adversos en los humanos. Se puede utilizar un horno de despirogenación para este propósito dado que temperaturas que exceden de 300°C son las que típicamente se requieren para descomponer la mayor parte de las endotoxinas . Por ejemplo, en base en material de empacado primario tal como jeringas o frascos, la combinación de una temperatura de vidrio de 250 °C y un tiempo de permanencia de 30 minutos con frecuencia es suficiente para obtener una reducción de 3 unidades logarítmicas en los niveles de endotoxina. Se contemplan otros métodos para eliminar endotoxinas que incluyen, por ejemplo, cromatografía y métodos de filtración, como se describe en la presente y como se conoce en el ámbito. También se incluyen métodos para producir polipéptidos de HRS dentro, y aislarlos de células eucarióticas tales como células de mamífero para reducir, si no eliminar, el riesgo de endotoxinas que están presentes en una composición de la invención. Se prefieren los métodos para producir polipéptidos de HRS dentro, y aislarlos de células libres de suero.
Las endotoxinas se pueden detectar utilizando técnicas habituales conocidas en el ámbito. Por ejemplo, el análisis de lisado de ameobocitos de Liraulus, el cual utiliza sangre de cangrejo de herradura es un análisis muy sensible para detectar la presencia de endotoxina. En esta prueba, niveles muy bajos de LPS pueden generar coagulación detectable del lisado de Limulus debido a una poderosa cascada enzimática que amplifica esta reacción. Las endotoxinas también pueden ser cuantificadas por análisis inmunosorbente unido a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) . Para que estén sustancialmente libres de endotoxinas, los niveles de endotoxina deben ser menores de aproximadamente 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 EU/mg de proteína. Típicamente 1 ng de lipopolisacárido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 EU. el término "epítopo" se refiere a aquella porción de un antígeno u otra molécula capaz de formar una interacción de unión que interactúa con la región variable de un anticuerpo (o proteína similar) , alternativa de anticuerpo, agente de unión o receptor de linfocitos T. En el caso de anticuerpos, estas interacciones de unión se pueden manifestar como un contacto intermolecular con uno o más residuos aminoácidos de un CDR. La unión de antígeno puede involucrar un CDR3 o un par de CDR3. Un epítopo puede ser una secuencia peptídica lineal (por ejemplo, "continua") o puede descomponerse en secuencias de aminoácidos no contiguas (por ejemplo, secuencias "conformacionales " o "discontinuas" las cuales pueden formar, por separado o juntas, una forma reconocible) . Una proteína de unión puede reconocer una o más secuencias de aminoácidos; por lo tanto, un epítopo puede definir más de una secuencia de aminoácidos distinta. Los epítopos reconocidos por proteínas de unión se pueden determinar por elaboración de mapas de péptidos y técnicas de análisis de secuencia bien conocidos por los expertos en el ámbito. Un "epítopo críptico" o un "sitio de unión críptico" es un epítopo o sitio de unión de una secuencia proteínica que no este expuesto o que está sustancialmente protegido de reconocimiento dentro de un polipéptido no modificado o un complejo de proteínas o multímero, pero que es capaz de ser reconocido por una proteína de unión al polipéptido proteolizado o un polipéptido disociado que no forma complejos. Las secuencias de aminoácidos que no están expuestas o que únicamente están expuestas parcialmente en la estructura de polipéptido multimérico no modificado son epítopos crípticos potenciales. Si un epítopo no se expone, o se expone solo parcialmente, entonces es probable que esté enterrado dentro del interior del polipéptido u oculto en el complejo polipeptídico de las proteínas de unión u otras proteínas o factores. Los epítopos crípticos candidatos pueden ser identificados, por ejemplo, al examinar la estructura tridimensional de un polipéptido no modificado.
Las "secuencias de control de expresión" son secuencias reguladoras de ácidos nucleicos o aminoácidos correspondientes, tales como promotores, líderes, mej oradores, intrones, motivos de reconocimiento para AR o proteínas de unión de ADN, señales de poliadenilación, terminadores , sitios de entrada de ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés) , señales de secreción, señales de localización subcelular y similares que tienen la capacidad de alterar la transcripción o traducción, o la ubicación subcelular o celular de una secuencia codificante en una célula hospedadora. Las secuencias de control de expresión ejemplares se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif . (1990) .
El término "fluidos corporales extracelulares" se refiere a los fluidos extracelulares del organismo mamífero. Los ejemplos incluyen sangre, ascitis, plasma, linfa, fluido amniótico, orina, saliva y líquido cefalorraquídeo.
El término "heterólogo" se refiere a un ácido nucleico o proteína la cual ha sido introducida en un organismo (tal como una planta, animal o célula procariótica) o una molécula de ácido nucleico (tal como cromosoma, vector o construcción de ácido nucleico) las cuales están derivadas de otra fuente o las cuales provienen de la misma fuente pero se localizan en un contexto diferente (es decir, no nativo) .
El término "homología" se refiere al porcentaje de número de aminoácidos que son idénticos o que constituyen sustituciones conservadoras. La homología se puede determinar utilizando programas de comparación de secuencia tales como GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387- 5 395) , el cual se incorpora en la presente como referencia. De esta manera, secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a las mencionadas en la presente se pueden comparar por inserción de separaciones en la alineación, estas separaciones se pueden determinar, por ejemplo, por el algoritmo de comparación utilizado por GAP.
El término "concentración eficaz semimáxima" o "CE5o" se refiere a la concentración de un agente (por ejemplo, el polipéptido de HRS u otro agente) como se describe en la presente en el cual se induce la mitad de una respuesta entre el valor inicial y un máximo después de cierto tiempo de exposición especificado; la CE50 de una curva dosis-respuesta graduada por lo tanto representa la concentración de un compuesto en el cual se observa 50% de su 20 efecto máximo. La CE50 también representa la concentración en plasma necesaria para obtener 50% de un efecto máximo in vivo. De modo similar, la "CE90" se refiere a la concentración de un agente o composición en el cual se observa 90% de su efecto máximo. La "CE90" se puede calcular a partir de "CE50" ?c- y la pendiente de Hill, o se puede determinar a partir de los datos directamente utilizando conocimiento habitual en el ámbito. En algunas modalidades, la CE50 de un agente bloqueador de anticuerpo es menor de aproximadamente 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 o 500 nM. En algunas modalidades, una composición bioterapéutica tendrá un valor de CE50 de aproximadamente 1 nM o menor.
Una "composición inmunogénica" de la invención, como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier composición que induce una respuesta inmunitaria en un animal, tal como un mamífero. Una "respuesta inmunitaria" es la reacción del cuerpo a sustancias extrañas sin que esto implique una consecuencia fisiológica o patológica de esta reacción, es decir, sin que necesariamente confiera inmunidad protectora en el animal . Una respuesta inmunitaria puede incluir uno o más de lo siguiente: (a) una respuesta inmunitaria mediada por células, la cual involucra la producción de linfocitos por el timo (linfocitos T) en respuesta a la exposición a antígeno; y/o (b) una respuesta inmunitaria humoral, la cual involucra la producción de linfocitos plasmáticos (linfocitos B) en respuesta a una exposición antígeno con producción subsecuente de anticuerpo.
Mediante el término "aislado" se quiere indicar material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por ejemplo, un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, como se utiliza en la presente, incluye el aislamiento y/o purificación in vitro de un péptido o molécula polipeptídica a partir de su ambiente celular natural y a partir de la asociación con otros componentes de la célula; es decir, no se asocia de modo significativo con sustancias in vivo.
El término "modulación" incluye "incremento", "mejoramiento" o "estimulación" así como "disminución" o "reducción" típicamente en una cantidad estadísticamente significativa o fisiológicamente significativa en comparación con un control. Una cantidad "aumentada", "estimulada" o "mejorada" típicamente es una cantidad "estadísticamente significativa" y puede incluir un incremento que es de 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (que incluye todos los enteros y puntos decimales entre los mismos y superiores a 1, por ejemplo, 1.5, 1,6, 1,7, 1.8, etc.), la cantidad producida sin la composición (por ejemplo, en ausencia de cualquiera de los polipéptidos de HRS de la invención) o una composición control, muestra o sujeto de prueba. Una cantidad "disminuida" o "reducida" típicamente es una cantidad "estadísticamente significativa" y puede incluir una disminución de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% en la cantidad producida sin la composición (la ausencia de un agente o compuesto) o una composición control que incluye todos los enteros entre los mismos.
Los términos "unido operablemente", "unido operativamente" o "acoplado operativamente", como se utilizan de manera intercambiable en la presente se refieren a la colocación de dos o más secuencias de nucleótidos o elementos de secuencia de una manera la cual permite que funcionen de la manera propuesta. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención incluye uno o más elementos de ADN capaces de abrir cromatina y/o mantener cromatina en un estado abierto unido operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína recombinante . En otras modalidades, una molécula de ácido nucleico adicionalmente puede incluir una o más secuencias de nucleótidos de ADN o A N que se seleccionan de: (a) una secuencia de nucleótidos capaz de incrementar la traducción; (b) una secuencia de nucleótidos capaz de incrementar la secreción de la proteína recombinante fuera de la célula; (c) una secuencia de nucleótidos capaz de incrementar la estabilidad del ARNm, y (d) una secuencia de nucleótidos capaz de unión a un factor de acción trans para modular la transcripción o traducción, en donde las secuencia de nucleótidos están unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína recombinante . Generalmente, aunque no de modo necesario, las secuencias de nucleótidos que están unidas operablemente son contiguas y, cuando es necesario, en marcos de lectura. No obstante, aunque un elemento de ADN unido operablemente capaz de abrir cromatina y/o mantener cromatina en un estado abierto generalmente se localiza dirección 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína recombinante; no necesariamente está contigua con esta. El enlace operable de diversas secuencias de nucleótidos se lleva a cabo por métodos recombinantes bien conocidos en el ámbito, por ejemplo utilizando metodología de PCR, por ligación en sitios de restricción adecuados o por reasociación. Los enlazantes o adaptadores oligonucleotídicos sintéticos se pueden utilizar de acuerdo con la práctica convencional si no están presentes sitios de restricción adecuados.
La actividad "no canónica", como se utiliza en la presente se refieren de manera general a ya sea: i) una actividad biológica de no aminoacilación nueva presentada por el polipéptido de HRS de la invención que no se encuentra en grado significativo alguno por la proteína de origen de longitud completa nativa intacta, o ii) una actividad que se encuentra en la proteína original de longitud completa nativa intacta, en donde el polipéptido de HRS ya sea que presente cualquiera de: a) una actividad específica significativamente mayor (por ejemplo, por lo menos 20% o mayor) con respecto a la actividad no canónica en comparación con la proteína de origen de longitud completa nativa intacta, o b) que presenta la actividad en un contexto nuevo; por ejemplo mediante aislamiento de la actividad de otras actividades presentadas por proteína original de longitud completa nativa intacta o en el contexto de un ambiente extracelular, en comparación con el compartimiento intracelular citoplásmico clásico.
Un "promotor" es una región reguladora de ADN capaz de unir ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante en la dirección 31. Como se utiliza en la presente, la secuencia promotora está unida en su parte 3 ' terminal por el sitio de inicio de transcripción y se extiende hacia el extremo 51 para incluir un número mínimo de bases o elementos necesarias para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Un sitio de inicio de transcripción (definido convenientemente por elaboración de mapa con nucleasa SI) puede encontrarse dentro de una secuencia promotora, así como dominios de unión de proteína (secuencias de consenso) responsables por la unión de ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos con frecuencia, pero no siempre pueden contener cajas "TATA" y cajas "CAT" . Los promotores procarióticos contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de las secuencias de consenso -10 y -35.
Son bien conocidos en el ámbito una gran cantidad de promotores, que incluyen promotores constitutivos, inducibles y reprimibles, a partir de una variedad de fuentes diferentes. Las fuentes representativas incluyen, por ejemplo, virales y tipos de células de mamífero, insectos, plantas, levaduras y bacterianos) y los promotores adecuados de estas fuentes están disponibles con facilidad o se pueden elaborar de manera sintética en base en secuencias disponibles públicamente en línea o, por ejemplo, de depositarios tales como ATCC así como otras fuentes comerciales o individuales. Los promotores pueden ser unidireccionales (es decir, iniciar la transcripción en una dirección) o bidireccionales (es decir, iniciar la transcripción en cualesquiera de una dirección 3' ó 5'). Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen, por ejemplo, el sistema de expresión bacteriano T7, el sistema de expresión bacteriano pBAD (araA) , el promotor de citomegalovirus (CMV) , el promotor SV40, el promotor RSV. Los promotores inducibles incluyen el sistema Tet (patentes de US 5,464,758 y 5,814,618), el sistema inducible por ecdisona (No et al., Proc . Nati. Acad. Sci. (1996) 93 (8) :3346-3351; el sistema T-REXMR (Invitrogen Carlsbad, CA) , LacSwitchMR (Stratagene, (San Diego, CA) y el sistema de recombinasa inducible por tamoxifeno Cre-ERT (Indra et al. Nuc. Acid. Res. (1999) 27 (22) : 4324-4327; Nuc . Acid. Res. (2000) 28 (23): e99; patente US número 7,112,715; y Kramer y Fussenegger, Methods Mol. Biol . (2005) 308:123-144) o cualquier otro promotor conocido en el ámbito adecuado para la expresión en las células deseadas.
En ciertas modalidades, la "pureza" de un agente dado (por ejemplo, el polipéptido de HRS) en una composición se puede definir específicamente. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden comprender un agente que es por lo menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% puro, que incluye todos los decimales entre los mismos, medido, por ejemplo y sin significar limitación, por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , una forma bien conocida de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos.
Los términos "polipéptidos " y "proteínas" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos de los mismos. Así, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos aminoácidos son aminoácidos que no se encuentran de manera natural, sintéticos, tales como un análogo químico de un aminoácido como se encuentra de manera natural correspondiente así como polímeros de aminoácidos que se encuentran de manera natural .
El término "pronóstico" se utiliza en la presente para referirse a la predicción de la probabilidad de síntomas de enfermedad que incluyen, por ejemplo, recurrencia, recrudecimiento y resistencia a fármacos de una enfermedad. El término "predicción" se utiliza en la presente para referirse a la probabilidad de que un sujeto o paciente responderá favorable o desfavorablemente a un fármaco o conjunto de fármacos, por ejemplo, polipéptidos de HRS u otros agentes. En una modalidad, la predicción se relaciona con el grado de estas respuestas. En una modalidad, la predicción se relaciona así y/o la probabilidad de que un paciente sobreviva o mejore después del tratamiento, por ejemplo el tratamiento con un agente terapéutico particular y por cierto período de tiempo sin recurrencia de la enfermedad. Los métodos de predicción de la invención se pueden utilizar clínicamente para tomar decisiones de tratamiento al seleccionar las modalidades de tratamiento más apropiadas para algún paciente en particular. Los métodos de predicción de la presente invención son herramientas útiles para predecir si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como un régimen terapéutico dado, que incluye, por ejemplo, administración de un atente terapéutico dado o combinación, intervención quirúrgica, tratamiento con esteroides, etc., o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente después de un régimen terapéutico.
Una "subpoblación de pacientes" o, de manera alternativa, una "subpoblación de sujetos" y variaciones gramaticales de estos términos, como se utilizan en la presente, se refiere a un subconjunto de pacientes caracterizados por presentar una o más características mensurables y/o identificables distintivas que distinguen al paciente o al subconjunto de sujetos de otros en una categoría de enfermedad más amplia a la cual pertenece. Las características incluyen subcategorías de enfermedad, género, estilo de vida, antecedentes de salud, órganos/tej idos involucrados, antecedentes de tratamiento, etc. En una modalidad, una subpoblación de pacientes o de sujetos se caracteriza por niveles de autoanticuerpo .
La "respuesta de un paciente" o, de manera alternativa la "respuesta de un sujeto" se puede determinar utilizando cualquier criterio de valoración que indique un beneficio para el paciente que incluye, sin limitación: (1) inhibición, en cierta medida, del progreso de la enfermedad, que incluye frenado y remisión completa; (2) reducción en el número de episodios de enfermedad y/o síntomas; (3) reducción en el tamaño de la lesión; (4) inhibición (es decir, reducción, frenado o detención completa) de infiltración de células y enfermedad en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (5) inhibición (es decir, reducción, frenado o detención completa) de la diseminación de la enfermedad; (6) disminución de la respuesta autoinmune la cual pueda resultar, pero no necesita ser así, en la regresión o supresión de la lesión de enfermedad; (7) alivio, en cierta medida, de uno o más síntomas asociados con el trastorno; (8) incremento en la duración de presentación sin enfermedad después del tratamiento; y/o (9) mortalidad disminuida en un punto de tiempo dado después del tratamiento.
El término "específico" es aplicable a una situación en la cual un miembro de un par de unión específico no mostrará unión significativa alguna a moléculas diferentes de uno o de varios de sus asociados de unión específicos. El término también es aplicable en donde, por ejemplo, un dominio de unión antígeno es específico para un epítopo particular el cual es transportado por un número de antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específico que presenta el dominio de unión a antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que presenten el epítopo.
Mediante el término "estadísticamente significativo" se quiere indicar que el resultado es poco probable que haya sido producido por aleatoriedad. La significancia estadística se puede determinar por cualquier método conocido en el ámbito. Las medidas de significancia utilizadas comúnmente incluyen el valor p, el cual es la frecuencia o probabilidad con la cual un evento observado puede producirse, si la hipótesis nula es cierta.
Si el valor p obtenido es menor que un nivel de significancia, entonces se rechaza la hipótesis nula. En casos sencillos, el nivel de significancia se define en un valor p de 0.05 o menos.
El término "solubilidad" se refiere a la propiedad de un agente bloqueador de anticuerpos que se proporciona en la presente para disolverse en un disolvente líquido y formar una solución homogénea. La solubilidad típicamente se expresa como concentración ya sea en masa de soluto por unidad de volumen de disolvente (g de soluto por kg de disolvente, g por dL (100 mi) , mg/ml, etc.) , molaridad, molalidad, fracción en moles u otras descripciones similares de concentración. La cantidad de equilibrio máximo de soluto que se puede disolver por cantidad de disolvente es la solubilidad de ese soluto en ese disolvente bajo condiciones especificadas que incluyen temperatura, presión, pH y la naturaleza del disolvente. En ciertas modalidades, la solubilidad se mide a pH fisiológico u otro pH, por ejemplo, a pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0 o pH 7.4. En ciertas modalidades, la solubilidad se mide en agua o un amortiguador fisiológico tal como PBS o NaCl (con o sin NaP) . En modalidades específicas, la solubilidad se mide a un pH relativamente más bajo (por ejemplo, pH 6.0) y una concentración de sal relativamente más alta (por ejemplo, NaCl 500 mM o NaP 10 mM) . En ciertas modalidades, la solubilidad se mide en un fluido biológico (disolvente) tal como sangre o suero. En ciertas modalidades, la temperatura puede ser aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25°C) o aproximadamente la temperatura corporal (37°C) . En ciertas modalidades, un polipéptido de HRS tiene una solubilidad de por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mg/ml a temperatura ambiente o a 37 °C.
Un "sujeto", como se utiliza en la presente, incluye cualquier animal que presente un síntoma o que se encuentre en riesgo de presentar un síntoma, el cual puede ser tratado o diagnosticado con un polipéptido de HRS o un agente bloqueador de anticuerpos de la invención. Los sujetos "pacientes" adecuados incluyen animales de laboratorio (tales como ratones, ratas, conejos o cobayos) , animales de granja y animales domésticos o plagas (tales como un gato o un perro) , primates no humanos y, preferiblemente, se incluyen pacientes humanos.
Los términos "sustancialmente" o "esencialmente" significa de manera casi total o completa, por ejemplo, 95% o mayor de cierta cantidad dada.
Una "respuesta terapéutica" se refiere a una mejora de los síntomas (sostenidos o no) en base en la administración de la respuesta terapéutica (si se induce o no tolerancia) .
El término "tolerancia" se refiere a una capacidad de respuesta reducida específica sostenida (por ejemplo, durante un mes o más) del sistema inmunitario a un antígeno (por ejemplo, un autoantígeno) en el ámbito de un sistema inmunitario que de otra manera es sustancialmente normal.
La tolerancia es distinta de la inmunosupresión generalizada en la cual toda, o la totalidad de una clase tal como las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos B de las respuestas inmunes están disminuidas. La "tolerización" se refiere a un proceso que lleva a un estado de tolerancia.
Como se utiliza en la presente, los términos "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéutica", "cantidad profilácticamente eficaz" o "cantidad diagnósticamente eficaz" es la cantidad del fármaco, por ejemplo del polipéptido de HRS o anticuerpo necesario para inducir la respuesta biológica deseada después de la administración. De manera similar, el término "tratamiento con polipéptido de HRS" se refiere a un tratamiento que mantiene la concentración promedio en estado estable de un polipéptido de HRS en el plasma del paciente por encima del nivel terapéutico eficaz mínimo.
Los términos "tratamiento" o "tratar", como se utilizan en la presente incluyen cualquier efecto deseable en los síntomas o patología de una enfermedad o condición y pueden incluir cambios incluso mínimos o mejoras en uno o más marcadores mensurables de la enfermedad o condición que está siendo tratada. El "tratamiento" o "tratar" no necesariamente indica erradicación completa o cura de la enfermedad o condición o los síntomas asociados de la misma. El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto en necesidad del mismo. Los marcadores ejemplares de mejoría clínica serán evidentes para las personas expertas en el ámbito.
El término "vacuna", como se utiliza en la presente, se refiere de manera general a cualquiera de las composiciones que se pueden administrar a un animal para inducir una respuesta inmunitaria protectora a la vacuna o antígeno coadministrado. Los términos "proteger", "protector", "respuesta inmunitaria" o "inmunidad protectora" como se utilizan en la presente describen el desarrollo de anticuerpos o sistemas celulares que reconocen específicamente el antígeno de vacuna.
Los términos "vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" significan el vehículo por el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) en una célula hospedadora de manera que transformen el hospedador y promuevan la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los vectores pueden incluir plásmidos, fagos, virus, etc., y se describen con mayor detalle más adelante.
A menos que se indique en otro sentido, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado al entendido habitualmente por una persona habitualmente experta en el ámbito a la cual pertenece la invención. Aunque los métodos, composiciones, reactivos, células, similares o equivalentes a los que aquí se describen se pueden utilizar en la práctica o la prueba de la invención, los métodos y materiales preferidos son los que aquí se describen. Todas las publicaciones y referencias, que incluyen pero que no se limitan a patentes y solicitudes de patentes mencionados en esta descripción se incorporan en la presente como referencia en su totalidad como si cada publicación individual o referencia fuera indicada específica e individualmente como incorporada como referencia en la presente como se establece de manera completa. Cualquier solicitud de patente a la cual esta solicitud reivindica prioridad también se incorpora como referencia en la presente en su totalidad de la manera descrita en lo anterior para las publicaciones y referencias.
GENERALIDADES La presente invención se relaciona con el desarrollo de composiciones terapéuticas mejoradas, diagnósticos y métodos para tratar enfermedades inflamatorias y autoinmunes, y en algunos aspectos para el tratamiento de miopatías inflamatorias y enfermedades y trastornos relacionados que incluyen enfermedades pulmonares asociadas con el desarrollo de autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa, proteínas relacionadas y otros anticuerpos.
La presente invención también incluye el desarrollo de composiciones terapéuticas mejoradas, diagnósticos y métodos para el tratamiento de enfermedades que tienen un componente inflamatorio secundario, el cual de otra manera exacerba, perpetua o induce progreso de enfermedad y el cual puede ser causado por un defecto genético o daño no relacionado .
En algunos aspectos estos tratamientos proporcionan eficacia mejorada en relación a métodos de tratamiento existentes y presentan un perfil de efecto secundario mejorado de modo significativo.
El término "inflamación" se refiere generalmente a la respuesta biológica de tejidos a estímulos dañinos tales como patógenos, células dañadas (por ejemplo, heridas) e irritantes. El término "respuesta inflamatoria" se refiere a los mecanismos específicos mediante los cuales la inflamación se obtiene y regula que incluyen, simplemente a modo de ilustración activación o migración de células inmunitarias , producción de citocinas, vasodilatación que incluye liberación de cinina, fibrinólisis y coagulación, entre otros descritos en la presente y conocidos en el ámbito.
Los signos clínicos de inflamación crónica dependen de la duración de la enfermedad, las lesiones inflamatorias, las causas y el área anatómica afectada (véase, por ejemplo, Kumar et al., Robbins Basic Pathology-8th Ed., 2009 Elsevier, London; Mi11er, LM. Pathology Lecture Notes. Atlantic Veterinary College, Charlottetown, PEI, Canadá). La inflamación crónica se asocia con una diversidad de condiciones o enfermedades patológicas que incluyen, por ejemplo, autoinmunidad, alergias, enfermedad de Alzheimer, anemia, estenosis de la válvula aórtica, artritis tal como artritis reumatoide y osteoartritis , cáncer, fallo cardíaco congestivo, fibromialgia, fibrosis, ataque cardíaco, fallo renal, lupus, pancreatitis, apoplejía, complicaciones quirúrgicas, enfermedad de pulmón inflamatorio, enfermedad de intestino inflamatorio, aterosclerosis , trastornos neurológicos , diabetes, trastornos metabólicos, obesidad y psoriasis, entre otros descritos en la presente y conocidos en el ámbito. En consecuencia, los polipéptidos de HRS pueden ser utilizados para tratar o administrar inflamación crónica, modular cualquiera de uno o más de las respuestas inflamatorias crónicas individuales o tratar cualquiera de una o más enfermedades o condiciones asociadas con inflamación aguda o crónica.
Los criterios para determinar los signos y síntomas de condiciones inflamatorias y de otro tipo, que se incluyen para propósitos de realización de un diagnóstico diferencial y también para monitorear tratamientos por ejemplo para determinar si una dosis terapéuticamente eficaz ha sido administrada en el curso de tratamiento, por ejemplo al determinar mejoría de acuerdo con los criterios clínicos aceptados, será evidente para aquellos expertos en el ámbito y se ejemplifica por las enseñanzas, por ejemplo, de Berkow et al., eds . , The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics , 10th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y. , (2001); Avery's Drug Treatment : Principies and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD. (1987) ; Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co . , Boston, (1985); Osolci al., eds., Remington's Pharmaceuticals Science, 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); Katzung, Basic and Clinical Pharmacology, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992) .
En consecuencia, algunos aspectos incluyen métodos para reducir inflamación de tejido, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo. En algunas modalidades, el tejido se selecciona de músculo, pulmón y piel.
Ciertos aspectos incluyen métodos para reducir la inflamación muscular o pulmonar asociada con una enfermedad autoinmune que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo .
También se incluyen métodos para tratar una enfermedad asociada con un autoanticuerpo que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, c) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo, o d) un anticuerpo o proteína de unión específica para el autoanticuerpo ; en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo .
Algunos aspectos incluyen métodos para inducir tolerancia a un antígeno para histidil-ARNt sintetasa (HisRS) , el método comprende administrar a un sujeto una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo; en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde la administración de la composición genera tolerización al autoantígeno .
Algunos aspectos incluyen métodos para reducir o eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T involucrados en una respuesta autoinmune a un autoantígeno de histidil ARNt sintetasa (HisRS) , el método comprende administrar a un sujeto una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS; b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo; en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde la administración de la composición genera supresión clonal de linfocitos T auto-reactivos.
También se incluyen métodos para inducir anergia en linfocitos T involucrados en una respuesta autoinmune a un autoantígeno de histidil ARNt sintetasa (HisRS) , el método comprende administrar a un sujeto una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante, en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo; en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde la administración de la composición produce inactivación funcional de los linfocitos T involucrados en la respuesta autoinmune. Algunas de estas modalidades y modalidades relacionadas incluyen métodos para reducir la presencia o niveles de "linfocitos T activados por autoantígeno" de histidil-ARNt sintetasa y/o "linfocitos B activados por autoantígeno" de histidil-ARNt sintetasa.
En algunas modalidades, el sujeto que tiene una enfermedad asociada con un autoanticuerpo tiene una predisposición genética a enfermedades o trastornos autoinmunes . Por ejemplo, en ciertas modalidades, el sujeto presenta un alotipo CPH clase II tal como HLA DR2 , HLA DR3, HLA DR4 , mutaciones en la proteína tirosina fosfatasa, sin receptor tipo 22 (PTPN22) y carencia de regulación de las vías tales como los receptores de reconocimiento de patógenos del sistema inmunitario innato y la familia del supergen de TNF (véase, por ejemplo, Rai y Wakeland, Semin. Immunology. 23:67-83, 2011), cada uno de los cuales se ha correlacionado con ciertos trastornos autoinmunes .
Algunos aspectos incluyen tratamientos de sustitución para tratar una enfermedad asociada con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, c) una célula hospedadora recombinante, en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo, o d) un anticuerpo o proteína de unión específico para el autoanticuerpo; en donde el polipéptido de HRS compensa funcionalmente la insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa.
En algunos tratamientos de sustitución, la insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa es causada por la presencia de anticuerpos anti-Jo-1. En algunos aspectos de este tratamiento de sustitución, la insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa es causada por mutaciones en una histidil-ARNt sintetasa endógena la cual modula la actividad, expresión o distribución celular de la histidil-ARNt sintetasa endógena. En algunos aspectos, la insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa se asocia con el síndrome de Perrault o el síndrome de Usher. En algunos aspectos, la insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa se asocia con producción local y suficiente de histidil-ARNt sintetasa dentro de un tejido o en un sitio de daño o inflamación. En ciertos aspectos, la insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa se asocia con uno o más de rabdomiolisis , caquexia y/o daño muscular.
El término "tolerancia", como se utiliza en la presente, se refiere a la reducción sostenida o ausencia en una respuesta inmunitaria a un antígeno específico en el mamífero, particularmente un humano. La tolerancia es distinta de la inmunosupresión generalizada, en la cual la totalidad de una clase específica de células inmunitarias tales como las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos B de una respuesta inmunitaria están disminuidas o han sido eliminadas. El desarrollo de tolerancia puede monitorearse habitualmente por la ausencia o una disminución en la concentración de anticuerpos a polipéptidos de HRS en el suero de un sujeto hospedador después de administración, en dosis únicas o sucesivas del tratamiento con el polipéptido de HRS. El desarrollo de tolerancia típicamente será suficiente para disminuir los síntomas de la enfermedad autoinmune en el paciente, por ejemplo un paciente puede mejorar lo suficiente de manera que mantenga actividades normales en ausencia, o en presencia de cantidades reducidas de inmunosupresores generales, por ejemplo, corticosteroides .
En cualquiera de estos métodos o composiciones la tolerancia típicamente estará sostenida lo que significa que tendrá una duración de aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente cuatro meses, aproximadamente cinco meses o aproximadamente seis meses o más prolongada. La tolerancia puede resultar en anergia de linfocitos B selectiva o anergia de linfocitos T o ambas.
En cualquiera de estos métodos, tratamientos y composiciones terapéuticas, el término "una enfermedad asociada con autoanticuerpos específicos para histidil-ARNt sintetasa" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno en el cual los anticuerpos a histidil-ARNt sintetasa se detectan, o son detectables sin importar si también se detectan otros autoanticuerpos o que se considere que jueguen un papel en el progreso o la causa de la enfermedad. Los métodos para detectar anticuerpos en muestras de pacientes se pueden realizar por cualquier procedimiento convencional que incluye, por ejemplo mediante RIA, ELISA, por inmunoprecipitación, por tensión de tejidos o células (que incluyen células transíectadas) , microarreglos de antígenos, análisis de espectro de masas, análisis de neutralización específica o uno de numerosos otros métodos conocidos en el ámbito para identificar especificidad de antígeno deseada. En algunos aspectos, la especificidad de anticuerpo se puede caracterizar adicionalmente al determinar la capacidad de los anticuerpos para unirse selectivamente a variantes de empalme diferentes y formas truncadas o proteolíticas de histidil-ARNt sintetasa. Un autoanticuerpo humano relativamente bien conocido para histidil-ARNt sintetasa incluye, por ejemplo, anticuerpos para Jo-1.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende un epítopo para histidil-ARNt sintetasa el cual específicamente produce una reacción cruzada con un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y composiciones que se reivindican, el polipéptido de HRS comprende un epítopo para histidil-ARNt sintetasa el cual genera una reacción cruzada específica con un linfocito T auto-reactivo asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende un epítopo el cual produce una reacción cruzada específica con un autoanticuerpo asociado a enfermedad de ya sea otra ARNt sintetasa o con un autoanticuerpo que es una ARNt sintetasa.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende un epítopo inmunodominante el cual es reconocido específicamente por la mayor parte de los anticuerpos a partir de los sueros de un paciente con una enfermedad asociada con autoanticuerpos a histidil-ARNt sintetasa. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende un epítopo inmunodominante el cual es reconocido específicamente por la mayor parte de los linfocitos T auto- eactivos a partir de los sueros de un paciente con una enfermedad asociada con autoanticuerpos a histidil-ARNt sintetasa.
En algunas modalidades, el epítopo está constituido dentro del dominio WHEP del polipéptido de HRS (aproximadamente aminoácidos 1-43 de la SEC ID NO: 1) ; el dominio de aminoacilación (aproximadamente aminoácidos 54-398 de la SEC ID NO: 1) ; o el dominio de unión anticodón (aproximadamente aminoácidos 406-501 de la SEC ID NO: 1) o cualquier combinación de los mismos.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS no comprende un epítopo el cual produzca una reacción cruzada específica con un autoanticuerpo asociado a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por la unión a autoanticuerpo asociado a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 1 x 10"7M. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por la unión de un autoanticuerpo asociado a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 5 x 10"7M. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS no compite significativamente por la unión a autoanticuerpo asociado a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 1 x 10"6M.
En consecuencia, en algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una afinidad menor por un autoanticuerpo asociado a enfermedad en comparación con la histidil-ARNt sintetasa natural (SEC ID NO: 1) medida en una prueba de ELISA competitiva. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una afinidad aparente por el autoanticuerpo asociado a enfermedad la cual es por lo menos aproximadamente 10 veces menor, o por lo menos aproximadamente 20 veces menor, o por lo menos aproximadamente 50 veces menor o por lo menos aproximadamente 100 veces menor que la afinidad del autoanticuerpo asociado a enfermedad a la forma humana natural (SEC ID NO: 1) . En algunos aspectos, el autoanticuerpo par histidil-ARNt sintetasa se dirige al antígeno Jo-1.
Los ejemplos de enfermedades asociadas con autoanticuerpos específicos para histidil-ARNt sintetasa (así como enfermedades asociadas con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa) incluyen, sin limitación, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y miopatías inflamatorias que incluye miopatías inflamatoria, polimiositis , miopatía inducidas por estatina, dermatomiositis , enfermedad de pulmón intersticial (u otras condiciones fibróticas pulmonares) y trastornos relacionados tales como superposición de polimiositis-escleroderma y miositis de cuerpos de inclusión (IBM) y condiciones tales como las que se encuentran en síndromes anti -sintetasa que incluyen, por ejemplo, enfermedad de pulmón intersticial, artritis, dismotilidad esofágica, enfermedad cardiovascular y otras manifestaciones vasculares tales como fenómeno de Reynaud; otros ejemplos de enfermedades asociadas con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa incluyen trastornos genéticos que resultan en una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa activa que incluyen síndrome de Usher y síndrome de Perrault . Los ejemplos adicionales de enfermedades de insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa incluyen enfermedades inflamatorias y trastornos asociados con producción local insuficiente de histidil-ARNt sintetasa dentro de un tejido o en el sitio de daño o inflamación. En algunos aspectos, la insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa se asocia con uno o más de rabdomiolisis , caquexia y/o daño muscular.
En ciertas modalidades, mediante bloqueo de unión, acción o producción de anticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa, las composiciones y métodos descritos en la presente tienen utilidad para tratar una amplia gama de enfermedades y trastornos autoinmunes e inflamatorios asociados con anticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa, otros autoanticuerpos así como enfermedades asociadas con insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa.
Adicionalmente , la administración de polipéptido de HRS de la invención, por restauración de la concentración de histidil -AR t sintetasa (en ausencia de anticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa) pueden modular las respuestas inflamatorias locales las cuales son eficaces tanto en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades y trastornos inflamatorios así como enfermedades en inflamación que son secundarios a la enfermedad primaria, como en el caso, por ejemplo, de distrofias musculares.
Ciertas modalidades incluyen métodos para tratar una miositis que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterologo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo. En algunas modalidades, la miositis es polimiositis . En algunas modalidades la miositis es dermatomiositis .
Algunas modalidades incluyen métodos de tratamiento de miositis de cuerpos de inclusión (IBM) que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterologo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo.
También se incluyen métodos para tratar miositis juvenil que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS , ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterologo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo .
Ciertas modalidades incluyen métodos para tratar una miopatía inducida por estatina que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterologo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo. En algunas modalidades, la estatina es cerivastatina .
Algunas modalidades incluyen métodos de tratamiento de una enfermedad pulmonar intersticial (ILD) que comprenden administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterologo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo.
Ciertas modalidades incluyen métodos para tratar síndrome de Usher que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o iii) una célula hospedadora recombinante, en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo. Ciertas modalidades incluyen métodos para tratar síndrome de Usher tipo 1. Algunas modalidades incluyen métodos de tratamiento de síndrome de Usher tipo 2. Ciertas modalidades incluyen métodos de tratamiento de síndrome de Usher tipo 3.
Algunas modalidades incluyen métodos para tratar síndrome de Perrault (PS) que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo.
También se incluyen métodos para tratamiento de una distrofia muscular que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo. En algunos aspectos, la distrofia muscular se selecciona de distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de anillo óseo, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia miotónica, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular distal y distrofia muscular congénita.
También se incluyen métodos para tratar caquexia que comprenden administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo.
También se incluyen métodos para tratar rabdomiolisis que comprenden administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: i) un polipéptido de HRS, ii) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o iii) una célula hospedadora recombinante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo.
Ciertos trastornos inflamatorios o autoinmunes ejemplares se describen con mayor detalle en lo siguiente.
La polimiositis afecta músculos esqueléticos (involucrados con la realización de movimiento) en ambos lados del cuerpo. Rara vez se observa en personas menores de 18 años; en la mayor parte de los casos son personas con edades entre 31 y 60 años. Además de los síntomas enumerados en lo anterior, la debilidad muscular progresiva genera dificultades para deglutir, hablar, levantarse de posición sedente, subir escaleras, levantar objetos o alcanzar cosas por encima de la cabeza. Las personas con polimiositis también experimentan artritis, respiración entrecortada y 0 arritmias cardíacas .
La dermatomiositis se caracteriza por erupciones cutáneas que preceden o que acompañan debilidad muscular progresiva. Las erupciones tienen una apariencia de parches, con cambios de color púrpura o rojo y se desarrollan de 5 manera característica en los párpados y en los músculos utilizados para extender o enderezar articulaciones, que incluyen nudillos, codos, rodillas y tobillos. Las erupciones rojas también se pueden presentar en la cara, cuello, Q hombros, parte superior del tórax, espalda y otros lugares y pueden presentar hinchazón en las áreas afectadas. Las erupciones algunas veces se producen sin relación muscular obvia. Los adultos con dermatomiositis pueden experimentar pérdida de peso o una fiebre de grado bajo, e presentar tumores inflamados y ser sensibles a la luz.
La dermatomiositis adulta, a diferencia de la polimiositis puede acompañar tumores de mama, pulmón, genitales femeninos o intestino. Los niños y adultos con dermatomiositis pueden desarrollar depósitos de calcio que aparecen como hinchazones duras bajo la piel o en el músculo (denominadas calcinosis) . La calcinosis más frecuentemente se produce 1 a 3 años después del inicio de la enfermedad pero puede presentarse muchos años después. Estos depósitos se observan con mayor frecuencia en dermatomiositis en la infancia que en la dermatomiositis que comienza en adultos. La dermatomiositis se puede asociar con enfermedades colágeno-vasculares o autoinmunes .
En algunos casos de polimiositis y dermatomiositis, se pueden ver afectados los músculos distales (alejados del tronco del cuerpo) , tales como en los antebrazos o alrededor de los nudillos y puños) conforme progresa la enfermedad. La polimiositis y dermatomiositis se pueden asociar con enfermedades colágeno-vasculares o autoinmunes.
La polimiositis también se puede asociar con trastornos infecciosos .
La miositis de cuerpos de inclusión (IBM) está caracterizada por debilidad muscular progresiva y agotamiento. El inicio de la debilidad muscular generalmente es gradual (durante meses o años) y afecta a los músculos proximales y distales. La debilidad muscular puede afectar solo un lado del cuerpo. Orificios pequeños denominados vacuolas algunas veces se observan en las células de fibras de músculo afectadas. Las caídas y tropiezos son habitualmente los primeros síntomas perceptibles de IBM. Para algunos individuos el trastorno comienza con debilidad en los puños y los dedos que provoca dificultad para pellizcar, abotonarse y sujetar objetos. Puede existir debilidad de los puños y los músculos de los dedos y atrofia (adelgazamiento o pérdida del volumen muscular) de los músculos del antebrazo y músculos cuadríceps en las piernas. La dificultad para deglutir se presenta en aproximadamente la mitad de los casos con IBM. Los síntomas de la enfermedad habitualmente comienzan después de la edad de 50 años, aunque la enfermedad puede presentarse antes. A diferencia de la polimiositis y la dermatomiositis , la IBM se presenta con mayor frecuencia en hombres que en mujeres.
La miositis juvenil tiene ciertas similitudes con la dermatomiositis adulta y la polimiositis. Habitualmente afecta a niños en edades de 12 a 15 años, con síntomas que incluyen debilidad de músculo proximal e inflamación, edema (recolección anormal de fluidos dentro de los tejidos corporales que provoca hinchazón) , dolor muscular, fatiga, erupciones cutáneas, dolor abdominal, fiebre y contracturas (acortamiento crónico de los músculos o tendones alrededor de las articulaciones, causado por inflamación de los tendones musculares que evita que las articulaciones se muevan libremente) . Los niños con miositis juvenil también presentan dificultad para deglutir y respirar y el corazón puede verse afectado. Aproximadamente 20 a 30% de los niños con dermatomiositis juvenil desarrolla calcinosis. Los niños afectados pueden no mostrar niveles mayores de los normales de la enzima muscular creatina cinasa en su sangre pero presentan niveles mayores de los normales de otras enzimas musculares .
Las miopatías inducidas por estatina se asocian con el uso a largo plazo de estatinas las cuales actúan vía inhibición de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGCR) . Generalmente bien tolerado, estas medicaciones se han descrito como inductores de miotoxicidad. Más recientemente ha habido reportes de pacientes en quienes las miopatías de estatina perduran incluso después de suspender el fármaco lo cual permite establecer la hipótesis de que presentan una causa autoinmune. Los beneficios de las estatinas están sin disputa para reducir el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria y el progreso de aterosclerosis coronaria. No obstante, las complicaciones asociadas pueden poner en peligro la vida. Más de 38 millones de personas en los Estados Unidos actualmente se calcula que están ingiriendo estatinas y hasta 7% (>2.6 millones) de estas personas se predice que desarrollarán síntomas en músculos con hasta 0.5% (>190,000) de estos quienes potencialmente avanzarán para desarrollar miopatías que pongan en peligro la vida .
Todas las estatinas pueden generar problemas musculares y el riesgo aumenta junto con incrementos en su 5 lipofilicidad, potencia para disminuir colesterol y dosificación. La cerivastatina en particular se ha implicado que presenta un riesgo mayor y se ha retirado del mercado en los Estados Unidos. De las estatinas remanentes, la ^o atorvastatina y la simvastatina tienen mayores tasas de miotoxicidad . Otros agentes que disminuyen lípidos diferentes de estatinas tales como niacina y fibratos también presentan riesgos de problemas musculares, particularmente cuando se combinan con estatinas. Aunque no es posible predecir que pacientes tendrán problemas musculares inducidos por L5 estatina, antes de que los problemas de músculo se vuelvan un factor de riesgo deben ser considerados cuando se inicia el tratamiento con estatinas. Antecedentes familiares de miopatía son relevantes y un paciente puede ser el portador 20 de una miopatía genética debido a que puede desenmascarar las tensiones agregadas del tratamiento con estatina. Otros factores de riesgo pueden incluir edad mayor de 80 años, peso corporal bajo, sexo femenino, hipotiroidismo, ciertos defectos genéticos y descendencia de asiáticos así como uso concomitante de ciertos medicamentos que incluyen bloqueadores de canal de calcio, antibióticos macrólidos, omeprazol, amiodarona, antimicóticos de azol, antagonistas de receptor H2 de histamina, nefasodona, ciclosporina, inhibidores de proteasa de VIH, warfarina y jugo de toronja.
Los síntomas musculares más comunes causados por las estatinas es dolor muscular o mialgia y se produce en aproximadamente 7% de los usuarios de estatina. La mialgia se puede presentar en cualquier parte desde ligera a grave y con frecuencia empeora por actividad muscular. Si el síntoma es tolerable y la indicación de estatina permanece fuerte, por ejemplo en un paciente con hipercolesterolemia y con infarto al miocardio reciente, puede ser apropiado el tratamiento continuo con estatina.
Los niveles de creatina cinasa (CK) de valores iniciales no se recomiendan uniformemente antes del inicio del tratamiento con estatinas por las organizaciones que guían el tratamiento con estatinas pero los niveles de CK pueden proporcionar información muy útil si se van a desarrollar posteriormente síntomas musculares. La debilidad muscular también se puede presentar y con frecuencia es fatigable en calidad y combinado con dolor y CK elevados. Al igual que la mayor parte de las miopatías, la debilidad es más pronunciada proximalmente . Episodios raros de rabdomiolisis también se han producido con el tratamiento con estatinas; este es mucho menos frecuente pero posiblemente puede ser mortal . Los cambios que se pueden observar en la histología de músculo que son más típicos de una miopatía de estatinas son fibras negativas a citocromo oxidasa, contenido aumentado de lípidos y fibras rojas rasgadas. La miopatía necrotizante autoinmune es una forma rara de miopatía por estatinas. En estos pacientes, la suspensión del fármaco de estatina no se traduce en recuperación incluso después de varios meses de suspender el medicamento. Los pacientes tienen una debilidad predominante proximal, con frecuencia sin dolor.
El diagnóstico se basa en los antecedentes médicos del individuo, que resulta de un examen físico y pruebas de resistencia muscular y muestras de sangre que muestran niveles elevados de diversas enzimas musculares y autoanticuerpos . Las herramientas de diagnóstico incluyen electromiografía para registrar la actividad eléctrica que controla los músculos durante la contracción y en reposo, ultrasonido para la búsqueda de inflamación de músculos y generación de imágenes por resonancia magnética para mostrar músculos anormales y evaluar enfermedad muscular. Una biopsia de músculo se puede examinar por microscopía en búsqueda de signos de inflamación crónica, muerte de fibras musculares, deformidades vasculares o cambios específicos del diagnóstico de IBM. Una biopsia de piel también puede mostrar cambios en la capa de la piel en pacientes con dermatomiositis .
La enfermedad de pulmón intersticial (ILD) es una categoría amplia de enfermedades de pulmón que incluye más de 130 trastornos caracterizados por cicatrización (es decir, "fibrosis" ) y/o inflamación de los pulmones. ILD constituye 15% de los casos observados por los especialistas en pulmones. La enfermedad de pulmón intersticial (ILD) se puede desarrollar a partir de diversas fuentes, que varían desde otras enfermedades hasta factores ambientales. Algunas de las causas conocidas de ILD incluyen: enfermedad de tejido conectivo o autoinmune que incluye, por ejemplo, escleroderma/esclerosis sistémica progresiva, lupus (lupus eritematoso sistémico) , artritis reumatoide y polimiositis/dermatomiositis ; exposiciones ocupaciones y ambientales que incluyen, por ejemplo, exposición a polvo y ciertos gases, venenos, quimioterapia y radioterapia.
En ILD, el tejido en los pulmones se inflama y/o cicatriza. El intersticio del pulmón incluye el área en y alrededor de los vasos sanguíneos pequeños y alvéolos (sacos de aire) en donde se lleva a cabo el cambio de oxígeno y dióxido de carbono. La inflamación y cicatrización del intersticio interrumpe este tejido y genera una disminución en la capacidad de los pulmones para extraer oxígeno del aire .
El progreso de ILD varía de una enfermedad a otra y de una persona a otra. Debido a que la enfermedad de pulmón intersticial interrumpe la transferencia de oxígeno y dióxido de carbono en los pulmones, sus síntomas habitualmente se manifiestan como problemas con la respiración. Los dos síntomas más comunes de ILD es respiración entrecortada con ejercicio y tos no productiva.
El síndrome de Usher es la condición más común que afecta al oído y la visión. Los síntomas mayores del síndrome de Usher son pérdida del oído y retinitis pigmentosa (RP) . RP provoca ceguera nocturna y pérdida de la visión periférica (visión lateral) a través de la degeneración progresiva de la retina. Conforme progresa la RP, el campo de visión se estrecha únicamente solo permanece la visión central. Muchas personas con síndrome de Usher también tienen problemas graves de equilibrio. Aproximadamente 3 a 6 por ciento de todos los niños quienes son sordos y otro 3 a 6 por ciento de niños quienes tienen oído duro presentan síndrome de Usher. En países desarrollados tal como Estados Unidos, aproximadamente cuatro bebés de cada 100,000 nacimientos presentan síndrome de Usher. El síndrome de Usher es heredado como un rasgo recesivo autosónico. Se han asociado diversos loci genéticos con el síndrome de Usher que incluyen histidil-ARNt sintetasa (Puffenberger et al., (2012) PLoS ONE 7 (l)e28936doi:10.1371/journal. one.0028936) .
Existen tres tipos clínicos de síndrome de Usher, tipo 1, tipo 2 y tipo 3. En los Estados Unidos, los tipos más comunes son tipo 1 y 2. Juntos, constituyen aproximadamente 90 a 95 por ciento de todos los casos de niños quienes tienen síndrome de Usher.
Los niños con síndrome de Usher tipo 1 son prof ndamente sordos al nacer y presentan problemas graves de equilibrio. Debido a los problemas de equilibrio asociados con el síndrome de Usher tipo 1, los niños con este trastorno son lentos para sentarse sin soporte y típicamente no caminan independientemente antes de que tengan 18 meses de edad. Estos niños habitualmente comienzan a desarrollar problema de visión en una época temprana en la infancia, casi siempre al momento de alcanzar la edad de 10 años. Los problemas de visión con mayor frecuencia son benignos con dificultad en observar en la noche pero tienden a progresar rápidamente hasta que la persona es completamente ciega.
Los niños con síndrome de Usher tipo 2 crecen con pérdida de oído moderada a grave y equilibrio normal. Aunque la gravedad de pérdida de oído varía, la mayor parte de estos niños se pueden beneficiar de auxiliares para oír y pueden comunicarse verbalmente. Los problemas de visión en el síndrome de Usher tipo 2 tienden a progresar más lentamente que en el tipo 1, con acceso de RP con frecuencia no es aparente hasta que son adolescentes.
Los niños con síndrome de Usher tipo 3 presentan audición normal al nacer. Aunque la mayor parte de los niños con el trastorno presentan un equilibrio casi normal, algunos pueden desarrollar problemas de equilibrio posteriormente. La audición y la visión empeoran con el tiempo pero la velocidad a la cual declinan puede variar de una persona a otra, incluso dentro de la misma familia. Una persona con síndrome de Usher tipo 3 puede desarrollar pérdida de oído en la adolescencia y la persona habitualmente requiere auxiliares para oír en la época adulta media a tardía. La ceguera nocturna habitualmente comienza en algún momento durante la pubertad. Aparecen puntos ciegos en el final de la adolescencia hasta la adultez temprana y en la parte media de la vida adulta la persona es habitualmente legalmente ciega.
El síndrome de Perrault (PS) se caracteriza por la asociación de disgénesis de ovario en hembras con deterioro sensorineural del oído y en algunos sujetos anomalías neurológicas que incluyen ataxia cerebelar progresiva y déficit intelectual. La prevalencia exacta del síndrome de Perrault no se conoce y probablemente ha sido mal diagnosticado, particularmente en hombres en donde el hipogonadismo no es una característica y el síndrome permanece sin detectarse. La media de edad en el diagnóstico es de 22 años después de la presentación con pubertad retrasada en mujeres con sordera sensorineural. Los defectos en la adición se observan en la totalidad excepto uno de los casos reportados (media de edad en el diagnóstico de 8 años) . La pérdida del oído es siempre sensorineural y bilateral pero su gravedad es variable (ligera a profunda) incluso en pacientes afectados de la misma familia. La disgénesis de ovarios se ha reportado en todos los casos femeninos pero no se han detectado defectos en las gónadas en hombres. La amenorrea es generalmente primaria pero también se ha reportado amenorrea secundaria. Un crecimiento retardado (altura inferior al tercer percentil) se ha reportado en la mitad de los casos documentados. La frecuencia exacta de anomalías neurológicas se desconoce pero nueve mujeres y dos hombres (de 16 a 37 años de edad) que carecen de anormalidades neurológicas han sido reportados. Los signos neurológicos son progresivos y generalmente aparecen posteriormente en la vida, retraso para caminar o caídas frecuentes tempranas se han observado en pacientes jóvenes con PS. Los signos neurológicos comunes son ataxia, dispraxia, movimientos extraoculares limitados y polineuropatía . También se han reportado algunos casos con escoliosis. La transmisión de PS es recesiva autosómica y las mutaciones en histidil-ARNt sintetasa mitocondrial recientemente se han identificado como la causa de disginésis ovárica y pérdida del oído sensorineural asociada con el síndrome de Perrault (Pierce et al. (2011) PNAS USA. 108 (16) 6543-6548) .
La distrofia muscular se refiere a un grupo de trastornos heredados en los cuales la fuerza y el volumen muscular declinan gradualmente. La totalidad de las distrofias musculares están marcadas por debilidad muscular que es generada por un defecto genético primario en una o más genes específicos de músculo. Adicionalmente, las distrofias musculares típicamente tienen un componente inflamatorio variable que genera inflamación muscular y que finalmente incrementa la degeneración de los tejidos musculares. Se han reconocido generalmente por lo menos nueve tipos de distrofias musculares.
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) : La DMD afecta a niños jóvenes lo que provoca debilidad muscular progresiva, que habitualmente comienza en las piernas. Es la forma más grave de distrofia muscular. DMD se presenta en aproximadamente 1 de 3500 nacimientos de hombres y afecta a aproximadamente 8000 niños y hombres jóvenes en los Estados Unidos. Una forma más ligera se presenta en algunas portadoras del género femenino.
La DMD es causada por mutaciones en el gen que codifica para distrofina, una proteína subsarcolema que funciona dentro del complejo de glucoproteína asociado a distrofina (DGC, por sus siglas en inglés) lo cual evita la producción de la proteína funcional . La cantidad de distrofina se correlaciona con la gravedad de la enfermedad (es decir, cuanto menos distrofina está presente, más grave es el fenotipo) . El complejo DGC conecta el citoesqueleto intracelular con la matriz extracelular . El DGC se concentra en las líneas Z del sarcómero y confiere la transmisión de fuerza a través de la fibra de músculo. La ruptura de este enlace resulta en inestabilidad de membrana lo que a la postre genera rupturas del sarcolema. La entrada de calcio extracelular altera los procesos moleculares como contracción muscular y activa la actividad proteolítica . Las fibras de músculo afectada se vuelven necróticas o apoptósicas y liberan quimioatrayentes mitogénicos los cuales inician los procesos inflamatorios. Los ciclos de degeneración y regeneración a la postre generan deterioro irreversible del músculo y sustitución por tejido fibrótico y adiposo.
Un niño con distrofia muscular de Duchenne habitualmente comienza a mostrar síntomas a nivel preescolar. Las piernas se afectan primero, volviendo difícil caminar y provocando problemas de equilibrio. La mayor parte de los pacientes caminan tres a seis meses después que lo esperado y presentan dificultades para correr. Las contracciones (apretamiento muscular permanente) habitualmente comienza a la edad de cinco o seis años, de manera más grave en los músculos de la pantorrilla. Las caídas frecuentes y huesos rotos son comunes al inicio de esta etapa. El subir escaleras y ascender sin ayuda se vuelve imposible a la edad de nueve o diez y la mayor parte de los niños utilizan sillas de ruedas para movilidad a la edad de 12 años. El debilitamiento de los músculos del tronco alrededor de esta edad con frecuencia genera escoliosis (una curvatura de la columna lado a lado) y cifosis (una curvatura de la parte frontal a la trasera) .
Una de las debilidades más graves de DMD es la debilidad del diafragma, la lámina de los músculos en la 5 parte superior del abdomen que realizan la función principal de respirar y toser. La debilidad del diafragma lleva a energía y fuerzas reducidas e infección pulmonar aumentada debido a la incapacidad para toser eficazmente. Las personas jóvenes con DMD pueden vivir hasta la segunda década y sobrepasarla con la condición de que tengan asistencia de ventilación mecánica y buena higiene respiratoria.
En algunas modalidades, un sujeto que presenta DMD está caracterizado por uno o más de lo siguiente: un signo de L5 Go er positivo, deterioro en reflejos de los músculos de las extremidades inferiores; niveles altos de creatina cinasa (CPK-MM) en la sangre; errores genéticos en el gen Xp21; o niveles reducidos o de ausencia de distrofina, por ejemplo, medida por biopsia muscular.
Se pueden utilizar las composiciones de HRS en el tratamiento de DMD, ya sean solas o en combinación con otros tratamientos tales como oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, tratamiento de salto de exones tales como Eteplirsen) , cortocosteroides, beta-2-agonistas, tratamiento físico, soporte ?? respiratorio, tratamientos con blastocitos y tratamientos de sustitución de genes. En algunas modalidades, la administración de los polipéptidos de HRS genera mejorías estadísticamente significativas en la prueba de caminar de 6 minutos .
Distrofia muscular de Becker (BMD) : La BMD afecta a niños más grandes y hombres jóvenes, seguido por un curso más ligero que DMD. BMD se presenta en aproximadamente 1 en 30,000 nacimientos masculinos. La distrofia muscular de Becker es una variante menos grave de la distrofia muscular de Duchenne y es causada por la producción de una forma de distrofina truncada pero parcialmente funcional.
Los síntomas de BMD habitualmente aparecen en la parte final de la infancia y en la parte inicial de la etapa adulta. Aunque el progreso de los síntomas puede ser paralelo al de DMD, los síntomas habitualmente son más ligeros y el curso es más variable. Puede producirse escoliosis, pero habitualmente es más ligera y progresa con mayor lentitud. La enfermedad muscular cardiaca (cardiomiopatía) se produce más comúnmente en BMD. Los problemas pueden incluir latidos cardiacos irregulares (arritmia) y fallo cardíaco congestivo. Los síntomas pueden incluir fatiga, respiración entrecortada, dolor en el pecho y mareos. También se presenta debilidad respiratoria y puede llevar a la necesidad de ventilación mecánica.
Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD) : La EDMD afecta a niños jóvenes, lo que provoca contracturas y debilitamiento en las pantorrillas , debilitamiento en los hombros y brazos superiores y problemas en la manera en que los impulsos eléctricos se desplazan a través del corazón para generar un latido (defectuosa en la condición del corazón) . Existen tres subtipos de distrofia muscular de Emery-Dreifuss , diferenciables por su patrón de herencia: dominante unido a X, dominante autosómico y recesivo autosómico. La forma unida a X es la más común. Cada tipo varía en prevalencia y síntomas. La enfermedad es causada por mutaciones en el gen LM A, o, de manera más común, el gen EMD . Ambos genes codifican para componentes de proteína de la envoltura nuclear.
La EDMD habitualmente comienza en una etapa temprana en la infancia, con frecuencia con contracciones que preceden debilitamiento muscular. Los debilitamientos afectan los hombres y el brazo superior originalmente, a lo largo de los músculos de la pantorrilla lo que genera caídas al caminar. La mayor parte de los hombres con EDMD sobreviven a la edad media, aunque el defecto en el ritmo del corazón (bloqueo cardíaco) puede ser mortal si no se trata con un marcapasos .
Distrofia muscular de anillo óseo (LGMD) : La LGMD comienza en la parte final de la infancia y la parte inicial de la etapa adulta y afecta a hombres y mujeres, provocando debilidad en los músculos alrededor de las caderas y los hombros. Es la más variable de las distrofias musculares y existen diferentes formas diversas de la enfermedad reconocidas actualmente. Muchas personas que se sospecha que presentan LGMD probablemente hayan sido mal diagnosticadas en el pasado y por lo tanto la prevalencia de la enfermedad es difícil de calcular. El número de personas afectadas en los 5 Estados Unidos puede estar en pocos miles.
Aunque existen por lo menos media docena de genes que provocan los diversos tipos de LGMD, las dos formas clínicas principales de LGMD se reconocen habitualmente . Una forma infantil grave es de apariencia similar a DMD pero es LO heredada como un rasgo recesivo autosómico.
La distrofia muscular de anillo óseo tipo 2B (LGMD2B) es causada por la pérdida de las mutaciones funcionales en el gen para disferlina. La disferlina se expresa principalmente en músculo esquelético y cardíaco pero L 5 también en monocitos, macrófagos y otros tejidos en donde se localiza en las vesículas citoplásmicas y en la membrana celular. La disferlina parece estar involucrada en la fusión y tráfico en membrana así como en procesos de reparación. 2Q LGMD2B es una enfermedad muscular de inicio tardío (adolescentes/adultos jóvenes) que está caracterizada por debilidad muscular simétrica progresiva y una patología inmunitaria/inflamatoria notablemente agresiva. Las biopsias de músculo típicamente muestran infiltración de células inflamatorias notable que consiste principalmente de macrófagos/marcadores de activación de macrófagos (HLA-DR, HLA-ABC, CD86), linfocitos T citotóxicos CD8+ y linfocitos T CD4+ junto con degeneración/regenación de fibra muscular.
Los síntomas del inicio adulto de LGMD habitualmente aparecen en la adolescencia o en la segunda 5 década de vida de las personas y está marcado por debilidad progresiva y agotamiento de los músculos más cercanos al tronco. Se pueden presentar contracciones y la capacidad de caminar habitualmente se pierde aproximadamente a los 20 años ^ después del inicio. Algunas personas con LGMD desarrollan debilidad respiratoria que requiere el uso de respiración asistida. El alcance de vida puede estar acortado en cierta medida (las formas dominantes autosómicas habitualmente se presentan posteriormente en la vida y progresan de manera relativamente lenta) .
L5 Distrofia muscular facioescapulohumeral (FSH) : La FSH, también conocida como enfermedad de Landouzy-Dej erine comienza en la etapa final de la infancia y al inicio de la etapa adulta y afecta a hombres y mujeres, provocando 3Q debilidad en los músculos de la cara, hombros y brazos superiores. Las caderas y piernas también pueden estar afectadas .
FSH se presenta en aproximadamente 1 de cada 20,000 personas y afecta aproximadamente a 13,000 personas en los Estados Unidos. FSH varía en su gravedad y edad de inicio, incluso entre miembros de la misma familia. Los síntomas más comúnmente benignos en la adolescencia o al inicio de la segunda década de vida, aunque el inicio en lactantes o niños es posible. Los síntomas tienden a ser más graves en aquellos con un inicio más temprano. La enfermedad se denomina por las regiones del cuerpo afectadas más gravemente por la enfermedad: músculos de la cara (fació-), hombros (escapulo-) y brazos superiores (humeral) . Las caderas y las piernas pueden estar también afectadas . Los niños con FSH con frecuencia desarrollan sordera parcial o completa.
Se necesitan dos defectos para FSHD, el primero es la supresión de las secuencias repetidas D4Z4 y el segundo es una "ganancia tóxica de función" del gen DUX4. El primer síntoma perceptivo con frecuencia es dificultad para levantar objetos por encima de los hombros. La debilidad puede ser mayor en un lado que en otro. La debilidad en los hombros también provoca que las paletas de los hombros se hagan hacia atrás, lo que se denomina aleteo escapular.
Distrofia miotónica: La distrofia miotónica también conocida como enfermedad de Steiner afecta a hombres y mujeres lo que provoca debilidad generalizada que se observa primero en la cara, pies y manos. Es acompañada por la incapacidad para relajar los músculos afectados (miotonia) . Los síntomas pueden comenzar desde el nacimiento hasta la edad adulta. La distrofia muscular miotónica tipo 1 (DM1) es la forma más común de distrofia muscular, afectando a más de 30,000 personas en los Estados Unidos. Resulta de la expansión de una secuencia repetida corta (CTG) en la secuencia de ADN del gen DMPK (proteína cinasa de distrofia miotónica) . La distrofia muscular miotónica tipo 2 (DM2) es mucho más rara y es un resultado de la expansión de la secuencia repetida CCTG en el gen ZNF9 (proteína de dedos de zinc 9) .
Los síntomas de distrofia miotónica incluyen debilidad facial y mandíbula floja, párpados caídos (ptosis) y agotamiento muscular en los antebrazos y pantorrillas . Una persona con esta distrofia presenta dificultad para relajar su mano, especialmente si el objeto está frío. La distrofia miotónica afecta al músculo cardíaco provocando arritmia y bloqueo cardíaco y los músculos del sistema digestivo lo que genera trastornos de motilidad y estreñimiento. Otros sistemas corporales también son afectados. La distrofina miotónica puede producir cataratas, degeneración retinal, coeficiente intelectual bajo, calvicie frontal, trastornos en la piel, atrofia testicular, apnea del sueño y resistencia a insulina. Es común una necesidad aumentada o un deseo por dormir, como una motivación disminuida. La inhabilitación grave afecta a la mayor parte de las personas con este tipo de distrofia en los primeros 20 años a partir del inicio, aunque la mayor parte no requiere una silla de ruedas incluso en la parte final de su vida. Las composiciones de HRS se pueden utilizar para tratar distrofia miotónica, por ejemplo, al reducir la inflamación asociada con tejido muscular, que incluye músculo esquelético (por ejemplo, músculos de cuadríceps) y/o tejido cardíaco, entre otros tejidos. 5 Distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) : La OPMD afecta a adultos de ambos sexos lo que provoca debilidad en los músculos de los ojos y la garganta. Es más común entre familias Franco Canadienses en Québec y en familias Americanas de ascendencia latina en el Suroeste de los 10 Estados Unidos .
OPMD habitualmente comienza en la tercera o cuarta década de vida de las personas con debilitamiento en los músculos que controlan los ojos y la garganta. Los síntomas ^ incluyen párpado caído, dificultad para deglutir (disfagia) y debilitamiento que progresa a otros músculos de la cara, cuello y ocasionalmente las extremidades superiores. La dificultad para deglutir puede provocar aspiración de alimentos o la introducción de alimentos o saliva a las vías 2Q respiratorias. Puede estar seguida de neumonía.
Distrofia muscular distal (DD) : La DD comienza en una edad media o posterior provocando debilidad en los músculos de los pies y de las manos. Es más común en Suecia y es rara en otras partes del mundo. DD habitualmente comienza ~q en la segunda o tercera década de vida, con debilitamiento de las manos, antebrazos y extremidades inferiores. La dificultad con movimientos finos tal como mecanografiar o sujetar botones pueden ser los primeros síntomas. Los síntomas avanzan lentamente y la enfermedad habitualmente no afecta la duración de la vida.
Distrofia muscular congénita (CMD) : La CMD está presente desde el nacimiento, resulta en debilidad generalizada y habitualmente progresa con lentitud. Un subtipo, denominado CMD de Fukuyama también involucra retardo mental. Ambas son raras; CMD de Fukuyama es más común en Japón.
CMD está marcada por debilidad muscular grave desde el nacimiento en donde los lactantes muestran "flojera" y movimientos voluntarios muy pequeños. No obstante, un niño con CMD puede aprender a caminar, ya sea con o sin un dispositivo de ayuda y pueden vivir hasta la etapa adulta joven o sobrepasarla. En contraste, los niños con CMD de Fukuyama rara vez son capaces de caminar y desarrollar retardo mental grave. La mayor parte de los niños con este tipo de CMD muere en la infancia.
Caquexia: La caquexia (o síndrome de agotamiento) típicamente se caracterizada por pérdida de peso, atrofia muscular, fatiga, debilitamiento y pérdida significativa del apetito el algunas personas quienes no intentan activamente perder peso. La definición formal de caquexia es la pérdida de masa corporal que no puede ser revertida nutricionalmente . Incluso si el paciente afectado consume más calorías, la masa corporal magra se pierde, lo que indica la existencia de una patología primaria.
La caquexia se experimenta por pacientes con 5 cáncer, SIDA, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, esclerosis múltiple, fallo cardíaco congestivo, tuberculosis, polineuropatía amiloide familiar, envenenamiento por mercurio (acrodinia) y deficiencia hormonal, entre otras enfermedades. La caquexia también puede ser un signo de diversos trastornos subyacentes que incluyen cáncer, acidosis metabólica (es decir, síntesis disminuida de proteínas y catabolismo aumentado de proteínas) , ciertas enfermedades infecciosas (por ejemplo, tuberculosis, SIDA), pancreatitis crónica, L5 trastornos autoinmunes o adicción a anfetaminas. La caquexia debilita físicamente a los pacientes a un estado de permanencia e inmovilidad a partir de la pérdida de apetito, astenia y anemia y la respuesta al tratamiento estándar habitualmente es pobre.
Aproximadamente 50% de todos los pacientes con cáncer padecen de caquexia. Aquellos con cánceres gastrointestinales superiores y pancreáticos presentan la mayor frecuencia de desarrollar un síntoma de caquexia. Además de la morbilidad y mortalidad aumentada agravado con ?t- los efectos secundarios de la quimioterapia y reducción en la calidad de vida, la caquexia se considera la causa inmediata de muerte de una gran proporción de pacientes con cáncer que varía de 22% a 40% de los pacientes. Los síntomas de caquexia en cáncer incluyen pérdida de peso progresiva y supresión de las reservas del hospedador de tejido adiposo y músculo esquelético. Los enfoques de tratamiento tradicionales incluyen el uso de estimulantes del apetito, antagonistas de 5-HT3, suplementación con nutrientes e inhibidores de COX-2.
Aunque la patogénesis de la caquexia se ha entendido poco, se espera que estén involucradas múltiples vías biológicas que incluyen citocinas proinflamatorias tales como TF-a, hormonas neuroendocrinas, IGF-1 y factores específicos de tumor tales como factor que induce proteólisis.
Las composiciones de HRS de esta manera se pueden utilizar para tratar caquexia y cualquiera de sus trastornos o complicaciones relacionados, subyacentes o secundarios. Las conposiciones de HRS se pueden utilizar solas o en combinación con otros tratamientos tal como suplemento en la dieta con una combinación de una cantidad alta de proteínas, leucina y aceite de pescado, antioxidantes, progestógeno (acetato de megestrol, acetato de medroxiprogesterona) y fármacos anticiclooxigenasa-2 , estimulantes del apetito y antagonistas de 5-HT3, entre otros .
Rabdomiolisis : La rabdomiolisis es la descomposición de las fibras musculares en el tejido de músculo esquelético. Los productos de descomposición se liberan al torrente sanguíneo y algunos de estos productos, tales como la mioglobina son dañinos para los ríñones y pueden llevar a fallo renal.
Los síntomas incluyen dolor muscular, vómito, confusión, coma o frecuencia y ritmo cardíaco anormales y su gravedad habitualmente depende del grado de daño muscular y de si se ha desarrollado fallo renal. El daño a los ríñones puede causar producción disminuida o ausente de orina, habitualmente de 12 a 24 horas después del daño inicial al músculo. La hinchazón del músculo dañado puede generar síndrome de compartimiento o compresión de tejidos circundantes, tales como nervios y vasos sanguíneos, en el mismo compartimiento facial y puede llevar a pérdida de sangre y daño (por ejemplo, pérdida de función) de las partes del cuerpo afectadas. Los síntomas de esta complicación incluyen dolor o sensación reducida en la extremidad afectada. Otras complicaciones incluyen coagulación intravascular diseminada (DIC, por sus siglas en inglés) , una interrupción grave en la coagulación sanguínea que puede llevar a hemorragias sin control.
El daño inicial a músculo puede ser causado, por ejemplo, por factores físicos (por ejemplo daño por trituración, ejercicio extenuante), suministro sanguíneo alterado (por ejemplo, trombosis arterial, embolia), metabolismo alterado (por ejemplo estado hiperosmolar hiperglucémico, hiper- e hiponatremia, hipocalemia, hipocalcemia, hipofosfatemia, cetoacidosis , hipotiroidismo) , temperatura corporal alterada (hipertermia, hipotermia) , medicaciones y toxinas (por ejemplo, estatinas, medicamentos antipsicóticos , agentes bloqueadores neuromusculares , diuréticos, metales pesados, cicuta, venenos de insectos o de víboras), abuso de drogas (por ejemplo alcohol, anfetaminas, cocaína, heroína, cetamina, LDS, MDMA) , infecciones (por ejemplo por virus de Coxcackie, virus de influenza A, virus de influenza B, virus de Epstein-Barr, infección primaria por VIH, Plasmodium falciparum, virus de herpes, Legionella pneumophila, salmonela) y daño a músculos autoinmune (por ejemplo, polimiositis , dermatomiositis) . Además, ciertas condiciones hereditarias incrementan el riesgo de rabdomiolisis , que incluye defectos en la glucólisis y glucogenólisis (por ejemplo, enfermedad McArdle, deficiencia de fosfofructocinasa, enfermedades de almacenamiento de glucógeno VIII, IX, X y XI), defectos en el metabolismo de lípidos (por ejemplo, deficiencia de carnitina palmitoil transferasa I y II, deficiencia de los subtipos de acil CoA deshidrogenasa (por ejemplo, deficiencia de LCAD, SCAD, MCAD, VLCAD, 3-hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa) , deficiencia de tiolasa) , miopatías mitocondriales (por ejemplo deficiencia de succinato deshidrogenasa, citocromo c oxidasa y coenzima Q10) y otras tales como deficiencia de glucosa-e-fosfato deshidrogenasa, deficiencia de mioadenilato desaminasa y distrofias musculares.
La rabdomiolisis abitualmente se diagnostica con pruebas sanguíneas y urinalísis y puede estar indicada como niveles aumentados anormalmente o en incremento de carnitina y urea, disminución en la generación de orina, cambio de color a roj izo-café de la orina. Los tratamientos primarios incluyen fluidos intravenosos, diálisis y hemofiltración .
Las composiciones de HRS de esta manera se pueden utilizar para tratar rabdomiolisis y cualquiera de los trastornos o complicaciones relacionados, secundarios o subyacentes. Las composiciones de HRS se pueden utilizar solas o en combinación con otros tratamientos que incluyen aquellos que generan tratamiento con choque y que conservan la función renal. Los tratamientos ejemplares incluyen la administración de fluidos intravenosos, habitualmente solución salina isotónica (0.9% en peso por volumen de solución de cloruro de sodio) y tratamiento sustitutivos (RRT, por sus siglas en inglés) tal como hemodiálisis, hemofiltración continua y diálisis peritoneal.
De manera más general, los polipéptidos de HRS que aquí se describen pueden reducir una respuesta inflamatoria por ejemplo al reducir la migración o infiltración de células inmunitarias en tejidos seleccionados, incrementar la producción de citocinas antiinflamatorias o reducir la producción o actividad de citocinas proinflamatorias, entre otros mecanismos.
En consecuencia, los polipéptidos de HRS de la invención se pueden utilizar para modular inflamación aguda, 5 inflamación crónica o ambos. Ciertas modalidades se relacionan con inflamación aguda en aumento o respuestas inflamatorias agudas y ciertas modalidades se relacionan con inflamación crónica en aumento o respuestas inflamatorias crónicas. Dependiendo de las necesidades del sujeto, ciertas 10 modalidades se relacionan con reducción de la inflamación aguda o respuestas inflamatorias y ciertas modalidades se relacionan con reducción de la inflamación crónica o respuestas inflamatorias crónicas.
La inflamación aguda se relaciona con la respuesta inicial del cuerpo a estímulos probablemente dañinos e involucra movimiento aumentado de plasma y leucocitos desde la sangre a los tejidos dañados. Es un proceso de corto plazo, que habitualmente comienza en los siguientes minutos u 20 horas y que finaliza cuando se retira el estímulo dañino. La inflamación aguda se puede caracterizar por uno o más de enrojecimiento, calor aumentado, hinchazón, dolor y pérdida de función. El enro ecimiento y el calor se deben principalmente a flujo sanguíneo aumentado en la temperatura ~,- del núcleo corporal hacia el sitio inflamado, y la hinchazón es causada por acumulación de fluidos, el dolor típicamente se debe a liberación de sustancias químicas que estimulan las terminales nerviosas y la pérdida de función tiene causas múltiples.
Las respuestas inflamatorias agudas se inician principalmente por células inmunitarias locales tales como 5 macrófagos residentes, células dendríticas, linfocitos, células de Kuppfer y linfocitos T. Al inicio de una infección, quemadura u otros daños estas células experimentan activación y liberación de mediadores inflamatorios ^ responsables de los signos clínicos de inflamación tales como aminas vasoactivas y ecosanoides. La vasodilatación y su flujo sanguíneo aumentado resultante generan el enrojecimiento y el calor aumentado. La permeabilidad aumentada de los vasos sanguíneos resulta en exudación o fuga de proteínas plasmáticas y fluido dentro del tejido, lo que L5 genera hinchazón. Ciertos mediadores liberados tales como bradicinina incrementan la sensibilidad al dolor y alteran los vasos sanguíneos para permitir la migración o extravasación de leucocitos, tales como neutrófilos, los 20 cuales típicamente migran a lo largo de un gradiente quimiotáctico generado por las células inmunitarias locales.
Las respuestas inflamatorias agudas también incluyen uno o más de sistemas de cascada bioquímica a celulares que consisten de modulación de proteínas , i- plasmáticas preformadas, las cuales actúan en paralelo para iniciar y propagar la respuesta inflamatoria. Estos sistemas incluyen el sistema de complemento el cual es activado principalmente por bacterias y los sistemas de coagulación y fibrinólisis los cuales son activados principalmente por necrosis, según el tipo de daño al tejido que es causado por ciertas infecciones, quemaduras u otros traumatismos. Por lo tanto, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para modular inflamación aguda o cualquiera de una o más de las respuestas inflamatorias agudas individuales.
La inflamación crónica, una respuesta inflamatoria prolongada y retardada se caracteriza por un desplazamiento progresivo en el tipo de células que están presentes en el sitio de inflamación y con frecuencia genera destrucción simultánea o casi simultánea y sanado del tejido a partir del proceso inflamatorio. A nivel celular, las respuestas inflamatorias crónicas involucran una diversidad de células inmunitarias tales como monocitos, macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y fibroblastos, aunque en contraste con la inflamación aguda, la cual es mediada principalmente por granulocitos, la inflamación crónica es mediada principalmente por células mononucleares tales como monocitos y linfocitos. La inflamación crónica también involucra una diversidad de mediadores inflamatorios tales como IFN-? y otras citocinas, factores de crecimiento, especies de oxígeno reactivas y enzimas hidrolíticas . La inflamación crónica puede durar durante muchos meses o años y puede resultar en destrucción no deseada de tejido y fibrosis.
Los signos clínicos de inflamación crónica dependen de la duración de la enfermedad, las lesiones inflamatorias, la causa y el área anatómica afectada (véase, por ejemplo, Kumar et al. Robbins Basic Pathology-SlA Ed. , 2009 Elsevier, London; Miller, LM, Pathology Lecture Notes, Atlantic Veterinary College, Charlottetown, PEI, Canadá). La inflamación crónica se asocia con una diversidad de condiciones o enfermedades patológicas que incluyen, por ejemplo, alergias, enfermedad de Alzheimer, anemia, estenosis de válvula aórtica, artritis tal como artritis reumatoide y osteoartritis , cáncer, fallo cardíaco congestivo, fibromialgia, fibrosis, ataque al corazón, fallo renal, lupus, pancreatitis, apoplejía, complicaciones quirúrgicas, enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedad de intestino inflamatorio, aterosclerosis y psoriasis, entre otras descritas en la presente y conocidas en el ámbito. De esta manera, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para tratar o administrar inflamación crónica, modular cualquiera de una o más de las respuestas inflamatorias crónicas individuales o tratar cualesquiera de una o más enfermedades o condiciones asociadas con inflamación crónica.
Los polipéptidos de HRS también pueden modular inflamación proliferativa, un proceso inflamatorio caracterizado por un incremento en el número de células tisulares. Esto puede abarcar condiciones cutáneas tales como psoriasis, seborrea o eczema o también se puede considerar en términos de cánceres y crecimientos anormales especialmente en base en las pruebas cada vez mayores basadas en métodos moleculares más eficientes para documentar inflamación crónica incluso de grado bajo.
En ciertas modalidades, los polipéptidos de HRS pueden modular las respuestas inflamatorias a nivel celular, por ejemplo al modular la activación, secreción de moléculas inflamatorias (por ejemplo secreción de citocinas o cininas) , proliferación, actividad, migración o adhesión de diversas células involucradas en la inflamación. Los ejemplos de estas células incluyen células inmunitarias y células vasculares. Las células inmunitarias incluyen, por ejemplo, granulocitos tales como neutrófilos, eosinófilos y basófilos, macrófagos/monocitos , linfocitos tales como los linfocitos B, linfocitos T citolíticos (es decir, linfocitos T CD8+) , linfocitos T cooperadores (es decir, linfocitos T CD4+ que incluyen linfocitos TI y T2) , células citolíticas naturales, linfocitos T ?d, células dendríticas y mastocitos. Los ejemplos de células vasculares incluyen células de músculo liso, células endoteliales y fibroblastos. También se incluyen métodos para modular una condición inflamatoria asociada con una o más células inmunitarias o células vasculares que incluyen condiciones inflamatorias mediadas por neutrófilos, mediadas por macrófagos y mediadas por linfocitos .
En ciertas modalidades, los polipéptidos de HRS modulan inflamación local, inflamación sistémica o ambas. 5 En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS puede reducir o mantener (es decir, evitar incrementos adicionales) de inflamación local o respuestas inflamatorias locales. En ciertas modalidades, dependiendo de las necesidades del sujeto, los polipéptidos de HRS puede incrementar la inflamación local o las respuestas inflamatorias locales. En ciertas modalidades, los polipéptidos de HRS pueden reducir o mantener (es decir, evitar incrementos adicionales) de inflamación sistémica o respuestas inflamatorias sistémicas. En ciertas modalidades, dependiendo de las necesidades del sujeto, los polipéptidos de HRS pueden incrementar la inflamación sistémica o las respuestas inflamatorias sistémicas.
En ciertas modalidades, la modulación de 20 inflamación o las respuestas inflamatorias se pueden asociar con uno o más tejidos u órganos. Los ejemplos no limitantes de estos tejidos u órganos incluyen la piel (por ejemplo dermis, epidermis, capa subcutánea), folículos pilosos, sistema nervioso (por ejemplo cerebro, médula espinal, ?t- nervios periféricos) , sistema auditivo u órganos del equilibrio (por ejemplo oído interno, oído medio, oído externo) , sistema respiratorio (por ejemplo nariz, tráquea, pulmones), tejidos gastroesofágicos , el sistema gastrointestinal (por ejemplo boca, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto) , sistema vascular (por ejemplo corazón, vasos sanguíneos y arterias) , hígado, vesícula biliar, sistema linfático/inmunitario (por ejemplo, nodulos linfáticos, folículos linfoides, bazo, timo, médula ósea), sistema urogenital (por ejemplo ríñones, uréter, vejiga, uretra, cuello uterino, trompas de Falopio, ovarios, úteros, vulva, próstata, glándulas bulbouretrales, epidídimo, próstata, vesículas seminales, testículos) , sistema musculoesquelético (por ejemplo músculos esqueléticos, músculos lisos, hueso, cartílago, tendones, ligamentos) , tejido adiposo, mamario y sistema endrocrino (por ejemplo hipotálamo, hipófisis, tiroides, páncreas, glándulas suprarrenales) . En consecuencia, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para modular inflamación asociada con cualquiera de estos tejidos u órganos por ejemplo para tratar condiciones o enfermedades que se asocian con la inflamación de estos tejidos u órganos.
Como se indica en lo anterior, ciertas modalidades pueden utilizar polipéptidos de HRS para reducir o administrar (es decir, evitar incrementos adicionales) de inflamación o respuestas inflamatorias asociadas con tejidos u órganos particulares. Se incluyen respuestas y condiciones inflamatorias asociadas con la piel, que incluyen inflamación, infecciones y cánceres asociados con las capas dérmica, epidérmica y subcutánea de la piel. Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con la piel incluyen, sin limitación, dermatitis tales como psoriasis, dermatitis irritante, dermatitis seborreica, dermatitis atópica (eczema) , dermatitis de contacto alérgica, dermatitis inducida por cambios térmicos, dermatitis inducida por drogas, dermatitis dishidrótica, urticaria, dermatitis autoinmune, cáncer de la piel tal como melanoma y dermatitis bulosa. También se incluyen infecciones bacterianasa, virales y parasitarias, eritema multiforme, eritema nodoso, granuloma anular, envenenamiento por enredadera/hiedra venenosa y necrólisis epidérmica tóxica.
Ciertas modalidades se relacionan con la reducción de las respuestas inflamatorias y condiciones asociadas con el sistema nervioso que incluyen inflamación, infecciones y cáncer asociado con el cerebro y médula espinal del sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico y las meninges. La expresión de mediadores inflamatorios incluyen complemento, moléculas de adhesión, enzimas de ciclooxigenasa y sus productos y citocinas que se incrementan en enfermedades neurodegenerativas experimentales y clínicas y estudios de intervención en animales de experimentación sugieren que varios de estos factores contribuyen directamente al daño neuronal . Por ejemplo, las citocinas específicas tales como interleucina-1 (IL-1) se han implicado fuertemente en neurodegeneración aguda tal como apoplejía y daño cefálico. 5 Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con el sistema nervioso incluyen, sin limitación, meningitis (es decir, inflamación de las membranas protectoras que cubren el cerebro y la medula espinal) , mielitis, LQ encefalomielitis (por ejemplo encefalomielitis mialgíca, encef lomielitis diseminada aguda, encefalomielitis diseminada o esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune) , aracnoiditis (es decir, inflamación de la aracnoide, una de las membranas que rodean y protegen los nervios del sistema nervioso central), granuloma, inflamación L 5 o meningitis inducida por drogas, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, apoplejía, demencia por VIH, síndrome de Sly, CMT, retinopatía, pérdida del oído sensoriuenural , atrofia muscular espinal, encefalitis por ALS tal como encefalitis viral y encefalitis bacteriana, infecciones parasitarias, trastornos desmielinizantes inflamatorios y trastornos autoinmunes tales como enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T CD8+ del SNC. Los ejemplos adicionales incluyen , c- enfermedad de Parkinson, miastenia grave, neuropatía motora, síndrome de Guillain-Barre , neuropatía autoinmune, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad neurológica paraneoplásica , atrofia cerebelar paraneoplásica , síndrome de hombre rígido no paraneoplásico, atrofia cerebelar progresiva, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral 5 amiotrófica, Corea de Sydeham, síndrome de Gilíes de la Tourette, poliendocrinopatía autoinmune, neuropatía disimune, neuromiotonia adquirida, artrogriposis múltiple, neuritis óptica y síndrome de hombre de giro.
Como se indica en lo anterior, también se incluyen 10 1 inflamaciones asociadas con infecciones del sistema nervioso. Los ejemplos específicos de infecciones bacterianas asociadas con inflamación del sistema nervioso incluyen, sin limitación, infección estreptocócica tal como estreptococus del grupo B (por ejemplo, subtipos III) y Streptococcus pneumoniae (por ejemplo serotipos 6, 9, 14, 18 y 23), Escherichia coli (por ejemplo, que presenta el antígeno Kl) , Listeria monocytogenes (por ejemplo, serotipo IVb) , infección neiserial tal como Neiseria meningitidis (meningococos) , 2Q infección estafilocócica, infección por hemofilus tal como Haemophilus influenzae tipo B, Klebsiella y Mycobacterium tuberculosis . También se incluyen infecciones por estafilococos y pseudomonas y otros bacilos gramnegativos , principalmente con respecto a traumatismo al cráneo que hace y- que las arterias en la cavidad nasal adquieran el potencial de entrar al espacio meníngeo o en personas con derivación cerebral o un dispositivo relacionado (por ejemplo, drenado extraventricular, depósito de Ommaya) . Los ejemplos específicos de infecciones virales asociadas con inflamación del sistema nervioso incluyen, sin limitación, enterovirus, virus de herpes simple tipo 1 y 2, virus linfotrópico T humano, virus de varicela zoster (varicela y zoster) , virus de paperas, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y virus de coriomeningitis linfocítica (LCMV, por sus siglas en inglés) . La meningitis también puede ser el resultado de una infección por espiroquetas tales como Treponema pallidum (sífilis) , Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme) , parásitos tales como paludismo (por ejemplo, paludismo cerebral) , hongos tales como Cryptococcus neiformans y amibas tales como Naegleria fowleri .
La meningitis u otras formas de inflamación del sistema nervioso también se pueden asociar con la diseminación de cáncer a las meninges (meningitis maligna) , ciertos fármacos tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, antibióticos e inmunoglobulinas intravenosas, sarcoidosis (o neurosarcoidosis) , trastornos del tejido conectivo tal como lupus eritematoso sistémico y ciertas formas de vasculitis (condiciones inflamatorias de las paredes de los vasos sanguíneos) tal como la enfermedad de Beliefs. Los quistes epidermoides y los quistes dermoides pueden provocar meningitis al liberar materia irritante en el espacio subaracnoideo . En consecuencia, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para tratar o administrar cualquiera de una o más de estas condiciones.
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de 5 las respuestas inflamatorias y condiciones asociadas con el sistema auditivo u órganos del equilibrio tal como el oído interior, oído medio y el oído externo. Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con el sistema auditivo o ^ los órganos del equilibrio incluyen, sin limitación, inflamación del oído externo (por ejemplo, infecciones en los oídos) , inflamación del oído medio, lo que puede llevar a acumulación de fluido en el espacio normalmente lleno de aire y pérdida del oído conductor asociado, inflamación de laberinto, una infección del oído interno o inflamación que L5 provoca mareos, (vértigo) y pérdida del oído, neuronitis vestibular, una infección de nervio vestibular, generalmente viral que provoca vértigo y neuronitis coclear, una infección del nervio coclear, generalmente viral que provoca sordera ?Q súbita pero sin vértigo. Los receptores de implantes cocleares para la pérdida de oído se encuentran en riesgo aumentado de meningitis pneumocócica y su inflamación asociada .
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de ,c las respuestas inflamatorias y condiciones asociadas con el sistema respiratorio, que incluye la inflamación, infecciones y cáncer asociado con nariz, traquea y pulmones. Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con el sistema respiratorio incluyen, sin limitación, enfermedades de pulmón inflamatorio, asma atópico, asma no atópico, asma alérgico, asma bronquial atópico mediado por IgE, asma bronquial, asma esencial, asma verdadero, asma intrínseco causado por alteraciones fisiopatológicas, asma extrínseco causado por factores ambientales, asma esencial de causa desconocida o no aparente, asma no atópico, asma bronquítico, asma enfisematoso, asma inducido por ejercicio, asma inducido por alérgenos, asma inducido por aire frío, asma ocupacional, asma infeccioso causado por infecciones bacterianas, micóticas, protozoarias o virales, asma no alérgico, asma incipiente, síndrome de sibilancias de lactante y bronquiolitis , broncocontricción crónica o aguda, bronquitis crónica, obstrucción de vías respiratorias pequeñas y enfisema. Los ejemplos adicionales incluyen enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias tales como neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés) , la COPD que incluye bronquitis crónica, enfisema pulmonar o disnea, asociado o no asociado con COPD, la COPD que se caracteriza por obstrucción de las vías respiratorias progresiva e irreversible y síndrome de malestar respiratorio adulto (ARDS, por sus siglas en inglés) .
Los ejemplos adicionales de condiciones asociadas con inflamación pulmonar incluyen condiciones relacionadas con exacerbación de hiperreactividad de vías respiratorias consecuencias con un tratamiento con otro fármaco, enfermedad de las vías respiratorias que se asocia con hipertensión pulmonar, bronquitis tal como bronquitis aguda, bronquitis laringotraqueal aguda, bronquitis araquídica, bronquitis catarral, bronquitis de croupus, bronquitis seca, bronquitis asmática infecciosa, bronquitis productiva, bronquitis estafilocócica o estreptocócica y bronquitis vesicular, daño pulmonar agudo y bronquiectasis tal como bronquiectasis cilindrica, bronquiectasis saculada, bronquiectasis fusiforme, bronquiectasis capilar, bronquiectasis quística, bronquiectasis seca y bronquiectasis folicular.
La COPD, en particular, se refiere a un grupo de enfermedades pulmonares que bloquean el flujo de aire y que bombean cada vez más difícil para los individuos afectados respirar normalmente. El enfisema y la bronquitis crónica son las dos condiciones principales dentro del grupo de las enfermedades de COPD, pero COPD también puede referirse a daño causado por bronquitis asmática crónica, entre otras condiciones conocidas en el ámbito. En la mayor parte de los casos, el daño a las vías respiratorias a la postre interfiere con el intercambio de oxígeno y dióxido de carbono en los pulmones. Los tratamientos convencionales se enfocan principalmente en el control de síntomas y minimizar daño adicional .
El enfisema representa un aspecto de COPD. El enfisema lleva a inflamación dentro de las paredes frágiles de los alvéolos, lo cual puede destruir parte de las paredes y fibras elásticas, lo que permite que las vías aéreas pequeñas colapsen cuando exhalan y deteriora el flujo de aire que sale de los pulmones. Los signos y síntomas de enfisema incluyen, por ejemplo, disnea, especialmente durante actividades físicas, sibilancias y pecho apretado.
La bronquitis crónica representa otro aspecto de COPD. La bronquitis crónica se caracteriza por tos activa y genera inflamación y estrechamiento de los tubos bronquiales. Esta condición también provoca generación aumentada de moco, lo cual puede bloquear adicionalmente los tubos estrechados. La bronquitis crónica se produce principalmente en fumadores y habitualmente se define como tos que dura por al menos tres meses a un año durante dos años consecutivos. Los signos y síntomas de bronquitis crónica incluye, por ejemplo, tener que aclarar la garganta como primera actividad en la mañana, especialmente para fumadores, una tos crónica que produce esputo amarillento, disnea en las etapas posteriores e infecciones respiratorias frecuentes. Como se indica en lo anterior, COPD se refiere principalmente a obstrucción en los pulmones que resulta de dos condiciones de pulmones crónicas indicadas antes. No obstante, muchas personas con COPD tienen ambas condiciones.
La bronquitis asmática crónica representa otro aspecto de COPD que habitualmente se caracteriza como bronquitis crónica combinada con asma (broncoespasmo) . El asma se puede presentar cuando secreciones inflamadas e infectadas irritan los músculos lisos en las vías respiratorias. Los síntomas son similares a los de la bronquitis crónica pero también incluyen episodios intermitentes o incluso diarios de sibilancias.
En ciertas modalidades, la COPD también puede tener un componente autoinmune. Por ejemplo, los linfocitos T de pulmón y sangre periférica en pacientes con enfisema grave secretan citocinas Thl y quimiocinas cuando se estimulan con péptidos de elastina in vitro y estos pacientes presentan anticuerpos aumentados anti -elastina en comparación con controles (véase Goswami et al., The Journal of Immunology. 178:130.41, 2007). Además, los autoanticuerpos de IgG con avidez por epitelio pulmonar y el potencial para mediar citotoxicidad son prevalentes en pacientes con COPD (véase Feghali -Bostwick et al., Am J. Respir Crit Care Med. 177; 156-63, 2008). Puesto que las respuestas inmunitarias autorreactivas pueden ser importantes en la etiología de esta enfermedad que incluyen, por ejemplo, respuestas autorreactivas a autoantígenos tales como elastina, pueden jugar un papel en COPD, el uso de polipéptidos de AARS para desensibilizar células inmunitarias a estos antígenos puede reducir la inflamación pulmonar.
Como se indica en lo anterior, ciertas modalidades se relacionan con el uso de polipéptidos de HRS para desensibilizar células inmunitarias a antígenos seleccionados, que incluye autoantígenos y antígenos extraños, irritantes, alérgenos o agentes infecciosos relacionados con inflamación pulmonar. Al desensibilizar estas células inmunes a un antígeno seleccionado, los polipéptidos de HRS pueden reducir la migración o reclutamiento de estas células a los pulmones y de esta manera reducir la inflamación. Los ejemplos de células inmunes incluyen linfocitos, monocitos, macrófagos, células dendríticas y granulocitos tales como neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Los ejemplos de antígenos incluyen, sin limitación, fumar, por ejemplo fumar un cigarro, contaminación de aire, humos tales como humo de soldadura, polvos que incluyen polvo de sílice y polvos de lugar de trabajo tales como los que se encuentran en las minas de carbón y minas de oro, sustancias químicas tales como cadmio e isocianatos. También se incluyen alérgenos conocidos y agentes infecciosos tales como antígenos bacterianos y virales que incluyen lipopolisacáridos (LPS) , los cuales pueden exacerbar COPD en individuos sensibles.
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de las respuestas inflamatorias y condiciones asociadas con el sistema gastrointestinal que incluyen inflamación, infecciones y cáncer asociado con la boca, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso y recto. El término "inflamación gastrointestinal", como se utiliza en la presente, se refiere a inflamación de una capa de la mucosa del tracto gastrointestinal y abarca condiciones inflamatorias agudas y crónicas. La inflamación aguda generalmente se caracteriza por un tiempo de inicio breve y la infiltración o entrada de neutrófilos. La inflamación crónica generalmente se caracteriza por un periodo de inicio generalmente más prolongado e infiltración o entrada de células mononucleares . La inflamación crónica típicamente también se caracteriza por periodos de revisión espontánea y presentación espontánea.
El término "capa mucosal del tracto gastrointestinal" significa incluir mucosa del intestino (que incluye intestino delgado e intestino grueso) , recto, revestimiento del estómago (gástrico) , cavidad bucal y similares. El término "inflamación gastrointestinal crónica" se refiere a inflamación de la mucosa del tracto gastrointestinal que se caracteriza por un periodo de inicio relativamente más prolongado, es de larga duración (por ejemplo de varios días, semanas, meses o años y hasta toda la vida del sujeto) y con frecuencia se asocia con infiltración o entrada de celdas raononucleares y puede asociarse adicionalmente con períodos de remisión espontánea y presentación espontánea. Las "condiciones inflamatorias gastrointestinales crónicas" (también denominadas como "enfermedades inflamatorias gastrointestinales crónicas") que tienen esta inflamación incluyen, pero no se limitan a enfermedad de intestino inflamatorio (IBD, por sus siglas en inglés) , colitis inducida por ataques ambientales (por ejemplo, inflamación gastrointestinal asociada con un régimen terapéutico tal como quimioterapia, radioterapia y similares) , colitis en condiciones tales como enfermedad granulomatosa crónica (véase, por ejemplo Schappi et al. Arch Dis Child. 84: 147-151, 2001), enfermedad celiaca, esprue celiaco (es decir, enfermedad heredable en la cual el revestimiento intestinal se inflama en respuesta a la ingestión de una proteína conocida como gluten) , alergias a alimentos, gastritis, gastritis infecciosa o enterocolitis (por ejemplo gastritis activa crónica infectada por Helicobacter pylori) y otras formas de inflamación gastrointestinal causadas por un agente infeccioso y otras condiciones similares.
Como se utiliza en la presente, la "enfermedad de intestino inflamatorio" o "IBD" se refiere a cualquiera de una diversidad de enfermedades caracterizadas por inflamación de la totalidad o parte de los intestinos. Los ejemplos de enfermedad de intestino inflamatorio incluyen, pero no se limitan a enfermedad de Crhon y colitis ulcerativa. El término IBD incluye colitis pseudomembranosa, colitis hemorrágica, colitis de síndrome hemolítico-urémico, colitis colagenoso, colitis isquémica, colitis por radiación, colitis inducida por fármacos y químicamente, colitis de desviación, colitis ulcerativa, síndrome de intestino irritable, síndrome de colon irritable y enfermedad de Crhon; y dentro de la enfermedad de Crhon todos los subtipos que incluyen enfermedad de Crhon activa, refractaria y fistulizante . De esta manera, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para tratar o administrar cualquiera de una o más de estas condiciones .
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de las respuestas inflamatorias y condiciones asociadas con el sistema vascular, o inflamación vascular tal como inflamación asociada con los vasos sanguíneos y el corazón. Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con el sistema vascular incluyen, sin limitación, miocarditis, pericarditis, enfermedad oclusiva, aterosclerosis , infarto al miocardio, trombosis, enteropatía autoinmune, cardiomiopatía , enfermedad de Kawasaki , artritis idiopática juvenil, granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, síndrome de Kawasaki, enfermedad autoinmune anti-factor VIII, vasculitis necrotizante de vasos pequeños, poliangiitis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrotizante focal pauci-inmune , glomerulonefritis creciente, síndrome antifosfolipídico, fallo cardíaco inducido por anticuerpos, púrpura trombocitopénica, anemia hemolítica autoinmune, autoinmunidad cardiaca en enfermedad de Chagas, autoinmunidad anti-linfocitos T cooperadores. También se incluyen endocarditis o infección de las válvulas cardiacas con diseminación de grupos pequeños de bacterias a través de la corriente sanguínea, flebitis o vasculitis, inflamación de una o más venas y tromboflebitis, inflamación de las venas relacionada con un trombo. La tromboflebitis puede presentarse de manera repetida en lugares diferentes y después se puede referir como tromboflebitis migrante o tromboflebitis que migra. La flebitis se puede asociar con una diversidad de causas tales como infección bacteriana, exposición a agentes químicos tales como soluciones irritantes o vesicantes, traumatismo físico por pulsiones de la piel tal como movimiento de una cánula en una vena durante la inserción, medicaciones tales como Celebrex, Olanzepina, antidepresivos y otros, o abuso de alcohol. Algunas modalidades se pueden relacionar con el tratamiento o administración de inflamación cardiaca causada por cualquiera de uno o más de fiebre reumática aguda, toxoplasmosis congénita, infección antenatal por enterovirus, enfermedad de Lyme, y fiebre reumática.
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de las respuestas inflamatorias y condiciones asociadas con el hígado o vesícula biliar, que incluyen inflamación hepática aguda y crónica y colecistis aguda y crónica. Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con hígado o vesícula biliar incluyen, sin limitación, hepatitis autoinmune, hepatitis viral (por ejemplo, virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de hepatitis D, virus de hepatitis E, mononucleosis , rubéola, virus de Epstein-Barr y citomegalovirus) , otras causas de hepatitis tales como infección bacteriana grave, infecciones por amibas, medicinas (por ejemplo agomelatina, alopurinol, amitriptilina, amiodarona, asatioprina, paracetamol, halotano, ibuprofeno, indometacina, isoniazida, rifampicina, pirazinamida, ketoconazol , loratadina, metotrexato, metildopa, minociclina, nifedipina, nitrofurantoina, fenitoina, ácido valproico, troglitazona, zidovudina) , toxinas (por ejemplo, alcohol, toxinas micóticas) y trastornos metabólicos (por ejemplo, enfermedad de ilson, un trastorno del metabolismo de cobre en el cuerpo, hemocromatosis, trastorno del metabolismo de hierro en el cuerpo, esteatohepatitis no alcohólica, deficiencia de alfa 1 - antitripsina) . Los ejemplos adicionales incluyen enfermedad de hígado graso no alcohólico, cirrosis tal como cirrosis biliar primaria, ictericia obstructiva, hepatitis isquémica y enfermedad de la vesícula biliar.
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de las respuestas inflamatorias y condiciones asociadas con el sistema linfático/inmunitario . Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con el sistema linfático/inmunitario incluye, sin limitación, enfermedades autoinmunes tales como enfermedad de Chagas, trastorno pulmonar obstructivo crónico (COPD) , enfermedad de Crhon, dermatomiositis, diabetes mellitus tipo I, endometriosis , síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hachimoto, hidradenitis supurativa, enfermedad de Kawasaki , nefropatía de IgA, púrpura trombocitopenia ( idiopática) , cistitis intersticial, lupus eritematoso, enfermedad de tejido conectivo mixto, morfea, miastenia grave, narcolepsia, neuromiotonia, pénfigo vulgar, anemia pernisiosa, psoriasis, artritis psoriática, polimiositis , cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide, esquizofrenia, escleroderma, síndrome de Sjogren, síndrome de persona rígida, arteritis temporal, colitis ulcerativa, vitíligo y granulomatosis de Wegener, además de anemia hemolítica autoinmune y diversas linfadenopatías .
También se incluyen condiciones inflamatorias relacionadas con el sistema inmunitario asociadas con el transplante de un injerto, tejido, célula u órgano tal como rechazo de transplante, rechazo crónico de transplante, rechazo subagudo de transplante, rechazo hiperagudo de transplante, rechazo agudo de injerto y enfermedad de rechazo inverso. En ciertas modalidades, los polipéptidos de AARS se pueden administrar a un transplante donador antes o durante la extirpación de tejido. En ciertas modalidades, los polipéptidos de HRS se pueden administrar a un receptor de transplante antes, durante o después de un tratamiento de transplante para reducir las complicaciones relacionadas con la inflamación del tratamiento de transplante. Los ejemplos de tratamientos de transplante incluyen el de médula ósea, blastocitos, sangre periférica, hígado, pulmón, corazón, piel y riñon, entre otros conocidos en el ámbito. Los ejemplos adicionales incluyen condiciones inflamatorias asociadas con alergias tales como asma, ronchas, urticaria, alergia al polen, alergia a ácaros del polvo, alergia a veneno, alergia a cosméticos, alergia al látex, alergia química, alergia a fármacos, alergia a picaduras de insectos, alergia a pelo de animales, alergia a plantas que pican, alergia a hiedra venenosa y alergia a alimentos.
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de las respuestas y condiciones inflamatorias asociadas con el sistema urogenital. Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con el sistema urogenital incluyen, sin limitación, inflamaciones, infecciones de cánceres del uréter, vejiga, uretra, cuello uterino, trompas de Falopio, ovarios, útero, matriz, vulva, próstata, glándulas bulbouretrales , epidídimo, próstata, vesículas seminales, testículos o ríñones. También se incluye nefritis intersticial autoinmune, abscesos renales ( intra-renales y extra-renales) , prostatitis aguda, hematuria, uretritis (por ejemplo enfermedades por clamidia y otras enfermedades transmitidas sexualmente) , enfermedad inflamatoria pélvica (PID, por sus siglas en inglés) y abscesos prostéticos. También se incluye nefritis asociada con uno o más de glomerulonefritis , nefritis por lupus, nefropatía, gota, venenos o sustancias químicas (por ejemplo éter, sulfato de talio) , ciertas medicaciones (por ejemplo, piroxicam, candyl, gel feldene, fensaid, pirox) , síndrome de Hermann, fiebre amarilla, enfermedades del complejo inmunitario, fiebre tifoidea, restricción uretral, tuberculosis renal y glomerulonefritis postestreptocócica .
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de respuestas y condiciones inflamatorias asociadas con el sistema musculoesquelético . Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con el sistema musculoesquelético incluyen, sin limitación, artritis tal como artritis reumatoide y artritis psoriática, espondilitis anquilosante, miositis autoinmune, síndrome de Sjogren primario, enfermedad autoinmune de músculo liso, miositis, polimiositis , tendinitis, inflamación de ligamentos, inflamación de cartílago, inflamación de articulaciones, inflamación sinovial, síndrome de túnel carpiano, inflamación de músculo crónico e inflamación de los huesos, que incluye inflamación ósea asociada con osteoporosis y osteoartritis . También se incluye el síndrome de Tietze, una hinchazón localizada no supurativa dolorosa benigna de las articulaciones costoesternal , esternoclavicular y costocondrial , costocondritis, síndrome del esternón, xifoidalgia, subluxación esternoclavicular espontánea, hiperostosis esternocostoclavicular, fibromialgia, tendinitis del hombro o bursitis, artritis gotosa, polimialgia reumática, lupus eritematoso, acantositos óseos, fracturas tales como fracturas por tensión, caquexia, sarcopenia, debilidad muscular, enfermedad de agotamiento muscular, daño muscular, mialgia, miopatía de cuerpos de inclusión esporádicos, miopatía de cuerpos de inclusión hereditarios y deficiencia de sarcoglucano. También se incluyen distrofias musculares (por ejemplo, DMD) , distrofias miotónicas, rabdomiolisis y otras enfermedades inflamatorias musculares descritas en la presente.
Ciertas modalidades se relacionan con reducir respuestas y condiciones inflamatorias asociadas con el sistema endocrino. Los ejemplos de condiciones inflamatorias asociadas con el sistema endocrino incluyen, sin limitación, inflamación, infección o cáncer asociado con el hipotálamo, hipófisis, tiroides, páncreas o glándulas suprarrenales, enfermedades glandulares tales como enfermedad pancreática, diabetes tal como diabetes tipo I, enfermedad de la tiroides, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema (idiopático) , autoinmunidad del ovario, infertilidad anti-esperma autoinmune, prostatitis autoinmune y síndrome poliglandular autoinmune tipo I.
Ciertas modalidades se relacionan con reducción de las respuestas y condiciones inflamatorias asociadas con tejidos adiposos, un participante activo en la regulación de procesos fisiológicos y patológicos, que incluyen inflamación inmunitaria, así como estados inflamatorios asociados con lipodistrofias , laminopatías , enfermedad de Kawasaki, artritis idiopática juvenil, enfermedades de almacenamiento de lisosomas y mucopolisacaridosis .
Los macrófagos con componentes del tej ido adiposo y participan activamente en sus actividades. Además, la interferencia entre linfocitos y adipositos puede llevar a regulación inmune. El tejido adiposo produce y libera una diversidad de factores proinflamatorios y antiinflamatorios que incluyen las adiposinas leptina, adiponectina, resistina y visfatina así como citocinas y quimiocinas tales como TNF-alfa, IL-6, proteína 1 quimioatrayente de monocitos y otros. Las moléculas proinflamatorias producidas por tejido adiposo se han implicado como participantes activos en el desarrollo de resistencia a insulina y un riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares asociadas con obesidad. En contraste, los niveles de leptina reducidos pueden predisponer a susceptibilidad aumentada a infección causada por respuestas de linfocitos T reducidas en individuos mal nutridos. Los niveles de adiposina alterados se han observado en una diversidad y condiciones inflamatorias (véase, por ejemplo, Fantuzzi, J. Allergy Clin Immunol . 115:911-19, 2005; y Berg et al. Circulation Research. 96:939-2005).
Los polipéptidos de HRS también se han utilizado para tratar o administrar inflamación asociada con hipersensibilidad. Los ejemplos de estas condiciones incluyen hipersensibilidad tipo I, hipersensibilidad tipo II, hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad tipo IV, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad mediada por anticuerpo, hipersensibilidad mediada por complejo inmunitario, hipersensibilidad mediada por linfocitos T e hipersensibilidad de tipo retardado.
Los polipéptidos de HRS también se pueden utilizar para tratar o administrar condiciones autoinflamatorias . Los ejemplos de condiciones autoinflamatorias incluyen fiebre mediterránea familiar, síndrome periódico asociado con receptor de TNF (TRAPS, por sus siglas en inglés) , síndrome de hiper-IgD (HIDS, por sus siglas en inglés) , enfermedades relacionadas con CIASI tales como síndrome de Muckle - Wells, síndrome autoinflamatorio frío familiar y enfermedad inflamatoria de sistemas múltiples de inicio neonatal, síndrome de PAPA (artritis estéril piogénica, pioderma gangrenoso, acné) y síndrome de Blau.
Los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para tratar o administrar inflamación asociada con una diversidad de cánceres. Los ejemplos de estos cánceres incluyen, sin limitación, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de riñon, cáncer de cerebro, melanoma, cáncer cutáneo que no es melanoma, cáncer de huesos, linfoma, leucemia, cáncer de tiroides, cáncer endometrial, mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda, neuroblastoma , glioblastoma y linfoma no hodgkiniano.
Como se indica en lo anterior, ciertas modalidades pueden utilizar polipéptidos de HRS para modular inflamación sistémica de manera que se reduzca o administre la inflamación sistémica. En ciertas modalidades, la inflamación sistémica puede ser asociada con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS, por sus siglas en inglés) , una condición inflamatoria de todo el cuerpo con una variedad de causas potenciales. El SIRS puede ser caracterizado o identificado de acuerdo con técnicas de diagnóstico sistemáticas. Como un ejemplo no limitante, se puede identificar SIRS por la presencia de dos o más de los siguientes: (i) una temperatura corporal que es menor de 36°C o mayor de 38°C, (ii) una frecuencia cardiaca que es mayor de 90 latidos por minuto, (iii) taquipnea (frecuencia respiratoria alta) con más de 20 inspiraciones por minuto; o una presión parcial arterial de dióxido de carbono menor de 4.3 kPa (32 mmHg) y (iv) cuenta leucocítica menor de 4000 células/mm3 (4 x 109 células/1) o mayor de 12,000 células/mm3 (12 x 109 células/1) ; o la presencia de más de 10% de neutrófilos inmaduros (que forman bandas) .
El SIRS se clasifica de manera general ya sea como infeccioso o no infeccioso. De manera más general, el SIRS infeccioso se asocia con septicemia, un estado inflamatorio de todo el cuerpo combinado con una infección conocida o que se sospecha, la cual incluye bacteriemia, viremia, parasitemia y síndrome de choque tóxico. La septicemia se puede asociar con una amplia variedad de agentes infecciosos que incluyen, sin limitación bacterias tales como Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Staphilococcus coagulasa negativo, Staphilococcus aureus, especies de Klebsiella, Pseudomonas auroginosa, especies de Enterobacter, S. agalactiae, especies de Serratia, especies de Acinetobacter, Streptococcus pneumoniae, especies de Salmonella y Neisseria meningitidis; virus tales como rubéola, citomegalovirus , herpes simple y virus de varicela; parásitos tales como en infección palúdica {por ejemplo Plasmodium faciparum) , tripanosomiasis y filariasis; y hongos tales como especies de Candida, especies de Aspergillus, especies de Histoplasma, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis y Pneumocistis carinii. En ciertas instancias las infecciones en los pulmones (por ejemplo, neumonía), vejiga y ríñones (por ejemplo infecciones en las vías urinarias) , piel (por 5 ejemplo, celulitis) , abdomen (por ejemplo, apendicitis) y otras áreas (por ejemplo, meningitis) se pueden diseminar y llevan a septicemia, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para modular la inflamación asociada con cualquiera de estos agentes infecciosos en donde la septicemia está 10 presente de otra manera.
Los SIRS no infecciosos se pueden asociar con traumatismo, quemaduras, pancreatitis, isquemia, hemorragia, complicaciones quirúrgicas, insuficiencia suprarrenal, embolia pulmonar, aneurisma aórtico, taponamiento cardíaco, 15 anafilaxia y sobredosis de drogas, entre otros. El SIRS con frecuencia está acompañado por fallo en uno o más órganos o sistemas de órganos, que incluyen los que aquí se describen. Los ejemplos específicos incluyen daño pulmonar agudo, daño 20 renal agudo, choque y síndrome de disfusión de órganos múltiples, entre otros. Típicamente, SIRS se trata al enfocarse en el problema subyacente (por ejemplo sustitución adecuada de fluidos para hipovolemia, IVF/NPO para pancreatitis, epinefrina/esteroides/benadril para ~¡- anafilaxis) . En ciertas instancias se ha demostrado que selenio, glutamina y el ácido eicosapentaenoico tienen eficacia en mejorar los síntomas de SIRS y los antioxidantes tales como la vitamina E también pueden ser útiles. De esta manera, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para tratar o administrar SIRS y las complicaciones de SIRS, solas 5 o en combinación con otros tratamientos.
La inflamación sistémica también se puede asociar con una "tormenta de citocinas", una reacción inmunitaria peligrosa causada por un bucle de retroalimentación positivo entre citocinas y células inmunes lo que resulta en niveles LO altamente elevados de diversas citocinas. En ciertas instancias, la tormenta de citocinas "hipercitocinemia" incluye la liberación sistémica de numerosos mediadores inflamatorios conocidos tales como citocinas, radicales de oxígeno libre y factores de coagulación) . Se incluyen niveles elevados de citocinas proinflamatorias tales como TNF-a, IL-1 e IL6 y citocinas antiinflamatorias tales como antagonista del receptor IL-10 e IL-1. Las tormentas de citocinas se pueden presentar en muchas enfermedades infecciosas y no infecciosas que incluyen rechazo inverso (GVHD, por sus siglas en inglés) , síndrome de malestar respiratorio agudo (ARDS) , septicemia, influenza aviar, viruela y SIRS. La tormenta de citocinas también puede ser inducida por ciertos medicamentos. El tratamiento incluye OX40 IG, lo que reduce )t- las respuestas de los linfocitos T, inhibidores de ACE, bloqueadores del receptor de angiotensina II, corticosteroides , gemfibrozil, eliminadores de radicales libres y bloqueadores de TNF-a. En consecuencia, los polipéptidos de HRS se pueden utilizar para tratar o administrar la tormenta de citocinas, solos o combinados con otros tratamientos.
Ciertas modalidades pueden utilizar polipéptidos de HRS para reducir cualquiera de una o más de inflamación granulomatosa, inflamación fibrinosa, inflamación purulenta, inflamación serosa o inflamación ulcerativa. La inflamación granulomatosa se caracteriza por la formación de granulomas, que típicamente resultan de una respuesta a agentes infecciosos tales como tuberculosis, lepra y sífilis. La inflamación fibrinosa resulta de un gran incremento en la permeabilidad vascular, lo que permite que la fibrina pase a través de los vasos sanguíneos . Si está presente un estímulo procoagulante apropiado, tal como una célula cancerosa, se deposita un exudado fibrinoso. Este procedimiento es observado comúnmente en cavidades serosas, en donde la conversión del exudado fibrinoso a una cicatriz se puede realizar entre membranas serosas, limitando su función. La inflamación purulenta resulta de la formación de una cantidad grande de pus, el cual consiste de neutrófilos, células muertas y fluido. La infección por bacterias pirogénicas tales como estafilococos es característica de esta clase de inflamación. Las recolecciones localizadas grandes de pus encerradas por tejidos circundantes se denominan abscesos. La inflamación serosa se caracteriza por la efusión copiosa de fluido seroso no viscoso, producido comúnmente por células del mesotelio de las membranas serosas, pero también se puede derivar de plasma sanguíneo. Los ejemplos de este tipo de inflamación incluyen ampollas cutáneas. La inflamación ulcerativa la cual típicamente se produce cerca del epitelio resulta en la pérdida necrótica de tejido desde la superficie por lo que exponen las capas inferiores del tejido. La excavación subsecuente del epitelio se conoce como una úlcera.
Los polipéptidos de HRS también se pueden utilizar en el tratamiento de daños físicos o heridas. Los ejemplos incluyen abrasiones, quemaduras, cortes, heridas punzantes, laceraciones, heridas por impacto, golpes, contusiones, quemaduras térmicas, picaduras de insectos, quemaduras químicas, quemaduras solares, gangrena, necrosis, desecaciones, quemaduras por radiación quemaduras por radioactividad, inhalación de humo, músculos torcidos, músculos jalados, tendones torcidos, tendones jalados, ligamentos jalados, ligamentos de torsión, hiperextensiones, cartílago torcido, fracturas óseas, nervios pellizcados, úlceras y disparos de arma u otras heridas traumáticas.
Los polipéptidos de HRS también se pueden utilizar para tratar o administrar inflamación idiopática o inflamación de etiología desconocida. También se incluyen tratamientos de combinaciones los cuales uno o más polipéptidos de AARS son administrados o utilizados en combinación con uno o más tratamientos adicionales para cualquiera de las enfermedades o condiciones inflamatorias descritas en la presente que incluyen aquellos tratamientos que están disponibles comúnmente y se conocen en el ámbito. Los ejemplos de combinación de politerapias incluyen el uso de agentes antiinflamatorios estándar tales como medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID, por sus siglas en inglés) , derivados antiinflamatorios selectivos inmunitarios (ImSAID, por sus siglas en inglés) y esteroides (por ejemplo, corticosteroides) , sustancias antiinfecciosas tales como antibióticos y agentes antivirales, antioxidantes, citocinas, agentes quimioterapéuticos y otros tratamientos contra el cáncer y tratamientos inmunosupresores .
En algunas modalidades, la presente invención se relaciona de manera general con métodos y composiciones para facilitar la remoción extracorporal de anticuerpos endógenos utilizando polipéptidos de HRS unidos a un soporte sólido biocompatible .
La separación específica de anticuerpos circulantes por inmunoadsorción extracorporal utilizando un antígeno inmovilizado ha sido descrita por diversos investigadores. Véase, de manera general, Kóhler et al., (2011) J Clin Apher. (6) :347-55; Müller et al., (2012) Dermatology. ; 224 (3 ) : 224 -7 ; Koziolek et al., (2012) J Neuroinflammation . 9(1) :80, Bontadi et al., (2012) J Clin Apher. doi : 10.1002/j ca .21229 ,-Westermann et al., (2012) J Dermol . 39 (2) : 168-71. Además, este enfoque ha sido comercializado con éxito como un sistema viable para eliminar específicamente anticuerpos circulantes, como se ejemplifica por las columnas de inmunoadsorción vendidas bajo las marcas comerciales ProsorbaMR, InmunosorbaMR, vendidas por Fresenius, St . Wendel, Alemania y SelesorbMR, vendido por Kaneka, Wiesbaden, Alemania.
En la inmunoadsorción extracorporal, los anticuerpos circulantes se extraen extracorporalmente utilizando una columna inmunoadsorbente específica para el anticuerpo endógeno. La sangre del paciente es extraída de manera continua o discontinua, separada en sus componentes celulares y plasma y el plasma se vuelve a suministrar por perfusión a través del material inmunoadsorbente con el fin de eliminar el anticuerpo. El plasma tratado y los componentes celulares de la sangre después de vuelven a suministrar al paciente, ya sea por separado o simultáneamente. En algunas modalidades, la inmunoadsorción extracorporal de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo inmediatamente antes de la administración de un polipéptido de HRS .
En consecuencia, algunas modalidades se relacionan con métodos para inmunoadsorción extracorporal de anticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa a partir de fluido del cuerpo extracelular, que comprende las etapas de: (a) proporcionar el fluido corporal extracelular el cual ha sido obtenido de un sujeto, (b) poner en contacto el fluido corporal extracelular con un soporte sólido biocompatible que tenga por lo menos un polipéptido de HRS unido al mismo, para de esta manera capturar los anticuerpos anti-HRS, y (c) volver a suministrar por infusión el fluido corporal extracelular de la etapa (b) dentro del sujeto.
También se incluyen composiciones inmunoadsorbentes para usarse en la separación de anticuerpos anti-HRS de un fluido corporal de un sujeto, que comprende un soporte sólido biocompatible que tiene por lo menos un polipéptido de HRS unido al mismo.
En general, en cualquiera de estos métodos y composiciones inmunoadsorbentes, los fluidos corporales se obtienen, se manejan y se vuelven a suministrar por infusión bajo condiciones asépticas utilizando métodos y sistemas que son bien conocidos por una persona experta en el ámbito. Por ejemplo, la sangre se extrae con una aguja que se introduce, por ejemplo, dentro de una vena periférica conectada por medio de un tubo adecuado a un recipiente que contiene el soporte sólido biocompatible y que se vuelve a suministrar por infusión en el paciente por medio de un tubo de entrada conectado a una aguja insertada dentro de otra vena. En situaciones en donde van a extraerse volúmenes grandes del sujeto, la sangre puede ser extraída, por ejemplo de la vena subclavia .
La sangre o plasma se pondrá en contacto con el soporte sólido biocompatible bajo condiciones que promuevan la unión entre los anticuerpos y los polipéptidos de HRS unidos al soporte. Las columnas adecuadas y los sistemas de perfusión para adsorción extracorporal están disponibles comercialmente , por ejemplo de Fresenius, St . endel, Alemania. Las temperaturas de contacto en el intervalo de 35°C a aproximadamente 40°C se utilizan habitualmente . El tiempo de contacto típicamente estará en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas . La porción no unida de la sangre o plasma después se recolecta para reintroducción en el paciente o se puede reintroducir directamente, en una base continua. El título de anticuerpo para Jo-1 del sujeto se puede monitorear por inmunoanálisis antes y/o después del procedimiento, para supervisar la eficiencia del procedimiento.
Opcionalmente se puede agregar a la sangre una sustancia anticoagulación tal como citrato de sodio, heparina o dextrano cuando se extrae del cuerpo para evitar coagulación de la sangre. El dextrano reduce la viscosidad de la sangre y, en combinación con la adición de solución salina, asegura una distancia aumentada entre las células sanguíneas y las plaquetas sanguíneas. Estos anticoagulantes se pueden agregar en cantidades suficientes para no coagulación de la sangre. Antes de reinfusión de la sangre tratada en el sujeto, el efecto de anticoagulación, por ejemplo de la heparina se puede reducir con la cantidad apropiada de heparinasa, protamina y/o vitamina K, etc.
Para reducir el riesgo de embolia, se deben tomar precauciones para evitar que las partículas del medio de adsorción entren al paciente cuando se realiza la reinfusión. En consecuencia, un dispositivo de captura de partículas típicamente se utiliza dirección 3' del recipiente de medio de adsorción para eliminar cualquier partícula residual del resto del fluido corporal antes de que se regrese al paciente. El dispositivo de captura de partículas puede ser un filtro o malla que tenga aberturas de un tamaño que retenga cualquier material particulado del medio de adsorción mientras que permite que las entidades no adsorbidas del fluido corporal pasen a su través. La perfusión sanguínea extracorporal se puede realizar continuamente o, de modo alternativo volúmenes separados de sangre se pueden remover del paciente, se tratan como se describe en lo anterior y el plasma tratado y los componentes celulares de la sangre se regresan al paciente después de que se ha completado el tratamiento.
Una amplia variedad de materiales serán adecuados como soportes sólidos biocompatibles , para usarse en cualquiera de estos métodos y composiciones de inmunoadsorbente , y, de modo ideal, la matriz de soporte será mecánicamente fuerte, suficientemente hidrofílica para evitar la unión no específica de proteínas, estable y compatible con la sangre u otras soluciones acuosas. Los materiales de matriz biocompatibles adecuados incluyen, por ejemplo, polímeros sintéticos y naturales, polisacáridos , poliamidas, esferas de vidrio, sílice particulado, vidrio poroso, sílice, resinas, matrices sintéticas que incluyen derivados de acrilamida, derivados de metacrilamida o derivados de poliestireno, etc., en diversas formas que incluyen esferas, forma fibrosa, láminas o fibras huecas.
Los polímeros ejemplares incluyen polisacáridos naturales y sintéticos y otros polímeros basados en carbohidratos que incluyen agar, alginato, carragenina, goma guar, goma arábiga, goma ghatti, goma de tragacanto, goma de karaya, goma de algarrobo, goma de xantano, agarosas, celulosas, pectinas, mucinas, dextranos, almidones, heparinas, quitosanas, hidroxialmidones, hidroxipropilalmidones, carboximetilalmidones, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosas y carboximetilcelulosas . Los polímeros orgánicos sintéticos y monómeros que resultan en polímeros incluyen polímeros acrílicos, poliamidas, poliimidas, poliésteres, poliéteres, compuestos poliméricos de vinilo, polialquenos y derivados sustituidos de los mismos así como ccpolímeros que comprenden más de una de estas funcionalidades de polímeros, y derivados sustituidos de los mismos; y mezclas de los mismos.
En cualquiera de estos métodos y composiciones extracorporales, los polipéptidos de HRS típicamente se acoplan covalentemente al soporte sólido biocompatible y los métodos convencionales para acoplamiento de proteínas tales como los polipéptidos de HRS son bien conocidos por aquellas expertos en el ámbito (véase, por ejemplo Affinity Chromatography, Principies and Methods (Pharmacia-LKB) , Dean, P.G., et al., eds . , 1985, Affinity Chromatography: A practical approach, IRL Press, Oxford, adn Scouten, .H., 1981, Affinity Chromatography, Wiley Interscience, New York), "Immbolized Affinity Ligand Techniques" by Hermanson et al., Academic Press, Inc., San Diego, 1992) . El soporte sólido biocompatible puede generar derivados (se puede activar) para formar una sustancia reactiva que puede reaccionar con uno o más grupos químicos funcionales dentro del polipéptido de HRS para de esta manera formar un enlace covalente químico para acoplar el polipéptido de HRS al soporte sólido biocompatible. De esta manera, los materiales que comprenden grupos hidroxilo, amino, amida, carboxilo o tiol se pueden activar o formar derivados utilizando diversas sustancias activantes químicas, por ejemplo, sustancias químicas tales como bromuro de cianógeno, divinilsulfona, epiclorohidrina, bisepoxiranos, dibromopropanol, dialdehído glutárico, carbodiimidas , anhídridos, hidrazinas, peryodatos, benzoquinonas , triazinas, tosilatos, tresilatos y/o iones diazonio, etc.
Los soportes sólidos biocompat ibles activados ejemplarmente específicos para usarse en cualquiera de estos métodos y composiciones incluyen, por ejemplo, CNBr- Sepharose , celulosas tales como Sepharose 4B activada por CNBr (Amersham) o agarosa activada por resina epóxica (Sigma) . Los separadores biocompat ibles (como por ejemplo Sepharose 4 Fast Flow activada con NHS) o sin (como, por ejemplo, Sepharose 4 activada con CNBr) se pueden utilizar y están disponibles comercialmente y métodos para acoplamiento de estos materiales a polipéptidos de HRS son bien conocidos en el ámbito y se pueden optimizar por experimentación sistemática en base en las instrucciones del fabricante.
Los polipéptidos de HRS adecuados para usarse en cualquiera de estos métodos y composiciones ext racorporales incluyen cualquiera de los polipéptidos de HRS enumerados en o derivables de la tabla 1 a la tabla 9 o cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido por un anticuerpo anti-Jo-1. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS se selecciona de HRS de longitud completa, HRS(l-506), HRS(2-506) y HRS(l-60).
POLIPÉPTIDOS DERIVADOS DE HISTIDIL-ARNt SINTETASA Las modalidades de la presente invención se relacionan de manera general con el uso de polipéptidos derivados de histidil -ARNt sintetasa (polipéptidos de HRS) , por ejemplo, como agentes antiinflamatorios, agentes bloqueadores de anticuerpos y/o inmunorreguladores o como proteínas de sustitución. Las histidil-ARNt sintetasa pertenecen a la familia de ARNt sintetasa clase II, las cuales tienen tres motivos de secuencia altamente conservados. Las ARNt sintetasas clase I y II se han reconocido ampliamente como responsables de la unión específica de un aminoácido a su ARNt a fin en una reacción de 2 etapas: el aminoácido (AA) primero es activado por ATP para formar AA-AMP y después se transfiere a un extremo aceptor del ARNt. La histidil-ARNt sintetasa de longitud completa citosólicas típicamente existen ya sea como un homodímero citosólico o una forma mitocondrial empalmada de manera alternativa.
Más recientemente se ha establecido que algunos fragmentos biológicos, o isoformas empalmadas de manera alternativa de histidil-ARNt sintetasas eucarióticas (fisiocrinas o polipéptidos de HRS) o en algunos contextos la sintetasa intacta modulan ciertas vías de señalización de células o tienen propiedades antiinflamatorias. Estas actividades, las cuales son distintas del papel clásico de las AR t sintetasas en síntesis de proteína se denominan de manera colectiva en la presente como "actividades no canónicas". Estas fisiocrinas pueden ser producidas naturalmente por ya sea empalme alternativo o proteólisis y pueden actuar de una manera autónoma de la célula (es decir, dentro de la célula hospedadora) o de una manera no autónoma de la célula (es decir, fuera de la célula hospedadora) para regular una diversidad de mecanismos homeostáticos . Por ejemplo, como se proporciona en la presente invención, los polipéptidos de HRS tales como el fragmento N-terminal de hist idil -ARNt sintetasa (por ejemplo, HRS(l-48), HRS(l-60)) son capaces, por ejemplo, de ejercer una señal ant i inf lamatoria al bloquear la migración de células inflamatorias a los sitios de inflamación activa in vivo. Además, ciertas mutaciones o supresiones (por ejemplo, HRS (1-506)) en relación a la secuencia de polipéptido de HRS de longitud completa confieren actividades aumentadas y/o propiedades farmacológicas mejoradas, estabilidad y/u homogeneidad en comparación con histidil -ARNt sintetasa natural. Las secuencias de ciertos polipéptidos de HRS ejemplares se proporcionan en la tabla DI .
Una cantidad de polimorfismos de nucleótido único (SNP, por sus siglas en inglés) de histidil-AR t sintetasa que se encuentra de modo natural y variantes que se encuentran de modo natural del gen humano han sido secuenciadas y se conocen en el ámbito que son funcionalmente intercambiables, por lo menos parcialmente. Varias de estas variantes de histidil-ARNt sintetasa (es decir, las SNP de histidil-ARNt sintetasa representativas) se muestran en la tabla D2 .
Adicionalmente , homólogos y ortólogos del gen humano existen en otras especies, como se enumera en la tabla D3 y por lo tanto sería materia de rutina seleccionar un aminoácido como se encuentra de manera natural o una variante nucleotídica presente en un NSP u otro homólogo como se encuentra de manera natural en lugar de cualquiera de las secuencias de polipéptidos de HRS humanas enumeradas en las tablas DI, D4 a D6 o D8.
En consecuencia, en cualquiera de los métodos, composiciones de diagnóstico, composiciones terapéuticas y kits de la invención, los términos "polipéptido de HRS " , "proteína de HRS" o "fragmento de proteína de HRS" incluyen las formas tanto las que se encuentran de modo natural como las sintéticas de la histidil-ARNt sintetasa que comprende por lo menos un epítopo el cual reacciona de manea cruzada específicamente con un autoanticuerpo o un linfocito T auto-reactivo de una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa, o posee una actividad no canónica. Estos polipéptidos de HRS incluyen la proteína humana de longitud completa, así como los péptidos de HRS derivados de la proteína de longitud completa enumerada en la tabla DI, así como los que se encuentran de manera natural y otras variantes, por ejemplo, como se describe en o como son derivables a partir de las tablas D2 a D9. En algunas modalidades, el término polipéptido de HRS se refiere a una secuencia polipeptídica derivada de histidil -AR t sintetasa humana (SEC ID NO: 1 en la tabla DI) de una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 aminoácidos.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS no 0 compite de modo significativo por unión a autoanticuerpos asociados a la enfermedad con histidil-ARNt sintetasa natural en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 1 a 5 x 10"7M o mayor. En consecuencia, en algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una afinidad menor por 5 autoanticuerpo asociado a enfermedad en comparación con histidil-ARNt sintetasa natural (SEC ID NO: 1) medido en una prueba de ELISA competitiva. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una afinidad aparente por el autoanticuerpo asociado a enfermedad Q el cual es por lo menos aproximadamente 10 veces menor, o por lo menos aproximadamente 20 veces menor, o por lo menos aproximadamente 50 veces menor, o por lo menos aproximadamente 100 veces menor que la afinidad del autoanticuerpo asociado a enfermedad con la forma humana c- natural (SEC ID NO : 1) .
POLIPÉPTIDOS DE HR5 MODIFICADOS Y VARIANTES Así, la totalidad de estos homólogos, ortólogos e isoformas como se encuentran de modo natural o sintéticas de histidil -AR t sintetasa (por ejemplo, cualquiera de las proteínas o sus ácidos nucleicos correspondientes enumerados en o derivables de las tablas DI a D9) están incluidos en cualquiera de los métodos, kits y composiciones de la invención. En algunos aspectos, tales polipéptidos de HRS retienen por lo menos un epítopo el cual la reacción cruzada específicamente con un autoanticuerpo o linfocito T auto-reactivo de un sujeto con una enfermedad asociada con autoanticuerpos a histidil-ARNt sintetasa y/o posee una actividad no canónica. Los polipéptidos de HRS pueden estar en su forma nativa, es decir, como diferentes variantes como aparecen en la naturaleza en diferentes especies las cuales pueden ser consideradas como variantes funcionalmente equivalentes de histidil-ARNt sintetasa humana o pueden ser derivados naturales f ncionalmente equivalentes de los mismos, los cuales pueden diferir en su secuencia de aminoácidos, por ejemplo por corte (por ejemplo, desde la parte N- o C-terminal, o ambas) u otras supresiones, adiciones, inserciones, sustituciones o modificaciones post-traduccionales de aminoácidos. Los derivados químicos como se encuentran de modo natural incluyen modificaciones post-traduccionales y productos de degradación de cualquier polipéptido de HRS y también se incluyen específicamente en cualquiera de los métodos y composiciones de la invención que incluyen, por ejemplo, las variantes piroglutamilo, isoaspartilo, proteolítica, fosforilada, glucosilada, oxidada, isomerizada y desaminada de un polipéptido de HRS. Los polipéptidos de HRS también pueden estar constituidos de aminoácidos como se encuentran de manera natural y/o aminoácidos que no se encuentran de manera natural, como se describe en la presente.
Además de los péptidos que consisten únicamente de aminoácidos como se encuentran de manera natural, los peptidomiméticos o análogos peptídicos también se proporcionan. Los análogos peptídicos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellas del péptido plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos" (Luthman, et al., A Texbook of Drug Design and Development, 14:386-406, segunda edición, Harwood Academic Publishers (1996) ; Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 33:1699-1720 (1994); Fauchere, J. , Adv. Drug Res., 15:29(1986); Veber and Freidinger TINS, p. 392 (1985); y Evans, et al., J. Med, Chem. 30:229 (1987)). Un peptidomimético es una molécula que imita la actividad biológica de un péptido pero que ya no tiene una naturaleza química peptídica. Los compuestos peptidomiméticos se conocen en el ámbito y se describen, por ejemplo, en la patente U.S. número 6,245,886. En ciertas modalidades, los polipéptidos de HRS pueden estar constituidos parcial o completamente de D-aminoácidos , por ejemplo, para incrementar la resistencia a degradación de proteínas in vivo (véase, por ejemplo, Wade et al., PNAS USA. 87:4761-4765, 1990; Hayry et al., FASEB Journal. 9:1336-44, 1995; Van Regenmortel and Muller, Curr. Opin. Biotech. 9:377-82, 1998; Navab et al., Circulation. 105:290-292, 2002; Tugyi et al., PNAS USA. 102:412-418, 2005; y Solicitud U.S. número 2004/00086988; véase también Taylor et al., Biochemistry, 49:3261-72, 2010; for retro- inverso-D-peptides: y véase también Dedkova et al., Biochemistry. 45:15541-51, 2006 for modified bacterial ribosomas that are capable of producing recombinant proteins with increased D-amino acids) .
Se conoce en la técnica modificar sintéticamente las secuencias de proteínas o péptidos y al mismo tiempo retener su actividad útil, y esto se puede llevar a cabo utilizando técnicas las cuales son convencionales en el ámbito y se describen ampliamente en la literatura, por ejemplo mutagénesis aleatoria o dirigida a sitio, escisión y ligación de ácidos nucleicos o por medio de síntesis química o modificación de aminoácidos o cadenas polipeptídicas . Similarmente , esta dentro de la habilidad en el ámbito corregir y/o mitigar preocupaciones de inmunogenicidad si surgen utilizando un polipéptido de HRS o variante del mismo, por ejemplo mediante el uso de programas de reconocimiento automatizados por computadora para identificar potenciales epítopos de linfocitos T y enfoques de evolución dirigida para identificar formas menos inmunogénicas .
Como se indica en lo anterior, las modalidades de la presente invención incluyen todos los homólogos, ortólogos e isoformas como se encuentran de modo natural de histidil-AR t sintetasa (por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas en o derivables de las tablas DI a D9 o sus ácidos nucleicos correspondientes) y "variantes" de estos polipéptidos de referencia de HRS. La mención de polipéptido "variantes" se refiere a polipéptidos que se diferencian de un polipéptido de HRS de referencia por la adición, supresión y/o sustitución de por lo menos un residuo aminoácido y el cual típicamente retiene (por ejemplo imita) o modula (por ejemplo, antagonista) una o más actividades no canónicas de un polipéptido de HRS de referencia. Las variantes también incluyen polipéptidos que han sido modificados por la adición, supresión y/o sustitución de por lo menos un residuo aminoácido para tener estabilidad mejorada u otras propiedades farmacéuticas.
En ciertas modalidades, una variante de polipéptidos de diferencia de un polipéptido de referencia por una o más sustituciones, las cuales pueden ser conservadoras o no conservadoras, como se describe en la presente y como se conocen en el ámbito. En ciertas modalidades, la variante de polipéptido comprende sustituciones conservadoras y, a este respecto, es bien entendido en el ámbito que algunos aminoácidos se pueden cambiar por otros con propiedades generalmente similares sin por esto cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido .
Los ejemplos específicos de variantes de polipéptido de HRS útiles en cualquiera de los métodos y composiciones de la invención incluyen polipéptidos de HRS de longitud completa o cortes o variantes de empalme de los mismos (por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas en o derivables de las tablas DI a D9) los cuales: i) retienen actividad no canónica detectable y/o retienen por lo menos un epítopo el cual la reacción cruzada específica con un autoanticuerpo o linfocito T auto-reactivo a partir de un sujeto con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa, y ii) tienen una o más inserciones, sustituciones, supresiones y/o cortes adicionales. En ciertas modalidades, un polipéptido variante incluye una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o más identidad de secuencia o similitud con una secuencia correspondiente de un polipéptido de referencia de HRS, como se describe en la presente (por ejemplo, las SEC ID NOS : 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182, o cualquiera de las proteínas enumeradas en, o derivables de las tablas DI a D9) y sustancialmente retiene la actividad no canónica de ese polipéptido de referencia. También se incluyen secuencias que difieren de las secuencias de HRS de referencia con la adición, supresión o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más aminoácidos los cuales retienen las propiedades del polipéptido de HRS de referencia. En ciertas modalidades, las adiciones o supresiones de aminoácidos se producen en el extremo C terminal y/o en el extremo N-terminal del polipéptido de referencia de HRS. En ciertas modalidades, las adiciones de aminoácidos incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más residuos naturales (es decir, a partir del polipéptido de HRS de longitud completa correspondiente) que son proximales al extremo C-terminal y/o al extremo N-terminal del polipéptido de referencia de HRS.
En algunas modalidades, los polipéptidos de HRS comprenden un fragmento polipeptídico de histidil-ARNt sintetasa de longitud completa de aproximadamente 50 a 250 aminoácidos, el cual comprende, consiste o consiste esencialmente de los aminoácidos de la secuencia de polipéptidos de HRS que se establece en una más de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182 o cualquiera de las proteínas enumeradas en o derivables de las tablas DI a D9. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende o consiste esencialmente de residuos 1-141, 1-408, 1-113 o 1-60 de la SEC ID NO: 1. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS es una variante de empalme que comprende, consiste o que consiste esencialmente de los residuos 1-60+175-509, 1-60+211-509 o 1-60+101-509 de la SEC ID NO: 1. En aspectos particulares, el polipéptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente de los residuos 1-48 o 1-506 de la SEC ID NO: 1.
En ciertas modalidades, un polipéptido de HRS de la invención comprende el fragmento activo mínimo de un polipéptido de HRS de longitud completa capaz de modular una actividad antiinflamatoria in vivo o que tiene autoanticuerpos o actividades bloqueadoras de linfocitos T auto-reactivos . En algunos aspectos, el fragmento activo mínimo comprende o consiste esencialmente del dominio HEP (es decir, aproximadamente los aminoácidos 1-43 de la SEC ID NO: 1) . En algunos aspectos, el fragmento activo mínimo comprende o consiste esencialmente del dominio de aminoacilación (por ejemplo, aproximadamente los aminoácidos 54-398 de la SEC ID NO: 1) . En algunos aspectos, el fragmento activo mínimo comprende o consiste esencialmente de un dominio que une anticodón (por ejemplo, aproximadamente aminoácidos 406-501 de la SEC ID NO: 1) . Otros fragmentos activos ejemplares se muestran en la tabla D4 a continuación.
En ciertas modalidades, los fragmentos activos mínimos pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o la totalidad de 29 aminoácidos de un enlazante flexible que conecta el dominio mínimo con una proteína heteróloga o variante de empalme .
Sin desear unirse a teoría alguna, la orientación o conformación únicas del dominio WHEP en ciertos polipéptidos de HRS puede contribuir a actividades mejoradas no canónicas y/o de bloqueo de anticuerpos observadas en estas proteínas.
Las frases "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprende "una secuencia 50% idéntica a", como se utilizan en la presente, se refieren al grado en que estas secuencias son idénticas, en una base nucleotídica por nucleótido o una base aminoácido por aminoácido sobre un intervalo de comparación. De esta manera, un "porcentaje de identidad de secuencias" se puede calcular al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima sobre el intervalo de comparación, determinar el número de posiciones a las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se presenta en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes con el número total de posiciones en el intervalo de comparación (es decir, el tamaño del intervalo) y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Los términos usados para describir relaciones de secuencia entre dos o más polipéptidos incluyen "secuencias de referencias", "intervalo de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de por lo menos 12 pero con frecuencia 15 a 18 y con frecuencia por lo menos 25 unidades monoméricas, que incluyen nucleótidos y residuos aminoácidos. Debido a que dos polipép idos pueden comprender cada uno: (1) una secuencia (es decir, únicamente una porción de la secuencia de polipéptidos completa) que es similar entre los dos polipéptidos, y (ii) una secuencia que es divergente entre los dos polipéptidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polipéptidos típicamente se realizan al comparar secuencias de los dos polipéptidos sobre un "intervalo de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Un "intervalo de comparación" se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, de manera más habitual de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el cual una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. El intervalo de comparación puede comprender adiciones o supresiones (por ejemplo, separaciones) de aproximadamente 20% o menos en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alineación de un intervalo de comparación se puede llevar a cabo por implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI , USA) o por inspección y por mejor alineación (es decir, que resulta del mayor porcentaje de homología sobre el intervalo de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También se puede hacer referencia a la familia de programas BLAST como por ejemplo los descritos por Alstchul et al., 1997, Nucí. Acids Res. 25:3389. Una discusión detallada de los análisis de secuencia se puede encontrar en la unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, capítulo 15.
Los cálculos de similitud de secuencia o de identidad de secuencia entre secuencias (los términos se utilizan de manera intercambiable en la presente) se pueden realizar como sigue. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se pueden alineara para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, las separaciones de pueden introducir en uno o ambos del primero y segundo aminoácidos o secuencia de aminoácidos para alineación óptima y secuencias no homologas se pueden desechar para propósitos de comparación) . En ciertas modalidades, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es por lo menos 30%, preferiblemente por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 50%, 60% e incluso de manera más preferible por lo menos 70%, 80%, 90% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes después se comparan. Cuando una posición a la primera secuencia es ocupada por el mismo residuo aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en consideración el número de separaciones y la longitud de cada separación, la cual necesita ser introducida para alineación óptima de las dos secuencias .
La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático. En algunas modalidades, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48:444-453) el cual ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de programas GCG, utilizando la matriz ya sea Blossum 62 o una matriz PAM250, y una ponderación de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra modalidad preferida adicional, el porcentaje de identidad entre dos secuencias nucleotídicas se determina utilizando el programa GAP en el paquete de programas GCG utilizando una matriz NWSgapdna . CMP y una ponderación de separación de 40, 50, 60, 70 u 80 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Otro conjunto ejemplar de parámetros incluye la matriz de calificación Blossum 62 con un castigo de separación de 12, un castigo de extensión de separación de 4 y un castigo de separación de desplazamiento de marco de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y . Miller (1989, Cabios, 4:11-17) el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando la tabla de residuo de ponderación PAM120, un castigo de longitud de separación de 12 y un castigo de separación de 4.
La secuencia de ácido nucleico y la proteína que aquí se describen se pueden utilizar como una "secuencia indagadora" para realizar una investigación acerca de bases de datos públicas para identificar, por ejemplo, otros miembros de familia o secuencias relacionadas. Estas investigaciones se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al., (1990, J. Mol. Biol, 215:403-10). Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, calificaciones = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias nucleotídicas homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas por BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, calificación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a moléculas de proteína de la invención. Las alineaciones con separaciones que se obtengan para propósitos de comparación, Gapped BLAST se pueden utilizar como se describe en Altschul et al. (Nucleic Acid Res. 25:3389-3402, 1997) . Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros implícitos de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) .
En ciertas modalidades, los polipéptidos variantes difieren de las secuencias de referencia de HRS correspondientes en por lo menos 1%, pero menos de 20%, 15%, 10% o 5% de los residuos. Si esta comparación requiere alineación, las secuencias se pueden alinear para similitud máxima. Las secuencias "saltadas" de las supresiones o inserciones o malos pareamientos se consideran diferencias. Las diferencias son, de manera adecuada, se consideran como diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitución conservadora. En ciertas modalidades, el peso molecular de un polipéptido de HRS variante difiere del de un polipéptido de referencia de HRS en aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 1 3%,1 4%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% o más.
También se incluyen "fragmentos" biológicamente activos de los polipéptidos de referencia de HRS, es decir, fragmentos biológicamente activos de los fragmentos de proteína de HRS. Los fragmentos biológicamente activos representativos generalmente participan en una interacción, por ejemplo, una interacción intramolecular o intermolecular. Una interacción intermolecular puede ser entre una interacción de unión específica o una interacción enzimática. Una interacción intermolecular puede ser un polipéptido de HRS y un asociado de unión celular, tal como un receptor celular u otra molécula hospedadora que participa en la actividad no canónica del polipéptido de HRS.
Un fragmento biológicamente activo del polipéptido de referencia de HRS puede ser un fragmento de polipéptido el cual tiene , por ej emplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70. 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 321, 322 , 323 , 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332 , 333 , 334 , 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363 , 364, 365, 380, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507 o 508 o más aminoácidos contiguos o no contiguos, que incluyen todos los enteros (por ejemplo, 101, 102, 103) e intervalos (por ejemplo, 50-100, 50-150, 50-200) entre estos, de las secuencias de aminoácidos que se establecen en cualquiera de los polipéptidos de HRS de referencia que aquí se describen. En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo comprende una secuencia, dominio o motivo relacionado con la actividad no canónica. En ciertas modalidades, la región C-terminal o N-terminal de cualquier polipéptido de referencia HRS puede estar truncado en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más aminoácidos o en aproximadamente 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500 o más aminoácidos, que incluyen todos los números enteros e intervalos entre estos (por ejemplo 101, 102, 103, 104, 105) y así de largos en la medida en que el polipéptido de HRS truncado retenga la actividad no canónica del polipéptido de referencia. Ciertos polipéptidos de HRS truncados ejemplares se muestran en la tabla 5 a continuación.
Típicamente, el fragmento biológicamente activo tiene no menos de aproximadamente 1%, 10%, 25% o 50% de una actividad del polipéptido de referencia de HRS biológicamente activo (es decir, actividad no canónica) del cual se deriva. Los métodos ejemplares para medir estas actividades no canónicas se describen en los ejemplos.
En algunas modalidades, las proteínas de HRS, variantes y fragmentos biológicamente activos de los mismos se unen a uno o más asociados de unión celulares con una afinidad de por lo menos aproximadamente 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 40, 50, 100 o 150 nM. En algunas modalidades, la afinidad de unión de un fragmento de proteína de HRS para un asociado de unión celular seleccionado, particularmente un asociado de unión que participa en una actividad no canónica, puede ser más fuerte que la de un polipéptido de HRS de longitud completa correspondiente o una variante de polipéptido de HRS empalmada alternativamente específica en por lo menos aproximadamente 1.5x, 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, lOx, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, lOOOx o mayor (que incluye todos los enteros entre los mismos) .
Como se indicó en lo anterior, un polipéptido de HRS puede estar alterado de diversas maneras que incluye sustituciones, supresiones, cortes e inserciones de aminoácidos. Los métodos para estas manipulaciones generalmente se conocen en el ámbito. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia de HRS se pueden preparar por mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones en la secuencia de nucleótidos son bien conocidas en el ámbito. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985, PNAS USA. 82:488-92), Kunkel et al, (1987, Methods in Enzymol, 154:367-382), patente U.S. número 4,873,192, Watson, J. D. et al. (Molecular Biology of the Gene", Fourth Edition, Benj amin/Cummings , Menlo Park, Calif., 1987) y las referencias mencionadas en estos documentos. Las guías respecto a las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden encontrar en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
Los polipéptidos de HRS biológicamente activos cortados y/o variantes pueden contener sustituciones conservadoras de aminoácidos en diversas ubicaciones a lo largo de su secuencia en comparación con un residuo de aminoácido de HRS de referencia de manera tal que las sustituciones adicionales pueden incrementar aún más la actividad o estabilidad de los polipéptidos de HRS con un contenido alterado de cisteína. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la cual el residuo aminoácido es sustituido con un residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en el ámbito, las cuales generalmente se pueden subclasificar como SÍgUe: Ácidos: Los residuos tienen una carga negativa debido a la pérdida del ión H a pH fisiológico y el residuo es atraído por soluciones acuosas de manera que buscan las posiciones en la superficie en la conformación de un péptido en el cual están contenidos cuando el péptido está en un medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral ácida incluyen ácido glutámico y ácido aspártico .
Básicos: El residuo tiene una carga positiva debido a la asociación con un ión H a pH fisiológico o dentro de una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina) y un residuo es atraído por solución acuosa de manera que busca las posiciones en la superficie en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral básica incluyen arginina, lisina e histidina .
Cargados: Los residuos están cargados a pH fisiológico y por lo tanto incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas o básicas (es decir, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina e histidina) .
Hidrofóbicos : Los residuos no están cargados a pH fisiológico y los residuos son repelidos por solución acuosa de manera que buscan posiciones interiores en la conformación de un péptido en el cual están contenidos cuando el péptido está en un medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrofóbica incluyen tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y triptofano.
Neutros/polares: Los residuos no están cargados a pH fisiológico, pero el residuo no es repelido suficientemente por soluciones acuosas de manera que busca posiciones internas en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales neutras/polares incluyen asparagina, glutamina, cisteína, histidina, serina y treonina.
Esta descripción también caracteriza ciertos aminoácidos como "pequeños" puesto que sus cadenas laterales no son suficientemente grandes, incluso si carecen de grupos polares para conferirles hidrofobicidad. Con la excepción de la prolina, los aminoácidos "pequeños" son aquellos con cuatro carbonos o menos cuando por lo menos un grupo polar está en la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral pequeña incluyen glicina, serina y treonina. El aminoácido secundario codificado por genes prolina es un caso especial debido a sus efectos conocidos sobre la conformación secundaria de las cadenas peptídicas. La estructura de prolina difiere de todos los demás aminoácidos como se encuentran de manera natural en que su cadena lateral está unida al nitrógeno del grupo a-amino, así como al carbono a. Varias matrices de similitud de aminoácidos se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, la matriz PA 120 y la matriz PAM250 como se describe, por ejemplo, por Dayhoff et al., 1978, A model of evolutionary change in proteins) . Matrices para determinar relaciones de distancia en M. O. Dayhoff, (ed) , Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp. 345-358, National Bioraedical Research Foundation, Washington DC; y por Gonnet et al., (Science, 256:14430-1445, 1992), no obstante, incluye a prolina en el mismo grupo que glicina, serina, alanina y treonina. En consecuencia, para propósitos de la presente invención, la prolina se clasifica como un aminoácido "pequeño" .
El grado de atracción o repulsión requerido para clasificación como polar o no polar es arbitrario y por lo 0 tanto los aminoácidos contemplados específicamente por la invención han sido clasificados como uno u otro. La mayor parte de los aminoácidos no mencionados específicamente se pueden clasificar en base en su comportamiento conocido.
Los residuos aminoácidos pueden ser subclasificados adicionalmente como cíclicos o no cíclicos y aromáticos o no aromáticos, las clasificaciones explicativas por si mismas con respecto a los grupos sustituyentes de cadena lateral de los residuos y a si son pequeños o grandes. El residuo se Q considera pequeño si contiene un total de cuatro átomos de carbonos o menos, incluyendo el carbono carboxilo, con la condición de que esté presente un sustituyente polar adicional, tres o menos si no. Los residuos pequeños, por supuesto, siempre son no aromáticos. Dependiendo de sus c propiedades estructurales, los residuos aminoácidos se pueden encontrar en dos o más clases. Para los aminoácidos de proteínas que se encuentran de modo natural, la subclasificación de acuerdo con este esquema se presenta en la tabla A.
TABLA A: SUBCLASIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS La sustitución conservadora de aminoácidos también incluye agrupamientos basados en cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que la sustitución de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto mayor sobre las propiedades del polipéptido variante resultante. Ya sea que un cambio de aminoácido resulte en un polipéptido de HRS funcional cortado y/o variante, se puede determinar fácilmente al analizar su actividad no canónica, como se describe en la presente. Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla B bajo el encabezado de sustituciones ejemplares. Las sustituciones de aminoácidos que se encuentran dentro del alcance de la invención en general están acompañadas por sustituciones de selección que no difieren de modo significativo en su efecto al mantener: (a) una estructura de la estructura principal peptídica en el área de sustitución, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula del sitio objetivo, (c) el volumen de la cadena lateral, o (d) la función biológica. Después de que se introducen las sustituciones, las variantes son cribadas para determinar actividad biológica.
TABLA B: SUSTITUCIONES EJEMPLARES DE AMINOÁCIDOS De manera alternativa, los aminoácidos similares para realizar sustituciones conservadoras se pueden agrupar en tres categorías basadas en la identidad de las cadenas laterales. El primer grupo incluye ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina, histidina, todas las cuales tienen cadenas laterales cargadas; el segundo grupo incluye glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, glutamina, asparagina; y el tercer grupo incluye leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina como se describe en Zubay, F., Biochemistry, tercera edición, Wm.C. Brown Publishers (1993) .
La estructura de RMN del dominio WHEP de HRS humana ha sido determinado (véase Nameki et al., acceso 1X59_A) . Además, se han determinado también las estructuras cristalinas de HRS humana de longitud completa y un mutante con supresión del dominio catalítico interno de HRS (HRSACD) (véase Xu et al., Structure. 20:1470-7, 2012; y solicitud U.S. número 61/674,639). En conjunción con la secuencia de aminoácidos primaria de HRS, estas descripciones físicas detalladas de la proteína proporcionan antelación precisa en los papeles reproducidos por aminoácidos específicos dentro de la proteína. Las personas expertas en el ámbito de esta manera pueden utilizar esta información para identificar dominios conservados estructuralmente, regiones de enlace, estructuras secundarias tales como hélices alfa, aminoácidos en superficie o expuestos a disolventes, regiones no expuestas o internas, sitios catalíticos y superficies que interactúan con ligandos, entre otros rasgos estructurales. Estas personas pueden de este modo utilizar esta y otra información para manipular fácilmente variantes de HRS que retienen o mejoran la actividad no canónica de interés, por ejemplo al conservar o alterar las características de los residuos aminoácidos dentro o adyacentes a estos u otros rasgos estructurales, por ejemplo por conservación o alteración de la polaridad, índice de hidropatía, carga, tamaño y/o ubicación (es decir, hacia adentro, hacia fuera) de una o varias cadenas laterales de aminoácidos seleccionados en relación a los residuos naturales (véase, por ejemplo Zaiwara et al., Mol Biotechnol . 51:67-102, 2012; Perona y Hadd, Biochemistry. 51:8705-29, 2012; Morin et al., Trends Biotechnol 29:159-66, 2011; Collins et al., Annu. Rev. Biophys. 40:81-98, 2011; y solicitud U.S. número 61/674,639).
Por lo tanto, un residuo aminoácido no esencial predicho en un polipéptido de HRS truncado y/o variante típicamente se sustituye con otro residuo aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia que codifica para HRS, por ejemplo mediante mutagénesis de saturación y los mutantes resultantes se pueden cribar para una actividad del polipéptido original para identificar mutantes los cuales retienen actividad. Después de mutagénesis de las secuencias codificantes, el péptido codificado se puede expresar recombinantemente y la actividad del péptido se puede determinar. Un residuo aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado de la secuencia de referencia de un polipéptido de modalidad sin abolir o alterar sustancialmente una o más de sus actividades no canónicas. De manera adecuada, la alteración no elimina sustancialmente una de estas actividades, por ejemplo, la actividad es por lo menos 20%, 40%, 60%, 70% u 80%, 100%, 500%, 1000% o mayor de la secuencia de HRS de referencia. Un residuo aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando se altera de la secuencia de referencia de un polipéptido de HRS, resulta en la supresión de una actividad de la molécula original de manera que menos de 20% de la actividad de referencia está presente. Por ejemplo, estos residuos aminoácidos esenciales incluyen aquellos que están conservados en los polipéptidos de HRS a través de diferentes especies, que incluyen aquellas secuencias que están conservadas en uno o varios sitios de unión activos o uno o varios motivos de los polipéptidos de HRS a partir de diversas fuentes.
Los análisis para determinar actividad antiinflamatoria, que incluye mediciones habituales de liberación de citocina basados a partir de células in vitro y estudios en animales están bien establecidos en el ámbito (véase, por ejemplo, Wittmann et al., J Vis Exp. (65) :e4203, doi: 10.3791/4203, 2012; Feldman et al., Mol. Cell. 47:585-95, 2012; Clutterbuck et al., J Proteomics . 74:704-15, 2011, Giddings and Maitra, J Biomol Screen. 15:1204-10, 2010; Wijnhoven et al., Glycoconj J. 25:177-85, 2008; y Frow et al., Med Res Rev. 24:276-98, 2004) y se pueden utilizar fácilmente para determinar el perfil y optimizar actividad antiinflamatoria. Por lo menos un sistema experimental in vivo ejemplar se describe en los ejemplos anexos.
Ciertos polipéptidos de HRS pueden tener una o más sustituciones cisteína, en donde uno o más residuos que se encuentran de modo natural (diferentes de cisteína) son sustituidos con cisteína, por ejemplo, para alterar las características de estabilidad o pK, facilitar la unión basada en tiol de moléculas de PEG, etc. En algunas modalidades, las sustituciones de cisteína están cerca de la parte N-terminal y/o C-terminal del polipéptido de HRS (por ejemplo, las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182) u otras regiones expuestas de la superficie de un polipéptido de HRS. Las modalidades particulares incluyen en donde uno o más residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos en relación a la parte N terminal y/o C-terminal de cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182 están sustituidas con un residuo cisteína. En algunas modalidades, los residuos cisteína pueden ser agregados al polipéptido de HRS a través de la creación de proteína de fusión en la parte N o C-terminal. Estas proteínas de fusión pueden ser de cualquier longitud pero típicamente serán de aproximadamente 1-5 o aproximadamente 5-10, o aproximadamente 10 a 20 o aproximadamente 20 a 30 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, se prefiere la fusión a la parte C-terminal.
Las modalidades ejemplares específicas de tales proteínas modificadas con cisteína se muestran en la tabla D6, en base en el polipéptido de HRS, HRS(l-60). Este enfoque es aplicable directamente a los polipéptidos de HRS de la tabla 5 y otros polipéptidos de HRS descritos en la presente.
En algunas modalidades, la inserción o sustitución de uno o varios residuos cisteína en el polipéptido de HRS se puede combinar con la eliminación de otros residuos de cisteina expuestos en la superficie. En consecuencia, en algunas modalidades, el polipéptido de HRS puede comprender una o más sustituciones y/o supresiones en Cys83, Cysl74, Cysl91, Cysl96, Cys224, Cys235, Cys379, Cys455, Cys507 y/o Cys509 (como se define por la SEC ID NO: 1) , por ejemplo, para remover residuos cisteina como se encuentran de modo natural .
Las modalidades específicas incluyen cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182 o variantes de las mismas que tienen una mutación o supresión en cualquiera de uno o más de Cys83, Cysl74, Cysl91, Cysl96, Cys224, Cys235, Cys379, Cys455, o la supresión de Cys507 y Cys509, por ejemplo, por la supresión de los tres aminoácidos en la parte C-terminal (?507-509) . Las mutaciones ejemplares en estas posiciones incluyen, por ejemplo, la mutación de cisteina a serina, alanina, leucina, valina o glicina. En ciertas modalidades, los residuos aminoácidos para sustituciones de cisterna específica se pueden seleccionar de sustituciones como se producen de manera natural que se encuentran en ortólogos de HRS a partir de otras especies de organismos. Las sustituciones ejemplares de este tipo se presentan en la tabla D7.
En algunas modalidades, los residuos cisteína como se encuentran de manera natural que se seleccionan para mutagénesis se identifican o seleccionan en base en su exposición en la superficie. En consecuencia, en algunos aspectos, los residuos cisteína seleccionados para sustitución se seleccionan de Cys224, Cys235, Cys507 y Cys509. En algunas modalidades los últimos tres residuos (C-terminal) de la SEC ID NO: 1 están suprimidos de manera que suprime los residuos 507 a 509. En algunas modalidades, las cisteínas se seleccionan para mutación o supresión eliminen un par de cisteína intramolecular, por ejemplo Cysl74 y Cysl91.
Los ejemplos adicionales específicos de mutaciones/sustituciones de cisteína deseadas (indicadas en negrillas y subrayado) para reducir residuos cisteína expuestos en la superficie se incluyen los que se enumeran en lo siguiente, en la tabla D8.
En algunas modalidades, estos mutantes sustituidos con cisteína se modifican para manipulación, inserción o introducción de alguna otra manera de un residuo cisteína expuesto en la superficie nueva en una posición expuesta a la superficie definida, en donde el residuo introducido no interfiere sustancialmente con la actividad no canónica del polipéptido de HRS. Los ejemplos específicos incluyen, por ejemplo, la inserción (o inserción nuevamente) de residuos cisteína adicionales en la parte N o C-terminal de cualquiera de los polipéptidos de HRS de cisteína reducida descritos en lo anterior. En algunas modalidades, la inserción de las cisteínas expuestas en la superficie N o C-terminales involucra la reinserción de el último 1, los últimos 2 o los últimos 3 aminoácidos C-terminales como se encuentran de manera natural de HRS humana de longitud completa a una variante de cisteína reducida de un polipéptido de HRS, por ejemplo la reinserción de la totalidad o parte de la secuencia CIC (Cys lie Cys) . Los mutantes de cisteína reducidos ejemplares incluyen, por ejemplo, cualquier combinación de mutaciones (o la supresión de) en los residuos Cys174, Cysl91, Cys224 y Cys235 y/o la supresión o sustitución de Cys507 y Cys509 (en base en la numeración de HRS humana de longitud completa (SEC ID NO: 1) en cualquiera de los polipéptidos de HRS de las SEC ID NOS: 1-106, 131-133, 137-143, 178, 180, 182, 184 o 186-195 o cualquiera de los polipéptidos de HRS enumerados en o derivables de las tablas DI a D9.
En diversas modalidades, la presente invención contempla modificaciones en cualquier posición de aminoácido en un polipéptido de HRS en virtud de sustitución de un aminoácido que no se encuentra de modo natural que opcionalmente comprende un grupo funcional . Los aminoácidos no naturales se pueden insertar o sustituir, por ejemplo, en uno o más residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 aminoácidos en relación a la parte N-terminal y/o C-terminal de cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 ó 176-182 (o cualquiera de los polipéptidos de HRS enumerados o derivables de las tablas DI a D9) ; en la parte N-terminal y/o C-terminal de cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23. 39, 41. 43, 70-71, 74-153, 160-172, ó 176-182 (o cualquiera de los polipéptidos de HRS enumerados en o derivables de las tablas DI a D9) ; o un residuo de aminoácido de superficie accesible con disolvente, como se describe en la presente.
En modalidades particulares, los aminoácidos que no se encuentran de modo natural incluyen, sin limitación cualquier aminoácido, aminoácido modificado o análogo de aminoácido diferente a selenocisteína y los siguientes veinte alfa-aminoácidos codificados genéticamente: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina. La estructura genérica de un alfa-aminoácido se ilustra por la siguiente fórmula: Un aminoácido no natural típicamente es cualquier estructura que tiene la fórmula precedente en donde el grupo R es cualquier sustituyente diferente de uno utilizado en los veinte aminoácidos naturales. Véase, por ejemplo, textos de bioquímica tales como Biochemistry por L. Stryer, tercera edición 1988, Freeman y Company, New York, para estructuras de los veinte aminoácidos naturales. Nótese que los aminoácidos no naturales descritos en la presente pueden ser compuestos como se encuentran de modo natural diferentes a los veinte alfa-aminoácidos anteriores. Debido a que los aminoácidos no naturales descritos en la presente habitualmente difieren de los aminoácidos naturales en únicamente la cadena lateral, los aminoácidos no naturales forman enlaces amida con otros aminoácidos, por ejemplo, naturales o no naturales de la misma manera en la cual se forman en proteínas como se encuentran de modo natural. No obstante, los aminoácidos no naturales tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R en la fórmula precedente opcionalmente comprende un alquilo, arilo, haluro de arilo, haluro de vinilo, haluro de alquilo, acetilo, cetona, aziridina, nitrilo, nitro, haluro, acilo, ceto, azido, hidoxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tioéter, epóxido, sulfona, ácido borónico, éster boronato, borano, ácido fenilborónico, tiol seleno, sulfónilo, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, piridilo, naftilo, benzofenona, un anillo restringido tal como ciclooctina, tioéster, enona, imina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, ácido carboxílico, ácido alfa-ceto carboxílico, ácidos alfa o beta insaturados y amidas, glioxilamida, o un grupo órganosilaño o similar o cualquier combinación de los mismos.
Los ejemplos específicos de aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a p-acetil-L- fenilalanina, O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una ?-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri -O-acetil -GlcNAcP-serina , ß-0-GlcNAc-L-serina, una tri-O-acetil-GalNAc-a-treonina, una a-GalNAc-L-treonina, una L-dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acilo-L- fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina , una fosfonotirosina , una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, las enumeradas más adelante o en otra parte en la presente, y similares.
En consecuencia, uno puede seleccionar un aminoácido que no se encuentre de modo natural que comprenda un grupo funcional que forme una unión covalente con cualquier grupo funcional preferido de porción heteróloga, por ejemplo una porción PEG. Los aminoácidos no naturales, una vez seleccionados, pueden ser adquiridos de vendedores o se pueden sintetizar químicamente. Cualquier número de aminoácidos no naturales se pueden incorporar en la molécula objetivo y pueden variar de acuerdo con el número de polímeros hidrosolubles deseados, por ejemplo, porciones PEG que se van a unir. Las porciones se pueden unir a la totalidad o solo a una parte de los aminoácidos naturales. Además, aminoácidos no naturales iguales o diferentes se pueden incorporar en un polipéptido de HRS, en base en el resultado deseado. En ciertas modalidades, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos no naturales se incorporan en un polipéptido de HRS cualquiera o la totalidad de los cuales puede estar conjugado a una porción heteróloga que comprende un grupo funcional deseado.
Ciertas modalidades de la presente invención también contemplan el uso de polipéptidos de HRS modificados que incluyen modificaciones que mejoran las características deseadas de un polipéptido de HRS, como se describe en la presente. Las modificaciones de polipéptidos de HRS de la invención incluyen generación de derivados químicos y/o enzimáticos en uno o más aminoácidos constitutivos que incluyen modificaciones en las cadenas laterales, modificaciones en la estructura principal y modificaciones en las partes N y C-terminal que incluyen acetilación, hidroxilación, metilación, amidación, y la unión de proteínas de fusión, porciones de carbohidratos o lípidos, cofactores, la sustitución de D aminoácidos y similares. Las modificaciones ejemplares también incluyen PEGilación de un polipéptido de HRS (véase, por ejemplo, Veronese y Harris, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 453-456, 2002; y Pasut et al., Expert Opinión. Ther. Patents 14(6) 859-894 2004, ambos incorporados en la presente como referencia ) . En algunas modalidades, los polipéptidos de HRS PEGilados comprenden una mutación para agregar o quitar una cisteína endógena, para habilitar el acoplamiento selectivo vía una cisteína exógeno, endógena u otro residuo.
PEG es un polímero bien conocido que tiene propiedades de solubilidad en agua y en muchos disolventes orgánicos, carencia de toxicidad y carencia de inmunogenicidad. También es transparente, incoloro, inoloro y químicamente estable. Por estos motivos y otros, se ha seleccionado a PEG como el polímero preferido para unión, pero se ha utilizado únicamente con propósitos de ilustración y no como limitación. Se pueden obtener productos similares con otros polímeros hidrosolubles que incluyen, sin limitación, alcohol polivinílico, otros poli (óxidos de alquileno) tales como poli (propilenglicol) y similares, poli (polioles etoxilados) tales como poli (glicerol oxietilado) y similares, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, etileno/anhídrido maléico y poliaminoácidos . Una persona experta en el ámbito será capaz de seleccionar el polímero deseado en base en la dosificación deseada, tiempo de circulación, resistencia a proteólisis y otras consideraciones.
En particular, una amplia variedad de derivados de PEG están disponibles y son adecuados para usarse en la preparación de conjugados de PEG. Por ejemplo, los reactivos de PEG de NOF Corp vendidos bajo la marca comercial serie SUNBRIGHTMR proporcionan numerosos derivados de PEG que incluyen metoxipolietilenglicoles y derivados de PEG activados tales como metoxi-PEG aminas, maleimidas, ásteres de N-hidroxisuccinimida y ácidos carboxílicos para acoplamiento de diversos métodos a la parte N-terminal, C-terminal o cualquier aminoácido interno del polipéptido AARS . La tecnología de PEGilación de Nektar Therapeutics Advanced también proporciona diversas tecnologías de acoplamiento de PEG para mejorar potencialmente la seguridad y eficacia de una sustancia terapéutica basada en el polipéptido de HRS .
Las patentes, solicitudes de patente publicadas y publicaciones relacionadas también proporcionan a aquellos expertos en el ámbito lectura de esta descripción con posibles tecnologías de acoplamiento de PEG significativas y derivados de PEG. Véanse, por ejemplo, en las patentes US Nos. 6,436,386; 5,932,462; 5,900,461; 5,824,784; y 4,904,584; el contenido de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad, que describen estas tecnologías y derivados y métodos para su elaboración.
En ciertos aspectos, la tecnología de ligación quimioselectiva se puede utilizar para modificar polipéptidos de HRS de la invención, por ejemplo mediante unión de polímeros de una manera especifica de sitio y controlada.
Esta tecnología habitualmente se basa en la incorporación de anclas quimioselectivas en la estructura principal de la proteína ya sea por medios químicos o recombinantes y modificación subsecuente con un polímero que presenta un enlazante complementario. Como resultado, se puede controlar el proceso de ensamblado y la estructura covalente del conjugado resultante proteína-polímero, lo que permite la optimización razonada de propiedades de fármacos tales como propiedades de eficacia y farmacocinéticas (véase, por ejemplo, Kochendoerfer, Current Opinión in Chemical Biology 9 : 555-560, 2005) .
En otras modalidades, también se incluyen proteínas de fusión del polipéptido de HRS a otras proteínas y estas proteínas de fusión pueden modular la actividad lógica del polipéptido de HRS, su secreción, antigenicidad, direccionamiento, vida biológica, capacidad de penetrar membranas celulares o la barrera hematoencefálica o propiedades farmacocinéticas . Los ejemplos de proteína de fusión que mejoran las propiedades farmacocinéticas ("modificadores de PK" ) incluyen, sin limitación, fusiones a albúmina humana (Osborn et al.: Eur. J. Pharmacol . 456(1-3): 149-158, (2002)), dominios Fe de anticuerpo, secuencias poli Glu o poli Asp y transíerrina . Adicionalmente , la fusión con secuencias de polipéptidos desordenados conformacionalmente constituidos de los aminoácidos Pro, Ala y Ser ( "PASilación" ) o hidroxietil almidón (vendido bajo la marca comercial HESYLATIONMR) proporciona una manera sencilla de incrementar el volumen hidrodinámico del polipéptido de HRS . Esta extensión adicional adopta una estructura aleatoria voluminosa lo cual incrementa de manera significativa el tamaño de la proteína de fusión resultante. Por este medio, la depuración típicamente rápida de polipéptidos de HRS más pequeños por medio de filtración renal se retarda en varios órdenes de magnitud. Adicionalmente , el uso de las proteínas de fusión de IgG también se ha demostrado que alguna proteína o proteínas de fusión penetren la barrera hematoencefálica (Fu et al., (2010) Brain Res. 1352: 208-13).
Los ejemplos de proteínas de fusión que modulan la antigenicidad o propiedades inmunomoduladoras del polipéptido de HRS incluyen fusiones a ligandos de unión de linfocitos T que incluyen, por ejemplo, proteínas clase I y II de CPH, microglobulina b-2, porciones de LFA-3, porciones de la región Fe de la cadena pesada y conjugados y derivados de los mismos. Los ejemplos de estas proteínas de fusión se describen, por ejemplo, en EP 1 964 854, las patentes de US Nos. 5,468,481; 5,130,297; 5,635,363; 6,451,314 y el documento US 2009/0280135.
Adicionalmente, en algunas modalidades, el polipéptido de HRS puede incluir secuencias de señal de secreción sintéticas o como se presentan de modo natural derivadas de otras proteínas secretadas bien caracterizadas. En algunas modalidades, estas proteínas pueden ser procesadas por escisión proteolítica para formar el polipéptido de HRS en el lugar. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS puede comprender sitios de escisión proteolíticos heterólogos para permitir la expresión en el lugar y la producción del polipéptido de HRS ya sea en una ubicación intracelular o extracelular. Otras proteínas de fusión también pueden incluir por ejemplo fusión del polipéptido de HRS a ubiquitina para proporcionar un nuevo aminoácido N-terminal, o el uso de una señal de secreción para mediar niveles altos de secreción del polipéptido de HRS dentro del medio extracelular, o etiquetas de epítopo N o C-terminal para mejorar la purificación o detección.
En ciertos aspectos, el uso de aminoácidos no naturales se puede utilizar para modificar (por ejemplo, incrementar) una actividad no canónica seleccionada de un polipéptido de HRS o para alterar la vida media in vivo o in vitro de la proteína. Los aminoácidos no naturales también se pueden utilizar para facilitar modificaciones químicas (selectivas) (por ejemplo, pegilación) de una proteína de HRS, como se describe en otra parte en este documento. Por ejemplo, ciertos aminoácidos no naturales permiten la unión selectiva de polímeros tales como PEG a una proteína dada, y de esta manera mejoran sus propiedades farmacocinéticas .
Los ejemplos específicos de análogos de aminoácidos y miméticos se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds . Gross y Meinhofer, Vol . 5, p. 341, Academic Press, Inc., New York, N. Y. (1983), el volumen completo de los cuales se incorporan en la presente como referencia. Otros ejemplos incluyen aminoácidos peralquilados , particularmente aminoácidos permetilados . Véase, por ejemplo, Combinatorial Chemistry, Eds. Wilson y Czarnik, Ch. 11, p. 235, John Wiley & Sons Inc., New York, N. Y. (1997), el libro completo del cual se incorpora en la presente como referencia. Otros ejemplos adicionales incluyen aminoácidos cuya porción amida (y por lo tanto la estructura principal amida del péptido resultante) ha sido sustituida, por ejemplo, por un anillo azúcar, esteroide, benzodiazepina o carbociclo. Véase, por ejemplo, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Ed. Manfred E. Wolff, Ch. 15, pp. 619-620, John Wiley & Sons Inc., New York, N. Y. (1995), libro completo el cual se incorpora en la presente como referencia. Los métodos para sintetizar péptidos, polipéptidos , péptido miméticos y proteínas son bien conocidos en el ámbito (véase, por ejemplo, patente U.S. No. 5,420,109; M. Bodanzsky, Principies of Peptide Synthesis (lst ed. & 2d rev. ed.), Springer-Verlag, New York, N. Y. (1984 % 1993) , véase capítulo 7; Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (2d ed.), Pierce Chemical Co. , Rockford, -III. (1984), cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia) . En consecuencia, los polipéptidos de HRS de la presente invención pueden estar constituidos de aminoácidos que se encuentran de modo natural o que no se encuentran de modo natural así como análogos de aminoácidos y miméticos.
En ciertas modalidades, los polipéptidos de HRS modificados o variantes que aquí se describen, por ejemplo, los polipéptidos de HRS con un contenido de cisteína reducido tienen propiedades alteradas (por ejemplo, mejoradas, aumentadas, disminuidas o reducidas) de las propiedades bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas en relación a los polipéptidos de HRS no modificados o no variantes (por ejemplo, HRS humano de longitud completa natural (SEC ID NO: 1) ; un fragmento de HRS correspondiente de la secuencia con los residuos cisteína naturales) bajo condiciones que de otra manera son idénticas o comparables. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante que tiene propiedades alteradas bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas tiene una mutación (por ejemplo, supresión, sustitución) de cualquiera de uno o más de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 y Cys509, como se describe en la presente. En modalidades específicas, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene una mutación de Cys507 y Cys509, por ejemplo, una supresión de los residuos 507-509 (?507-509) . Algunos polipéptidos de HRS modificados o variantes comprenden los residuos 1-506 o 2-506 de la SEC ID NO: 1 (o una variante de la misma) pero carecen de los residuos 507-509 de la SEC ID N0:1 (también denominados como HRS(1-506), HRS (2-506)) y opcionalmente tienen propiedades bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas mejoradas en relación con la HRS humana de longitud completa (SEC ID NO: 1) .
Los ejemplos de propiedades bioquímicas, físicas y farmacocinéticas incluyen, sin limitación actividad biológica absoluta (por ejemplo, actividad no canónica) , estabilidad (por ejemplo vida media, cinética o estabilidad térmica, estabilidad funcional, susceptibilidad a oxidación), claridad (por ejemplo, turbidez, opalescencia) en solución, formación de agregados en solución, homogeneidad o monodispersión en solución (por ejemplo, relación alterada de formas monomérica/dimérica o monomérica/oligomérica, niveles alterados de formación de unión disulfuro intercadena) , inmunogenicidad, reactividad cruzada, unión no específica, expresión mejorada en bacterias tales como E. coli (por ejemplo contaminación de endotoxina reducida, homogeneidad mejorada, homogeneidad de carga mejorada) , rendimiento mejorado de proteína soluble, unión de endotoxina reducida, grado de degradación en solución, biodisponibilidad (la fracción de un fármaco que es absorbida) , distribución de tejido, volumen de distribución (volumen aparente en el cual la droga está distribuida de inmediato después de que ha sido inyectada intravenosamente y equilibrada entre los tejidos plasmáticos y circundantes) , concentración (inicial o concentración en estado estable del fármaco en plasma) , constante de velocidad de eliminación (velocidad a la cual los fármacos son removidos del cuerpo) , velocidad de eliminación (velocidad de infusión requerida para equilibrar la eliminación) , área bajo la curva (ABC; integral de la curva concentración-tiempo, después de una dosis única o en estado estable) depuración (volumen de plasma depurado del fármaco por unidad de tiempo) , Cmax (concentración plasmática pico de un fármaco después de administración oral) , tmax (tiempo para alcanzar Cmax) , Cm n (concentración más baja que alcance el fármaco antes de que se administre la siguiente dosis) y fluctuación (fluctuación pico y valle dentro de un intervalo de dosificación en estado estable) .
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene un perfil de ABC farmacocinético en plasma o suero de por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces mayor o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% mayor que un polipéptido de HRS no modificado o no variante correspondiente cuando se administra a un mamífero.
En algunos aspectos, estas propiedades mejoradas se obtienen sin alterar de manera significativa la estructura secundaria y/o al reducir la actividad biológica no canónica de la variante o del polipéptido de HRS modificado. En realidad, algunos polipéptidos de HRS variantes o modificados tienen actividad biológica no canónica aumentada. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido de HRS modificado o variante tiene actividad biológica aumentada (por ejemplo, absoluta) , en relación a un polipéptido de HRS no modificado no variante bajo condiciones comparables. Las actividades ejemplares incluyen cualquiera de las actividades no canónicas descritas en la presente tales como actividades antiinflamatorias y la capacidad para unirse a anticuerpos anti-Jo-1 u otros agentes de unión celulares. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces mayor, o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% mayor de actividad biológica en comparación con un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene una CI50 menos (es decir, mayor afinidad de unión) por unión a un anticuerpo Jo-1 en comparación con la proteína no modificada de longitud completa (SEC ID NO: 1) en un análisis de ELISA. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene una CI50 en una prueba de ELISA competitiva para Jo-1 la cual es por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que la del polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene una CI50 en una prueba de ELISA competitiva para Jo-1 la cual es menor de aproximadamente 0.2 nM, menor de aproximadamente 0.18 nM, menor de aproximadamente 0.16 nM o menor que o igual a aproximadamente 0.15 nM.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene "estabilidad" aumentada (por ejemplo, medida por vida media, velocidad de degradación de proteína) la cual es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces mayor, o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% mayor que un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. En modalidades particulares, un polipéptido de HRS modificado o variante tiene una vida media bajo un conjunto dado de condiciones (por ejemplo, temperatura, pH) de por lo menos aproximadamente 30 minutos , aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas , aproximadamente 3 horas , aproximadamente 4 horas , aproximadamente 5 horas , aproximadamente 6 horas , aproximadamente 12 horas , aproximadamente 18 horas , aproximadamente 24 horas , aproximadamente 36 horas , aproximadamente 48 horas , aproximadamente 60 horas , aproximadamente 72 horas , aproximadamente 84 horas , aproximadamente 96 horas , aproximadamente 120 horas , aproximadamente 144 horas , aproximadamente 168 horas, aproximadamente 192 horas , aproximadamente 216 horas o mayor, aproximadamente 240 horas o mayor o cualquier vida media intermedia o intervalo entre los mismos.
En algunas modalidades, la "estabilidad" de un polipéptido de HRS incluye su "estabilidad funcional" o la velocidad a la cual por lo menos una actividad biológica se reduce bajo un conjunto dado de condiciones con respecto al tiempo. Las actividades biológicas ejemplares incluyen cualquiera de uno o más de actividades no canónicas descritas en la presente y la retención de por lo menos un epítopo el cual produce una reacción cruzada específica con un autoanticuerpo o un linfocito T autorreactivo a partir de una enfermedad asociada con autoanticuerpos para HRS humano.
En algunas modalidades, la actividad biológica de un polipéptido de HRS modificado o variante se reduce a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta, o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables .
En ciertas modalidades, la "estabilidad" de un polipéptido de HRS incluye su "estabilidad cinética" o "estabilidad térmica", que incluye su velocidad de desnaturalización bajo un conjunto dado de condiciones con respecto al tiempo. Una proteina que es cinéticamente estable se desnaturalizará más lentamente que una proteína cinéticamente inestable. En una proteína cinéticamente estable, se requiere una barrera de energía libre grande para la desnaturalización y los factores que afectan la estabilidad son las energías libres relativas de estado plegado (Gf) y de transición (Gts) para la primera etapa involucrada sobre la vía de desnaturalización. Una proteína se puede desnaturalizar de manera irreversible si la proteína desnaturalizada experimenta rápidamente algún cambio permanente tal como agregación o degradación proteolítica . En modalidades particulares, un polipéptido de HRS modificado o variante se desnaturaliza a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta, o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% mayor que la temperatura de fusión de un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS modificado o variante tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50°C o mayor en comparación con un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. La temperatura de fusión se puede medir, por ejemplo, mediante fluorometría de exploración diferencial (DSF, por sus siglas en inglés) .
En algunas modalidades, un polipéptido de HRS modificado o variante presenta homogeneidad mejorada o aumentada o monodispersión (por ejemplo, la relación de monómeros/oligómeros, relación de dímeros/oligómeros , relación de monómeros/dímeros, relación de dímeros/monómeros , relación de formación de unión disulfuro entre cadenas bajo condiciones reductoras, distribución de pesos moleculares aparentes que incluye peso molecular alto reducido o picos de peso molecular bajos detectados ya sea por análisis SDS-PAGE o HPLC) en solución a relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante. En algunas modalidades, la homogeneidad o monodispersión de un polipéptido de HRS modificado o variante se incrementa en por lo menos aproximadamente al menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces, o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. En modalidades específicas, el polipéptido de HRS que tiene una supresión (?507-509) o sustitución de los residuos cisteína en la parte C-terminal Cys507 y Cys509 presente homogeneidad aumentada (es decir, relación de monómeros/oligómeros) en solución, en relación a un polipéptido de HRS correspondiente que tiene uno o ambos de Cys507/Cys509 (por ejemplo, la SEC ID NO: 1) . Sin desear unirse a teoría alguna, el HRS humano de longitud completa oligomeriza por medio de residuos cisteína C-terminales Cys507/Cys509 , y la sustitución o supresión de uno o ambos de estos residuos cisteína puede incrementar la homogeneidad del polipéptido de HRS en solución (por ejemplo, amortiguador fisiológico, composición farmacéutica/terapéutica, fluido biológico tal como sangre o plasma) . En modalidades específicas, el polipéptido de HRS variante es HRS (1-506) (SEC ID NO: 70) o HRS (2-506) . La homogeneidad aumentada de monómeros en solución también puede generar, por ejemplo, actividad biológica aumentada, estabilidad u otras propiedades descritas en la presente.
En algunas modalidades, un polipéptido de HRS modificado o variante tiene turbidez reducida (por ejemplo, el grado de partícula o formación de fibras) en solución, en relación o un polipéptido de HRS no modificado o no variante. En algunas modalidades, la turbidez de un polipéptido de HRS modificado o variante se reduce en aproximadamente por lo menos alrededor de 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. La turbidez se puede medir, por ejemplo, por absorbancia a A340.
En algunas modalidades, un polipéptido de HRS modificado o variante presente opalescencia reducida en solución en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante. En algunas modalidades, la opalescencia de un polipéptido de HRS modificado o variante se reduce en por lo menos aproximadamente por lo menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces, o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. La opalescencia se puede medir, por ejemplo, por absorbancia a A580.
En algunas modalidades, un polipéptido de HRS modificado o variante tiene agregados reducidos (por ejemplo, agregados de peso molecular alto, agregados de peso molecular bajo) en solución en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante. En algunas modalidades, al formación de agregado de un polipéptido de HRS modificado o variante se reduce en aproximadamente o por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. La agregación se puede medir, por ejemplo, mediante HPLC por exclusión de tamaño o análisis SDS-PAGE. Niveles altos de agregación también pueden ser monitoreados por mediciones de turbidez, como se describe en la presente.
En algunas modalidades, un polipéptido de HRS modificado o variante tiene un rendimiento mejorado en E. coli en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante. En algunas modalidades, el rendimiento mejora por al menos aproximadamente 1.2, 1.5, 2, 3, 4, ,5, 6, 7, 8, 9, ó 10 veces o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante producido bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables .
En algunas modalidades, un polipéptido de HRS modificado o variante presenta pureza aumentada y/o contenido reducido de endotoxina después de la expresión y purificación de E. coli en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante. En algunas modalidades, el nivel de endotoxina se reduce en por lo menos aproximadamente 1.2, 1.5, 2, 3, 4, ,5, 6, 7, 8, 9, ó 10 veces o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante producido bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables.
En algunas modalidades, un polipéptido de HRS modificado o variante tiene una fragmentación reducida en solución en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante. En algunas modalidades, el grado de fragmentación de un polipéptido de HRS modificado o variante se reduce en por lo menos aproximadamente, por lo menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS no modificado o no variante bajo condiciones idénticas o de otra manera comparables. La fragmentación se puede medir, por ejemplo, por análisis de SDS-PAGE y HPLC de exclusión de tamaño.
Las condiciones ejemplares para medir cualquiera de las propiedades bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas descritas en la presente incluyen "condiciones fisiológicas" tales como un intervalo de temperatura de ~ 20-40°C, una presión atmosférica de ~ 1 y un pH de ~ 6-8. Los ejemplos generales de condiciones incluyen, sin limitación, condiciones in vivo ante administración a un mamífero, condiciones in vitro o en solución, en un fluido biológico (por ejemplo sangre, suero, cultivo de tejido) y condiciones in vitro o en solución en un amortiguador fisiológico o una composición farmacéutica/terapéutica . Las composiciones farmacéuticas/terapéuticas ejemplares se describen en otra parte en la presente. En algunas modalidades, las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente -80, -60, -40, -20, -10, -5, -4, -3, -20, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ó 100°C, que incluye todos los enteros e intervalos entre los mismos. En algunas modalidades, las condiciones incluyen un pH de aproximadamente 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, ó 8.0, que incluye todos los enteros e intervalos entre los mismos .
Las propiedades farmacocinéticas , bioquímicas y/o físicas descritas en la presente se pueden medir bajo cualquier condición dada o condiciones cambiantes (por ejemplo, temperatura en incremento) durante aproximadamente 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ó 24 horas o aproximadamente 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 días o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 24 semanas, o aproximadamente 1,2 ,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses o similar. En algunas modalidades, las propiedades farmacocinéticas , bioquímicas y/o físicas se miden después de congelamiento-recalentamiento de una composición por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces.
POLINUCLEÓTIDOS DE HRS Ciertas modalidades se relación con polinucleótidos que codifican para un polipéptido de HRS, que incluye cortes y/o variantes de los mismos así como composiciones que comprenden estos polinucleótidos. Entre otros usos, estas modalidades pueden ser utilizadas para producir de manera recombinante el polipéptido de HRS deseado o una variante del mismo o para expresar el polipéptido de HRS en una célula o sujeto seleccionado. Las secuencias de nucleótidos como se encuentran de modo natural representativas que codifican para los polipéptidos de HRS nativos incluyen, por ejemplo, los accesos de GeneBank Nos. AK000498.1 y U18937.1.
Como se utiliza en la presente, los términos "ADN" y "polinucleótido" y "ácido nucleico" se refieren a una molécula de ADN que ha sido aislada libre de ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica para un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias codificantes aunque aún está sustancialmente aislado, separado de o purificado en forma libre de ADN genómico total de las especies de las cuales el segmento de ADN se ha obtenido. Se incluyen dentro de los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido" que son segmentos de ADN y segmentos más pequeños de estos segmentos y también vectores recombinantes que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus y similares.
Como se entenderá por aquellos expertos en el ámbito, las secuencias polinucleotídicas de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmidos y segmentos de genes manipulados más pequeños que expresan o que se pueden expresar adaptar para expresar proteínas, polipéptidos , péptidos y similares. Estos segmentos pueden ser aislados de manera natural o pueden modificarse sintéticamente por la mano del hombre .
Los polinucleótidos pueden ser de cadena sencilla (codificantes o antisentido) o de cadena doble, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintéticos) o ARN. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, aunque no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención y un polinucleótido puede, aunque no es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica para un polipéptido de HRS o una porción del mismo) o pueden comprender una variante o un equivalente funcional biológico de esta secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones, como se describe adicionalmente más adelante, preferiblemente de manera que la actividad moduladora de respuesta inflamatoria del polipéptido codificado no disminuya de modo sustancial en relación al polipéptido no modificado. El efecto de la actividad moduladora de respuesta inflamatoria del polipéptido codificado generalmente se puede determinar como aquí se describe.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden diversas longitudes de tramos contiguos de secuencia idénticos a complementarios al polipéptido de HRS, en donde los polinucleótidos aislados codifican para un polipéptido de HRS truncado como se describe en la presente.
Se apreciará por aquellos habitualmente expertos en el ámbito, como resultado de la degeneración del código genético, que existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican para un polipéptido de HRS como se describe en la presente. Algunos de estos polinucleótidos pueden presentar homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente por la presente invención, por ejemplo en los nucleótidos que son optimizados para selección de codones humanos, de levadura o bacterianos.
Por lo tanto, múltiples polinucleótidos pueden codificar para los polipéptidos de HRS de la invención. Además, la secuencia de polinucleótidos puede ser manipulada por diversos motivos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a la incorporación de codones preferidos para mejorar la expresión del polinucleótido en diversos organismos (véase de manera general Nakamura et al., Nuc. Acid. Res. 28 (1) : 292, 2000). Además, se pueden incorporar mutaciones silenciosas con el fin de introducir o eliminar sitios de restricción, disminuir la densidad de motivos dinucleótidos CpG (véase, por ejemplo, Kameda et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. 349(4): 1269-1277, 2006) o reducir la capacidad de secuencias de cadena sencilla para formar estructuras de tallo-bucle (véase, por ejemplo, Zuker M. , Nucí. Acid Res. 31(13): 3406-3415, 2003). Además, la expresión de mamífero puede ser optimizada adicionalmente al incluir una secuencia de consenso Kozak [es decir, (a/g) ce (a/g) ccATGg; SEC ID NO: 130] en el codón de inicio. Las secuencias de consenso Kozak útiles para este propósito se conocen en el ámbito (Mantyh et al. PNAS. 92: 2662-2666, 1995; Mantyh et al., Prot . Exp. & Purif . 6, 124, 1995) . Las secuencias polinucleotídicas optimizadas en codones ejemplares se proporcionan en la tabla D9 a continuación.
CK3AAAAAATOOGTACGA(XX3^^ GAAAAAACT CTCGAAGACnX^ TOXGCTATTA CiCCGAACTG^ GAATCAGCTCCAGTATTGIGAA^ TATOjGGGAACAAGAACnXiAAAGA ^ GATTAAACGCCGTACACXjrcAGíX CTUKjrATTTGC Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, aunque no necesita, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención y un polinucleótido puede, aunque no necesita, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte. De lo anterior, los polinucleótidos de la presente invención, sin importar la longitud de la secuencia codificante misma, se pueden combinar con, y se pueden acoplar operativamente a otras secuencias de ADN o AR , tales como secuencias de control de expresión que incluyen, por ejemplo, promotores, señales de poliadenilación . Adicionalmente , los polinucleótidos pueden comprende adicionalmente sitios de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes y similares de manera que su longitud total puede variar considerablemente .
Por lo tanto se contempla que un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud se puede utilizar; con la longitud total que preferiblemente se limita por la facilidad de preparación y el uso del protocolo de ADN recombinante destinado. Se incluyen los polinucleótidos de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 270, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 o más bases de longitud (que incluyen todos los número enteros entre los mismos) , que incluyen cualquier porción o fragmento (por ejemplo, mayor de aproximadamente 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de longitud) de un polinucleótido de referencia de HRS (por ejemplo, el número de base X-Y en el cual X es aproximadamente 1-3000 o mayor e Y es aproximadamente 10-3000 o mayor), o su complemento.
Las modalidades de la presente invención también incluyen "variantes" de las secuencias de polinucleótido de referencia que codifican para el polipéptido de HRS. Los polinucleótidos "variantes" pueden contener una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones en relación a un polinucleótido de referencia. Generalmente, las variantes de una secuencia de polinucleótidos de referencia del polipéptido de HRS pueden tener por lo menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, generalmente por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, de manera deseable aproximadamente 90% a 95% o mayor y de manera más adecuada aproximadamente 98% o más de identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos particular (tal como, por ejemplo, las SEC ID NOS: 24-38, 40, 42, 72-73, 173-175 ó 183-189) como se determina por los programas de alineación de secuencia descritos en otra parte en este documento utilizando parámetros implícitos. En ciertas modalidades, las variantes pueden diferir de una secuencia de referencia en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (que incluye todos los enteros entre los mismos) o más bases. En ciertas modalidades, por ejemplo cuando la variante de polinucleótido codifica para un polipéptido de HRS que tiene una actividad no canónica, la actividad deseada del polipéptido de HRS codificado no disminuye sustancialmente en relación al polipéptido no modificado. El efecto sobre la actividad del polipéptido codificado generalmente se puede determinar como se describe en la presente que incluye, por ejemplo, los métodos descritos en la presente. En algunas modalidades, las variantes pueden alterar el estado de agregación de los polipéptidos de H S, por ejemplo, para proporcionar para polipéptidos de HRS que existen en diferentes modalidades principalmente como un monómero, dímero o multímero.
Ciertas modalidades incluyen polinucleótidos que 5 hibridizan con una secuencia de polinucleótidos de HRS de referencia (tales como, por ejemplo, cualquiera de las SEC ID NOS: 24-38, 40, 42, 72-73, 173-175, ó 183-189) o con sus complementos, bajo condiciones de rigurosidad descritos más adelante. De la manera en que se utiliza en la presente, el LO término "hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media o alta rigurosidad o condiciones de muy alta rigurosidad" describe condiciones para hibridación y lavado. La guía para realizar reacciones de hibridación se L¡_ puede encontrar en Ausubel et al., (1998, supra) , secciones 6.3.-6.3.6, Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y cualquiera de ellos se puede utilizar.
La referencia en la presente a condiciones de baja rigurosidad incluye y abarca desde por lo menos Q aproximadamente 1% v/v a por lo menos 15% v/v de formamida y desde por lo menos aproximadamente 1 M a por lo menos aproximadamente 2 M de sal para hibridación a 42°C, y por lo menos aproximadamente 1 M a por lo menos aproximadamente 2 M de sal para lavado a 42°C. Las condiciones de baja , j- rigurosidad también pueden incluir albúmina sérica bovina (BSA) , 1%, EDTA 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), SDS 7% para hibridación a 65°C, y (i) 2 x SSC, SDS 0.1%; o (ii) BSA 0.5%, EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM (pH 7.2), SDS 5% para lavado a temperatura ambiente. Una modalidad de condiciones de baja rigurosidad incluye hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en 0.2 x SSC, SDS 0.1%, por lo menos 50°C (la temperatura de los lavados se puede incrementar a 55°C para condiciones de baja rigurosidad) .
Las condiciones de rigurosidad media incluyen y abarcan desde por lo menos aproximadamente 16%, v/v, a por lo menos aproximadamente 30%, v/v de formamida y desde por lo menos aproximadamente 0.5 M a por lo menos aproximadamente 0.9 M de sal para hibridación a 42°C, y por lo menos aproximadamente 0.1 M a por lo menos aproximadamente 0.2 M de sal para lavado a 55°C. Las condiciones de rigurosidad media también incluye albúmina sérica bovina (BSA) 1%, EDTA 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), SDS 7% para hibridación a 65°C, y (i) 2 x SSC, SDS 0.1%; o (ii) BSA 0.5%, EDTA 1 mM, NaHP0440 mM (pH 7.2), SDS 5% para lavado a 60-65°C. Una modalidad de condiciones de baja rigurosidad media incluye hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS 0.1%, por lo menos 60°C. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen y abarcan desde por lo menos aproximadamente 31%, v/v, a por lo menos aproximadamente 50%, v/v de formamida y de aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 0.15 M de sal para hibridación a 42°C y aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 0.02 M de sal para lavado a 55°C.
Las condiciones de alta rigurosidad pueden incluir BSA 1%, EDTA 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), SDS 7% para hibridación a 65°C, y (i) 0.2 x SSC, SDS 0.1%; o (ii) BSA 0.5%, EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM (pH 7.2), SDS 1% para lavado a temperatura en exceso de 65°C. Una modalidad de condiciones de alta rigurosidad incluye hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS 0.1%, a 65°C. Una modalidad de condiciones de muy alta rigurosidad incluye hibridación en fosfato de sodio 0.5 M, SDS 7% a 65 °C seguido por uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS 1% a 65°C.
Otras condiciones de rigurosidad son bien conocidas en el ámbito y una persona experta reconocerá que se pueden manipular diversos factores para optimizar la especificidad de la hibridación. La optimización de la rigurosidad de los lavados finales puede servir para asegurar un alto grado de hibridación. Para ejemplos detallados véase Ausubel et al., supra en las páginas 2.10.1 a 2.10.16 y Sambrook et al. (1989, supra) en las secciones 1.101 a 1.104. Aunque los lavados rigurosos habitualmente se realizan a temperaturas de aproximadamente 42°C a 68°C, una persona experta en el ámbito apreciará que otras temperaturas pueden ser adecuadas para condiciones rigurosas. La tasa de hibridación máxima habi ualmente se produce a una temperatura de aproximadamente 20°C a 25°C debajo de la Tm para formación de un híbrido ADN-ADN. Es bien conocido en el ámbito que la Tm es la temperatura de fusión o la temperatura a la cual no se disocian secuencias de polinucleótidos complementarias. Los métodos para calcular Tm son bien conocidos en el ámbito (véase Ausubel et al., supra en la página 2.10.8).
En general, la Tm de un dúplex perfectamente coincidente de ADN se puede predecir como una aproximación 0 por la fórmula: Tm = 81.5 + 16.6 (log10 M) + 0.41 (%G+C) - 0.63 (% de formamida) - (600/longitud) en donde: M es la concentración de Na+, preferiblemente en el intervalo de 0.01 molar a 0.4 molar; %G+C es la suma de bases guanosina y citosina como un porcentaje del número total de base, dentro del intervalo entre 30% y 75% G+C; % de formamida es el porcentaje de concentración de formamida en volumen; longitud es el número de pares de bases en el dúplex de ADN. La Tm de ADN dúplex disminuye en aproximadamente 1°C con cada Q incremento de 1% en el número de pares de bases malpareadas aleatoriamente. El lavado generalmente se lleva a cabo a Tm - 15°C para alta rigurosidad o Tm - 30 °C para rigurosidad moderada .
En un ejemplo para un procedimiento de hibridación, c una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon) que contiene ADN inmovilizado se hibridiza durante la noche a 42 °C en un amortiguador de hibridación (formatnida desionizada 50%, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (Ficoll 0.1%, polivinilpirrolidona 0.1% y albúmina sérica bovina 0.1%), SDS 0.1% y 200 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado) que contiene una sonda etiquetada. La membrana después se somete a dos lavados secuenciales de rigurosidad media (es decir, 2 x SSC, SDS 0.1% durante 15 min a 45 °C seguido por 2 x SSC, SDS 0.1% durante 15 min a 50 °C) seguido por dos lavados secuenciales de rigurosidad mayor (es decir, 0.2 x SSC, SDS 0.1% durante 12 min a 55 °C seguido por 0.2 x SSC y solución de SDS 0.1% durante 12 min a 65-68°C) .
PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE HRS El polipéptido de HRS se puede preparar por cualquier procedimiento adecuado conocido por aquellos expertos en el ámbito, por ejemplo mediante la utilización de síntesis de péptidos en fase sólida convencional (Merrifield, J. Am. Chem. Soc . 85: 2149-2154 (1963)) o por tecnología recombinante utilizando un hospedador modificado genéticamente. La síntesis de proteína se puede realizar utilizando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede realizar, por ejemplo, utilizando el equipo de Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) . De manera alternativa, diversos fragmentos pueden ser sintetizados químicamente por separado y combinarse utilizando métodos químicos para producir la molécula deseada.
Los polipéptidos de HRS también se pueden producir al expresar una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de HRS en cuestión) en una célula hospedadora adecuada por técnicas bien conocidas. La secuencia de polinucleótidos que codifica para el polipéptido de HRS se puede preparar sintéticamente por métodos estándar establecidos, por ejemplo el método de fosfoamidita descrito por Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869 o el método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3: 801-805. De acuerdo con el método de fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se forman las cadenas dúplex y se ligan para formar la construcción de ADN sintético. De manera alternativa, la construcción de ADN se puede construir utilizando técnicas de biología molecular recombinante estándar que incluye clonación mediada por enzima de restricción y amplificación de genes basada en PCR.
Las secuencias de polinucleótidos también pueden ser de origen genómico mixto, de ADNc y sintético. Por ejemplo, una secuencia genómica o de ADNc que codifica para un péptido líder se puede unir a una secuencia genómica o de ADNc que codifica para el polipéptido de HRS, después de lo cual la secuencia de ADN se puede modificar en un sitio al insertar oligonucleótidos sintéticos que codifican para la secuencia de aminoácidos deseada o por PCR utilizando oligonucleótidos adecuados. En algunas modalidades una secuencia de señal se puede incluir antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica para un péptido señal N-terminal a la secuencia codificante la cual comunica a la célula hospedadora para dirigir el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido al medio. Típicamente, el péptido señal se elimina por corte de la célula hospedadora antes de que la proteína abandone la célula. Los péptidos señal se pueden encontrar en una variedad de proteínas en procariotas y eucariotas.
Se conocen una diversidad de vectores de expresión/sistemas de hospedador y muchos pueden ser utilizados para contener y expresar secuencias polinucleotídicas . Estos incluyen, pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes , plásmidos o vectores de expresión de ADN cósmidos ; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus) ; sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, los plásmidos Ti o pBR322) ; o sistemas de células animales que incluyen células de mamífero y de manera más específica sistemas de células humanas transformadas con vectores de expresión virales, plasmídicos, episomícos o de integración.
Estos vectores de expresión pueden comprender secuencias de control de expresión que incluyen, por ejemplo, mejoradores, promotores, regiones 5' y 3' no traducidas - las cuales interactúan con proteínas celulares hospedadoras para llevar a cabo transcripción y traducción. Estos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y hospedador utilizados, se puede usar cualquier cantidad de elementos adecuados de transcripción y traducción que incluyen promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, los promotores inducibles tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, California) o el plásmido PSP0RT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares se pueden usar. En sistemas de células de mamífero, los promotores a partir de genes de mamífero o a partir de virus de mamífero son los que se prefieren generalmente. Es necesario generar una línea de células que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica para un polipéptido, vectores basados en SV40 o EBV pueden ser utilizados ventajosamente con un marcador seleccionable apropiado.
Ciertas modalidades pueden utilizar sistemas de expresión basados en E. coli (véase, por ejemplo, Structural Genomics Consortium et al., Nature Methods . 5: 135-146, 2008) . Estas y modalidades relacionadas pueden basarse parcial o totalmente en clonación independiente de ligación (LIC, por sus siglas en inglés) para producir un vector de expresión adecuado. En modalidades específicas, la expresión de proteína se puede controlar por ARN polimerasa T7 (por ejemplo, la serie de vector pET) . Estas modalidades y las relacionadas pueden utilizar la cepa hospedadora de expresión BL21 (DE3) , un lisógeno ???3 de BL21 que soporta expresión mediada por T7 y que es deficiente en las proteasas Ion y ompT para estabilidad mejorada de la proteína objetivo.
También se incluyen cepas hospedadoras de expresión que presentan plásmidos que codifican para ARNt nuevamente utilizados en E. coli, tales como las cepas ROSETTAMR (DE3) y Rosetta 2 (DE3) . En algunas modalidades, otras cepas de E. coli se pueden utilizar que incluyen otras cepas de E. coli K-12 tal como W3110 (F~ lambda" IN (rrnD-rrnE) 1 rph-1) lo cual puede resultar en niveles reducidos de modificaciones post-transduccionales durante la fermentación. La lisis de células y el manejo de muestras también pueden mejorar utilizando reactivos vendidos bajo las marcas comerciales nucleasa BENZONASE^ y reactivo de extracción de proteína BUGBUSTERMR. Para cultivo de células, los medios autoinductores pueden mejorar la eficiencia de muchos sistemas de expresión que incluyen sistemas de expresión de alto rendimiento. Los medios de este tipo (por ejemplo, el sistema de autoinducción OVER IGHT EXPRESSMR) inducen gradualmente expresión de proteínas a través de desplazamiento metabólico sin la adición de agentes inductores artificiales tales como IPTG.
Las modalidades particulares utilizan etiquetas de hexahistidina u otras etiquetas de afinidad o de purificación seguidas por purificación por cromatografía de afinidad inmovilizada en metal (IMAC, por sus siglas en inglés) o técnicas relacionadas. No obstante, en ciertos aspectos, las proteínas de grado clínico se pueden aislar de cuerpos de inclusión de E. coli con o sin el uso de etiquetas de afinidad (véase, por ejemplo, Shimp et al., Protein Expr Purif. 50: 58-67, 2006). Como un ejemplo adicional, ciertas modalidades pueden utilizar un sistema de producción de alto rendimiento con E. coli inducido por choque en frío, debido a que la sobreexpresión de proteínas en Escherichia coli a baja temperatura mejora su solubilidad y estabilidad (véase, por ejemplo, Qing et al., Nature Biotechnology, 22: 877-882, 2004).
También se incluyen sistemas de fermentación bacterianos de alta densidad. Por ejemplo, el cultivo de alta densidad celular de Ralstonia eutropha permite la producción de proteínas de densidades celulares superiores a 150 g/1 y la expresión de proteínas recombinantes y títulos que exceden de 10 g/1. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, muchos de los vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH se pueden utilizar. Para revisiones, véase Ausubel et al. (supra) y Grant et al., Methods Enzymol . 153: 516-544 (1987). También se incluyen sistemas de expresión de Pichia pastoris (véase, por ejemplo, Li et al., Nature Biotechnology. 24, 210 - 215, 2006; y Hamilton et al., Science, 301: 1244, 2003). Ciertas modalidades incluyen sistemas de levadura que son manipulados para glucosilar selectivamente proteínas que incluyen levadura que tienen vías de N-glucosilación humanizadas, entre otros (véase, por ejemplo, Hamilton et al., Science. 313: 1441-1443, 2006; Wildt et al., Nature Reviews Microbiol . 3: 119-28, 2005; y Gerngross et al., Nature-Biotechnology. 22: 1409-1414, 2004; patentes de U.S Nos. 7,629,163; 7,326,681; y 7,029,872). Simplemente a modo de ejemplo los cultivos de levadura recombinante se pueden hacer crecer en matraces Fernbach de termentadores de 15 1, 50 1, 100 1 y 200 1, entre otros.
En casos en donde se utilizan vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifican para polipéptidos puede ser inducida por cualquiera de numerosos promotores. Por ejemplo, los promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV se pueden utilizar solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987)). De manera alternativa, los promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o los promotores de choque térmico se pueden utilizar (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224: 838-843 (1984); y Winter et al., Results Probl . Cell Differ. 17: 85-105 (1991)). Estas construcciones se pueden introducir en células de plantas por transformación de ADN directo o transfección mediada por patógenos. Estas técnicas se describen en numerosas revisiones disponibles generalmente (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196 (1992)).
Un sistema de insectos también se puede utilizar para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de estos sistemas, se utiliza virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en células de Trichoplusia . Las secuencias que codifican para el polipéptido se pueden clonar en una región no esencial del virus, tal como en gen para polihedrina y se pueden colocar bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica para el polipéptido volverá al gen para polihedrina inactiva y producirá virus recombinante que carezca de la proteína de recubrimiento. Los virus recombinantes después se pueden utilizar para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o de Trichoplusia en las cuales el polipéptido de interés se puede expresar (Engelhard et al., Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 91: 3224-3227 (1994)). También se incluyen los sistemas de expresión de baculovirus que incluyen aquellos que utilizan células SF9, SF21 y T. ni (véase, por ejemplo, Murphy y Piwnica-Worms, Curr Protoc Protein Sci. capítulo 5: Unit5.4, 2001). Los sistemas de insectos pueden proporcionar modificaciones post-transduccionales que son similares a los sistemas de mamífero .
En células hospedadoras de mamífero son bien conocidos numerosos sistemas de expresión en el ámbito y están disponibles comercialmente . Los sistemas de vector de mamífero ejemplares incluyen, por ejemplo, pCEP , pREP4 y pREP7 de Invitrogen, el sistema PerC6 de Crucell y sistemas basados en Lentiviral tales como pLPl de Invitrogen y otros. Por ejemplo, en casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, las secuencias que codifican para un polipéptido de interés se pueden ligar en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste del promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción de una región El o E3 no esencial del genoma viral se puede utilizar para obtener un virus viable el cual es capaz de expresar el polipéptido en células hospedadoras infectadas (Logan & Shenk, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3655-3659, 1984) . Además los mej oradores de transcripción, tales como el mej orador de virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés) se pueden utilizar para incrementar la expresión en células hospedadoras de mamífero.
Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero útiles incluyen la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la línea de riñon embriónico humano (células 293 +o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J". Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células hepáticas humanas (Hep G2 , HB 8065); tumor mamario de ratón (M T 060562, ATCC CCL51) ; células TR1 (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y línea de hepatoma humano (Hep G2) . Otras líneas de células hospedadoras de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) que incluyen células DHFR-CHO (Urlaub et al., PNAS USA 77: 4216 (1980)); y líneas de células de mieloma tales como NSO y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas de células hospedadoras de mamífero adecuadas para producción de anticuerpo véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol . 248 (B. K. C Lo, ed. Humana Press, Totowa, N. J., 2003), p . 255-268. Ciertos sistemas de expresión de células de mamífero preferidos incluyen sistemas de expresión basados en células CHO y HEK293. Los sistemas de expresión de mamífero pueden utilizar líneas de células unidas, por ejemplo en matraces T, botellas giratorias o fabricas de células o cultivos de suspensión, por ejemplo en sistemas giratorios de 1 1 y 5 1 , biorreactores de tanque de agitación de 5 1, 14 1, 40 1, 100 1 y 200 1 o biorreactores WAVE de 20/50 1 y 100/200 1, entre otros conocidos en el ámbito .
También se incluyen métodos de expresión de proteínas libres de células. Estas modalidades y otras relacionadas habitualmente utilizan ARN polimerasa purificada, ribosomas, AR t y ribonucleótidos . Estos reactivos pueden ser producidos, por ejemplo, mediante extracción de células o a partir de sistemas de expresión basados en células.
Además, una cepa de células hospedadoras se puede seleccionar por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de manera deseada. Estas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a modificaciones post-transduccionales tales como acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación, o la inserción de aminoácidos que no se encuentran de manera natural (véanse de manera general las patentes US NOs . : US 7,939,496; US 7,816,320; US 7,947,473; US 7,883,866; US 7838,265; US 7,829,310; US 7,820,766; US 7,820,766; US 7,7737,226, US 7,736,872; US 7,638,299; US 7,632,924; y US 7,230,068). El procesamiento post-transduccional el cual separa la forma "prepro" de la proteína también se puede utilizar para facilitar la inserción, naturalización y/o función correctas. Se pueden seleccionar diferentes células hospedadoras tales como células de levadura, CHO, HeLa, MDCk, HEK293 y W138 además de células bacterianas las cuales tienen o incluso carecen de la maquinaria celular específica y mecanismos característicos para estas actividades post-transduccionales con el fin de asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña.
Los polipéptidos de HRS producidos por una célula recombinante se pueden purificar y caracterizar de acuerdo con una diversidad de técnicas conocidas en el ámbito. Los sistemas ejemplares para realizar purificación de proteína y analizar la pureza de proteína incluyen cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, los sistemas AKTA y Bio-Rad FPLC) , cromatografía líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, Beckman and Waters HPLC) . Las químicas ejemplares para purificación incluyen cromatografía de intercambio de iones (por ejemplo, Q, S) , cromatografía de exclusión de tamaño, gradientes de sal, purificación de afinidad (por ejemplo Ni, Co, FLAG, maltosa, glutatión, proteína A/G) , filtración en gel, en fase inversa, cromatografía de intercambio de iones HIPERDMR cerámica y columnas de interacción hidrofóbica (HIC, por sus siglas en inglés) entre otros conocidos en el ámbito. Varios métodos ejemplares J también se describen en las secciones de los ejemplos.
VECTORES RECOMBINANTES Y POLINUCLEOTIDOS Otra modalidad de la invención proporciona polinucleótidos recombinantes , vectores recombinantes y vectores virales recombinantes que comprende un polinucleótido cuya secuencia comprende una secuencia nucleotídica la cual codifica para cualquiera de los polipéptidos de HRS descritos en la presente.
También se incluyen formulaciones que comprenden ARNm modificados o mejorados que codifican para los polipéptidos de HRS los cuales son capaces de reducir la actividad inmunitaria innata de una población de células en las cuales son introducidas, de esta manera se incrementa la eficiencia de producción de proteínas en esa población de células. Estos ARNm modificados incluyen, por ejemplo, la estructura 5 'Capí y la cola poliA de una longitud de aproximadamente 160 nucleótidos y las cuales opcionalmente se formulan en una formulación lipídica tal como un liposoma, lipoplexo, una nanopartícula lipídica como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud US No. 2012/0251618 y en las solicitudes Internacionales Nos. PCT/US2011/046861 y PCT/US2011/054636 , el contenido de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
La selección de vectores recombinantes adecuados para expresar los polipéptidos de HRS de la invención, los métodos para insertar las secuencias de ácido nucleico para expresar polipéptidos de HRS en el vector y los métodos para suministrar el vector recombinante a las células de interés están dentro de la habilidad en el ámbito. Véase, por ejemplo, Tuschl . T. (2002), Nat . Biotechnol, 20: 446-448; Brummelkamp T R et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison P J et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee N S et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; Paul C P et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508, Conese et al., Gene Therapy 11: 1735-1742 (2004) y Fjord-Larsen et al., (2005) Exp Neurol 195: 49-60 las descripciones completas de las cuales se incorporan en la presente como referencia.
Los vectores de expresión recombinantes disponibles comercialmente representativos incluyen, por ejemplo pREP4, pCEP4, pREP7 y pcDNA3.1 y pcDNA s/FRT de Invitrogen y pBK-CMV y pExchange-6 Core Vectors de Stratagene . Los vectores de expresión viral disponibles comercialmente representativos incluyen, pero no se limitan a sistemas basados en adenovirus tales como el sistema Per.C6 disponible de Cricell, Inc., sistemas basados en lentivirus tales como pLPl de Invitrogen y vectores retrovirales tales como los vectores retrovirales pFB-ERV y pCFB-EGSH de Stratagene (US) .
En general, cualquier vector recombinante o viral capaz de aceptar las secuencias codificantes para los polipéptidos de HRS que se van a expresar se pueden utilizar, por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV) ; virus adeno-asociados (AAV) ; retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV) , rabdovirus, virus de leucemia murina) ; herpes virus, virus de papiloma (patentes de US Nos. 6,399,383 y 7,205,126) y similares. El tropismo de los vectores virales también se puede modificar mediante pseudotipificación de los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus. Por ejemplo, un vector de AAV de la invención puede ser pseudotipificado con proteínas de superficie de virus de estomatitis vesicular (VSV) , virus de rabia, virus de ébola, virus de mokola y similares. Los pseudoviriones no infecciosos, por ejemplo, de virus de papiloma también se pueden utilizar para habilitar en un suministro eficiente de genes a membranas de la mucosa (patente de US No. 7,205,126, Peng et al., Gene Ther, 2010 julio 19 epub) .
En algunos aspectos, los vectores virales derivados de AV y AAV se pueden utilizar en la presente invención. Los vectores de AAV adecuados para expresar los polipéptidos de HRS de la invención, los métodos para construir el vector de AAV recombinante y los métodos para suministrar los vectores en células objetivo se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol . , 70: 520-532; Samulski R et al (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; patente U.S. No. 5,252,479; patente U.S. No. 5,139,941; solicitud de patente internacional No. WO 94/13788; y solicitud de patente internacional No. WO 93/24641, las descripciones completas de las cuales se incorporan en la presente como referencia.
Típicamente, los vectores recombinantes y los vectores virales recombinantes incluyen secuencias de control de expresión que dirigen la expresión del polinucleótido de la invención en diversos sistemas, tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, un conjunto de elementos reguladores dirigirá la expresión en ciertas células de mamífero o tejidos y otro conjunto de elementos reguladores dirigirá la expresión a células bacterianas y aún así un tercer conjunto de elementos reguladores dirigirá la expresión en sistemas de baculovirus. Algunos vectores son vectores híbridos que contienen elementos reguladores necesarios para la expresión en más de un sistema. Los vectores que contienen estos sistemas reguladores diversos están disponibles comercialmente y una persona experta en el ámbito será capaz con facilidad de clonar los polinucleótidos de la invención en estos vectores.
En algunas instancias, los polinucleótidos o vectores presentarán promotores para expresión de los polipéptidos de HRS en una amplia variedad de células. En otras instancias los vectores presentarán promotores que son específicos de tejido. Por ejemplo, los promotores dirigen la expresión únicamente en células inmunitarias , células de 0 músculo. En algunos aspectos, el vector de la invención comprende un polinucleótido cuya secuencia nucleotídica codifica para un polipéptido de HRS de cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 ó 176-182.
Los polinucleótidos y vectores recombinantes se 5 1 pueden administrar a un paciente directamente o junto con un reactivo de suministro adecuado, que incluye el reactivo lipofílico inis Transit LT1; lipofectina, lipofectamina ; celfectina; policationes (por ejemplo, polilisina) o Q liposomas. La selección de los vectores virales recombinantes adecuados para usarse en la invención, los métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresión de los polipéptidos de HRS en el vector y los métodos de suministro del vector viral a las células de interés están dentro de la ? habilidad en el ámbito. Véase, por ejemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; y Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30, las descripciones completas de las cuales se incorporan en la presente como referencia.
CÉLULAS HOSPEDADORAS Algunas modalidades incluyen una célula hospedadora transformada con un vector o polinucleótido descrito en la presente. En algunos aspectos, los polipéptidos de HRS que aquí se describen se expresan por la célula hospedadora con el fin de producir o manufacturar el polipéptido de HRS. Estas células hospedadoras incluyen bacterias, células de insecto, células de levadura y células de mamífero.
En algunos aspectos, las células hospedadoras se pueden utilizar para expresar y suministrar un polipéptido de HRS por medio de terapia con células. En consecuencia, ciertos aspectos incluyen una terapia con células para tratar una enfermedad o trastorno autoinmune o inflamatorio, que comprende administrar a una célula hospedadora que expresa o que es capaz de expresar un polipéptido de HRS de la invención. En algunos aspectos, la enfermedad o trastorno se selecciona de miopatías inflamatorias que incluyen, por ejemplo, polimiositis, dermatomiositis , superposición de polimiositis-escleroderma, enfermedad de pulmón intersticial, neumonitis por hipersensibilidad, escleroderma, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Churg-Strauss , granulomatosis de egener, síndrome de Goodpasture, asma, distrofias musculares, caquexia y rabdomiolisis , entre otras descritas en la presente.
La terapia con células involucra la administración 5 de células las cuales han sido seleccionadas, multiplicadas y tratadas o alteradas farmacológicamente (por ejemplo, modificadas genéticamente) fuera del cuerpo (Bordignon, C. et al. Cell Therapy: Achievements and Perspectives (1999), Haematologica, 84, pp. 1110-1149) . Estas células hospedadoras incluyen, por ejemplo, células primarias que incluyen células de músculo, PBMC, macrófagos y blastocitos los cuales han sido modificados genéticamente para expresar un polipéptido de HRS de la invención. El objetivo de la terapia con células es sustituir, reemplazar o mejorar la función biológica de L5 tejidos u órganos dañados (Bordignon, C. et al. (1999), Haematologica, 84, pp . 1110-1149) .
En algunos aspectos de estos métodos la célula hospedadora secreta el polipéptido de HRS y de esta manera proporciona Q una fuente sostenible del polipéptido de HRS dentro del tejido u órgano en el cual se implanta la célula hospedadora.
OTROS AGENTES TERAPÉUTICOS En algunas modalidades, las composiciones y métodos que aquí se describen pueden utilizar anticuerpos, fragmentos )C¡ de anticuerpos o proteína de unión que no son polipéptidos de HRS para bloquear la actividad de autoanticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa. En algunos aspectos, el anticuerpo o la proteína de unión se dirige al dominio de unión de antígeno del autoanticuerpo, es decir, los anticuerpos representan anticuerpos anti-idiotipo, por lo que bloquean selectivamente la actividad del autoanticuerpo. En consecuencia, estos agentes de unión se pueden utilizar para diagnosticar, tratar o evitar enfermedades, trastornos u otras condiciones que son mediadas por anticuerpos a una histidil-ARNt sintetasa asociada con enfermedades autoinmunes.
El término "anticuerpo" describe una inmunoglobulina natural o producida sintéticamente, de manera parcial o completa. El término también abarca cualquier polipéptido o proteína que tenga un dominio de unión el cual es, o sea homólogo a un dominio que une antígeno. Los anticuerpos injertados por CDR, que incluyen anticuerpos biespecífieos y anticuerpos humanizados en los cuales una o más de las CDR se derivan de anticuerpos obtenidos de linfocitos B identificados, clonados o seleccionados utilizando cualquiera de los métodos descritos o reivindicados en la presente también se contemplan por este término.
Los "anticuerpos IgG nativos" y las "inmunoglobulinas IgG nativas" típicamente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons constituidas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera, en algunos casos, está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intercadena separados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable ( "VH" ) seguido por un número de dominios constantes ("CH") . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo ("VL") y un dominio constante ("CL") en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos aminoácidos particulares se considera que forman una interface de contacto entre los dominios variables de cadena ligera y pesada.
El término "dominio variable" se refiere a dominios de proteína que difieren extensamente en secuencia entre miembros de la familia (es decir, entre diferentes isoformas o en especies diferentes) . Con respecto a los anticuerpos, el término "dominio variable" se refiere a los dominios variables de anticuerpos que se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. No obstante, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables tanto en la cadena ligera como en los dominios variables de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan "región de inf aestructura" o "FR" . Los dominios variables de los cadenas pesada y ligera no modificadas comprenden, cada uno, cuatro FR (respectivamente FR1, FR2, FR3 y FR4) , adoptando principalmente una configuración de lámina ß conectada por tres regiones hipervariables las cuales forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por los FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) , páginas 647-669) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno sino que presentan diversas funciones efectoras tales como participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente de anticuerpo .
El término "región hipervariable" , cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo los cuales son responsables de unión a antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de tres "regiones determinadoras de complementariedad" o "CDR" los cuales son indirectamente, de una manera complementaria, a un antígeno y se conocen como CDR1, CDR2 y CDR3 , respectivamente.
En el dominio variable de cadena ligera, las CDR corresponden a aproximadamente los residuos 24-34 (CDRL1) , 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) y en el dominio variable de cadena pesada las CDR corresponden a aproximadamente los residuos 31-35 (CDRH1) , 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) y/o aquellos residuos forman un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y LeskJ., Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
Como se utiliza en la presente, "región de infraestructura variable" o "VFR" se refiere a residuos de infraestructura que forman una parte del receptáculo y/o surco de unión a antígeno que se puede poner en contacto con el antígeno. En algunas modalidades, los residuos infraestructura forman un bucle que es una parte del receptáculo o surco de unión a antígeno. Los residuos de aminoácidos en el bucle pueden o no hacer contacto con el antígeno. En una modalidad los aminoácidos del bucle de VFR se determina por inspección de la estructura tridimensional de un anticuerpo, cadena pesada de anticuerpo o cadena ligera de anticuerpo. La estructura tridimensional se puede analizar para posiciones de aminoácidos accesibles por disolvente dado que tales posiciones es probable que formen un bucle y/o que proporcionen contacto con el antígeno en un dominio variable de anticuerpo. Algunas de las posiciones accesibles por disolvente pueden tolerar diversidad de secuencia de aminoácidos y otras (por ejemplo, posiciones estructurales) pueden estar menos diversificadas.
La estructura tridimensional del dominio variable de anticuerpo se puede derivar de una estructura cristalina o moderado de proteína. En algunas modalidades, la VFR comprende, consiste esencialmente o consiste de posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácidos 71 a 78 del dominio variable de cadena pesada, las posiciones definidas de acuerdo con Kabat et al., 1991. En algunas modalidades, la VFR forma una porción de la región de infraestructura 3 localizada entre CDRH2 y CDRH3. Preferiblemente , VFR forma un bucle que está bien colocado para hacer contacto con un antígeno objetivo o forma parte del receptáculo de unión a antígeno.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante o sus cadenas pesadas, a las inmunoglobulinas se les pueden asignar diferentes clases.
Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas : IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada (Fe) que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denomina, respectivamente, a, d, e, ?, y µ. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada se pueden asignar a uno o dos tipos claramente distintos denominados kappa o ( "K" ) y lambda o ( "?" ) , en base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Los términos "porción de unión a antígeno de un anticuerpo", "fragmento que une antígeno", "dominio que une antígeno", "fragmento de anticuerpo'O un "fragmento funcional de un anticuerpo" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para indicar uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al., Nature Biotech. 23 (9); 1126-1129 (2005)). Los ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpo incluidos dentro, pero no limitados a el término "porción que une antígeno" de un anticuerpo incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CHi; (ü) un fragmento F(ab' )2/ un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHi; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb ( ard et al., (1989) Nature 341: 544-546) el cual consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinadora de complementariedad (COR, por sus siglas en inglés) asilada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH son codificados por genes separados, pueden estar unidos utilizando métodos recombinantes , por un enlazante sintético que los habilita para que se elaboren como una cadena proteínica única en la cual el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés) ; véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) PNAS USA. 85: 5879-5883; y Osbourn et al. (1998) Nat . Biotechnol . 16: 778) . Estos anticuerpos de cadena sencilla también se denominan que están abarcados dentro del término "porción que une antígeno" de un anticuerpo. Cualquiera de las secuencias VH y VL de scFv específico se pueden unir a un ADNc de región constante de inmunoglobulina humana o secuencias genómicas con el fin de generar vectores de expresión que codifican para moléculas de IgG completas u otros isotipos. VH y VL también se pueden utilizar en la generación de Fab, Fv u otros fragmentos de inmunoglobulinas utilizando ya sea química de proteínas o tecnología de ADN recombinante . Otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos también pueden estar abarcados .
Las porciones "F(ab' )2" y "Fab" se pueden producir al tratar inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) con una proteasa tal como una pepsina y papaína e incluye un fragmento de anticuerpo generado al digerir inmunoglobulina cerca de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas H. Por ejemplo, la papaína se separa IgG dirección 5' de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas H para generar dos fragmentos de anticuerpo homólogos en los cuales una cadena L compuesta de VL (región variable de cadena L) y CL (región constante de cadena L) y un fragmento de cadena H compuesto de VH (región variable de la cadena H) y 0??? (región ?? de la región constante de la cadena H) están conectados en sus regiones C terminales a través de un enlace disulfuro. Cada uno de estos fragmentos de anticuerpo homólogo se denomina Fab' . La pepsina separa IgG dirección 3' de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones de bisagra en cada uno de las dos cadenas H para generar un fragmento de anticuerpo ligeramente más grande que el fragmento en el cual los dos Fab' mencionados antes se conectan en la región de bisagra. Este fragmento de anticuerpo se denomina F(ab')2.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en la parte carboxilo terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual uno o varios residuos cisteína de los dominios constantes presentan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' los cuales presentan cisteínas de bisagra entre ellos. Se conocen también otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo el cual contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Esta región consiste de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. De manera colectiva, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. No obstante, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque con una afinidad menor que la totalidad del sitio de unión.
Los términos "cadena sencilla Fv" o fragmentos de anticuerpo "sFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. En algunas modalidades, el polipéptido Fv comprende adicionalmente un enlazante polipeptídico entre los dominios VH y VL el cual permite que sFv forme la estructura deseada para unión a antígeno. Para una revisión de las moléculas sFv véase, por ejemplo, Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol . 113, Rosenburg y Moore eds . Springer-Verlang, New York, pp. 269-315 (1994) .
Como se utiliza en la presente, los anticuerpos "naturales" o "como se encuentran de modo natural" o dominios variables de anticuerpo se refiere a anticuerpos o dominios variables de anticuerpo que tienen una secuencia de un anticuerpo o dominio variable de anticuerpo identificada a partir de una fuente no sintética, por ejemplo, a partir de una secuencia de línea germinal, o linfocitos B específicos de antígeno diferenciados obtenidos ex vivo, o su línea de células de hibridoma correspondientes o a partir del suero de un animal. Estos anticuerpos pueden incluir anticuerpos generados en cualquier tipo de respuesta inmunitaria, ya sea natural o inducida de alguna otra manera. Los anticuerpos naturales incluyen las secuencias de aminoácidos y las secuencias nucleotídicas que constituyen o que codifican para estos anticuerpos, por ejemplo, como se identifican en la base de datos de abat .
Los anticuerpos se pueden preparar por cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas por aquellos habitualmente expertos en el ámbito. Véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Los anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido de interés se pueden preparar, por ejemplo, utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol . 6: 511-519, 1976 y mejoras a la misma. También se incluyen métodos que utilizan animales transgénicos tales como ratones para expresar anticuerpos humanos. Véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature Biotechnology 14: 826, 1996; Lonberg et al., Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, 1994; y Lonberg et al., Internal Review of Immunology 13: 65-93, 1995. Los ejemplos particulares incluyen la plataforma VELOCIMMUNEMR por REGER EREXMR (véase, por ejemplo, la patente U.S. NO. 6,596,541). Los anticuerpos también pueden ser generados o identificados mediante el uso de presentación de fago o bibliotecas de presentación de levadura (véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 7,244,592; Chao et al., Nature Protocols. 1: 755-768, 2006). Los ejemplos no limitantes de bibliotecas disponibles incluyen bibliotecas clonadas o sintéticas tales como la biblioteca de anticuerpo combinatorio humano (HuCAL, por sus siglas en inglés) en la cual la diversidad estructural del repertorio de anticuerpos de humanos está representada por siete cadenas pesadas y siete genes para la región variable de la cadena ligera. La combinación de estos genes da lugar a 49 inf aestructuras en la biblioteca maestra. Al superponer casetes genéticos altamente variables (CDR = regiones determinadoras de complementariedad) sobre estas infraestructuras, se puede reproducir un vasto repertorio de anticuerpos humanos. También se incluyen bibliotecas humanas diseñadas con fragmentos que tienen como fuente donadores humanos que codifican para una región variable de cadena ligera, un CDR-3 de cadena pesada, ADN sintético que codifica para diversidad en CDR-1 de cadena pesada y ADN sintético que codifica para la diversidad en CDR-2 de cadena pesada. Otras bibliotecas adecuadas para usarse serán evidentes para las personas expertas en el ámbito .
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona adicionalmente alternativas de anticuerpo u otros agentes de unión tales como receptores solubles, adnectinas, péptidos, miméticos de péptido, aptámeros, etc. que presentan especificidad de unión por un autoanticuerpo a histidil-AR t sintetasa y composiciones de métodos de uso de las mismas. Los agentes de unión que se pueden utilizar en cualquiera de los métodos terapéuticos y composiciones que aquí se describen. Los agentes de unión basados en sustancias biológicas tales como adnectinas, receptores solubles, avímeros y trinectinas son particularmente útiles.
En ciertas modalidades, estos agentes de unión son eficaces para bloquear los anticuerpos a una histidil-ARNt sintetasa asociada con enfermedades autoinmunes. En consecuencia, estos agentes de unión se pueden utilizar para diagnosticar, tratar o evitar enfermedades, trastornos u otras condiciones que son mediadas por anticuerpos a una histidil-ARNt sintetasa asociada con enfermedades autoinmunes, por ejemplo para antagonizar o ser agonista de su actividad de manera parcial o completa.
Como se indica en lo anterior, los "péptidos" son incluidos como agentes de unión. El término péptido típicamente se refiere a un polímero de residuos aminoácidos y variantes y análogos sintéticos de los mismos. En ciertas modalidades, el término "péptido" se refiere a polipéptidos relativamente cortos, que incluye péptidos que consisten de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos, que incluyen todos los números enteros e intervalos (por ejemplo 5-10, 8-12, 10-15) entre los mismos y que interactúan con uno o más anticuerpos con una histidil -ARNt sintetasa asociada con enfermedades autoinmunes . Los péptidos pueden estar constituidos de aminoácidos como se encuentran de modo natural y/o aminoácidos que no se encuentren de modo natural, como se describe en la presente.
Además, de los péptidos que consisten únicamente de aminoácidos como se encuentran de modo natural, también se proporcionan peptidomiméticos o análogos peptídicos. Los análogos peptídicos se utilizan habitualmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellas del péptido plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denomina "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos" (Luthman, et al., A Texbook of Drug Design and Development, 14: 386-406, 2nd Ed. , Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 1699-1720 (1994); Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15: 29 (1986); Veber y Freidinger TINS, p. 392 (1985); y Evans, et al., J. Med. Chem. 30: 229 (1987)). Un péptido mimético es una molécula que imita la actividad biológica de un péptido pero que ya no es un péptido en su naturaleza química. Los compuestos peptidomiméticos se conocen en el ámbito y se describen, por ejemplo, en la patente de U.S. No. 6, 245, 886.
La presente invención también incluye peptoides. Los derivados peptoides o péptidos representan otra forma de péptidos modificados que retienen lo determinantes estructurales importantes para actividad biológica, aunque elimina los enlaces peptídicos con los que se les confiere resistencia a proteólisis (Simón, et al., PNAS USA. 89: 9367-9371, 1992) . Los peptoides son oligómeros de glicinas N sustituidas. Se han descrito numerosos grupos N-alquilo, cada uno correspondiente a la cadena lateral de un aminoácido natural. Los peptidomiméticos de la presente invención incluyen compuestos en los cuales por lo menos un aminoácido, algunos aminoácidos o todos los residuos aminoácidos han sido sustituidos por las glicinas N-sustituidas correspondientes. Las bibliotecas de peptoides se describen, por ejemplo, en la patente de U.S. No. 5,811, 387.
Los aptámeros también se incluyen como agentes de unión (véase, por ejemplo, Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; y Tuerk et al., Science. 249, 505-10, 1990). Los ejemplos de aptámeros incluyen aptámeros de ácido nucleico (por ejemplo aptámeros de ADN, aptámeros de ARN) y aptámeros peptídicos. Los aptámeros de ácido nucleico se refieren de manera general a especies de ácido nucleico que han sido manipuladas mediante rondas repetidas de selección in vitro o método equivalente tal como SELEX (siglas en inglés para evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) para unirse a diversos objetivos moleculares tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos e incluso células, tejidos y organismos. Véase, por ejemplo las patentes U.S. Nos. 6,376,190; y 6,387,620. De esta manera, se incluyen aptámeros de ácido nucleico que se unen a polipéptido de AARS descritos en la presente y/o sus asociados de unión celular.
Los aptámeros de péptido típicamente incluyen un bucle de péptido variable unido en ambos extremos a un andamiaje de proteína, una limitante estructural doble que típicamente incrementa la afinidad de unión del aptámero peptídico a niveles comparables con los de un anticuerpo (por ejemplo, en el intervalo nanomolar) . En ciertas modalidades, la longitud del bucle variable puede estar constituido de aproximadamente 10-20 aminoácidos (que incluye todos los enteros entre los mismos) y el andamiaje puede incluir cualquier proteína que tenga buena solubilidad y propiedades de compactación . Ciertas modalidades ejemplares pueden utilizar la proteína bacteriana tiorredoxina-A como una proteína de andamiaje, el bucle variable se inserta dentro del sitio activo reductor (bucle -Cys-Gly-Pro-Cys- en la proteína natural) con las dos cadenas laterales cisteínas capaces de formar un puente disulfuro. Los métodos para identificar aptámeros peptídicos se describen, por ejemplo, en la solicitud U.S. No. 2003/0108532. Por lo tanto, se incluyen aptámeros peptídicos que se unen a los polipéptidos de AARS descritos en la presente y/o sus asociados de unión celulares. La selección de aptámero peptídico se puede realizar utilizando diferentes sistemas conocidos en el ámbito que incluyen el sistema de levadura de dos híbridos. 5 También se incluyen ADNECTINSMR. AVIMERSMR, anafonos y anticalinas que se unen específicamente a un fragmento de proteína de AARS de la invención. El término ADNECTINSMR se refiere a una clase de sustancias biológicas dirigidas derivadas de fibronectina humana, una proteína extracelular LO abundante que se une de modo natural a otras proteínas.
Véanse, por ejemplo, las solicitudes U.S. Nos. 2007/00082365; 2008/0139791; y 2008/0220049. Las ADNECTINSMR típicamente consisten de una estructura principal de fibronectina natural así como los dominios de direccionamiento múltiple de una L5 porción específica de fibronectina humana. Los dominios de direccionamiento se pueden manipular para permitir que una ADNECTINMR reconozca específicamente autoanticuerpos para una histidil -AR t sintetasa asociada con enfermedades ,0 autoinmunes.
El término AVIMERSMR se refiere a proteínas de unión multiméricas o péptidos manipulados utilizando barajado de exón in vitro y presentación de fago. Los múltiples dominios de unión se unen, lo que resulta en una mayor afinidad y especificidad en comparación con dominios de inmunoglobulina de epítopo único. Véase, por ejemplo, Silverman et al., Nature Biotechnology. 23: 1556-1561, 2005; patente U.S. No. 7,166,697; y solicitudes U.S. Nos. 2004/0175756, 2005/0048512, 2005/0053973, 2005/0089932 y 2005/0221384.
También se incluyen proteínas repetidas de alquirina designadas (DARPinas) las cuales incluyen una clase de proteínas que no son inmunoglobulinas que pueden proporcionar ventajas sobre anticuerpos para unión dirigida en el descubrimiento de fármacos y en el desarrollo de fármacos. Entre otros usos, las DARPinas son adecuadas idealmente para generación de imagen in vivo o suministro de toxinas u otras cargas útiles terapéuticas debido a sus propiedades moleculares favorables que incluyen tamaño pequeño y alta estabilidad. La producción de bajo costo en bacterias y la rápida generación de muchas DARPinas específicas para objetivo vuelve al enfoque por DARPinas útil en el descubrimiento de fármacos. Adicionalmente , se pueden generar fácilmente DARPinas en formatos multiespecífieos lo que ofrece el potencial de dirigir una DARPina efectora a un órgano específico o a receptores múltiples objetivo con una molécula constituida de varias DARPinas. Véase, por ejemplo, Stumpp et al., Curr Opin Drug Discov Devel . 10: 153-159, 2007; solicitud U.S. No. 2009/0082274; y PCT/EP2001/10454.
Ciertas modalidades incluyen "monocuerpos" , los cuales típicamente utilicen el décimo dominio tipo III de fibronectina de la fibronectina humana (FNfnlO) como un andamiaje para presentar múltiples bucles de superficie para unión de objetivo. FNfnlO es una proteína pequeña (94 residuos) con una estructura ß-emparedado similar a la del plegado de inmunoglobulina. Es altamente estable sin enlace disulfuro o iones metálicos y se puede expresar en forma plegada correctamente a un nivel alto en bacterias. El andamiaje FNfnlO es compatible con virtualmente cualquier tecnología de presentación. Véase, por ejemplo, Batori et al., Protein Eng. 15: 1015-20, 2002; y Wojcik et al., Nat Struct Mol Biol . , 2010; y la patente U.S. No. 6,673,901.
Las anticalinas se refieren a una clase de miméticos de anticuerpo los cuales típicamente se sintetizan a partir de lipocalinas humanas, una familia de proteínas de unión con una región de bucle hipervariable soportada por una infraestructura estructuralmente rígida. Véase, por ejemplo, la solicitud U.S. No. 2006/0058510. Las anticalinas típicamente tienen un tamaño de aproximadamente 20 kDa. Las anticalinas se pueden caracterizar por una estructura de cilindro formada por ocho cadenas ß antiparalelas (un andamiaje de cilindro ß estable) que están conectadas por pares mediante cuatro bucles peptídicos y a una a-hélice unida. En ciertos aspectos, las desviaciones conformacionales para obtener unión específica se realizan en una o varias regiones de bucle hipervariable. Véase, por ejemplo Skerra, FEBS J. 275: 2677-83, 2008, incorporada en la presente como referencia.
COMPOSICIONES TERAPEUTICAS, FORMULACIONES FARMACEUTICAS, ADMINISTRACIÓN Y KITS Las modalidades de la presente invención incluyen composiciones terapéuticas o farmacéuticas para tratar una o varias enfermedades inflamatorias, distrofias musculares, randomiolisis , caquexia y otras enfermedades descritas en la presente, que comprenden por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS presenta una o más actividades no canónicas.
También se incluyen composiciones terapéuticas o farmacéuticas para tratar una o varias enfermedades autoinmunes que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS presenta una o más actividades no canónicas.
Algunas modalidades se relacionan con composiciones terapéuticas o farmacéuticas para tratar enfermedades autoinmunes, una o varias enfermedades inflamatorias, distrofias musculares, rabdomiolisis , caquexia y otras enfermedades descritas en la presente, que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo el cual produce reacción cruzada específicamente con un autoanticuerpo o con linfocitos T autorreactivos a partir de una enfermedad asociada con autoanticuerpos a histidil -ARNt sintetasa y/o que posee una o más actividades no canónicas. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo Th de la histidil-ARNt sintetasa.
Algunas modalidades incluyen composiciones terapéuticas o farmacéuticas para tratar enfermedades autoinmunes, una o varias enfermedades inflamatorias, distrofias musculares, rabdomiolisis , caquexia y otras enfermedades descritas en la presente, que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS de mamífero, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo de la histidil-ARNt sintetasa y/o que posee una o más actividades no canónicas y en donde el ácido nucleico está acoplado operativamente a las secuencias de control de expresión para habilitar la expresión de HRS en una célula.
Ciertas modalidades incluyen composiciones terapéuticas o farmacéuticas para tratar enfermedades asociadas con autoanticuerpos específicos para histidil-ARNt sintetasa, que comprenden una célula hospedadora recombinante, en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterologo el cual comprende por lo menos un epítopo de la histidil-ARNt sintetasa y en donde el ácido nucleico está acoplado operativamente a las secuencias de control de expresión para habilitar la expresión del HRS en una célula. También se incluyen composiciones terapéuticas o farmacéuticas para tratar enfermedades asociadas con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa, que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS es capaz de sustituir por lo menos una función canónica o no canónica de la histidil-ARNt sintetasa.
Algunas modalidades incluyen composiciones terapéuticas o farmacéuticas para tratar enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil-ARNt sintetasa, que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por la unión de autoanticuerpo asociado a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 1 x 10"7 M.
Algunas modalidades incluyen composiciones terapéuticas o farmacéuticas las cuales mejoran, optimizan o prolongan la estabilidad, homogeneidad, monodispersión o actividad de los polipéptidos de HRS.
También se incluyen en la invención composiciones médicamente útiles, terapéuticas o farmacéuticas que comprenden un polipéptido de por lo menos aproximadamente 400 aminoácidos de un polipéptido de HRS; en donde el polipéptido es: a) por lo menos aproximadamente 95% puro; b) menos de aproximadamente 5% agregado; y c) sustancialmente libre de endotoxina .
En otra modalidad, las composiciones médicamente útiles, terapéuticas o farmacéuticas comprenden un polipéptido de HRS de entre aproximadamente 40 y 80 aminoácidos, en donde el polipéptido es: a) por lo menos aproximadamente 95% puro; b) menos de aproximadamente 5% agregado; y c) sustancialmente libre de endotoxina. 5 También se incluye usos médicos nuevos de los polipéptidos de HRS en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune.
En cualquiera de estas composiciones y usos terapéuticos, las composiciones se pueden formular en soluciones farmacéuticamente aceptables, fisiológicamente aceptables y/o de grado farmacéutico para la administración a una célula, sujeto o un animal, ya sea solas o en combinación con una o más modalidades de tratamiento adicionales. También L5 se entenderá que, si se desea, las composiciones de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos o agentes farmacéuticamente activos. En este contexto, "administrado en combinación" incluye: (1) parte de jQ la misma forma de dosificación unitaria; y (2) administración por separado, pero como parte del mismo programa o régimen de tratamiento terapéutico, típicamente, aunque no de manera necesaria en el mismo día.
En algunas modalidades, las composiciones )C- comprenden una mezcla de 2 o más polipéptidos de HRS. En algunos aspectos, ' las composiciones pueden comprender aproximadamente 2 a aproximadamente 50, o aproximadamente 2 a aproximadamente 25, o aproximadamente 2 a aproximadamente 15, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más polipéptidos de HRS descritos en la presente.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que comprenden una dosis terapéutica de un polipéptido de HRS incluyen cualquiera de uno o más homólogos, ortólogos, variantes, fragmentos, polipéptidos modificados y/o isoformas como se encuentra de manera natural de histidil-ARNt sintetasa descrita en la presente (por ejemplo, cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172, ó 176-182 o cualquiera de los polipéptidos de HRS o ácidos nucleicos enumerados en, o que se pueden derivar de las tablas DI a D9) .
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por la unión a autoanticuerpo asociado a enfermedad con histidil-ARNt sintetasa natural en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 1 x 107 M. En consecuencia, en algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una afinidad menor a autoanticuerpo asociado a enfermedad en comparación con la histidil-ARNt sintetasa natural (SEC ID NO: 1) medida en una prueba de ELISA competitiva. En algunas modalidades, el polipéptido den HRS tiene una afinidad aparente por el autoanticuerpo asociado a enfermedad el cual es por lo menos aproximadamente 10 veces menor, o por lo menos aproximadamente 20 veces menor, o por lo menos aproximadamente 50 veces menor, o por lo menos aproximadamente 100 veces menor que la afinidad del autoanticuerpo asociado a enfermedad con la forma humana natural (SEC ID NO: 1) .
Para producción farmacéutica, las composiciones de polipéptido de HRS típicamente estarán sustancialmente libres de endotoxina. Las endotoxinas son toxinas asociadas con ciertas bacterias, típicamente bacterias gram-negativas , aunque las endotoxinas se pueden encontrar en bacterias gram-positivas tales como histeria monocytogenes . Las endotoxinas más prevalentes son lipopolisacáridos (LPS) o lipo-oligosacáridos (LOS) encontrados en la membrana exterior de diversas bacterias gram-negativas y las cuales representan un rasgo patogénico central en la capacidad de estas bacterias para provocar enfermedades. Cantidades pequeñas de endotoxina en humanos pueden producir fiebre, disminución de la presión sanguínea y activación de inflamación y coagulación, entre otros efectos fisiológicos adversos.
Las endotoxinas se pueden detectar utilizando técnicas habituales conocidas en el ámbito. Por ejemplo, el análisis de lisado de ameobocitos de Limulus, el cual utiliza sangre del cangrejo de herradura, es un análisis muy sensible para detectar la presencia de endotoxina. En esta prueba, niveles muy bajos de LPS pueden provocar coagulación detectable del lisado de Limulus debido a una poderosa cascada enzimática que amplifica esta reacción. Las endotoxinas también se pueden cuantificar por análisis inmunosorbente unido a enzima (ELISA) .
Para estar sustancialmente libre de endotoxinas, los niveles de endotoxina deben ser de aproximadamente o menores de aproximadamente 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 EU/mg de proteína. Típicamente, 1 ng de lipopolisacárido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 EU.
En ciertas modalidades, una composición tiene un contenido de endotoxina de aproximadamente o menor de aproximadamente 10 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 9 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 8 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 7 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 6 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 5 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 4 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 3 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 2 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 1 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 1 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 0.1 EU/mg de polipéptido de HRS, aproximadamente o menos de aproximadamente 0.1 EU/mg de polipéptido de HRS o aproximadamente o menos de aproximadamente 0.01 Eu/mg de polipéptido de HRS. En ciertas modalidades, como se indica en lo anterior, una composición es por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97% o 98% libre de endotoxina, por lo menos aproximadamente 99% libre de endotoxina y por lo menos aproximadamente 99.5% libre de endotoxina, o por lo menos aproximadamente 99.99% libre de endotoxina, en una base de peso/peso de proteína.
En algunas modalidades, una composición comprende uno o más agentes amor iguadores de pH, es decir, amortiguadores. Los amortiguadores ejemplares incluyen histidina (por ejemplo, L-histidina, D-histidina) , amortiguadores de citrato (por ejemplo, citrato de sodio, ácido cítrico, mezclas de los mismos) y amortiguadores de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio, solución salina amortiguada con fosfato (pBS) ) .
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 15 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 10 mM, o aproximadamente 0.3 mM a aproximadamente 5 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 15 mM, o aproximadamente 1 M a aproximadamente 10 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 15 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 5 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 tríM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 15 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 20 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 25 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 rriM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 30 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 30 riíM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 35 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 35 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 45 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 40 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 45 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 55 mM, o aproximadamente 45 mM a aproximadamente 50 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 55 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 55 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 55 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 55 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 55 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 55 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 55 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 55 mM aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 55 mM aproximadamente 65 mM, o aproximadamente 55 mM aproximadamente 60 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 60 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 60 mM a aproximadamente 90 mM, aproximadamente 60 mM aproximadamente 85 mM, aproximadamente 60 mM aproximadamente 80 mM, aproximadamente 60 mM aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 60 mM aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 60 mM aproximadamente 65 mM. En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 65 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 65 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 65 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 65 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 65 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 65 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 65 mM a aproximadamente 70 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 70 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 70 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 70 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 70 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 70 mM a aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 70 mM a aproximadamente 75 m . En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 75 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 75 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 75 mM a aproximadamente 85 mM, o aproximadamente 75 mM a aproximadamente 80 mM.
En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 80 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 80 mM a aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 80 mM a aproximadamente 85 mM. En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 85 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 85 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 85 mM a aproximadamente 90 mM. En algunas modalidades, el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 90 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 90 mM a aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 95 mM a aproximadamente 100 mM.
En algunas modalidades el amortiguador está presente en una concentración que varía de aproximadamente 40 -60, 41 -60, 42-60, 43- 60, 44-60, 45-60, 46-60, 47-60, 48 -60, 49 -60, 50-60, 51- 60, 52-60, 53-60, 54-60, 55-60, 56 -60, 57 -60, 58-60, 59- 60 mM, o aproximadamente 40-59, 41 -59, 42 -59, 43-59, 44-59, 45-59, 46-59, 47-59, 48-59, 49 -59, 50 -59, 51-59, 52-59, 53-59, 54-59, 55-59, 56-59, 57 -59, 58 -59 mM, o aproximadamente 40-58, 41-58, 42-58, 43 -58, 44 -58, 45-58, 46-58, 47-58, 48-58, 49-58, 50-58, 51 -58, 52 -58, 53--58, 54--58, 55-58, 56-58, 57-58 mM, o aproximadamente 40 -57, 41 -57, 42-57, 43-57, 44-57, 45-57, 46 -57, 47 -57, 48-57, 49-57, 50-57, 51-57, 52-57, 53-57, 54 -57, 55 -57, 56-57 mM, o aproximadamente 40-56, 41-56, 42 -56, 43 -56, 44- 56, 45-56, 46-56, 47-56, 48-56, 49-56, 50-56, 51-56, 52-56, 53-56, 54-56, 55-56 mM, o aproximadamente 40-55, 41-55, 42-55, 43-55, 44-55, 45-55, 46-55, 47-55, 48-55, 49-55, 50-55, 51-55, 52-55, 53-55, 54-55 mM, o aproximadamente 40-54, 41-54, 42-54, 43-54, 44-54, 45-54, 46-54, 47-54, 48-54, 49-54, 50-54, 51-54, 52-54, 53-54 mM, o aproximadamente 40-53, 41-53, 42-53, 43-53, 44-53, 45- 53, 46-53, 47-53, 48-53, 49-53, 50-53, 51-53, 52-53 mM, o aproximadamente 40-52, 41-52, 42-52, 43-52, 44-52, 45-52, 46- 52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52, 51-52 mM, o aproximadamente 40-51, 41-51, 42-51, 43-51, 44-51, 45-51, 46-51, 47-51, 48-51, 49-51, 50-51 mM, o aproximadamente 40- 50, 41-50, 42-50, 43-50, 44-50, 45-50, 46-50, 47-50, 48-50, 49-50 mM, o aproximadamente 40-49, 41-49, 42-49, 43-49, 44-49, 45-49, 46-49, 47-49, 48-49 mM, o aproximadamente 40-48, 41-48, 42-48, 43-48, 44-48, 45-48, 46-48, 47-48 mM, o aproximadamente 40-47, 41-47, 42-47, 43-47, 44-47, 45-47, 46-47 mM, o aproximadamente 40-46, 41-46, 42-46, 43-46, 44-46, 45-46 mM, o aproximadamente 40-45, 41-45, 42-45, 43-45, 44-45 mM, o aproximadamente 40-44, 41-44, 42-44, 43-44 mM, o aproximadamente 40-43, 41-43, 42-43 mM o aproximadamente 40-42, 41-42 mM, o aproximadamente 40-42 mM.
En algunas modalidades, la composición comprende un amortiguador en una concentración de aproximadamente 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0• 8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 mM, que incluye todos los intervalos entre estos valores.
En algunas modalidades, la presencia del amortiguador altera (por ejemplo, mejora, incrementa, disminuye o reduce) una o más propiedades bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas del polipéptido de HRS en relación a una composición sin el amortiguador o con un amortiguador diferente.
Por ejemplo, en ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador tiene una actividad biológica aumentada en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. Las actividades ejemplares incluyen cualquier actividad no canónica descrita en la presente, tal como actividades antiinflamatorias y otras actividades biológicas que incluyen unión a anticuerpo (por ejemplo, unión a anticuerpos anti-Jo-1) . En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en el amortiguador tiene por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces mayor o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% mayor de actividad biológica en comparación con un polipéptido de HRS correspondiente en una composición de otra manera idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En aspectos específicos, el amortiguador es un amortiguador de histidina.
En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador tiene "estabilidad" aumentada (por ejemplo, medido por su vida media) la cual es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces mayor o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% mayor que el polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En aspectos específicos, el amortiguador es un amortiguador de histidina.
En algunas modalidades, la "estabilidad" del polipéptido de HRS incluye su "estabilidad funcional" o la velocidad a la cual por lo menos una actividad biológica del polipéptido de HRS se reduce bajo un conjunto de condiciones dado durante el tiempo. Las actividades biológicas ejemplares incluyen cualquiera de una o más actividades canónicas o no canónicas descritas en la presente que incluyen, por ejemplo, la retención de por lo menos un epítopo el cual de manera específica da reacción cruzada con el anticuerpo anti-Jo-1. En algunas modalidades, la actividad biológica del polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador se reduce a una tasa que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2 , 3 , 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que la de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición de otra manera idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En aspectos específicos, el amortiguador es un amortiguador de histidina.
En ciertas modalidades, la "estabilidad" del polipéptido de HRS incluye su "estabilidad cinética" o "estabilidad térmica" , que incluye su velocidad de desnaturalización, agregación o precipitación bajo un conjunto dado de condiciones con respecto al tiempo. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador se desnaturaliza, se agrega o precipita a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que la de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición de otra manera idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente .
En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador se desnaturaliza, se agrega o precipita a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, ~ 20-25°C), o aproximadamente 37°C durante aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente por lo menos aproximadamente 7 días en una composición de otra manera idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o mayor que la temperatura de fusión de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición de otra manera idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50°C mayor que la de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición de otra manera idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En aspectos específicos el amortiguador es un amortiguador de histidina.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una homogeneidad o monodispersión mejorada o aumentada (por ejemplo, la relación de monómeros/oligómeros, relación de dímeros/oligómeros, relación de monómeros/dímeros , relación de dímeros/monómeros , relación de enlace disulfuro intercadena bajo condiciones reductoras, distribución de pesos moleculares aparentes que incluyen peso molecular alto reducido y/o picos de peso molecular bajo como se detectan por ya sea SDS-PAGE o análisis HPLC) en la presencia del amortiguador en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición de otra manera idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En algunas modalidades, la homogeneidad o monodispersión del polipéptido de HRS en el amortiguador se incrementa en por lo menos aproximadamente al menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición de otra manera idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En aspectos específicos, el amortiguador es un amortiguador de histidina a un pH dentro del intervalo de aproximadamente pH 7.0 a aproximadamente pH 7.5 o un amortiguador citrato a un pH dentro del intervalo de aproximadamente pH 7.5 a aproximadamente pH 6.5.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador histidina o citrato presente uno o varios picos de peso molecular alto disminuidos por análisis de SE-HPLC que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37°C durante aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En algunos aspectos, la composición de HRS tiene un contenido de pico de peso molecular alto, por análisis SE-HPLC, en cual es menor de aproximadamente 2% del pico principal después de 2 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición de HRS tiene un contenido de pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 1% del pico principal después de 2 días de almacenamiento a 37°C.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS en presencia del amortiguador de histidina o de citrato tiene uno o varios picos de peso molecular bajo disminuidos por análisis SE-HPLC que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menos que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37°C por aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición de otra manera es idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS en la presencia del amortiguador histidina o de citrato tiene una turbidez disminuida (A340) que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que la de un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o temperatura ambiente (por ejemplo ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición de otra manera es idéntica o comparable sin el amortiguador o con un amortiguador diferente. En algunos aspectos la composición de HRS comprende un amortiguador de histidina de aproximadamente pH de 7.0 a 7.5 y tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.5 después de 2 días de almacenamiento a 37°C. En aspectos específicos, la composición de HRS tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.05 después de 2 días de almacenamiento a 37 °C. En algunos aspectos, la composición de HRS comprende un amortiguador de citrato de aproximadamente pH 7.0 a 7.5 y tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.5 después de 2 días de almacenamiento a 37°C. En aspectos específicos, la composición de HRS tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.05 después de 2 días de almacenamiento a 37°C.
En ciertas modalidades, el pH de la composición (por ejemplo, en la presencia del agente amortiguador o amortiguador) es aproximadamente 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, o aproximadamente 8.0. En algunas modalidades, el pH de la composición varía de aproximadamente 6.0-6.1, 6.0-6.2, 6.0-6.3, 6.0-6.4, 6.0-6.5, 6.0-6.6, 6.0-6.7, 6.0-6.8, 6.0-6.9, 6.0-7.0, 6.0-7.1, 6.0-7.2, 6.0-7.3, 6.0-7.4, 6.0-7.5, 6.0-7.6, 6.0-7.7, 6.0-7.8, 6.0-7.9, 6.0-8.0, o de aproximadamente 6.5-6.6, 6.5-6.7, 6.5-6.8, 6.5-6.9, 6.5-7.0, 6.5-7.1, 6.5-7.2, 6.5-7.3, 6.5-7.4, 6.5-7.5, 6.5-7.6, 6.5-7.7, 6.5-7.8, 6.5-7.9, 6.5-8.0, o de aproximadamente 7.0-7.1, 7.0-7.2, 7.0-7.3, 7.0-7.4, 7.0-7.5, 7.0-7.6, 7.0-7.7, 7.0-7.8, 7.0-7.9, 7.0-8.0, o desde aproximadamente 7.2-7.3, 7.2-7.4, 7.2-7.5, 7.2-7.6, 7.2-7.7, 7.2-7.8, 7.2-7.9, 7.2-8.0, o de aproximadamente 7.4-7.5, 7.4-7.6, 7.4-7.7, 7.4-7.8, 7.4-7.9, 7.4-8.0, o de aproximadamente 7.5-7.6, 7.5-7.7, 7.5-7.8, 7.5-7.9, 7.5-8.0, o de aproximadamente 7.6-7.7, 7.6-7.8, 7.6-7.9 ó 7.6-8.0.
En algunas modalidades, el pH de la composición o amortiguador altera (por ejemplo, mejora, incrementa, disminuye o reduce) una o más propiedades bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas del polipéptido de HRS en relación a una composición que tiene un pH fuera de los intervalos anteriores. En modalidades específicas, el amortiguador es histidina y el pH de la composición varía de aproximadamente 7.0-7.5. En otras modalidades el amortiguador es un amortiguador citrato y el pH de la composición varía de aproximadamente 6.5-7.5. En otras modalidades, el amortiguador es un amortiguador de fosfato de sodio y el pH de la composición varía de aproximadamente 7.0-7.5.
Por ejemplo, en ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en una composición comprende: (a) un amortiguador histidina y un pH de aproximadamente 7.0-7.5, (b) un amortiguador citrato y un pH de aproximadamente 6.5-7.5, o (c) un amortiguador fosfato y un pH de aproximadamente 7.0-7.5 tiene una actividad biológica aumentada en relación a una composición comparable que tiene un pH fuera de estos intervalos en (a), (b) o (c) anteriores. Las actividades ejemplares incluyen cualquiera de las actividades no canónicas descritas en la presente tal como actividades antiinflamatorias y otras actividades biológicas que incluyen unión a anticuerpo (por ejemplo, unión a anticuerpos anti-Jo-1) . En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más actividad biológica que un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a), (b) o (c) anteriores.
En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en una composición comprende: (a) un amortiguador histidina y un pH de aproximadamente 7.0-7.5, (b) un amortiguador citrato y un pH de aproximadamente 6.5-7.5, o (c) un amortiguador fosfato y un pH de aproximadamente 7.0-7.5 tiene "estabilidad" aumentada (por ejemplo, medida por vida media) la cual es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces mayor o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% mayor que un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a) , (b) o (c) anteriores.
En algunas modalidades, la "estabilidad" del polipéptido de HRS incluye su "estabilidad funcional" o la velocidad a la cual por lo menos una actividad biológica del polipéptido de HRS se reduce bajo un conjunto dado de condiciones con respecto al tiempo. Las actividades biológicas ejemplares incluyen cualquiera de uno o más de actividades canónicas o no canónicas descritas en la presente que incluyen, por ejemplo, la retención de por lo menos un epítopo el cual proporciona una reacción cruzada específicamente con un anticuerpo anti-Jo-1. En algunas modalidades, la actividad biológica del polipéptido de HRS se reduce a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a), (b) o (c) anteriores.
En ciertas modalidades, la "estabilidad" del polipéptido de HRS incluye su "estabilidad cinética" o "estabilidad térmica", que incluye su velocidad de desnaturalización bajo un conjunto dado de condiciones con respecto al tiempo. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS se desnaturaliza a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% mayor que la temperatura de fusión de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a), (b) , o (c) anteriores. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 44, 45,, 46, 47, 48, 49, ó 50 °C mayor que un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a), (b) o (c) anteriores.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS tiene homogeneidad o monodispersión mejorada o incrementada (por ejemplo, la relación de monómeros/oligómeros , relación de dímeros/oligómeros , relación de monómeros/dímeros , relación de dímeros/monómeros , relación de formación de enlace disulfuro e intercadena bajo condiciones reductoras, distribución de los pesos moleculares aparentes, por ejemplo peso molecular alto reducido o picos de peso molecular bajo detectados ya sea por SDS-PAGE o análisis HPLC) en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a) , (b) o (c) anteriores. En algunas modalidades, la homogeneidad o monodispersión del polipéptido de HRS se incrementa en por lo menos aproximadamente por lo menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a) , (b) o (c) anteriores.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS dentro de los intervalos de pH en (a) , (b) o (c) anteriores tienen uno o varios picos de peso molecular alto disminuidos por análisis SE-HPLC que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, - 20-25°C) o a aproximadamente 37°C durante aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a), (b) o (c) anteriores.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS en los intervalos de pH en (a) , (b) o (c) anteriores tienen uno o varios picos de peso molecular bajos disminuidos por análisis SE-HPLC que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o a aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37°C durante aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a), (b) o (c) anteriores.
En ciertas modalidades, la composición del polipéptido de HRS en los intervalos de pH en (a) , (b) o (c) anteriores tienen una turbidez disminuida (A340) que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, O 500% menor que la de un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37°C durante aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días , o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable que tiene un pH fuera de los intervalos en (a), (b) o (c) anteriores.
En algunas modalidades, una composición tiene una fuerza iónica definida, por ejemplo, una concentración definida de cloruro de sodio (NaCl) u otra sal. Por ejemplo, una composición puede tener aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 ó 400 mM de NaCl u otra sal, que incluye todos los enteros e intervalos entre los mismos. En algunas modalidades, una composición tiene aproximadamente 50-300, 100-300, 150-300, 200-300, 250-300, 50-250, 100-250, 150-250, 200-250, 50-200, 100-200, 150-200, 50-150, 100-150 ó 50-100 mM de NaCl u otra sal. En ciertas modalidades, la composición tiene una alta concentración de sal, por ejemplo de aproximadamente o > aproximadamente 140 mM de NaCl, o aproximadamente > aproximadamente 280 mM de NaCl.
En algunas modalidades, la presencia de NaCl en cualesquiera de uno o más de estas concentraciones o intervalos altera (por ejemplo mejora, aumenta, disminuye o reduce) una o más propiedades bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas del polipéptido de HRS en relación a una composición sin el NaCl o en relación a una composición con una concentración de NaCl que se encuentra fuera de las cantidades o intervalos anteriores. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia de la concentración definida de NaCl se desnaturaliza, se agrega o precipita a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin la concentración definida de NaCl.
En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia de NaCl se desnaturaliza, agrega o precipita a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que la de un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o a aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, ~ 20-25°C) o aproximadamente 37°C durante aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin el NaCl con una concentración de NaCl que se encuentra fuera de las cantidades o intervalos anteriores.
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia de la concentración definida de NaCl tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% mayor que la temperatura de fusión de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin la concentración definida de NaCl. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en presencia de la concentración definida de NaCl tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50°C mayor que la de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin la composición definida de NaCl o con una concentración de NaCl que se encuentra fuera de las cantidades o intervalos anteriores. En ciertas modalidades, la composición también comprende un amortiguador, como se describe en lo anterior. En modalidades específicas, el amortiguador es un amortiguador de histidina. En otras modalidades, el amortiguador es un amortiguador de citrato.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS tiene una concentración de NaCl que varía de aproximadamente 140 mM a aproximadamente 240 mM y tiene uno o varios picos de peso molecular alto disminuidos, por análisis de SE-HPLC que son por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin el NaCl. En algunos aspectos, la composición de HRS comprende aproximadamente 140 mM a aproximadamente 280 mM de NaCl, un amortiguador de histidina que tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.5 y que tiene un contenido de pico de peso molecular alto, por análisis SE-HPLC en cual es menor de aproximadamente 2% del pico principal después de 2 días de almacenamiento a 37°C. En aspectos específicos, la composición de HRS tiene un contenido de pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 1% del pico principal después de 2 días de almacenamiento a 37°C.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS tiene una concentración de NaCl que varía de aproximadamente 140 mM a aproximadamente 240 mM y que tiene uno o varios picos de peso molecular bajo disminuidos por análisis SE-HPLC que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37°C durante aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin el NaCl o sin una concentración de NaCl que se encuentre fuera de aproximadamente 140 mM a aproximadamente 240 mM.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS tiene una concentración de NaCl que varía de aproximadamente 140 mM a aproximadamente 240 mM y que tiene una turbidez disminuida (A340) que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5oC o temperatura ambiente (por ejemplo ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37°C durante aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin el NaCl o con una concentración de NaCl que se encuentra fuera de aproximadamente 140 mM a aproximadamente 240 mM. En algunos aspectos, la composición de HRS comprende aproximadamente 140 mM a aproximadamente 280 mM de NaCl, un amortiguador de histidina que tiene un pH de aproximadamente de 7.0 a 7.5 y tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.5 después de 2 días de almacenamiento a 37°C. En aspectos específicos, la composición de HRS tiene una turbidez (A340) la cual es menor que o de aproximadamente 0.05 después de 2 días de almacenamiento a 37°C.
En algunas modalidades la composición comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes ejemplares incluyen, sin limitación, sacarosa, manitol, trehalosa, sorbitol, arginina, glicina y glicerol. En ciertas modalidades, el excipiente está presente en aproximadamente 0 • 1, 0 • 2, 0 •3, 0 • 4, 0.5, 0 • 6, 0 • 7, 0.8, 0.9, 1.0, 1-1, 1.2, 1. 3, 1. 4, 1 .5, 1 ¦ 6, 1.7, 1. .8, 1 -9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2. 5, 2. 6, 2 •7, 2 • 8, 2.9, 3. ¦ 0, 3 • 1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3. 7, 3. ,8, 3 ¦9, 4. .0, 4.1, 4. 2, 4 • 3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4. 9, 5. o, 5 • 1, 5. • 2, 5.3, 5. 4, 5 • 5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6. 1, 6. 2, 6 .3, 6. • 4, 6.5, 6. 6, 6 • 7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7. 3, 7. 4, 7. •5, 7. • 6, 7.7, 7. 8, 7 • 9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8. 5, 8. 6, 8, • 7, 8. .8, 8.9, 9. o, 9 • 1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9. 7, 9. 8, 9. 9, ó 10% (P/V; 1 , que incluye todos los intervalos entre los mismos. En algunas modalidades, el excipiente está presente en un intervalo de aproximadamente 0.1-5.0, 0.1-4.5, 0.1-4.0, 0.1-3.5, 0.1-3.0, 0.1-2.5, 0.1-2.0, 0.1-1.5, 0.1-1.0, 0.1-0.5% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 0.2-5.0, 0.2-4.5, 0.2-4.0, 0.2-3.5, 0.2-3.0, 0.2-2.5, 0.2-2.0, 0.2-1.5, 0.2-1.0, 0.2-0.5% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 0.5-5.0, 0.5-4.5, 0.5-4.0, 0.5-3.5, 0.5-3.0, 0.5-2.5, 0.5-2.0, 0.5-1.5, 0.5-1.0% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 1.0-5.0, 1.0-4.5, 1.0-4.0, 1.0-3.5, 1.0-3.0, 1.0-2.5, 1.0-2.0, 1.0-.1.5% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 1.5-5.0, 1.5-4.5, 1.5-4.0, 1.5-3.5, 1.5-3.0, 1.5-2.5, 1.5-2.0% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 2.0-5.0, 2.0-4.5, 2.0-4.0, 2.0-3.5, 2.0-3.0, 2.0-2.5% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 2.5-5.0, 2.5-4.5, 2.5-4.0, 2.5-3.5, 2.5-3.0% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 3.0-5.0, 3.0-4.5, 3.0-4.0, 3.0-3.5% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 3.5-5.0, 3.5-4.5, 3.5-4.0% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 4.0-5.0, 4.0-4.5 ó 4.5-5.0% (p/v). En algunas modalidades, el excipiente está presente en una concentración de aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 ó 400 mM, que incluye todos los intervalos entre estos valores. En algunas modalidades, el excipiente está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-400, 100-400, 150-400, 200-400, 250-400, 300-400, 350-400, 50-350, 100-350, 150-350, 200-350, 250-350, 300-350, 50-300, 100-300, 150-300, 200-300, 250-300, 50-250, 100-250, 150-250, 200-250, 50-200, 100-200, 150-200, 50-150, 100-150 ó 50-100 mM .
En algunas modalidades, la presencia de uno o más excipientes altera (por ejemplo, mejora, incrementa, disminuye, reduce) una o más propiedades bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas del polipéptido de HRS en relación a una composición sin uno o varios de los excipientes o en relación a una composición con una concentración de uno o varios de los excipientes que se encuentra fuera de las cantidades o intervalos anteriores. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia de uno o varios excipientes se desnaturaliza a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que la de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno o varios de los excipientes. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia de uno o varios excipientes tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% mayor que la temperatura de fusión de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno o varios de los excipientes. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en presencia de uno o varios de los excipientes tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50°C mayor que la de un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno o varios de los excipientes.
En ciertas modalidades, la composición también comprende un amortiguador, como se describe en lo anterior y opcionalmente tiene una concentración definida de NaCl, como se describe en lo anterior. En modalidades específicas, el amortiguador es un amortiguador de histidina. En otras modalidades, el 5 amortiguador es un amortiguador de citrato.
En ciertas modalidades, una composición comprende uno o más tensioactivos . Los tensioactivos ejemplares incluyen, sin limitación, polisorbatos y poloxámeros . Los polisorbatos son líquidos oleosos derivados de sorbitano LO PEGilado (un derivado de sorbitol) que son esterificados con ácidos grasos. Algunos polisorbatos se venden bajo los nombres comerciales AlkestMR, CanarcelMR y TweenMR. Los polisorbatos ejemplares incluyen polisorbato 20 (polioxietileno (20) de monolaurato de sorbitano), polisorbato 40 (polioxietileno (20) de monopalmitato de sorbitano) , polisorbato 60 (polioxietileno (20) de monoestearato de sorbitano) y polisorbato 80 (polioxietileno (20) de monoaleato de sorbitano) . Los poloxámeros son ¡0 copolímeros tribloque no iónicos que comprenden una cadena hidrofóbica central de polioxipropileno (poli (óxido de propileno) ) flanqueada por dos cadenas hidrofílicas de polioxietileno (poli (óxido de etileno) ) . Algunos poloxámeros se venden bajo los nombres comerciales SynperonicsMR . ,c- PluronicsM y KolliphorMR. En ciertas modalidades, el tensioactivo está presente en aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 ó 3.0% (p/v) que incluye todos los intervalos entre estos valores. En algunas modalidades, el tensioactivo está presente en un intervalo de aproximadamente 0.01-3.0, 0.01-2.5, 0.01-2.0, 0.01-1.5, 0.01-1.0, 0.01-1.5, 0.01-1.0, 0.01-0.5, 0.01-0.1% (p/v), o en un intervalo de aproximadamente 0.05-3.0, 0.05-2.5, 0.05-2.0, 0.05-1.5, 0.05-1.0, 0.05-1.5, 0.05-1.0, 0.05-0.5, 0.05.0.1% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 0.1-3.0, 0.1-2.5, 0.1-2.0, 0.1-1.5, 0.1-1.0, 0.1-1.5, 0.1-1.0, 0.1-0.5% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 0.5-3.0, 0.5-2.5, 0.5-2.0, 0.5-1.5, 0.5-1.0, 05.1.5, 0.5-1.0% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 1.0-3.0, 1.0-.25, 1.0-1.5% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 1.5-3.0, 1.5-2.5, 1.5-2.0% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 2.0-3.0, 2.0-2.5% (p/v) o en un intervalo de aproximadamente 2.5-3.0% (p/v) . En algunas modalidades, el tensioactivo es Polisorbato 20 (PS20) . En ciertas modalidades, el tensioactivo es el poloxámero Pluronic F68.
En algunas modalidades, la presencia de uno o más tensioactivos altera (por ejemplo, mejora, aumenta, disminuye, reduce) una o más propiedades bioquímicas, físicas y/o farmacocinéticas del polipéptido de HRS en relación a una composición sin uno o varios de los tensioactivos , o en relación a una composición con una concentración de uno o varios tensioactivos que se encuentran fuera de las cantidades o intervalos anteriores. En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia de uno o varios tensioactivos se desnaturaliza, se agrega o precipita a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno o varios de los tensioactivos.
En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS en presencia de uno o varios tensioactivos se desnaturaliza, se agrega o precipita a una velocidad que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 veces más lenta o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% más lenta que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o a aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, ~ 20-25°C) o aproximadamente 37°C durante aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno o varios de los tensioactivos .
En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en la presencia de uno o varios de los tensioactivos tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% mayor que la temperatura de fusión del polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno o varios de los tensioactivos. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS en presencia de uno varios de los tensioactivos tiene una temperatura de fusión (Tm) que es por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 Ó 50°C mayor que un polipéptido de HRS correspondiente en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno varios de los tensioactivos. En ciertas modalidades, la composición también comprende un amortiguador, como se describe en lo anterior y opcionalmente tiene una concentración definida de NaCl, como se describe en lo anterior y opcionalmente comprende uno o más excipientes como se describen en lo anterior. En modalidades específicas, el amortiguador es un amortiguador de histidina. En otras modalidades, el amortiguador es un amortiguador de citrato.
En ciertas modalidades, la composición de 5 polipéptido de HRS en presencia de uno o varios tensioactivos tiene uno o varios picos de peso molecular alto disminuidos, por análisis de SE-HPLC que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 10 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, - 20- 25°C) o a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno varios de los tensioactivos.
En algunos aspectos, la composición de HRS ^ comprende PS20, un amortiguador de histidina que tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.5 y NaCl aproximadamente 140 mM y que tiene un contenido de pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 1% del pico principal por análisis SE-HPLC después de 7 días de almacenamiento a 37°C.
^ En algunos aspectos, la composición de HRS tiene un contenido de pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 0.5% del pico principal después de 7 días de almacenamiento a 37°C.
En algunos aspectos la composición de HRS comprende PS80, un amortiguador de histidina que tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.5 y NaCl aproximadamente 140 mM y que tiene un contenido de pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 2% del pico principal por análisis SE-HPLC después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición de HRS tiene un contenido de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 0.5% del pico principal después de 7 días de almacenamiento a 37°C.
En algunos aspectos, la composición de HRS comprende pluronic F68, un amortiguador de histidina que tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.5 y NaCl aproximadamente 140 mM y que tiene un contenido de pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 1% del pico principal por análisis SE-HPLC después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición de HRS tiene un contenido de pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 0.5% del pico principal después de 7 días de almacenamiento a 37°C.
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS en presencia de uno o varios tensioactivos tiene uno o varios picos de peso molecular bajo disminuidos, por análisis SE-HPLC, que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37°C durante aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno o varios de los tensioactivos .
En ciertas modalidades, la composición de polipéptido de HRS en uno o varios tensioactivos tiene turbidez disminuida (A340) que es por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces menor o por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, o 500% menor que un polipéptido de HRS correspondiente cuando se incuba a aproximadamente 5°C o a aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo ~ 20-25°C) o a aproximadamente 37°C durante aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 horas, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 3 días, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 7 días en una composición que de otra manera es idéntica o comparable sin uno o varios de los tensioactivos .
En algunos aspectos, la composición de HRS comprende PS20, un amortiguador de histidina que tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.5 y NaCl aproximadamente 140 mM y que tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.5 después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición de HRS tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.2 después de 7 días de almacenamiento a 37°C.
En algunos aspectos, la composición de HRS comprende PS80, un amortiguador de histidina que tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.5 y NaCl aproximadamente 140 mM y que tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.5 después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición de HRS tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.2 después de 7 días de almacenamiento a 37°C.
En algunos aspectos, la composición de HRS comprende pluronic F68, un amortiguador de histidina que tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.5 y NaCl aproximadamente 140 mM y que tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.5 después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición de HRS tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.2 después de 7 días de almacenamiento a 37°C.
En ciertas modalidades, una composición comprende uno o más compuestos antioxidantes. Los antioxidantes ejemplares incluyen, sin limitación, cisteína, metionina, N-acetilcisteína (NAC) y glutatión, tocoferoles, carotenos, ubiquinol y ácido ascórbico. En algunas modalidades, el compuesto antioxidante está presente en una concentración de aproximadamente 0 •1, 0 .2, 0 •3, 0 • 4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1. 3, 1. 4, 1. 5, 1. 6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2. 5, 2. 6, 2. 7, 2. 8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3. 7, 3. 8, 3. 9, 4. o, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4. 9, 5. o, 5. 1, 5. 2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6. 1, 6. 2, 6. 3, 6. 4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7. 3, 7. 4, 7. 5, 7. 6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8. 5, 8. 6, 8. 7, 8. 8, 8.9, 9.0, 9-1, 9.2, 9.3, 9-4, 9.5, 9.6, 9. 7, 9. 8, 9. 9, Ó 10 mM, incluyendo todos los intervalos entre estos valores. En algunas modalidades, el compuesto antioxidante está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1-5.0, 0.1-4.5, 0.1-4.0, 0.1-3.5, 0.1-3.0, 0.1-2.5, 0.1-2.0, 0.1-1.5, 0.1-1.0, 0.1-0.5 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 0.2-5.0, 0.2-4.5, 0.2-4.0, 0.2-3.5, 0.2-3.0, 0.2-2.5, 0.2-2.0, 0.2-1.5, 0.2-1.0, 0.2-0.5 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 0.5-5.0, 0.5-4.5, 0.5-4.0, 0.5-3.5, 0.5-3.0, 0.5-2.5, 0.5-2.0, 0.5-1.5, 0.5-1.0 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 1.0-5.0, 1.0-4.5, 1.0-4.0, 1.0-3.5, 1.0-3.0, 1.0-2.5, 1.0-2.0, 1.0-1.5 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 1.5-5.0, 1.5-4.5, 1.5-4.0, 1.5-3.5, 1.5-3.0, 1.5-2.5, 1.5-2.0 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 2.0-5.0, 2.0-4.5, 2.0-4.0, 2.0-3.5, 2.0-3.0, 2.0-2.5 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 2.5-5.0, 2.5-4.5, 2.5-4.0, 2.5-3.5, 2.5-3.0 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 3.0-5.0, 3.0-4.5, 3.0-4.0, 3.0-3.5 mM o un intervalo de concentración de aproximadamente 3.5-5.0, 3.5-4.5, 3.5-4.0 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 4.0-5.0, 4.0-4.5 ó 4.5-5.0 mM.
En algunas modalidades, la composición comprende un agente quelante. Los agentes quelantes ejemplares incluyen, sin limitación, etilendiamino tetraacetato (EDTA) , ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) , ácido l,2-bis(o-aminofenoxi) etano-N, ?,?' ,?' -tetraacético (BAPTA) y ácido 2 , 3 -dimercapto-l-propansulfónico (DMPS) . En ciertas modalidades, el agente quelante está presente en una concentración de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, ó 5.0 mM, que incluye todos los intervalos entre estos valores . En algunas modalidades, el agente quelante está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1-5.0, 0.1-4.5, 0.1-4.0, 0.1-3.5, 0.1-3.0, 0.1-2.5, 0.1-2.0, 0.1-1.5, 0.1-1.0, 0.1-0.5 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 0.2-5.0, 0.2-4.5, 0.2-4.0, 0.2-3.5, 0.2-3.0, 0.2-2.5, 0.2-2.0, 0.2-1.5, 0.2-1.0, 0.2-0.5 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 0.5-5.0, 0.5-4.5, 0.5-4.0, 0.5-3.5, 0.5-3.0, 0.5-2.5, 0.5-2.0, 0.5-1.5, 0.5-1.0 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 1.0-5.0, 1.0-4.5, 1.0-4.0, 1.0-3.5, 1.0-3.0, 1.0-2.5, 1.0-2.0, 1.0-.1.5 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 1.5-5.0, 1.5-4.5, 1.5-4.0, 1.5-3.5, 1.5-3.0, 1.5-2.5, 1.5-2.0 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 2.0-5.0, 2.0-4.5, 2.0-4.0, 2.0-3.5, 2.0-3.0, 2.0-2.5 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 2.5-5.0, 2.5-4.5, 2.5-4.0, 2.5-3.5, 2.5-3.0 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 3.0-5.0, 3.0-4.5, 3.0-4.0, 3.0-3.5 mM o un intervalo de concentración de aproximadamente 3.5-5.0, 3.5-4.5, 3.5-4.0 mM, o un intervalo de concentración de aproximadamente 4.0-5.0, 4.0-4.5 ó 4.5-5.0 mM.
En algunas modalidades, una composición y/o uno o varios de los polipéptidos de HRS contenidos en la misma se caracterizan por una o más propiedades físicas absolutas tales como el grado de agregación de peso molecular alto (o formación de agregado) , apariencia o claridad (por ejemplo, turbidez, opalescencia), grado de homogeneidad o monodispersión, solubilidad, pureza de proteína, temperatura de fusión, concentración de proteína y/o grado de fragmentación de proteínas.
En ciertos aspectos, una composición tiene un contenido de agregados de aproximadamente o menor de aproximadamente 10% en relación a la cantidad total de proteína presente, o en algunas modalidades una composición tiene un contenido de agregado de aproximadamente o menos de aproximadamente 9%, 8%, 7%, 6% o 5% o en algunos aspectos una composición tiene un contenido de agregado de aproximadamente o menos de aproximadamente 4%, 3% o 2%, o en aspectos específicos una composición tiene un contenido de agregado de aproximadamente o menos de aproximadamente 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, o 0.1%. En algunas modalidades, el contenido de agregado es un contenido de agregado de peso molecular alto. El contenido de agregado de peso molecular alto se puede determinar por una diversidad de técnicas analíticas que incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño (SE-HPLC) , dispersión de luz dinámica, análisis SDS-PAGE y ultracentrifugación analítica.
En algunos aspectos, la apariencia de una composición es clara y carece de partículas significativas o formación de fibras. La claridad de una composición se puede caracterizar, por ejemplo, por su turbidez, opalescencia o ambas. La turbidez se puede medir por absorbancia a A340 y la opalescencia se puede medir por absorbancia a A580. En algunas modalidades, la turbidez de una composición, medida por absorbancia a A340 es aproximadamente o menor de 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002 ó 0.001. En ciertas modalidades, la opalescencia de una composición, medida por absorbancia a A580 es aproximadamente o menor de aproximadamente 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002 ó 0.001.
En algunos aspectos, una composición comprende uno o más polipéptidos de HRS que están sustancialmente homogéneos o monodispersos , lo que significa que las composiciones de polipéptido de HRS existen sustancialmente (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o mayor) en una forma de peso molecular aparente cuando se determina, por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño, dispersión de luz dinámica, SDS-PAGE o ultracentrifugacion analítica. En algunos aspectos, el polipéptido de HRS existe sustancialmente como un monómero. En ciertos aspectos, el polipéptido de HRS existe sustancialmente como un dímero . En algunos aspectos, estas composiciones pueden comprender DTT, u otros agentes reductores adecuados para reducir la formación de enlace disulfuro.
En ciertas modalidades, los polipéptidos de HRS tienen una solubilidad que es deseable para el modo de administración particular tal como administración intravenosa, administración subcutánea, etc. Los ejemplos de solubilidades deseables incluyen aproximadamente o por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 mg/ml, o por lo menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 mg/ml, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, o 49 mg/ml, o aproximadamente o por lo menos aproximadamente 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 mg/ml.
En algunos aspectos, una composición tiene una pureza en una base de proteína (por ejemplo, polipéptido de HRS en relación a otras proteínas celulares) de aproximadamente o por lo menos aproximadamente 90%, o en algunos aspectos tiene una pureza en una base de proteína de aproximadamente o por lo menos aproximadamente 95% , 96%, 97%, o 98%, o en algunos aspectos tiene una pureza en una base de proteína de aproximadamente o por lo menos aproximadamente 99% o 99.5%. La pureza se puede determinar por medio de cualquier método analítico habitual, como se conoce en el ámbito.
En algunos aspectos, el polipéptido de HRS en una composición dada tiene una estabilidad térmica definida, como se caracteriza, por ejemplo, por la temperatura de fusión (Tm) . En algunos aspectos, el polipéptido de HRS en una composición tiene una Tm de aproximadamente o por lo menos aproximadamente 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 o 70°C. En ciertos aspectos, el polipéptido de HRS en una composición tiene una Tm que varía de aproximadamente 45-70, 46-70, 47-70, 48-70, 49-70, 50-70, 51-70, 52-70, 53- 70, 54-70, 55-70, 56-70, 57-70, 58-70, 59-70, 60-70, 61-70, 62-70, 63-70, 64-70, 65-70, 66-70, 67-70, 68-70, o 69-70°C, o varía de aproximadamente 45-69, 46-69, 47-69, 48-69, 49-69, 50-69, 51-69, 52-69, 53-69, 54-69, 55-69, 56-69, 57-69, 58-69, 59-69, 60-69, 61-69, 62-69, 63-69, 64-69, 65-69, 66-69, 6769, 68-69°C, o varía de aproximadamente 45-68, 46-68, 47-68, 48-68, 49-68, 50-68, 51-68, 52-68, 53-68, 54-68, 55-68, 56-68, 57-68, 58-68, 59-68, 60-68, 61-68, 62-68, 63-68, 64-68, 65-68, 66-68, 67-68°C, o varía de aproximadamente 45-67, 46-67, 47-67, 48-67, 49-67, 50-67, 51-67, 52-67, 53-67, 54-67, 55-67, 56-67, 57-67, 58-67, 59-67, 60-67, 61-67, 62-67, 63-67, 64-67, 65-67, 66-67°C, o varía de aproximadamente 45-66, 46-66, 47-66, 48-66, 49-66, 50-66, 51-66, 52-66, 53-66, 54-66, 55-66, 56-66, 57-66, 58-66, 59-66, 60-66, 61-66, 62-66, 63-66, 64-66, 65-66°C, o varía de aproximadamente 45-65, 46-65, 47-65, 48-65, 49-65, 50-65, 51-65, 52-65, 53-65, 54-65, 55-65, 56-65, 57-65, 58-65, 59-65, 60-65, 61-65, 62-65, 63-65, 64-65°C, o varía de aproximadamente 45-64, 46-64, 47-64, 48-64, 49-64, 50-64, 51-64, 52-64, 53-64, 54-64, 55-64, 56-64, 57-64, 58-64, 59-64, 60-64, 61-64, 62-64, 63-64°C, o varía de aproximadamente 45-63, 46-63, 47-63, 48-63, 49-63, 50-63, 51-63, 52-63, 53-63, 54-63, 55-63, 56-63, 57-63, 58-63, 59-63, 60-63, 61-63, 62-63°C, o varía de aproximadamente 45-62, 46-62, 47-62, 48-62, 49-62, 50-62, 51-62, 52-62, 53-62, 54-62, 55-62, 56-62, 57-62, 58-62, 59-62, 60-62, 61-62°C, o varía de aproximadamente 45-61, 46-61, 47-61, 48-61, 49-61, 50-61, 51-61, 52-61, 53-61, 54-61, 55-61, 56-61, 57-61, 58-61, 59-61, 60-61°C, o varía de aproximadamente 45-60, 46-60, 47-60, 48-60, 49-60, 50-60, 51-60, 52-60, 53-60, 54-60, 55-60, 56-60, 57-60, 5860, 59-60°C, o varía de aproximadamente 45-59, 46-59, 47-59, 48-59, 49-59, 50-59, 51-59, 52-59, 53-59, 54-59, 55-59, 56-59, 57-59, 58-59°C, o varía de aproximadamente 45-58, 46-58, 47-58, 48-58, 49-58, 50-58, 51-58, 52-58, 53-58, 54- 58, 55-58, 56-58, 57-58°C, o varía de aproximadamente 45-57, 46-57, 47-57, 48-57, 49-57, 50-57, 51-57, 52-57, 53-57, 54-57, 55-57, 56-57°C, o varía de aproximadamente 45 -56, 46-56, 47-56, 48-56, 49-56, 50-56, 51-56, 52- 56, 53 -56, 54-56, 55--56°' C, o varía de aproximadamente 45-55, 46 -55, 47-55, 48 -55, 49-55, 50-55, 51-55, 52-55, 53-55, 54 -55° C, o varía de aproximadamente 45-54, 46-54, 47-54, 48 -54, 49-54, 50 -54, 51-54, 52-54, 53-54°C, o varía de aproximadamente 45-53, 46-53, 47-53, 48-53, 49-53, 50-53, 51-53, 52-53°C, o varía de aproximadamente 45-52, 46-52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52, 51-52°C, o varía de aproximadamente 45-51, 46-51, 47-51, 48-51, 49-51, 50-51°C, o varía de aproximadamente 45-50, 46-50, 47-50, 48-50, 49-50°C, o varía de aproximadamente 45-49, 46-49, 47-49, 48-49°C, o varía de aproximadamente 45-48, 46-48, 47-48, 45-47, 46-47 o 45-46°C. La temperatura de fusión se puede determinar por una diversidad de métodos analíticos que incluyen, por ejemplo, fluorimetría de exploración diferencial (DSF) .
En algunos aspectos, el polipéptido de HRS está presente en una composición a una concentración de proteína definida. Por ejemplo, ciertas composiciones tienen una concentración de uno o varios de los polipéptidos de HRS de aproximadamente o por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 mg/ml . Algunas composiciones tienen una concentración de uno o varios polipéptidos de H S que varía de aproximadamente 5-100, 10-100, 15-100, 20-100, 25-100, 30-100, 35-100, 40-100, 45-100, 50-100, 55-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100 mg/ml , o de aproximadamente 5-90, 10-90, 15-90, 20-90, 25-90, 30-90, 35-90, 40-90, 45-90, 50-90, 55-90, 60-90, 70-90, 80-90 mg/ml, o de aproximadamente 5-80, 10-80, 15-80, 20-80, 25-80, 30-80, 35-80, 40-80, 45-80, 50-80, 55-80, 60-80, 70-80 mg/ml, o de aproximadamente 5-70, 10-70, 15-70, 20-70, 25-70, 30-70, 35-70, 40-70, 45-70, 50-70, 55-70, 60-70 mg/ml, o de aproximadamente 5-60, 10-60, 15-60, 20-60, 25-60, 30-60, 35-60, 40-60, 45-60, 50-60, 55-60 mg/ml, o de aproximadamente 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50 mg/ml, o de aproximadamente 5-45, 10-45, 15-45, 20-45, 25-45, 30-45, 35-45, 40-45 mg/ml, o de aproximadamente 5-40, 10-40, 15-40, 20-40, 25-40, 30-40, 35-40 mg/ml, o de aproximadamente 5-35, 10-35, 15-35, 20-35, 25-35, 30-35 mg/ml, o de aproximadamente 5-30, 10-30, 15-30, 20-30, 25-30 mg/ml, o de aproximadamente 5-25, 10-25, 15-25, 20-25, 5-20, 10-20, 15-20, 5-15, 10-15, o 5-10 mg/ml de proteína .
En ciertos aspectos, una composición tiene un grado de fragmentación de proteína de menos de aproximadamente 10% en relación a la cantidad total de proteína presente, o en algunas modalidades, una composición tiene un grado de fragmentación de proteína de menos de aproximadamente 9%, 8%, 7%, 6%, o 5% o algunos aspectos, una composición tiene un grado de fragmentación de proteína de menos de aproximadamente 4%, 3% o 2%, o en aspectos específicos una composición tiene un grado de fragmentación de proteína de menos de aproximadamente 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, o 0.1%. La fragmentación de proteína se puede medir por una diversidad de técnicas analíticas que incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño, análisis por SDS-PAGE y ultracentrifugación analítica.
En modalidades específicas, la composición terapéutica comprende por lo menos un polipéptido de HRS sustancialmente puro, opcionalmente en una concentración de por lo menos aproximadamente 10-50 mg/ml, histidina aproximadamente 40-50 mM (por ejemplo, L-histidina, NaCl aproximadamente 140-240 mM, trehalosa aproximadamente 1-2%, polisorbato 20 (PS20) , aproximadamente 0.20-0.05%, tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.5 y está sustancialmente libre de endotoxina. En algunos aspectos, la composición terapéutica está caracterizada por un contenido pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 1% del pico principal por análisis SE-HPLC después de 7 días de almacenamiento a 37 °C. En algunos aspectos, la composición terapéutica tiene un contenido pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 0.5% del pico principal por análisis SE-HPLC después de 7 días de almacenamiento a 37 °C.
En algunos aspectos, la composición terapéutica está caracterizada por una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.5 después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición terapéutica tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.2 después de 7 días de almacenamiento a 37 °C.
En otras modalidades, la composición comprende por lo menos un polipéptido de HRS sustancialmente puro, opcionalmente en una concentración de por lo menos aproximadamente 10-50 mg/ml, histidina (por ejemplo, L-histidina) aproximadamente 40-50 mM, NaCl aproximadamente 140-240 mM, sacarosa aproximadamente 1-2%, polisorbato 20 (PS20) aproximadamente 0.01-0.05%, tiene un pH de aproximadamente 7.3 y está sustancialmente libre de endotoxina. En algunos aspectos, la composición terapéutica está caracterizada por un contenido pico de peso molecular alto el cual es menor de aproximadamente 1% del pico principal por análisis SE-HPLC después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición terapéutica tiene un contenido pico de peso molecular alto por análisis SE-HPLC el cual es menor de aproximadamente 0.5% del pico principal después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En alguno aspectos, la composición terapéutica está caracterizada por una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.5 después de 7 días de almacenamiento a 37°C. En algunos aspectos, la composición terapéutica tiene una turbidez (A340) la cual es menor de aproximadamente 0.2 después de 7 días de almacenamiento a 37 °C.
En ciertas modalidades, el polipéptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente de cualquiera de 5 las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172, o 176-182, o un polipéptido de HRS incluido en o derivable de cualquiera de las Tablas 1 a 9, que incluye variantes de las mismas. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS es HRS (1-506) o HRS (2-506), o una variante del mismo, el cual LO tiene una Tm en la composición de por lo menos aproximadamente 58, 59, 60, o 61°C.
Las propiedades bioquímicas, físicas y/o fármacocinéticas de las composiciones de polipéptido de HRS L5 que aquí se describen se pueden caracterizar bajo cualquier conjunto de condiciones definidas, tales como temperatura, pH u otra condición y opcionalmente en un tiempo dado durante un período de tiempo. Por ejemplo, en algunas modalidades, estas propiedades se caracterizan a una temperatura de ,Q aproximadamente -80, -60, -40, -20, -10, -5, -4, -3, -20, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100°C, que incluyen todos los >,- números enteros e intervalos entre los mismos. En algunas modalidades, estas propiedades están caracterizadas aproximadamente a temperatura ambiente (por ejemplo, 20-25°C) . Estas propiedades también pueden ser caracterizadas durante un período de tiempo, por ejemplo, durante un período de aproximadamente 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas, o durante un período de aproximadamente 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 días, o durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, o 24 semanas o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o similar. En algunas modalidades, estas propiedades están caracterizadas después de congelamiento-recalentamiento de la composición a por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de un polipéptido de HRS . Para una revisión sobre sales adecuadas véase Handbook of Pharmaceutical Salts ; Properties, Selection, and Use por Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, 2002) . Las sales de base adecuadas se forman a partir de bases las cuales forman sales no tóxicas. Los ejemplos representativos incluyen sales de aluminio, arginina, benzatina, calcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnesio, meglumina, olamina, potasio, sodio, trometamina y zinc. Las hemisales de ácidos y bases también se pueden formar, por ejemplo, sales de hemisulfato y hemicalcio. Las composiciones que van a ser utilizadas en la invención adecuadas para administración parenteral pueden comprender soluciones y/o suspensiones acuosas estériles de los ingredientes farmacéuticamente activos que preferiblemente se vuelven isotónicas con la sangre del receptor, generalmente utilizando cloruro de sodio, glicerina, glucosa, manitol, sorbitol y similares. Los ácidos orgánicos adecuados para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen, a modo de ejemplo y no como limitación, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido palmítico, ácido benzoico, ácido 3- (4-hidroxibenzoil) benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácidos alquilsulfónicos (por ejemplo ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido 1 , 2 -etan-disulfónico, ácido 2 -hidroxietansulfónico, etc.), ácidos arilsulfónicos (por ejemplo, ácido bencensulfónico, ácido 4 -clorobencensulfónico, ácido 2-naftalensulfónico, ácido 4-toluensulfónico, ácido camforsulfónico, etc.), ácido 4 -metilbiciclo (2.2.2 ) -oct-2 -eno- 1-carboxílico, ácido glucoheptónico, ácido 3 -fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido terbutilacético, ácido laurilsulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicíclico, ácido esteárico, ácido mucónico y similares.
En modalidades particulares, el portador puede incluir agua. En algunas modalidades, el portador puede ser una solución acuosa de solución salina, por ejemplo, agua que contiene concentraciones fisiológicas de sodio, potasio, calcio, magnesio y cloruro a un pH fisiológico. En algunas modalidades, el portador puede ser agua y la formulación puede incluir adicionalmente NaCl . En algunas modalidades, la formulación puede ser isotónica. En algunas modalidades, la formulación puede ser hipotónica. En otras modalidades, la formulación puede ser hipertónica. En algunas modalidades, la formulación puede ser isoosmótica. En algunas modalidades, la formulación está sustancialmente libre de polímeros (por ejemplo, polímeros formadores de gel, agentes poliméricos que incrementa la viscosidad, etc.). En algunas modalidades, la formulación está sustancialmente libre de agentes que incrementen la viscosidad (por ejemplo, carboximetilcelulosa, polímeros polianiónicos , etc.) . En algunas modalidades, la formulación está sustancialmente libre de polímeros formadores de gel. En algunas modalidades, la viscosidad de la formulación es aproximadamente la misma viscosidad de una solución salina que contiene la misma concentración de un polipéptido de HRS (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) .
Las composiciones farmacéuticas de la invención, formulación de excipientes farmacéuticamente aceptables y soluciones portadoras es bien conocida por aquellos expertos en el ámbito así como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usarse de las composiciones particulares que aquí se describen en una diversidad de regímenes de tratamiento que incluyen, por ejemplo, formulaciones orales, parenterales , intravenosas, intranasales y administración intramuscular.
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se pueden suministrar por medio de administración oral a un sujeto. De esta manera, estas composiciones se pueden formular con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o suave o pueden comprimirse en tabletas o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el suministro de polipéptidos de HRS y métodos para su preparación serán evidentes con facilidad por aquellos expertos en el ámbito.
Estas composiciones y métodos para su preparación se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Phaxr ceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995) .
La administración de una dosis terapéutica de un polipéptido de HRS puede ser por cualquier método adecuado conocido en las técnicas médicas que incluyen, por ejemplo, administración oral, rectal, intranasal, parenteral, que incluye las vías intravítreal , subconjuntival , subtendonal, retrobulbar, supracoroidal intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , intratecal, intraventricular, intrauretral , intraesternal , intracraneal, intramuscular, intrasinovial, intraocular, tópica y subcutánea. Los dispositivos adecuados para administración parenteral incluyen inyectores de aguja (que incluyen microagujas) , inyectores sin agujas y técnicas de infusión.
Las formulaciones parenterales típicamente son soluciones acuosas las cuales pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes amortiguadores (preferiblemente a un pH de 3 a 9) pero, en algunas aplicaciones pueden ser formuladas de manera más adecuada como una solución no acuosa estéril o como una forma seca para ser utilizada junto con un vehículo adecuado tal como una solución estéril, sustancialmente libre de pirógenos o agua libre de pirógenos. La preparación de formulaciones parenterales bajo condiciones estériles, por ejemplo por liofilización se puede llevar a cabo fácilmente utilizando técnicas farmacéuticas convencionales bien conocidas por los expertos en el ámbito.
Las formulaciones para administración parenteral se pueden formular para ser de liberación inmediata o sostenida. Las composiciones de liberación sostenida incluyen liberación retardada, modificada, por pulsos, controlada, dirigida y programada. De esta manera, un polipéptido de HRS se puede formular como una suspensión o como un sólido, semisólido o líquido tixotrópico para administración como un depósito implantado que proporcionan liberación sostenida de polipéptidos de HRS. Los ejemplos de estas formulaciones incluyen, sin limitación, endoprótesis recubiertas con fármaco y semisólidos y suspensiones que comprenden formas cargadas con fármaco de poliácidos (DL-láctico-co-glicólico) (PGLA, por sus siglas en inglés), poli (DL-lactida-co-glicolida) (PLG, por sus siglas en inglés) o vesículas laminares de poli ( lactida) (PLA, por sus siglas en inglés) o micropartículas , hidrogeles (Hoffman AS: Ann. N. Y. Acad. Sci. 944: 62-73 (2001)), sistemas de nanopartículas de poliaminoácidos tales como el sistema Medusa desarrollado por Flamel Technologies Inc., sistemas de geles no acuosos tal como Atrigel desarrollado por Atrix, Inc., y SABER (siglas en inglés para liberación extendida de isobutirato y acetato de sacarosa) desarrollado por Durect Corporation, y sistemas basados en lípidos tales como DepoFoam desarrollado por Skye harma .
Como se indica en lo anterior, las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua y mezclar adecuadamente con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa, polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80) o Pluronic F68. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar el crecimiento de 5 microorganismos .
Las formas farmacéuticas adecuadas para usarse inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (patente U.S. No. 5,466,468, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad) . En todos los casos las formas deben ser estériles y deben ser fluidas en la medida en que exista facilidad para suministro por jeringa. Deben ser estables bajo las condiciones de manufactura y L5 almacenamiento y deben estar conservadas contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede incluir un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol ,Q (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) , mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Se puede mantener fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula ,i- requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos . La prevención de acción de microorganismos se puede facilitar por diversos agentes antibacterianos y antimicóticos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo mediante el uso de composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administración parenteral, en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser amortiguada adecuadamente si es necesario, y el líquido primero se debe volver isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal . A este respecto, un medio acuoso estéril que se puede utilizar se conoce por aquellos expertos en el ámbito en base en la descripción presente. Por ejemplo, una dosificación se puede disolver en 1 mi de solución isotónica de NaCl y ya sea puede agregar a 1000 mi de fluido de hipodermoclisis o se puede inyectar en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo Re ington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp . 1035-1038 y 1570-1580) . Cierta variación en la dosificación necesariamente se presentará dependiendo de una condición del sujeto que es tratado. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración en humanos, las preparaciones deben satisfacer las normas de esterilidad, pirogenicidad y de seguridad general y pureza como lo requieren las normas de la oficina de biólogos de la FDA (siglas en inglés para Administración de Alimentos y Medicamentos) .
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los diversos ingredientes adicionales enumerados en lo anterior, según se requiera, seguido por filtración mediante esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril el cual contiene el medio de dispersión básico y los ingredientes adicionales requeridos a partir de aquellos enumerados en lo anterior. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y técnicas de liofilizado las cuales generan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada y esterilizada del mismo.
Las composiciones que se describen en la presente se pueden formular en forma neutra o de sal . Las sales farmacéuticamente aceptables, que incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y los cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina , histidina, procaína y similares. Ante la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sean terapéuticamente eficaces. Las formulaciones se pueden administrar fácilmente en una diversidad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares .
Como se utiliza en la presente, el término "portador" incluye cualquiera y la totalidad de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antimicóticos , agentes isotónicos que retardan la absorción, excipientes, modificadores de fuerza iónica, tensioactivos , amortiguadores, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en el ámbito. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional no sea compatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones .
La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o no deseada similar cuando se administra en un humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un ingrediente activo es bien entendida en el ámbito. Habitualmente, estas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en un líquido antes de su inyección también se pueden preparar. La preparación también puede ser emulsificada .
Los métodos de formulación son bien conocidos en el ámbito y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995). Las composiciones y agentes proporcionadas en la presente se pueden administrar de acuerdo con los métodos de la presente invención en cualquier régimen de dosificación terapéuticamente eficaz. La cantidad y frecuencia de dosificación se seleccionan para crear un nivel eficaz del agente sin efectos dañinos. La cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, el tipo de animal homeotérmico que sea tratado y las características físicas del animal homeotérmico específico bajo consideración. Estos factores y su relación para determinar esta cantidad son bien conocidos por los practicantes expertos en las técnicas médicas. Esta cantidad y el método de administración se pueden adecuar para obtener eficacia óptima pero dependerán de factores tales como peso, dieta, medicación concurrente y otros factores los cuales reconocerán aquellos en las técnicas médicas.
En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas se pueden suministrar por aspersiones intranasales , inhalación y/u otros vehículos de suministro en aerosol. Los métodos para suministrar genes, polinucleótidos y composiciones de péptidos directamente a los pulmones vía aspersiones de aerosol nasal se han descrito, por ejemplo, en la patente U.S. No. 5,756,353 y la patente U.S. No. 5,804,212 (cada una incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad) . De igual manera, el suministro de fármacos utilizando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga et al., 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (patente U.S. No. 5,725,871, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad) también son bien conocidos en el ámbito farmacéutico. De igual manera, el suministro de fármaco transmucosal en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la patente de U.S. 5,780,045 (incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad) .
En ciertas modalidades, el suministro puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocápsulas , micropartículas , microesferas, partículas de lípidos, vesículas y similares, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células hospedadoras adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención se pueden formular para suministro ya sea encapsulado en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similar. La formulación y el uso de tales vehículos de suministro se puede llevar a cabo utilizando técnicas conocidas y convencionales .
En ciertas modalidades, los agentes proporcionados en la presente se pueden unir a un sustrato sólido farmacéuticamente aceptable que incluye sustratos biocompatibles y biodegradables tales como polímeros y matrices. Los ejemplos de estos sustratos sólidos incluyen, sin limitación, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (metacrilato de 2 -hidroxietilo) , o poli (alcohol vinílico) ) , polilactidas (patente U.S. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, por sus siglas en inglés) y LUPRON DEP0TMR (microesferas inyectables constituidas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , ácido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutírico, colágeno, metal, hidroxiapatita, biovidrio, aluminato, materiales biocerámicos y proteínas purificadas.
En una modalidad particular, el sustrato sólido comprende un polímero biodegradable tal como el vendido bajo la marca comercial AtrigelMR (QLT, Inc., Vancouver, B.C.). El sistema del suministro de fármacos de AtrigelMR consiste de polímeros biodegradables disueltos en portadores biocompatibles . Las sustancias farmacéuticas se pueden combinar en este sistema de suministro líquido en el momento ¾ de fabricación o, dependiendo del producto, se pueden agregar posteriormente por el médico en el momento de uso. Cuando el producto líquido se inyecta en el espacio subcutáneo a través de una aguja de calibre pequeño o se coloca en sitios de te ido accesibles a través de una cánula, el agua en los fluidos del tejido provocan que el polímero precipite y atrape al fármaco en un implante sólido. El fármaco encapsulado dentro del implante después es liberado de una manera controlada conforme la matriz de polímero se biodegrada con el tiempo.
En modalidades particulares, la cantidad de una composición de HRS, el agente administrado generalmente variará de una dosificación desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg/kg/día y típicamente de aproximadamente 0.1 a 10 mg/kg cuando se administre por vía oral o intravenosa. En modalidades particulares, una dosificación es de 1 mg/kg o 5.0 mg/kg. Para humanos, la dosificación diaria utilizada puede variar de aproximadamente 0.1 mg/kg a 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a 5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a 10 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a 20 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a 30 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a 50 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg a 100 mg/kg/24 horas.
En ciertas modalidades, una composición o agente se administra en una dosificación única de 0.1 a 10 mg/kg o 0.5 a 15 mg/kg. En otras modalidades, una composición o agente se administra en una dosificación de 0.1 a 1 mg/kg/día, 0.5 a 2 mg/kg/día o 5 a 20 mg/kg/día, o aproximadamente 20 a 80 mg/kg/día, o aproximadamente 80 a 150 mg/kg/día.
En diversas modalidades, la dosificación es de aproximadamente 50-2500 mg/día, 100-2500 mg/día, 300-1800 mg/día o 500-1800 mg/día. En una modalidad, la dosificación está entre aproximadamente 100 y 600 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está entre aproximadamente 300 y 1200 mg/día. En modalidades particulares, la composición o agente se administra a una dosificación de 100 mg/día, 240 mg/día, 300 mg/día, 600 mg/día, 1000 mg/día, 1200 mg/día o 1800 mg/día, en una o más dosis al día (es decir, cuando las dosis combinadas alcanzan la dosificación diaria deseada) . En modalidades relacionadas, una dosificación es 200 mg bid, 300 mg bid, 400 mg bid, 500 mg bid, 600 mg bid o 700 mg bid, 800 mg bid, 900 mg bid, o 1000 mg bid. En diversas modalidades, la composición o agente se administran en dosificación única o repetida. La dosificación inicial y las dosificaciones subsecuentes pueden ser iguales o diferentes .
En algunas modalidades, la dosis total administrada puede ser aproximadamente 0.001 mg, aproximadamente 0.005 mg, aproximadamente 0.01 mg, aproximadamente 0.05 mg, aproximadamente 0.1 mg, 0.5 mg aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 500 mg, 1,000 mg, aproximadamente 2,000 mg, aproximadamente 3,000 mg, aproximadamente 4,000 mg, aproximadamente 5,000 mg, aproximadamente 6,000 mg, aproximadamente 7,000 mg, aproximadamente 8,000 mg, aproximadamente 9,000 mg, aproximadamente 10,000 mg, /intervalo de dosificación (por ejemplo, cada 24 horas). En algunas modalidades, el intervalo de dosificación puede ser una vez cada día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez a la semana o una vez cada dos semanas. Para administraciones repetidas durante varios días o por períodos más prolongados, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de enfermedad. El progreso de este y otros tratamientos (por ejemplo, terapias ex vivo) se pueden monitorear fácilmente por métodos convencionales y análisis y se pueden basar en criterios conocidos por los médicos u otras personas expertas en el ámbito.
Se apreciará adicionalmente que para dispositivos de suministro sostenido y composiciones, la dosis total de HRS contenida en tales sistemas de suministro correspondiente será más grande, dependiendo del perfil de liberación del sistema de liberación sostenida. De esta manera, una composición o dispositivo de liberación sostenida que está destinado para suministrar polipéptido de HRS durante un período de 5 días típicamente comprenderá por lo menos aproximadamente 5 a 10 veces la dosis diaria del polipéptido de HRS; una composición o dispositivo de liberación sostenida que esté destinado para suministrar un péptido de HRS durante un período de 365 días típicamente comprenderá por lo menos aproximadamente 400 a 800 veces la dosis diaria del polipéptido de HRS (dependiendo de la estabilidad y biodisponibilidad del polipéptido de HRS cuando se administra utilizando el sistema de liberación sostenida) .
En ciertas modalidades, una composición o agente es administrado intravenosamente, por ejemplo, mediante infusión durante un período de tiempo de aproximadamente, por ejemplo, 10 minutos a 90 minutos. En otras modalidades relacionadas, una composición o agente se administra por infusión continua, por ejemplo, a una dosificación de entre aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg/kg/h durante un período de tiempo. Aunque el período de tiempo puede variar, en ciertas modalidades el período de tiempo puede estar entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 24 horas o entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 3 días.
En modalidades particulares, una cantidad eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para obtener una concentración total de la composición o agente en el plasma de la sangre de un sujeto con una Cmax de entre aproximadamente 0.1 µg/ml y aproximadamente 20 yg/ml o entre aproximadamente 0.3 yg/ml y aproximadamente 20 µg/ml. En ciertas modalidades, una dosificación oral es una cantidad suficiente para obtener una concentración plasmática en sangre (Cmax) de entre aproximadamente 0.1 ug/ml y aproximadamente 5 ug/ml o entre aproximadamente 0.3 ug/ml y aproximadamente 3 µ/ml. En ciertas modalidades, una dosificación intravenosa es una cantidad suficiente para obtener una concentración plasmática en sangre (Cmax) de entre aproximadamente 1 µg/ml a aproximadamente 10 g/ml o entre aproximadamente 2 ug/ml y aproximadamente 6 vg/ml. En una modalidad relacionada, la concentración total de un agente en el plasma de la sangre del sujeto tiene una concentración pasante media de menos de aproximadamente 20 ug/ml y/o una concentración en estado estable de menos de aproximadamente 20 ug/ml. En una modalidad adicional, la concentración total de un agente en el plasma de la sangre del sujeto tiene una concentración pasante media de menos de aproximadamente 10 ug/ml Y/° UNA concentración en estado estable de menos de aproximadamente 10 ug/mi- En otra modalidad adicional, la concentración total de un agente en el plasma de la sangre de un sujeto tiene una concentración pasante media de entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 ug/t?? y/o una concentración en estado estable de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 10 ug/ml- En una modalidad, la concentración total de un agente en el plasma de la sangre del sujeto tiene una concentración pasante media de entre aproximadamente 0.3 g/ml y aproximadamente 3 pg/ml y/o una concentración en estado estable de entre aproximadamente 0.3 g/ml y aproximadamente 3 pg/ml .
En modalidades particulares, una composición o agente se administra en una cantidad suficiente para obtener en el mamífero una concentración en plasma sanguíneo que tiene una concentración pasante media de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 10 µg/ml y/o una concentración en estado estable de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 10 yg/ml . En modalidades relacionadas la concentración total del agente en el plasma de la sangre del mamífero tiene una concentración pasante media de entre aproximadamente 0.3 yg/ml y aproximadamente 3 g/ml y/o una concentración en estado estable de entre aproximadamente 0.3 g/ml y aproximadamente 3 yg/ml.
En modalidades particulares de la presente invención, la cantidad eficaz de una composición o agente, o la concentración en plasma de sangre de la composición o agente se obtiene o se mantiene, por ejemplo, durante por lo menos 15 minutos, por lo menos 30 minutos, por lo menos 45 minutos, por lo menos 60 minutos, por lo menos 90 minutos, por lo menos 2 horas, por lo menos 3 horas, por lo menos 4 horas, por lo menos 8 horas, por lo menos 12 horas, por lo menos 24 horas, por lo menos 48 horas, por lo menos 3 días, por lo menos 4 días, por lo menos 5 días, por lo menos 6 días, por lo menos una semana, por lo menos 2 semanas, por lo menos un mes, por lo menos 2 meses, por lo menos 4 meses, por lo menos 6 meses, por lo menos un año, por lo menos 2 años o más de 2 años .
En ciertas modalidades, la cantidad del péptido administrado estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg o aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg del peso corporal del paciente. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 0.1 ug/kg a aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0.1-15 mg/kg/dosis) del polipéptido pueden ser una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o por infusión continua. Por ejemplo, un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg seguido por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del polipéptido o aproximadamente la mitad de la dosis de cargado. No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados antes. Para administraciones repetidas durante varios días o por períodos más prolongados, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de enfermedad. En modalidades particulares, la dosificación eficaz alcanza los niveles de plasma en sangre o la concentración pasante media de una composición o agente descrito en la presente. Esto se puede determinar fácilmente utilizando procedimientos habituales.
En modalidades particulares, la dosificación eficaz alcanza los niveles de plasma en sangre o la concentración pasante media de una composición o agente descrito en la presente. Esto se puede determinar fácilmente utilizando procedimientos habituales.
En algunas modalidades, la composición también puede incluir uno o más adyuvantes, por ejemplo, cuando se utilicen las composiciones inmunogénicas terapéuticas como vacunas. Los adyuvantes son sustancias que de manera no específica aumentan o potencian la respuesta inmunitaria (por ejemplo, las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos CTL y T cooperadores (TH) a un antígeno y de esta manera se pueden considerar útiles en las composiciones terapéuticas de la presente invención. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina o TLR5 derivados de flagelina, ligando FLT3 , GM-C SF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA) , ImuFact IMP321, Interferon-alfa o beta o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCO ATRIX, ISCOM, Juvlmmune, LipoVac, MALP2 , MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones agua en aceite y aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vector PepTelMR, micropartículas PLG, resquimod, SLR172, Virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, trampa VEGF, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón Aquila's QS21, el cual se deriva de saponina, extractos micobacerianos e imitadores de pared celular bacteriano sintéticos y otros adyuvantes registrados tales como Detox de Ribi , Quil o Superfos . Se prefieren los adyuvantes tales como el adyuvante de Freund o GM-CSF. Varios adyuvantes inmunológicos (por ejemplo MF59) específicos para células dendríticas y su preparación se han descrito previamente (Dupuis M et al. 1998; Allison 1998). También se pueden utilizar citocinas. Varias citocinas se han relacionado directamente indicando que alteran la migración de células dendríticas a tejidos linfoides (por ejemplo, TNF-a) , acelerando la maduración de células dendríticas en células presentadores de antígeno eficientes para linfocitos T (por ejemplo, GM-CSF- IL-1 e IL-4) (patente U.S. 5,849,589, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad) y que actúan como inmunoadyuvantes (por ejemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al. 1996).
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de CpG también se ha reportado que incrementan los efectos de los adyuvantes en el ámbito de vacunas. Sin desear unirse a teoría alguna, los oligonucleótidos de CpG actúan al activar el sistema inmunitario innato (no adaptable) por medio de receptores similares a peaje (TLR, por sus siglas en inglés) , principalmente TLR9. La activación de TLR9 disparada por CpG incrementa las respuestas humoral y celular específicas de antígeno a una amplia variedad de antígenos que incluyen antígenos peptídicos o proteínicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas celulares autólogas y conjugados de polisacárido en vacunas profilácticas y terapéuticas. De manera más importante, incrementa la maduración y diferenciación de células dendríticas lo que resulta en activación mejorada de linfocitos THi y la generación de linfocitos T citotóxicos fuertes (CTL, por sus siglas en inglés) , incluso en ausencia de ayuda de linfocitos T CD4. El desplazamiento a THi inducido por la estimulación con TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes de vacuna tales como alumbre o adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) que normalmente promueven la tendencia hacia TH2 · Los oligonucleótidos de CpG muestran una actividad adyuvante incluso mayor cuando se formulan o se coadministran con otros adyuvantes o en formulaciones tales como micropartículas , nanopartículas , emulsiones empíricas o formulaciones similares, las cuales son especialmente necesarias para inducir una fuerte respuesta cuando el antígeno es relativamente débil. También acelera la respuesta inmunitaria y habilitan las dosis de antigeno para que se reduzcan en aproximadamente 2 órdenes de magnitud, con respuestas de anticuerpo comparables a una vacuna de dosis completa sin CpG en algunos experimentos (Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, JUNIO 2006, 471-484) . La patente U.S. No. 6,406,705 Bl describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes diferentes de ácido nucleico y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un antagonista de TLR9 CpG disponible comercialmente es dSLIM (inmunomodulador de tallo y bucle doble) de Mologen (Berlín, Alemania) , el cual es el componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención. También se pueden utilizar otras moléculas de unión de TLR tales como TLR 7 que une ARN, TLR 8 y/o TLR 9.
Otros ejemplos de adyuvantes útiles incluyen, pero no se limitan a CpG modificados químicamente (por ejemplo CpR, Idera) , Poli(I:C), tales como AmpliGen, ADN o ARN bacteriano diferente de CpG así como moléculas pequeñas inmunoactivas y anticuerpos tales como ciclofosfamida, sunitinib, Bavacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafinib, XL-999, CP-547632, pazopanib, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 y SC58175, los cuales pueden actuar terapéuticamente y/o como un adyuvante. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención se pueden determinar fácilmente por los expertos en el ámbito sin experimentación indebida .
POLITERAPIA La presente invención también incluye politerapias que comprenden administración a un paciente de una dosis terapéutica de un polipéptido de HRS, o un reactivo bloqueador de anticuerpo en combinación con un segundo agente activo, o un dispositivo o un procedimiento para tratar enfermedades autoinmunes, una o varias enfermedades inflamatorias, distrofias musculares, rabdomiólisis , caquexia y otras enfermedades descritas en la presente. En este contexto, el término "administrado de modo combinado" significan: (1) parte de la misma forma de dosificación unitaria; (2) administración por separado, pero como parte del mismo programa o régimen de tratamiento terapéutico, habitualmente pero no de manera necesaria en el mismo día.
En algunos aspectos de estas politerapias, el segundo agente activo se selecciona de uno o más antihistamínicos , uno o más agentes antiinflamatorios, uno o más agentes antineoplásicos , uno o más agentes inmunosupresores , uno o más agentes antivirales, uno o más agentes que inhiben linfocitos B, que bloquean la diferenciación de linfocitos B o la activación de los linfocitos B de memoria o uno o más agentes antioxidantes. Los agentes farmacológicos o terapéuticos los cuales pueden tener uso en combinación con los polipéptidos de HRS de la invención incluyen, sin limitación los descritos en la patente U.S. No. 4,474,451, columnas 4 a 6 y la patente U.S. No. 4,327,725, columnas 7 a 8.
Los ejemplos de antihistamínicos incluyen, pero no se limitan a loradatina, hidroxizina, difenhidramina, clorfeniramina, bromfeniramina, citroheptadin , terfenadina, clemastina, triprolidina, carbinoxamina, difenilpiralina, fenindamina, azatadina, tripelenamina, dexclorfeniramina, dexbromfeniramina, metdilazina y trimprazina, doxilamina, feniramina, piralamina, chiorciclizina, tonzilamina, y derivados de las mismas.
Los ejemplos de agentes antineoplásicos incluyen, pero no se limitan a: antibióticos y análogos (por ejemplo, aclacinomicinas , actinomicina fi, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carrubicina, carzinofilina , cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-n norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, menogaril, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, pirarrubicina, plicamicina, porfiromicina, puromicina, estreptonigrina, estrptozocina , tubercidina, zinostatina, zorubicina) , antimetabolitos (por ejemplo, análogos de ácido fólico (por ejemplo denopterina, edatrexato, metotrexato, piritrexim, pteropterina, Tomudex!^, trimetrexato) , análogos de purina (por ejemplo cladribina, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina) , análogos de pirimidina (por ejemplo, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, doxifluridina, emitefur, enocitabina, floxuridina, fluorouracilo, gemcitabina, tagafur) .
Los ejemplos de agentes antiinflamatorios incluyen pero no se limitan a agentes antiinflamatorios esteroideos y agentes antiinflamatorios no esteroideos. Los ejemplos de agentes antiinflamatorios estereoideos incluyen acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desanida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucoronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de flucinolona, fluocinonida, butilo de fluocortina, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenólido, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona , prednicarbato, prednisolona, 25-dietilamino-acetato de prednisolona, fosfato de prednisolona de sodio, prednisona, prednival, prednilideno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona , benetónida de triamcinolona y hexacetónido de triamicinolona . 5 Los agentes antiinflamatorios no esteroideos ejemplares incluyen derivados de ácido amino arilcarboxílico (por ejemplo, ácido enfenámico, etofenamato, ácido flufenámico, isonixina, ácido meclofenámico , ácido mefenámico, ácido niflúmico, talniflumato, terofenamato, LO ácido tolfenámico) , derivados de ácido arilacético (por ejemplo, aceclofenaco, acemetacina, alclofenaco, anfenaco, amtolmetina guacilo, bromfenaco, bufexamaco, cinmetacina, clopiraco, diclofenaco de sodio, etodolaco, felbinaco, ácido fenclózico, fentiazaco, glucametacina, ibufenaco, L5 indometacina, isofezolaco, isoxepaco, lonazolaco, ácido metazínico, mofezolaco, oxametacina, pirazolaco, proglumetacina, sulindaco, tiaramida, tolmetina, tropesina y zomepiraco) , derivados de ácido arilbutírico (por ejemplo >0 bumadizon) , butibufeno, fenbufeno, xenbucina) , ácidos arilcarboxílicos (por ejemplo clidanaco, quetorolaco, tinoridina) , derivados de ácido arilpropiónico (por ejemplo alminoprofeno, benoxaprofeno, bermoprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, flurbiprofeno, )C- ibuprofeno, ibuproxam, indoprofeno, quetoprofeno. loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina, picetoproleno, pirprofeno, pranoprofeno, ácido protizínico, suprofeno, ácido tiaprofénico, ximoprofeno y zaltoprofeno) , pirazoles (por ejemplo difenamizol, epirizol) , pirazolonas (por ejemplo, apazona, benzpiperilona , feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propifenazona, ramifenazona, suxibuzona, tiazolinobutazona) , derivados de ácido salicílico (por ejemplo acetaminosalol, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato de calcio, diflunisal, etersalato, fendosal, ácido gentísico, salicilato de glicol, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, salicilato de 1-naftilo, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato de fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida, ácido salicilamida o-acético, ácido salisilsulfúrico, salsalato, sulfasalazina) , tiazinacarboxamidas (por ejemplo, ampiroxicam, droxicam, isoxicam, lornoxicam, piroxicam, tenoxicam) , ácido e-acetamidocaproico, s-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazaco, bencidamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, fepradinol, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, oxaceprol, paranilina, perisoxal, procuazona, superóxido dismutasa, tenidap y zileuton.
Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, sin limitación, pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (véase la patente U.S. No. 4,665,077); azatioprina; ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (el cual oculta los antígenos de CPH como se describe en la patente U.S. No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos de CPH y fragmentos de CPH; ciclosporina A; esteroides tales como glucocorticosteroides , por ejemplo prednisona, metilprednisolona y dexametasona ; citocina o antagonistas de receptor de citocina que incluyen anticuerpos anti-interferón-?, -ß, o -a, anticuerpos anti-factor-a de necrosis tumoral , anticuerpos anti-factor 43 de necrosis tumoral, anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos anti -receptor IL-2; anticuerpos anti-LFA-1, que incluye anticuerpos anti-CDlla y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocitos heteróloga; anticuerpos pan-T, preferiblemente anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene el dominio de unión LFA-3 (WO 90/08187 publicada el 27 de julio de 1990) ; estreptocinasa ; TGF-ß; estreptodornasa; ARN o ADN del hospedador; FK506; RS-61443; desoxiespergualina ; rapamicina; receptor de linfocitos T (Cohén et al., patente U.S. No. 5,114,721); fragmentos de receptor de linfocitos T (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991; Wo 90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); y WO 91/01133); y anticuerpos del receptor de linfocitos T (EP 340,109) tal como T10139; anticuerpos anti-CD19 como se describe en Hekman et al. Cáncer Immunol . Immunother. 32:364-372 (1991) y Vlasveld et al. Cáncer Immunol. Immunother. 40:37-47 (1995); el anticuerpo B4 en Kiesel et al. Leukemia Researc II, 12: 1119 (1987); anticuerpos anti-CD22 que incluyen epratruzumab; anticuerpos anti-BLyS (CD257) que incluyen Belimumab (benalysta) ; anticuerpos anti-CD20 que incluyen Ocrelizumab, rituximab, y ofaturaumab . Los términos "Rituximab" o "RITUXA MR" se refiere a un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico manipulado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20 y denominado "C2B8" en la patente de U.S. No. 5,736,137. El anticuerpo es una inmunoglobulina IgGi kappa que contiene las secuencias de la región variable de las cadenas ligera y pesada murinas y secuencias de región constante humanas. Rituximab tiene una afinidad de unión por el antígeno CD20 de aproximadamente 8.0 nM .
Los ejemplos de agentes antivirales incluyen interferón gamma, zidovudina, clorhidrato de amantadina, ribavirina, aciclovir, valciclovir, didesoxicitidina, ácido fosfonofórmico, ganciclovir y derivados de los mismos.
Los ejemplos de agentes que inhiben linfocitos B, que bloquean la diferenciación de linfocitos B o la activación de linfocitos B de memoria incluyen anticuerpos anti-CD19, anticuerpos anti-CD22 que incluye epratuzmab; anticuerpos anti BLyS (CD257) que incluyen Belimumab (benalysta) ; anticuerpos anti-CD20 que incluyen Ocrelizumab, rituximab, ofatumumab y "Rituximab" o "RITUXANMR" .
Los ejemplos de agentes antioxidantes incluyen ascorbato, alfa-tocoferol , manitol, glutation reducido, diversos carotenoides , cisteína, ácido úrico, taurina, tirosina, superóxido dismutasa, luteína, zeaxantina, criotpxantina, astazantina, licopeno, N-acetil-cisteína, carnosina, gamma-glutamilcisteína, quercitina, lactoferrina, ácido dihidrolipoico, citrato, extracto de Ginkgo biloba, té de catecinas, extracto de arándano, vitaminas E o ésteres de vitamina E, palmitato de retinilo y derivados de los mismos. Otros agentes terapéuticos incluyen escualamina, inhibidores de anhidrasa carbónica, agonistas de receptor adrenérgico alfa-2, antiparasitarios, antimicóticos y derivados de los mismos.
Preferiblemente, el polipéptido de HRS se puede administrar en una dosificación diaria fija y los otros agentes activos se toman en una base según se requieran. Cuando el polipéptido de HRS se administra como tratamiento adyuvante con un segundo agente activo, una dosificación diaria preferida es de aproximadamente 0.1 mg/kg/24 horas a aproximadamente 55 mg/kg/24 horas, de manera más preferible aproximadamente 2 mg/kg/24 horas a aproximadamente 20 mg/kg/24 horas.
La dosis exacta de cada componente administrado diferirá, por supuesto, en base en los componentes específicos prescritos, en el sujeto que es tratado, en la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, la gravedad de la reacción inflamatoria, en la manera de administración y bajo el criterio del médico que prescribe. De este modo, debido a la variabilidad de un paciente a otro, las dosificaciones suministradas en lo anterior son una línea de guía y el médico puede ajustar las dosis de los compuestos para obtener el tratamiento que el médico considera apropiado. 5 KITS Las modalidades de la presente invención, en otros aspectos, proporciona un kit que comprende uno o más recipientes rellenados con uno o más de los polipéptidos de lo HRS aislados, polinucleótidos , anticuerpos y proteínas de unión de la invención como se describe en la presente. Los kits pueden incluir instrucciones escritas de cómo utilizar estas composiciones (por ejemplo, para modular señalización celular, condiciones inflamatorias, diagnóstico, etc.).
Los kits en la presente también pueden incluir uno L 5 o más agentes terapéuticos adicionales u otros componentes adecuados o deseados para la indicación que es tratada, o para la aplicación diagnóstica deseada. Un agente terapéutico adicional puede estar contenido en un segundo recipiente, si así se desea. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero no se limitan a agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes angiogénicos , etc.
Los kits en la presente también pueden incluir una , c o más jeringas u otros componentes necesarios o deseados para facilitar un modo de suministro destinado (por ejemplo, endoprótesis, depósitos implantables , etc.).
En otro aspecto de la invención, los kits comprenden: a) un recipiente que comprende un componente de polipéptido de HRS; y b) instrucciones para usarse. Las instrucciones pueden incluir etapas de cómo manejar los polipéptidos de HRS, como almacenar los polipéptidos de HRS y qué espera del uso de los polipéptidos de HRS.
En otro aspecto de la invención, los kits comprenden: a) un recipiente que comprende un vector recombinante o polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para un componente de polipéptido de HRS; y b) instrucciones para usarse. Las instrucciones pueden incluir etapas de cómo manejar los vectores o polinucleótidos , cómo almacenar los vectores o polinucleótidos o cómo transfectar células con los vectores o polinucleótidos.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan kits para tratar una enfermedad o trastorno, que comprenden: a) un recipiente que comprende una composición farmacéutica que comprende un componente de polipéptido de HRS en una formulación farmacéuticamente aceptable, y b) instrucciones y/o un inserto de producto.
DIAGNÓSTICOS Los polipéptidos de HRS y los polinucleótidos correspondientes (polinucleótidos de HRS) se pueden utilizar en análisis de diagnóstico y composiciones de diagnóstico. Entre otros, se incluyen métodos y composiciones bioquímicas, histológicas y métodos basados en células.
Estas modalidades y las relacionadas incluyen la detección de una o varias secuencias de polinucleótido de H S I o una o varias secuencias de polipéptido 4e HRS correspondiente o porciones de las mismas o anticuerpos de las mismas. Por ejemplo, ciertos aspectos incluyen la detección de una o varias secuencias de polinucleótidcj de HRS o una o varias secuencias de polipéptido correspondientes o porciones de las mismas de una o más variantes de empalme de HRS identificadas recientemente y/o una o más uniones de empalme de estas variantes de empalme. En ciertas modalidades, el polinucleótido o una o varias secuencias polipeptídicas correspondientes de por lo menos unal de las uniones de empalme es única para esa variante de empalme de HRS particular. En algunas modalidades, las variajites de empalme de HRS pueden indicar una susceptibilidad! a una enfermedad que incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, una o varias enfermedades inflamatorias, distrofias musculares, rabdomiólisis, caquexia ¾| otras enfermedades descritas en la presente. I También se incluye la detección directa ¡ de los fragmentos de proteína de HRS, que incluye variantes de empalme, fragmentos proteolíticos y otros. En ! ciertas modalidades, la presencia o niveles de uno o más fragmentos de proteína de HRS recién identificados se asocian o se correlacionan con uno o más tipos celulares o estados celulares que incluyen, por ejemplo, autoanticuerpos específicos. Por lo tanto, la presencia o los niveles de un polipéptido o polinucleótido de HRS se puede utilizar para distinguir entre diferentes tipos celulares o diferentes estados celulares. La presencia o los niveles de fragmento de proteína de HRS o sus polinucleótidos relacionados se pueden detectar de acuerdo con técnicas de diagnóstico basadas en polinucleótidos y/o polipéptidos , como se describe en la presente y como se conoce en el ámbito.
Ciertos aspectos pueden utilizar los fragmentos de proteína de HRS o polinucleótidos de HRS como parte de un método de diagnóstico acompañado, típicamente para determinar si un sujeto o población de sujetos responderán favorablemente a un tratamiento médico específico. Por ejemplo, un agente terapéutico basado en un polipéptido de HRS dado (por ejemplo, fragmento de proteína, anticuerpo, agente de unión) puede ser identificado como adecuado para un sujeto o ciertas poblaciones de sujetos en base en si uno o varios de los sujetos tienen uno o más biomarcadores seleccionados o anticuerpos para una enfermedad o condición dada. Los ejemplos de biomarcadores incluyen marcadores de suero/tej ido, anticuerpos preexistentes para histidin-ARNt sintetasa así como marcadores que pueden ser identificados por técnicas de generación de imágenes médicas. En ciertas modalidades, la proteína de HRS como se encuentra de modo natural o un fragmento de la misma (o su polinucleótido correspondiente) en sí mismos pueden proporcionar un biomarcador en suero y/o tejido que puede ser utilizado para medir los niveles de anti-polipéptido de HRS o niveles de polipéptido de HRS libre en un sujeto específico o una población de sujetos específica. En ciertos aspectos, la identificación de un polipéptido de HRS o una secuencia de referencia polinucleótidica puede incluir caracterizar la expresión diferencial de esa secuencia, ya sea en un sujeto seleccionado, un tejido seleccionado o de alguna otra manera, como se describe en la presente y como se conoce en el ámbito .
Algunos de los métodos que aquí se proporcionan se basan en la expresión diferencial de un polipéptido de HRS o un polinucleótido para caracterizar la condición o estado de una célula, tejido o sujeto y para distinguirlo de otra célula, tejido o sujeto. Los ejemplos no limitantes incluyen métodos para detectar la presencia o niveles de un polipéptido de HRS o polinucleótido en una muestra biológica para distinguir entre células o tejidos de diferentes especies, células de diferentes tejidos u órganos, estados de desarrollo celular tal como neonatal y adulto, estados de diferenciación celular, condiciones tales como salud, enfermo y tratado, fracciones intracelulares y extracelulares además de cultivos de células primarios y otros cultivos de células tales como cultivos de células inmortalizados.
La expresión diferencial incluye una diferencia estadísticamente significativa en uno o más niveles de expresión de genes de un polinucleótido de HRS o secuencias de referencia de polipeptido y en comparación con los niveles de expresión de la misma secuencia en un control apropiado. La diferencia estadísticamente significativa se puede relacionar ya sea con un incremento o una disminución en los niveles de expresión, medidos por los niveles de ARN, niveles de proteína, función proteínica o cualquier otra medida relevante de expresión de genes tal como las que aquí se describen. También se incluye una comparación entre un polinucleótido de HRS o polipéptidos de la invención y una secuencia de HRS citosólica o mitocondrial de longitud completa o natural, típicamente del tipo igual o correspondiente. La expresión diferencial se puede detectar por una diversidad de técnicas en el ámbito y como se describe en la presente que incluyen técnicas basadas en polinucleótidos y polipéptidos tales como PCR en tiempo real, hibridación sustractiva, arreglos de polinucleótidos y polipéptidos y otras.
Un resultado típicamente se denomina como estadísticamente significativo si es poco probable que se haya producido por azar. El nivel de significancia de una prueba o resultado se relaciona tradicionalmente con un concepto de prueba de hipótesis estadística de frecuencia. En casos sencillos, la significancia estadística se puede definir como la probabilidad de tomar una decisión para rechazar la hipótesis nula cuando la hipótesis nula en realidad es verdadera (una decisión conocida como error tipo I o "determinación de falso positivo"). Esta decisión con frecuencia se realiza utilizando el valor p: si el valor p es menor que un nivel de significancia, entonces se rechaza la hipótesis nula. Cuando menor es el valor p más significativo es el resultado. Los factores de Bayes también se pueden utilizar para determinar significancia estadística (véase, por ejemplo, Goodman S., Ann Intern Med 130:1005-13, 1999).
En casos más complicados, pero prácticamente importantes, el nivel de significancia de una prueba o el resultado puede reflejar un análisis en el cual la probabilidad de tomar una decisión para rechazar la hipótesis nula cuando la hipótesis nula en realidad es verdadera es no mayor que la probabilidad establecida. Este tipo de análisis permite que aquellas aplicaciones en las cuales la probabilidad para decidir rechazar pueden ser mucho menores que el nivel de significancia de algunos conjuntos de suposiciones abarcadas dentro de la hipótesis nula.
En ciertas modalidades ejemplares, la expresión diferencial estadísticamente significativa puede incluir situaciones en donde el nivel de expresión de una secuencia de HRS dada proporcione por lo menos aproximadamente 1.2X, 1.3X, 1.4X, 1.5X, 1.6X, 1.7X, 1.8X, 1.9X, 2.0X, 2.2X, 2.4X, 2.6X, 2.8X, 3.0X, 4.0X, 5.0X, 6. OX, 7.0X, 8.0X, 9.0X, 10. OX, 15.0X, 20. OX, 50. OX, 100. OX o más de diferencia en expresión (es decir, una expresión diferencial que puede ser una expresión mayor o menor) en una muestra biológica sospechosa en comparación con un control apropiado, que incluye todos los enteros y puntos decimales entre los mismos (por ejemplo 1.24X, 1.25X, 2. IX, 2.5X, 60.0X, 75.0X, etc.). En ciertas modalidades, la expresión diferencial estadísticamente significativa puede incluir situaciones en donde el nivel de expresión de una secuencia de HRS dada proporcione por lo menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 por ciento (%) o más de diferencia en expresión (es decir, expresión diferencial que puede ser mayor o menor) en una muestra biológica sospechosa en comparación con un control apropiado, que incluye todos los números enteros y puntos decimales entre los mismos.
Como un ejemplo adicional, la expresión diferencial también se puede determinar al realizar la prueba Z, es decir, calcular una calificación Z absoluta, como se describe en la presente y como se conoce en el ámbito. La prueba Z típicamente se utiliza para identificar diferencias significativas entre una media de una muestra y una media de una población. Por ejemplo, en comparación con una tabla normal estándar (por ejemplo, un tejido control) con un intervalo de confianza de 95% (es decir, a un nivel de significancia de 5%) , una calificación Z con un valor absoluto mayor de 1.96 indica carencia de aleatoridad. Para un intervalo de confianza de 99%, si Z absoluto es mayor de 2.58, significa que p<0.01, y la diferencia es incluso más significativa -se puede rechazar la hipótesis nula con mayor confianza. En esta y en modalidades relacionadas, una calificación Z absoluta de 1.96, 2, 2.58, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más, que incluye todos los puntos decimales entre los mismos (por ejemplo, 10.1, 10.6, 11.2, etc.), puede proporcionar una medida fuerte de significancia estadística. En ciertas modalidades, una calificación Z absoluta de más de 6 puede proporcionar una significancia estadística excepcionalmente alta .
Similitud sustancial se relaciona generalmente con la carencia de una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión entre la muestra biológica y el control de referencia. Los ejemplos de niveles de expresión sustancialmente similares pueden incluir situaciones en donde el nivel de expresión de un SSCIGS dado proporciona menos de aproximadamente 0.05X, 0.1X, 0.2X, 0.3X, 0.4X, 0.5X, 0.6X, 0.7X, 0.8X, 0.9X, 1.0X, 1.1X, 1.2X, 1.3X o 1.4X de diferencia en la expresión (es decir, expresión diferencial que puede ser expresión mayor o menor) en una muestra biológica sospechosa en comparación con una muestra de referencia, que incluye todos los puntos decimales entre los mismos (por ejemplo, 0.15X, 0.25X, 0.35X, etc.). En ciertas modalidades, la expresión diferencial puede incluir situaciones en donde el nivel de expresión de una secuencia de HRS dada proporciona menos de aproximadamente 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 por ciento (%) de diferencia en la expresión (es decir, expresión diferencial que puede ser mayor o menor) en una muestra biológica sospechosa en comparación con una muestra de referencia, que incluye todos los puntos decimales entre los mismos.
En ciertas modalidades, por ejemplo, cuando se utiliza el microarreglo Affymetrix para medir los niveles de expresión de un polinucleótido de HRS o una secuencia de referencia polipeptídica, la expresión diferencial también se puede determinar por la media de los valores de expresión resumida por el programa Affymetrix Microarray Suite 5 (Affymetrix, Santa Clara, CA) , u otro programa similar, típicamente con una media escalada de valor de expresión de 1000.
Las modalidades de la presente invención incluyen métodos para detectar la presencia o niveles de polinucleótido de HRS o secuencia de referencia polipeptídica para caracterizar o diagnosticar la condición o una célula, tejido, órgano o sujeto, en el cual esta condición puede ser caracterizada como sana, enferma, en riesgo de estar enferma o tratada. Para estos propósitos de diagnóstico, el término "diagnóstico" o "diagnosticado" incluye identificar la presencia o naturaleza de una condición patológica, caracterizar el riesgo de desarrollar esta condición y/o medir la probabilidad (o falta de probabilidad) de una condición patológica en respuesta al tratamiento. Los métodos de diagnóstico pueden diferir en su sensibilidad y especificidad. En algunas modalidades, la sensibilidad de un análisis de diagnóstico se refiere al porcentaje de células, tejidos o sujetos enfermos los cuales son positivos para la prueba (porcentaje de "positivos verdaderos"). Las células, tejidos o sujetos enfermos no detectados por el análisis típicamente se denomina como "falsos negativos". Las células, tejidos o sujetos que no están enfermos y los cuales presentan un resultado negativo en el análisis se pueden denominar como "verdaderos negativos". En ciertas modalidades, la "especificidad" de un análisis de diagnóstico se puede definir como (1) menos la tasa de falsos positivos, en donde la tasa de "falsos positivos" se define como la proporción de aquellas muestras o sujetos si la enfermedad y los cuales dan resultado positivo. Aunque un método de diagnóstico particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una condición, es suficiente que el método proporcione una indicación positiva que ayude en el diagnóstico. 5 En ciertas instancias, la presencia o riesgo de desarrollar una condición patológica se puede diagnosticar al comparar la presencia o niveles de uno o más polinucleótidos de HRS seleccionados o secuencias de referencia ^ polipeptídicas o porciones de las mismas, o anticuerpos para los mismos, que se correlacionan con la condición, ya sea por niveles aumentados o disminuidos, en comparación con un control adecuado. Un "control adecuado" o "control apropiado" incluye un valor, nivel, rasgo, característica o propiedad determinado en una célula u otra muestra biológica de un L5 tejido u organismo, por ejemplo, una célula, tejido u organismo control o normal que presenta, por ejemplo, rasgos normales tales como la ausencia de la condición. En ciertas modalidades, un "control adecuado" o "control apropiado" es jQ un valor, nivel, rasgo, característico o propiedad predefinido. Otros controles adecuados serán evidentes para las personas expertas en el ámbito. Los ejemplos de enfermedades y condiciones, por ejemplo enfermedades asociadas con autoanticuerpos específicos para histidil-ARNt 5R sintetasa se describen en otra parte en este documento.
Las modalidades de la presente invención incluyen polinucleótido de HRS o técnicas de detección basadas en ácido nucleico, las cuales proporcionen ciertas ventajas debido a la sensibilidad de detección. Por lo tanto, algunas modalidades se relacionan con el uso o detección de polinucleótidos de HRS como parte de un método de diagnóstico o análisis. La presencia y/o niveles de polinucleótidos de HRS se puede medir por cualquier método conocido en el ámbito que incluye análisis de hibridación tales como transferencia Northern, reacción en cadena de polimerasa (PSR) cuantitativa o cualitativa, PCR por transcriptasa inversa (RT-PCR) cuantitativa o cualitativa, microarreglo, las pruebas dot o slot blot, o hibridación in situ tal como hibridación in situ fluorescente (FISH) , entre otros. Algunos de estos métodos se describen con mayor detalle a continuación.
Los polinucleótidos de HRS tales como ADN y ARN se pueden recolectar y/o generar a partir de sangre, fluidos biológicos, tejidos, órganos, líneas celulares u otra muestra relevante utilizando técnicas conocidas en el ámbito tal como aquellas descritas en Kingston. (2002 Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publ . Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (véase, por ejemplo, como se describe por Nelson et al. Proc. Nati Acad Sci U S A, 99: 11890-11895, 2002) y en otras partes. Además, una diversidad de kits disponibles comercialmente para construir ARN son útiles para elaborar el ARN que va a ser utilizado en la presente invención. El ARN se puede construir a partir de órganos/tej idos/células procurados de sujetos sanos normales; no obstante, esta invención también contempla la construcción de ARN a partir de sujetos enfermos. Ciertas modalidades contemplan el uso de cualquier tipo de órgano a partir de cualquier tipo de sujeto o animal. Para las muestras de prueba el ARN debe ser procurado de un individuo (por ejemplo cualquier animal, que incluye mamíferos) con o sin enfermedad visible y a partir de muestras de tejido, fluidos biológicos (por ejemplo, sangre completa) o similares.
En ciertas modalidades, la amplificación o construcción de secuencias de ADNc puede ser útil para incrementar las capacidades de detección. La presente descripción, así como la técnica, proporcionan el nivel necesario de detalle para realizar estas tareas. En una modalidad ejemplar, se utiliza sangre completa como la fuente de ARN y en consecuencia, opcionalmente se utilizan reactivos estabilizantes de ARN tales como tubos PAX, como se describe, por ejemplo, en Thach et al., J. Immunol . Methods . Dec 283(1-2):269-279, 2003 y Chai et al., J. Clin. Lab Anal . 19(5) :182-188, 2005 (ambas las cuales se incorporan como referencia). Se pueden generar bibliotecas de ADN complementario (ADNc) utilizando técnicas conocidas en el ámbito tales como aquellas descritas en Ausubel et al. (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ . Assoc. Inc . & John iley & Sons, Inc., NY, NY) ; Sambrook et al . (1989 Molecular Cloning, Segunda Ed. , Cold Sping Harbor Laboratory, Plainview, NY) ; Maniatis et al . (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) y en otras partes. Además, una diversidad de kits disponibles comercialmente para construir bibliotecas de ADNc son útiles para elaborar las bibliotecas de ADNc de la presente invención. Las bibliotecas se pueden construir a partir de órganos/tej ido/células procurados de sujetos sanos normales.
Ciertas modalidades pueden utilizar métodos de hibridación para detectar secuencias de polinucleótido de HRS . Los métodos para llevar a cabo análisis de hibridación de polinucleótidos han sido bien desarrollados en el ámbito. Los procedimientos y condiciones de análisis de hibridación variarán dependiendo de la aplicación y se seleccionan de acuerdo con los métodos de unión generales conocidos que incluyen aquellos a los que se hace referencia en: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Berger y Kimmel Methods in Enzymology, Vol . 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987); Young and Davis, PNAS. 80: 1194 (1983). Los métodos y aparatos para realizar reacciones de hibridación repetidas y controladas han sido descritas en las patentes de U.S. Nos. 5,871,928, 5,874,219, 6,045,996 y 6,386,749, 6,391,623, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.
Ciertas modalidades, pueden utilizar métodos de amplificación de ácido nucleico para detectar secuencias de polinucleótidos de HRS . El término "amplificación" o "amplificación de ácido nucleico" se refiere a la producción de copias múltiples de un ácido nucleico objetivo que contiene por lo menos una porción de la secuencia de ácido nucleico objetivo específica destinada. Las múltiples copias se pueden denominar como amplicones o productos de amplificación. En ciertas modalidades, el objetivo amplificado contiene menos que las secuencias en objetivo completas (intrones y axones) o una secuencia de gen objetivo expresada (transcrito empalmado de intrones y secuencias no traducidas flanqueantes) . Por ejemplo, los amplicones específicos se pueden producir por amplificación de una porción del polinucleótido objetivo mediante la utilización de cebadores de amplificación que hibridizan, y que inician la polimerización desde posiciones internas del polinucleótido objetivo. Preferiblemente, la porción amplificada contiene una secuencia objetivo detectable que se puede detectar utilizando cualquiera de una diversidad de métodos bien conocidos.
Los términos "amplificación selectiva" o "amplificación específica", como se utilizan en la presente, se refieren a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo de acuerdo con la presente invención en donde la amplificación detectable de la secuencia objetivo se limita sustancialmente a amplificación de la secuencia objetivo contribuida por una muestra de ácido nucleico de interés que es probada y que no contribuye con la secuencia de ácido nucleico objetivo contribuida por otra fuente de muestra, por ejemplo, contaminación presente en reactivos utilizados durante "reacciones de amplificación o en el ambiente en el cual se realizan las reacciones de amplificación.
El término "condiciones de amplificación" se refiere a condiciones que permiten la amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Las condiciones de amplificación, en algunas modalidades, pueden ser menos rigurosas que las "condiciones de hibridación rigurosas" como se describe en la presente. Los oligonucleótidos utilizados en las reacciones de amplificación de la presente invención hibridizan a sus objetivos destinados bajo condiciones de amplificación pero pueden o no hibridizar bajo condiciones de hibridación rigurosas. Por otra parte, las sondas de detección de la presente invención típicamente hibridizan bajo condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones aceptables para llevar a cabo amplificaciones de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se pueden determinar fácilmente por una persona habitualmente experta en el ámbito dependiendo del método particular de amplificación utilizado.
Muchos métodos bien conocidos de amplificación de ácido nucleico requieren termociclado para desnaturalizar de manera alternativa ácidos nucleicos de cadena doble e hibridizar cebadores; no obstante, otros métodos bien conocidos de amplificación de ácido nucleico son isotérmicos. La reacción en cadena de polimerasa (patentes de U.S. Nos. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188), comúnmente denominadas como PCR utilizan ciclos múltiples de desnaturalización, reasociación de pares de cebadores a cadenas opuestas y extensión de cebador para incrementar exponencialmente los números de copias de la secuencia objetivo. En una variación denominada RT-PCR, se utiliza transcriptasa inversa (RT) para realizar un ADN complementario (ADNc) a partir de ARNm, y el ADNc después se amplifica por PCR para generar copias múltiples de ADN.
Como se indica en lo anterior, el término "PCR" se refiere a ciclos de amplificación múltiples que amplifiquen selectivamente especies objetivo de ácido nucleico. Se incluyen las pruebas PCR cuantitativa (qPCR) , PCR en tiempo real) , PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) que han sido bien descritas en el ámbito. El término "PCR" se refiere a reacción en cadena de polimerasa cuantitativa y el término "qRT-PCR" se refiere a reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa cuantitativa. Se pueden utilizar las pruebas qPCR y qRT-PCR para amplificar y simultáneamente cuantificar una molécula de ADNc dirigida. Permite tanto la detección como cuantificacion de una secuencia específica en un acumulado de ADNc, tal como un gen o transcrito para AARS seleccionado.
El término "PCR en tiempo real" puede utilizar tinción unida a ADN para unir la totalidad del ADN de cadena doble (ds, por sus siglas en inglés) en PCR, lo que genera fluorescencia del colorante. Un incremento en el producto de ADN durante PCR por lo tanto genera un incremento en la intensidad de fluorescencia y se mide en cada ciclo lo que permite que se puedan cuantificar las concentraciones de ADN. No obstante, los colorantes para ADNds tales como SYBR Green, se unirán a todos los productos de PCR de ADNds. La fluorescencia se detecta y se mide en un termociclador de PCR en tiempo real y su incremento geométrico correspondiente al incremento exponencial del producto se utiliza para determinar el ciclo umbral ("Ct") en cada reacción.
El término "Calificación Ct" se refiere al número de ciclo umbral, el cual es el ciclo en el cual la amplificación de PCR ha sobrepasado un nivel umbral. Si existe una cantidad mayor de ARNm para un gen particular en una muestra, cruzará el umbral más pronto que un gen que se expresa de manera baja puesto que existe más ARN inicial para amplificar. Por lo tanto, una calificación de Ct baja indica una expresión de gen alta en una muestra y una calificación Ct alta indica una expresión de gen baja.
Ciertas modalidades pueden utilizar la reacción en cadena de ligasa (Weiss, Science. 254: 1292, 1991), denominada comúnmente como LCR, por sus siglas en inglés, la cual utiliza dos conjuntos de oligonucleótidos de ADN complementarios que hibridizan a regiones adyacentes del ácido nucleico objetivo. Los oligonucleótidos de ADN se unen covalentemente a una ADN ligasa en ciclos repetidos de desnaturalización térmica, hibridación y ligación para producir un producto oligonucleótido ligado de cadena doble detectable.
Otro método es la amplificación de desplazamiento de hebra (Walker et al., 1992, PNAS USA 89:392-396; patentes U.S. Nos. 5,270,184 y 5,455,166) denominadas comúnmente como SDA, la cual utiliza ciclos de pares de reasociación de secuencias de cebador a hebras opuestas de una secuencia objetivo, extensión de cebador en presencia de dNTPaS para producir un producto de extensión de cebador semifosforotioado dúplex, cortes mediados por endonucleasa de un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción semimodificado y extinción de cebador mediado por polimerasa desde el extremo 3 ' de corte para desplazar una hebra existente y producir una hebra para la siguiente ronda de reasociación de cebador, corte y desplazamiento de hebra lo que resulta en amplificación geométrica del producto. La SDA termofílica (tSDA) utiliza endonucleasas y polimerasas termofílicas a temperaturas mayores en esencialmente el mismo método (patente europea No. 0 684 315) .
Otros métodos de amplificación incluyen, por ejemplo: amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (patente U.S. No. 5,130,238), denominado comúnmente como NASBA; una que utiliza una ARN replicasa para amplificar la molécula de sonda misma (Lizardi et al., 1988, BioTechnol. 6: 1197-1202) , denominado comúnmente como replicasa ?)ß; un método de amplificación basado en transcripción (Kwoh, D. et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173-1177); replicasa en la secuencia autosostenida (Guatelli, J. et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878); y amplificación mediada por transcripción (patentes U.S. Nos. 5,480,784 y 5,399,491), denominadas comúnmente como TMA. Para una discusión adicional de métodos de amplificación conocidos véase Persing, David H., 1993, " In vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" en Diagnostic Medical Microbiology : Principies and Applications (Persing et al., Eds . ) , pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC) .
Los sistemas de amplificación basados en transcripción ilustrativos de la presente invención incluyen TMA, el cual utiliza una ARN polimerasa para producir transcritos de ARN múltiples de una región objetivo (patentes de U.S. Nos. 5,480,784 y 5,399,491). TMA utiliza un "promotor-cebador" que hibridiza para el ácido nucleico objetivo en presencia de una transcriptasa inversa y una ARN polimerasa para formar un promotor de cadena doble a partir del cual la ARN polimerasa genera transcritos de ARN. Estos transcritos pueden volverse plantillas para rondas adicionales de TMA en presencia de un segundo cebador capaz de hibridizar a los transcritos de ARN. A diferencia de PCR, LCR u otros métodos que requieren desnaturalización con calor, TMA es un método isotérmico que utiliza actividad de ribonucleasa H para digerir la hebra de ARN de un híbrido ARN: ADN y de esta manera vuelve disponible la hebra de ADN para hibridación con un cebador o promotor-cebador . Generalmente, la actividad de ribonucleasa asociada con la transcriptasa inversa proporcionada para amplificación es la que se utiliza.
En un método de TMA ilustrativo, un cebador de amplificación es un promotor y un cebador oligonucleotídico que comprende una secuencia promotora la cual se vuelve funcional cuando la cadena doble, localizada 5' de la secuencia de unión objetivo, la cual es capaz de hibridizar a un sitio de unión de un ARN objetivo en una ubicación 3' respecto a la secuencia que se va a amplificar. Un promotor y un cebador se puede denominar como un "cebador T7" , cuando es específico para reconocimiento de ARN polimerasa T7. Bajo ciertas circunstancias, el extremo 3' de un promotor y un cebador o una subpoblación de estos promotores-cebadores se puede modificar para bloquear o reducir la extensión del cebador. Desde un promotor y un cebador no modificado, la transcriptasa inversa genera una copia de ADNc del AR objetivo, mientras que la actividad de ribonucleasa H degrada el ARN objetivo. Un segundo cebador de amplificación después se une al ADNc. Este cebador se puede denominar como "cebador no T7" para distinguirlo del "cebador T7". Desde este segundo cebador de amplificación, la transcriptasa inversa genera otra hebra de ADN, lo que resulta en un ADN de cadena doble con un promotor funcional en un extremo. Cuando es de cadena doble, la secuencia promotora es capaz de unir una ARN polimerasa para iniciar la transcripción de la secuencia objetivo a la cual se hibridiza el promotor-cebador. Una ARN polimerasa utiliza esta secuencia promotora para producir múltiples transcritos de ARN (es decir, amplicones) , generalmente de aproximadamente 100 a 1000 copias. Cada amplicón recién sintetizado puede reasociarse con el segundo cebador de amplificación. La transcriptasa inversa después genera una copia de ADN mientras que la actividad de ribonucleasa H degrada el ARN de este dúplex ARN: ADN. El promotor de un cebador puede unirse después al ADN recién sintetizado, lo que permite que la transcriptasa inversa genere un ADN de cadena doble, a partir del cual la ARN polimerasa genera amplicones múltiples. De esta manera, se puede obtener amplificación isotérmica de múltiplos de miles de millones utilizando dos cebadores de amplificación.
En ciertas modalidades se pueden utilizar otras técnicas para evaluar transcritos de ARN de los transcritos a 5 partir de una biblioteca de ADNc particular, que incluye análisis de microarreglo (Han et al., Nat Biotechnol, 19: 631-635, 2001; Bao et al., Anal. Chem, 74: 1192-1191 , 2002; Schena et al., PNAS. USA 93:10614-19, 1996; y Heller et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:2150-55, 1997) y SAGE (análisis LO en serie de expresión de genes) . Al igual que MPSS, SAGE es digital y puede generar una gran cantidad de secuencias de firma (véase, por ejemplo, Velculescu, V. E., et al., Trends Genet, 16: 423-425., 2000; Tuteja R. y Tuteja N. Bioessays.
L5 2004 Aug; 26 (8) : 916 -22 ) , aunque los órdenes de magnitud menores que los que están disponibles a partir de técnicas tales como MPSS.
En ciertas modalidades, el término "microarreglo" incluye un "microarreglo de ácido nucleico" que tiene una 20 pluralidad unida a sustrato de ácidos nucleicos, la hibridación a cada una de la pluralidad de ácidos nucleicos unidos es detectable de un modo separado. El sustrato puede ser sólido o poroso, plano o no plano, unitario o distribuido. Los microarreglos de ácido nucleico incluyen la ?c¡ totalidad de los dispositivos mencionados en Schena (ed.), DNA Microarrays : A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet . 21(1) (suppl.): 1-60 (1999); Schena (ed.), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/BioTechniques Books División (2000) . Los microarreglos de ácido nucleico pueden incluir una pluralidad unida a sustrato de ácidos nucleicos en los cuales la pluralidad de ácidos nucleicos se colocan sobre una pluralidad de esferas, en vez de sobre un sustrato plano unitario, como se describe, por ejemplo, en Brenner et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 97(4) : 1665-1670 (2000) . Los ejemplos de microarreglos de ácido nucleico se pueden encontrar en las patentes U.S. Nos. 6, 391, 623, 6,383,754, 6,383,749, 6, 380, 377, 6, 379, 897, 6, 376, 191, 6,372,431, 6 , 351, 712 , 6, 344, 316, 6, 316, 193, 6, 312, 906, 6, 309, 828, 6,306,643, 6, 300, 063, 6, 287, 850, 6, 284,497, 6, 284, 465, 6,280, 954, 6,262,216, 6, 251, 601, 6, 245, 518, 6,263,287, 6, 251, 601, 6,238, 866, 6, 228, 575, 6, 214, 587, 6,203, 989, 6, 171, 797, 6,103,474, 6, 083, 726, 6, 054, 274, 6, 040, 138, 6, 083, 726, 6, 004, 755, 6, 001, 309, 5, 958, 342, 5, 952, 180, 5, 936, 731, 5, 843, 655, 5,814,454, 5, 837, 196, 5, 436, 327, 5,412,087 y 5,407, 783, la descripción de los cuales se incorporan como referencia .
Los ejemplos adicionales incluyen arreglos de ácido nucleico que están disponibles comercialmente de Affymetrix (Santa Clara, Calif.) bajo la marca comercial GENECHIPMR. Los métodos ejemplares adicionales de elaboración y uso de arreglos se proporcionan, por ejemplo, en las patentes U.S. Nos. 7,028,629; 7,011,949; 7,011,945; 6,936,419; 6,927,032; 6,924,103; 6,921,642; y 6,818,394.
La presente invención se relaciona con arreglos y 5 microarreglos que también contemplan muchos usos para polímeros unidos a sustratos sólidos. Estos usos incluyen monitoreo de expresión de genes, generación de perfiles, cribado de bibliotecas, determinación de genotipo y diaqnóstico. Los métodos de monitoreo y generación de LO perfiles de expresión de genes y los métodos útiles para el monitoreo y generación de perfiles de expresión de genes se muestran en las patentes U.S. 5,800,992, 6,013,449, 6,020,135, 6,033,860, 6,040,138, 6,177,248 y 6,309,822. La determinación del genotipo y los usos por lo tanto se L5 muestran en U.S. Nos. de Serie 10/442,021, 10/013,598 (solicitud U.S. No. 2003/0036069) y en las patentes U.S. Nos. 5,925,525, 6,268,141, 5,856,092, 6,267,152, 6,300,063, 6,525,185, 6,632,611, 5,858,659, 6,284,460, 6,361,947, 20 6,368,799, 6,673,579 y 6,33,179. Otros métodos de amplificación de ácido nucleico, marcado y análisis que se pueden utilizar en combinación con los métodos descritos en la presente se indican en las patentes U.S. Nos. 5,871,928, 5,902,723, 6,045,996, 5,541,061 y 6,197,506. ?c. Como será evidente para las personas expertas en el ámbito, ciertas modalidades pueden utilizar oligonucleótidos , tales como cebadores o sondas para amplificación o detección, como se describe en la presente. Los oligonucleótidos de una secuencia definida y de estructura química se pueden producir por técnicas conocidas por aquellos habitualmente expertos en el ámbito tal como por síntesis química o bioquímica o por expresión in vitro o in vivo a partir de moléculas de ácido nucleico recombinantes , por ejemplo vectores bacterianos o virales. En ciertas modalidades, un oligonucleótido no consiste únicamente de ADN cromosómico natural o de productos de transcripción in vivo de los mismos.
Los oligonucleótidos o cebadores se pueden modificar de cualquier manera, en la medida en que una modificación dada sea compatible con la función deseada de un oligonucleótido dado. Una persona habitualmente experta en el ámbito puede determinar con facilidad si una modificación dada es adecuada o deseada para cualquier oligonucleótido dado de la presente invención. Los oligonucleótidos AARS relevantes se describen con mayor detalle en la presente.
Aunque el diseño y la secuencia de oligonucleótidos depende de su función como se describe en la presente, diversas variables generalmente se toman en consideración. Entre las más pertinentes está: longitud, temperatura de fusión (Tm) , especificidad, complementariedad con otros oligonucleótidos en el sistema, contenido G/C, tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G) y la secuencia en el extremo 31. El control para estas y otras variables es de un aspecto convencional y bien conocido del diseño de oligonucleótidos y diversos programas de computadora están disponibles fácilmente para el cribado de grandes cantidades de oligonucleótidos potenciales para buscar los óptimos.
Ciertas modalidades por lo tanto incluyen métodos para detectar el polinucleótido de AARS objetivo en una muestra, el polinucleótido comprende la secuencia de un polinucleótido de AARS de referencia, como se describe en la presente, que comprende: a) hibridizar la muestra con una sonda que comprende una secuencia complementaria al polinucleótido objetivo en la muestra y sonda la cual hibridiza específicamente con el polinucleótido objetivo, bajo condiciones con las cuales se forma un complejo de hibridación entre la sonda y el polinucleótido objetivo o fragmentos del mismo, y b) detectar la presencia o ausencia del complejo de hibridación y, opcionalmente, si está presente, la cantidad del mismo. También se incluyen métodos para detectar un polinucleótido de HRS objetivo en una muestra, el polinucleótido comprende la secuencia de un polinucleótido de HRS de referencia, como se describe en la presente, que comprende: a) amplificar el polinucleótido objetivo o fragmento del mismo; y b) detectar la presencia o ausencia del polinucleótido objetivo amplificado o fragmento del mismo y, opcionalmente , si esta presente, la cantidad del mismo. Las modalidades específicas se relacionan con la detección de variantes de empalme de AARS por ejemplo mediante detección de una unión de empalme única de la variante de empalme, ya sea por método de hibridación, amplificación u otro método de detección.
Las modalidades de la presente invención incluyen una diversidad de técnicas de detección basadas en polipéptido de HRS que incluyen técnicas de detección basadas en anticuerpo. Incluidas en estas modalidades están el uso de polipéptidos de HRS para detectar, cuantificar o elaborar mapas de epítopo de anticuerpos anti-HRS en una muestra biológica, tal como suero, sangre completa o plasma. Ciertas modalidades pueden utilizar metodologías y detectores estándar tal como transferencia Western e inmunoprecipitación, análisis inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) , citometría de flujo y análisis de inmunofluorescencia (IFA, por sus siglas en inglés) los cuales utilizan un dispositivo generador de imagen .
Los polipéptidos de HRS humanos presentan características de unión a anticuerpos sorprendentemente superiores en comparación con las metodologías de detección de anticuerpo preexistentes las cuales se basan en histidil -AR t sintetasa no humana y/o preparaciones crudas.
En algunas modalidades de estos análisis, el polipéptido de HRS son polipéptidos de HRS enumerados en, o derivables de las tablas DI a D9. En algunas modalidades, el polipéptido de HRS comprende una etiqueta para facilitar la unión a una superficie sólida. En una modalidad, la etiqueta es una etiqueta poli-his.
En consecuencia, en algunas modalidades, el polipéptido de HRS puede ser utilizado para establecer un perfil de pacientes para identificar su carga de enfermedad de anticuerpo Jo-1. Estos perfiles permiten la selección de pacientes en subpoblaciones que se podrían beneficiar del tratamiento con el polipéptido de HRS, pronosticar la probabilidad de resultado terapéutico y/o identificar uno o más polipéptidos de HRS más adecuados para usarse como agentes terapéuticos.
En una modalidad, la invención incluye un método para identificar un sujeto humano en riesgo de tener una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS, que comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo, o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil-ARNt sintetasa en el sujeto; y b) identificar al sujeto considerando si se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene anticuerpos detectables para histidil-AR t sintetasa o el polipéptido de HRS.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto presenta una concentración de anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en su suero de más de aproximadamente 1 micromolar.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en su suero de más de aproximadamente 2 micromolar.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que se encuentra en alto riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histil-AR t sintetasa en su suero de más de aproximadamente 4 micromolar.
En otra modalidad, la invención incluye un método para seleccionar un polipéptido de HRS para tratar a un sujeto humano con una condición autoinmune o inflamatoria que comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo o la especificidad de epítopo del anticuerpo anti -histidil-ARNt sintetasa en el sujeto; y b) seleccionar un polipéptido de HRS el cual tiene una afinidad reducida por el anticuerpo anti-histidil-ARNt sintetasa en comparación con histidil-ARNt sintetasa natural.
En una modalidad, la invención incluye un método para pronosticar el progreso de enfermedad en un sujeto humano que comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil-ARNt sintetasa en el sujeto; y b) identificar si el sujeto se encuentra en riesgo de desarrollar una enfermedad más grave si el sujeto tiene anticuerpos detectables para histidil-AR t sintetasa o el polipéptido de HRS.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que se encuentra en riesgo de desarrollar enfermedad más grave si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en su suero de más de aproximadamente 1 micromolar.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que se encuentre en riesgo de desarrollar enfermedad más grave si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en su suero de más de aproximadamente 2 micromolar.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que se encuentra en un riesgo alto de desarrollar enfermedad más grave si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en su suero de más de aproximadamente 4 micromolar.
En otra modalidad, la invención incluye un método para predecir las respuestas de los sujetos a la administración del polipéptido de HRS que comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil-ARNt sintetasa en el sujeto; y b) identificar al sujeto como adecuado para administración del polipéptido de HRS si el sujeto no tiene anticuerpos detectables para histidil -ARNt sintetasa, o el polipéptido de HRS.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que es adecuado para administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histidil -ARNt sintetasa en su suero de menos de aproximadamente 1 micromolar.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que es adecuado para administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en su suero de menos de aproximadamente 0.1 micromolar.
En algunos aspectos, el sujeto se puede identificar que es adecuado para administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene una concentración de anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en su suero de más de aproximadamente 0.01 micromolar.
Ciertas modalidades, pueden utilizar "arreglos" tales como "microarreglos . En ciertas modalidades, un "microarreglo" también puede referirse a un "microarreglo peptídico" o "microarreglo proteínico" que tiene una colección unida a sustrato de una pluralidad de polipéptidos , a la unión de cada uno de la pluralidad de polipéptidos es detectable por separado. De manera alternativa, el microarreglo de péptidos puede tener una pluralidad de enlazantes que incluyen pero que no se limitan a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , enlazantes de presentación de fago, enlazantes de 2 híbridos de levadura y aptámeros los cuales pueden detectar específicamente la unión de los polipéptidos de HRS descritos en la presente. El arreglo se puede basar en detección de autoanticuerpo de estos polipéptidos de HRS, como se describe, por ejemplo, en Robinson et al., Nature Medicine 8(3):295-301 (2002). Los ejemplos arreglos de péptidos se pueden encontrar en WO 02/31463, WO 02/25288, WO 01/94946, WO 01/88162, WO 01/68671, WO 01/57259, WO 00/61806, WO 00/54046, WO 00/47774, WO 99/40434, WO99/39210 y WO 97/42507 y las patentes U.S. Nos. 6,268,210, 5,76,960 y 5,143,854, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.
Ciertas modalidades pueden utilizar S u otros métodos basados en peso molecular para detectar de manera diagnóstica las secuencias de polipéptido de HRS. La espectrometría de masas (MS) se refiere de manera general a una técnica analítica para determinar la composición elemental de una muestra o molécula. También se puede utilizar MS para determinar las estructuras químicas de moléculas tales como péptidos y otros compuestos químicos.
De manera general, el principio de MS consiste en ionizar compuestos químicos para generar moléculas cargadas o fragmentos de moléculas y después medir sus relaciones masa respecto a carga. En un procesamiento ilustrativo de MS ; una muestra se carga sobre el instrumento de MS y experimenta vaporización, los componentes de la muestra se ionizan por uno de una diversidad de métodos (por ejemplo, al hacerlos chocar con un haz de electrones) lo que resulta en la formación de partículas cargadas positivamente, los iones positivos después son acelerados a un campo magnético, y se realizan cálculos respecto a la relación masa respecto a carga (m/z) de las partículas en base en los detalles de movimiento de los iones conforme transitan a través de los campos magnéticos y, la detección de los iones, etapa previa en la cual se clasifican de acuerdo con m/z.
Los instrumentos de MS ilustrativos tienen tres módulos: una fuente de iones la cual convierte las moléculas de muestra de fase gaseosa en iones (o, en el caso de ionización por electroaspersión, mueven iones que existen en solución en la fase gaseosa) ; un analizador de masa la cual clasifica los iones por sus fases al aplicar campos electromagnéticos; y un detector, el cual mide el valor de una cantidad indicadora y por lo tanto proporciona datos para calcular las abundancias de cada ión presente.
Las técnicas de MS tienen usos cualitativos y cuantitativos, que incluyen identificación de compuestos desconocidos, determinación de la composición isotópica de los elementos en una molécula y determinar de la estructura de un compuesto al observar su fragmentación. Otros usos incluyen cuantificar la cantidad de un compuesto en una muestra o estudiar los fundamentos de química de iones en fase gaseosa (la química de iones y sustancias neutras en el vacío) . Se incluyen la cromatografía-espectrometría de masas (GC/MS o GC-MS) , la cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC/MS o LC-MS) y la espectrometría de movilidad de iones/espectrometría de masas (IMS/MS o IMMS) . En consecuencia, se pueden utilizar las técnicas MS de acuerdo con cualquiera de los métodos que aquí se proporcionan para medir la presencia o niveles de un polipéptido de AARS de la invención en una muestra biológica y comparar estos niveles con una muestra control o un valor predeterminado.
Ciertas modalidades pueden utilizar clasificación de células o visualización de células o dispositivos/técnicas de generación de imágenes para detectar o cuantificar la presencia o niveles de polinucleótidos o polipéptidos de AARS. Los ejemplos incluyen citometría de flujo o FACS, análisis de inmunofluorescencia (IFA) y técnicas de hibridación in situ tales como hibridación fluorescente in situ (FISH, por sus siglas en inglés) .
Ciertas modalidades pueden utilizar métodos, programas y sistemas de biología convencional para propósitos de diagnóstico. Los productos de programa de computadora de la invención habitualmente incluyen medios legibles en computadora que tienen instrucciones ejecutables por una computadora para realizar las etapas lógicas del método de la invención. El medio legible en computadora incluye disco flexible, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, unidad de disco duro, memoria instantánea, ROM/RAM, cintas magnéticas, etc. Las instrucciones ejecutables en computadora se pueden escribir en un lenguaje de computadora adecuado o combinación de varios lenguajes. Los métodos de biológica computacional básicos se describen en, por ejemplo, Setubal y Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology (Elsevier, Amsterdam, 1998) ; Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Applications in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000) and Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd, ed., 2001). Véase patente U.S. No. 6,420,108.
Ciertas modalidades pueden utilizar diversos productos y programas de programa de computadora para una 57 diversidad de propósitos tal como diseño de sondas, administración de datos, análisis y operación de instrumentos. Véanse las patentes de U.S. 5,593,839; 5,795,716; 5,733,729; 5,974,164; 6,066,454; 6,090,555; 6,185,561; 6,188,783; 6,223,127; 6 , 229 , 911 y 6 , 308 , 170.
El análisis de muestreo de genoraa completo (WGSA, por sus siglas en inglés) se describe, por ejemplo en Kennedy et al., Nat. Biotech. 21, 1233-1237 (2003), Matsuzaki et al., Gen. Res. 14: 414-425 (2004), and Matsuzaki, et al., Nature Methods 1:109-111 (2004). Los algoritmos para usarse con los análisis de elaboración de mapas se describen, por ejemplo en Liu et al., Bioinforwatics. 19: 2397-2403 (2003) y Di et al., Bioinformatics. 21:1958 (2005) . Los métodos adicionales relacionados con WGSA y arreglos útiles para WGSA y aplicaciones para WGSA se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente U.S. 60/676,058 presentada el 29 de abril de 2005, 60/616,273 presentada el 5 de octubre del 2004, 10/912,445, 11/044,831, 10/442,021, 10/650,332 y 10/463,991. Los estudios de asociación amplios de genoma utilizando análisis de elaboración de mapas se describen, por ejemplo, en Hu et al., Cáncer Res.; 65(7):2542-6 (2005), Mitra et al., Cáncer Res., 64(21) :8116-25 (2004), Butcher et al., Hum Mol Genet . , 14 (10) : 1315-25 (2005), y Klein et al., Science. 308 (5720) : 385-9 (2005).
Adicionalmente , ciertas modalidades, pueden incluir métodos para proporcionar información genética sobre redes tal como la internet, como se muestra por ejemplo, en las solicitudes U.S. Nos. 10/197,621, 10/063,559 (Publicación de los Estados Unidos No. 2002/0183936), 10/065,856, 10/065,868, 10/328,818, 10/328,872, 10/423,403 y 60/482,389.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 PRODUCCIÓN DE RESOCINA MARCADA CON HIS (HRS(l-60)) OPTIMIZACIÓN DE COPÓN Y SÍNTESIS DE GEN El ADN que codifica para resocina (HRS(l-60)) se optimiza en codones para expresión en E. coli utilizando el algoritmo desarrollado por DNA.2.0 (Menlo Park, CA) . El gen se sintetiza con una etiqueta 6xHis C-terminal y se subclona en el vector pJexpress411 en donde se utiliza el promotor T7 para activar la transcripción de la resistencia a canamicina y se utiliza para selección por antibióticos. La secuencia de ADN optimizada en codones es la siguiente: ATGGCAGAACGTGCGGCATTGGAAGAATTGGTTAAACTGCAAGGTGAACGTGTTCGTGG TCTGAAGCAGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCTGATCGAAGAAGAGGTGGCCAAACTGCTG AAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCC GAAACACCACCATCACCATCAC (SEC ID NO : 40) La secuencia de proteínas traducida es la siguiente : MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDES QKFVLKTPKH HHHHH (SEC ID NO: 41) Cepa de expresión. Se transforman células competentes BL21(DE3) (Novagen, catálogo No. 69450) con la construcción de expresión optimizada de codón. Brevemente, el plásmido 1 µ?, se agrega 50 µ? de las células competentes. La reacción se mezcla y se incuba en hielo durante 30 minutos. La reacción se somete a choque térmico a 42 °C durante 30 segundos seguido por choque frío en hielo durante 2 minutos. Después se agregan 500 µ? del medio SOC y el tubo se incuba a 37 °C, 250 rpm durante 1 hora. Finalmente se dispersa una alícuota de 50 µ? de cultivo en la placa de canamicina (Teknova S9641) y se incuba a 37 °C durante la noche. Una 0 colonia única se toma y se utiliza para aumento de expresión.
Medio. El medio M9YE se prepara al mezclar 200 mi de sal mínima M9 estéril 5X (BD248510) , 778 mi de 30 g/1 de extracto de levadura en agua purificada estéril (BD212750) , 20 mi de glucosa 20% esterilizada (Sigma G7021) y 2 mi de 5 MgS04 1.0 M estéril (Sigma M7506) . La solución de alimentación contiene extracto de levadura 5%, glucosa 50%, elementos en trazas y 2 g/1 de sulfato de magnesio. Se agrega sulfato de canamicina (Invitrogen 15160) a una concentración final de Q 100 µg/ml tanto en M9YE como en solución de alimentación.
Fermentación de alimentación por lotes. Se utiliza un termentador de 4 1 (Sartorius Biostat B plus) con el programa MFCS/DA utilizado para fermentación de alimentación por lotes. La agitación se establece a 1000 rpm. El valor de c pH se controla a 7.0 automáticamente por la admisión de hidróxido de amonio 30% (Sigma 221228) y ácido fosfórico 30% (Sigma P5811) . El aire se proporciona a un caudal de 4 1/min con un compresor de aire de diafragma libre de aceite (Cole-Parmer) . El aire se hace pasar a través de un filtro Midistart 2000 de 0.2 µt? (Sartorius 17805) . El oxígeno puro (West Air) se suministra automáticamente para controlar el nivel de oxígeno disuelto a 70%. La temperatura se controla a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific) . El espumado se controla por la adición de la antiespuma 204 (Sigma A8311) . El volumen inicial de medio M9YE y del termentador es de 3 1. El termentador se inocula con 150 mi de cultivo de siembra que se hace crecer durante la noche a 30°C y 250 rpm. Cuando se agota la glucosa en el recipiente, la solución de alimentación concentrada se introduce en el recipiente por una bomba peristáltica ajustada a 0.9 ml/min. Cuando la densidad óptica de las células de 600 nm alcanza aproximadamente 30, el cultivo se induce con 0.5 m de IPTG (Fisher Scientific BP1755) . El cultivo se corre durante la noche (aproximadamente 18 horas de la fase de alimentación por lotes) y se cosecha por centrifugación a 6000 x g durante 1 hora. El sedimento celular se almacena a -20 °C hasta purificación. La expresión de resocina se confirma en SDS-PAGE.
Purificación de resocina. Se resuspenden 70 g de pasta de célula congelada en 280 mi (es decir, 4 ml/g de pasta celular) de amortiguador de lisis (50 mM de Tris, NaCl 300 mM, Imidazol 10 mM, ß-?? 5 mM, pH 7.5). Se agregan tabletas de inhibidor de EDTA completo- libre de proteasa (Roche) a la suspensión en una relación de 1 tableta/50 mi. La suspensión se hace pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 103 kPa (15,000 psi) y se enfría en hielo. El lisado se centrifuga a 15,000 x durante 30 min a 4°C. El sobrenadante se filtra a través de filtros de cápsula Acropak 400 de 0.45+0.22 m (Pall).
El lisado clarificado se une a la resina de Ni-NTA (Qiagen) , preequilibrada con amortiguador de unión Ni-NTA (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 10 mM, pH 7.5). La columna se lava con 50 volúmenes de columna de amortiguador de unión Ni-NTA + Tritón X-114 0.1% seguido por 20 volúmenes de columna del amortiguador de unión Ni-NTA. La proteína unida, resocina, se eluye con 4 volúmenes de columna de amortiguador de elución de Ni-NTA (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 7.5).
El eluato de Ni-NTA se purifica adicionalmente por columna de intercambio catiónico. Específicamente, el eluato de Ni-NTA se diluye 20 veces y el amortiguador de unión SP (fosfato de Na 10 mM, pH 7.0) y se carga en una columna HP SP-sepharose 33 mi preequilibrado con amortiguador de unión SP. La dimensión de la columna es de 2.6 de diámetro a una altura de 6.2 cm. El producto deseado se separa por elución de la columna por medio de un gradiente lineal de NaCl 0-0.5 M en el amortiguador de unión SP sobre 10 volúmenes de columna. La proteína purificada se concentra a 6 mg/ml, se somete a intercambio de amortiguador en PBS (Invitrogen, producto # 10010) y se filtra a través de un filtro estéril de 0.22 µt?. El rendimiento de la proteína purificada es de 150 mg (a partir de 70 g de pasta de célula) y su nivel de endotoxina es < 1.7 EU/mg.
EJEMPLO 2 PRODUCCIÓN DE HIST DIL-ARNt SINTETASA (HRS) DE LONGITUD COMPLETA MARCADA CON HIS Optimización de codón y síntesis de gen. El gen para HisRS de longitud completa se optimiza por codones para expresión en E. coli y se subclona en el vector pET21a en donde se utiliza el promotor T7 para activar la transcripción. Además, un enlazante de 5 aminoácidos y la etiqueta 6xHis se une a parte C terminal.
La secuencia de ADN es la siguiente: ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGT ACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTG CCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAA TTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGC CGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGC TGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAAT ATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTG CTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAAT AAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAAC CCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATT GCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGT GAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGC CGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTA CAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAA AATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTG -L o GTGACTATGTTCAACAAC ATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGG ATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAA TTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATC TGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTC TCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTG 15 GCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTG ACCCT AAAGGCCGT AAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTG AACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAacCCAAGTCT TAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCA GAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAA 20 ATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTAT TATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAA GCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGC CGCACCGGTCAACCGTTATGTATTTGCGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCAC CACCACTGA (SEQ ID NO:42) 25 La secuencia de la proteína traducida es la siguiente : MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELffiEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFV LKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDS KLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRG R YREF YQCDFDIAGNFDPMIPD AECLKIMCEILS S LQIGDFL VKVNDRRILDGMFAI CGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGV SLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTG VIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVER IFSrVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQ KLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKN PKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVI LRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRT GQPLCICAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:43) Cepa de expresión. Se transforman células competentes BL21 (DE3) (Novagen, catálogo número 64950) con la construcción de expresión optimizada en codones. Brevemente, se agregan 1 µ? de plásmido en 50 µ? de células competentes. La reacción se mezcla e incuba en hielo durante 30 minutos. La reacción se somete a choque térmico a 42 °C durante 30 segundos seguido por choque frío en hielo durante 2 minutos. Se agregan 500 µ? de medio SOC y el tubo se incuba a 37 °C, 250 rpm durante 1 hora. Finalmente, una alícuota de 50 µ? de cultivo se dispersa en una placa de ampicilina (Teknova S9641) y se incuba a 37°C durante la noche. Se toma una sola colonia y se utiliza para incremento de expresión.
Medio. Se prepara el medio M9YE al mezclar 200 µ? de sal mínima M9 estéril 5X (BD248510) , 778 mi de 30 g/1 de extracto de levadura en agua purificada estéril (BD212750) , 20 mi de glucosa 20% esterilizada (Sigma G7021) y 2 mi de MgS04 1.0 M estéril (Sigma M7506) . La solución de alimentación contiene extracto de levadura 5%, glucosa 50%, elementos en traza y sulfato de magnesio 2 g/1. Se agrega ampicilina a una concentración final de 100 µg/ml en solución tanto M9YE como solución de alimentación.
Fermentación de alimentación por lotes. Se utiliza un termentador de 4 1 (Sartorius Biostat B plus) con el programa MFCS/DA para la fermentación de alimentación por lotes. La agitación se establece a 1000 rpm. El valor de pH se controla a 7.0 automáticamente por la adición de hidróxido de amonio 30% (Sigma 221228) y ácido fosfórico 30% (Sigma P5811) . El aire se suministra a un caudal de 4 1/min con un compresor de aire de diafragma libre de aceite (Cole-Parmer) . El aire se hace pasar a través de un filtro Midisart 2000 de 0.2 µt? (Sartorius 17805). Se suministra automáticamente oxígeno puro (West Air) para controlar el nivel de oxígeno disuelto en 70%. La temperatura se controla a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific) . El espumado se controla por la adición de antiespumante 204 (Sigma A8311) . El volumen inicial del medio M9YE en el termentador es de 3 1. El termentador se inocula con 150 mi del cultivo de siembra que se hace crecer durante la noche a 30 °C y 250 rpm. Cuando se agota la glucosa en el recipiente, la solución de alimentación concentrada se introduce en el recipiente por medio de una bomba peristáltica ajustada a 0.9 ml/min. Cuando la densidad óptica de las células a 600 nm alcanza aproximadamente 30, el cultivo se induce con IPTG 0.5 mM (Fischer Scientific BP1755) . El cultivo se corre durante la noche (aproximadamente 18 horas en la fase de alimentación por lote) y se cosecha por centrifugación a 6,000 x g durante 1 hora. El sedimento celular se almacena a -20°C hasta purificación. La expresión de HisRS se confirma en SDS-PAGE.
Purificación de HisRS. Se resuspenden 40 g de pastas de células congeladas en 160 mi (es decir, 4 ml/g de pasta de célula) de amortiguador de lisis (Tris 20 mM, NaCll 400 mM, imidazol 20 mM, ß-?? 14 mM, pH 8.0 a 4°C). Se agregan tabletas de inhibidor EDTA completo-libre de proteasa (Roche) a una suspensión en una relación de 1 tableta/50 mi. La suspensión se hace pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 103 kPa (15,000 psi) con enfriamiento con hielo. El lisado se centrifuga a 35,000 x g durante 45 minutos a 4°C. El sobrenadante se filtra a través de filtros de cápsula Acropak 200 de 0.22 µt? (Pall).
El lisado clarificado se une a la resina Ni-NTA (Qiagen) , preequilibrada con amortiguador de unión Ni-NTA (Tris 20 mM, NaCl 400 mM, imidazol 20 mM, ß-?? 5 mM, pH 8.0 a 4°C) . La columna se lava con 500 volúmenes de columna de amortiguador de unión Ni-NTA + Tritón X-114 0.1% seguido por 50 volúmenes de columna del amortiguador de unión Ni-NTA. La proteína de unión HisRS se eluye con cinco volúmenes de columna de amortiguador de elución Ni-NTA (Tris 20 mM, NaCl 400 mM, imidazol 500 mM, ß-?? 5 mM, pH 8.0 a 4°C) .
El eluato de Ni-NTA se purifica adicionalmente por una columna de intercambio aniónico. Específicamente, el eluato de Ni-NTA se dializa contra amortiguador de unión Q (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, pH 7.4) y se carga en una columna Q-sepharose 5 mi, preequilibrada con amortiguador de unión Q. El producto deseado se separa por elución de la columna con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M en el amortiguador de unión Q sobre 10 volúmenes de columna. El HisRS purificado se concentra y se somete a intercambio de amortiguador en PBS (Invitrogen, producto #10010) + DTT 1 mM y se filtra a través de un filtro estéril de 0.22 µt?.
EJEMPLO 3 EVALUACIÓN DE RESOCINA (HRS(l-60)) COMO UN AGENTE ANTI INFLAMATORIO Para evaluar la propiedad antiinflamatoria potencial de los polipéptidos derivados de HRS se prueba una variante de empalme que se encuentra de manera natural, N-terminal que comprende los aminoácidos 1-60 de HRS (Resocina) en un modelo de colitis inducido por TNBS (Epistem, Ltd, Reino Unido) .
Las formas más comunes de enfermedad de intestino inflamatorio (IBD, por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa son trastornos inflamatorios crónicos y progresivos del tracto digestivo. La enfermedad de Crohn habitualmente afecta tanto el íleon y colon mientras que la colitis ulcerativa habitualmente afecta únicamente el revestimiento más interior del colon y recto. Los síntomas de la enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa generalmente son similares al dolor abdominal y la diarrea. En colitis ulcerativa moderada a grave, las heces con sangre con frecuencia se observan. Actualmente no hay cura para IBD. Los fármacos y sustancias biológicas que se utilizan comúnmente para tratar los síntomas inducen remisión y evitan la recaída. Los fármacos antiinflamatorios tales como sulfasalazina, mesalamina y corticosteroides con frecuencia son los medicamentos de elección para el tratatamiento de IBD para inducir remisión mientras que los supresores del sistema inmunitario generalmente se utilizan para ayudar a mantener la remisión. Los moduladores más comunes del sistema inmunitario utilizados para tratar IBD son azatioprina, mercaptopurina y tratamientos biológicos tales como antifactor de necrosis tumoral (anti-TNF-a) .
El desarrollo de modelos animales de IBD ha contribuido a la comprensión y descubrimiento de los tratamientos para IBD. Los modelos en roedor de colitis por sulfato de dextrano (DSS) y ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) han demostrado que la gravedad de pérdida de peso, histopatología de colon y calificación de endoscopía corresponden al grado de oportunidades de las citocinas y quimiocinas proinflamatorios que de modo preferencial atraen infiltración de neutrófilos y metaloproteinasas de matriz. Estos modelos en roedor de IBD también se han utilizado para validar un enfoque computacional para identificar tratamientos potenciales con medicamentos nuevos para IBD.
Se han realizado estudios en ratones macho BDF-1, con 12 ratones/grupo; todos los ratones en los grupos de tratamiento recibieron 3 mg de TNBS en 50% de etanol/solución salina por instilación del colon en el día del estudio 0 con el fin de inducir colitis, y se agregó Budenosida a 5 mg/kg oralmente como un control positivo.
En este estudio se administró resocina diariamente por inyección IV, comenzando 3 horas antes del tratamiento con TNBS, a una concentración de 1 ó 5 mg/kg. Los datos que se muestran en la figura 1 demuestran que el tratamiento con resocina (HRS(l-60)) a cualquiera de las concentraciones resultó en un incremento significativo en la supervivencia. En consecuencia, la resocina parece tener potentes efectos antiinflamatorios concordantes con la hipótesis de que los polipéptidos de HRS están involucrados en el control local de procesos inflamatorios.
Para comparar directamente HRS (1-60) directamente con HRS (1-506) , se llevó a cabo un estudio de TNBS repetido por Biomodels (MA, USA en ratones C57BL/6) .
Diseño del estudio: Un grupo control sin tratamiento consistió de 5 ratones con administración intrarrectal de vehículo para TNBS (Grupo 1) . Se administró TNBS (4 mg/100 mi en etanol 50%) al grupo 2 (15 ratones/grupo) y 10 ratones/grupo para los grupos 3-7 en el día 0. Los grupos 2 y 4-7 recibieron administración intravenosa q.d. de vehículo, HRS (1-506) , 3 y 1 mg/kg y aTyrl920 5 y 1 mg/kg, respectivamente, desde los días -1 a 5. El grupo 3 recibió administración oral de 2 mg/kg de Prednisolona q.d. los días -1 a 5. Se pesó a los animales diariamente. Todos los animales experimentaron endoscopía de video los días 3 y 5 para determinar el grado de colitis y para determinar si se puede observar algún efecto benéfico del tratamiento. Todos los animales sobrevivientes se sacrificaron el día 5 para obtener tejido del colon para mediciones de peso y longitud y para examen patológico.
Métodos. La endoscopía se realizó de manera a ciegas utilizando en un endoscopio para animales pequeños (Karl Storz Endoskope, Alemania) . Para evaluar la gravedad de la colitis, los animales fueron anestesiados con isofurano y se sometieron a endoscopía de video en el colon inferior. La colitis se calificó visualmente en una escala de 5 puntos que varía de 0 para normal a 4 para ulceración grave. En términos descriptivos, esta escala se define como se muestra en la Tabla El. A cada ratón se le asignó una calificación única que corresponde al daño más grave observado en toda la longitud del colon. En el día 5 se sacrificó a los animales y se extirpó el colon, se enjuagó y se midieron sus longitudes.
TABLA El Escala de calificación de colitis por endoscopía La histología se determinó al examinar el colon que abarca los 5 cm inferiores de cada animal el cual se recortó y las secciones de 2 cm para cada extremo se fijaron en formalina 10%, se embeben, se seccionan a aproximadamente 5 micrómetros y se tiñen con hematoxilina y eosina (H & E) para análisis histológico. Una sección de 1 cm media del colon se congela instantáneamente y se almacena a -80 °C. Los cortes de tejido se examinan por un patólogo veterinario certificado del equipo con experiencia particular en patología GI, de modo a ciegas. Cada sección se calificó para inflamación, edema y necrosis epitelial/pérdida utilizando una escala de 5 puntos de acuerdo con los criterios enumerados en la Tabla E2. Las calificaciones para cada una de las cuatro secciones se promediaron para obtener una media de calificación única por ratón y por parámetro. La media de la calificación sumada, la cual es la suma de los tres parámetros calificados también se reporta.
TABLA E2 Escala de calificación de colitis por histología Resultados : Todos los animales tratados con TNBS perdieron de manera notable peso corporal el día comenzaron a ganar peso nuevamente los días 3 ó 4. En los días 3 y 5 el tratamiento con 1 y 3 mg/kg de HRS (1-506) o 1 y 5 mg/kg de HRS (1-60) produjeron una disminución ligera a moderada en las calificaciones de colitis (Tabla E3) . El tratamiento con 3 mg/kg de HRS (1-506) produce de manera consistente una disminución más grande de calificaciones de colitis en comparación con otros grupos de tratamientos en ambos días, 3 y 5 (Tabla E3) . El tratamiento con 2 mg/kg de prednisolona produjo una disminución ligera en las calificaciones de colitis en el día 5 pero no tuvo efecto en el día 3. El tratamiento con 1 y 3 mg/kg de HRS (1-506) y 1 y 5 mg/kg de HRS (1-60) resulta en disminuciones significativas de inflamación, edema, necrosis epitelial/pérdida y la suma de calificaciones en comparación con el tratamiento con TNBS + vehículo (Tabla E3) .
Conclusión: En un modelo de ratón de colitis inducida por TNBS, el tratamiento intravenoso con HRS (1-60) a 1 y 5 mg/kg y HRS (1-506) a 1 y 3 mg/kg resulta en disminuciones significativas en calificaciones de colitis endoscópia y calificaciones de patología de inflamación, edema, necrosis epitelial/pérdida y calificación de suma. No hubo efectos adversos atribuidos a tratamiento con HRS (1-60) , HRS (1-506) , o prednisolona . Estos resultados confirman estudios previos y establecen adicionalmente un papel antiinflamatorio para los polipéptidos de HRS en enfermedades y trastornos inflamatorios tales como IBD.
EJEMPLO 4 TITULACIÓN DEL SITIO ACTIVO DEL RESIDUO CISTEÍNA EN HARS DE LONGITUD COMPLETA Para determinar la ubicación e identidad de residuos cisteína expuestos en la superficie en HARS de longitud completa, se incubó proteína recombinante purificada con yodoacetamida bajo condiciones nativas y desnaturalizadas para alquilar cualquier residuo cisteína expuesto en la superficie. Las muestras después se analizaron al limitar proteólisis seguido por LC-análisis de masas para determinar la ubicación e identidad de los residuos cisteína modificados .
Para realizar los estudios de alquilación, HRS etiquetada con polihistidina, de longitud completa (6.65 mg/ml en PBS, glicerol 10%, DTT 2 mM, pH 7.4 (Ejemplo 2) primero se reduce completamente y por incubación con DTT 10 mM durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las incubaciones con yodoacetamida se llevaron a cabo con una concentración de yodoacetamida ya sea de 30 mM ("Baja") o 100 mM ("Alta") durante 30 minutos en la oscuridad y se llevaron a cabo sobre muestras nativas y desnaturalizadas de HARS para confirmar que la reacción es exitosa. Se preparó HARS desnaturalizada por preincubación de la proteína con guanidina 4M durante 45 min a 50 °C. Después de incubación con yodoacetamida, las muestras se dializaron en PBS pH 7.4 a 4°C utilizando una membrana de diálisis de límite de peso molecular de 10 kDa y con por lo menos 3 intercambios de amortiguador y después se utilizaron para análisis de espectroscopia de masas como se describe más adelante.
En breve, las muestras se prepararon al diluir las proteínas en ácido fórmico 0.1% a una concentración final de 1 mi /mi y muestras de 5 mg de proteínas se inyectaron y analizaron por HPLC en fase inversa seguido por análisis de espectro de masas utilizando un espectrómetro de masas Agilent TOF . Las muestras primero se separaron en una columna de HPLC C3 (columna Agilent ZORBAX 300SB-C3, 5 µ?a, 2.1 x 150 mm) utilizando un gradiente lineal de (fase móvil B de 2-60%) durante 18 min (fase móvil A: ácido fórmico 0.1%; fase móvil B: ácido fórmico 0.1% en acetonitrilo) . El análisis de espectrometría de masas de las muestras estaba en modo de perfil. Los datos se adquirieron y analizaron por un equipo MassHunter (Agilent) . El peso molecular medido se calculó por MassHunter Bioconfirm Agilent) .
Los resultados (datos no mostrados) demuestran que bajo condiciones nativas únicamente 3 ó 4 residuos cisteína son rara vez modificados, mientras que en comparación cuando la proteína es desnaturalizada por primera vez para romper su conformación nativa, la totalidad de las 10 cisteínas se desnaturalizan con facilidad.
Para identificar la identidad de los residuos cisteína modificados muestras antes y después de incubación con yodoacetamida se someten a desnaturalización en clorhidrato de guanidina 4 M a 37°C durante 30 min seguido por escisión proteolítica con LysC utilizando una relación 10:1 (p/p) a temperatura ambiente durante 20 h. Los digeridos de proteína se analizan por LC/MS/MS utilizando Dionex HPLC y el espectrómetro de masas Thermo LTQ XL. Las muestras se separan primero en una columna C18 HPLC (Agilent ZORBAX 300SB-C18, 5 ym, 2.1 x 150 mm) utilizando un gradiente de fase móvil B (fase móvil A: ácido fórmico 0.1%; fase móvil B: ácido fórmico 0.1% en acetonitrilo) . El gradiente comienza con 1 a 3% de B en 10 min y después a 40% de B en 76 min. Los digeridos de proteínas separados se analizan ya sea por MS completo en modo de perfil o por exploración MS completo y se analizan por exploración en tándem MS/MS en la parte superior de los tres iones identificados. Los datos se adquieren y analizan por Xcalibur (Thermo) . El secuenciado de péptidos se basa en los espectros MS/MS de cada péptido en los cuales los picos de ión b e y coinciden con sus iones teóricos. La identificación de los péptidos y la elaboración de mapas de los sitios de modificación se basan en el peso molecular y se confirman por secuenciado de péptidos utilizando espectros MS/MS y se enumeran en la Tabla E4.
Los resultados mostraron (datos no mostrados) que Cys235, Cys507 y Cys509 se modifican fácilmente por tratamiento con yodoacetamida y por lo tanto es probable que sean residuos expuestos a la superficie que son susceptibles con facilidad a modificación química.
EJEMPLO 5 CREACIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE HRS MODIFICADOS CON CONTENIDO ALTERADO DE CISTEINA Para determinar si cualquiera de los 10 residuos cisteína que se encuentran de modo natural en HRS de longitud completa puede mutarse a residuos aminoácidos como se encuentran de modo natural alternativos o se pueden suprimir, se diseñan cebadores para mutar selectivamente cada residuo cisteína. Para llevar a cabo esto, se pueden utilizar cebadores basados en lo siguiente (véase Tabla E5) .
Para conf irmar los datos de titulación de sitio activo , la estructura de cristal de HRS de longitud completa se anal iza utilizando el programa Getarea 1 . 1 para determinar la ubicación relativa de los 10 res iduos cisteína . Los resultados (datos no mostrados) sugieren que la adición a Cys235 , Cys507 y Cys509, las cisteínas en las posiciones Cysl74 , Cysl91 y Cys224 de la SEC ID NO: 1 están expuestos por lo menos parcialmente a la superficie y probablemente estén modificados por reactivos estándar. Un análisis adicional de la estructura de cristales de HRS sugiere que Cysl74 y Cysl91 son capaces de reali zar un enlace disulfuro interno mientras que Cys507 y Cys509 son capaces de real izar enlaces disulfuro intercadena dentro del dimero de HRS , ambos contribuyen potencialmente a la microheterogeneidad que puede ser el iminada benéf icamente .
Para determinar directamente la significancia de los dos residuos cisteína C-terminales en su contribución en la formación de enlaces disulfuro intercadena, se compararon versiones etiquetadas con His de HRS de longitud completa y versiones suprimidas en la parte C-terminal de (HRS (1-506) ) por medio de análisis SDS-PAGE antes y después de la reducción, como se describe más adelante. Los resultados, mostrados en la figura 2, muestran que HRS de longitud completa es una mezcla ~50:50 de dímero no covalente y unido SS- mientras que HRS (1-506) reduce notoriamente el dímero del enlazado SS . La comparación de las dos proteínas por ELISA competitiva, como se describe más abajo mostró que ambas proteínas tienen valores CI50 comparables con respecto a la unión a anticuerpo Jo-1 (datos no mostrados) . La formación de enlace disulfuro intercadena reducido notablemente asociado con HRS (1-506) sugiere que esta variante es un punto de inicio adecuado para el desarrollo de formas de producto de la siguiente generación mejorados.
Para determinar si cualquiera de los cuatro residuos cisteína expuestos parcialmente en HRS de longitud completa puede mutarse a residuos aminoácidos como se encuentra de manera natural alternativos se diseñaron cebadores para mutar selectivamente residuos C174, C191, C224 y C235. Para llevar a cabo esto, se utilizaron los siguientes cebadores como se enumeran en la Tabla E6.
Se introdujeron mutaciones por mutagénesis utilizando el QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent, catálogo No. 210518) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de mutagénesis, las muestras se tratan con la enzima Dpn I a 37 °C y se transforman en células competentes XL10 gold utilizando procedimientos de rutina. Colonias múltiples se hacen crecer en caldo terrific durante la noche a 37 °C y los plásmidos resultantes se purifican con QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, catálogo No. 27106) . Los plásmidos se secuencian para confirmar la identidad de la sustitución de aminoácidos de cada clon. Los clones representativos se transforman en células competentes NovaBlue (Novagen, catálogo número 70181) y se hacen crecer en 250 mi de medio M9YE a 37 °C durante la noche. Se realizan axipreps utilizando el HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen, catálogo número 12663) para crear un concentrado de plásmido del mutante para análisis adicional. La concentración y pureza se determinó al medir A260, A280 y A230. Los plásmidos purificados se almacenaron a -20°C antes de transfección en E. coli o células de mamífero siguiendo protocolos estándar.
Para determinar el impacto de la mutación de cada residuo, se transformaron clones representativos en E. coli o células de mamífero y los rendimientos de producción, contenidos de endotoxinas, estabilidad y actividad relativa en un análisis de ELISA para determinar unión a anticuerpo Jo-1 como se describe más adelante.
Producción de proteína. Células competentes BL21 (DE3) (Novagen, catálogo número 69450) o células W3110 (ATTC) se transformaron con las construcciones de expresión optimizadas por codón que codifican para las construcciones de cisteína reducidas como se describe en lo anterior. El sistema de expresión, el medio de fermentación, las condiciones de fermentación y las etapas de purificación utilizadas para producir la proteína recombinante fueron esencialmente las mismas a aquellas descritas en el Ejemplo 6 más adelante después de ajustar la escala de producción y la cantidad de pasta de células utilizada. La Tabla E7 a continuación muestra los rendimientos de purificación y los niveles de endotoxina para las proteínas elaboradas.
El resultado muestra que la totalidad de las variantes de Cys reducidas se expresan relativamente bien y se purifican con éxito con bajos niveles de endotoxina. En particular, las variantes de cisteína reducidas en base en la mutación de Cysl91 y Cys235 muestran niveles de expresión favorables; aunque todos los clones presentan niveles razonables de expresión y niveles bajos de endotoxina. En comparación con la expresión de HRS de longitud completa, la totalidad de las proteínas modificadas en cisteína presentan un contenido de endotoxina significativamente menor. Además, los imitantes de cisteína reducidos HRS (1-506), HRS (1-506) C191V, HRS (1-506) C191S y HRS (1-506) C235S muestran todos expresión mejorada en relación a HARS natural de longitud completa .
Para determinar el impacto de las mutaciones de cisteína sobre la heterogeneidad de carga de las proteínas purificadas muestras de cada clon se analizaron por enfoque isoeléctrico. Se cargaron muestras de 10 ig sobre un gel de enfoque isoeléctrico (pH 3-10) utilizando un gel Life Technologies Novex pH 3-10 IEF 1.0 mm (catálogo número P/N EC6645B0X) , Novex IEF Marker 3-10 (catálogo número P/N 391201) , kit amortiguador Novex pH 3-10IEF (catálogo número P/N LC5317) , se corre con amortiguador de cátodo IX (cámara superior) y amortiguador de ánodo IX (cámara inferior) a 100V durante 1 hora, 200V durante 1 hora, y 500V durante 30 minutos. Los geles se fijan con TCA 12% con ácido sulfosalicílico 3.5% durante 30 minutos y se tiñen con Expedeon InstantBlue (catálogo número P/N ISB1L) . Los datos (resultados no mostrados) muestran que la mutación de la cisteína en la posición 174 reduce de manera significativa la heterogeneidad de punto isoeléctrico, consistente con la posibilidad de que este residuo cisteína experimente una formación de enlace disulfuro 5 intramolecular con cisteína 191.
Para determinar el impacto de las modificaciones de cisteína sobre la estabilidad térmica, la susceptibilidad de agregación y la actividad de ARNt sintetasa de las proteínas resultantes, las proteínas se determinan por fluorimetría de LO exploración diferencial, HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC) , ELISA competativa y titulación de sitio activo. Los resultados se muestran en la Tabla E8 más adelante.
La fluorimetría de exploración diferencial se realiza sobre muestras de proteína al monitorear L5 fluorescencia como una función de la intensidad de fluorescencia de un colorante lipofílico durante la desnaturalización térmica. Se llevaron a cabo estudios sobre muestras después de que se diluyeron a 0.5 mg/ml en 100 µ? de Q volumen final de PBS, pH 7.0 (NaCl 150 mM, fosfato 20 mM) y se mezclaron con solución de colorante de desplazamiento térmico, el cual se prepara al diluir la solución concentrada (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4461146) 20 veces en agua destilada ultrapura (Gibco, P/N 10977) . Se agregan 5 µ? del colorante diluido a 100 µ? de muestra. La mezcla se coloca en placas, en una placa de reacción óptica transparente de 384 pozos (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4309849) A 20 µ? cada pozo y 4 duplicados de pozos por muestra. Las placas se leen por medio de ViiA 7 Real Time PCR Instrument (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4453552). El protocolo de desnaturalización térmica comienza con una velocidad de cambio de 1.6°C/s, hasta que se alcanza una temperatura de 25°C, punto en el cual el instrumento mantiene esta temperatura 2 minutos, antes de incrementar adicionalmente la temperatura a 99 °C, a una velocidad de 0.5°C/s, punto en el cual esta temperatura se mantiene durante 2 minutos adicionales.
El análisis de HPLC por exclusión de tamaño se completa en muestras de proteína purificadas utilizando TSKgel Super SW3000, 4.6 mm ID x 30 cm, tamaño de partícula de 4 µ??, columna de 250 Á (Tosoh, 18675) utilizando una fase móvil de fosfato de sodio en 200 mM, NaCl 150 mM, pH 7.0 a un caudal de 0.3 ml/min con un sistema Agilent 1260 HPLC equipado con desgasificador al vacío, bomba binaria/cuaternaria, automuestreador termoajustado, compartimiento de columna termoajustado, detector de arreglo de diodos (DAD, por sus siglas en inglés) y el programa de cromatografía Chemstation) . Se inyectan 40 µg de muestras no diluidas de cada proteína después de centrifugación breve. Se utilizan una muestra de adecuabilidad del sistema (albúmina sérica bovina, BSA, Thermo Scientific, P/N: 23209) y un control interno (HRS natural) para encerrar muestras para asegurar la validez de esta prueba.
Se realizan las pruebas de ELISA competitivas en placas de 96 pozos (Immulon 4HBX) las cuales se han recubierto con 50 µ? de solución de HARS etiquetado con His de longitud completa, se ajustan a una concentración de 2 yg/ml con PBS . Las placas se sellan y se incuban durante la noche a 4°C. Antes de su uso, las placas se lavan cinco veces con PBST y subsecuentemente se bloquean con 100 µ? de BSA 1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Aunque las placas de ELISA estaban bloqueadas, las moléculas de competencia de cisteína reducidas (sobre un intervalo de concentración de 1 x 10"6M a 1 x 10"13M) se incuban con anticuerpos -Jo-l (GenWay GWB-FB7A3D o Immunovision HJO-0100) a una dilución 1:10,000 en PBS BSA 1% en una placa de incubación separada (Costar 3357 de 96 pozos) durante 1 hora a 4°C. Después de que finaliza el bloqueo, las placas de ELISA se lavan tres veces con PBST y se agregan 50 µ? de solución que contiene anticuerpo y competidor a la placa de ELISA y las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de la incubación de unión inicial las placas se lavan cinco veces con PBST. Después se agregan 50 µ? de anticuerpo de detección (AbD Serotec de chivo, anti-IgG humano F(ab')2:HRP 0500-0099) a una dilución de 1:5,000 y se incuba durante una hora a temperatura ambiente. Después de incubación de unión secundaria, las placas se lavan con cinco veces PBST y se agregan 50 µ? de sustrato TMB (Thermo Scientific Pierce TMB Substrate PI-34021) . Las reacciones se llevan a cabo durante 8 minutos, punto en el cual se agregan 50 µ? de solución de detención de ácido sulfúrico 2M. La cuantificación colorimétrica se realiza utilizando un lector de placa SpectraMax a 450 nM.
Para determinar el número de sitios activos catalíticos en cada variante de cisteína de HA S506, se utilizó el análisis de titulación de sitio activo (como se describe en Fersht et al., (1975) Biochemistry) . Brevemente, se realizaron análisis a temperatura ambiente con HARS 5 µ?, MgCl2 10 mM, ATP 50 mM, L-histidina 20 mM, pirofosfatasa inorgánica 2 µg/ml [?-32?]??? 1.65 µ? en amortiguador estándar (HEPES 100 mM, pH 7.5, KC1 20 mM) . Las reacciones se inician con enzimas en placa de PCR de bajo perfil y los puntos de tiempo se suspenden en placas de filtro PVDF multiScreen de 96 pozos Millipore que contienen HCl04/lechada de carbón activo (1:4 de HC104 7%:lechada de carbón activo 10%) a los 30s, 1 min, 2 min, 4 min y 10 min. Después de mezclar hacia arriba y hacia abajo por pipeteo y al someter las muestras a centrifugación en una placa de recolección con material de centelleo Supermix se realiza una cuenta en un lector de placa Microbetae.
Los resultados de estos estudios confirman que la totalidad de los mutantes de cisteína son activos con poca o nula pérdida de actividad, estabilidad o conformación, medida por titulación de sitio activo, unión en ELISA y determinaciones de Tm para desnaturalización térmica.
La titulación de sitio activo de la actividad de ARNt sintetasa mostró que la totalidad de los mutantes de cisteína reducidos son activos y por lo tanto adecuados para usarse en cualquiera de las composiciones, métodos y kits de la invención. En general, las sustituciones Cysl91 muestran en general una menor termoestabilidad mientras que los mutantes Cysl74 presentan heterogeneidad significativamente menor determinada por enfoque isoeléctrico.
EJEMPLO 6 CREACIÓN DE POLIPEPTIDOS DE HRS MODIFICADOS CON CORTES EN LA PARTE C-TERMINAL (HÍsRSN8) Para suprimir los últimos tres aminoácidos y el enlazante entre HisRS natural y la etiqueta His, se diseñaron cebadores para usarse con QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent, catálogo número 210519) . Para realizar esto se utilizaron los siguientes cebadores como se indica en la Table E9 : La supresión se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante de QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit. Después de la mutagénesis las muestras se tratan con la enzima Dpn I a 37 °C y se transforman en células competentes XL10 gold utilizando procedimientos de rutina. Se hacen crecer colonias múltiples en caldo Luria-Bertani durante la noche a 37 °C y los plásmidos resultantes se purifican con QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen catálogo número 27106) . Los plásmidos se secuencian para confirmar la identidad de la sustitución de aminoácidos de cada clon. Para suprimir la etiqueta His, los cebadores se diseñan para usarse con QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent, catálogo número 210519) . Para llevar a cabo esto, se utilizan los siguientes cebadores como se indica en la Tabla E10: La supresión se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante de QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit como se describe en lo anterior.
Producción de proteínas. Células competentes BL21 (DE3) (Novagen, catálogo número 69450) o células W3110 (ATTC) se transforman con la construcción de expresión optimizada en codón que codifica para HisRS (HRS (1-506)) como se describe en el Ejemplo 2. El sistema de expresión, los medios de fermentación y las condiciones de fermentación utilizadas para producir la proteína recombinante son esencialmente las mismas a las descritas en el Ejemplo 2.
Purificación de HisRSN8 libre de etiqueta (HisRS (1-506)). Se resuspenden 400 g de pasta de células congeladas en 1600 mi, 4 volúmenes de amortiguador de Lysis (Tris 50 m , NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM, L-Cisteína 2 mM, pH 7.4). Se agregaron tabletas de inhibidor de EDTA completo-libre de proteasa (Roche, Catálogo número 05 056 489 001) a la suspensión en una relación de 1 tableta/50 mi. La suspensión se hace pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 124 kPa (18,000 psi) con enfriamiento con hielo. El lisado se centrifuga a 15,000 x g durante 45 min a 4°C. El sobrenadante se filtra a través de 2-3 cápsulas AcroPak 1500 (0.8/0.2 pm, Pall, PN12675) .
El lisado clarificado se carga en una columna Q HP de 382 mi (5 x 19.5 cm) preequilibrada con Q amortiguador A (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7.4) . El producto se eluye con un gradiente lineal de 0-30% de Q amortiguador B (Tris 50 mM, NaCl 1 M, pH 7.4) sobre 10 volúmenes de columna (CV, por sus siglas en inglés). Las fracciones se recolectan a 0.5 CV/fracción y se analizan por SDS-PAGE. El acumulado se basa en el análisis en gel.
Se agrega una solución de sulfato de amonio 3.5 M al acumulado Q HP anterior a una concentración final de 1.2 M. La mezcla se filtra a través de AcroPak 200 (0.2 µ??) y se carga sobre 481 mi de una columna Phenyl HP (5 x 24.5 cm) preequilibrada con Tris 20 mM, sulfato de amonio 1.2 M, pH 5 7.0. El producto se eluye con un gradiente lineal de 1.2-0 M de sulfato de amonio en Tris 20 mM/pH 7.0 sobre 10 CV. Las fracciones (0.5 CV/fracción) que contiene el producto en base en el análisis de SDS-PAGE se acumularon.
El acumulado de fenilo de lo anterior se concentra 10 a 0.5 1 por medio del sistema TFF, que consiste de un sujetador de minicasete Pellicon (Millipore número de catálogo XX42PMINI) , una bomba Masterflex I/P y un cásete 2 x 0.1 m2 (30 kD MWCO, Novasep número de catálogo PP030M01L) . La solución concentrada después se intercambia en amortiguador con 6 diavolúmenes (3 1) de CHT amortiguador A (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.0) . El retenido se filtra a través de un filtro 0.2 µp? Millex GP-50 (Millipore parte # SLGP 05010) antes de avanzar a la siguiente etapa. 2Q La solución anterior se carga en una columna de 380 mi de cerámica de hidroxiapatita (5 x 19.4 cm) preequilibrada con CHT amortiguador A. La columna se lava con amortiguador A y es seguida por 6% de amortiguador B (fosfato de sodio 500 mM, NaCl 150 mM, pH 7.0) . El producto se eluye ?[- con un gradiente lineal de 6%-56% de amortiguador B sobre 10 CV. Las fracciones (0.5 CV/fracción) que contiene el producto en base en el análisis SDS-PAGE se acumulan.
Utilizando el mismo sistema de TFF, el acumulado de CHT se concentra a -0.2 1, se intercambia el amortiguador con 6 diavolúmenes de amortiguador de formulación de corriente (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.0) y se concentra a una concentración objetivo de -10 mg/ml. La solución de producto se filtra a través de un filtro 0.2 µp? Millex GP-50 (Millipore parte # SLGP 05010) y se almacena en un congelador a -80°C.
EJEMPLO 7 EVALUACIÓN DE POLIPEPTIDOS DE HRS PARA UNIR ANTICUERPOS ANTI- JO-1 A PARTIR DE MUESTRAS DE UN PACIENTE HUMANO Placas de 96 pozos (Immulon 4HBX) se recubren con una solución de 50 µ? de proteína, se ajustan a una concentración de 2 µg/ml con PBS . Las placas se sellan y se incuban durante la noche a 4°C. Antes de su uso, las placas se lavan cinco veces con PBST y subsecuentemente se bloquean con 100 µ? de BSA 1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Mientras las placas de ELISA son bloqueadas, las moléculas de competencia se incuban con anticuerpos OÍ-JO-1 disponibles comercialmente (GenWay GWB-FB7A3D, Immunovision HJO-0100 o RDL) a diversas diluciones en PBS BSA 1% en una placa de incubación separada (Costar 3357, 96 pozos) durante una hora a 4°C. Después de que finaliza el bloqueo, las placas de ELISA se lavan tres veces con PBST y 50 µ? de solución que contiene anticuerpo y competidor se agregan a la placa de ELISA y las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 1.5 horas . Después de la incubación de unión inicial, las placas se lavan cinco veces con PBST. Después se agregan 50 µ? de anticuerpo de detección (AbD Serotec de chivo anti-IgG humano F(ab')2:HRP 0500-0099) se agrega una dilución 1:5,000 y se incuba durante una hora a temperatura ambiente. Después de incubación de unión secundaria las placas se lavan cinco veces con PBST y se agregan 50 µ? de sustrato TMB (Thermo Scientific Pierce TMB Substrate PI-34021) . Las reacciones se llevan a cabo durante 8 minutos, punto en el cual se agregan 50 µ? de una solución de detención de ácido sulfúrico 2 M. La cuantificación colorimétrica se realiza utilizando un lector de placa SpectraMax a 450 nM.
Los resultados representativos se muestran en pruebas de ELISA competitivas para HisRSN8 (HRS1-506) en comparación con HRS de longitud completa (Figura 5) , resocina (HisRSN4: HRS (1-60) ) en comparación con HRS de longitud completa (figura 4) y HRS de longitud completa incubado con suero sobre un intervalo de diluciones (figura 3). Los datos muestran que HisRSN8 y HRS de longitud completa, pero no resocina son capaces de competir por la unión de anticuerpos anti-Jo-1 de muestras de paciente humano con miopatía inflamatoria y/o enfermedad pulmonar intersticial quienes presentan anticuerpos anti-Jo-1. De este modo, tanto HisRSN8 como HRS de longitud completa proporcionan una estrategia viable para competir con y bloquear la actividad de anticuerpos anti-Jo-1 a partir de muestras clínicas humanas que tienen una enfermedad asociada con autoanticuerpos específicos para histidil-ARNt sintetasa.
Adicionalmente, los datos muestran sorprendentemente que resocina (HisRSN4) bajo estas condiciones no proporciona reacción cruzada significativa con anticuerpos anti-Jo-1 y no compiten de modo significativo hasta que está presente en concentraciones mayores de aproximadamente 1 x 10~7 M, cuando la histidil-ARNt sintetasa de longitud completa está unida a la superficie de la placa. La resocina (HisRSN4) de esta manera puede administrarse a pacientes para mediar un efecto antiinflamatorio potencialmente sin provocar reactividad cruzada significativa con anticuerpos anti-Jo-1 circulantes.
Para explorar adicionalmente esta observación se llevaron a cabo estudios de competencia adicionales utilizando ELISAs de titulación tradicionales (Figura 6) . Los resultados muestran que cuando HisRSN4 o histidil-ARNt sintetasa esencialmente de longitud completa se unen na la superficie de la placa, las curvas de unión de anticuerpos anti-Jo-1 son aproximadamente comparables, lo que sugiere que la avidez u otros efectos pueden contribuir significativamente a las diferencias aparentes observadas en el análisis de ELISA competitivo.
EJEMPLO 8 EVALUACIÓN DE ESPECIFICIDAD DE EPÍTOPO DE ANTICUERPO ANTI-JO-1 Para evaluar la especificidad de epítopo de los anticuerpos anti-Jo-1 de una diversidad de pacientes, se obtienen muestras de suero de RDL (California) y se criban por el enfoque de ELISA de supresión para identificar la especificidad de anticuerpo relativa de las muestras.
En breve, las placas de ELISA se ajustan con muestras de proteína etiquetadas con His enumeradas en la figura 7, como se describe previamente, las cuales se expresan y se purifican en E. coli como se describe en el Ejemplo 2. Las muestras primero se incuban en placas de ELISA que contienen las proteínas enumeradas en lo anterior (véase Ejemplo 5), y los sobrenadantes despué se transfieren a una placa de ELISA nueva a la cual se une histidil-ARNt-sintetasa esencialmente de longitud completa. Al comparar los títulos de anticuerpo antes y después de la supresión es posible calcular la porción de anticuerpo anti-Jo-1 que se une, el cual es específico para cada construcción de proteína.
Los datos, que se muestran en la figura 8, muestran una amplia gama de especificidad de anticuerpo para ambos, la región de dominio WHEP (1-60) así como la porción remanente de la proteína (dWHEP) .
EJEMPLO 9 REMOCIÓN EXTRACORPORAL DE ANTICUERPOS JO-1 CON POLIPÉPTIDOS DE HRS Para evaluar si los polipéptidos de HRS pueden ser utilizados para efectivamente inmunosuprimir anticuerpos anti-HRS (por ejemplo, anticuerpos anti-Jo-1) del suero de un paciente, se inmovilizan muestras de HRS (1-506) y HRS (1-60) en un soporte sólido y después se ponen en contacto con sueros para determinar si son capaces de inmunosupresión de muestras de suero de anticuerpos anti-HRS. Los títulos de anticuerpo anti-Jo-1 se miden antes y después de la aplicación a la columna de afinidad para determinar la capacidad de cada uno de los polipéptidos de HRS para remover anticuerpos anti-Jo-1.
Inmovilización de los polipéptidos de HRS y supresión de anticuerpo Jo-1. Se inmovilizan HARS de longitud completa, HRS (1-506) y HRS (1-60) así como albúmina sérica bovina en gel de agarosa utilizando química de reticulado de N-hidroxi-succinimida (NHS) como lo indican las recomendaciones del fabricante (Bio-Rad Affi-gel catálogo #153-6046) . Una relación de 2 mg de proteína por 1 mi de resina se utiliza para conjugación. Los anticuerpos anti-Jo-1, obtenidos de un proveedor comercial (RDL, Los Angeles CA) , se diluyen 1:1,000 y después las muestras se hacen fluir a través de una columna elaborada con cada uno de los conjugados de polipéptido de HRS y agarosa inmovilizados preparados como se describe en lo anterior. Los títulos de anticuerpo Jo-1 se determinan antes y después de su paso a través de la columna de afinidad como se describe más adelante . 5 Titulación del anticuerpo Jo-1. Se recubren placas de 96 pozos (Thermo Scientific Immulon 4 HBX plates, catálogo #6484) con HisRSl a una concentración de 2 µg/ml en PBS durante la noche a 4°C. Al siguiente día las placas se lavan ^o con PBST y se bloquean con BSA 1% (Invitrogen, catálogo #15260) diluido en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas después se lavan tres veces con PBST y se incuban con muestras que contienen anticuerpos Jo-1 durante 1.5 horas a 37 °C. Las placas después se lavan nuevamente tres veces con PBST y se incuban con anticuerpo secundario (AbD Serotec de L5 chivo, anti IgG humano, catálogo #0500-0099) y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas después se lavan nuevamente tres veces con PBST y se incuban con sustrato 3 , 3 ' , 5 , 51 -tetrametilbencidina (TMB) (Thermo ?g scientific, catálogo #34021) durante 5 minutos y se agrega ácido sulfúrico 2M y se mezcla para detener la reacción. Las placas después se leen a 450 nM y el título de anticuerpo relativo se determina.
Los resultados (Figura 9) revelan que HARS de longitud completa y HRS (1-506) son eficaces en inmunosuprimir anticuerpos Jo-1 de muestras de suero humano. Sorprendentemente, HRS (1-506) es capaz de remover hasta 99% de anticuerpos Jo-1 detectables, con un paso único a través de la resina de afinidad mientras que los HARS de longitud completa son capaces de remover solo aproximadamente 93% de los anticuerpos detectables bajo las mismas condiciones. Concordante con estudios anteriores, el uso de un fragmento más pequeño de HARS, HRS (1-60) es capaz de suprimir solo aproximadamente 20% de los anticuerpos Jo-1 detectables, lo que sugiere que este polipéptido de HRS puede ser útil para remoción selectiva de subpoblaciones específicas de anticuerpos Jo-1 circulantes.
EJEMPLO 10 EVALUACIÓN DE POLIPEPTIDOS DE HRS PARA EL TRATAMIENTO DE MIOSITIS INDUCIDA POR ESTATINA Y RABDOMIOLISIS Las estatinas son inhibidores de HMG CoA reductasa los cuales inhiben la síntesis de mevalonato, la etapa limitante de velocidad en la síntesis de colesterol . El tratamiento con estatina se ha demostrado ser benéfico para disminuir los niveles de colesterol en pacientes. No obstante, los efectos secundarios y complicaciones del tratamiento con estatina se incluyen debilidad muscular, miositis y rabdomiólisis . La miopatía muscular es una complicación con varias estatinas en el vector y los pacientes con frecuencia son retirados del tratamiento con estatinas si presentan cualquiera de estos síntomas. Al igual que muchas otras miopatías, las distrofias musculares y los trastornos inflamatorios de músculo, el progreso de la enfermedad en mipoatía inducida por estatina parece presentarse como resultado de un daño inicial químico, genético o físico el cual se vuelve inflamado cada vez más como un resultado de la invasión de las células inmunitarias a la célula de músculo dañado.
En consecuencia, la miopatía inducida por estatina representa un sistema de modelo aplicable ampliamente para estudiar miositis inducida por fármacos lo cual es directamente aplicable a otras miopatías y distrofias musculares, la totalidad de las cuales comparten un componente inflamatorio común el cual media el progreso de la enfermedad al promover invasión de células inmunitarias del tejido muscular dañado.
El propósito de este estudio es evaluar la eficacia de HRS (1-506) en revertir los efectos de miositis muscular inducida por estatina, como se indica por niveles de enzima circulante alterados y cambios en la expresión de genes de la función muscular y marcadores inflamatorios en respuesta al tratamiento con HRS (1-506) .
Para obtener esto, a las ratas se les dosifica diariamente con 1 mg/kg de Cerivastatina y después se les cambia a una dosificación cada tercer día (qod) con Cerivastatina. El objetivo de este régimen de dosificación es mantener un estado de enfermedad sostenido en los animales pero no tener la enfermedad grave en donde la supervivencia de la rata se impacta grandemente. La eficacia de la administración de la dosis de HRS (1-506) se evalúa después en ratas después de dosificación con estatina que se ha iniciado de antemano cambios mensurables en los marcadores circulantes de miositis.
Protolo y métodos. En este estudio, ratas Sprague-Dawley hembra de 10 semanas de edad se tratan con 1 mg/kg de Cerivastatina ((Sigma, Catálogo número SML0005) en metilcelulosa 0.5%, comenzando en el día 1 por medio de sonda oral. Después de 7 días de administración diaria, se cambian las ratas a una estrategia de dosificación cada tercer día (qod) los días 9, 11 y 13. Se inicia la administración de HRS (1-506) y vehículos el día 6 mediante inyección intravenosa en ratas que se dosifica diariamente hasta el día 14 (que se muestra esquemáticamente en la figura 10A) . Todas las ratas suspendieron en el día 15, 24 horas después de la dosificación de artículo de prueba final y 48 horas antes de la administración de la última estatina. Se administró HRS (1-506) a 3 dosis (0.3, 1.0 y 3.0 mg/kg) en NaP04 20 mM, NaCl 0.15 M, pH 7.0, diariamente.
Para lograr el objetivo primario de este estudio, se realizaron las siguientes mediciones de estudio y criterios de valoración (supervivencia de ratas, peso, concentraciones de CK sérica circulante los días 12 y 15, tinción por H&E en el día 15 de muestras de isquiotibiales, Troponina-I ELISA, CBC en extracción de sangre en el día 15, qPCR en muestras de isquiotibiales y niveles de HARS endógeno en suero.
Métodos de qPCR. Los isquiotibiales de ratón se extirparon de los animales y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. El tejido se preparó en grupos de 10 isquiotibiales utilizando Qiagen's RNeasy Fibrous Tissue Midi Kit (Catálogo #75742) . Una vez que el AR se eluye de la columna Qiagen, se corre sobre un equipo Agilent Bioanalyzer 2100 para probar la integridad de ARN y NanoDrop para determinar la concentración en pureza de ARN. El ARN después se almacena a -80 °C.
La transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés) de ARN a ADNc se realiza en un formato de placa de PCR de 96 pozos en una máquina de PCR Eppendorf Mastercycler con el siguiente programa: 37 °C durante 60 minutos, 95 °C durante 5 minutos. Los pozos del borde de la placa de 96 pozos no se utilizan y se llenan con 50 µ? de agua para evitar evaporación del interior de los pozos. 20 µ? de ARN y 30 µ? de mezcla maestra de transcripción inversa (Ambion's TaqMan PreAmp Cells to CT Kit Catálogo #4387299) se utilizan por muestra de RT. Una vez que se completa RT, la siguiente etapa es preamplificar genes de interés en el ADNc de muestra. Los cebadores de genes de interés (cebadores DELTAgene diseñados por Fluidigm) se combinan a una concentración final de 200 nM. Utilizando estos cebadores, los genes de interés se pueden preamplificar en cada muestra. La preamplificación se realiza en reacciones de 10 µ? (2.5 µ? de ADNc, 7.5 µ? de Pre-Amp mastermix) en un formato de 384 pozos utilizando un equipo Applied Biosystems ViiA7 PCR con el siguiente programa: 95 °C durante 10 minutos, 14 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 4 minutos. Después de la etapa de preamplificación se agrega exonucleasa (New England BioLabs catálogo #M0293L) para remover cebadores no incorporados de cada muestra. Esta reacción de exonucleasa también se contempla por medio de una máquina de ViiA7 PCR con el siguiente programa: 37 °C durante 30 minutos, 80 °C durante 15 minutos. Después de la exonucleasa, la muestra de RT se diluye adicionalmente 1:5 (7 µ? de muestra de exonucleasa + 18 µ? de amortiguador EDTA bajo) .
El chip utilizado para correr qPCR en el sistema Fluidigm's Biomark es un equipo con una distribución de 96.96 Dynamic Array IFC para expresión de gen. El chip se ceba primero con HX controlador de IFC como lo indican las recomendaciones del fabricantes antes de que se cargue la muestra y los análisis. Para preparar análisis que van a ser cargados en un chip, 4.4 µ? de mezcla maestra de análisis (Fluidigm's 2X Assay Loading Reagent catálogo #8500736 y EDTA TE bajo) a 3.6 µ? 20 µ? de cebadores directo e inverso por cada gen de interés se preparan en una placa de 96 pozos.
Para preparar las muestras, se agregan 4.5 µ? de muestra Master Mix, Fluidigm's 20X DNA Binding Dye Sample Loading Reagent catálogo número 100-0388, y Biotium's 20X EvaGreen catálogo #31000) a 3 µ? de una muestra preamplificada diluida/exonucleasa en una placa de 96 pozos. Una vez que el chip ha sido cebado, 5 µ? de muestra del análisis preparado en lo anterior se cargan sobre el chip. El chip después se regresa al controlador de IFC para que las muestras se carguen en el chip. Después de que el chip ha terminado el cargado, qPCR después se puede llevar a cabo en el equipo Biomark utilizando el programa prestablecido para 96.96 Dynamic Array para expresión de gen con una curva de fusión para determinar la especificidad de cebador. La expresión de gen relativa se determina por el método delta-delta Ct .
Cuantificación de HARS extracelular . Una prueba de ELISA basada en 96 pozos se desarrolla dentro del laboratorio utilizando 2 anticuerpos monoclonales anti-HARS de ratón M03 (Sigma #SAB1403905, y Abnova #H00003035-M03) y M01 (Abgent #AT2317a) en un formato tipo emparedado para detectar HARS en suero de rata. Los análisis se llevan a cabo en placas Costar de 96 pozos (placa Costar de 96 pozos #3369) utilizando una curva estándar de siete puntos la cual se genera partiendo de 75 a 0.1 ng/ml utilizando una solución concentrada de HRS (1-506); (7.5 mg/ml en NaP04 20 mM, NaCl 0.15 M, pH 7.0 utilizando lx de PBST (0.05% de Tween-20) como diluyente) . El monoclonal de ratón M01, clón 1C8 (Abgent #AT2317a) se biotina en el laboratorio y se utiliza como el anticuerpo de detección y el anticuerpo monoclonal de ratón M03 (Sigma #sabl403905, lote #11238, 0.5 mg/ml y Abnova #H00003035-M03 , lote #11238, 0.5 mg/ml) se utiliza como el anticuerpo de captura. Se utiliza caseína (Thermo Scientific #37528) como un agente de bloqueo y se utiliza lx PBST (Tween-20 0.05%) como amortiguador de lavado. La unión de anticuerpo se cuantifica utilizando estreptavidina-HRP (Invitrogen catálogo #434323, Lote #816755A) utilizando sustrato TMB (Thermo #34021) y con ácido sulfúrico 2M como solución de detención.
Los análisis de ELISA se llevan a cabo en placas de recubrimiento durante la noche con 0.6 a 2 µg/ml de anticuerpo M03 en IX de PBS, el cual después se bloquea por incubación con caseína durante 1 hora y se lava 3 veces con PBST. Las placas después se incuban con estándares y muestras durante 1 hora, se lavan 3 x PBST y después se incuban con 15 ng/ml de biotinado-M01 diluido en PBST, 1 hora, se lava 3 x PBST, y se incuba con 200 ng/ml de estreptavidina-HRP durante 1 hora, se lava 3x con PBST y después el sustrato de TMB se agrega durante 4 minutos. La reacción se detiene con solución de detención y se lee la absorbancia a 450 nm.
Los resultados se cuantifican en la base en la curva estándar en base en los valores de absorbancia promedio sin tratar, sin sustracción del fondo. Se utilizan Prism como ajuste de curva estándar. Modelo: Logaritmo (agonista) versus ajuste de respuesta [regresión logística de 4 parámetros] . El porcentaje de recuperación se calcula para cada punto de concentración individual (no promediado) por: (medido - real) x 100% (real) Otras lecturas. Las ratas se pesan diariamente. Las muestras de suero se toman los días 1, 8 ó 12 (por medio de la vena de la cola) y en el día 15 (terminal) para ser utilizado para análisis de enzima circulante (Idexx) y mediciones de troponina-I de músculo esquelético en suero, se miden utilizando un kit de ELISA comercial. El urianálisis se realiza los días 3, 5, 8, 10, 12 y 15 antes de dosificación en ése día. Los análisis de CBC se realizan sobre sangre aislada en el día 15 antes de matar a las ratas. En el día 15, las ratas son sacrificadas y una porción del músculo isquiotibial y el pulmón (no inflado) se colocan en NBF 10% para embebido en parafina y tinción con H&E de secciones (Premier Laboratory) . Otra porción del músculo isquiotibial y el pulmón se coloca a -80 °C para usarse para extracción y determinación de perfil de ARN. El hígado, riñon y corazón también se aislan el día 15 y se colocan en zinc-formalina para embebido en parafina (Histología TSRI) para almacenamiento de tejido a largo plazo.
Resultados. Existe una supervivencia de 100% en este estudio y todas las ratas sobrevivieron a la cuenta programada en el día 15. Ratas dosificadas con estatina tuvieron pesos promedios menores que las ratas control no dosificadas con estatina. En el día 15, el grupo con estatina + vehículo presentó el peso promedio en rata más bajo de todos los grupos mientras que el grupo dosificado con estatina + 3 mg/kg de HRS (1-506) presentó el promedio de peso más alto de la totalidad de los animales tratados con estatina (datos no mostrados) . El análisis por CBC muestra otros patrones similares generales de cambios entre diferentes grupos de tratamiento de animales (datos no mostrados) .
Se observa un incremento pequeño en CK sérico en ratas tratadas con estatina con respecto a los controles no tratados los días 12 y 15. En el día 12, las ratas dosificadas con 1 mg/kg y 3 mg/kg de HRS (1-506) presentaron promedios de CK más estrechos y pequeños en comparación con los animales tratados con estatina + vehículo (Figura 11) consistente con el impacto positivo del tratamiento con HRS (1-506) sobre miositis inducida por estatina, también concordante con un efecto positivo de HRS (1-506) sobre la función muscular, los niveles de troponina C muscular también se redujeron en animales tratados con HRS (1-506) (figura 10B) . Además, los niveles endógenos de HRS en suero se elevaron en ratas tratadas con estatina en comparación con ratas quienes no recibieron estatina (figura 12) lo que sugiere que la liberación de HRS puede jugar un papel como un regulador endógeno de inflamación muscular. La tinción con H y E en isquiotibiales demostró degeneración/necrosis muscular reducida y calificaciones de inflamación en ratas tratadas con estatina dosificadas con 1 mg/kg y 3 mg/kg de HRS (1-506) en comparación con ratas dosificadas con vehículo o con 0.3 mg/kg de HRS (1-506) figura 13).
Para investigar adicionalmente la base mecanística de los efectos de HRS sobre la miopatía inducida por estatina, se examinaron cambios en la expresión de genes en los isquiotibiales de animales tratados examinados después de completar el estudio. Se realizó una determinación de perfil de AR en músculos isquiotibiales aislados de ratas en el día 15 como se describe en lo anterior. Los resultados de estos estudios demuestran que la totalidad de los 13 genes que estaban elevados en más de 5 veces en respuesta al tratamiento con estatina se redujeron por el tratamiento con HRS (1-506) (véase Tabla Ell; y figuras 14-15) .
La elaboración de un perfil transcripcional de isquiotibiales de rata tratados con estatina: mostró que 10 genes relacionados con diabetes/síndrome metabólico (figura 16) y varios genes intrínsecos (datos no mostrados) no fueron impactados significativamente por el tratamiento con HRS . En contraste, la elaboración de perfiles transcripcionales de isquiotibiales de rata tratados con estatina de 26 genes marcadores de células inmunitarias mostró cambios significativos en un número más grande de genes (véanse las figuras 17 a 19) que incluyen inhibición dependiente de la dosis en la expresión de ITGAL (CDlla) , CDllb, CD8a, CD8b, CD18, CCR5 y PTPPC (CD45R) . Adicionalmente, HRS (1-506) fue eficaz en reducir la expresión de un número de genes marcadores inflamatorios que incluyen IL6, MCP1, IL10 e IFN-gamma (véanse las figuras 20 a 21) . También se observaron cambios transcripcionales en 14 genes relacionados con adhesión, desarrollo y fibrosis (véanse las figuras 22 a 23), el gen de capacidad de contracción muscular Neb (datos no mostrados) , y en genes asociados con agotamiento, agotamiento muscular, atrofia y miogénesis (véanse las figuras 24 a 25) .
Conclusiones. CK disminuida, troponina-I sérica y degradación/necrosis de células musculares e inflamación muscular se observaron todos en animales que recibieron dosis más altas de HRS (1-506), ya sea a 1.0 mg/kg o 3.0 mg/kg en contraste con animales que recibieron vehículo o una dosis baja de 0.3 mg/kg de HRS (1-506) . Los datos de elaboración de perfiles de ARN soportados por estos resultados al demostrar expresión reducida de CD8a, IL-6, MCP-1 y MMP-9 en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina dosificadas con dosis más altas de HRS (1-506) . La regulación por aumento de estos genes es debida muy probablemente a infiltrado aumentado de células inmunes en el tejido de músculo dañado. En base en la identidad de los genes expresados, es probable que las células inmunitarias que se infiltran constituyan uno o más de los siguientes tipos de células, linfocitos T, células dendríticas, células NK y macrófagos/monocitos . Todos estos tipos de células han sido asociados con inflamación muscular y la capacidad de los polipéptidos de HRS, que incluyen HRS (1-506) a mediar una inhibición dramática en esta entrada de células inmunitarias lo que sugiere que los polipéptidos de HRS, tal como HRS (1-506) representan potentes inmunorreguladores , los cuales son capaces de actuar como potentes inmunomoduladores en un intervalo amplio de enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunes .
EJEMPLO 11 EVALUACIÓN DE LOS POLIPÉPTIDOS DE HRS PARA EL TRATAMIENTO DE DISTROFIA MUSCULAR La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es causada por mutaciones en el gen que codifica para distrofina, una proteína del subsarcolema que funciona dentro del complejo de glucoproteína asociado a distrofina (DCG, por sus siglas en inglés) . Este complejo conecta el citoesqueleto intracelular con la matriz extracelular . El DGC se concentra en las líneas Z del sarcómero y confiere la transmisión de fuerza a través de la fibra muscular. La ruptura de este enlace resulta en inestabilidad de membrana lo que a la postre genera rupturas del sarcolema. La entrada de calcio extracelular altera el proceso molecular como la contracción muscular y activa la actividad proteolítica . Las fibras de músculo afectada se vuelven necróticas o apoptósicas y liberan quimioatrayentes mitogénicos lo que inicia el proceso inflamatorio. Los ciclos de degeneración y regeneración a la postre generan agotamiento muscular irreversible y sustitución por tejido fibrótico y adiposo.
El músculo tiene el potencial de regenerarse por activación de células precursoras miogénicas no diferenciadas (células satélite) los cuales normalmente están en reposo y están situadas entre la membrana basal y las neofibras. Ante la activación, las células satélite proliferan y se dividen asimétricamente con las células descendientes que presentan destinos celulares divergentes. Únicamente una de las células descendientes se difierencian, progresa a un estado de neoblasto y subsecuentemente se fusiona con otros mioblastos o con fibras de músculo dañadas para inducir reparación de fibra muscular. Las otras células descendientes permanecen en un estado de proliferación o regresan al reposo. Las mutaciones genéticas responsables de DMD también están presentes en células satélite. Por lo tanto, la capacidad para restaurar función muscular normal permanece obstruida. Un número pequeño de fibras musculares son capaces de producir distrofina funcional, debido muy probablemente a mutaciones secundarias en células precursoras miogénicas las cuales restauran el marco de lectura. No obstante, estas denominadas fibras de reversión son una minoría demasiado pequeña para corregir la patología de la deficiencia de distrofina. El agotamiento del acumulado de células satélite debido a ciclos de degeneración y de regeneración se considera que contribuye de manera crítica a la enfermedad.
El modelo de ratón mdx para DMD presenta mutación espontánea en elección 23 del gen para Dmd, lo que introduce un codón de detención prematuro. La patología del ratón mdx se caracteriza por etapas histológicamente bien definidas con similitud con la patología humana. El tejido de músculo neonatal parece no ser afectado. Los procesos necrótico o apoptósico en combinación con inflamación surgen a aproximadamente 3 semanas de edad. Los procesos de regeneración se inician alrededor de la edad de 6 semanas y continúan con alternancia con degeneración que avanza hasta las 12 semanas de edad. Los ratones Mdx muestran una declinación en su capacidad de regeneración a una edad avanzada (>65 semanas) , mientras que persiste el proceso necrótico. Puesto que los procesos de degeneración son similares a aquellos observados en la patología humana, las diferencias de regeneración pueden mantenerse como una de las claves de restauración de la función muscular apropiada.
En consecuencia, este modelo de ratón proporciona un sistema de modelo in vivo para probar el impacto de los polipéptidos de HRS sobre la degeneración de células musculares, regeneración e inflamación así como los antecedentes genéticos de relevancia directa con la enfermedad humana y el tratamiento de distrofias musculares.
El propósito de este estudio es evaluar la eficiencia de HRS (1-506) en revertir los efectos relacionados con la edad del defecto genético del gen para distrofina en la pérdida progresiva de la función muscular en el modelo de ratón Mdx, como se indica por los niveles de enzima circulantes alterados y cambios en la expresión de genes de la función muscular y marcadores inflamatorios en respuesta al tratamiento con HRS (1-506) .
Para obtener esto, grupos de 8 animales (ratones C57B : /10ScSn-Dmdmdx/J; de seis semanas de edad al inicio del estudio) se les administró por inyección IV vehículo, HRS (1-506) (3 mg/kg) o un control positivo (Dexametasona) (1 mg/kg) una vez al día durante 14 días.
Protocolos y métodos. Se pesó a los ratones los días 1, 8 y 15 del estudio. Se realizó una prueba de función de músculo colgando de un cable para determinar la fuerza muscular los días 1, 8 y 15. Se tomaron muestras de suero los días 1 y 8 (por medio de la vena de la cola) y el día 15 (terminal) para ser utilizado para análisis de enzima circulante (Idexx) . El análisis CBC se realizó sobre sangre aislada el día 15 antes de matar a las ratas. En el día 15, se mató a las ratas y una porción del músculo anterior tibial y los diafragmas se colocaron en NBF 10% para embeberlo en parafina y para tinción de las secciones con H y E (Premier Laboratory) .
Resultados: No se observaron diferencias significativas en los pesos, tiempos de colgado o datos de CBC de animales tratados con HRS (1-506) o tratados con dexametasona (DEX) en comparación con controles no tratados ya sea en el día 8 o en el día 15 del estudio (datos no mostrados) . No obstante, se observaron reducciones en CK sérica, AST y LDH en ratones tratados con HRS (1-506) y tratados con dexametasona en comparación con los controles a los que se les administró vehículo (Figura 26) .
Los resultados demuestran que con dosificación únicamente durante 14 días se observan reducciones consistentes en los niveles circulantes de una diversidad de marcadores de suero de inflamación muscular que incluye niveles de CK, AST y LDH, indicando que HRS (1-506) tiene eficacia terapéutica en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne (DMD) .
EJEMPLO 12 EVALUACIÓN DEL IMPACTO DE ANTICUERPOS A HRS EN EL DESARROLLO DE DISTROFIA MUSCULAR DE ANILLO ÓSEO La distrofia muscular Limb Girdle tipo 2B (LGMD2B) es causada por mutaciones de pérdida de función del gen disferlina. La disferlina se expresa principalmente en músculo esquelético y pancreático pero también en monocitos, macrófagos y otros tejidos en donde se localiza en vesículas citoplásmicas y en la membrana celular. La disferlina parece estar involucrada en función y tráfico de membrana así como procesos de reparación. LGMD2B es una enfermedad muscular de inicio tardío (adolescentes/adultos jóvenes) que está caracterizada por debilidad muscular simétrica progresiva y de manera notable patología inmune/inflamatoria agresiva. Las biopsias de músculo típicamente muestran infiltración celular inflamatoria marcada que consiste principalmente de macrófagos/marcadores de activación de macrófagos (HLA-DR, HLA-ABC, CD86) , linfocitos citotóxicos CD8+ y linfocitos T CD4+, junto con degeneración/regeneración de fibra muscular.
Los ratones SJL/J presentan una supresión en marco de 171 pares de bases en la unión de empale 31 del exón 45 de disferlina. Desarrollan miopatía espontánea que se asocia con inflamación muscular obvia conforme envejecen. Juntas, estos rasgos vuelven a los ratones SJL/J un homólogo genético de miopatías deficientes en disferlina humana. Los cambios in lamatorios en los músculos de ratones SJL/J típicamente son de aproximadamente 4-6 semanas de edad y se caracterizan por infiltración de macrófagos activados seguido por linfocitos T CD4+. A los 6 meses, el infiltrado consiste principalmente de macrófagos junto con alguna necrosis de fibra muscular. A los 16 meses, las fibras musculares degeneran por completo y son sustituidas por grasa y colágeno .
Aunque los rasgos bioquímicos e histopatológicos de la cepa SJL/J se han documentado relativamente bien, no se han caracterizado completamente las causas funcionales de miopatía progresiva, particularmente durante las etapas tempranas de enfermedad las cuales muy probablemente sean útiles para evaluación de estrategias de tratamiento potencial. Para evaluar directamente el papel potencial de los polipéptidos de HRS endógenos en regular los procesos inflamatorios en el trabajo en la cepa SJL/J, ratones se inmunizan con HRS de longitud completa para secuestrar cualquier HRS endógeno. Si HRS está involucrado en regulación del proceso inflamatorio en músculo, entonces este enfoque puede resultar en la inducción de inflamación muscular. En consecuencia, este modelo de ratón proporciona fundamento 51 adicional para un papel de los polipéptidos de HRS en modular la degeneración, regeneración e inflamación de células musculares en un fondo genético de relevancia directa a la enfermedad humana y el tratamiento de distrofias musculares.
Para generar anticuerpos para HARS de longitud completa, los ratones SLJ/J se inmunizan con una inmunización subcutánea con adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés) el día 1 y se suministra un refuerzo de antígeno con IFA los días 15 y 29 para estimular adicionalmente la producción de anticuerpos.
Protocolo y métodos. Se inmunizaron grupos de 8 animales de ratones macho SLJ/J (JAX laboratorios) ; (ocho semanas de edad en el inicio del estudio) con 0.2 mg de HRS de ratón (mHRS) de longitud completa vía administración subcutánea, con adyuvante completo de Freund, los días 1, 15 y 29. Se aisló suero los días 10, 25 y 43 para determinar la producción de anticuerpo. Se mató a los animales el día 43 y tanto los isquiotibiales como los pulmones (los pulmones inflados) se recolectaron para histología (tinción con H y E de secciones (Premier Laboratory) . Se examinaron los niveles de enzima circulante en suero aislado en el día 43 (Idexx) .
Resultados: Los ratones SJL/J inmunizados con mHisRS generaron subcut neamente una respuesta de anticuerpos robusta a HisRS de longitud completa (figura 27A) . No se observaron cambios significativos en los niveles de enzima circulante en ratones inmunizados en comparación con los controles tratados con vehículo, aunque los niveles de aCK se encontraron ligeramente elevados en el grupo inmunizado con HRS (datos no mostrados). No obstante, el tejido muscular de ratones inmunizados con HisRS claramente mostró algunas regiones de infiltración celular y miositis (figura 27B) y concordante con esta histopatología, dos ratones inmunizados mostraron signos de miositis.
EJEMPLO 13 DESARROLLO DE FORMULACIONES ESTABILIZADAS PARA POLIPÉPTIDOS DE HRS Para determinar las condiciones de amortiguador óptimas para almacenar polipéptidos de HRS, se utilizó un enfoque paulatino para optimizar las condiciones de formulación básicas. Estos estudios involucran la determinación del intervalo de pH óptimo, el amortiguador estabilizante preferido y uno o varios excipientes para mantener la estabilidad y solubilidad de proteínas.
Se llevaron a cabo estudios con proteínas almacenadas en "amortiguador de control" (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.0) a una concentración de 2 mg/ml. Se prepararon soluciones concentradas de trabajo de HRS (1-506) al diluir la concentración de proteína concentrada (12.5 mg/ml almacenada a -80 °C) a una concentración de 2 mg/ml en los amortiguadores respectivos hasta un volumen final de 9.1 ral. Las proteínas diluidas después se dializan contra 2 1 de amortiguador deseada durante la noche con 10 kDa WCO Slide-A-Lyzers (Thermo Fisher) a 2-8°C (P/N: 66810) y después se dializa en 2 1 de amortiguador fresco durante 4 horas al día siguiente.
Después de la diálisis, las muestras se prueban para determinar los valores de tiempo cero de los parámetros medidos y se distribuyen en tubos de poliestireno de 5 mi (BD Falcon, #352859) a un volumen de 1 ml/condición. Los tubos se taparon y las tapas se envolvieron con Parafilm. Se realizó una inspección visual antes y después de la diálisis. Los análisis realizados para cada muestra incluyen apariencia, pH, fluorimetría de exploración diferencial, turbidez y opalescencia, análisis HPLC por exclusión de tamaño (SE-HPLC) y análisis SDS-PAGE.
Métodos analíticos: Apariencia: La apariencia de las proteínas se evaluó por examen visual en dos categorías: A) opalescencia y B) partículas. Categoría A: 1 claro; 2 = ligeramente opalescente; 3 = opalescente; categoría B: 1 = sin partículas: 2 = partículas presentes; 3 = fibras. Los resultados se expresan como "categoría A, seguido por categoría B". Por ejemplo, un resultado de "1,1" significa una solución clara sin partículas. pH: Se mide el pH de la muestra utilizando un medidor Accumet Basic AB15 plus pH (Fisher Scientific) con una microsonda (electrodo Accumet, catálogo #13-620-292). La calibración y medición se realizaron de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante.
Absorbancia: La absorbancia a 280 nm, 340 nm y 580 nm se mide utilizando el espectrofotómetro SpectraMax M2 5 (Molecular Devices) . En cada punto en el tiempo, 100 µ? de muestras no tratadas (pura) se utilizan para lecturas a A 340 (turbidez) y A580 (opalescencia) . Las muestras remanentes se centrifugaron durante 5 min a 14,000 rcf, y los sobrenadantes se diluyen 4 veces en amortiguadores correspondientes y se miden para absorción a A280.
Se realizó fluorimetría de exploración diferencial (DSF, por sus siglas en inglés) sobre muestras de proteína al monitorear fluorescencia como una función de la intensidad de fluorescencia de un colorante lipofílico durante desnaturalización térmica. Se llevaron a cabo estudios en muestras después de que se diluyeron a 0.5 mg/ml en 100 µ? de volumen final de PBS, pH 7.0 (NaCl 150 mM, fosfato 20 mM) y se mezclaron con solución de colorante de desplazamiento 20 térmico, el cual se preparó al diluir la solución concentrada (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4461146) 20 veces en agua destilada ultrapura (Gibco, P/N 10977) . Se agregaron 5 µ? de colorante diluido a 100 µ? de muestra. La mezcla se coloca en placas en una placa de reacción óptica clara de 384 -je- pozos (Applied Biosystems/Life Technologies P/N 4309849) a 20 µ? cada pozo y 4 pozos por duplicado por muestra. La placa se lee con el equipo ViiA 7 Real Time PCR Instrument (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4453552) . El protocolo de desnaturalización térmica comenzó con una velocidad de cambio de 1.6°C/s, hasta que se alcanzó una temperatura de 25 °C, punto en el cual el instrumento mantuvo esta temperatura durante 2 minutos, antes de incremento adicional de la temperatura a 99°C, a una velocidad de 0.5°C/s, punto en el cual esta temperatura se mantuvo durante 2 minutos adicionales.
El análisis de HPLC por exclusión de tamaño (SE- HPLC) se completó en muestras de proteína purificadas utilizando el equipo TSKgel Super SW3000, 4.6 mm ID x 30 cm, tamaño de partícula de 4 ym, columna de 250 Á (Tosoh, 18675) utilizando una fase móvil de fosfato de sodio 200 mM, NaCl 150 mM, pH 7.0, a una velocidad de flujo de 0.3 ml/min con un sistema Agilent 1260 HPLC equipado con desgasificador de vacío, bomba binaria/cuaternaria, automuestreador termoajustado, compartimiento de columna termoajustado, detector de arreglo de diodo (DAD) y programa de cromatografía Chemstation) . Se inyectaron 40 yg de muestras no diluidas de cada proteína después de centrifugación breve. Se utilizó muestra de adecuabilidad de sistema (albúmina sérica bovina, BSA, Thermo Scientific, P/N: 23209) y un control interno (HRS natural) para encerrar muestras para asegurar la validez de la prueba.
Análisis SDS-PAGE: Para determinar fragmentación y agregación, los genes de SDS reducidos y no reducidos se corren para cada punto en el tiempo. Muestra de 10 µg de cada proteína se cargaron por carril y se analizaron utilizando un sistema Xcell Surelock Mini-Cell (Invitrogen) utilizando 4-12% de geles precargados Bis-Tris NuPAGE, 1.5 mm x 10 pozos (Invitrogen PN NP0335BOX) y amortiguador de corrimiento NuPAGE MES SDS (Invitrogen PN NP0002) o amortiguador de corrimiento NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen PN N0001) siguiendo las instrucciones del fabricante. El amortiguador de muestra reductor se preparó a partir de un concentrado 4 x (Tris 0.25M, SDS 8%, Glicerol 40%, azul de bromofenol 0.008%, ß?? 14.3M, 20%); el amortiguador de muestra no reductora se prepara sin mercaptoetanol . Los marcadores de peso molecular teñidos previamente se obtienen de Invitrogen (Véase Blue Plus2, Invitrogen PN LC5925) . Los geles se tiñen con InstantBlue (Expedeon PN ISB1L) sigiuendo las instrucciones del fabricante.
Estudios preliminares sobre los efectos de pH e histidina sobre la estabilidad térmica. Los estudios de estabilidad exploratorios se realizaron utilizando HARS de longitud completa etiquetado con 6xHis y HRS etiquetado con 6xHis (1-506) . La proteína de longitud completa se dializó en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM al pH indicado (pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ó 7.5) por diálisis durante la noche en amortiguadores al pH respectivo. Los resultados del análisis de DSF demostraron que existen dos transiciones térmicas para HRS cuando se incuba a pH 7-7.5. La primera transición se produce a 48 °C, como se indica por la flecha, en la figura 28A y la transición principal a este intervalo de pH se produce en aproximadamente 54°C. Las temperaturas de transiciones principales para cada condición de incubación de pH se resumen en la Tabla E12. El análisis SE-HPLC muestran niveles comparables de picos de peso molecular alto (HMW, por sus siglas en inglés) para muestras almacenadas a pH 6.5-7.5 y un contenido de HMW significativamente más alto con muestras almacenadas a aproximadamente pH 5.5 (datos no mostrados). La precipitación también se observó con la muestra almacenada en amortiguador pH 5.5 y esta muestra no se evaluó más.
TABLA El2 Los resultados de estos estudios preliminares por lo tanto sugieren que el pH óptimo está en el intervalo de aproximadamente 6.5 a pH 7.5 y se llevaron a cabo estudios más detallados adicionales dentro de este intervalo de pH, como se indica con mayor detalle en lo siguiente.
Para determinar si la adición de histidina exógena puede incidir en la estabilidad de HARS, se llevaron a cabo estudios de estabilidad preliminares sobre un intervalo de concentraciones de histidina dentro del intervalo de 0.1 a 50 mM. Los resultados para los experimentos en el intervalo de histidina 0.5 a 10 mM se muestran en la figura 28B y el efecto de un intervalo más amplio de concentraciones se muestra en la Tabla E13.
TABLA El3 Los resultados de estos experimentos demuestran que la adición de histidina exógena es eficaz sobre un intervalo amplio de concentraciones para estabilizar la estructura de polipéptidos de HRS. Este efecto es evidente a una concentración de histidina tan baja como 0.03 mM y comienza a alcanzar su máximo en concentraciones de aproximadamente 5 mM y anteriores. En consecuencia, las concentraciones de histidina dentro del intervalo de aproximadamente 0.03 mM a 50 mM son eficaces para estabilizar los polipéptidos de HRS y las concentraciones de histidina dentro del intervalo de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM proporcionan estabilización térmica mejorada de modo significativo de los polipéptidos de HRS.
Caracterización detallada de la influencia de pH en la estabilidad del polipéptido de HRS. El impacto de pH sobre la estabilidad de HRS (1-506) se evalúa sobre un intervalo más amplio de condiciones de intubación y con una caracterización analítica más detallada dentro del intervalo de pH 6.0 a 7.5. Estos estudios se realizaron utilizando los métodos analíticos descritos en lo anterior y con muestras incubadas a 5° C , temperatura ambiente y 37 ° C hasta por una semana. Los resultados de estos estudios se resumen en la Tabla E14 Los resultados en totalidad sugieren que la proteína es relativamente estable cuando se incuba en un amortiguador a pH dentro del intervalo de aproximadamente 7.0 a aproximadamente pH 7.5 pero que la degradación potencial y los problemas de agregación comienzan a aparecer a valores de pH más bajos. En base en las condiciones probadas y los resultados de análisis obtenidos se concluye que el intervalo óptimo de pH para el almacenamiento de polipéptidos de HRS está dentro del intervalo de aproximadamente pH 7.0 a aproximadamente 7.5.
Caracterización detallada de la influencia de diferentes composiciones amor iguadoras sobre la estabilidad del polipéptido de HRS. El impacto de la composición de amortiguador sobre la estabilidad de HRS (1-506) se evaluó utilizando tres sistemas amortiguadores alternativos en base aproximadamente en amortiguador de fosfato, un amortiguador de citrato y un amortiguador de histidina a tres valores de pH, 7.3, 7.0 y 6.5. Estos estudios se realizaron utilizando los métodos analíticos descritos en lo anterior y con muestras incubadas a 5°C, temperatura ambiente y 37 °C hasta por una semana y los resultados se resumen en la Tabla E15.
Resultados y conclusiones. El amortiguador histidina dentro del intervalo de aproximadamente pH 7.0 a pH 7.4 tuvo el mejor desempeño en estos estudios. El amortiguador de histidina también mejoró la estabilidad de naturalización del polipéptido de HRS en ~8°C (datos no mostrados) . Los polipéptidos de HRS también mostraron buena estabilidad en amortiguador de citrato dentro de un intervalo amplio de valores de pH (pH 6.7-7.3) .
El intervalo más grande de valores de pH aceptables observados con los amortiguadores de citrato en comparación con los amortiguadores de histidina sugiere que ambos amortiguadores, basados en citrato y en histidina son emas de amortiguadores candidatos potencialmente atractivos para evaluar adicionalmente como amortiguadores de almacenamiento para polipéptidos de HRS Caracterización detallada de la influencia de diferentes excipientes en la estabilidad del polipéptido de HRS. El impacto de la composición amortiguadora sobre la estabilidad de HRS (1-506) se evaluó utilizando una variedad de excipientes potenciales que incluyen sacarosa, manitol, trehalosa, sorbitol, arginina, glicina, glicerol y alta concentración de sal (NaCl 280 mM) . Estos estudios se realizaron utilizando métodos analíticos descritos en lo anterior y con muestras incubadas a 5°C, temperatura ambiente y 37 °C hasta por una semana y los resultados se resumen en las Tablas E16 y E17.
Estos resultados demuestran mejoras significativas en la estabilidad de polipéptidos de HRS en presencia de un amortiguador de histidina, dentro del intervalo de pH 7.0 a 7.5 y en presencia de cloruro de sodio, arginina, sacarosa, trehalosa, sorbitol y/o glicina. Para evaluar adicionalmente el potencial para el desarrollo de formulaciones con características estabilizantes adicionales, se evaluaron las combinaciones que se incluyen en la Tabla E17.
Resultados: Utilizando estos sistemas amortiguadores existen pocos o nulos cambios en turbidez o formación de agregado de HMW cuando las muestras se incuban a 5°C o a temperatura ambiente. No obstante se observan incrementos dependientes de tiempo en estos parámetros para todas las muestras cuando se incuban a 37 °C. Todas las formulaciones tienen muy poco cambio cuando se someten a 5 ciclos de enfriamiento-recalentamiento. 5 En general, las condiciones PS20 (histidina/sacarosa/PS20) y F68 (histidina/sacarosa/F68 ) funcionaron mejor en base en el análisis SE-HPLC de formación de agregado de peso molecular alto y estos agentes son ^ capaces de reducir significativamente la formación de picos HMW cuando los polipéptidos de HRS se incuban a 37 °C hasta por 7 días .
Con respecto a la formación de turbidez (A340) , la adición de arginina funciona mejor, seguido por una alta L5 concentración de sal (condiciones de NaCl 280 mM y NaCl 140 mM) , lo que sugiere que estos agentes reducen efectivamente o evitan la agregación y desnaturalización de los polipéptidos de HRS cuando se incuban por períodos de tiempo prolongados a 37°C. Bajo estas condiciones, el j0 polisorbato 80, polisorbato 20 y Pluronic F68 también reducen efectivamente tanto la turbidez como la formación de agregados de HMW, según se determina por análisis HPLC. En estos estudios, la sacarosa y la trehalosa parecen ser aproximadamente comparables y ambos agentes inhiben )C- significativamente la desnaturalización de proteína y agregación, según se determina por turbidez y formación de HMW reducidas por incubación prolongada a 37 °C.
En base en estos estudios, la estabilización de polipéptidos de HRS se puede obtener fácilmente a través de la utilización de amortiguadores de histidina dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 7.0 a 7.5. Sorprendentemente, la adición de cloruro de sodio dentro del intervalo de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM proporciona estabilización adicional de estos amortiguadores lo que genera un incremento adicional de la Tm de 61°C (datos no mostrados) y reduce la desnaturalización cuando se somete a incubación prolongada a 37°C. La estabilidad puede mejorar aún más por medio de la adición de azúcares tales como trehalosa dentro del intervalo de aproximadamente 0.2% a 5% o sacarosa dentro del intervalo de aproximadamente 0.2% a 5%. Además, la adición de tensioactivos que incluyen polisorbato 20 ó 80 o pluronic F68 dentro del intervalo de aproximadamente 0.01 a 1% mejora adicionalmente la estabilidad general, particularmente cuando se incuba por períodos extendidos a 37°C. Mejoras adicionales en la estabilidad general de proteínas también son probables mediante la adición de agentes reductores (agentes antioxidantes) y/o agentes quelantes, como se describe en la presente.
En base en estos estudios las formulaciones ejemplares para los polipéptidos de HRS representan estabilidad mejorada incluyen amortiguadores que comprenden uno o más de los componentes que se incluyen en la Tabla E18.
TABLA El8 hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (192)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Una composición terapéutica caracterizada porque comprende polipéptido de histidil -ARNt sintetasa (HRS) de una longitud de aproximadamente 20-90 aminoácidos que es por lo menos 90% idéntico a la SEC ID NO: 1, en donde la compos i c ión/pol ipépt ido de HRS es: a) por lo menos aproximadamente 95% pura; b) menos de aproximadamente 5% agregada; y c) sustancialmente libre de endotoxina.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque por lo menos 20 aminoácidos del polipéptido de HRS son de la región definida por los residuos 1-67 de la SEC ID NO: 1.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque por lo menos 40 aminoácidos del polipéptido de HRS son de la región definida por los residuos 1-67 de la SEC ID NO: 1.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque por lo menos 60 aminoácidos del polipéptido de HRS son de la región definida por los residuos 1-67 de la SEC ID NO : 1.
5. Una composición terapéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido de histidil -ARNt sintetasa (HRS) de una longitud de por lo menos aproximadamente 400 aminoácidos que comprende 80 o más aminoácidos contiguos que son por lo menos 90% idénticos con la SEC ID NO : 1, en donde 5 la composición/polipéptido de HRS es: a) por lo menos aproximadamente 95% pura; b) menos de aproximadamente 5% agregada; y c) sustancialmente libre de endotoxina.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido de HRS comprende 200 o más aminoácidos que son por lo menos 90% idénticos a la SEC ID NO : 1.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido de HRS comprende 400 o más aminoácidos que son por lo menos 90% idénticos a la SEC ID NO: 1.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 500 aminoácidos. 20
9. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido de HRS comprende la secuencia de HRS humana de longitud completa (SEC ID NO: 1) .
10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el polipéptido de HRS está truncado en el ,,- residuo 505 (HRS (1-505)) o 506 (1-506) de la SEC ID NO: 1.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una mutación de por lo menos un residuo cisteína.
12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el residuo cisteína se selecciona de de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235, Cys507 y Cys509.
13. Una composición terapéutica caracterizada porque comprende un polipéptido de histidil-ARNt sintetasa (HRS) con una longitud de por lo menos 400 aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la SEC ID NO: 1, en donde la composición/polipéptido de HRS es: a) por lo menos aproximadamente 95% pura; b) menos de aproximadamente 5% agregada; y (c) sustancialmente libre de endotoxina .
14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un polipéptido de HRS de una longitud de por lo menos aproximadamente 500 aminoácidos que es por lo menos 90% idéntico a la SEC ID NO: 1.
15. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el polipéptido de HRS comprende la secuencia de la SEC ID NO: 1 (HRS humano de longitud completa) .
16. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el polipéptido de HRS está truncado en el residuo 505 (HRS) (1-505)) o 506 (HRS) (1-506)) de la SEC ID NO: 1.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una mutación de por lo menos un residuo cisteína.
18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cy2235, Cys455, Cys507 y Cys509.
19. Una composición terapéutica caracterizada porque comprende el polipéptido de histidil-ARNt sintetasa (HRS) de una longitud de 500-506 aminoácidos que es por lo menos 90% idéntico a la SEC ID NO: 70 (HRS (1-506) y que carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO: 1, en donde la composición/polipéptido de HRS es: a) por lo menos aproximadamente 95% pura; b) menos de aproximadamente 5% agregada; y c) sustancialmente libre de endotoxina.
20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de 505-506 aminoácidos y es por lo menos 90% idéntica a la SEC ID NO: 70.
21. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de 506 aminoácidos.
22. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polipéptido de HRS comprende la SEC ID NO: 70.
23. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polipéptido de HRS consiste esencialmente de la SEC ID NO: 70.
24. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polipéptido de HRS consiste de la SEC ID NO: 70.
25. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de 505 aminoácidos.
26. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el polipéptido de HRS comprende los residuos 2-506 de la SEC ID NO: 70 (HRS (2-506) ) .
27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el polipéptido de HRS consiste esencialmente de los residuos 2-506 de la SEC ID NO: 70 (HRS (2-506)).
28. La composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el polipéptido de HRS consiste de los residuos 2-506 de la SEC ID NO: 70 (HRS (2-506)).
29. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una mutación de por lo menos un residuo cisteína.
30. La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque por lo menos un residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235 y Cys455.
31. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 30, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene actividad biológica, estabilidad y/u homogeneidad incrementadas en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS humana de longitud completa) bajo condiciones comparables que varían de aproximadamente 4-40°C y un pH de aproximadamente 6.0-8.0.
32. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 20-25°C (temperatura ambiente) y un pH de aproximadamente 7.0-7.5, opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días.
33. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 37°C y un pH de aproximadamente 7.0-7.5 opcionalmente durante un periodo de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 0 7 días.
34. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, caracterizada porque la actividad aumentada comprende un incremento absoluto en la actividad biológica no canónica de por lo menos aproximadamente 10%.
35. La composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la actividad no canónica es actividad antiinflamatoria o unión específica a un anticuerpo anti-Jo-1.
36. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene formación reducida de disulfuro intercadena bajo condiciones reductoras en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS de longitud completa) .
37. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene heterogeneidad de carga reducida en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS de longitud completa) .
38. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene formación reducida de agregados de peso molecular alto en solución, en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS de longitud completa) .
39. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, caracterizada porque la homogeneidad aumentada comprende por lo menos un incremento de 10% en la monodispersión del polipéptido de HRS en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1.
40. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 39, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene un rendimiento aumentado de proteína soluble ante la producción recombinante de E. coli en relación al polipéptido de la SEC ID NO: 1 (HRS de longitud completa) .
41. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, caracterizada porque el polipéptido de HRS se fusiona a un asociado de fusión 5 heterólogo, opcionalmente un ligando de linfocitos T.
42. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, caracterizada porque el polipéptido de HRS comprende por lo menos un D-aminoácido.
LQ 43. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, caracterizada porque comprende un amortiguador en una concentración que varía de aproximadamente 0.03 mM a aproximadamente 100 mM.
44. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque comprende un L5 amortiguador en una concentración que varía de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM.
45. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque comprende un amortiguador en una concentración que varía de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM.
46. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque comprende un amortiguador en una concentración que varía de > c aproximadamente 45 mM a aproximadamente 55 mM.
47. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque comprende un amortiguador en una concentración aproximadamente 50 mM.
48. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, caracterizada porque el amortiguador en un amortiguador de histidina, un amortiguador de citrato o un amortiguador de fosfato.
49. La composición de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el amortiguador es un amortiguador de histidina y en donde el polipéptido de HRS tiene estabilidad aumentada en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable sin el amortiguador de histidina, bajo condiciones comparables, que varían de aproximadamente 4-40°C y un pH de aproximadamente 7.0-7.5.
50. La composición de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el amortiguador es un amortiguador de citrato y en donde el polipéptido de HRS tiene estabilidad aumentada en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable sin el amortiguador de citrato, bajo condiciones comparables, que varían de aproximadamente 4-40°C y un pH de aproximadamente 6.5-7.5.
51. La composición de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el amortiguador es un amortiguador de fosfato y en donde el polipéptido de HRS tiene estabilidad aumentada en relación a un polipéptido de HRS correspondiente en una composición comparable sin el amortiguador de fosfato, bajo condiciones comparables que varían de aproximadamente 4-40°C y un pH de aproximadamente 7.0-7.5.
52. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, caracterizada porque las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 5°C, opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7 días .
53. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, caracterizada porque las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 20-25°C (temperatura ambiente) , opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3 , 4, 5, 6 ó 7 días.
54. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, caracterizada porque las condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 37°C, opcionalmente durante un período de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días.
55. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 54, caracterizada porque la estabilidad aumentada comprende estabilidad térmica, en donde la temperatura de fusión (Tm.) del polipéptido de HRS es por lo menos aproximadamente 5°C mayor que la del polipéptido de HRS correspondiente en la composición sin el amortiguador y/o fuera del intervalo de pH.
56. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 54, caracterizada porque la estabilidad aumentada comprende estabilidad térmica, en donde la temperatura de fusión del polipéptido de HRS se desnaturaliza a una velocidad que es por lo menos 10% más lenta que la del polipéptido de HRS correspondiente en la composición sin el amortiguador y/o fuera del intervalo de pH.
57. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 56, caracterizada porque la composición tiene una agregación y/o precipitación reducidas en relación a una composición sin el amortiguador y/o fuera del intervalo de pH bajo condiciones de otra manera comparables.
58. La composición de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque la agregación se reduce en por lo menos aproximadamente 10% medida por adsorbancia a A340.
59. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 58, caracterizada porque la composición tiene agregados de peso molecular alto reducidos en relación a una composición sin el amortiguador y/o fuera del intervalo de pH, bajo condiciones que de otra manera son comparables .
60. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 59, caracterizada porque el amortiguador es un amortiguador de histidina y en donde el polipéptido de HRS es por lo menos 90% idéntico a los residuos 1-506 o 2-506 de la SEC ID NO : 1 y carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO : 1.
61. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 59, caracterizada porque el amortiguador es un amortiguador de citrato y en donde el polipéptido de HRS es por lo menos 90% idéntico a los residuos 1-506 o 2-506 de la SEC ID NO: 1 y carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO: 1.
62. La composición de conformidad con la reivindicación 60 ó 61, caracterizada porque el polipéptido de HRS es HRS (1-506) o HRS (2-506) .
63. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 62, caracterizada porque comprende cloruro de sodio (NaCl) en una concentración que varía de aproximadamente 100-300 m , opcionalmente en aproximadamente 140 mM.
64. La composición de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque el polipéptido de HRS es por lo menos 90%, idéntico a los residuos 1-506 o 2-506 de la SEC ID NO: 1 y carece de los residuos 507-509 de la SEC ID NO: 1, opcionalmente en donde el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) de por lo menos aproximadamente 60°C.
65. La composición de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque el polipéptido de HRS es HRS (1-506) o HRS (2-506) , opcionalmente en donde el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) de por lo menos aproximadamente 60 °C.
66. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 65, caracterizada porque comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
67. La composición de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables se seleccionan de sacarosa, manitol, trehalosa, sorbitol, arginina, glicina y glicerol.
68. La composición de conformidad con la reivindicación 66 o 67, caracterizada porque uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables están en una concentración que varía de aproximadamente 0.2-5.0%.
69. La composición de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque el excipiente farmacéuticamente aceptable es sacarosa de aproximadamente 1-3%, opcionalmente sacarosa de aproximadamente 2%.
70. La composición de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque el excipiente farmacéuticamente aceptable es trehalosa de aproximadamente 1-3%, opcionalmente trehalosa de aproximadamente 2%.
71. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 70, caracterizada porque comprende uno o más tensioactivos .
72. La composición de conformidad con la reivindicación 71, caracterizada porque el tensioactivo es un polisorbato o un poloxámero.
73. La composición de conformidad con la reivindicación 72, caracterizada porque el polisorbato es polisorbato 20 (PS20) , polisorbato 40 (PS40) , polisorbato 60 (PS60) o polisorbato 80 (PS80) .
74. La composición de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque el polisorbato es PS20.
75. La composición de conformidad con la reivindicación 72, caracterizada porque el poloxámero es Pluronic F68.
76. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71 a 74, caracterizada porque el tensioactivo está presente en un intervalo de aproximadamente 0.1-5.0% (p/v) .
77. La composición de conformidad con la reivindicación 76, caracterizada porque el tensioactivo es PS20 de aproximadamente 0.05% (p/v).
78. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 74, caracterizada porque comprende un compuesto antioxidante.
79. La composición de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque el compuesto antioxidante se selecciona de cisteína, metionina y N-acetilcisteína (NAC) .
80. La composición de conformidad con la reivindicación 78 ó 79, caracterizada porque el compuesto antioxidante está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1-5.0 mM.
81. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 80, caracterizada porque comprende un agente quelante.
82. La composición de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque el agente quelante es etilendiaminotetraacetato (EDTA) .
83. La composición de conformidad con la reivindicación 81 u 82, caracterizada porque el agente quelante está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1-2.0 mM . 0
84. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 83, caracterizada porque el polipéptido de HRS está presente en una concentración de por lo menos aproximadamente 10 mg/ml.
85. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 83, caracterizada porque el polipéptido de HRS está presente en una concentración de por lo menos aproximadamente 25 mg/ml.
86. La composición de conformidad con cualquiera Q de las reivindicaciones 1 a 83, caracterizada porque el polipéptido de HRS está presente en una concentración de por lo menos aproximadamente 50 mg/ml.
87. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 86, caracterizada porque la composición tiene una turbidez de menos de aproximadamente 0.5 medida por absorbancia a A340.
88. La composición de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque la absorbancia a A340 se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a 37 °C. 5
89. La composición de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque la absorbancia a A340 se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a temperatura ambiente.
90. La composición de conformidad con la 10 reivindicación 87, caracterizada porque la absorbancia a A340 se mide después de congelamiento-recalentamiento de la composición por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 veces.
91. La composición de conformidad con cualquoera de las reivindicaciones 1 a 86, caracterizada porque la composición tiene una opalescencia de menos de aproximadamente 0.6 medida por absorbancia a A580.
92. La composición de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la absorbancia a A580 2Q se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a 37°C.
93. La composición de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la absorbancia a A580 se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, ?t- 5, 6 ó 7 días de incubación a temperatura ambiente.
94. La composición de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la absorbancia a A580 se mide después de congelamiento-recalentamiento de la composición por lo menos 1, 2, 3, 4 ó 5 veces.
95. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 94, caracterizada porque la composición tiene menos de aproximadamente 3% de agregados de peso molecular alto.
96. La composición de conformidad con la reivindicación 95, caracterizada porque la agregación de peso molecular alto (HMW) se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a 37°C.
97. La composición de conformidad con la reivindicación 95, caracterizada porque la agregación de peso molecular alto (HMW) se mide después de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días de incubación a temperatura ambiente.
98. La composición de conformidad con la reivindicación 95, caracterizada porque la agregación de peso molecular alto se mide después de congelamiento-recalentamiento de la composición por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 veces.
99. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 98, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) en la composición de por lo menos aproximadamente 50°C.
100. La composición de conformidad con la reivindicación 99, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) en la composición de por lo menos aproximadamente 55 °C.
101. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque el polipéptido de HRS tiene una temperatura de fusión (Tm) en la composición de por lo menos aproximadamente 60 °C.
102. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 101, caracterizada porque el polipéptido de HRS está por lo menos aproximadamente 90% monodisperso.
103. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 a 102, caracterizada porque la composición comprende L-histidina aproximadamente 50 mM, NaCl aproximadamente 140 mM, trehalosa aproximadamente 2%, polisorbato 20 (PS20) , aproximadamente 0.05% y tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.4.
104. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 102, caracterizada porque la composición comprende L-histidina aproximadamente 50 mM, NaCl aproximadamente 140 mM, sacarosa aproximadamente 2%, polisorbato 20 (PS20) , aproximadamente 0.05% y tiene un pH de aproximadamente 7.0-7.4.
105. La composición de conformidad con la reivindicación 103 ó 104, caracterizada porque el polipéptido de HRS es HRS (1-506) o HRS (2-506) y tiene una temperatura de fusión (Tm) en la composición de por lo menos aproximadamente 60°C.
106. La composición de conformidad con la reivindicación 105, caracterizada porque la composición tiene una turbidez de menos de aproximadamente 0.1, o menos de aproximadamente 0.05, medida por absorbancia a A340.
107. La composición de conformidad con la reivindicación 105, caracterizada porque la composición tiene una opalescencia de menos de aproximadamente 0.1, o menos de aproximadamente 0.05, medida por absorbancia a A580.
108. La composición de conformidad con la reivindicación 105, caracterizada porque la composición tiene menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1% de agregados de peso molecular alto.
109. Una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa, la cual comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS es capaz de sustituir por lo menos una función canónica o no canónica de la histidil-ARNt sintetasa.
110. La composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 109, en donde el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por la unión de autoanticuerpo asociado a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 5 x 10"7M.
111. Una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con un anticuerpo específico para histidil-ARNt sintetasa, que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde el polipéptido de HRS es capaz de generar tolerizacion.
112. Una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil-ARNt sintetasa, que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS de mamífero, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo, y en donde el ácido nucleico está acoplado operativamente a secuencias de control de expresión y en donde la expresión del ácido nucleico genera tolerizacion.
113. Una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil-ARNt sintetasa, que comprende una célula hospedadora recombinante, en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo que comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo, y en donde el ácido nucleico está acoplado operativamente a las secuencias de control de expresión para habilitar la expresión de HRS en la célula hospedadora .
114. Una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil-ARNt sintetasa, que comprende un anticuerpo o proteína de unión específica para el autoanticuerpo en donde el anticuerpo o la proteína de unión bloquea la unión del autoanticuerpo a histidil-ARNt sintetasa nativa.
115. Una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS tiene por lo menos una actividad no canónica.
116. Una composición terapéutica para usarse en el tratamiento de distrofia muscular que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS tiene por lo menos una actividad no canónica.
117. La composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 116, caracterizada porque la distrofia muscular se selecciona de distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de anillo óseo, distrofia muscular facioescapulohumeral , distrofia miotónica, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular distal y distrofia muscular congénita.
118. Una composición terqapéutica para usarse en el tratamiento de rabdomiolisis , agotamiento muscular, caquexia, inflamación muscular o daño a músculo que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS tiene por lo menos una actividad no canónica.
119. El uso de un polipéptido de histidil-ARNt sintetasa (HRS) en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune o inflamatoria.
120. La composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 118, o el uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde la composición terapéutica o el polipéptido de HRS se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 108.
121. La composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 118, o el uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 aminoácidos.
122. La composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 118, o el uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 aminoácidos.
123. La composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 118, o el uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 80 a aproximadamente 200 aminoácidos.
124. La composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 118, o el uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el polipéptido de HRS es de longitud completa.
125. La composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 118, o el uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el polipéptido de HRS está truncado en el residuo 505 o 506 de la SEC ID NO: 1.
126. La composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 118, o el uso de conformidad con la reivindicación 119, en donde el polipéptido de HRS tiene por lo menos una mutación en un residuo cisteína.
127. La composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 126, en donde el residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 y Cys509.
128. La composición terapéutica o uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un D-aminoácido .
129. La composición terapéutica o el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido de HRS comprende o consiste esencialmente de un dominio WHEP.
130. La composición terapéutica o uso de 5 conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido de HRS comprende a) una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOS : 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74- 153, 160-172 o 176-182, o b) una secuencia de aminoácidos por LO lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las secuencias en las tablas DI, D3 a D6 o D8.
131. La composición terapéutica o el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones L5 precedentes, en donde el polipéptido de HRS se fusiona a una proteína heteróloga.
132. La composición terapéutica o el uso de conformidad con la reivindicación 131, en donde la proteína heteróloga comprende un ligando de linfocito T.
133. Un método para tratar una enfermedad asociada con un autoanticuerpo caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que ?t- codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo, o d) un anticuerpo o una proteína de unión específica para el autoanticuerpo.
13 . El método de conformidad con la reivindicación 133 , caracterizado porque la composición terapéutica se administra a un 5 sujeto antes de la aparición de los síntomas de enfermedad.
135 . El método de conformidad con la reivindicación 133 ó 134 , caracterizado porque el autoanticuerpo es específico para histidil ARNt sintetasa humana.
136. El método de conformidad con la reivindicación 135, 10 caracterizado porque el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo de la histidil ARNt sintetasa reconocido por el autoanticuerpo específico de la enfermedad.
137 . El método de conformidad con la reivindicación 136 , caracterizado porque el pol ipéptido de 15 HRS bloquea la unión del autoant icuerpo a histidil ARNt sintetasa humana nativa .
138 . El método de conformidad con la reivindicación 133 , caracterizado porque el pol ipéptido de 2 0 HRS provoca una supresión clonal de linfocitos T auto- reactivos .
139 . El método de conformidad con la reivindicación 133 , caracterizado porque el pol ipéptido de HRS provoca inactivación funcional de los l infocitos T j e involucrados en la respuesta aut o inmune .
140. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque el polipéptido de HRS resulta en inflamación reducida en músculo o pulmón.
141. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque el polipéptido de HRS induce tolerancia.
142. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 141, caracterizado porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 aminoácidos.
143. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 141, caracterizado porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 aminoácidos.
144. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 141, caracterizado porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 80 a aproximadamente 200 aminoácidos.
145. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 141, caracterizado porque el polipéptido de HRS es de longitud completa.
146. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 141, caracterizado porque el polipéptido de HRS está truncado en el residuo 505 ó 506.
147. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 141, caracterizado porque el polipéptido de HRS tiene por lo menos una mutación en un residuo cisteína.
148. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el residuo cisteína se selecciona de Cysl74, Cysl91, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 y Cys509.
149. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 148, caracterizado porque el polipéptido de HRS comprende por lo menos un D-aminoácido .
150. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 149, caracterizado porque el polipéptido de HRS comprende o consiste esencialmente de un dominio WHEP.
151. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 150, caracterizado porque el polipéptido de HRS comprende: a) una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 o 176-182 o b) una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las secuencias en las tablas DI, D3 a D6 o D8.
152. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 151, caracterizado porque el polipéptido de HRS se fusiona a una proteína heteróloga.
153. El método de conformidad con la reivindicación 152, caracterizado porque la proteína heteróloga comprende un ligando de linfocito T.
154. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 153, caracterizado porque la composición se formula para suministro por medio de administración oral, intranasal, pulmonar, intramuscular o parenteral.
155. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 154, caracterizado porque la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de miopatías inflamatorias que incluyen miopatías inflamatorias, polimiositis, dermatomiotisis y trastornos relacionados, superposición de polimiositis-escleroderma, miositis de cuerpos de inclusión (IBM), síndrome de anti-sintetasa, enfermedad de pulmón intersticial, artritis y fenómeno de eynaud.
156. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 155, caracterizado porque el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo inmunodependiente reconocido por anticuerpos en sueros de los sujetos.
157. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 133 a 156, caracterizado porque el polipéptido de HRS se une a una molécula clase II del complejo de histocompatibilidad humano (CPH) .
158. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque el ácido nucleico está acoplado operativamente a secuencias de control de expresión y en donde la expresión del ácido nucleico produce tolerización.
159. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque la composición terapéutica comprende un vehículo de suministro que se selecciona del grupo que consiste de liposomas, micelas, emulsiones y células.
160. Un método para reducir la inflamación de tejido caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora predominante; en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo.
161. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque el tejido se selecciona de músculo, pulmón y piel.
162. Un método para reducir inflamación muscular o de pulmón caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo; o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo .
163. Un método para tratar una distrofia muscular caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo.
164. El método de conformidad con la reivindicación 163. caracterizado porque la distrofia 0 muscular se selecciona de distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery- Dreifuss, distrofia muscular de anillo óseo, distrofia muscular facioescapulohumeral , distrofia miotónica, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular distal y distrofia muscular congénita.
165. Un método de tratamiento de rabdomiolisis , agotamiento muscular, caquexia, inflamación muscular o daño muscular caracterizado porque comprende administrar a un Q sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende uno o más de a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo, o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo.
166. Un método para inducir tolerancia a un autoantígeno de histidil-AR t sintetasa (HisRS) , caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS, b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo; o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde la administración de la composición produce tolerización al autoantígeno .
167. Un método para eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T involucrados en una respuesta autoinmune a un autoantígeno de histidil-ARNt sintetasa (HisRS) , caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS; b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo; o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo y en donde la administración de la composición provoca supresión clonal de linfocitos T auto-reactivos.
168. Un método para inducir anergia en linfocitos T involucrados en una respuesta autoinmune a un autoantígeno de histidil-AR t sintetasa (HisRS) , caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una composición que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS; b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo; o c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo, en donde el polipéptido de HRS comprende por lo menos un epítopo reconocido específicamente por el autoanticuerpo, y en donde la administración de la composición provoca inactivación funcional de los linfocitos T involucrados en la respuesta autoinmune.
169. Un tratamiento de sustitución para tratar una enfermedad asociada con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende uno o más de: a) un polipéptido de HRS; b) un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de HRS heterólogo; c) una célula hospedadora recombinante en donde la célula hospedadora expresa por lo menos un polipéptido de HRS heterólogo; o d) un anticuerpo o proteína de unión específica para el autoanticuerpo; en donde el polipéptido de HRS compensa funcionalmente la insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa .
170. Un método para tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende por lo menos un polipéptido de HRS. 5
171. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la proteína de HRS no compite de modo significativo por autoanticuerpo asociado con enfermedad unido a histidil -ARNt sintetasa en una prueba ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 5 x 10~7M.
172. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 aminoácidos.
173. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 aminoácidos. 20
174. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 80 a aproximadamente 200 aminoácidos.
175. El método de conformidad con cualquiera de las ?c reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido de HRS es de longitud completa.
176. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido de HRS comprende por lo menos un D-aminoácido .
177. El método de conformidad con cualquiera de las 5 reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido de HRS comprende o consiste esencialmente de un dominio WHEP.
178. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el 10 polipéptido de HRS comprende: a) una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOS: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 y 176-182 o b) una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las secuencias en las tablas DI, D3 15 a D6 o D8.
179. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porqüe el polipéptido de HRS está fusionado a una proteína heteróloga. 2Q
180. El método de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque la proteína heteróloga comprende un dominio de inmuno-reconocimiento o un dominio inmuno-co-estimulador .
181. El método de conformidad con cualquiera de las ~¡- reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la composición se formula para suministro por medio de administración oral, intranasal, pulmonar, intramuscular o parenteral .
182. Un método para determinar la presencia o niveles de un polipéptido de HRS, o fragmento del mismo en una muestra caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con uno o más agentes de unión que se unen específicamente al polipéptido de HRS y detectar la presencia o ausencia del agente de unión y de esta manera determinar la presencia o niveles del polipéptido de HRS.
183. Un método para determinar la especificidad de epítopo de un anticuerpo antipolipéptido de HRS a un polipéptido de HRS específico, caracterizado porque comprende poner en contacto el anticuerpo con uno o más polipéptidos de HRS y detectar la presencia o ausencia de unión a anticuerpo y de esta manera determinar la especificidad de epítopo del anticuerpo .
184. Un método para tratar enfermedades asociadas con un autoanticuerpo específico para histidil -ARNt sintetasa, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición terapéutica que comprende por lo menos un polipéptido de HRS, en donde el polipéptido de HRS no compite de modo significativo por la unión a auto-anticuerpo asociada a enfermedad a histidil-ARNt sintetasa en una prueba de ELISA competitiva hasta una concentración de aproximadamente 1 x 10~7M.
185. Un método para identificar un sujeto humano en riesgo de presentar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS, caracterizado porque comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopos del anticuerpo anti-histidil-ARNt sintetasa en el sujeto; y b) identificar al sujeto que se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene anticuerpos detectables para histidil-ARNt sintetasa, o el polipéptido de HRS.
186. El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque el sujeto se identifica que se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS cuando la concentración de los anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en el suero de los sujetos es mayor de aproximadamente 2 micromolar.
187. El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque al sujeto se le identifica que se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS cuando la concentración de los anticuerpos para histidil-ARNt sintetasa en el suero de los sujetos es mayor de aproximadamente 2 micromolar.
188. Un método para inmunoadsorción extracorporal de anticuerpos anti -histidil -ARNt sintetasa (HRS) a partir de un fluido corporal extracelular, caracterizado porque comprende: a) proporcionar el fluido del cuerpo extracelular el cual ha sido obtenido de un sujeto, poner en contacto el 5 fluido corporal extracelular con un soporte sólido biocompatible que tiene por lo menos un polipéptido de histidil-ARNt sintetasa unido al mismo, para de esta manera captar los anticuerpos anti-HRS sobre el soporte sólido, y c) volver a suministrar por infusión en fluido corporal 10 extracelular de la etapa b) en el sujeto.
189. El método de conformidad con la reivindicación 188, caracterizado porque los anticuerpos anti-HRS incluyen un anticuerpo Jo-1.
190. Un método para seleccionar un polipéptido de 15 HRS para tratar a un sujeto humano con una condición autoinmune o inflamatoria, caracterizado porque comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil ARNt sintetasa en el sujeto; y 20 b) seleccionar un polipéptido de HRS el cual tiene afinidad reducida por el anticuerpo anti-histidil-ARNt sintetasa en comparación con histidil-ARNt sintetasa natural.
191. Un método para pronosticar el progreso de una enfermedad en un sujeto humano, caracterizado porque -JE- comprende a) determinar el nivel de anticuerpo o especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil-AR t sintetasa en el sujeto; y b) identificar al sujeto considerando que se encuentre en riesgo de desarrollar enfermedad más grave si el sujeto tiene anticuerpos detectables a histidil-ARNt sintetasa o el polipéptido de HRS .
192. Un método para predecir respuestas en un sujeto a la administración del polipéptido de HRS, caracterizado porque comprende: a) determinar el nivel de anticuerpo, la especificidad de epítopo del anticuerpo anti-histidil-ARNt sintetasa en el sujeto; y b) identificar al sujeto que se encuentra en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria adversa a la administración del polipéptido de HRS si el sujeto tiene anticuerpos detectables para histidil-ARNt sintetasa o el polipéptido de HRS.
MX2014009706A 2012-02-16 2013-02-15 Histidil-arnt sintetasas para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias. MX356107B (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261599802P 2012-02-16 2012-02-16
US201261655358P 2012-06-04 2012-06-04
US201261725414P 2012-11-12 2012-11-12
PCT/US2013/026494 WO2013123432A2 (en) 2012-02-16 2013-02-15 Histidyl-trna synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014009706A true MX2014009706A (es) 2015-01-14
MX356107B MX356107B (es) 2018-05-15

Family

ID=48984896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014009706A MX356107B (es) 2012-02-16 2013-02-15 Histidil-arnt sintetasas para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

Country Status (14)

Country Link
US (3) US8835387B2 (es)
EP (2) EP2814514B1 (es)
JP (2) JP6170077B2 (es)
KR (1) KR20140123571A (es)
CN (1) CN104334196B (es)
AU (2) AU2013221317B2 (es)
CA (1) CA2864300A1 (es)
DK (1) DK2814514T3 (es)
ES (1) ES2652136T3 (es)
IN (1) IN2014MN01642A (es)
MX (1) MX356107B (es)
NZ (1) NZ628126A (es)
RU (1) RU2659423C2 (es)
WO (1) WO2013123432A2 (es)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8159825B1 (en) 2006-08-25 2012-04-17 Hypres Inc. Method for fabrication of electrical contacts to superconducting circuits
EP2403864B1 (en) 2009-02-27 2015-08-12 Atyr Pharma, Inc. Polypeptide structural motifs associated with cell signaling activity
AU2010226726B8 (en) 2009-03-16 2014-08-14 Pangu Biopharma Limited Compositions and methods comprising histidyl-tRNA synthetase splice variants having non-canonical biological activities
EP2425240A4 (en) 2009-04-30 2012-12-12 Good Start Genetics Inc METHOD AND COMPOSITION FOR EVALUATING GENETIC MARKERS
US12129514B2 (en) 2009-04-30 2024-10-29 Molecular Loop Biosolutions, Llc Methods and compositions for evaluating genetic markers
CA2797093C (en) 2010-04-26 2019-10-29 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-trna synthetase
AU2011248521B2 (en) 2010-04-27 2017-03-16 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of threonyl tRNA synthetases
EP2563381B1 (en) 2010-04-27 2017-08-09 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases
CN103097524B (zh) 2010-04-28 2016-08-03 Atyr医药公司 与丙氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
EP2563383B1 (en) 2010-04-29 2017-03-01 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of valyl trna synthetases
CA2797374C (en) 2010-04-29 2021-02-16 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of asparaginyl trna synthetases
AU2011248227B2 (en) 2010-05-03 2016-12-01 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-tRNA synthetases
ES2668207T3 (es) 2010-05-03 2018-05-17 Atyr Pharma, Inc. Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de metionil-ARNt sintetasas
EP2566516B1 (en) 2010-05-03 2019-07-03 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of seryl-trna synthetases
CN103096925A (zh) 2010-05-03 2013-05-08 Atyr医药公司 与精氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
CN103096909A (zh) 2010-05-04 2013-05-08 Atyr医药公司 与谷氨酰-脯氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
JP6008844B2 (ja) 2010-05-04 2016-10-19 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド ｐ３８ＭＵＬＴＩ−ｔＲＮＡ合成酵素複合体のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
EP2568996B1 (en) 2010-05-14 2017-10-04 aTyr Pharma, Inc. Therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-beta-trna synthetases
US9034598B2 (en) 2010-05-17 2015-05-19 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of leucyl-tRNA synthetases
CN103096913B (zh) 2010-05-27 2017-07-18 Atyr 医药公司 与谷氨酰胺酰‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
CA2800281C (en) 2010-06-01 2021-01-12 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases
KR20130102534A (ko) 2010-07-12 2013-09-17 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 히스티딜­trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견
KR20180059575A (ko) 2010-07-12 2018-06-04 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 아스파르틸­trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견
US8999321B2 (en) 2010-07-12 2015-04-07 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
AU2011289831C1 (en) 2010-07-12 2017-06-15 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
CN103108650A (zh) 2010-08-25 2013-05-15 Atyr医药公司 与酪氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
CN103118696B (zh) 2010-10-06 2020-02-14 Atyr 医药公司 与色氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
US9714419B2 (en) 2011-08-09 2017-07-25 Atyr Pharma, Inc. PEGylated tyrosyl-tRNA synthetase polypeptides
CA2852665A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Good Start Genetics, Inc. Analysis methods
WO2013086228A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 Atyr Pharma, Inc. Pegylated aspartyl-trna synthetase polypeptides
WO2013086216A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 Atyr Pharma, Inc. Improved aspartyl-trna synthetases
CA2858613A1 (en) 2011-12-29 2013-08-08 Atyr Pharma, Inc. Aspartyl-trna synthetase-fc conjugates
EP2814514B1 (en) 2012-02-16 2017-09-13 Atyr Pharma, Inc. Histidyl-trna synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
EP2917368A1 (en) * 2012-11-07 2015-09-16 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for identifying contamination in samples
EP2971159B1 (en) 2013-03-14 2019-05-08 Molecular Loop Biosolutions, LLC Methods for analyzing nucleic acids
ES2708565T3 (es) * 2013-03-15 2019-04-10 Atyr Pharma Inc Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa
WO2014197377A2 (en) 2013-06-03 2014-12-11 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for storing sequence read data
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
EP3058096A1 (en) 2013-10-18 2016-08-24 Good Start Genetics, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
US11053548B2 (en) 2014-05-12 2021-07-06 Good Start Genetics, Inc. Methods for detecting aneuploidy
WO2015187502A1 (en) 2014-06-02 2015-12-10 Cellics Therapeutics, Inc. Use of nanoparticles coated with red blood cell membranes to treat hemolytic diseases and disorders
WO2016025818A1 (en) 2014-08-15 2016-02-18 Good Start Genetics, Inc. Systems and methods for genetic analysis
WO2016028965A1 (en) * 2014-08-20 2016-02-25 The Regents Of The University Of California Self-antigen displaying nanoparticles targeting auto-reactive immune factors and uses thereof
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
JP2017536087A (ja) 2014-09-24 2017-12-07 グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド 遺伝子アッセイのロバストネスを増大させるためのプロセス制御
WO2016112073A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Good Start Genetics, Inc. Screening for structural variants
WO2016137280A1 (ko) * 2015-02-26 2016-09-01 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 유효성분으로 포함하는 감염성 염증 질환의 치료 또는 예방용 조성물 및 면역증강용 조성물
CN105001341A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 广州天宝颂原生物科技开发有限公司 一种重组人自身抗原JoSmD1
US10702606B2 (en) 2015-12-10 2020-07-07 Menicon Co., Ltd. Peptide composition
CA3045321A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Atyr Pharma, Inc. Anti-hrs antibodies and combination therapies for treating cancers
JP7233149B2 (ja) * 2016-12-14 2023-03-06 ベニテック アイピー ホールディングス インコーポレーテッド 眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｐｍｄ）を治療するための試薬及びその使用
CN108511044B (zh) * 2017-02-23 2021-12-17 珠海健康云科技有限公司 一种互联网咨询分诊方法及系统
CA3060514A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods for treating lung inflammation
CN108014333B (zh) * 2017-10-11 2020-10-20 江苏省农业科学院 动物用粘膜靶向免疫增强剂及其在兽用疫苗中的应用
JP7490925B2 (ja) * 2018-07-26 2024-05-28 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド Ｎｒｐ２関連疾患を治療するための組成物および方法
CN112755026A (zh) * 2021-03-01 2021-05-07 滨州医学院 雷帕霉素在制备治疗中耳炎药物中的应用
CN112986451B (zh) * 2021-05-06 2022-05-17 湖南师范大学 一种基于风味特征的杂交鱼类肉品质评价方法
IT202100014333A1 (it) * 2021-06-01 2022-12-01 Materias S R L Nuovo impiego terapeutico di inibitori della iodiotironina deiodinasi di tipo 2 (D2)
CA3252156A1 (en) * 2022-02-24 2023-08-31 Rion Llc COMPOSITIONS AND METHODS OF MODULATING THE IMMUNE SYSTEM
CN115960924A (zh) * 2022-11-04 2023-04-14 广州达安基因股份有限公司 重组jo-1抗原的制备方法和应用
CN116790609B (zh) * 2023-08-22 2023-10-27 中国海洋大学 对类胡萝卜素具有高亲和性的核酸适配体及其应用
CN120058951B (zh) * 2025-02-27 2025-11-04 郑州伊美诺生物技术有限公司 抗氨基酰基-tRNA合成酶的单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (309)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IL47062A (en) 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
US4327725A (en) 1980-11-25 1982-05-04 Alza Corporation Osmotic device with hydrogel driving member
JPS58126435U (ja) 1982-02-19 1983-08-27 オリンパス光学工業株式会社 Ｔｔｌオ−トストロボ用絞り制御回路
US4483105A (en) 1983-03-11 1984-11-20 Maschinenfabrik Gehring, Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung & Co. Kommanditgesellschaft Device to hold workpieces for the honing of their axial center bore
US5155214A (en) 1984-03-05 1992-10-13 The Salk Institute For Biological Studies Basic fibroblast growth factor
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5766960A (en) 1987-07-27 1998-06-16 Australian Membrane And Biotechnology Research Institute Receptor membranes
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
US4865841A (en) 1987-10-23 1989-09-12 Imre Corporation Methods and compositions for transient elimination of humoral immune antibodies
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
IL85746A (en) 1988-03-15 1994-05-30 Yeda Res & Dev Preparations comprising t-lymphocyte cells treated with 8-methoxypsoralen or cell membranes separated therefrom for preventing or treating autoimmune diseases
FI891226A7 (fi) 1988-04-28 1989-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Anti-T-solun reseptorideterminantit autoimmuunisairauden hoitoon
US5468481A (en) 1988-06-23 1995-11-21 Amergen, Inc. MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5130297A (en) 1988-06-23 1992-07-14 Anergen, Inc. Conjugates useful in ameliorating autoimmunity MHC-II-peptide
US6106840A (en) 1988-06-23 2000-08-22 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
US5856092A (en) 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
ES2062519T5 (es) 1989-03-21 2003-07-16 Immune Response Corp Inc Vacunacion y metodos contra enfermedades originadas a partir de respuestas patogenicas mediante poblaciones especificas de linfocitos t.
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5925525A (en) 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5871928A (en) 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
WO1991001384A1 (en) 1989-07-11 1991-02-07 Gen-Probe, Incorporated Nucleic acid sequence amplification methods utilizing a transcription complex
IL95125A (en) 1989-07-19 1995-07-31 Vandenbark Arthur Allen T cell peptides receive a method for their selection and preparation, and pharmaceutical preparations containing them
US5725871A (en) 1989-08-18 1998-03-10 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions comprising lysophosphoglycerolipid
US5707644A (en) 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
EP0502036B1 (en) 1989-11-22 1995-12-20 Genentech, Inc. Latency associated peptide and uses therefor
US5556645A (en) 1990-01-12 1996-09-17 Bockman; Richard Methods of enhancing wound healing and tissue repair
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
US5965695A (en) 1990-05-15 1999-10-12 Chiron Corporation Modified peptide and peptide libraries with protease resistance, derivatives thereof and methods of producing and screening such
AU8544591A (en) 1990-09-07 1992-03-30 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The Antigens associated with polymyositis and with dermatomyositis
SE9100142L (sv) 1991-01-17 1992-07-18 Bengt Sandberg En metod och ett system foer foerbaettrad in vivo reducering av diagnostiska och/eller terapeutiska substanser medelst extrakorporeal borttagning, och anvaendandet av naemnda substanser foer detta aendamaal
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5936731A (en) 1991-02-22 1999-08-10 Applied Spectral Imaging Ltd. Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and chromosome painting
US5981606A (en) 1991-03-01 1999-11-09 Warner-Lambert Company Therapeutic TGF-beta-wound healing compositions and methods for preparing and using same
US5149691A (en) 1991-03-12 1992-09-22 Creative Biomolecules, Inc. Issue repair and regeneration through the use of platelet derived growth factor (pdgf) in combination with dexamethasone
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5270184A (en) 1991-11-19 1993-12-14 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid target generation
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US5756353A (en) 1991-12-17 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery
US5541061A (en) 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
ES2105262T3 (es) 1992-05-18 1997-10-16 Minnesota Mining & Mfg Dispositivo de suministro de farmaco a traves de las mucosas.
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
ATE366744T1 (de) 1992-06-05 2007-08-15 Scripps Research Inst Verknüpftes d-protein und verfahren zur identifizierung von rezeptor aktivität modulierenden verbindungen
US5977079A (en) 1992-08-21 1999-11-02 Alberta Research Council Edmonton Compositions for attenuating antibody- mediated xenograft rejection in human recipients
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5484703A (en) 1993-04-22 1996-01-16 United States Of America Assay using recombinant histidyl-tRNA synthetase
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5464758A (en) 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
DE69431719T2 (de) 1993-06-25 2003-09-18 Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) Hybridisierung und sequenzierung von nukleinsäuren
US5858659A (en) 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5641867A (en) 1993-09-29 1997-06-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibody which specifically binds to endothelial-monocyte activating polypeptide II
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US5420109A (en) 1993-11-12 1995-05-30 Houghten Pharmaceuticals, Inc. Cytokine restraining agents
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US6090555A (en) 1997-12-11 2000-07-18 Affymetrix, Inc. Scanned image alignment systems and methods
WO1995025180A1 (en) 1994-03-16 1995-09-21 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
AU691297B2 (en) 1994-05-13 1998-05-14 Miltenyi Biotec Gmbh Sterile and pyrogen-free columns coupled to protein for binding and removal of substances from blood
US5571639A (en) 1994-05-24 1996-11-05 Affymax Technologies N.V. Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
US6287850B1 (en) 1995-06-07 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture
US6379897B1 (en) 2000-11-09 2002-04-30 Nanogen, Inc. Methods for gene expression monitoring on electronic microarrays
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5795716A (en) 1994-10-21 1998-08-18 Chee; Mark S. Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6169073B1 (en) 1995-02-16 2001-01-02 Bayer Corporation Peptides and peptidomimetics with structural similarity to human p53 that activate p53 function
US5635363A (en) 1995-02-28 1997-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells
AU702131B2 (en) 1995-06-05 1999-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast growth factor-14
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US6013483A (en) 1995-06-07 2000-01-11 Human Genome Sciences, Inc. DNA encoding endothelial monocyte activating polypeptide III
US5733729A (en) 1995-09-14 1998-03-31 Affymetrix, Inc. Computer-aided probability base calling for arrays of nucleic acid probes on chips
US5843655A (en) 1995-09-18 1998-12-01 Affymetrix, Inc. Methods for testing oligonucleotide arrays
US6300063B1 (en) 1995-11-29 2001-10-09 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
EP1275720A3 (en) 1996-01-19 2003-04-16 Smithkline Beecham Plc Histidyl-trna synthetase of staphylococcus aureus
GB9601067D0 (en) 1996-01-19 1996-03-20 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
WO1997026344A1 (en) * 1996-01-19 1997-07-24 Smithkline Beecham Plc ASPARTYL-tRNA SYNTHETASE OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US5837196A (en) 1996-01-26 1998-11-17 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
AU2189397A (en) 1996-02-08 1997-08-28 Affymetrix, Inc. Chip-based speciation and phenotypic characterization of microorganisms
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
US6114122A (en) 1996-03-26 2000-09-05 Affymetrix, Inc. Fluidics station with a mounting system and method of using
US6238866B1 (en) 1996-04-16 2001-05-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Detector for nucleic acid typing and methods of using the same
US5795758A (en) 1997-04-18 1998-08-18 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding histidyl tRNA synthetase variant from Streptococcus pneumoniae
GB9607993D0 (en) 1996-04-18 1996-06-19 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
GB9609262D0 (en) 1996-05-02 1996-07-03 Isis Innovation Peptide library and method
US5958342A (en) 1996-05-17 1999-09-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Jet droplet device
US5853993A (en) 1996-10-21 1998-12-29 Hewlett-Packard Company Signal enhancement method and kit
DE69735112T2 (de) 1996-11-06 2006-09-07 Sequenom, Inc., San Diego Verfahren zur Analyse und Vorrichtung
JP3402972B2 (ja) 1996-11-14 2003-05-06 東京エレクトロン株式会社 半導体装置の製造方法
US5804386A (en) 1997-01-15 1998-09-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Sets of labeled energy transfer fluorescent primers and their use in multi component analysis
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
EP1958962A3 (en) 1997-06-12 2013-05-01 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
DE69833758T2 (de) 1997-06-13 2006-08-31 Affymetrix, Inc. (n.d.Ges.d.Staates Delaware), Santa Clara Verfahren zur erkennung von genpolymorphismen und allelexpression unter verwendung von sondenchips
US6333179B1 (en) 1997-06-20 2001-12-25 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for multiplex amplification of nucleic acids
US5858720A (en) 1997-07-23 1999-01-12 Smithkline Beecham Corporation Hiss
US5882892A (en) 1997-07-23 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Asps
US6188783B1 (en) 1997-07-25 2001-02-13 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
US6420108B2 (en) 1998-02-09 2002-07-16 Affymetrix, Inc. Computer-aided display for comparative gene expression
US6223127B1 (en) 1997-08-15 2001-04-24 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection utilizing clustering analysis
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6391311B1 (en) 1998-03-17 2002-05-21 Genentech, Inc. Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1
US6399383B1 (en) 1997-10-28 2002-06-04 Maxygen, Inc. Human papilloma virus vectors
DE69829402T2 (de) 1997-10-31 2006-04-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corp.), Santa Clara Expressionsprofile in adulten und fötalen organen
US6054274A (en) 1997-11-12 2000-04-25 Hewlett-Packard Company Method of amplifying the signal of target nucleic acid sequence analyte
US6013449A (en) 1997-11-26 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Probe-based analysis of heterozygous mutations using two-color labelling
CA2319828A1 (en) 1998-01-29 1999-08-05 Miller, Samuel High density arrays for proteome analysis and methods and compositions therefor
AU3027699A (en) 1998-02-02 1999-08-16 Amersham Pharmacia Biotech Ab Nucleic acid analysis method
US6083726A (en) 1998-02-03 2000-07-04 Lucent Technologies, Inc. Methods for polynucleotide synthesis and articles for polynucleotide hybridization
US7794946B1 (en) 1998-02-04 2010-09-14 Life Technologies Corporation Microarray and uses therefor
CN1292033A (zh) 1998-03-04 2001-04-18 昂尼克斯药物公司 用于遗传物质高通量表达的杆状病毒表达系统和方法
US6428960B1 (en) 1998-03-04 2002-08-06 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Selection method for producing recombinant baculovirus
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US6020135A (en) 1998-03-27 2000-02-01 Affymetrix, Inc. P53-regulated genes
US6004755A (en) 1998-04-07 1999-12-21 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Quantitative microarray hybridizaton assays
US6284497B1 (en) 1998-04-09 2001-09-04 Trustees Of Boston University Nucleic acid arrays and methods of synthesis
US6525185B1 (en) 1998-05-07 2003-02-25 Affymetrix, Inc. Polymorphisms associated with hypertension
US6268210B1 (en) 1998-05-27 2001-07-31 Hyseq, Inc. Sandwich arrays of biological compounds
US6800286B1 (en) 1998-08-19 2004-10-05 The Regents Of The University Of Colorado Chimeric fibroblast growth factor proteins, nucleic acid molecules, and uses thereof
US6306643B1 (en) 1998-08-24 2001-10-23 Affymetrix, Inc. Methods of using an array of pooled probes in genetic analysis
US6185561B1 (en) 1998-09-17 2001-02-06 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for providing and expression data mining database
US6203989B1 (en) 1998-09-30 2001-03-20 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays
US6316193B1 (en) 1998-10-06 2001-11-13 Origene Technologies, Inc. Rapid-screen cDNA library panels
US6262216B1 (en) 1998-10-13 2001-07-17 Affymetrix, Inc. Functionalized silicon compounds and methods for their synthesis and use
CA2345441A1 (en) 1998-10-27 2000-05-04 Affymetrix, Inc. Complexity management and analysis of genomic dna
US6263287B1 (en) 1998-11-12 2001-07-17 Scios Inc. Systems for the analysis of gene expression data
MXPA01002875A (es) 1998-11-13 2002-04-08 Los Angeles Childrens Hospital Metodos para facilitar el crecimiento vascular.
US6309828B1 (en) 1998-11-18 2001-10-30 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for fabricating replicate arrays of nucleic acid molecules
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6245518B1 (en) 1998-12-11 2001-06-12 Hyseq, Inc. Polynucleotide arrays and methods of making and using the same
US6351712B1 (en) 1998-12-28 2002-02-26 Rosetta Inpharmatics, Inc. Statistical combining of cell expression profiles
US6586802B2 (en) 1999-01-14 2003-07-01 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Semiconductor device
US6312906B1 (en) 1999-01-15 2001-11-06 Imperial College Innovations, Ltd. Immobilized nucleic acid hybridization reagent and method
US6251601B1 (en) 1999-02-02 2001-06-26 Vysis, Inc. Simultaneous measurement of gene expression and genomic abnormalities using nucleic acid microarrays
US6329145B1 (en) 1999-02-09 2001-12-11 Gilead Science, Inc. Determining non-nucleic acid molecule binding to target by competition with nucleic acid ligand
US6177248B1 (en) 1999-02-24 2001-01-23 Affymetrix, Inc. Downstream genes of tumor suppressor WT1
CA2365431A1 (en) 1999-03-10 2000-09-14 Hui Ge Universal protein array system
EP1183387A2 (en) 1999-04-09 2002-03-06 Arcturus Engineering, Inc. GENERIC cDNA OR PROTEIN ARRAY FOR CUSTOMIZED ASSAYS
US6284465B1 (en) 1999-04-15 2001-09-04 Agilent Technologies, Inc. Apparatus, systems and method for locating nucleic acids bound to surfaces
US6268141B1 (en) 1999-05-12 2001-07-31 Beckman Coulter, Inc. Immobilization of unmodified biopolymers to acyl fluoride activated substrates
WO2000073801A2 (en) 1999-05-28 2000-12-07 Ludwig Institute For Cancer Research Breast, gastric and prostate cancer associated antigens and uses therefor
US6387620B1 (en) 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex
WO2001012855A2 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Yale University Binary encoded sequence tags
US6171797B1 (en) 1999-10-20 2001-01-09 Agilent Technologies Inc. Methods of making polymeric arrays
WO2001036448A2 (en) 1999-10-27 2001-05-25 Cel-Sci Corporation Preparation and composition of peptides useful for treatment of autoimmune and transplant related graft versus host conditions
US6548060B1 (en) 1999-11-18 2003-04-15 Sunghoon Kim Anti-apoptotic use of human glutaminyl-tRNA synthetase with two consecutive pro-apoptotic mediators
US6372431B1 (en) 1999-11-19 2002-04-16 Incyte Genomics, Inc. Mammalian toxicological response markers
DE19957827C2 (de) 1999-11-25 2003-06-12 Epigenomics Ag Verwendung eines Oligomer-Arrays mit PNA- und/oder DNA-Oligomeren auf einer Oberfläche
US6383749B2 (en) 1999-12-02 2002-05-07 Clontech Laboratories, Inc. Methods of labeling nucleic acids for use in array based hybridization assays
US20030158400A1 (en) 2000-02-03 2003-08-21 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
US20030165921A1 (en) 2000-02-03 2003-09-04 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
US20020128187A1 (en) 2000-02-03 2002-09-12 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
US20070042392A1 (en) 2000-02-03 2007-02-22 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20010046674A1 (en) 2000-02-03 2001-11-29 Andrew Ellington Signaling aptamers that transduce molecular recognition to a differential signal
CA2399776A1 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US6267152B1 (en) 2000-02-18 2001-07-31 Wisconsin Label Corporation Hang tag and method of applying hang tag to an elongated object
JP3464460B2 (ja) 2000-02-24 2003-11-10 ジー・ケー・エヌ・レブロ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ドライブシャフト
DE10011482B4 (de) 2000-03-09 2004-06-09 Fresenius Hemocare Gmbh Verfahren zum Herstellen eines Adsorbens zum Absenken der Konzentration von Fibrinogen und/oder Fibrin, Adsorbens und Verwendung des Adsorbens zur Herstellung eines Adsorbers
US6376191B1 (en) 2000-03-22 2002-04-23 Mergen, Ltd. Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
US7144984B2 (en) 2000-03-31 2006-12-05 The Scripps Research Institute Human aminoacyl-tRNA synthetase polypeptides useful for the regulation of angiogenesis
WO2001075078A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 The Scripps Research Institute HUMAN AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE POLYPEPTIDES USEFUL FOR THE REGULATION OF ANGIOGENESIS
US7273844B2 (en) 2000-03-31 2007-09-25 The Scripps Research Institute Tryptophanyl-tRNA synthetase-derived polypeptides useful for the regulation of angiogenesis
AU2001289284A1 (en) 2000-04-04 2001-10-15 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying peptide aptamers capable of altering a cell phenotype
US20040181830A1 (en) 2001-05-07 2004-09-16 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
CN1322818A (zh) 2000-05-09 2001-11-21 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人II类氨酰基－tRNA合成酶10和编码这种多肽的多核苷酸
WO2001088162A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Genway Biotech, Inc. Methods and vectors for generating antibodies in avian species and uses therefor
JP2004512014A (ja) 2000-05-18 2004-04-22 学校法人日本大学 虚血状態の検査方法
WO2001090330A2 (en) 2000-05-25 2001-11-29 Incyte Genomics, Inc. AMINOACYL tRNA SYNTHETASES
EP1297338B1 (en) 2000-06-05 2007-04-18 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Microarrays for performing proteomic analyses
AU5114000A (en) 2000-06-14 2001-12-24 Imagene Co., Ltd. P43 anti-tumor therapeutic agent and three dimensional structure of its cytokinedomain
US6531283B1 (en) 2000-06-20 2003-03-11 Molecular Staging, Inc. Protein expression profiling
US6386749B1 (en) 2000-06-26 2002-05-14 Affymetrix, Inc. Systems and methods for heating and mixing fluids
ES2252261T3 (es) 2000-06-28 2006-05-16 Glycofi, Inc. Metodos para producir glicoproteinas modificadas.
CN1331293A (zh) * 2000-06-28 2002-01-16 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——组氨酸tRNA合成酶11.99和编码这种多肽的多核苷酸
US6380377B1 (en) 2000-07-14 2002-04-30 Applied Gene Technologies, Inc. Nucleic acid hairpin probes and uses thereof
WO2002031463A2 (en) 2000-08-31 2002-04-18 Motorola, Inc. High density column and row addressable electrode arrays
JP2002071687A (ja) 2000-08-31 2002-03-12 Canon Inc 変異遺伝子のスクリーニング方法
CN1341725A (zh) 2000-09-07 2002-03-27 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人苏氨酰－tRNA合成酶48.73和编码这种多肽的多核苷酸
CN1341727A (zh) 2000-09-07 2002-03-27 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——甲硫氨酰tRNA合成酶35.09和编码这种多肽的多核苷酸
US6812339B1 (en) 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
US20070037165A1 (en) 2000-09-08 2007-02-15 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
EP1332209B1 (en) 2000-09-08 2009-11-11 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
AU2001292959A1 (en) 2000-09-22 2002-04-02 Clontech Laboratories, Inc. Highly sensitive proteomic analysis methods and kits and systems for practicing the same
US6376190B1 (en) 2000-09-22 2002-04-23 Somalogic, Inc. Modified SELEX processes without purified protein
FR2814642B1 (fr) 2000-10-03 2005-07-01 Ass Pour Le Dev De La Rech En Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN1352242A (zh) 2000-11-02 2002-06-05 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人谷氨酰tRNA合成酶12.65和编码这种多肽的多核苷酸
CN1352252A (zh) 2000-11-06 2002-06-05 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人II类氨酰基－tRNA合成酶11.77和编码这种多肽的多核苷酸
US6436386B1 (en) 2000-11-14 2002-08-20 Shearwater Corporation Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
JP2004537270A (ja) 2000-12-15 2004-12-16 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
AU2002255478A1 (en) 2001-01-10 2002-09-12 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
WO2002055663A2 (en) 2001-01-12 2002-07-18 Exelixis, Inc. Srebp pathway modulation through targeting hisrs
US20020183936A1 (en) 2001-01-24 2002-12-05 Affymetrix, Inc. Method, system, and computer software for providing a genomic web portal
US6743619B1 (en) 2001-01-30 2004-06-01 Nuvelo Nucleic acids and polypeptides
ATE420653T1 (de) 2001-02-23 2009-01-15 Scripps Research Inst Von tryptophanyl-trna-synthetase stammende polypeptide zur regulierung der angiogenese
US6903189B2 (en) 2001-03-21 2005-06-07 The Scripps Research Institute Human aminoacyl-tRNA synthetase polypeptides useful for the regulation of angiogenesis
WO2002085923A2 (en) 2001-04-19 2002-10-31 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of unnatural amino acids
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20030082630A1 (en) 2001-04-26 2003-05-01 Maxygen, Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
CN1114690C (zh) 2001-05-15 2003-07-16 乔良 乳头瘤假病毒及其制备方法
US20030215827A1 (en) 2001-05-22 2003-11-20 Henry Yue Aminoacyl trna synthetases
KR100405919B1 (ko) 2001-06-05 2003-11-14 주식회사 이매진 ｐ43의 Ｎ-말단 펩타이드를 유효성분으로 하는 면역증강용 약학조성물
US20040018505A1 (en) 2001-06-29 2004-01-29 Lee Ernestine A. Aminoacyl trna synthetases
US6632611B2 (en) 2001-07-20 2003-10-14 Affymetrix, Inc. Method of target enrichment and amplification
US6872529B2 (en) 2001-07-25 2005-03-29 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
AU2002332430A1 (en) 2001-07-26 2003-02-17 Novartis Ag Methods of treating neuropilin-mediated diseases
IL160131A0 (en) 2001-08-15 2004-06-20 Women First Healthcare Inc Topical composition for follicular delivery of an ornithine decarboxylase inhibitor
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20040048290A1 (en) 2001-12-13 2004-03-11 Lee Ernestine A Aminoacyl trna synthetases
US7011945B2 (en) 2001-12-21 2006-03-14 Eastman Kodak Company Random array of micro-spheres for the analysis of nucleic acids
US20040101879A1 (en) 2002-01-11 2004-05-27 Cynthia Seidel-Dugan Srebp pathway modulation through targeting hisrs
US7244592B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Dyax Corp. Ligand screening and discovery
WO2003080648A2 (en) 2002-03-20 2003-10-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Raav vector compositions and methods for the treatment of choroidal neovascularization
WO2003094848A2 (en) 2002-05-10 2003-11-20 Incyte Corporation Nucleic acid-associated proteins
AU2003234600A1 (en) 2002-05-13 2003-11-11 Rigel Pharmaceuticals, Inc. tRNA SYNTHASE: MODULATORS OF ANGIOGENESIS
KR100515016B1 (ko) 2002-07-22 2005-09-15 재단법인서울대학교산학협력재단 ｐ43을 유효성분으로 하는 창상 치료용 약학적 조성물
WO2004023973A2 (en) 2002-09-12 2004-03-25 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
US7011949B2 (en) 2002-09-30 2006-03-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for producing labeled probe nucleic acids for use in array based comparative genomic hybridization applications
AU2003295328A1 (en) 2002-10-02 2004-04-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2004060262A2 (en) 2003-01-07 2004-07-22 Lorantis Limited Modulators of notch signalling for use in immunotherpapy
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
JP2006517533A (ja) 2003-01-23 2006-07-27 ロランティス リミテッド Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路のアクチベーターを用いる自己免疫疾患の治療
US7028629B2 (en) 2003-02-03 2006-04-18 Richard Walcome Self-sealing port light assembly
KR100575251B1 (ko) 2003-03-03 2006-05-02 재단법인서울대학교산학협력재단 ｐ38／ＪＴＶ－1을 유효성분으로 하는 암 치료용 약학적조성물 및 암 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2005035727A2 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Ambrx, Inc. Polymer derivatives
US20070054278A1 (en) 2003-11-18 2007-03-08 Applera Corporation Polymorphisms in nucleic acid molecules encoding human enzyme proteins, methods of detection and uses thereof
US20080220049A1 (en) 2003-12-05 2008-09-11 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins
EP1713914A2 (en) 2004-01-28 2006-10-25 Celldex Therapeutics Limited MEDICAL TREATMENT USING AN RNAi AGENT TARGETING A HUMAN NOTCH SIGNALLING PATHWAY MEMBER
EP1745147A2 (en) 2004-03-05 2007-01-24 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with coronary heart disease, methods of detection and uses thereof
WO2005113812A2 (en) 2004-04-23 2005-12-01 Invitrogen Corporation Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents
KR100599454B1 (ko) 2004-04-27 2006-07-12 재단법인서울대학교산학협력재단 종양 억제자로 작용하는 ａｉｍ3의 신규 용도
PT2484365E (pt) 2004-06-04 2013-12-12 Scripps Research Inst Composições e métodos para o tratamento de doenças neovasculares
US7632924B2 (en) 2004-06-18 2009-12-15 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
WO2006091231A2 (en) 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US8282921B2 (en) 2004-08-02 2012-10-09 Paul Glidden tRNA synthetase fragments
US20060078553A1 (en) 2004-10-07 2006-04-13 Paul Glidden Diverse multi-unit complexes including a tRNA synthetase fragment
US20060079673A1 (en) 2004-08-02 2006-04-13 Paul Glidden Polynucleotides encoding tRNA synthetase fragments and uses thereof
US20060024288A1 (en) 2004-08-02 2006-02-02 Pfizer Inc. tRNA synthetase fragments
EP1815021A2 (en) 2004-11-03 2007-08-08 Almac Diagnostics Limited Transcriptome microarray technology and methods of using the same
EP1657232A1 (en) 2004-11-05 2006-05-17 Cellzome Ag Use of S-enantiomers of alpha-sustituted aryl acetic acids for the prevention of Alzheimer's disease
US8003780B2 (en) 2004-11-24 2011-08-23 Neomics Co., Ltd. AIMP2-DX2 gene and SiRNA targeting AIMP2-DX2
US7459529B2 (en) 2004-11-24 2008-12-02 Seoul National University Industry Foundation AIMP2-DX2 and its uses
EP1836298B1 (en) 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
CN103520735B (zh) 2004-12-22 2015-11-25 Ambrx公司 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
JP2008528577A (ja) 2005-02-01 2008-07-31 イマジェネ カンパニー リミテッド コラーゲン合成及び／又はｋｇｆ発現の促進方法
US20060275794A1 (en) 2005-03-07 2006-12-07 Invitrogen Corporation Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents
CA2638892A1 (en) 2005-03-18 2006-09-28 Oregon Health & Science University Recombinant mhc molecules useful for manipulation of antigen-specific t cells
KR100689274B1 (ko) 2005-03-30 2007-03-08 김현기 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질
US7842467B1 (en) 2005-05-12 2010-11-30 Celera Corporation Breast disease targets and uses thereof
US20070072175A1 (en) 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
US7375188B2 (en) 2005-07-29 2008-05-20 Mallinckrodt Baker, Inc. Vegetarian protein a preparation and methods thereof
DE102005043321A1 (de) 2005-09-12 2007-03-22 Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh Hohlfasermembrantrennvorrichtung
US7514229B2 (en) 2005-09-29 2009-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for diagnosing and evaluating treatment of blood disorders
US8026088B2 (en) 2005-12-02 2011-09-27 The Scripps Research Institute Angiogenic tyrosyl tRNA synthetase compositions and methods
US8014957B2 (en) 2005-12-15 2011-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Genes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof
US20090305973A1 (en) 2006-01-23 2009-12-10 Sung-Hoon Kim Novel peptide and use thereof
CA2641880C (en) * 2006-02-10 2014-09-09 Summit Corporation Plc Treatment of duchenne muscular dystrophy
CA2653752A1 (en) 2006-05-26 2007-12-06 Vickery Laurence Arcus Ob fold domains
WO2008007818A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Seoul National University Industry Foundation Novel use of aimp1 for controlling glucose level
EP2052088A2 (en) 2006-08-02 2009-04-29 Genizon Biosciences Genemap of the human genes associated with psoriasis
AU2007284651B2 (en) 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
TWI415629B (zh) * 2006-10-26 2013-11-21 Otsuka Pharma Co Ltd 含有瑞巴匹特之水性醫藥懸浮物及其製造方法
EP2121739A4 (en) 2007-02-01 2010-03-10 Imagene Co Ltd NOVEL POLYPEPTIDE HAVING ANTITUMOR ACTIVITY
JP2010525362A (ja) 2007-04-27 2010-07-22 アイマジーン カンパニー リミテッド 免疫調節剤のスクリーニング方法
EP2559698B1 (en) 2007-08-24 2014-11-12 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Mutant double cyclized receptor peptides inhibiting beta 1-adrenoceptor antibodies
KR101067816B1 (ko) 2007-11-09 2011-09-27 (주)네오믹스 Ａｉｍｐ2-ｄｘ2의 억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성질환 예방 및 치료용 조성물
EP2274006A2 (en) 2008-03-11 2011-01-19 University Of North Carolina At Chapel Hill Angiostatic compositions comprising truncated tyrosyl-trna synthetase polypeptides and methods of using same
WO2009152247A2 (en) 2008-06-11 2009-12-17 Atyr Pharma, Inc Thrombopoietic activity of tyrosyl-trna synthetase polypeptides
CN102159708B (zh) 2008-06-26 2016-08-31 Atyr医药公司 包含具有非常规生物活性的甘氨酰-tRNA合成酶的组合物和方法
AU2008360729A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 Seoul National University Industry Foundation Method for controlling cancer metastasis or cancer cell migration by modulating the cellular level of lysyl tRNA synthetase
EP2351575B1 (en) 2008-10-10 2016-12-14 SNU R & DB Foundation Grs for use in treating a cancer
KR101067817B1 (ko) 2008-10-10 2011-09-27 서울대학교산학협력단 Ａｉｍｐ1 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 관절염 진단용 조성물
KR101067815B1 (ko) 2009-02-05 2011-09-27 서울대학교산학협력단 제1형 당뇨병의 신규한 진단 마커
US20120058133A1 (en) 2009-02-19 2012-03-08 President And Fellows Of Harvard College Inhibition of trna synthetases and therapeutic applications thereof
EP2403864B1 (en) 2009-02-27 2015-08-12 Atyr Pharma, Inc. Polypeptide structural motifs associated with cell signaling activity
AU2010226726B8 (en) 2009-03-16 2014-08-14 Pangu Biopharma Limited Compositions and methods comprising histidyl-tRNA synthetase splice variants having non-canonical biological activities
US20100310576A1 (en) 2009-03-31 2010-12-09 Adams Ryan A COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING ASPARTYL-tRNA SYNTHETASES HAVING NON-CANONICAL BIOLOGICAL ACTIVITIES
PL4218797T3 (pl) * 2009-09-21 2025-02-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Stabilizowane płynne i liofilizowane preparaty adamts13
US8828395B2 (en) 2009-12-11 2014-09-09 Atyr Pharma, Inc. Antibodies that bind tyrosyl-tRNA synthetases
WO2011072266A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Atyr Pharma, Inc. Aminoacyl trna synthetases for modulating hematopoiesis
US9127268B2 (en) * 2009-12-11 2015-09-08 Atyr Pharma, Inc. Aminoacyl tRNA synthetases for modulating inflammation
US8828685B2 (en) 2010-02-04 2014-09-09 The Scripps Research Institute Monomeric forms of human aminoacyl-t-RNA synthetases having non-canonical biological activities
KR20130102534A (ko) * 2010-07-12 2013-09-17 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 히스티딜­trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
MX374963B (es) 2011-04-29 2025-03-06 Selecta Biosciences Inc Nanoportadores sintéticos tolerogénicos para reducir las respuestas de anticuerpos.
WO2013036301A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Selecta Biosciences, Inc. Induced tolerogenic dendritic cells for inducing regulatory b cells
EP2814514B1 (en) 2012-02-16 2017-09-13 Atyr Pharma, Inc. Histidyl-trna synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015513534A (ja) 2015-05-14
AU2013221317A1 (en) 2014-09-18
DK2814514T3 (en) 2017-12-18
NZ628126A (en) 2016-10-28
AU2017232051A1 (en) 2017-10-12
JP6170077B2 (ja) 2017-07-26
AU2013221317B2 (en) 2017-07-06
US9273302B2 (en) 2016-03-01
IN2014MN01642A (es) 2015-07-03
US20160369259A1 (en) 2016-12-22
RU2659423C2 (ru) 2018-07-02
ES2652136T3 (es) 2018-01-31
HK1204268A1 (en) 2015-11-13
EP2814514A2 (en) 2014-12-24
EP3311847A1 (en) 2018-04-25
KR20140123571A (ko) 2014-10-22
JP6330088B2 (ja) 2018-05-23
CN104334196A (zh) 2015-02-04
CN104334196B (zh) 2018-04-10
WO2013123432A3 (en) 2013-10-17
US20130344096A1 (en) 2013-12-26
MX356107B (es) 2018-05-15
EP2814514A4 (en) 2015-10-07
US8835387B2 (en) 2014-09-16
RU2014137321A (ru) 2016-04-10
JP2017222665A (ja) 2017-12-21
WO2013123432A2 (en) 2013-08-22
EP2814514B1 (en) 2017-09-13
US20150093799A1 (en) 2015-04-02
CA2864300A1 (en) 2013-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6330088B2 (ja) 自己免疫および炎症疾患を処置するためのヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素
US20140066321A1 (en) Structures of human histidyl-trna synthetase and methods of use
ES2708565T3 (es) Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa
KR102099730B1 (ko) 아스파르틸­trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견
JP6177129B2 (ja) ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
CA2798301C (en) Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutamyl-prolyl-trna synthetases
AU2011261486B2 (en) Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-tRNA synthetases
AU2011289831B2 (en) Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
AU2011248227B2 (en) Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-tRNA synthetases
AU2011252990B2 (en) Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-beta-tRNA synthetases
CA2808539A1 (en) Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of tyrosyl-trna synthetases
CA2797799A1 (en) Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of seryl-trna synthetases
CA2797362A1 (en) Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases
KR20210142006A (ko) 유전성 혈관부종 발작의 치료를 위한 혈장 칼리크레인 저해제 및 이의 용도
HK1204268B (en) Histidyl-trna synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration