MXPA04007732A

MXPA04007732A - Celulas madre similares a las embrionarias, derivadas de la placenta de mamiferos despues del parto y usos y metodos de tratamiento usando dichas celulas.

Info

Publication number: MXPA04007732A
Application number: MXPA04007732A
Authority: MX
Inventors: J Hariri Robert
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Priority date: 2002-02-13
Filing date: 2003-02-13
Publication date: 2004-10-15
Also published as: WO2003068937A2; KR20110036114A; KR101176146B1; AU2003216286A1; AU2003216286B2; IL163439A; WO2003068937A3; EP1482787A4; CA2476553A1; AU2008249204A1; EP1482787A2; IL207763A; KR20040094426A; ZA200406356B; IL207763A0; JP2010059193A; JP2005517402A; AU2008249204B2; NZ534643A

Abstract

La presente invencion proporciona composiciones y metodos de uso de celulas madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta despues del parto con celulas de composiciones convencionales de sangre del cordon u otras celulas madre o celulas progenitoras. Las celulas madre similares a las embrionarias se pueden usar solas o en una mezcla con otras poblaciones de celulas madre. De acuerdo con la presente invencion, las celulas madre similares a las embrionarias se pueden mezclar con otras poblaciones de celulas madre, que incluyen pero no limitan a, celulas de sangre del cordon umbilical, celulas madre hematopoyeticas fetales y neonatales y otras celulas progenitoras, celulas madre humanas y celulas progenitoras derivadas de la medula osea. Las celulas madre similares a las embrionarias y las poblaciones mezcladas de las celulas madre similares a las embrionarias y celulas madre tienen una multitud de usos y aplicaciones, que incluyen pero no se limitan a, uso terapeuticos para el transplante y el tratamiento y prevencion de padecimientos, y usos en diagnostico e investigacion.

Description

CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS, DERIVADAS DE LA PLACENTA DE MAMÍFEROS DESPUÉS DEL PARTO Y USOS Y MÉTODOS DE TRATAMIENTO USANDO DICHAS CÉLULAS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invénción se refiere al uso de células madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta después del parto con composiciones convencionales de sangre del cordón u otras células madre o progenitoras. Las células embrionarias similares a las embrionarias pueden ser usadas aisladamente o en una mezcla con otras poblaciones de células madre. De conformidad con la presente invención, las células madre similares ' a las embrionarias pueden ser mezcladas con otras poblaciones de células madre, incluyendo pero 1 no limitadas a, sangre del cordón umbilical, células madre hematopoyéticas fetales y neonatales y células progenitoras, células madre y células progenitoras humanas derivadas de la médula ósea. Las células madre similares a las embrionarias y las poblaciones mezcladas de células madre similares a las embrionarias y células madre, tienen una multitud de usos y aplicaciones, incluyendo pero no limitados a, usos terapéuticos para transplante, usos de diagnostico e investigación. Las células madre similares a las embrionarias y las poblaciones mezcladas son útiles también en el tratamiento de enfermedades o trastornos, incluyendo la enfermedades vasculares, enfermedades o trastornos neurológicos , enfermedades o . trastornos autoinmunes, enfermedades o trastornos que involucran inflamación, y cáncer o los trastornos asociados con las mismas. En particular, las células madre similares a las embrionarias o las mezclas que las incluyen, se administran enf altas dosis y sin tipología HLA. . ' 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe ún interés considerable en la « identificación, aislamiento y generación de células madre humanas. Las células madre humanas son células precursoras totipotenciales o pluripotenciales capaces de generar una variedad de linajes de células humanas maduras. Esta habilidad sirve como la base para la diferenciación y especialización celular necesarias para el desarrollo de órganos y tejidos. Los éxitos recientes en el transplante de tales células madre han proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o suplementar la 'médula ósea después de la mieloblacion debida a la enfermedad, exposición a químicos tóxicos y/o radiación. Existe evidencia adicional que demuestra que las células madre pueden ser empleadas para repoblar muchos, si no todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica. La aplicación de las células madre en ingeniería de tejidos, administración de terapia genética y terapéuticas celulares, está avanzando también de manera rápida. Muchos diferentes tipos de células madre de mamíferos han sido caracterizadas. Por ejemplo, se conocen las células madre embrionarias, células germinales embrionarias, las células madre de adulto u otras células madre o células progenitoras comprometidas. Ciertas células madre no solo han sido aisladas y caracterizadas sino que también han sido cultivadas bajo las condiciones para permitir la diferenciación a una extensión limitada. Permanece un problema básico, sin embargo, por que obtener cantidades y poblaciones suficientes de células madre de humano las cuales son capaces de diferenciación en todos los tipos de células es casi imposible. Las células madres existen en un aprovisionamiento críticamente escaso. Estas son importantes para el tratamiento de una amplia variedad de trastornos incluyendo malignidades, errores congénitos del metabolismo, hemoglobinopatías, e inmunodeficiencias . · Sería altamente ventajoso .tener una fuente de más células . madre embrionarias . Obtener números suficientes de células madre ha sido problemático por varias razones. Primero, el aislamiento de poblaciones de células madre que se dan normalmente en tejidos adultos, ha sido técnicamente difícil costoso, debido en parte a la cantidad muy limitada encontrada en la sangre o los tejidos. En segundo lugar, la procuración de estas células a partir de embriones de tejido fetal incluyendo los abortos, ha dado lugar a preocupaciones religiosas y éticas. La creencia mantenida ampliamente de que los embriones y los fetos humanos constituyen vida independiente ha incitado restricciones gubernamentales sobre el uso de tales fuentes para todos los propósitos, incluyendo la investigación médica. Las fuentes alternativas que no requieren el uso de células procuradas de tejido embrionario o fetal son por lo tanto esenciales para el progreso ulterior en el uso clínico de células madre. Existen, por lo tanto, pocas fuentes alternativas viables ,de células madre, particularmente células madre de humano, y por lo tanto el aprovisionamiento es limitado. Ademas, la recolección de células madre a partir de fuentes alternativas, en cantidades adecuadas para propósitos terapéuticos y de investigación, es generalmente laborioso, por ejemplo, recolección de células o tejidos de un sujeto o paciente 'donador, cultivo1 y/o propagación de las células in vitro, disección,' etc. Por ejemplo, Caplan et al., (Patente Norteamericana No. 5,486,359 titulada "Human mesenchymal stem cells," publicada el 23 de enero de 1996) , describe composiciones de células madre mesenquimales (hMSC) derivadas de médula ósea, que sirven como las progenitoras para linajes de células mesenquimales . Caplan et al . describe que las h SCs están identificadas por los marcadores de la superficie celular específicos que se identifican con anticuerpos monoclonales . Las composiciones de hMSC homogéneas se obtienen mediante la selección positiva de células de médula o periosteales adherentes que están libres de los marcadores asociados ya sea con las células hematopoyéticas o. células mesenquimales diferenciadas. Estas poblaciones de células mesenquimales aisladas despliegan características epitopicas asociadas con las células madre mesenquimales, tienen la habilidad de regenerarse en cultivos sin diferenciación, y tienen la habilidad de diferenciarse en linajes mesenquimales específicos cuando · se introducen ya sea in vitro o se colocan in vivo en el sitio del tejido dañado. La desventaja de tales métodos, sin embargo, es que requieren la recolección de las células de la médula o periosteales de un donador, de la cuales deben ser aisladas subsecuentemente las MSCs. Hu et al. (WO 00/73421 titulada "Methods of isolation, , cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells", publicada él 7 de diciembre de 2000) describe las células epiteliales amnióticas humanas derivadas de la placenta en el alumbramiento, que se aislan, cultivan, criopreservadas para su uso futuro, o se les induce la diferenciación. De acuerdo a Hu et al . , una placenta se recolecta inmediatamente después del alumbramiento y la membrana amniótica se separa del corion, por ejemplo, mediante disección. Las células epiteliales amnióticas se aislan de la membrana amniótica de acuerdo a las técnicas estándar para aislamiento de células. Las células descritas pueden ser cultivadas en varios medios, expandidas en el cultivo', criopreservadas , o inducidas a diferenciarse. Hu . et al., describe que las células epiteliales amnióticas son multipotenciales (y posiblemente pluripotenciales) , y pueden diferenciarse en tejidos epiteliales tales como el epitelio de la superficie corneal o el epitelio vaginal. La desventaja de tales métodos, sin embrago, es que requieren mucho trabajo y el rendimiento de las células madre en muy bajo. Por ejemplo-, para obtener números suficientes de células madre para propósitos terapéuticos o de investigación típicos, las células epiteliales amnióticas deben ser aisladas primero del la placenta o el tejido del cordón umbilical, mediante disección y las técnicas de separación de células, después cultivadas y expandidas in vitro. La sangre del cordón umbilical ("sangre del cordón") es una fuente alternativa conocida de células madre progenitoras hematopoyéticas . Las células madre de la sangre del cordón se cripreservan de manera rutinaria para usarse en la reconstitución hematopoyética , un procedimiento terapéutico ampliamente usado en los transplantes de médula ósea y otros ¦ trasplantes relacionados (ver, por ejemplo, Boyse et al U.S. 5,004,681, "Preservation of Fetal and Neonatal Hematopoyétin Stem and Progenitor Cells of the Blood", Boyse et al., Patente Norteamericana No. 5,192,553, titulada "Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoyétic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use", publicada el 9 de marzo de 1993). Las técnicas convencionales para la recolección de sangre del cordón se basan en el uso de una aguja o cánula, la cual se usa con la ayuda de la gravedad para drenar la sangre del cordón (es decir, extraer sangre) de la placenta (Boyse et al., Patente Norteamericana No. 5,192,553, publicada el 9 de Marzo de 1993; Boyse et al.., Patente Norteamericana No. 5,004,681, publicada el 2 de abril de 1991; Anderson, Patente Norteamericana No 5,372,581, titulada Method and apparatus for placental blood collection, publicada el 13 de diciembre de 1994; Hessel et al., Patente Norteamericana No.> 5,415,665, titulada Umbilical cord clamping, cutting, and blood collecting device and method, publicada el 16 de mayo dé 1995).. La aguja o cánula se coloca usualmente en la vena umbilical y la placenta se masajea suavemente para ayudar en el drenado de la sangre del cordón desde la placenta. Después, sin embargo, se ha considerado que la placenta drenada ya no tiene uso y se ha típicamente desechada. Una limitación principal de la procuración de células madre de la sangre del cordón, ha sido el volumen frecuentemente inadecuado de la sangre del cordón obtenido, que resulta en números de células insuficientes para reconstituir efectivamente la médula ósea después del transplante. Naughton et al. (Patente Norteamericana No. 5,962,325 titulada "Three-dimensional stromal tissue- cultures" publicada el 5 de octubre de 1999) describe qué las células fetales, incluyendo las células similares a los fibroblastos y las progenitoras de condrocitos, pueden ser obtenidas del tejido del cordón umbilical o la placenta o la sangre del cordón umbilical . Kraus et al., (Patente Norteamericana No. 6,338,942, titulada "Selective expansión of target . cell populations" , publicada el 15 de enero de 2002) describe que una población-objetivo predeterminada de células . puede ser expandida selectivamente introduciendo una muestra inicial de células de la sangre del cordón o la sangre periférica, en un medio de crecimiento, originando que las células de la población de células objetivo se divida, y poniendo en contacto las células en el medio de crecimiento con un elemento de selección qúe comprende moléculas de enlace con afinidad específica (tales como un anticuerpo monoclonal para CD34) para una población predeterminada de células (tales como las células CD34) , para seleccionar las células de la población objetivo predeterminada de otras células en el medio de crecimiento. Rodgers et al. (Patente Norteamericana No. 6,335,195 titulada "Method for promoting hematopoyétic and mesenchymal cell proliferation and differentiation" publicada . el 1 de enero del 2002) , describe métodos para el cultivo ex vivo de células madre hematopoyéticas y mesenquimales y la* introducción dé la proliferación y diferenciación de células" específicas del linaje mediante cultivo en' presencia de angiotensinogenos , angiotensina I (ÁI) , ' análogos- de AI, fragmentos de AI y análogos de los mismos, angiotensina II (AII), análogos, de AII, fragmentos de AII o análogos de los mismos o agonistas del receptor AII AT2 tipo 2, ya sea asiladamente o en combinación con otros factores de crecimiento y citosinas. Las células madrease derivan de la médula ósea, sangre periférica o sangre del cordón umbilical. La desventaja de tales métodos, sin embargo,- es que tales métodos ex vivo para introducir la ¦ proliferación y diferenciación de las células madre son lentos, como se discute arriba, y también resultan en bajos rendimientos de células madre. A causa de las restricciones sobre la recolección y el uso de células madre, y los números inadecuados de células recolectados típicamente de la sangre del cordón, las células madre están en un abasto críticamente escaso. Las células madre tienen el potencial de ser usadas en el tratamiento de una amplia variedad de trastornos, incluyendo malignidades, errores congénitos del metabolismo^, hemoglobinopatías, e inmunodeficiencias . Existe una necesidad crítica por una fuente fácilmente accesible de grandes números de células madre para una variedad de propósitos terapéuticos y otros propósitos relacionados médicamente. La presente invención trata esa necesidad y otras. Adicionalmente , resta /aquí una necesidad para el tratamiento de condiciones neurológicas tales como la esclerosis lateral amilotropica (ALS) . Aunque los estudios recientes usando modelos de ratón irradiados para, la ALS familiar, una forma menos común de ALS, han sugerido que la sangre del cordón umbilical puede ser útil en el tratamiento de esta enfermedad, la publicación de la fuente discutida arriba hace esta opción menos que ideal . Ver Ende et al'. , Life Sci. 67:53059 (2000). Por lo tanto, permanece aquí una necesidad de poblaciones de células madre o progenitoras que pueden ser usadas para, tratar enfermedades,, particularmente cantidades grandes de estas poblaciones cuando están siendo tratadas enfermedades tales como ALS. 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones de sangre del cordón o las células madre o progenitoras de la misma en las cuales, .dichas composiciones están suplementadas con o en contacto con células madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta después del parto. Las células madre similares a las embrionarias las cuales son el objetivo de otras solicitudes, pueden ser usadas aquí, como una composición o una. mezcla con otras poblaciones de células madre o progenitoras. De conformidad con la presente invención, las células madre similares a las embrionarias puede ponerse en contacto con otras poblaciones de células madre o progenitoras, incluyendo pero no limitadas a, sangre del cordón umbilical, células madre y células progenitoras hematopoyéticas fetales y neonatales, células madre y células progenitoras derivadas de la médula ósea humanas. Las células madre similares a las embrionarias y las poblaciones mezcladas de células madre similares a las embrionarias y células madre o progenitoras tienen una multitud de usos y aplicaciones, incluyendo pero no limitados a, usos terapéuticos para transplante y el tratamiento y prevención de enfermedades, y usos de diagnostico e investigación. De conformidad con la presente invención, las poblaciones de células madre se mezclan con las poblaciones de células madre similares a las embrionarias para · suplementar, aumentar o mejorar las concentraciones de las células madre pluripotentes o multipotentes en las poblaciones de células madre, por ejemplo, en una modalidad, la sangre del cordón umbilical, o las células madre ó progenitoras de la misma, se aumentan o se ponen en contacto con las células madre similares a las embrionarias de la invención, antes de la administración al paciente. Se reconoce qué las células madre similares a las embrionarias . pueden ser administradas también simultáneamente o secuencialmente con la sangre del cordón umbilical, o las células de la misma. Sin embargo, se prefiere poner en contacto las células de cada una antes de la administración. Las células madre similares a las embrionarias de la invención, pueden ser caracterizadas por la presencia de los siguientes marcadores de la superficie celular: CD10, CD29, · CD44, CD54, CD90, SH2 , SH3 , SH , OCT-4 y ABC-p, y la ausencia de los .siguientes marcadores de la superficie celular: CD34, CD38, CD45, SSEA3 y SSEA4. En una modalidad preferida, tales células madre similares a - las embrionarias pueden ser caracterizadas por la presencia de los marcadores de . la superficie celular OCT-4 APC-p. Las células madre similares a las embrionarias que se originan de la placenta, tienen las características de las células madre embrionarias pero no se derivan de embriones. En otras palabras, la invención abarca las mezclas de sangre del cordón y células madre similares a las embrionarias aisladas de placentas que son 0CT-4+ y/o ABC-p+ . Tales células madre similares a las embrionarias son tan versátiles (por ejemplo, pluripotentes) como las células madre embrionarias humanas. De conformidad con la presente invención, las poblaciones de células madre se mezclan con las células madre similares a las embrionarias, que son pluripotentes o mult ipotentes . Tales células similares a las embrionarias pueden ser aisladas de la placenta inundada en diferentes momentos, por ejemplo, las células hematopoyéticas CD34+/CD38+, CD34+/CD38-, y CD34-/CD38-. En una modalidad, tales células pueden ser usadas para suplementar las poblaciones de células madre hematopoyéticas, tales como aquéllas encontradas en la sangre del cordón umbilical, de conformidad con los métodos de la invención. La invención proporciona también una composición en la cual una mezcla de células madre con células madre similares a las embrionarias, está contenida · dentro de una bolsa o recipiente. En una modalidad preferida, la composición es una composición de dosis unitaria farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención proporciona una composición en la cual una población de células madre y una población de células madre similares a las embrionarias están contenidas dentro de dos bolsas o recipientes separados. En ciertas modalidades, tal juego de "dos bolsas" puede ser mezclado antes, en particular inmediatamente antes, o en el momento de la administración a un paciente en necesidad del mismo. En otras modalidades, los contenidos de cada bolsa pueden ser administrados de manera separada a un paciente, en donde el mezclado de las dos poblaciones celulares ocurre in vivo. En otras modalidades,- el recipiente está sellado, es hermético al aire, y es estéril. La presente invención se refiere a poblaciones de células madre mezcladas con células madre similares a las embrionarias. De acuerdo con la presente invención, las células madre que pueden ser mezcladas con las células madre similares a las embrionarias incluyen, pero no se limitan a, sangre del cordón umbilical, células madre y células progenitoras, hematopoyéticas , fetales y neonatales, células madre y células progenitoras de humano, derivadas de la médula ósea. En una modalidad preferida de la présente invención, las células madre similares a las embrionarias " se mezclan con la sangre del cordón umbilical. La presente invención 'proporciona también los métodos para tratar a un paciente en necesidad de los mismos mediante la administración de una población de células madre suplementada con células madre similares a las embrionarias . En una modalidad, la suplementacion de la población de células de sangre del cordón con células madre similares a las embrionarias, ocurre mezclando las células madre y las células similares a las embrionarias antes de la administración al paciente de la población combinada o "clavada" . En otra modalidad, la suplementacion de la población, de células madre con células madre similares a las embrionarias ocurre tras, la administración de la población suplementada al paciente, por ejemplo, mediante la administración simultanea de las células de sangre del cordón y las células madre' similares a las embrionarias. En otra modalidad, la suplementacion de la población de células madre con las células madre similares a las embrionarias ocurre después de la administración de las células de sangre del cordón al paciente, por ejemplo, administrando las. células madre embrionarias de manera separada de, y antes o después, de la administración de las células madre. De conformidad con la invención, las poblaciones de células madre, por ejemplo, la sangre del cordón umbilical, suplementadas con células madre similares a las embrionarias de la placenta, tiene una multitud de usos, incluyendo los usos profilácticos, terapéuticos y de diagnostico. Las poblaciones suplementadas de células madre, pueden ser usadas para transplante y/o para tratar o prevenir enfermedades. En una modalidad de la invención, las poblaciones suplementadas de células se usan para renovar y repoblar tejidos y órganos, reemplazando o reparando por ello los tejidos enfermos, órganos o porciones de los mismos. En otra modalidad, las poblaciones suplementadas de , células madre pueden ser usadas como un diagnostico para seleccionar trastornos genéticos o una predisposición para una enfermedad o trastorno.' En otra modalidad, la invención proporciona un método para aislar otras células madre similares a las -embrionarias y/o multipotentes o pluripotentes a partir de un extracto o perfusado de una placenta a la que se le ha extraído sangre y usándolas para suplementar poblaciones de células. de sangre del cordón de acuerdo a los métodos de la invención. La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden poblaciones de células madre, por ejemplo, células de sangre del cordón umbilical, que han sido suplementadas con una o más poblaciones de células madre similares a las embrionarias, de la invención. La presente invención proporciona una población aislada, homogénea, de células madre de la placenta humana que tienen el potencial para diferenciarse en todos los tipos de células: En otra modalidad, lá población de células madre de lá placenta humana tiene el potencial de diferenciarse; en un- tipo de células. En aun otra modalidad, la población de células madre de la placenta humana, tiene el potencial de diferenciarse en varios tipos de células diferentes. Tales células pueden ser usadas para suplementar poblaciones de células madre, por ejemplo, sangre del cordón umbilical, de acuerdo a los métodos de la invención. La invención también abarca las composiciones farmacéuticas que comprenden poblaciones de células madre hematopoyéticas , suplementadas con una o más poblaciones de células que tienen altas concentraciones (o poblaciones mayores) de células madre hematopoyéticas . homogéneas incluyendo, pero no limitadas a, células CD34+/CD38 - ; células CD34-/CD38-, y células CD133+ . Una o * más de estas poblaciones de células pueden ser usadas con, b mezcladas con, células madre hematopoyéticas, es decir, células hematopoyéticas CD34+/CD38+, obtenidas de la sangre del cordón umbilical u otras fuentes, para transplante y otros usos. La presente invención proporciona también los métodos para mezclar una población de células madre, progenitoras o de sangre del cordón, que incluyen células . depositadas en un banco o criopreservadas , con una población de células madre similares a las embrionarias. En una modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente. En otro aspecto de esta modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente y después se tratan con un factor de crecimiento, por ejemplo, una citosina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación celular. En otro aspecto de esta ' modalidad, las células madre y/o las células madre similares a las embrionarias son tratadas con un factor de crecimiento, por ejemplo, una citosina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación célula y después mezcladas físicamente. En una modalidad, las poblaciones mezcladas son tratadas con un' factor de crecimiento para inducir la diferenciación en una variedad de tipos de células. En otra modalidad, las poblaciones mezcladas son tratadas con un» factor de crecimiento para inducir la diferenciación a un "tipo particular de células. En otra modalidad, las poblaciones mezcladas son tratadas con un factor dé crecimiento para prevenir o suprimir la diferenciación a un tipo particular de células. En ciertas modalidades, las condiciones de cultivo puede ser controladas, pór ejemplo, las población de células mezclada puede ser tratada con un cóctel específico de citosinas o interleucinas, para dirigir o inducir la diferenciación a un tipo específico de. células.- ¦ '-' En otra modalidad, la invención proporciona un .método para tratar a un paciente en necesidad del mismo que comprende la administración de una pluralidad de células de sangre del cordón umbilical y una pluralidad de células madre similares a las embrionarias. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar la mielodisplasia , el cual comprende, administrar células de sangre del cordón umbilical (o células madres aisladas ' de la misma) y células madre similares a las embrionarias a un paciente en necesidad de las mismas . La invención se refiere también a nuevos Usos de la células madre de la placenta humana (células madre similares a las embrionarias). Aquí están abarcados también los métodos para tratar o prevenir enfermedades con las composiciones que contienen las células madre similares a las embrionarias y otras células madre o progenitoras o las fuentes de las mismas. De manera similar, están abarcados los métodos para dosificar tales composiciones. Finalmente, debería notarse que las composiciones de la invención pueden contener poblaciones de células madre o progenitoras de múltiples donadores. La invención incluye el uso de composiciones no apareadas con HLA en pacientes así como composiciones. apareadas con HLA. Se prefiere la correspondencia del tipo de sangre con el paciente pero no se requiere cuando se usan composiciones que contienen tanto células madre similares a las embrionarias y células madre o progenitoras . 3.1. DEFINICIONES Como se usa aquí, el término "birreactor" se refiere a un sistema ex vivo para propagar células, producir o expresar materiales biológicos e incrementar o cultivar células, tejidos, organoides, virus, proteínas, polinucleótidos y microorganismos. Como se usa aquí, los términos "sangre del cordón" y "sangre del cordón umbilical" son intercambiables. Como se usa aquí, el término "células madre embrionarias" se refiere a células que se derivan de la masa celular interna de un blastocisto (por ejemplo un embrión humano de 4 a 5 días de edad) y que son pluripotentes . Como se usa aquí, el término "células madre similares a las embrionarias" se refiere a células que no .se derivan de la masa celular interna de un blastocisto. Como se usa aquí, las "células madre similares a las embrionarias" pueden ser conocidas también como "células madre de la placenta" , preferiblemente las células madre de la placenta humana derivadas de una placenta difundida después del parto. Las célula madre similares a las embrionarias son preferiblemente pluripotentes. Sin embargo, las células madre las cuales pueden ser obtenidas de la placenta incluyen, células madre similares a las embrionarias, células multipotentes, y células progenitoras comprometidas. De acuerdo a los "métodos de la invención, las células madre similares a las embrionarias derivadas de la placenta, pueden ser recolectadas de la placenta aislada, una vez que se le ha extraído la sangre y difundido por un periodo de tiempo suficiente para remover las células residuales. « Como se usa aquí, el término "sangre extraída" o "extraer sangre", cuando se usa con respecto a la placenta, se refiera a la remoción y/o drenado de substancialmente toda la sangre del cordón de la placenta. De conformidad con la presente invención, la extracción de sangre de la placenta puede ser lograda, por ejemplo, pero no a manera de limitación, mediante drenado, _ flujo inducido por gravedad, masaje, constricción, bombeo, etc. En una modalidad preferida, la extracción de sangre de la placenta puede ser lograda además inundando, enjuagando o vaciando la placenta con un fluido que puede o no contener agentes, tales como anticoagulantes, para ayudar en la extracción de sangre de la placenta. Como se usa aquí, el término "mezclar" significa combinar o mezclar en una maza o mezcla; poner juntos en una masa de modo que las partes constituyentes son más o menos homogéneas; crear o formar combinando los ingredientes; formar' mediante aleación, aumento, suplementación o mezclado, o agregar un ingrediente o elemento a otro ingrediente o elemento, y viceversa .

Como se usa aquí, el término "inundar o perfundir" o "perfusión o inundación", se refiere al acto de verter o hacer pasar un fluido sobre o a través de un órgano o tejido, preferiblemente, el paso del fluido a través de un órgano o tejido con fuerza o presión suficiente para remover cualquier célula residual, por ejemplo, las células no adheridas del órgano o tejido. Como se usa aquí, el término "perfundido" se refiere al fluido recolectado enseguida de su paso a través de un órgano o tejido. En una modalidad preferida, el perfundido contiene uno o más anticoagulantes. ' Como se usa aquí, el término "células exógenas" " se refiere a las células "extrañas", es decir, una célula heteróloga (es decir, una célula "non-auto" derivada de una fuente que no sea el donador de la placenta) o célula autóloga (es decir, una "auto" célula derivada del donador de " la placenta) que se deriva de un órgano o tejido diferente de la placenta. Como se usa aquí, el término "organoide" se refiere a una agregación de uno o más tipos de células ensambladas en apariencia superficial o en su estructura actual como cualquier órgano o glándula de un cuerpo de mamífero, preferiblemente el cuerpo humano . Como se usa aquí, el término "células multipotentes" se refiere a las células que tiene la capacidad para crecer en cualquiera de un subconjunto de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de un mamífero. A diferencia de las células pluripotentes, las células multipotentes- no tienen la capacidad de formar todos los tipos de células. Como se usa aquí, el término "células pluripotentes" se refiere a las células que tienen versatilidad de diferenciación completa, es decir, la capacidad de crecer en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de un mamífero. Las células pluripotentes pueden ser autorrenovables , y pueden permanecer latentes o inactivas dentro de un tejido. A diferencia de las células totipótentes (por ejemplo, las células huevo, diploides, fertilizadas), las células madre embrionarias usualmente no pueden formar un nuevo blastocisto. ' Como se usa aquí, el término "células progenitoras" se refiere a las células que están comprometidas a diferenciarse en un tipo específico de células o a formar un tipo específico de tejido. , * Como se usa aquí, el término "células madre" se refiere a las células maestras que pueden reproducirse indefinidamente para formar las células especializadas de tejidos y órganos. Las células madre son células pluripotentes o multipotentes desde el punto de vista del desarrollo. Las células madre pueden dividirse para producir dos células madre hijas, o una célula hija y una progenitora ("transitoria"), las cuales proliferan entonces a células maduras, completamente formadas, del tejido. Las "células madre" usadas aquí incluyen las "células progenitoras" a menos que se señale de otra manera. Cómo se usa aquí, el término "células totipotentes" se refiere a las células que son .capaces de formar un embrión completo (por ejemplo, un blastocisto) . 4. DESCRIPCIÓN DETALLADA DÉ LA INVENCIÓN La presente invención se basa en parte en el descubrimiento inesperado de que las células madre similares a las embrionarias, producidas por placentas a las que se les ha extraído sangre, inundadas y/o cultivadas, son células madre pluripotentes que pueden ser diferenciadas fácilmente, en cualquier tipo de células deseado. Estas células "madre similares a las embrionarias pueden ser usadas para suplementar, aumentar o mejorar las poblaciones de células madre, incluyendo, pero no limitadas . a, sangre del cordón umbilical, células madre y células progenitoras hematopoyéticas fetales y neonatales, células madre y células progenitoras humanas derivadas de la médula ósea. De acuerdo con la presenté invención, las poblaciones de células madre se mezclan con las poblaciones de células madre similares a las embrionarias para suplementar, aumentar, o mejorar las concentraciones de células madre pluripotentes y multipotentes en las poblaciones de células madre. De acuerdo con la presente invención, las poblaciones de células madre mezcladas con las poblaciones de células madre similares a las embrionarias tienen una multitud de usos y aplicaciones, incluyendo pero no limitadas a, usos terapéuticos para transplante ' y tratamiento y prevención de enfermedades, y sus de diagnostico e investigación La invención proporciona también una composición en la cual, una mezcla de células , madre y células madres similares a las embrionarias, se obtiene dentro de una bolsa o recipiente. En otra modalidad, la invención proporciona una composición en la cual, una población de células madre y una población de células madre similares a las embrionarias, están contenidas dentro de dos bolsas o recipientes separados. En ciertas modalidades, tal composición de "dos bolsas" puede ser mezclada antes, en particular inmediatamente antes de, o al momento de la administración a un paciente en, necesidad de la misma. En otras modalidades, los contenidos de cada bolsa pueden ser administrados separadamente a un paciente, en donde las poblaciones de dos células se usan de manera adjunta in vivo . La presente invención proporciona también los métodos para mezclar una población de células madre o progenitoras o sangre del cordón, incluyendo la sangre del cordón depositada en bancos o criopreservada con una población de células madre similares a las embrionarias. En una modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente. En un aspecto de esta modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente -y después se tratan con un, factor de crecimiento, por ejemplo, una citosina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación celular. En otro aspecto de esta invención, las células madre y/o las células madre similares a las embrionarias, se tratan con un factor de crecimiento, por ejemplo una citosina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación celular, y después se mezclan físicamente. La presente invención proporciona también los métodos para mezclar una población de células comprometidas, por ejemplo, una población de células comprometidas para diferenciarse en neuronas, células musculares, hematopoyéticas, células vasculares, adipocitos, condrocitos, osteocitos, hepatocitos, células pancreáticas o cardiacas, con una población de células madre similares a las embrionarias. En una modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente. En otro aspecto de esta modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente y después de tratan con un factor de crecimiento, por ejemplo, una citosina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación" celular. En otro aspecto de esta modalidad, las células comprometidas y/o las células madre similares a las embrionarias se tratan con un factor de crecimiento, por ejemplo, una citosina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación celular- y ¦ después se mezclan físicamente. De acuerdo a los métodos de la invención, las células madre similares a las embrionarias , se extraen de una placenta drenada por medio de una técnica de inundación que' utiliza bien la arteria umbilical y la vena umbilicál o ambas. La placenta se drena preferiblemente mediante extracción de sangre y recolección de la sangre residual (por ejemplo, la sangre residual del cordón umbilical). La placenta drenada se procesa entonces en tal manera para establecer el ambiente del biorreactor, ex vivo, natural en el cual las células madre similares a las embrionarias dentro son reclutadas dentro de la parénquima y el. espacio extravascular . Las células madre similares a las embrionarias migran hacia la microcirculación drenada, vacía, donde, de conformidad con los métodos de la invención, son recolectadas, preferiblemente mediante lavado en un recipiente de recolección por perfusión. Como se discute arriba, un número de células madre pluripotentes o multipotentes diferentes puede ser aislado de la placenta inundada . a diferentes puntos de tiempo durante la perfusión, por ejemplo, células hematopoyéticas CD34+/CD38+", CD34+/CD38-, y CD34-/CD38-. En una modalidad, tales células pueden ser usadas para suplementar poblaciones de células madre, por ejemplo, células de sangre del cordón, de acuerdo a los métodos de la invención. La presente invención además proporciona una población homogénea aislada de células madre de placenta humana, que tiene el potencial de diferenciarse en todos los tipos de células. En otra modalidad, la población de células madre de la placenta humana tiene el potencial -,para diferenciarse en un tipo de células. En aún otra modalidad, la .población de células madre de placenta humanas tiene el potencial para diferenciarse en varios tipos de células diferentes. Tales células pueden ser usadas para suplementar poblaciones de células madre, por ejemplo, células de sangre del cordón, de acuerdo a los métodos de la invención. ' La presente invención proporciona también los métodos para mezclar una población de células madre con una .población de células madre similares a las embrionarias. En una modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente. En otro aspecto de esta modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente y después se tratan con un factor de. crecimiento, por ejemplo, una citosina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación celular. En otro aspecto de' esta modalidad, las células madre y/o las células madre similares a las embrionarias se tratan con un factor de crecimiento, por ejemplo, una citosina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación celular y después se mezclan físicamente. En una modalidad, las poblaciones- mezcladas se tratan con un factor de crecimiento para inducir la diferenciación celular en una variedad de tipos de células. En otra modalidad, las poblaciones mezcladas se tratan con' un factor de crecimiento para inducir la diferenciación en un tipo particular de células. En otra modalidad, las poblaciones mezcladas se tratan con un factor de crecimiento para prevenir o suprimir la diferenciación en ún tipo particular de células. En ciertas modalidades, las . condiciones de' cultivo pueden ser controladas, por ejemplo, la población mezclada de células puede ser tratada con un cóctel específico de citosinas e interleucinas para dirigir o inducir la diferenciación a un tipo específico de células. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las poblaciones de células madre, por ejemplo, células de sangre del cordón, que han sido suplementadas con una o más poblaciones de células madre similares a las embrionarias de la invención. La invención abarca también las composiciones farmacéuticas que comprenden las poblaciones de células madre, por ejemplo células de sangre del cordón, suplementadas con una o más poblaciones de células que tienen concentraciones altas (o poblaciones mayores) de células madre hematopoyéticas homogéneas, incluyendo, pero no limitadas a, células CD34+/CD38-; y células CD34-/CD38-. Una o más de estas poblaciones celulares puede ser usada con, o mezclada con, células hematopoyéticas de sangre del cordón" umbilical, es decir, células hematopoyéticas CD34+/CD38+ para transplante y otros usos . · . De acuerdo a la invención, las poblaciones de células madre, por ejemplo, sangre del cordón umbilical, suplementadas con células madre similares a las embrionarias ' de la placenta, tienen una multitud de usos, incluyendo usos terapéuticos y de diagnóstico. Las poblaciones suplementadas de células, madre pueden ser usadas para transplante o para tratar o prevenir enfermedades. En una modalidad de la invención, las poblaciones suplementadas de células se usan para renovar y repoblar tejidos y órganos, reemplazando o reparando por ello tejidos enfermos, órganos o porciones de los mismos. En otra modalidad, las poblaciones suplementadas de células madre pueden ser usadas como un diagnostico para la selección de trastornos genéticos o una predisposición para una enfermedad o trastorno particular. La presente invención proporciona métodos para tratar un paciente en necesidad de los mismos mediante lá administración de una población de células madre suplementada con células madre similares a las embrionarias. En una modalidad, la suplementacion de la población de células de sangre del cordón con células madre similares . a las embrionarias ocurre mezclando las células madre y las células madre similares a las embrionarias antes de la administración al paciente de la población suplementada. En otra modalidad, la suplementacion de la población de células madre con células madre similares a las embrionarias ocurre por la administración al paciente de la población suplementada, por ejemplo, mediante administración simultanea de las células de sangre. del cordón y las células madre similares a las embrionarias. En otra modalidad, la suplementacion de la población de células madre con células madre similares a las embrionarias ocurre después de la administración de las células de sangre del cordón al paciente, por ejemplo, administrando las células madre embrionarias de manera separada de, y antes o después, la administración de las células madre. ' 4.1. MÉTODOS PARA AISLAR Y CULTIVAS LA PLACENTA 4.1.1 Pretratamiento de la Placenta De acuerdo a los métodos de la invención, una placenta humana se recupera poco después de su expulsión después del alumbramiento y, en ciertas modalidades, se recupera la sangré del cordón en la placenta. En ciertas modalidades, la placenta se somete a un proceso convencional de recuperación de la sangre del cordón. Tal recuperación de la sangre del cordón puede ser obtenida comercialmente, por ejemplo, de LifeBank Inc., Cedar Knolls, N.J., Viacord, Cord Blood Registry y Criocell. La sangre del cordón puede ser drenada poco después de la expulsión de la placenta. En otras modalidades, la placenta es pretratada de acuerdo a los métodos descritos en la solicitud co-pendiente No'. 10/076,180, presentada el 13 de febrero de 2002, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. 4.1.2. Extracción de sangre de la Placenta y Remoción de las Células Residuales Como se describe en la Publicación PCT WO 02/0.64755, publicada el 22 de agosto del 2002, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, la placenta ' después del alumbramiento contiene células inactivas que pueden ser activadas si la placenta se procesa apropiadamente después del alumbramiento. Por ejemplo, después de la expulsión desde el útero, se extrae la sangre de la placenta tan rápido como sea posible para prevenir o minimizar la apoptosis. Subsecuentemente, tan pronto como sea posible después de la extracción de sangre la placenta se inunda para remover la sangre, células residuales, factores y cualquier otro material presente en el órgano. Los desechos de materiales pueden ser removidos también de la placenta. La perfusión se continúa normalmente con un perfundido apropiado por al menos dos a más de veinticuatro horas. La placenta puede ser usada por lo tanto fácilmente como una fuente rica y abundante de células madre similares a las embrionarias, las cuales células pueden ser usadas para investigación, incluyendo descubrimiento de fármacos, tratamiento y prevención de' enfermedades, en particular cirugías o terapias de transplante, y la generación de células, te idos y organoides comprometidos. Además, sorprendentemente e 'inesperadamente, las células madre de placenta humana producidas mediante la extracción de sangre, inundación y/o cultivo de' la placenta son células madre pluripotentes que pueden ser diferenciadas fácilmente en cualquier tipo deseado de células. . De acuerdo a los métodos de la invención, las células madre, o progenitoras , incluyendo, peso no limitadas a células madre similares a las embrionarias, pueden ser recuperadas a partir de una placenta a la que se le ha extraído la sangre, es decir, completamente drenada de la sangre del cordón que permanece después del alumbramiento y/o un procedimiento convencional para recuperación de la sangre del "cordón. De acuerdo a los métodos de la invención, los métodos para extracción de sangre de la placenta y remoción de las células residuales pueden ser logrados usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, los métodos descritos en la publicación PCT WO 02/064755, publicada el 22 de agosto de 2002, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. 4.3.1. Cultivo dé la Placenta . Después ' de la extracción de la sangre y un tiempo suficiente de perfusión de la placenta, se observa que las células madre similares a las embrionarias migran hacia la microcirculación de la placenta a la que se le ha extraído la ¦ sangre e inundado donde, de acuerdo a los" métodos de la invención, se recolectan, preferiblemente mediante lavado en un recipiente de recolección por perfusión. ' En otras modalidades, la placenta se cultiva, y las células propagadas se monitorean, clasifican y/o caracterizan de acuerdo a los métodos descritos en la publicación PCT WO 02/064755, publicada el 22 de agosto de 2002, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. 4.2. RECOLECCIÓN DE LAS CÉLULAS DE LA PLACENTA Después de la extracción de sangre y la perfusión de la placenta, las células madre similares a las embrionarias migran hacia la microcirculación drenada, vacía de la placenta donde, de acuerdo a la invención, se recolectan, preferiblemente recolectando el perfundido efluente en un. recipiente de recolección. En las modalidades preferidas, las células cultivadas en la placenta son aisladas del perfundido efluente usando las técnicas conocidas por aquellas personas experimentadas en la técnica, tales como, por ejemplo, centrifugación por gradiente de densidad, separación magnética de células, ' citometría de flujo, u otros métodos de separación o clasificación de células bien conocidos en la técnica y se clasifican.' En una modalidad específica, las células ttiadre similares a las embrionarias se recolectan a-partir de la placenta y, en ciertas modalidades, son preservadas, de acuerdó a los métodos descritos en la publicación PCT O 02/064755, publicada el 22 de agosto del 2002, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. · . 4.3. CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS Las células madre similares a las embrionarias obtenidas de acuerdo con los métodos de la invención pueden incluir células pluripotentes, es decir, que tienen versatilidad de diferenciación completa, que son autorrenovables , y pueden permanecer latentes o inactivas dentro del tejido. Las células madre las cuales pueden ser obtenidas a partir de la placenta incluyen células madre similares a las embrionarias, células multipotentes , células progenitores comprometidas, y células fibroblastoides . La primera recolección de la sangre de la placenta se conoce como sangre de la placenta, la cual contiene predominantemente células progenitoras hematopoyéticas CD34+ y CD38+. Dentro de las primeras veinticuatro " horas de la perfusión después del parto, pueden ser aisladas de la placenta altas concentraciones de células progenitoras' hematopoyéticas CD34+ y CD38-, junto con altas concentraciones de células progenitoras hematopoyéticas CD34- y CD38+. Después de aproximadamente veinticuatro horas de la perfusión, pueden ser aisladas de la placenta altas concentraciones de células CD34- y CD38- junto cón las células, antes mencionadas. La placenta aislada, perfuridida de la invención proporciona ' una fuente de grandes cantidades" de células" madre enriquecidas para las células madre CD34+ y CD38- y las células madre CD34-y CD38+. La placenta aislada la cual ha sido inundada durante veinticuatro horas o más, proporciona una fuente de grandes cantidades de células madre enriquecidas para las células madre CD34- y CD38-. . '¦ En una modalidad preferida, las células madre similares a las embrionarias Obtenidas mediante los métodos , de'-, la invención son células madre viables, inactivas, pluripotentes que existen dentro de una placenta humana a largo plazo y que pueden ser recuperadas enseguida del, nacimiento exitoso y la expulsión de la placenta, resultando en la recuperación, de tantas "como' un billón de células que poseen núcleo, lo cual da 50-100 millones de células madre multipotentes y pluripotentes . Las células madre de la placenta humanas proporcionadas por la placenta son sorprendentemente similares a las embrionarias, por ejemplo, la presencia de los siguientes marcadores de la superficie celular ha sido identificada para estas células: SSEA3-, SSEA4-, 0CT-4+ y ABC-p+. Preferiblemente, las células madre similares a las embrionarias de la invención, se caracterizan por la presencia de los marcadores de la superficie celular 0CT-4+ y ABC-p+. Por lo tanto, la invención abarca las células madre las cuales no han sido aisladas u obtenidas de otra manera de una fuente embrionaria pero las cuales pueden ser identificadas por los siguientes marcadores: SSAE3-, SSAE41 , OCT-4+ y ABC-p+. En una modalidad, las células madre humanas de la placenta no expresan los antígenos MHC Clase 2. Las células madre aisladas de la placenta son homogéneas, y estériles. Además, las células madre se obtienen fácilmente en una forma adecuada para la administración a los humanos, es decir, son de grado farmacéutico. Las células madre similares á las embrionarias preferidas obtenidas mediante los métodos de la invención, pueden ser identificadas por la presencia de los siguientes marcadores de la superficie celular: OCT-4+ y ABC-pt. Además, la invención abarca las células madre embrionarias que tienen los siguientes marcadores: CD10+, CD38-, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3 - , SSEA4-, 0CT-4+ , y ABC-p+. Tales marcadores de la superficie celular son determinados de manera rutinaria de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante citometría de flujo, seguida por lavado y teñido con un anticuerpo del anti-marcador de la superficie celular. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD-34 o CD-38, las células pueden ser lavadas en PBS y después se tiñen doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isocianato de fluoresceína anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . En otra modalidad, las células cultivadas en el biorreactor de la placenta se identifican y caracterizan mediante un análisis de unidad dé formación de la colonia, el cual se conoce comúnmente en la técnica, tal como medio Mesen Cult™ (stem cell Technologies, Inc., Vancouver Columbia Británica) . ; Las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención pueden ser inducidos a diferenciarse a lo largo de linajes celulares específicos, incluyendo adipogenicos, codrogenicos, osteogenicos, hematopoyéticos, miogenicos, vasogenicos, neurogenicos y hepatdgenicos . En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias obtenidas de acuerdo a los métodos de la invención son inducidos a diferenciarse para usarse en transplantes y protocolos de tratamiento ex vivo. En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención son inducidas a diferenciarse en un t'ipo de células particular y modificadas genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico. En una modalidad específica, las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención se incuban con un compuesto in vitro que la induce a diferenciarse, seguido por el transplante directo a un sujeto de las células diferenciadas. Por lo tanto, la invención abarca los métodos para diferenciar las células madre humanas de la placenta usando medios de cultivo estándares. Además, la invención -abarca las células hematopoyéticas, células neuronales, células fibroblásticas , células de fibras o filamentosas y células hepáticas. Las células madre similares a las embrionarias pueden ser cultivadas además posteriormente después de la recolección a partir de la placenta usando los métodos bien conocidos en la técnica, ' por ejemplo, mediante cultivo en células alimentadoras tales como fibroblastos irradiados, obtenidos de la misma placenta que' las células madre similares a las embrionarias o de otras fuentes humanas o no humanas, o en medio acondicionado obtenido de cultivos de tales células alimentadoras , para obtener cultivos continuados a largo plazo de células madre similares a las embrionarias. Las células madre similares a las embrionarias pueden ser expandidas también, bien dentro dé la placenta antes de la recolección del birreactor de la placenta o in. vivo- después de la recuperación a partir de la placenta. En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias a ser expandidas, son expuestas a, o cultivadas en presencia de, un agente que suprime la diferenciación celular. Tales agentes son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos Delta-1 de humano y Serrate-1 de humano (ver, Sakano et al:, Patente Norteamericana No. 6,337,387 titulada "Differentiation-suppressive polypeptide" , publicada el 8 de enero de 2002), el factor inhibidor de la leucemia (LIF) y el factor de las células madre. Los métodos para la expresión de las poblaciones celulares son conocidos también en la' técnica (ver, por ejemplo, Emerson et al., Patente Norteamericana No. 6,326,198 titulada " ethods and compositions for the ex vivo replication of stem cells," for the optimization of hematopoyétic progenitor cell cultures, and for increasing the . metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of humans stromal cells", publicada el 4 de diciembre de 2001; raus et al., Patente Norteamericana No. 6,338,942, titulada "Selective expansión of target cell populations" , publicada el 15 de enero de 2002) . Las células madre similares a las embrionarias pueden ser evaluadas por su viabilidad, potencial de proliferación, y longevidad usando las técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como el análisis de exclusión .de azul de trypan, el análisis de asimilación de diacetato de fluoresceína, el análisis de asimilación de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad); y el análisis de asimilación de timidina, el análisis de proliferación celular por MTT (para evaluar la proliferación) . La longevidad puede ser determinada por los métodos bien conocidos en la técnica, tales como mediante la determinación de número máximo de duplicación de la población en un cultivo extendido. En ciertas modalidades, la diferenciación de células madre o células progenitoras que se cultivan en la placenta a la que se le ha extraído la sangre, inundada y/o cultivada, se modula usando un agente o composiciones farmacéuticas que comprenden una dosis o dosificaciones, efectivas tras la administración individual o múltiple, para ejercer un efecto suficiente para inhibir, modular y/o regular la diferenciación de las células recolectadas a partir de la placenta. Loa agentes que pueden inducir la diferenciación de las células madre o progenitoras son bien . conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, Ca2+, EGF,_ a-FGF, ß-FGF, PDGF, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , TGF-ß, ¦citocinas (por ejemplo IL-la, IL-?ß) , IFN-?, TFN) , ácido retinoico, transferían, hormonas (por ejemplo, andrógenos, estrógenos, insulina, prolactina, triyodotironina, hidrocortisona, dexametasona) , , butirato de sodio, TPA, DMSO, NMF, DMF, elementos de matriz (por ejemplo, colágeno, laminina, sulfato de heparan, Matrigel™) , o combinaciones de los mismos . , . Los agentes que suprimen la diferenciación celular son-bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos Delta-1 de humano y Serrate-1 de humano- (ver, Sakano et al.,, Patente Norteamericana No. 6,337, 387 titulada "Differentiation-suppressive polypeptide" , publicada el 8 de enero de 2002), factor inhibidor* dé la leucemia- (LIF) , y el factor de las células madre. ' < ' ' - ' El agente usado para modular la diferenciación puede ser introducido en el birreactor de la placenta para inducir la diferenciación de las células que se cultivan- en la placenta. Alternativamente, el agente puede ser usado para modular la diferenciación in vitro después - que las células han sido recolectadas o removidas de la placenta. La determinación de que las células madre se han diferenciado en un tipo de células particular puede lograrse mediante los métodos bien conocidos en la. técnica, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de la superficie celular usando las técnicas tales como citometría de flujo o inmunocitoquímica (por ejemplo, células teñidas con anticuerpos específicos del tejido o específicos del marcador de la célula) , mediante examinación de la morfología de las células usando microscopía luminosa o confocal , o midiendo los cambios en la expresión genética usando las técnicas bien conocidas en la técnica, tales como PCR y caracterización de la expresión genética. 4.4. SUPLEMENTAR LAS POBLACIONES DE CÉLULAS MADRE CON CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS La presente invención se refiere a poblaciones de células madre que están mezcladas con células madre similares a las embrionarias. De acuerdo con la presente invención, las células madre que pueden ser mezcladas con las células madre similares a las embrionarias incluyen, pero no se limitan a, sangre del cordón umbilical, células madre y células progenitoras hematopoyéticas fetales y neonatales, células madre y células progenitoras humanas derivadas de la médula ósea. En una modalidad preferida de la presente invención, las células madre similares a las embrionarias de la invención se mezclan con sangre del cordón umbilical. La presente invención proporciona una "población homogénea aislada de células madre humanas de la placenta (células madre similares a las embrionarias) las cuales tienen el potencial de diferenciarse en todos los tipos de células. Tales células pueden ser usadas para suplementar poblaciones de células madre, por ejemplo, células de sangre del cordón, de acuerdo a los métodos de la invención. La invención proporciona también poblaciones de células de sangre del cordón que han sido suplementadas (es decir, mezcladas, combinadas o aumentadas) con poblaciones de células madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta. Las poblaciones suplementadas son muy versátiles, porque contienen poblaciones de células que son células madre pluripotentes o muítipotentes, por ejemplo, células que despliegan un fenotipo CD34+/CD38+, CD34+/CD38- o CD34-/CD38-. De conformidad con la presente invención, ' las poblaciones suplementadas de células madre de la invención contienen células madre similares a las embrionarias y otras células madre o prógenitoras a una relación de 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,00.0:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1,· 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1 : 500 ; 1 : 1 000 ; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000; o 1:100,000,000, comparando los números de células que tienen núcleo en cada población. En otra modalidad, la invención proporciona métodos para suplementar, mezclar, combinar o aumentar las células madre, por ejemplo, ' la sangre del « cordón umbilical, con Una composición de la invención, por ejemplo, de células madre de la placenta similares a las embrionarias puras o una población de células enriquecidas por células madre de la placenta similares a las embrionarias. En una modalidad, una alícuota (o población) de células madre de la placenta similares . a las embrionarias se agrega a una alícuota de sangre del cordón umbilical, antes de la administración a un paciente en necesidad de las mismas. · La presente invención proporciona también métodos para suplementar una población de células de la sangre del cordón con una población de células madre similares a las. embrionarias. En- una modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente. En* otro aspecto de está modalidad, las poblaciones se mezclan físicamente y después se tratan con un factor de crecimiento, por ejemplo," una citocina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación celular. En otro aspecto de esta modalidad, las células- de sangre del cordón y/o las células madre similares a las embrionarias - se tratan con un factor de crecimiento, por ejemplo, una citocina y/o una interleucina, para inducir la diferenciación celular y después se mezclan físicamente. La presente invención proporciona también los métodos para tratar a un paciente en necesidad de las mismas mediante la administración de una población de células de sangre del cordón con células madre similares a las embrionarias. En una modalidad, la suplementación de la población de células de sangre 'del cordón con células .madre similares a las embrionarias ocurre mezclando las células de sangre del cordón y las células madre similares a las embrionarias antes de la administración al paciente de la población suplementada . En otra modalidad, la suplementación de las células de sangre del cordón con las células madre similares a las embrionarias ocurre por la administración al paciente de la población suplementada, por ejemplo, mediante la administración simultanea de las células de sangre del cordón y las células madre similares a las embrionarias. En otra modalidad, la suplementación de las células de sangre del cordón con las células madre similares a las embrionarias ocurre después de la administración al paciente de la células de sangre de cordón, por ejemplo, administrando las células madre similares a las embrionarias de manera separada 'de, y- antes "o después, de la administración de las células de sangre del cordón.

En una modalidad, la invención proporciona los métodos para suplementar las células de sangre del cordón con las células madre similares a las embrionarias, en donde la mezcla está contenida dentro de una bolsa. En otra modalidad, la invención proporciona los métodos para suplementar las células de sangre del cordón con células madre similares a las embrionarias, . en donde las células de sangre del cordón y las células madre similares a las embrionarias están contenidas cada una en bolsas separadas. Tal composición de "dos bolsas" puede ser ' mezclada antes de o en , el momento de la administración al paciente en necesidad de la misma. En otra modalidad, una alícuota (o población) de células madre de la placenta similares, a las embrionarias son acondicionadas antes de ser agregadas a, y mezcladas en, una alícuota de sangre del cordón umbilical, antes de la administración a un paciente en necesidad de las mismas. Por ejemplo, en un aspecto de esta modalidad,, una población de las células madre de la placenta similares a las embrionarias se induce a diferenciarse en un linaje de células particular, por ejemplo, el linaje hematopoyético, neuronal, adipogeñico, condrogenico, osteogenico, hepatogenico, pancreático, o miogenico, como se describe arriba en la Sección 4.3, mediante la exposición, por ejemplo, a citosinas (por ejemplo, IL-la, IL-?ß, IFN-?, TFN) , ácido retinoico, transferrina, hormonas (por ejemplo, andrógenos, estrógenos, insulina, prolactina, triyodotronina, hidrocortisona, dexametasona) , butirato de sodio, TPA, DMSO, F, DMF, elementos de matriz (por ejemplo colágeno, . laminina, sulfato de heparan, Matrigel™) , o combinaciones de las mismas, antes de ser agregada a, y mezclada en, una alícuota de sangre del cordón umbilical. En otro aspecto de esta modalidad, una población de células madre de la placenta similares a las embrionarias se acondiciona siendo expuesta un ' agente que suprime la diferenciación, por ejemplo, polipéptidos Delta-1 de -humano y Serrate-1 de humano, o combinaciones.de los .mismos, antes de ser agregada a, y mezclada en, una alícuota' de sangre del cordón . . , En otra modalidad, una alícuota (o población) de células madre de la placenta similares a las embrionarias no acondicionadas y una alícuota de sangre del cordón umbilical, se mezclan, y la población mezclada. de células se acondiciona antes de ser administrada a un paciente en necesidad de la misma. En las modalidades específicas, la ¦ población'' mezclada de células madre de la placenta similares a las . embrionarias y células de sangre del cordón umbilical, se acondicionan con un agente que induce o ?µ?G????e la diferenciación celular, como se discute arriba. * " En úna modalidad- específica, una población de células madre similares a las embrionarias de la invención se agrega a, o mezcla en, una población de células de sangre del cordón umbilical antes de la administración a un paciente en necesidad de la misma, en otra modalidad específica, una población de células madre similares a las embrionarias de la invención se agrega a, o se mezcla en, una población de células de la sangre del cordón umbilical durante, o simultáneamente con, la administración a un paciente en necesidad de la misma. En otra modalidad específica, una población de células madre similares a las embrionarias de la invención y una población de células de sangre del cordón umbilical se mezclan secuencialmente a un paciente en necesidad de la misma. En una modalidad, la población de células madre similares a las embrionarias se administra primero y la población de células., de sangre del cordón umbilical se administran en segundo lugar. En otra modalidad, la población de células de sangre del cordón umbilical se administra primero y la población de células madre de la placenta similares a las embrionarias se administra en segundo lugar. La población de células de sangre del cordón insertada con células madre similares a las embrionarias puede ser cultivada, inducida a propagarse, y/o inducida a diferenciarse bajo una variedad de condiciones, incluyendo pero no limitadas a, tratar las poblaciones insertadas mediante la introducción en el medio de. cultivo de nutrientes, hormonas, vitaminas, factores de crecimiento, o cualquier combinación de los mismos. Los factores de crecimiento son usuálmente proteína e incluye, pero no se limitan a: citosinas, limfocinas, interferonas, factores de estimulación de la colonia (CSF's), interferonas, quimiosinas, e interleucinas. Otros factores de crecimiento que pueden ser usados incluyen los factores de crecimiento hematopoyéticos .humanos recombinantes incluyendo ligandos, factores de células madre, trombopoeitina ( po) , factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF) , factor inhibidor de la leucemia. Factor de crecimiento de los fibroblastos básicos, factor de crecimiento derivado dé la placenta y factor de crecimiento epidérmico. En una modalidad, las poblaciones suplementadas se tratan con un factor de crecimiento para inducir la diferenciación en una variedad de tipos de células. En otra modalidad, las poblaciones insertadas se tratan con un factor de crecimiento para inducir la diferenciación en un tipo de células particular. En otra modalidad, las poblaciones suplementadas se tratan con un factor de crecimiento para prevenir o suprimir, la diferenciación en un tipo particular de células. En ciertas modalidades de la invención, los métodos para suplementar una población de sangre del cordón comprende (a) la inducción de la diferenciación de las células madre similares a las embrionarias, (b) . mezclar, las células madre similares a las embrionarias con una población de células de sangre del cordón y (c) administración de la mezcla a un paciente en necesidad de la misma. En otras modalidades de la invención, los métodos para suplementar una población de sangre del cordón comprende (a) mezclar las células madre similares a las embrionarias con una población de células- de sangre del cordón (b) inducción de la diferenciación de la mezcla de la , población insertada- de células de sangre del cordón y células madre similares a las embrionarias y (c) administración de la mezcla aun paciente en necesidad de la misma. En otras modalidades de la invención, los métodos para suplementar una población de sangre del cordón comprende' (á) administración de una mezcla de células de sangre del cordón suplementada con células madre similares a las embrionarias a un paciente en necesidad de la misma y (b) inducción de la diferenciación de la mezcla y (c) administración a un paciente en necesidad de la misma. En ciertas modalidades, las células madre o progenitoras se inducen a diferenciarse en un tipo de células particular, mediante exposición a un factor de crecimiento, de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica. En las modalidades específicas, el factor de crecimiento es: GM-CSF, IL-4, Flt3L, CD40L, IFN-alfa, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-2, IL-6, ácido retinoico, factor de crecimiento básico de los fibroblastos, TGF-beta-1, TGF-beta-3, factor de crecimiento de los hepatocitos, factor de crecimiento epidérmico, cardiotropina-1, angiotensinogenos, angiotensina I (AI), arígiotensina II (II), agonistas del receptor, AII AT2 -tipo 2, o análogos o fragmentos de los mismos. , En una modalidad, las células madre o progenitoras se inducen a diferenciarse en neuronas, de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante exposición a ß-mercaptoetanol o a- DMSO/hidroxianisol butilado, de 'acuerdo a los métodos descritos en la Sección 5.4.1.. En otra modalidad, las -células madre o progenitoras se inducen a diferenciar se en adipositos, de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica, mediante exposición dexametasona, indometacina, insulina e IBMX, de acuerdo a los métodos descritos en la Sección 5.4.2. En otra modalidad, las células madre o progenitoras se inducen a diferenciar se en condrocitos, de acuerdo a los métodos bien^ conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante exposición a TGF-.beta-3, de acuerdo a 'los métodos descritos en la Sección 5.4.3. En otra modalidad, las células madre o progenitoras se inducen a diferenciarse en osteocitos, de acuerdo de los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante exposición a la dexametasona, ácido-2-fosfato ascórbico y beta-glicerofosfato, de acuerdo a los métodos descritos en la Sección 5.4.4. En otra modalidad, las células madre o progenitoras se inducen a diferenciarse en hepatocitos, de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica,, por ejemplo, mediante exposición a IL-6+/-IL-15 , de acuerdo a los métodos, déscritos en la Sección 5.4.5. En otra modalidad, las células madre o progenitoras se inducen a diferenciarse en células pancreáticas, de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante exposición al' factor de crecimiento básico del fibroblasto, y el factor de crecimiento transformante , beta- 1 , de acuerdo a los métodos descritos en la Sección 5.4.6. En otra modalidad, las células madre o progenitoras se inducen a diferenciarse en células cardiacas, de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante exposición a ácido retinoico, factor de crecimiento básico del fibroblasto, TGF-beta-1 y factor de crecimiento epidérmico, mediante exposición a la cardiotropina-1 o mediante exposición a extracto de miocardio humano, de acuerdo a los métodos descritos en la Sección 5.4.7. embrionarias son estimuladas para producir moléculas bioactivas, tales como inmunoglobulinas, hormonas, enzimas. En otra modalidad, las células madre similares a las embrionarias se estimulan para proliferar, por. ejemplo, mediante administración de eritropoyetina , citocinas, limfocinas, interferonas , factores de estimulación de la colonia (GSF's), interferonas, quimosinas, interleucinas, factores de crecimiento hematopoyeticos humanos recombinantes incluyendo ligandos, factores de células madre, trombopoeitina (Tpo) , interleucinas, y' factor de crecimiento estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento. ' · . .· , En otra modalidad, las " células madre similares a las embrionarias son modificadas, genéticamente bien antes de, o después de la recolección a partir de la placenta, usando, por ejemplo, un vector viral -tal como un vector adenoviral o retroviral, o usando medios mecánicos tales como asimilación de ADN liposomica o,mediada químicamente". Un vector que contiene, un transgen puede , ser introducido en células de interés mediante los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, transíección, trarisformación, transducción, electroporación, infección, microinyección, fusión celular, DEAE dextran. · Precipitación de fosfato de calcio, liposomas, LIPOFECTIN™, fusión lisosomica, . lípidos catiónicos sintéticos, uso de una pistola genética o un transportador de vector de ADN, de modo que el trasgen es transmitido a las células hijas, por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias o células progenitoras hijas producidas por la división de células madre similares a las embrionarias. Para varias técnicas de transformación o transfección de células de mamífero, ver Keown et al., 1990, Methods Enzymol . 185 : 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Preferiblemente, el transgen es introducido usando cualquier técnica, siempre que no sea destructivo para la membrana nuclear de las células u otras estructuras celulares o genéticas existentes. En ciertas modalidades, el transgen se inserta en el material genético por microinyección . La microinyección de células y estructuras celulares se conoce y se practica comúnmente en la técnica. Para la transfección estable de células, de mamífero cultivadas, tales como las células madre similares a las embrionarias, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. La eficiencia de integración depende del vector y la técnica de transfección usada. Para identificar un integrante de selección, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para la resistencia a los antibióticos) se introduce generalmente en la células madre similares a las embrionarias junto con la secuencia del gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexate. La estabilidad de las células transfectadas con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas mediante selección de fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán) . Tales métodos son particularmente útiles en los métodos que involucran recombinación homologa en células de mamíferos (por ejemplo, en células madre similares a las embrionarias) entes de- la introducción o transplante de las células recombinantes en un sujeto o paciente. Un número de sistemas de selección puede, ser usado para seleccionar las células similares a las embrionarias hospederas, transformadas. En particular, el vector puede contener ciertos marcadores detectable so seleccionables. Otros métodos para la selección incluyen pero no se limitan a seleccionar otros marcadores tales' como: la timidina cinasa del virus de herpes simples (Wigles ef al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforrinosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc . Nati. Acad. Sci . EEUU 48:2026), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:827) los genes pueden ser empleados en células tk- , hgprt- o aprt-, respectivamente. También, pueden ser usada, la resistencia a los antimetabolitos como la" base de selección para los siguientes genes dhfr, el cual confiere resistencia al metotrexate (Wigler et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc." Nati. Acad. Sci. EEUU 78:1527); gpt , el cual confiere resistencia al ácido micofenolico (Mulligan' y Berg, 1981. Proc. Natl.; Acad. Sci. EEUU 78:2072); neo, el cual confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Colberre-Gerapin et al., ?981, J. Mol. Biol . 150:1) ; e hygro, el cual ' confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147) . El transgen puede integrarse en el genoma de las células de interés, preferiblemente mediante integración al azar. En otras modalidades, el transgen puede integrarse mediante un método directo, por ejemplo, mediante recombinación homologa directa (es decir, "introducción o extracción" de un gen de interés en el genoma de las células de interés) , Chappel, Patente Norteamericana No. 5,272,071; y la Publicación PCT No. WO 91/06667, publicada el 16 de mayo de 1991; Patente Norteamericana 5,627,059, Capecchi et al., publicada el 6 de mayo de 1997; Patente Norteamericana 5,487,992, Capecchi et al., publicada el 30 de enero de 1996) .

Los métodos para generar células que tienen el las modificaciones del gen. buscadas cómo objetivo a través de recombinación homologa se conocen en la técnica.. El constructo comprenderá al menos una porción de un gen de interés con una modificación genética deseada, e incluirá las regiones de homología para el locus objetivo, es decir, la copia endógena del gen buscado como objetivo en el genoma huésped. Los constructos de ADN .para la integración al azar, en contraste a aquellos usados para la recombinación homologa, no necesitan incluir las regiones de homología para mediar la recombinación. Los marcadores pueden · ser incluidos en el constructo buscado como objetivo o el constructo al azar para llevar a cabo la * selección positiva y negativa para la inserción del transgen. , Para crear una célula recombinante homologa, por ejemplo, células madre similares a las embrionarias, recombinantes homologas, las células endógenas o las células exógenas de la placenta se cultivan en la placenta; se prepara un vector recombinante homólogo ren -el ¦ cual un gen de interés esta flanqueado en sus extremos 5' y 3' "por secuencias del gen que son endógenas al genoma de las células buscadas como objetivo, para permitir que ocurra la recombinación · homologa entre el gen de interés , transportado por el vector y el gen endógeno en el genoma de las células buscadas como objetivo. Las secuencias de ácido nucleico de flanqueo adicionales son de longitud suficiente para la recombinación homologa exitosa con el gen endógeno en el genoma de las células buscadas como objetivo. Típicamente, varias, kilobases de ADN de flanqueo (tanto en el extremo -5' y 3') se incluyen en el vector. Los métodos para construir vectores de recombinación homologa y animales recombinantes homólogos pará recombinan células madre, se conocen de manera comú en la técnica (ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503; Bradley, 1991, Curr. Opin. Bio/Technol. 2:823-29; y las Publicaciones PCT Nos. WO 90/11354, WO 91/01140 y WO 93/04169. En una modalidad, el genoma de las células exógenas cultivadas en la placenta de acuerdo a los métodos de la invención, es un objetivo de la orientación de genes vía recombinación homologa o vía integración al azar. En una modalidad específica, los métodos de Bonadio et al., (Patente Norteamericana No. 5,942,496, titulada Methods and compositions for múltiple gene transfer into bone cells, publicada el 24 de agosto de 1999; y PCT WO 95/22611, titulada Methods and compositions for stimulating bone cell, publicada el 24 de agosto de 1995) se usan para introducir ácidos nucleicos en células de interés tales como células madre, células progenitoras o células, exógenas cultivadas en la placenta, por ejemplo, células progenitoras de hueso. 4.5. USOS DE LAS CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS Y LAS POBLACIONES DE CÉLULAS MADRE SUPLEMENTADAS Las células madre similares a las. embrionarias pueden ser obtenidas a partir de placentas inundadas de acuerdo a los métodos descritos en la solicitud para Estados Unidos copendiente No. 01/076,180, presentada el 13 de febrero del 2002 , Las células madre de placenta (células madre similares a las embrionarias) pueden ser inducidas a diferenciarse _ en ( un tipo de células particular, bien ,ex vivo o in _ vivc ,;," Por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias pluripotentes pueden ser inyectadas en un órgano dañado, y para la neogénesis del órgano y reparación · del daño in vivo.

Tal daño puede deberse a tales condiciones ' y trastornos que f ¦ ·' - · ' incluyen, pero no se limitan a, infarto al miocardio, trastorno epiléptico, esclerosis múltiple, apoplejía, hipotensión, paro cardiaco, isquemia, inflamación, perdida de la función cognoscitiva relacionada con ., el envejecimiento, daño por radiación, parálisis cerebral, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Leigh, demencia por SIDA, pérdida de la memoria, esclerosis lateral amiotropica, enfermedad renal isquémica, trauma del cerebro o de la médula ósea, derivación corazón-pulmón, glaucoma, isquemia de. la retina, o trauma de la retina . Las células madre similares a las embrionarias aisladas a partir de la placenta, aisladamente o en combinación con poblaciones de células madre o progenitoras (es decir, composiciones de células de la invención) pueden ser usadas, en modalidades específicas, en terapia de reemplazo de enzimas autologas o heterologas para tratar enfermedades o condiciones específicas, incluyendo, pero no limitadas a enfermedades de almacenamiento lisosomico, tales como los síndromes de Tay-Sachs, Niemann-Pick, de Fabri , de Gaucher, de Hunter y de Hurler, así como otras gangliosidosis , mucopolisacaridosis , y glicogenosis . En otras modalidades, las células madre similares a las embrionarias, aisladamente o en combinación . con las poblaciones de células madre o progenitoras, pueden ser usadas como portadores transgénicos autologos o heterologos en terapia génica para corregir errores congénitos del metabolismo. adrenoleucodistrofia, fibrosis quística, enfermedad de almacenamiento de glicógeno, hipotiroidismo, anemia de las células falciformes, síndrome de Pearson, enfermedad de Pompe, fenilcetonuria . (PKU) , porfirias, enfermedad de orina de jarabe de maple, homocistinuria, nosis de los mucopolisacaridós , enfermedad- granulomatosai crónica y tirosemia y enfermedad de Tay-Sachs o para tratar el cáncer, tumores u otras condiciones patológicas. En otras modalidades, las composiciones de células pueden ser usadas en la regeneración de tejidos autologos o heterologos o terapias o protocolos de reemplazo, incluyendo, pero no limitadas a, tratamiento de defectos epiteliales de la cornea, reparación de cartílago, dermabrasión facial, membranas mucosas, membranas timpánicas, revestimientos intestinales, estructuras neurológicas (por ejemplo, la retina, las neuronas auditivas en la membrana basilar, las neuronas olfativas en el epitelio olfativo), reparación de quemaduras y heridas por daños traumáticos de la piel, o para, la reparación de otros órganos o tejidos dañados o enfermos. Los grandes números de células madre similares a las embrionarias y/o progenitoras obtenidos usando los métodos . de; la invención deberían, en ciertas modalidades, reducir la necesidad de grandes donaciones de médula ósea. Aproximadamente 1 x 108 a 2 x 108. células mononucleares de médula ósea por kilogramo de peso del paciente deben ser implantadas para el injerto en un transplante de médula ósea (es decir, aproximadamente 70 mL de médula para un donador de 70 kg) . Para obtener 70 mL se requiere una donación intensiva y una pérdida de sangre significativa en el proceso de donación. En una' modalidad específica, las- células de una pequeña donación de médula ósea (por ejemplo, 7-10 mL) podrían ser expandidas mediante propagación en un birreactor de placenta antes del implante en un paciente. Además, un pequeño número de células madre y células progenitoras circulan normalmente en la corriente sanguínea. En otra modalidad, tales células madre exógenas o células progenitoras exógenas son recolectadas mediante aféresis, un procedimiento en el cual la sangre es substraída, uno o más componentes son removidos selectivamente, y el resto de la sangre es reinfundida en el donador. Las células exógenas recuperadas mediante aféresis son expandidas mediante propagación en un birreactor de placenta, eliminando por lo tanto completamente la necesidad de la donación de médula ósea. Mientras las células de la sangre se regeneran entre los tratamientos de quimioterapia, "sin embargo,' el cáncer» tiene? tiempo de crecer y se vuelve posiblemente más resistente a los fármacos de quimioterapia debido a la selección natural. Por lo tanto, mientras más prolongada se de la quimioterapia y más, corta la duración entre los tratamientos, mayores son las oportunidades de eliminar el cáncer. Para acortar el tiempo entre los tratamientos de quimioterapia, las células madre similares a las embrionarias o células progenitoras recolectadas dé acuerdo a' los métodos de la invención, aisladamente o en combinación con otras poblaciones de células madre o células progenitoras, podrían ser introducidas en el paciente. Tal tratamiento reduciría el tiempo en que el paciente exhibiría un conteo de células sanguíneas bajo, y permitiría por lo tanto la reanudación pronta del tratamiento de quimioterapia. Las células madre similares a las embrionarias, las células progenitoras, las células extrañas, o las células modificadas obtenidas a partir de una placenta de acuerdo a los métodos de la invención, aisladamente o en combinación con otras poblaciones de células madre o células progenitoras, pueden ser usadas en la fabricación de un tejido u. órgano in vivo. Los métodos de la invención abarcan usar las. células obtenidas a partir de la placenta, por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias, las células progenitoras o las células madre o progenitoras extrañas, para sembrar una matriz y para ser cultivadas bajo las- condiciones apropiadas para permitir a las células diferenciarse y poblar la matriz. Los tejidos y órganos obtenidos mediante los métodos de la invención pueden ser usados para una .variedad de propósitos, incluyendo propósitos de investigación y terapéuticos. Lás célulás madre similares a las embrionarias y las poblaciones suplementadas de células madre de la invención, pueden, ser usadas también para una amplia, variedad . de protocolos profilácticos o terapéuticos en los cuales un tejido u órgano del cuerpo es aumentado, reparado o reemplazado mediante el injerto, transplante o infusión de una población deseada de células, tales como una población de células madre o células progenitoras . Las células madre similares a las embrionarias y las poblaciones suplementadas de células madre de la invención, pueden ser usadas para reemplazar o aumentar los tejidos existentes, para introducir tejidos nuevos o alterados, o para unir otros tejidos o estructuras biológicas. Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células .madre suplementadas de la invención, pueden ser substituidas también por las células madre embrionarias en los protocolos terapéuticos descritos aquí, en los cuales, las células madre embrionarias serían usadas típicamente. En una modalidad preferida de la invención, las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células madre ' suplementadas pueden ser usadas como transplantes autologos y alogenicos, incluyendo transplantes hematopoyéticos compatibles e incompatibles del tipo HLA. De acuerdo con el uso de las células, madre similares a las embrionarias como transplantes hematopoyéticos alogenicos, puede ser necesario tratar el huésped para reducir el rechazo inmunológico de las células del donador, tales como aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,800,539, publicada el 1 de septiembre de 1998; y la Patente Norteamericana No. 5,806,529, publicada el 15 de septiembre de 1998, ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia. Por ejemplo, las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células madre suplementadas de la invención, pueden ser usadas para protocolos terapéuticos de transplante, por ejemplo, para aumentar o reemplazar las células madre o las células progenitoras del' hígado, páncreas, riñon, pulmón, sistema nervioso, sistema muscular/ hueso,' médula ósea, timo, baso, te ido mucoso, gónadas, ? cabello. Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células madre suplementadas pueden * ser usadas en lugar de las clases /específicas de células progenitoras (por ejemplo, condrocitos , hepatocitos ,* células hematopoyéticas , células parenquimales 'pancreáticas, neuroblastos, células progenitoras musculares, etc.) en protocolos terapéuticos o de , investigación en los cuales las células progenitoras serian usadas típicamente'. Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células madre suplementadas- de la invención, pueden ser usadas para el aumento,, reparación o reemplazo de cartílago, tendones, o ligamentos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, las prótesis (por ejemplo, las , prótesis de, la cadera) son revestidas con constructos de tejido cartilaginoso de reemplazo cultivados a partir de las células madre similares a las embrionarias de la invención. En otras modalidades, las articulaciones (por ejemplo, de la rodilla) se reconstruyen con constructos de tejido cartilaginoso cultivados a partir de células madre similares a las embrionarias. Los constructos de tejido cartilaginoso pueden ser empleados también en cirugía reconstructiva mayor para diferentes tipos de articulaciones (para protocolos, ver, por ejemplo, Resnick, D., y Niwayama, G. , eds . , 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d ed. , W.B. Saunders Co.) . Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células madre suplementadas de la invención pueden ser usadas para reparar los tej idos y órganos dañados que resultan de traumas, trastornos metabólicos, o enfermedades. En tal modalidad, pueden ser administradas a un paciente las células madre similares a las embrionarias, de manera aislada o combinadas con otras poblaciones de células madre o progenitoras , para régenerar o restablecer los tejidos u órganos los cuales han sido dañados como consecuencia de enfermedades, por ejemplo, mejorar el sistema inmune enseguida de la quimioterapia o radiación, reparar el tejido cardiaco enseguida del infarto al miocardio. Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células madre suplementadas de la invención, pueden ser usadas para aumentar ó reemplazar las células de la médula ósea en transplantes de médula ósea. Los transplantes de médula ósea autologa y alogénica humana se usan como terapias para enfermedades tales como leucemia, linfoma y otros trastornos que ponen la vida- en peligro. La desventaja de estos procedimientos, sin embargo, es que debe ser removida una gran cantidad de médula ósea del donador para asegurar que existen suficientes células para el injerto. Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células madre suplementadas de la invención, pueden proporcionar células madre' y células progenitoras que reducirían la necesidad de grandes donaciones de médula ósea. Sería posible también, de acuerdo a los métodos de la invención, obtener . una pequeña donación y después expandir el número de células .madre y de células progenitoras, cultivándolas y expandiéndolas en la placenta antes de la infusión o transplante en un recipiente. Las poblaciones de células madre similares á las embrionarias y de células madres suplementadas de la invención pueden ser usadas, en modalidades específicas, en terapia de reemplazo de enzimas autologas o heterologas para tratar enfermedades o condiciones específicas, incluyendo, pero no limitadas a enfermedades dé almacenamiento lisosomico, tales como los síndromes de Tay-Sachs, Niemann-Pick, de Fabry, de Gaucher, de Hunter, de Hurlér, así como otras gangliosidosis , mucopolisacaridosis , y glicogenosis . En otras modalidades, las células pueden ser usadas como portadores de transgenes autologos y heterologos en la terapia génica, para corregir errores congénitos del metabolismo, tales como adrenoleucodistrofia, fibrosis quística,' enfermedad de almacenamiento de glicógeno, hipotiroidismo, anemia de- las células falciformes, síndrome de Pearson, enfermedad de Pompe, fenilcetonuria (PKU) , y enfermedad "de Tay-Sachs, porfirias, enfermedad de orina de jarabe de maple, homocistinuria, nosis de mucopolipsacaridos , enfermedad granulomátosa crónica, y tirosemia, o para tratar el cáncer, . tumores u otras condiciones patológicas o neoplásicas ., En otras modalidades, las células pueden' ser usadas en terapias o protocolos de regeneración o reemplazo de tejidos autologos o heterologos, incluyendo, pero no limitados a, tratamiento de defectos epiteliales de la cornea, reparación de cartílago, dermabrasión facial, membranas mucosas, membranas timpánicas, revestimientos intestinales, estructuras neurológicas (por ejemplo, la retina, las neuronas aditivas en la membrana basilar, neuronas .olfativas en el epitelio olfativo) , reparación de quemaduras y heridas por daños traumáticos de la "piel, * transplante de cuero cabelludo (cabello), o para la reconstrucción de otros órganos o tejidos dañados o enfermos . Los grandes números de células madre similares a las embrionarias yo progenitoras obtenidos usando los métodos de la invención, reducirían, en ciertas modalidades, la necesidad de grandes donaciones de médula ósea. Aproximadamente 1 x 108 a 2 x 108 células mononucleares de médula ósea por kilogramo de peso del paciente deben ser infundidas ' para el injerto en un transplante · de médula ósea (es- decir, aproximadamente 70 mL de médula .para un donador de 70 kg) . En una modalidad específica, las células de una pequeña donación de médula ósea (por ejemplo, 7-10 mL) podrían ser expandidas mediante propagación en un birreáctor de placenta antes de la infusión en un paciente. En otra., modalidad, las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de- células madre suplementadas de la invención pueden ser usadas en un tratamiento suplementario además de la quimioterapia. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos usados para buscar y destruir las células cancerosas actúan eliminando todas las células proliferantes, es decir, las células que pasan por la división celular. Como la médula ósea es uno de los tejidos más activamente proliferantes en el ¦¦ cuerpo, las células madre hematopoyéticas son dañadas o destruidas con frecuencia . por los agentes quimioterapéuticos y en consecuencia, la producción de células sanguíneas disminuye o decrece. La quimioterapia debe ser terminada a intervalos que permitan al sistema . hematopoyético del paciente reabastecer el suministro de células sanguíneas antes de reiniciar la quimioterapia. Pueden . tomar un mes o más para que las células madre antiguamente inactivas, proliferen e incrementen el conteo de células sanguíneas blancas a niveles aceptables de modo que la quimioterapia puede reiniciarse (cuando otra vez, las células madre de la médula ósea son destruidas) . , ¦ Las células sanguíneas blancas se regeneran entre los tratamientos de quimioterapia, sin embrago, el cáncer . tienen tiempo de crecer y posiblemente se vuelve más resistente a los f rmacos quimioterapéuticos debido a la selección natural . Por lo tanto, mientras más prolongada se de la quimioterapia y más corta la duración entre los tratamientos, más grandes las posibilidades de eliminar exitosamente el cáncer. Para acortar el tiempo entre los tratamientos quimioterapéuticos, las células madre similares a las embrionarias o las células progenitoras recolectadas de acuerdo a los métodos de la invención podrían ser introducidas en el paciente. Tales tratamientos reducirían el tiempo en que el paciente exhibiría un conteo bajo de células sanguíneas, y permitiría por lo tanto la reanudación del tratamiento quimioterapéutico. En otra modalidad, las células madre de la placenta humana pueden ser usadas para tratar o prevenir enfermedades genéticas, tales como enfermedad granulomatosa crónica. 4.6. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS La presente invención abarca las composiciones farmacéuticas las cuales comprenden. las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células madre suplementadas de la invención. La presente invención abarca las composiciones farmacéuticas que comprenden una dosis y/o varias dosis efectivas por la administración individual o múltiple, antes de o enseguida del transplante de las células madre progenitoras humanas acondicionadas o no acondicionadas-, que son capaces de ejercer un efecto suficiente para inhibir, modular y/o regular la diferenciación de : células madre progenitoras pluripotentes ' y multipotentes de origen placentario en uno o más linajes celulares, por ejemplo, los linajes celulares mesodérmico, adiposo, . condrocitico, osteocitico, miocitico, vascular, néural , ¦· ' endotelial, hepático, renal, pancreático y/o hematopoyético . De acuerdo con esta modalidad, las -poblaciones de células madre similares · a las embrionarias y de células madre suplementadas de la invención pueden ser . formuladas como un inyectable (por ejemplo, PCT WO 96/39101, incorporado aquí como referencia en su "totalidad) . En _ una modalidad alternativa, las células y tejidos de la presente invención pueden ser formuladas usando hidrogeles polimerizables o reticulantes como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,709,854; 5,516,532; 5,654,381; cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Las células madre similares a las embrionarias pueden ser administradas como se obtienen de la placenta, o pueden ser insertadas en la sangre del cordón umbilical y administradas como una composición de células mezcladas, o pueden ser colocadas en cualquier amortiguador o fluido fisiológicamente aceptable para un individuo. La invención abarca también las composiciones farmacéuticas que tienen altas concentraciones (o poblaciones mayores) de células madre similares a las embrionarias homogéneas, en donde una o más de estas poblaciones de células puede ser usada con, o como una mezcla con, otras células madre o progenitoras ,. para usarse en transplantes y otros usos. Otras células madre o progenitoras pueden incluir peró no se limitan a: células madre adipogénicas , condrogénicas , osteogénicas , hematopoyéticas , miogénicas, vasogénicas, neurogénicas , y hepatogénicas ; células madre mesenquimales , células del tejido adherente, células endoteliales , hepatocitos, queratinocitos , y células madre o progenitoras para un tipo particular de células, tejidos u órganos, incluyendo pero no limitados a neuronas, mielina, músculos, sangre, médula ósea, piel, corazón, tejido conectivo, pulmón, riñon, hígado, y páncreas (por ejemplo, células de las isletás pancreáticas) . En una modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que tienen altas concentraciones (o poblaciones mayores) de células madre hematopoyéticas homogéneas incluyendo pero no limitadas a células CD34+/CD38-; y células CD34-/CD38-. Una o más de estas poblaciones celulares pude ser usada con, o como una mezcla con, otras células madre, para usarse en transplantes y otros usos. En una modalidad específica, la composición farmacéutica comprende células madre de la placenta similares a las embrionarias' de la invención y células hematopoyéticas de sangre del cordón, es decir,, células hematopoyéticas CD34+/CD38+. Una o más de estas poblaciones celulares pueden ser usadas con o como una · mezcla con células hematopoyéticas de sangre del cordón, es decir, células hematopoyéticas CD34+/CD38+ para transplantes y otos usos. En una modalidad, la invención proporciona poblaciones heterogéneas de células con núcleo que comprende células madre de . la placenta similares a las embrionarias. En ciertas modalidades, se prefiere una población heterogénea de células con "núcleo (en lugar de una población pura de células madre de la placenta similares a las embrionarias de células CD34+) .

En otra modalidad, la invención proporciona una población mezclada de células (por ejemplo, células de sangre del cordón y células madre de la placenta similares a las embrionarias) . La población de células mezcladas puede ser congelada o no congelada. Tal población mezclada puede ser almacenada y/o usada en un recipiente, por ejemplo, una bolsa o una jeringa.

En otra modalidad, la invención proporciona dos o más poblaciones separadas o distintas de diferentes tipos de células (por ejemplo, células sanguíneas y células madre de la placenta similares a las embrionarias) . Cada población separada puede ser almacenada y/o usada en un recipiente separado, por ejemplo, una bolsa (por ejemplo, la bolsa de almacenamiento de sangre de Baxter, Becton-Dickinson," Medcep, Nacional Hospital Products o Terumo) o una jeringa, la cual contiene un sólo tipo de · células "o población^ de; células. En ciertos aspectos de esta modalidad, la invención proporciona recipientes separados para diferentes tipos de células a ser mezclados antes de la administración. Tales células pueden estar no congeladas o congeladas. En una modalidad específica, las células de. sangre del cordón están contenidas en una bolsa y las células madre de la placenta similares a las embrionarias están contenidas en una segunda bolsa. En otra modalidad, la invención proporciona células madre de la placenta similares a las embrionarias que son "acondicionadas" antes de la congelación. En otra modalidad, una población de células incluyendo, pero no limitadas a células madre de la placenta similares a las embrionarias, pueden ser acondicionadas mediante la remoción de las células sanguíneas rojas y/o- los granulocitos, de acuerdo a los métodos estándar, de modo que resta una población de células con núcleo que esta enriquecida por células madre de la placenta similares a las embrionarias. Tal población enriquecidas de células madre de la placenta similares a las embrionarias puede ser usada sin congelar, o congelada para el uso posterior. Si la población de células deberá ser congelada, un criopreservativo (por ejemplo, DMSO, glicerol, Medio de Congelamiento de Células Epilife™ (Cascade Biologics) ) se agrega a la población enriquecida de células antes su congelación. En otra modalidad, una población de células incluyendo, pero no limitadas a, células madre de la placenta similares a las embrionarias puede ser acondicionada mediante la remoción de las células sanguíneas rojas y/o los granulocitos después de que ha sido congelada y descongelada. De acuerdo a la invención, los agentes que inducen la diferenciación celular pueden ser usados para acondicionar una población de células madre similares a las embrionarias. En ciertas modalidades, un agente que induce la diferenciación puede ser agregado a una población de células dentro de un recipiente, incluyendo pero no limitados a, Ca2+, EGF, OÍ-FGF, ß-FGF, PDGF, factor de crecimiento de ceratinocitos (KGF) , TGF-ß, citosinas (por ejemplo, IL-la, IL-?ß, IFN-?, TFN) , ácido retinoico, transferrina, hormonas (por ejemplo, andrógenos, estrógenos, insulina', prolactina, triyodotironina, hidrocortisona, dexametasona) , butirato de sodio, TPA, DMSO, NMF, DMF, elementos de matriz (por ejemplo, colágeno, laminina, sulfato de heparan, Matrigel™) , o combinaciones de los mismos . En otra modalidad, los agentes que suprimen la diferenciación celular pueden ser agregados a una población de células madre similares a las embrionarias. En ciertas modalidades, un agente que suprime la diferenciación celular puede ser agregado a una población de células dentro de un recipiente, incluyendo, pero no limitados a, polipéptidos Delta-1 de humano y Sérrate-1 de humano (Ver Sakano et al., Patente Norteamericana No. 6,337,387 titulada "Differentiation-suppresive polypeptide" , expedida el 8 de enero del 2002) , factor inhibidor de la leucemia (LIF) , factor de células madre, o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, una o más poblaciones de células madre similares a las embrionarias son administradas a un paciente en necesidad de las mismas. En ciertas modalidades, dos o más poblaciones de células frescas (nunca congeladas) se administran desde a partir desde un recipiente .o sistema de administración individual. En otra modalidad, dos o más poblaciones de células congeladas y descongeladas se administran desde un recipiente' individual o sistema de administración individual. En otra modalidad, cada una de las .poblaciones de células frescas (nunca congeladas) se transfieren a, y se administran. desde, un contenedor individual o sistema de administración individual. En otra modalidad, cada una de , las dos o más poblaciones de células congeladas y descongeladas se transfiere a, y se administra desde, un recipiente individual o sistema de administración individuál . En otro aspecto de estas modalidades, cada población se administra desde una diferente bolsa de infusión IV (por ejemplo, de Baxter,. Becton-Dickinson, Medcep, National . Hospital Products ' o Terumo) . Los contenidos de cada recipiente (por ejemplo, una bolsa de infusión IV) pueden ser administrados via un sistema de administración separado, o cada recipiente puede ser "realizada a cuestas" de modo que sus contenidos se combinen o mezclen antes de la administración desde un sistema de administración individual. Por ejemplo, las dos o más poblaciones de células pueden ser alimentadas a y/o mezcladas dentro de una línea de flujo común (por ejemplo, tubería) , o pueden ser alimentadas y/o mezcladas dentro de un recipiente común (por ejemplo, una cámara o bolsa) . De acuerdo a la invención, las dos o más poblaciones de células pueden ser combinadas antes de la administración, durante o en la administración o entrega, simultáneamente. En una modalidad, un mínimo de 1.7 x 107 células con núcleo/kg se administran a un paciente en necesidad de las mismas. Preferiblemente, al menos 2.5 x 107 células con núcleo/ kg se administran a un paciente en necesidad de las mismas . En una modalidad, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto, que comprende, administrar a un sujeto en el cual se desea tal tratamiento prevención, una cantidad terapéuticamente efectiva de las poblaciones de células madre similares a las embrionarias, o de células suplementadas . En ótra modalidad, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto, que comprende, administrar a un sujeto en el cual se desea tal tratamiento o prevención, una cantidad terapéuticamente efectiva de las células madre similares a las embrionarias de la invención. - , ' Se espera que las células madre similares a las embrionarias de la invención tengan un efecto antiinflamatorio cuando se administran a un individuo que experimenta inflamación. En una modalidad preferida, las poblaciones de células madre o de células suplementarias de la invención pueden ser usadas para tratar cualquier enfermedad, condición o trastorno que resulta de, o asociados con, la inflamación. La inflamación puede estar presente en cualquier órgano o tejido, por ejemplo, los músculos; el sistema nervioso, incluyendo el cerebro, la médula espinal y el sistema nervioso periférico^ los tejidos vasculares, incluyendo el tejido cardiaco; el páncreas; los intestinos o otros órganos del tracto digestivo; pulmones, hígado, órganos reproductores; tejido endotelial, o tejido endodérmico. Las poblaciones de células madre similarés a las embrionarias o las de células suplementadas de la invención, pueden ser usadas para tratar trastornos relacionados con el sistema autoinmune o inmune, incluyendo aquellos asociados con la inflamación. Por lo tanto, ciertas modalidades de la invención proporcionan un método para tratar un individuo que tiene una enfermedad o condición autoinmune, que comprende administrar a tal individuo, una cantidad terapéuticamente efectiva de las poblaciones de células o ' de células suplementadas de la invención, ' en' donde, dicha enfermedad o trastorno puede ser, pero no se limita a, diabetes, esclerosis lateral amilotropica, miastenia gravis, neuropatía diabética o lupus. En las modalidades relacionadas, las poblaciones de células madre similares a las embrionarias o de células suplementadas de la invención, pueden ser usadas para tratar trastornos relacionados con la · inmunidad, tales como alergias crónicas o agudas. En ciertas modalidades, la enfermedad ? trastorno incluye, pero no se limita a, cualquiera de las enfermedades o trastornos descritos aquí, incluyendo', pero no ¦ limitados a anemia aplástica, mielodisplasia, infarto al miocardio, trastorno epiléptico, esclerosis múltiple, apoplejía, hipotensión, paro cardiaco, isquemia, inflamación, perdida de la función cognoscitiva relacionada con el envejecimiento, daño por radiación, parálisis cerebral, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad- de Parkinson, enfermedad de Leigh, demencia por SIDA, perdida 'de la memoria, esclerosis lateral amilotropica (ALS) , enfermedad renal isquémica, trauma del cerebro o de la médula espinal, derivación .corazón-pulmón, glaucoma, isquemia de la retina, trauma de la retina, enfermedades por almacenamiento lisosomico, tales como los síndromes de Tay-Sachs, Niemann-Pick, de Fabry, de Gaucher, de Hunter y de Hurler, así como otras gangliosidosis, mucopolisacaridosis, . glicogenosis , errores congénitos del metabolismo, adrenoleucodistrofia. fibrosis quística, enfermedad por almacenamiento de glicógeno, hipotiroidismo, anemia de las células falciformes, síndrome de Pearson, enfermedad de Pompe, fenilcetonuria (PKU) , porfirias, enfermedad de orina de jarabe de maple, homocistinuria, nosis de mucopolisacaridos, enfermedad granulomatosa crónica y tirosinemia, enfermedad de Tay-Sachs, cáncer, tumores u otras condiciones patológicas o neoplásicas. En otras modalidades, las células pueden ser usadas en el tratamiento de cualquier tipo de daño debido a trauma, particularmente trauma que involucra inflamación. Los ejemplos de tales condiciones relacionadas con el trauma, , incluyen daños al sistema nervioso central (CNS), incluyendo daños al cerebro, a la medula espinal, o al tejido que rodea el CNS, daños al sistema nervioso periférico (PNS) ,- o daños a cualquier otra parte del cuerpo. Tales traumas pueden ser causados por accidentes, o pueden ser una consecuencia normal o anormal de un procedimiento medico tal como cirugía o angioplastia . El trauma puede estar relacionado con . una ruptura u oclusión de un vaso sanguíneo, por ejemplo, en apoplejías o flebitis. En las modalidades específicas, las células pueden ser usadas en terapias ¦ o protocolos de regeneración o reemplazo de tejidos autologos o heterologos, incluyendo, pero no limitados a, tratamiento de defectos epiteliales de la cornea, reparación de cartílago, dermabrasión facial, las membranas mucosas, las membranas timpánicas, los revestimientos intestinales, las estructuras neurológicas (por ejemplo, la retina, las neuronas auditivas en la membrana basilar, las neuronas olfativas en el epitelio olfativo) , reparación de quemaduras o heridas por daños traumáticos de la piel, o para la reconstrucción de otros órganos o tejidos dañados o enfermos. En una modalidad específica, la enfermedad o trastorno es anemia aplástica, mielodisplasia, leucemia, un trastorno de la médula ósea o una enfermedad o trastorno hematopoyético . En otra modalidad específica, el sujeto es un humano. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad, un trastorno o condición asociada con o resultado de -la inflamación. En otras modalidades, la invención proporciona un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad, trastorno o condición, neurologica. En una modalidad más específica, dicha enfermedad neurologica es ALS . En una modalidad más específica, dicha enfermedad neurologica es la enfermedad de Parkinson. En otra modalidad específica, dicha enfermedad es una enfermedad vascular o cardiovascular. En una modalidad más específica, dicha enfermedad es ateroesclerosis . En otra modalidad específica, dicha enfermedad es diabetes. En una modalidad específica, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una alícuota de sangre del cordón umbilical a la cual han sido agregadas células madre de la placenta similares a las embrionarias, como se describe arriba en la Sección 4.4. Un número de células madre similares a las embrionarias, o de poblaciones de células . suplementadas , administradas . una vez, son capaces de injertarse en el huésped, formando "colonias" a largo plazo. Esto resulta en un huésped que es esencialmente quimérico . Ya que las quimeras en otros contextos genéticos son generalmente más vigorosas y elásticas, se espera que tal quimeri-smo mejore la salud y el bienestar del huésped. Como tal, las células madre similares a las embrionarias pueden seír administradas no solamente a un individuo que sufre de una enfermedad, trastorno o condición específica, sino que pueden ser administradas a un individuo para incrementar la salud global y el bienestar del individuo.

Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias o de células' suplementadas de la invención, pueden ser tratadas antes de la administración a un individuo, con los compuestos que modulan la actividad de la TÑF-ot. Tales compuestos se describen en detalle en la Solicitud Provisional para los Estados Unidos copendiente No. 60/372,348, presentada el 12 de abril de 2002, la cual descripción se incorpora aquí en su totalidad. Los compuestos preferidos se conocen como IMiDs y SelCids, y los compuestos particularmente preferidos están disponibles bajo los nombres comerciales Actimid™ y Revimid™. Un aspecto particularmente útil de las células madre similares a las embrionarias de la invención es que, en ciertas modalidades, no existe la necesidad de tipo HLA las células antes de la administración. En otras palabras, las células madre similares a las embrionarias pueden ser tomadas de un donador heterologo, o una pluralidad de donadores heterologos, y transplantadas a un individuo en necesidad de tales células, y las células transplantadas permanecerán dentro del huésped indefinidamente. Esta eliminación de la necesidad de tipología HLA facilita en gran medida tanto el procedimiento de trasplante en si y la identificación de donadores para el transplante. Sin embargo, poblaciones de células madre similares a las embrionarias o de células suplementadas que las contienen pueden ser comparadas por HLA (donador a receptor) antes de la administración. Los inventores han descubierto que la eficacia para tratar a un individuo con las poblaciones de células madre similares a las embrionarias o de células suplementadas se mejora si estas células son preacondicionadas . El preacondicionamiento ' comprende almacenar las células en un recipiente permeable a los gases por un periodo de tiempo a aproximadamente -5 a 23°C, 0-10 IC, o preferiblemente 4-5°C. El periodo de tiempo puede estar entre 18 horas y 21 días, entre 48 horas y 10 días, y está preferiblemente entre 3-5 días. Las células pueden ser criopreservadas antes de preacondicionamiento o, preferiblemente se preacondicionan inmediatamente antes de la administración. Por lo tanto, en una modalidad, la invención proporciona un método para tratar a un individuo que comprende, administrar a dicho individuo las células madre similares a las embrionarias recolectadas a partir de al menos un donador. "Donador" como se usa aquí, significa un adulto, niño, infante o, preferiblemente una placenta. En otra modalidad preferida, el método comprende, administrar a dicho individuo, las células madre similares a las embrionarias que · son recolectadas de una pluralidad de donadores y seleccionadas. En una modalidad específica, dichas células madre similares a las embrionarias son células madre tomadas de una pluralidad de donadores. Cuando se recolectan de múltiples donadores, las unidades de dosificación, donde una "unidad de dosificación" es una recolección de un sólo donador, pueden ser seleccionadas antes de la administración, pueden ser administradas secuencialmente , o pueden ser' administradas alternadamente. En otra modalidad del método, . dichas células madre similares a las embrionarias se mezclan con, o "spiked" en sangre del cordón umbilical, y la mezcla se administra a un individuo. En modalidades más específicas del método, la relación de células madre similares a las embrionarias a sangre del cordón puede ser al menos 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30 u 80:20, por número de células con núcleo totales. 4.7. ADMINISTRACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE: DOSIFICACIONES.

Un aspecto particularmente útil de la invención es la administración de altas dosis de células madre a un individuo'; tales números de células son significativamente más efectivos que el material (por ej emplo, , médula ósea o sangre del cordón) del cual se derivaron. En- este contexto "dosis altas" indica 5, 10, 15 o 25 o más veces . el. número de células' con -núcleo totales. Incluyendo las células madre, particularmente las células madre similares a las embrionarias, que serían administradas, por ejemplo, en un transplante de médula ósea. Típicamente, un paciente que recibe una infusión de células madre, por ejemplo, para un transplante de médula usa, recibe una unidad de células, donde una unidad es aproximadamente 1 x 109 células con núcleo (correspondientes a 1-2 x 10a células madre). Para terapias de dosis altas, por lo tanto, deberían administrarse a un paciente 3 billones, 5 billones, 10 billones, 15 billones, 20 billones, 30 billones, 40 billones 50 billones o más, o alternativamente 3, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 unidades o más, de células con núcleo totales, bien de células madre similares a las embrionarias solas, o células madre similares a las embrionarias insertadas en otra población de células madre o progenitoras (por ejemplo, células madre similares a las embrionarias insertadas en sangre del cordón umbilical. En una modalidad preferida, por ejemplo, se dan a un individuo 15 unidades de sangre del cordón insertada, donde la unidad contiene aproximadamente 750 millones de células del cordón y 500 millones de células madre similares a las embrionarias . Por lo tanto, en una modalidad, el número de células madre con núcleo administradas a un individuo es al menos cinco veces el número de células administradas normalmente en un reemplazo de médula ósea. En otra modalidad específica del método, el número de células con núcleo administradas a un individuo, es al menos diez veces el número de células administradas normalmente en un reemplazo de médula ósea. En otra modalidad especifica del método, el número de células con núcleo administrado a un individuo es al menos quince veces el número de células administrado normalmente en un reemplazo de médula ósea. En otra modálidad del método, el número total de células con núcleo, el cual incluye las células, madre, administrado a un individuo, está entre 1-100 x 108 por kilogramo de peso corporal . En otra modalidad, el número de células con núcleo totales administrado, es al menos 5 billones de células. En otra modalidad, el numero total de células con núcleo administradas, es al menos 15 billones de células. En otra modalidad del método, dichas células madre similares a las embrionarias y dicha sangre del cordón se mezclan inmediatamente antes de (es decir, en cuestión de cinco minutos) la administración a dicho individuo. En otra modalidad, dichas células madre similares a las embrionarias y dicha sangre del cordón se mezclan en un punto de tiempo mayor que cinco minutos antes de la administración a dicho individuo . En otra modalidad del . método, las células madre embrionarias son criopreservadas y descongeladas antes de la administración a dicho individuo. En otra modalidad, dichas células madre similares a las embrionarias y dicha sangre, del cordón, se mezclan para formar una población de células suplementadas en un punto de tiempo' mayor que veinticuatro horas antes de la administración a dicho individuo, en donde dicha población de células suplementadas ha sido criopreservada y descongelada antes de de dicha administración. En otra modalidad, dichas células madre similares a las embrionarias y/o poblaciones de células suplementadas pueden ser administradas más de una vez. En otra modalidad, dichas células madre similares a las embrionarias y/o dichas poblaciones de células suplementadas se preacondicionan mediante almacenamiento desde entre 18 horas y 21 días antes de la administración. En una modalidad más específica, las células se preacondicionan por 48 horas a 10 días, antes de la administración. En una modalidad específica, dichas células se preacondicionan por 3-5 días antes del transplante. En una modalidad preferida de cualquiera de los métodos de aquí, dichas células madre similares a las embrionarias no son tipos HLA- antes de la administración a un individuo. En otra modalidad específica del método, dichas células madre similares a las embrionarias son sobre todo (es decir, >50%) células CD34+. En una modalidad más específica del método, dichas células madre similares a las embrionarias son ante todo células madre CD34+33+. El tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo, con las poblaciones de células madre similares a las embrionarias o de células suplementadas que las contienen, puede ser considerado eficaz si la enfermedad, trastorno o condición se mejora mesurablemente en cualquier manera. Tal mejora puede ser mostrada por un número de indicadores. Los indicadores mesurables incluyen, por ejemplo, cambios detectables en una condición fisiológica o conjunto de condiciones fisiológicas asociadas con. una enfermedad, trastorno o condición particular (incluyendo, pero no limitadas a, presión sanguínea, velocidad del corazón, velocidad respiratoria, conteos de varios tipos de células sanguíneas, niveles en la sangre de ciertas proteínas, carbohidratos, lípidos o citosinas o la modulación en la expresión de los marcadores genéticos asociados con la enfermedad, trastorno o condición) . El tratamiento de un individuo con las poblaciones de células madre o de células suplementadas de la invención, sería considerado efectivo si cualquiera de tales indicadores responde a tal tratamiento, cambiando a un valor que esta dentro, o más cercano, al valor normal. El valor normal puede ser establecido por lo rangos normales que son conocidos en la técnica para varios indicadores, o mediante la comparación con tales valores en un control. En la ciencia media, la eficacia de un tratamiento se caracteriza también frecuentemente en términos de las impresiones del individuo y el sentimiento subjetivo del estado de salud del individuo. Las mejoras, por lo tanto, pueden ser caracterizadas también por indicadores subjetivos, tales como el sentimiento subjetivo del individuo de la mejoría, bienestar aumentado, estado de salud incrementado, nivel de energía mejorado, o los similares, después de la administración de las poblaciones de células madre o . de células suplementadas" de la invención. Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias y de células suplementadas de la invención, pueden ' ser administradas a un paciente en cualquier manera farmacéuticamente o médicamente aceptable, incluyendo mediante inyección o transfusión. Las poblaciones de células o células suplementadas pueden ser contenidas, o estar contenidas en cualquier portador farmacéuticamente aceptable (Ver, la Sección 4.8). Las poblaciones de células madre similares a las embrionarias o de células suplementadas, pueden ser llevadas, almacenadas o transportadas en' cualquier contenedor farmacéuticamente o médicamente aceptable, por ejemplo, una bolsa de sangre, bolsa de transferencia, tubo de plástico o frasco . 4.8. EQUIPOS La invención proporciona también un paquete o equipo que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociado con tal (es) ' recipientes pueden estar: un aparato para el cultivo de células, uno o más recipientes llenados con un medio de cultivo de células o uno o más componentes de un medio de cultivo de células, un aparato para usarse en la administración de las composiciones de la invención, por ejemplo, un aparato para la inyección intravenosa de las composiciones de la invención, y/o un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de los productos farmacéuticos o biológicos, el cual aviso refleja la aprobación por la agencia, de la fabricación el uso o venta para administración humana. En una modalidad específica, el equipo comprende uno o más recipientes llenados con las células madre similares a las embrionarias de la invención, y uno o más recipientes diferentes : llenados con célula madre, por ejemplo, sangre del cordón umbilical, como se discute arriba. En una modalidad, · el equipo comprende una mezcla de células madre, por ejemplo, células de sangre de cordón, suplementadas con las células madre similares. a las embrionarias contenidas dentro de una bolsa o recipiente. En otra modalidad, el equipo comprende" una población de células de sangre del cordón y una población de las células madre similares a las embrionarias que están contenidas dentro de dos bolsas o recipientes separados. En ciertas modalidades, el equipo comprende una composición de "dos bolsas" en donde la bolsa que contiene las células de sangre del cordón y la bolsa que contiene las células madre similares a las embrionarias se mezclan antes de, o en "el momento de, la administración a un paciente en necesidad de las mismas. En otras modalidad, el equipo comprende una población de células de sangre del cordón y una población de células madre similares a las embrionarias que están contenidas dentro de dos bolsas o recipientes separados y que se administran de manera separada (por ejemplo, simultáneamente o secuencialmente) a un paciente, en donde el mezclado de las dos poblaciones de células ocurre in vivo . En otra modalidad, el equipo proporciona una población de células de sangre del. cordón y una población de células madre similares a las embrionarias que se mezclan físicamente antes de la administración. En otro aspecto de esta modalidad, el equipo comprende un recipiente que contiene un factor de crecimiento, por ejemplo, GM-CSF, IL-4, Flt3L, CD40L, IFN-alfa, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-2, IL-6, ácido retinoico, factor de crecimiento básico del fibroblasto, TGF-beta-1, TGF-beta-3, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento epidérmico, cardiotropina-1 , angiotensinogeno, angiotensina I (AI), angiotensina II (AII) , agonistas del receptor AII AT2 tipo 2, o análogo o fragmentos de los mismos. En otro aspecto de esta modalidad, las dos poblaciones se mezclan físicamente y después se tratan con el factor de crecimiento comprendido en el equipo, para inducir la diferenciación celular, antes de la administración al paciente. En otro aspecto de esta modalidad, las células de sangre del cordón y/o las células madre similares a las embrionarias se tratan con el factor de crecimiento comprendido en el equipo, para inducir la diferenciación celular y después se mezclan físicamente antes de la administración al paciente. Los siguientes ejemplos experimentales se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. . 5. EJEMPLOS 5.1 EJEMPLO 1: ANÁLISIS DE LOS TIPOS DE CÉLULAS RECUPERADOS A PARTIR DEL PERFUNDIDO DE LA PLACENTA DRENADA Este ejemplo describe el análisis de los tipos de células recuperados del perfundido efluente de una placenta cultivada de acuerdo a los métodos de la invención. Veinte mL de una solución salina amortiguada con fosfato (PBS) se agregaron al líquido de perfusión y una porción de 10 mL se recolectó y se sometió a centrifugación por 25 minutos a 3000 rpm (revoluciones por minuto) . El efluente se dividió en cuatro tubos y se colocó en un baño de. hielo. 2.5 mL de una solución de suero de becerro fetal (FCS) al 1% se agregó, Y los tubos se sometieron a centrifugación (140 minutos x 10 g (aceleración debida a la gravedad) . La pelotilla se resuspendió en 5 mL de FSC al 1% y dos tubos se combinaron. Los mononucleocitos totales se calcularon sumando los linfocitos totales y los monocitos totales, y después multiplicando el resultado por el volumen total de la suspensión de células. ' Lá siguiente tabla describe los tipos de células obtenidos por la perfusión de una placenta cultivada de acuerdo a los métodos descritos más arriba.

WBC Volumen 1000/ml Lym% MID% GRA% Total # de Células CB (Sangre del 10.5 43.2 8 48.8 6.3 x 108 Cordón) PP (Perfiindido 12.0 62.9 18.2 18.9 1.8 x lO8 dé la Placenta, ¦ * ' temperatura . ambiente) PP2 (Perfundido 11.7 56.0 19.2 24.8 3.5xl08 de la placenta, 37°C) Las muestras de PP fueron después del Ficoll. El número total de células para PP después del Ficoll fue de 5.3 x 10a y el número de CB antes del procesamiento es de 6.3 x 108. Lym% indica el porcentaje de linfocitos; MID% indica el porcentaje de células sanguíneas blancas de rango medio; y GRA% indica el porcentaje de granulocitos . 5.2. EJEMPLO 2: ANÁLISIS DE LAS CÉLULAS CONTENIDAS POR LA PERFUSIÓN E INCUBACIÓN DE LA PLACENTA El siguiente ejemplo describe un análisis de las células obtenidas por la perfusión e incubación de la placenta de acuerdo a los métodos de la invención. 5.2.1. MATERIALES Y MÉTODOS Donadores de placenta fueron reclutadas de madres gestantes que se enrolaron en programas de depósito en bancos de sangre del cordón umbilical privados y proporcionaron el consentimiento documentado permitiendo el uso de la placenta con la sangre extraída enseguida de la recuperación de la sangre del cordón para propósitos dé investigación. Los datos del donador pueden ser confidenciales. Estos donadores permitieron también el uso de los datos protegidos generados del procesamiento normal de sus especímenes de cordón umbilical para la criopreservación . Esto permitió la comparación entre la composición de la sangre del cordón recolectada y el pérfundido efluente recuperado usando el método experimental descrito abajo. Enseguida de la extracción de la sangre del cordón del cordón umbilical y la placenta se almacenaron a temperatura ambiente y se entregaron al laboratorio en cuestión de veinticuatro horas, de acuerdo a los métodos descritos aquí más arriba, la placenta se colocó en un recipiente estéril, aislado, a la temperatura ambiente y se entregó al laboratorio en un plazo de 4 horas del nacimiento. Las placentas de desecharon si, en la inspección, tenían evidencia de daño físico tal como fragmentación - del órgano o ablución de los vasos umbilicales. Las placentas se mantuvieron a la temperatura ambiente (23+2°C) o se refrigeraron (4°C) en recipientes estériles por 2 a 20 horas. Periódicamente, las placentas se sumergieron y se lavaron en solución salina estéril a ' 25±3°C para remover cualquier desecho de sangre superficial visible. El cordón umbilical fue cortado , transversalmente aproximadamente 5 cm desde si inserción en la placenta y los vasos umbilicales fueron canulados con catéteres de TEFLÓN® o polipropileno conectados a una vía de fluido estéril, permitiendo la perfusión bidireccional de la placenta y la recuperación del fluido efluente. Los métodos descritos aquí más arriba permitieron todos los aspectos del acondicionamiento de la placenta, la perfusión y la recolección del efluente a ser llevado a cabo" bajo condiciones atmosféricas controladas, así como el monitoreó en tiempo real de la presión intravascular y las velocidades de flujo, las temperaturas del núcleo y el perfundido" y los volúmenes del efluente recuperado. Un rango de protocolos de condicionamiento fueron evaluados durante un periodo después del partote 24 horas, y la composición celular del fluido efluente se analizó mediante citometría de flujo, microscopía luminosa y ensayóte unidad de formación de la colonia. 5.2.2. ACONDICIONAMIENTO DE LA PLACENTA Las p-lacentas de las donadores se procesaron a la temperatura ambiente en un plazo de 12 a 24 horas después del alumbramiento. Antes del procesamiento, las membranas fueron retiradas y el sitio maternal fue lavado limpiándolo de la sangre residual. Los vasos umbilicales fueron canulados con catéteres fabricados de agujas Butterfly calibre 20 usadas para la recolección muestras de sangre. Las placentas de las 1 donadores se .mantuvieron bajo condiciones variantes tales como el mantenimiento a 5-37°, 5% de C02, pH 7.2 a 7.5, preferiblemente pH 7.45, en un intento para estimular y sostener un ambiente fisiológicamente compatible para la proliferación y reclutamiento de las células madre similares a las embrionarias. La cánula se evacuó con medio libre de suero IMDM (GibcoBRL, NY) . que contenía 2U/mL de heparin (Elkins-sinn, J) . La perfusión de la placenta continuó a una velocidad de 50 mL por minuto hasta que se recolectaron aproximadamente 150 mL de perfundido. El volumen de perfundido se etiqueta . "primera fracción" . La perfusión continuada de la placenta a la misma velocidad resultó en la recolección de una segunda fracción de aproximadamente 150 mL y fue etiquetada "última fracción" . Durante el curso de procedimiento, la placenta fue masajeada suavemente para ayudar en el proceso de perfusión y asistir en la recuperación del material celular. El fluido efluente se recolecto del circuito de perfusión tanto por drenaje por gravedad y aspiración a través de la cánula arterial . Las placentas se sometieron a perfusión con Medio Tagle modificado de Dulbeco heparinizado (H . DMEM) (2U/mL) a la velocidad de 15 mL/minuto por 10 minutos y los perfundidos se recolectaron de los sitios maternos en un plazo de una hora y las células con núcleo se contabilizaron. Los procedimiento de perfusión y recolección se repitieron una vez o dos veces hasta que el número de células con núcleo recuperadas cayó debajo de lOO/mL. Los perfundidos se seleccionaron y se sometieron a centrif gación ligera para remover las plaquetas, desechos y desnuclear las membranas celulares. Las células con núcleo fueron aisladas entonces mediante centrifugación por gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y después lavado, se resuspendieron en H.DMEM. Para él aislamiento de las células adherentes, alícuotas de 10 x 106 células se colocaron en cada uno de los varios frascos T-75 y se cultivaron con Medio de Cultivo de Células Madre Mesenquimales (MSCGM) disponible comercialmente , obtenido de BioWhittaker, y se colocaron en un incubador para cultivo de tejidos (37°C, 5% C02) . Después de 10 a 15 días, las células no adherentes se removieron mediante lavado con PBS, el cual se reemplazó después por MSCGM. Los frascos se examinaron diariamente por la presencia de varias tipos de células adherentes y en particular, para la identificación y expansión de agrupaciones de células fibroblastoides . * 5.2.3. RECUPERACIÓN Y AISLAMIENTO DE LAS. CELULAS Las células se recuperaron de los. perfundidos mediante centrifugación a 5000 x g por 15 minutos a la temperatura ambiente. Este procedimiento sirvió para separar las células de los desechos contaminantes. Las pelotillas de células se resuspendieron en medio libre de suero IMDM, que contenía 2U/mL de heparin y EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY) . La fracción total de células mononucleares se aisló usando Lymphopred (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo al procedimiento recomendado por el fabricante y la fracción de células mononucleares fue resuspendió . Las células fueron contabilizadas usando o hemocitometro. La viabilidad se evaluó mediante exclusión de azul de trypan. El aislamiento de las células mesenquimales se logró mediante "tripsinización diferencial" usando una solución de tripsina al 0.05% con 0.2% de EDTA (Sigma, St Louis MO) . La tripsinización diferencian fue posible porque las células fibroblastoides se separaron de las superficies plásticas en un plazo de cinco minutos mientras que las otras poblaciones adherentes requirieron más de 20-30 minutos de incubación. Las células fibroblastoides separadas se recolectaron enseguida de la tripsinización y la neutralización de la tripsina, usando Solución de Neutralización de Tripsina (TNS, BioWhittaker) . Las células se lavaron en H.DMEM y se resuspendieron en MSCGM. La citometría de flujo se llevó a cabo usando un instrumento FACSCAlibur de Becton-Dickinson y los anticuerpos monoclonales etiquetados FITC y PE (mAbs) , seleccionados en base a los marcadores conocidos para las MSC (células madre mesenquimales) derivadas de médula ósea, fueron comprados de B.S. y Caltag laboratoires (South San Francisco, CA) , y los anticuerpos SH2 , SH3 y SH4 productores de hibridomas se obtuvieron de y las reactividades de los mAbs en sus sobrenadantes cultivados se detectaron mediante los anticuerpos anti ratón de cabra F(ab)'2 etiquetados FITC o PE. La diferenciación del linaje se llevó a cabo usando el medio de cultivo para inducción y mantenimiento (BioWhittaker) , usado según las instrucciones del fabricante. 5.2.4. AISLAMIENTO DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS í EMBRIONARIAS DE LA PLACENTA El examen microscópico de las células adherente en los frascos de cultivo reveló diferentes tipos de células - ? morfológicamente diferentes. Se observaron células en forma de huso, células redondas con núcleo grande y numerosas vacuolas pequeñas perinucleares , y células en forma de estrellas con varias proyecciones (a través de una de las cuales las células en forma de estrellas estaban unidas al frasco) , adheridas a los frascos de cultivo. Aunque no se hicieron intentos por caracterizar adicionalmente estas células adherentes, se observaron células similares en el cultivo de médula ósea, sangre del cordón y periférica, y se consideraron por lo tanto que no eran células similares a las células madre en naturaleza. Las células fibroblastoides que aparecieron al último como racimos, fueron candidatas para ser SC (células madre mesenquimales) y se aislaron mediante tripsinización diferencial y subcultivadas en frascos secundarios. La microscopía de fases de las células redondeadas, después de la tripsinización, reveló que las células estaban altamente granuladas; indistinguibles de las MSC derivadas de la médula ósea, producidas en el laboratorio o compradas de Bio hittaker . Cuando se subcultivarón, las células madre similares a las embrionarias derivadas de la placenta, en contraste a su primer fase, se adhirieron en un plazo de horas, asumieron las características de forma fibroblastoide, y formaron un patrón de crecimiento idéntico a las MSC derivadas de la médula ósea de referencia. Durante el subcultivo y realimentación, además, las células mononucleares adheridas flojamente fueron lavadas y los cultivos permanecieron homogéneos y desprovistos de cualquier célula no fibroblastoide contaminante. 5.2.5. RESULTADOS La expresión de CD-34, CD-38 y otros marcadores de superficiales asociados con las células madre, en las células mononucleares purificadas de la primera y la última fracciones fue evaluada mediante citometría de flujo. Las células recuperadas, clasificadas, se lavaron en PBS y después se tiñe doblemente con ficoeritrina antiCD34 e isocianato de fluoresceina anti-CD38 (Becton Dickinson, ountain View, CA) .

El aislamiento de las células se logró usando separación magnética de células, tal como por ejemplo, Auto Macs (Miltenyi) . Preferiblemente, el aislamiento de las células CD 34+ se lleva a cabo primero. 5.3. EJEMPLO 3: MEDIO DE PERFUSIÓN El siguiente ejemplo proporciona una fórmula de la solución para el perfundido preferida para el cultivo de las placenta aisladas.

Químico Fuente Concentración Concentración 500 mL Base Final DMEM-LG GibcoBRL 1 1885- 300 mL 084 MCDB201 Sigma M-6770 disuelto en ph a 7.2 200 mi H20 filtro FCS Hyclone 100% 2% 10 mL ITS Sigma 1-3146 o lOOx lx 5 mL GibcoBRL41400- 045 Pend&Strep GibcoBRL15140- lOOx lx 5 mL 122 LA+BSA Sigma+GibcoBRL 100x(l µg/mL 10 ng/mL de 5 mL BSA de LA LA Dexametasona Sigma D-2915 0.25mM en 0.05 µ? ???µ? H20 Acido L- Sigma A-8960 lOOOx(lOOmM) lx(0.1 mM) 500 µ? Ascórbico PDGF (50 R&D 220BD 10 µg/mL en 4 10 ng/ml 500 µ? mM HC1 + EGF (200 µg) Sigma E-9644 10 µg/mL en 10 ng/ml 500 µ? HAc + lO mM La composición de arriba es un perfundido que puede ser. usado a una variedad de temperaturas para inundar la placenta. Debería notarse que componentes adicionales, tales como antibióticos, anticoagulantes y otros factores de crecimiento, pueden ser usados en el perfúsate o el medio de cultivo. 5.4. EJEMPLO 4 : INDUCCIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN EN TIPOS DE CÉLULAS PARTICULARES Las células de sangre del cordón y/o las células . madre similares a las embrionarias son inducidas a diferenciarse en untito particular de células mediante la exposición a un factor de crecimiento. Los factores de crecimiento que se usan para inducir la inducción incluyen, pero no se limitan a GM-CSF, IL-4, Flt3L, CD40L, IFN-alfa, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-2, IL-6, ácido retinoico, factor de crecimiento de los fibroblastos, TGF-beta-1, TGF-beta-3, factor de crecimiento de los hepatocitos, factor de ¦ crecimiento epidérmico, cardiotropina-1 , angiotensinogenos , angiotensina I (AI), angiotensina II (AII), agonistas del receptor AII AT2 tipo 2, o análogos o fragmentos de los mismos. 5.4.1 Inducción de la Diferenciación en Neuronas Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre del cordón y/o las células madre similares a las embrionarias para 'diferenciarse e neuronas. El siguiente protocolo se emplea para inducir- la diferenciación neuronal: 1. Las células madre de la placenta se cultivan por 24 h en un medio de preinducción que consiste de DMEM/FBS al 20% y beta-mercaptoetanol 1-mM. 2. El medio de preinducción se remueve y las células se lavan con PBS . 3. Se agrega medio de inducción Neuronal que consiste de DMD y betamercaptoetanol 1-10 mM. Alternativamente, puede ser usado medio de inducción que consiste de DMDM/DMSO al 2%/hidroxianisol butilatado 200 µ?, para mejorar la eficiencia de la diferenciación neuronal. ¦ 4. En ciertas modalidades, los cambios morfológicos y moleculares pueden ocurrir tan pronto como 60 minutos después de la exposición al medio libre de suero y el betamercaptoetanol ( oodbury et al., Neurosoi . Res . , 61:364— 370). Puede ser usado RT/PCR para evaluar 'la expresión de, por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento nervioso y los genes de la cadena pesada de los neurofilamentos . 5.4.2. Inducción de la Diferenciación a Adipocitos Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre del cordón y/o las células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en adipocitos. El siguiente protocolo se . emplea para inducir la ·· diferenciación adipogénica : - 1. Las células madre de la placenta se cultivan en MSCGM (Bio hittaker) o DMEM suplementado con 15% de suero de sangre del cordón. 2. Se usan tres ciclos de inducción. Cada ciclo consiste de alimentar las células madre de la placenta con Medio de Inducción de Adipogénesis (Bio Whittaker) y cultivar las células por 3 días (a 37°C, 5% de C02) , seguido por 1-3 días de cultivo en Medio de Mantenimiento de la Adipogénesis (Bio Whittaker) . Se usa un medio de inducción que contiene dexametasona 1 µ?, indometacina 0.2 - mM, 0.01 mg/mL de insulina, 0.5 mM de ' IBM , DMEM-alta glucosa, FBS, y antibióticos . . 3. Después de 3 ciclos completos de inducción/mantenimiento, las células se cultivan por 7 días adicionales en medio de mantenimiento de la adipogénesis, reemplazando el medio cada 2-3 días!. 4. La adipogénesis puede ser evaluada por el desarrollo de múltiples vesículas de lípidos intracitoplásmicos que pueden ser observadas fácilmente usando el aceite de teñido lipofilico rojo O. Se emplean los análisis de RT/PCR para examinar la expresión de la lipasa y los genes de protéína de enlazamiento del ácido graso. 5.4.3. Inducción De la Diferenciación en Condrocitos Este ' ejemplo describe la inducción de las células de sangre del cordón o las células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en condrocitos . El siguiente protocolo se emplea para inducir la diferenciación condrogénica: 1. Las células madre de la placenta se mantienen en MSCGM (Bio Whittaker) o DMEM suplementado con suero de sangre del cordón al 15%. 2. Las células madre de la placenta se toman como alícuotas en un tubo de polipropileno estéril. Las células se someten a centrifugación (150 x g por 5 minutos) y se lavan 'dos veces en Medio de Condrogénesis Incompleta (Bio Whittaker) . 3. Después del último lavado, las células se resuspenden en Medio de Condrogénesis Incompleta (Bio Whittaker) que contiene 0.01 yg/mL de TGF-beta-3 a una concentración de 5 x 10(5) células/mL. 4. 0.5 mL de las . células se toman como alícuotas en un tubo de cultivo de polipropileno de 15 mL. Las células se convierten en una pelotilla a 150 x g por 5 minutos. La pelotilla se deja intacta en el medio. 5. Tubos tapados flojamente se incuban a 37°C, 5% de C02 por 24 horas . 6. Las pelotillas de células se alimentan cada 2-3 días con medio de condrogénesis completa recién preparado. 7. Las pelotillas de suspenden en el medio mediante la agitación diaria usando un vortex de baja velocidad. 8. Las pelotillas de células condrogénicas se cosechan después de 14-28 días en el cultivo. 9. La condrogénesis puede ser caracterizada, por ejemplo, mediante la observación de. la producción de la sustancia esonofilica. molida, evaluando la morfología de. las células y/o RT/PCR para examinar la expresión del gen del colágeno 2 y el tcolágeno 9. , . 5.4.4 Inducción De la Diferenciación en Osteocitos Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre del cordón y las células madre similares · a las embrionarias para 'diferenciarse en osteocitos. El siguiente protocolo se emplea para inducir ' la diferenciación osteogénica : 1. Cultivos adherentes de células madre de la placenta se cultivan en MSCGM (Bio Whittaker) o DMEM suplementado con 15% de suero de sangre del cordón. 2. Los cultivos de' dejan reposar por 24 horas en frascos de cultivo de tejidos. 3. La diferenciación osteogénica se induce reemplazando el MSCGM con Medio de Inducción osteogénica (Bio Whittaker) que contiene dexametasona 0.1 µ?, ácido 2-fosfato ascórhico 0.05 mM, beta glicerofosfato .10 mM. 4. Las células se alimentan cada 3-4 días por 2-3 semanas con Medio de Inducción de la Osteogénesis . 5. La diferenciación se analiza usando un tinte específico del calcio y RT/PCR para la fosfatasa alcalina y la expresión del gen de la osteopontina . 5.4.5. Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre ,del cordón o las células madre similares a las embrionarias, para diferenciarse en hepatocitos. El siguiente protocolo se emplea para inducir la diferenciación hepatogénica : 1. Las células madre de la placenta se cultivan en DMEM/20% de CBS suplementado con el factor de crecimiento de los hepatocitos, 20. ng/mL; y el factor de crecimiento epidérmico, 100 mg/mL. Puede ser usado el Reemplazo de Suero de agénico en vez de CBS. 2. Se agregaron 50 ng/ml de IL-6 a los frascos de inducción. 5.4.6. Inducción de Diferenciación en Células Pancreáticas Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre del cordón y/o las células madre similares a las embrionarias, para diferenciarse en células pacreáticas. El siguiente protocolo- se emplea para inducir la diferenciación pancreática : ' 1. Las células madre de la placenta se cultivan en DMEM/20% de CBS suplementado con el factor de crecimiento fibroblástico básico, 10 ng/mL; y el factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/mL. Puede ser usado el Reemplazo de Suero de agénico en vez de CBS. 2. El medio acondicionado de los cultivos de células neuronales nestin-positivos se agrega al medio a una concentración de 50/50. 3. Las células se cultivan por 14-28 días, realimentando cada 3 -4 días . 4. La diferenciación se caracteriza analizando la proteína de la insulina o la expresión del gen de la insulina mediante RT/PCR. 5.4.7 Inducción de la Diferenciación En Células Cardiacas Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre del cordón o las células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en células, cardiacas. El siguiente protocolo se emplea para inducir la diferenciación miogénicar . ¦ - . 1. Las células madre de la placenta se cultivan en DMEM/20% CBS, suplementado con ácido retinoicó, 1 µ?, factor de crecimiento de los fibroblastos, 10 ng/mL; y el factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/mL; y el factor de crecimiento epidérmico, 100 ng/mL. Puede ser usado el Reemplazo de Suero agénico en vez de CBS. 2. Alternativamente, las células madre de la placenta se cultivan en DMEM/20% GBS suplementado con 50 ng/mL de Cardiotropina-1 por 24 horas. , 3. Alternativamente, las células madre de la placenta se mantienen en medio libre de proteínas por 5-7 días, estimuladas después, con extracto de miocardio humano (análisis de dosis cada vez mayores) . El extracto de. miocardio se produce homogeneizando 1 gm de miocardio humano en ' amortiguador HEPES al 1% suplementado con suero de sangre del cordón al 1%. La suspensión se incuba por 60. minutos, -después se somete a centrifugación y se recolecta el sobrenadante. 4. Las células se cultivan por 10-14 días, realimentándolas cada.3- días. 5. La diferenciación se evalúa usando análisis de expresión del gen de actina cardiaca por RT/PCR. 5.4.8. Caracterización de las Células de Sangre del Cordón y/o las Células Madre Similares a las Embrionarias Antes de y/o Después de la Diferenciación Las células madre similares a las embrionarias, las células de sangre del cordón y/o las poblaciones de células de sangre del cordón insertado con células madre similares a las embrionarias se caracterizan antes de y/o después de la diferenciación, midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de la superficie celular, usando técnicas tales como la citometría de flujo y la inmunocitoquímica, y midiendo los cambios en la expresión genética usando técnicas tales como PCR. Las células que han sido expuestas a los factores de crecimiento y/o que se han diferenciado, se Caracterizan por la presencia o ausencia de los siguientes marcadores de la superficie celular; CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3 - , SSEA4-, 0CT-4+, y ABC-p+ . Preferiblemente, las células madre- similares a las embrionarias se caracterizan antes de la diferenciación, por la presencia de los marcadores de la superficie celular OCT-4+, APC-p+, CD34- y GD38-. Las células madre que llevan estos marcadores son tan versátiles (por ejemplo, pluripotentes) como las células madre embrionarias humanas. Las células de sangre del cordón se caracterizan, antes de la diferenciación, por la presencia de los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38+. Las células diferenciadas derivadas de las células madre similares a las embrionarias, las células de sangre del cordón y/o las poblaciones de células de sangre del cordón insertado con células madre similares a las embrionarias preferiblemente no expresan estos marcadores. 5.5. EJEMPLO 5: TRATAMIENTO DE LOS INDIVIDUOS QUE TIENEN ESCLEROSIS LATERAL AMILOTROPICA, CON AS CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS La Esclerosis Lateral Amilotrófica (ALS, llamada también enfermedad de Lou Gehrig, es una enfermedad neurodegenerativa fatal que afecta las neuronas motoras del cortex, ' el tallo cerebral y la médula espinal . La ALS afecta a tantos como 20,000 Americanos con 5,000 nuevos casos que ocurre en EU cada año. La mayoría de los casos de ALS son esporádicos (S-ALS) en tanto que -5-10% son hereditarios (F-ALS familiar) la ALS ocurre cuando las células nerviosas especificas en el cerebro y la médula espinal, que controlan el movimiento voluntario se degeneran gradualmente. La característica cardinal de la ALS es la perdida de neuronas motoras espinales, lo cual causa que los músculos bajo su control se debiliten y se desechen llevando a la parálisis. La ALS se manifiesta en si en diferentes maneras, dependiendo de cuales músculos se debilitan primero. La ALS impacta en la edad madura con los hombres que son una y media veces más propensos a tener la enfermedad que las mujeres. La ALS es usualmente fatal en un plazo de cinco años después del diagnostico. La ALS tiene tanto la forma familiar y esporádica, y las formas familiares no han sido relacionadas actualmente con varios locus genéticos distintos. Solamente alrededor de 5-10% de los casos de ALS son familiares. De estos, 15-20% son debidos a mutaciones en el . gen que codifica la Cu/Zn superoxido dismutasa 1 (SOD1) . Estas parecen ser mutaciones de "ganancia de función" que confieren propiedades tóxicas a la enzima. El descubrimiento de las mutaciones de SOD como una causa para la ALS, ha preparado el camino para algún progreso en el entendimiento de la enfermedad; los modelos animales para la enfermedad están disponibles ahora y las hipótesis están siendo desarrolladas y probadas con respecto a los eventos moleculares que llevan a la muerte celular. El presentado abajo es un método ejemplar para tratar a un individuo que tiene ALS con las células madre similares a las embrionarias derivadas de la placenta. El método involúcrala infusión intravenosa. a través de un angiocatéter periférico, temporal. Un individuo que tiene ALS se evalúa primero mediante la ejecución de los análisis de laboratorio estándar. Tales análisis pueden incluir un perfil metabólico; CDC con diferencial; perfil de lípidos, nivel de fibrinógenos ; tipificando ABO rh de la sangre; pruebas de la función del* hígado; y determinación de los niveles de BU /creatina. Los individuos se instruyen el día anterior al transplante para tomar las siguientes medicaciones: difenidramina (Benadryl™) , 25 mg t.i.d, y perdnisona, 10 mg. Las células madre similares a las embrionarias bien aisladamente o insertados en sangre del cordón, se toman de las existencias criopreservadas , descongeladas, y mantenidas durante aproximadamente dos días antes del transplante a una temperatura de aproximadamente 5°C. El individuo es transplantado en un centro clínico de atención externa el cual tiene todas las instalaciones necesarias para la infusión intravenosa, el monitores, fisiológico y la observación física. Aproximadamente una hora antes del transplante, el individuo recibe difenidramina (Benadryl™) , 25 mg x 1 P.O., y prednisona, 10 mg x 1 P.O. Esto es precautorio, y significa reducir la probabilidad de una reacción alérgica aguda. En el momento de la transfusión, una línea venosa periférica residente 18 G se coloca en una de las extremidades del individuo y se mantiene abierta mediante la infusión de solución salina normal D5 ½ + 20 mEq de KCl a una velocidad de TKO. El individuo se examina antes del transplante, específicamente para notar la' velocidad del corazón, la velocidad respiratoria, y la temperatura. Otros monitoreos pueden llevarse a cabo, tales como un electrocardiograma y una medición de la presión sanguínea. Las células madre similares a las embrionarias se infunden entonces a una velocidad de 1 unidad por hora en un volumen de fluido administrado total de 60 mL, donde una unidad es aproximadamente 1-2 x 109 células con núcleo totales. Alternativamente, ¦ la unidad .de células , madre similares a las embrionarias se administra en sangre del cordón que tiene un volumen de fluido total de 60 mL. En este caso, la relación del número de células madre similares a las embrionarias a células madre en la sangre del cordón es al menos 2:1. La unidad administrada puede consistir también de sangre del cordón sola. En base a los datos de los estudios preclínicos, serían administradas un total de 2.0-2.5 x 108 células por kilogramo 'de peso corporal. El individuo debería .ser monitoreado con respecto a los signos de la respuesta alérgica «o la hipersensibilidad, los cuales son signos de la detención inmediata de la infusión. Después . de la infusión, el individuo debería ser monitoreado en una posición recostada por al menos 60 minutos, después de lo cual, el o ella puede reiniciar sus actividades normales. 5.6. EJEMPLO 6: TRATAMIENTO DE LOS INDIVIDUOS QUE TIENEN ATEROESCLEROSIS, USANDO LAS CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS El protocolo de infusión delineado en el Ejemplo 5 puede ser usado para administrar las células madre similares a las embrionarias, bien aisladamente o insertadas en sangre del cordón umbilical, a un paciente que tiene aterosclerosis . Las células madre similares a las embrionarias o las poblaciones e -células suplementadas pueden ser administradas a individuos asintomático, individuos que son candidatos para la

Claims

angioplastia, o a pacientes que han sufrido recientemente (en un plazo de una semana) de cirugía cardiaca. La presente invención no deberá ser limitada en su ámbito a las modalidades específicas descritas aquí. Ciertamente, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas aquí, se .volverán aparentes para aquellas personas experimentadas en la técnica, a partir de la descripción anterior. Tales' modificaciones se destinan para caer dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.' Todas las referencias citadas aquí sé incorporan aquí como referencia en su totalidad y para todos los propósitos en la misma extensión como si cada publicación patente o solicitud de patente individual fuera indicada específicamente e individualmente para ser incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos. La cita de cualquier publicación es para su descripción antes_ de la fecha de presentación y no debería ser considerada como una admisión de que, la presente invención no está titulada para preceder tal publicación en virtud de la invención previa.
REIVINDICACIONES 1. Una composición, caracterizada porque comprende células madre o progenitoras y células madre similares a las embrionarias . 2. Una composición, caracterizada porque comprende células de sangre del cordón umbilical y células madre similares a las embrionarias.
3. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una población de células madre o progenitoras y una población de células madre similares a las embrionarias.
4. La composición de* la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque está contenida en un recipiente.
5. La composición de la reivindicación 4, caracterizada porque el recipiente está sellado, es hermético al aire, y es estéril.
6. La composición de la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque las células madre o progenitoras y las cm. están en contacto mutuamente antes o en el momento de la administración a un paciente en necesidad de las mismas.
7. La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque las células madre o progenitoras de las células madre similares a las embrionarias son adecuadas para la administración separadamente a un paciente.
8. La composición de la reivindicación 1 o 2, 42 caracterizada porque es adecuada para el transplante de médula ósea .
9. La composición de la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque es adecuada para la administración en r 5 humanos . 10. La composición de la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque las células madre o progenitoras son células de sangre del cordón umbilical o de sangre de la placenta, células madre hematopoyéticas fetales o neonatales,
10 células madre de humano, células de adulto o células madre o progenitoras de la médula ósea.
11. La composición de la reivindicación 10, caracterizada porque las células madre o progenitoras son células madre o progenitoras hematopoyéticas fetales o neonatales. 15
12. La composición de la reivindicación 11, caracterizada porque una pluralidad de las células madre o progenitoras hematopoyéticas expresa los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38-.
13. La composición de la reivindicación 10, caracterizada 20 porque las células madre o progenitoras son células madre de sangre del cordón umbilical.
14. La composición de la reivindicación 13, caracterizada porque una pluralidad de las células madre de sangre del cordón umbilical expresan los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38-.
15. La composición de la reivindicación 13, caracterizada porque una. pluralidad de las células madre de la sangre del cordón umbilical expresan los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38+.
16. La composición de la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque, las células madre similares a las embrionarias exhiben al menos uno de los siguientes marcadores de la superficie celular: CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2 , SH3, SH4, OCT-4 o ABC-p, o carecen de la menos uno de los siguientes marcadores de la superficie celular: CD34, CD45, SSEA3 , SSEA4. . .
17. La composición de la reivindicación 16, caracterizada porque las células madre similares a las embrionarias son OCT-4+ y ABC-p+ . ·
18. La composición de la reivindicación 16, caracterizado porque las células madre similares a las embrionarias son SSEA3- y SSEA4- .
19. Un paquete que comprende una composición de la reivindicación l o 2, caracterizado porque dichas células madre o progenitoras están en un primer recipiente y dichas células madre similares a las embrionarias están en un segundo recipiente.
20. Un método para preparar una composición que comprende una pluralidad de células madre o progenitoras y una pluralidad de células madre similares a las embrionarias, el cual se caracteriza porque, comprende aislar y poner en contacto la pluralidad de células madre con la pluralidad dé células madre similares a las embrionarias.
21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque, la pluralidad de células madre "o progenitoras y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias está cada una contenida en un recipiente separado, antes del mezclado.
22. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la composición es adecuada para la administración en humanos .
23. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque las células madre o progenitoras son células de sangre del cordón umbilical o sangre de la placenta, células, madre o progenitoras hematopoyéticas fetales o neonatales, células de adulto o células madre o progenitoras de la médula ósea.
24. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque, ls células madre o progenitoras son células madre o progenitoras hematopoyéticas fetales o neonatales.
25. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque una pluralidad de .las células madre o progenitoras hematopoyéticas expresan los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38-.
26. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la pluralidad de células madre o progenitoras y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se mezclan físicamente.
27. Un método para tratar a un paciente en necesidad de las mismas, caracterizado porque comprende la administración .de una pluralidad de célula madre o progenitoras y una pluralidad de células madre similares a las embrionarias. ¾
28. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque la pluralidad de células madre o progenitoras y la pluralidad de células' madre similares a las embrionarias, está contenida cada una en . un recipiente, separado entes del mezclado.
29. 'El método de la reivindicación 27,' caracterizado porque la pluralidad de células madre o progenitoras y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias están en contacto unas con .otras antes o en el momento de la administración a un paciente en necesidad de las mismas.
30. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque las células madre o progenitoras- y las células madre similares a las embrionarias son adecuadas paira el transplante de médula ósea. ,
31. ' El método de la reivindicación 27, caracterizado porque las células madre o progenitoras y las células madre 'similares a las embrionarias son adecuadas para la administración a un humano.
32. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque las células madre o progenitoras son células de sangre del cordón umbilical o de sangre de la placenta, células madre o progenitoras hematopoyéticas fetales o neonatales, células madre de humano, células de adulto, o células madre o progenitoras de la médula ósea. ,
33. El método de la reivindicación 32, caracterizado porque las células madre' o progenitoras son células madre o progenitoras hematopoyéticas fetales. o neonatales.
34. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque una pluralidad de las células madre o .progenitoras hematopoyéticas expresan los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38-.
35. El método de la. reivindicación 32, caracterizado porque, las células madre o progenitoras con células madre de sangre. del cordón umbilical . .
36.. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque, una pluralidad de las células madre de sangre del cordón umbilical expresa los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38-.
37. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque,, una pluralidad de las célula madre de sangre del cordón umbilical expresa los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38+.
38. El método de la reivindicación '27, caracterizado porque las células madre similares a las embrionarias exhiben al menos uno de los siguientes marcadores de la superficie celular: CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, 0CT-4+ y ABC-p+.
39. El método de a reivindicación 38, caracterizado porque, las células madre similares a las embrionarias son OCT-4+ y ABC-p+ .
40. · El método de la reivindicación 38, caracterizado porque, las células madre similares a las embrionarias son SSEA3- y SSEA4- .
41. El método dé la reivindicación 27, caracterizado porque, la pluralidad de células madre o progenitoras y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se mezclan antes o en el momento de la administración a un paciente en necesidad de las mismas.
42. El método, de la reivindicación 27, caracterizado porque, la pluralidad de célula madre o . progenitoras y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se mezclan físicamente.
43. ? método de la reivindicación 27, caracterizado porque, la pluralidad de células madre o progenitoras y/o la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se tratan con un factor de crecimiento para inducir la diferenciación celular en un tipo particular de células.
44. El método de la reivindicación 27, _ caracterizado porque la pluralidad de células madre o progenitoras y/o la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se tratan con un factor de crecimiento para prevenir o suprimir la diferenciación en un tipo particular de células.
45. Un método para tratar a un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende la administración de una pluralidad de ¦ células de sangre del- cordón umbilical y una pluralidad de células madre similares a las embrionarias.
46. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la pluralidad de células de sangre del cordón umbilical y lá' pluralidad de células madre similares a las embrionarias está contenida cada una en un recipiente separado antes del mezclado.
47. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la pluralidad de células de sangre del cordón umbilical y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias están en ' contacto mutuamente entes de o en el momento de la administración a un paciente en necesidad de las mismas.
48. El método de' la reivindicación 45, caracterizado porque la pluralidad de células de sangre del cordón umbilical y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias son adecuadas para la administración separadamente a un paciente.
49. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque las células de sangre del cordón umbilical son células madre o progenitoras hematopoyéticas fetales o neonatales.
50. El método de la reivindicación 49, caracterizado porque una pluralidad de las células madre o progenitoras hematopoyéticas expresan los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38-.-
51. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque una pluralidad de las células madre de sangre del cordón umbilical expresan los marcadores de superficie celular CD34+ y CD38- .
52. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque una pluralidad de células madre de la sangre del cordón umbilical expresan los marcadores de la superficie celular CD34+ y CD38+.
53. El método dé la reivindicación 45, caracterizado porque las células madre similares a las embrionarias exhiben al menos uno de los siguientes marcadores de la superficie celular: CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+ .
54. El método de a reivindicación 53, caracterizado porque las células madre similares a las embrionarias son OCT-4+ y ABC-pt . 55. El método de la reivindicación 53, caracterizado porque las células madre similares a las embrionarias son
SSEA3- y SSEA4- .
56. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la pluralidad de células madre o progenitoras y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se mezclan antes o en el momento de la administración a un paciente en necesidad de las mismas..
57. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la pluralidad de célula madre o progenitoras y la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se mezclan físicamente.
58. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la pluralidad de células madre de sangre del cordón umbilical y/o la . pluralidad de células madre similares a las embrionarias se tratan con un factor de crecimiento.
59. El método de la reivindicación 58, caracterizado porque la pluralidad de células madre de sangre del cordón umbilical y/o la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se tratan con un factor de' crecimiento para inducir la diferenciación en un tipo particular de células.
60. El método de la reivindicación 58, caracterizado porque la pluralidad de células madre de sangre del cordón umbilical y/o la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se tratan con el factor de crecimiento para prevenir o suprimir la diferenciación en un tipo particular de células.
61. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque dicho paciente tiene una enfermedad, trastorno o condiciones que incluye un componente de inflamación.
62. El método de la réivindicación 45, caracterizado porque, dicho paciente tiene una enfermedad, trastorno o condición vascular.
63. El método de la r ivindicación .62, caracterizado porque, dicha enfermedad, trastorno o condición es ateroesclerosis .
64. El método de la reivindicación, 45, caracterizado porque, dicho paciente tiene una enfermedad, trastorno o condición neurológica.
65. El método de la reivindicación 64, caracterizado porque dicha enfermedad, trastorno o condición se selecciona a partir del grupo que consiste de esclerosis lateral amilotr'opica y esclerosis múltiple.
66. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque dicho paciente tiene un trastorno autoinmune.
67. El método de la reivindicación 66, caracterizado porque dicho trastorno se selecciona a partir del grupo que consiste de diabetes y esclerosis lateral amilotropica.
68. El método de la reivindicación 45, caracterizado 5 porque dicho paciente tiene una condición que es causada por o asociada con trauma o lesiones.
69. El método de la reivindicación 68, caracterizado porque dicho trauma o lesiones es un trauma o lesiones al sistema nervioso central . 10
70. - El método de la reivindicación 68, caracterizado porque, dicho trauma o lesiones es traumá o lesiones al sistema nervioso periférico.
71. Un método para tratar ,1a mielodisplasia, el cual se caracteriza porque comprende, administrar células de sangre 15 del cordón umbilical o células madre aisladas de la misma, y células madre similares a las embrionarias, a un paciente en necesidad de las mismas.
72. El método de la reivindicación 71, caracterizado porque la administración de las células de sangre del cordón 20. umbilical (o células madre aisladas de la misma) y la administración de ' las células madre similares a las embrionarias es concurrente.
73. El método de la reivindicación 71, caracterizado porque las células de sangre del cordón umbilical (o las células madre aisladas de la misma) y las células madre similares a las embrionarias se combinan antes de la administración.
74. Un método para transplantar células progenitoras hematopoyéticas para el tratamiento o prevención de enfermedades, el cual método se caracteriza porque, comprende administrar células de sangre del cordón umbilical (o células madre aisladas de la misma) y células madre similares a las embrionarias, a un paciente en necesidad de las mismas.
75. El método de la reivindicación 74, caracterizado porque la administración de las células de sangre del cordón umbilical, o las células madre aisladas de la misma, y la administración de las células madre similares a las embrionarias, es concurrente.
76. El método de la reivindicación 74, caracterizado porque, las células de sangre del cordón umbilical, ?· las células madre aisladas de la misma, y las células madre similares a las embrionarias, se combinan antes de la administración.
77. Una composición, la cual se caracteriza porque, comprende células madre o progenitoras de sangre del cordón umbilical suplementadas con una pluralidad de células madre similares a las embrionarias.
78. Un método para tratar a un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque, comprende, la administración de al menos 5 x 109 células con núcleo a dicho paciente, dichas al menos 5 x 108 células con núcleo que comprende células madre similares a las embrionarias.
79. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dichas células madre similares á las embrionarias están contenidas en un. recipiente .
80. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dichas células madre similares a las embrionarias son adecuadas para la administración a un paciente.
81. El método dé la reivindicación 78, caracterizado porque dichas células madre similares a las embrionarias son adecuadas para el transplante de médula ósea.
82. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque, dichas células madre similares a las embrionarias son adecuadas para la administración en humanos.
83. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque las células madre similares a las embrionarias exhiben al menos uno de los siguientes marcadores de la superficie celular: CD10+ CD29+, CD34-, CD44+, GD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+.
84. El método de a reivindicación 83, caracterizado ' porque las células madre similares a las embrionarias son OCT- 4+ y ABC-p+ . "
85. El método de la reivindicación 83, caracterizado porque, las células madre similares a las embrionarias son SSEA3- y SSEA4-. .
86. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque las células madre similares a las embrionarias se tratan con un factor de crecimiento.
87. El método de la reivindicación 8.6, caracterizado porque el factor dé crecimiento es una citocina, linfocina, interferona, factor estimulante de la colonia (CSF) , interferón, quimiocina, interleucina, factor de crecimiento hematopoyético humano, ligando del factor de crecimiento hematopoyético, factor de células madre, trombopoyetina (Tpo) , factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF) , factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento básico de los fibroblastos, factor de crecimiento derivado de la placenta o factor de crecimiento epidérmico.
88. El método de la reivindicación 87, caracterizado porque las células madre similares a las embrionarias se tratan con el factor de crecimiento para inducir la diferenciación en una pluralidad de tipos de células.
89. El mét.odo de la reivindicación 87, caracterizado porque la pluralidad de células madre similares a las embrionarias se trata con el factor de crecimiento para prevenir o suprimir la diferenciación en un tipo particular de células .
90. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dicho tratamiento comprende administrar al menos 10 x 108 células con núcleo totales.
91. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dicho tratamiento comprende administrar al menos 20 x 109 células con núcleo totales.
92. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque el manos 30% de dichas células en dicha composición son células madre similares a las embrionarias.
93. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque al menos 60% de dicha células en dicha composición son células madre similares a las embrionarias.
94. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dicho paciente tiene una enfermedad, trastorno o condición que incluye un componente de inflamación.
95. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dicho paciente tiene una enfermedad, trastorno o condiciones vascular.
96. El método de la reivindicación 95, caracterizado porque, dicha enfermedad, trastorno o condición es ateroesclerosis .
97. El método de la reivindicación 78. caracterizado porque dicho paciente tiene una enfermedad, trastorno o condición neurológica.
98. El método de la reivindicación 97, caracterizado porque dicha enfermedad, trastorno o condición se selecciona a partir del grupo que consiste de esclerosis lateral amilotropica y esclerosis múltiple.
99. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dicho paciente tiene un trastorno relacionado con la inmunidad.
100. El método de la reivindicación 99, caracterizado porque dicho trastorno autoinmune se selecciona a partir del grupo que consiste de alergias, diabetes y esclerosis lateral amilotropica .
101. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dicho paciente tiene una condición que es causada por o asociada con trauma o lesiones.
102. El método de la reivindicación 101, caracterizado porque dicho trauma o lesiones es trauma o lesiones al sistema nervioso central .
103. El método de la reivindicación 101, caracterizado porque dicho trauma o lesiones es trauma o lesiones al sistema nervioso periférico.
104. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dichas al menos 5 x 109 células con núcleo comprenden una selección de células derivadas de una pluralidad de donadores .
105. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque ninguna de dichas células en dichas al menos 5 x 109 células con núcleo es tipificada como HLA antes de dicha administración .
106. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dichas al menos 5 x 109 células con núcleo son preacondicionadas entre 18 horas y 21 días antes de dicha administración .
107. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dichas al menos 5 x 109 células con núcleo se preacondicionan entre 48 horas y 10 días antes de dicha administración .
108. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque dichas al menos 5 x 109 células con núcleo se preacondicionan por entre 3-5 días antes de dicha administración .