NL1006764C2

NL1006764C2 - Bereiding van preparaten die hoge concentraties vitamine B12 bevatten.

Info

Publication number: NL1006764C2
Application number: NL1006764A
Authority: NL
Inventors: Hendrik Louis Bijl
Original assignee: Gist Brocades Bv
Priority date: 1996-08-12
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 1997-11-18
Also published as: DE69717207T2; IT1293968B1; KR20000029904A; PT824152E; AU730618B2; DK0824152T3; AR022986A1; DE69717207D1; NO990653D0; BE1010976A5; NL1006764A1; HUP9903580A2; PL331514A1; EP0824152B1; IL128032A0; EP0824152A3; CN1229440A; ITTO970738A1; NO990653L; US6187761B1

Description

Gist-brocades B.V.

BEREIDING EN GEBRUIK VAN PREPARATEN DIE HOGE CONCENTRA-5 TIES

VITAMINE B12 BEVATTEN

Terrein van de uitvinding

De uitvinding heeft betrekking op de bereiding van 10 preparaten die natuurlijk vitamine B12 bevatten.

Achtergrond van de uitvinding

Vitamine B12 is een belangrijk vitamine voor mensen en dieren. Het wordt gebruikt om pernicieuze 15 anaemie en perifere neuritis te behandelen en wordt gebruikt als een voedingssupplement. Vitamine B12 is ook een belangrijk diervoersupplement als groeiverbeteraar.

De term vitamine B12 wordt gebruikt om verbindingen van de kobaltcorrinoïdenfamilie te beschrijven, in 20 het bijzonder die van de cobalaminegroep. De meest gebruikte verbinding van deze groep is cyanocobalamine en als zodanig wordt de term vitamine B12 soms gebruikt om te verwijzen naar cyanocobalamine. In deze beschrijving moet aan de term vitamine B12 de algemene betekenis 25 worden toegekend zodat hij alle kobaltcorrinoïden van de cobalaminegroep omvat, die in het bijzonder cyanocobalamine, hydroxocobalamine, methylcobalamine en 5'-desoxyadenosylcobalamine omvatten respectievelijk gekenmerkt door een cyaan-, hydroxyl-, methyl- of 30 5'-desoxyadenosylgroep. Van de methylcobalamine- en 5'- desoxyadenosylcobalamineverbindingen is bekend dat ze in geïsoleerde vorm instabiel zijn voor licht en in een waterige oplossing gemakkelijk worden omgezet in hydroxocobalamine. Om deze reden bestaan bijna alle 35 commerciële vitamine B12-preparaten uit het stabiele cyanocobalamine dat als zodanig niet de chemische vorm is waarin vitamine B12 in de natuur kan worden gevonden. In deze beschrijving wordt de term natuurlijk vitamine B12 zo gedefinieerd dat hij alle chemische vormen van 1006764 · 2 vitamine B12 omvat die natuurlijk voorkomen in de natuur, waarbij cyanocobalamine dus wordt uitgesloten.

Vitamine B12 wordt industrieel geproduceerd door microbiële fermentatie, waarbij bijna uitsluitend Pseudo-5 monas denitrificans en Propionibacterium-soorten worden gebruikt, waarbij het natuurlijke vitamine B12 vervolgens in de cyanocobalaminevorm wordt omgezet door chemische werkwijzen waaronder cyanidisering gevolgd door extractie- en zuiveringsstappen met gebruikmaking van 10 organische oplosmiddelen (waarvan een overzicht gegeven wordt door Spalla et al, 1989 "Microbial production of vitamin B12", in: Biotechnology of vitamins, pigments and growth factors, E.J. Vandamme red., Elsevier, London, New York, biz. 257-284). De chemische omzettingsstap en 15 eventueel daaropvolgende zuiveringsstappen zorgen ervoor dat deze bereidingswerkwijze duur, onveilig voor de operators en milieuonvriendelijk is.

Bij opname zetten dieren en mensen cyanocobalamine om in één van de natuurlijke vormen van vitamine B12 20 zoals methylcobalamine of 5'-desoxyadenosylcobalamine die dienen te functioneren als een coënzym voor verschillende biologische omzettingen (Ellenbogen, L. in: Handbook of vitamins, Nutritional biochemical and clinical aspects; red.: L.J. Machlin, Marcel Dekker Inc., New York and 25 Basel). Bovendien vraagt efficiënte groei van dieren de aanwezigheid van een voldoende hoeveelheid vitamine B12-activiteit in het diervoer. Vitamine B12-preparaten worden vaak verkocht als voersupplementen zodanig of als onderdeel van een voormengsel dat verdere vitaminen en 30 andere voedseladditieven bevat.

Het is dus duidelijk dat een bron van 5'-desoxyadenosylcobalamine of methylcobalamine in plaats van cyanocobalamine voordelig zou zijn. Gezien de instabiliteit van deze twee verbindingen worden ze niet 35 in geïsoleerde vorm bereid, maar worden ze bereid in een droge samenstelling samen met de biomassa van het organisme waarin zij worden geproduceerd. Dergelijke 1006764 3 samenstellingen zijn zeer geschikt voor gebruik als diervoersupplement. Voor de bereiding van methylcobalamine en 5'-desoxyadenosylcobalamine hebben bacteriën van het geslacht Propionibacterium het meest de 5 voorkeur, omdat, in tegenstelling tot P. denitrificans, bacteriën van dit geslacht de GRAS-status (Generally Recognized As Safe, algemeen beschouwd als veilig) van de U.S. Food and Drug Administration hebben verkregen en omdat van deze bacteriën bekend is dat ze geen 10 endotoxinen produceren. Propionibacterium-soorten zijn aerotolerante, niet beweeglijke, niet-sporenvormende, Gram-positieve bacteriën die verder gekenmerkt worden door de productie van grote hoeveelheden propionzuur uit koolhydraten, melkzuur en polyhydroxyalcoholen. Het 15 geslacht Propionibacterium valt in de hoge "GC" -onderafdeling van de Gram-positieve bacteriën (T.D. Brock, M.T. Madigan, J.M. Martinko en J. Parker in: The Biology of Microorganisms 7th Edition, Prentice-Hall International Inc., 1994).

20 Octrooiaanvrage RU 2001953 (Antibiotics Enzymes

Research Technical Institute) heeft betrekking op een sproeidroogwerkwijze voor Propionibacterium shermanii die is gebruikt om 5'-desoxyadenosylcobalamine-bevattende biomassa te produceren. Methylcobalamine in biomassa van 25 methanogene bacteriën is commercieel verkrijgbaar bij de Gedeon Richter Company. Het vitamine B12-gehalte in deze preparaten is echter beperkt door het gehalte waarbij het vitamine B12 wordt geproduceerd tijdens fermentatie en dientengevolge is het vitamine B12-gehalte in deze 30 preparaten niet hoger dan 0,1% (gew./gew.). De concentratie van vitamine B12 in een preparaat wordt gewoonlijk gemeten als het droge gewicht van vitamine B12 als een percentage van het droge gewicht van het preparaat.

35 Geconcentreerde (dat wil zeggen > 0,1% gew./gew.) producten van cyanocobalamine zijn in de handel verkrijgbaar. Voerfabrieken en fabrikanten van voormengsel kunnen 1006764 4 dit materiaal niet gebruiken omdat als gevolg van de elektrostatische eigenschappen cyanocobalamine zich afscheidt van zijn drager bij verwerking in voerfabrieken en bij fabrikanten van voormengsel wanneer het wordt 5 samengesteld met concentraties > 0,1% gew./gew..

Afscheiding is een bijzonder probleem tijdens zeven, windziften of als men de samenstelling een lange tijd laat staan.

De uitvinding beschrijft een werkwijze waarmee het 10 mogelijk wordt een samenstelling te bereiden die een relatief hoge concentratie (> 0,1% gew./gew.) natuurlijk vitamine B12 bevat. Deze nieuwe geconcentreerde producten kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in diervoer, menselijk voedsel of als een bestanddeel in cosmetica. 15 Deze nieuwe geconcentreerde producten kunnen gemakkelijker te gebruiken en te transporteren zijn zodat een verlaging van de kosten mogelijk wordt. Ze kunnen voordelig worden gebruikt door voerfabrieken en fabrikanten van voormengsels daar ze verminderde 20 afscheiding van de vitamine B12 van de drager tijdens verwerking kunnen vertonen. De werkwijze kan gemakkelijk worden uitgevoerd op een industriële schaal en is relatief milieuvriendelijk omdat er geen noodzaak is om organische oplosmiddelen te gebruiken of te cyanideren.

25

Beschrijving van de uitvinding

De uitvinding verschaft een werkwijze voor de bereiding van een samenstelling die natuurlijk vitamine B12 bevat die een vitamine B12-concentratie op 30 basis van droge stof hoger dan 0,1% (gew./gew.) heeft. De werkwijze omvat de stappen van a) het verkrijgen van microbiële cellen die natuurlijk vitamine B12 bevatten, b) het open breken van de microbiële cellen zodanig dat ten minste een deel van de oplosbare inhoud van de cellen 35 die vitamine B12 bevatten wordt afgegeven aan een vloeistof waarin de cellen aanwezig zijn, c) het scheiden van de opengebroken cellen en de vloeistof die het 1006764 5 vitamine B12 bevat en eventueel d) het bereiden van een mengsel van het vitamine B12 en ten minste een deel van de opengebroken cellen.

De microbiële cellen die vitamine B12 bevatten 5 worden bij voorkeur verkregen in een industrieel fermentatieproces met een micro-organisme waarvan bekend is dat het vitamine B12 produceert. Deze omvatten bacteriën die behoren tot de geslachten van Acetobacterium, Aerobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, 10 Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium,

Corynebacterium, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Metbanobacillus, Methanosarcina, Mycobacterium, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Salmonella, Serratia, 15 Streptococcus, Streptomyces en Xanthomonas. Bij voorkeur is de in de werkwijze volgens de uitvinding te gebruiken bacterie veilig voor consumptie door mensen en/of dieren en produceert geen endo- of exotoxinen. Liever heeft de bacterie de GRAS-status (Generally Recognized As Safe) 20 van de U.S. Food and Drug Administration verkregen. De bacterie die het meest de voorkeur heeft voor gebruik bij de werkwijze van de uitvinding is van het geslacht Propionibacterium, waarvan de soorten die de voorkeur hebben P. freudenreichii of P. shermanii zijn.

25 Het is bekend bij deskundigen dat de industriële bereiding van vitamine B12, zoals die van vele andere microbiële metabolieten, wordt uitgevoerd met stammen die verkregen zijn uit programma's ontwikkeld om de gewenste kwaliteiten van een bepaalde stam te verbeteren. Deze 30 programma's bestaan in wezen uit de behandeling van de productiestam met een mutageen middel en de keuze van mutanten die een verbeterde productiviteit of andere voordelen vertonen. Verschillende technieken zijn beschreven voor de rationele selectie van mutante micro-35 organismen met een overproductie van vitamine B12 (Spalla, C., Grein, A., Garofo, L en Ferni, G. Microbial production of vitamin B12, in: Biotechnology of vitamins, 1006764 6 pigments and growth factors biz. 257-284 (E.J. Vandamme, red.) Elsevier, London/NY, 1989). Dergelijke mutante stammen worden gebruikt bij voorkeurswerkwijzen van de uitvinding en kunnen de vitamine B12-concentraties in de 5 verkregen preparaten verder verhogen.

In de uitvinding wordt de term "natuurlijk vitamine B12" zo gedefinieerd dat deze alle chemische vormen van vitamine B12 omvat die natuurlijk voorkomen in de natuur, waarbij de cyanococobalaminevorm van vitamine B12 10 wordt uitgesloten. In de voorkeurswerkwijzen en preparaten van de uitvinding omvat het natuurlijke vitamine B12 5'-desoxyadenosylcobalamine en/of methylcobalamine.

Bij de werkwijze van de uitvinding worden de 15 microbiële cellen die vitamine B12 bevatten zo behandeld dat lysis of ander openbreken van de celmembraan wordt veroorzaakt. Lysis beschrijft het openbreken van de microbiële cellen zodanig dat (ten minste een deel van) de oplosbare inhoud van de cellen die het vitamine B12 20 bevatten wordt afgegeven aan een vloeistof waarin de cellen aanwezig zijn. Voorkeursbehandelingen voor het openen van de cellen zijn behandelingen met warmte waaronder pasteurisatie of verwarmen in een autoclaaf, behandeling met bacteriolytische enzymen zoals lysozym, 25 mechanisch openbreken van de cellen waaronder malen of het gebruik van afschuifkrachten, behandeling met chemicaliën die cellysis veroorzaken zoals detergenten of organische oplosmiddelen, alsook combinaties van deze behandelingen. De lysis of ander openbreken van de 30 membraan geeft een lysaat dat kan worden gescheiden in vaste en vloeibare fasen.

Bij een voorkeurswerkwijze van de uitvinding wordt ten minste een deel van de vaste fase (opengebroken cellen) toegevoegd aan de vloeistoffase die het 35 natuurlijke vitamine B12 bevat, zodat een preparaat wordt verkregen dat een mengsel is dat biomassa, dat wil zeggen bij voorkeur opengebroken microbiële cellen, en

1006764 I

7 natuurlijk vitamine B12 bevat. Het vitamine B12-gehalte of de vitamine B12-concentratie van deze preparaten wordt uitgedrukt als het gewichtspercentage van vitamine B12 op basis van het droge-stofgehalte van het preparaat.

5 De werkwijze van de uitvinding geeft preparaten met een vitamine B12-concentratie hoger dan 0,1% (gew./gew.) op basis van droge stof. In voorkeurswerkwijzen heeft het preparaat een concentratie natuurlijk vitamine B12 hoger dan 0,2% (gew./gew.), 10 liever hoger dan 0,4% (gew./gew.), nog liever hoger dan 0,6%, nog liever hoger dan 0,8% (gew./gew.) en liefst hoger dan 1,0% (gew./gew.). Het heeft de voorkeur dat vitamine B12-concentraties van de preparaten van de uitvinding niet hoger zijn dan 10% (gew./gew.), liever 15 zijn de vitamine B12-concentraties niet hoger dan 5%.

Bij de werkwijze van de uitvinding wordt de vaste fase van het lysaat dat de celbrokstukken afkomstig van het openbreken van de cellen bevat, gescheiden van de vloeistof die het afgegeven vitamine B12 bevat. Een 20 aantal verschillende vaste-vloeistofscheidingstechnieken zijn beschikbaar voor de deskundige om deze scheiding uit te voeren, waaronder centrifugatie en filtratietechnieken. Een voorkeurswerkwijze voor het scheiden van de vaste celbrokstukken van de vloeistof die 25 vitamine B12 bevat is ultrafiltratie.

Bij een voorkeurswerkwijze van de uitvinding worden de geopende microbiële cellen gewassen en wordt de wasvloeistof gecombineerd met het vitamine B12 verkregen na een scheiding van de cellen en de vloeistof die 30 vitamine B12 bevat. Bij voorkeur wordt het wassen bewerkstelligd door diafiltratie, waarbij bij voorkeur ionen-vrij water wordt gebruikt voor het wassen van de opengebroken cellen. Het diafiltraat dat vitamine B12 bevat, wordt vervolgens gecombineerd met de vloeibare 35 fase die vitamine B12 bevat.

In een voorkeurswerkwijze van de uitvinding wordt de vloeibare fase die natuurlijk vitamine B12 bevat 1006764 8 onderworpen aan een droogbehandeling. Ieder geschikt middel voor drogen kan worden gebruikt zoals bijvoorbeeld sproeidrogen, drogen met een gefluïdiseerd bed, vriesdrogen of drogen in vacuüm.

5 In een voorkeurswerkwij ze van de uitvinding worden de microbiële cellen die vitamine B12 bevatten gewassen voordat ze lysis ondergaan, zodat de vitamine B12-concentratie op basis van droge stof verder wordt verhoogd door het verwijderen van mediumcomponenten. Bij voorkeur wordt 10 het wassen uitgevoerd met diafiltratie, waarbij bij voorkeur ionen-vrij water wordt gebruikt.

In een verder .aspect verschaft de uitvinding preparaten die vitamine B12 bevatten, die kunnen worden verkregen met een werkwijze van de uitvinding. Bij 15 voorkeur is het grootste deel van de vitamine B12-activiteit in deze preparaten in de vorm van natuurlijk vitamine B12. Preparaten van de uitvinding worden gekenmerkt doordat het vitamine B12 aanwezig is in een concentratie op basis van droge stof hoger dan 0,1% 20 (gew./gew.). In een voorkeurspreparaat van de uitvinding is de vitamine B12-concentratie hoger dan 0,2% (gew./gew.), bij voorkeur hoger dan 0,4% (gew./gew.), liever hoger dan 0,6%, nog liever hoger dan 0,8% (gew./gew.) en liefst hoger dan 1,0% (gew./gew.). De 25 vitamine B12-concentraties van de preparaten van de uitvinding zijn echter bij voorkeur niet hoger dan 10% (gew./gew.), liever zijn de vitamine B12-concentraties niet hoger dan 5%. De preparaten van de uitvinding bevatten vitamine B12 en een drager die bij voorkeur 30 biomassa, bijvoorbeeld hele cellen en/of celbrokstukken bevat. De biomassa die aanwezig is in deze preparaten is bij voorkeur afkomstig van een micro-organisme dat vitamine B12 kan produceren, zoals de hiervoor genoemde bacteriën, waarvan de Propionibacterium-soorten het meest 35 de voorkeur hebben.

De preparaten van de uitvinding zijn bij voorkeur droge preparaten, waarbij droog wordt gedefinieerd als 1006764 9 hebbende een watergehalte van minder dan 15 gew.%, liever minder dan 10 %, liefst minder dan 5 gew.%.

In droge preparaten van de uitvinding die de voorkeur hebben is de vitamine B12-activiteit nagenoeg 5 homogeen verdeeld door het poeder of het gegranuleerde poeder dat de drager en het vitamine B12 bevat. Dientengevolge scheidt de vitamine B12-activiteit in deze preparaten zich voordelig niet in een grote mate van de andere bestanddelen in het preparaat af, in het bijzonder 10 wanneer blootgesteld aan gravitatiekrachten, zeven, windziften of elektrostatische krachten tijdens verwerken van de preparaten, . zelfs wanneer gebruikt bij concentraties hoger dan 0,1% (gew./gew.). Het is de bedoeling dat verwerken hierin het verwerken van de 15 preparaten van de uitvinding tot voer en voervoormengsels omvat.

In een verder aspect van de uitvinding wordt het preparaat van de uitvinding gebruikt als of bij de bereiding van groeibevorderend voedingssupplement voor dieren. 20 Voor dit doel worden de preparaten die vitamine B12 bevatten toegevoegd aan de andere voercomponenten, direct of in de vorm van een voormengsel dat ook andere vitaminen, mineralen en/of biologisch actieve bestanddelen bevat. Zoals getoond in het specifieke 25 voorbeeld bevordert het voeren van een dier met voer dat een preparaat van de uitvinding bevat de groei van het dier.

In nog een verder aspect van de uitvinding worden preparaten die vitamine B12 bevatten gebruikt als of bij 30 de productie van een menselijk voedingssupplement en/of worden opgenomen in cosmetische preparaten, zoals shampoo's of bodylotions.

Voorbeelden 35 Experimenteel

Vitamine B12-bepaling 1006764 - 10

Vitamine B12-activiteit werd bepaald met de turbidimetrische biologische bepaling op basis van de groeirespons van Lactobacillus leichmanii ATCC 7830 zoals in detail beschreven in: The United States Pharmacopoeia, 5 The National Formulary, 1995, blz. 1719-1721, United States Pharmacopoeial Convention, Inc., Rockville MD.

Plasma B12-concentraties

Plasma B12 werd gemeten met een in de handel 10 verkrijgbare radioassay-kit (Bio-Rad Laboratories Ltd., Hemel Hempstead, UK.). Het plasmamonster wordt gecombineerd met vitamine B12 (57Co) in een oplossing die dithiothreitol en cyanide bevat. Het mengsel wordt 30 minuten gekookt om endogene bindingseiwitten te 15 inactiveren en om de verschillende vormen van vitamine B12 in cyanocobalamine om te zetten. Het mengsel wordt gekoeld en vervolgens gecombineerd met geïmmobiliseerde (gebonden aan polymeerkralen), affiniteit-gezuiverde intrinsic factor van het varken. 2 0 Dit regelt en buffert de pH van het reactiemengsel op 9,35. Het reactiemengsel wordt vervolgens 60 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Tijdens incubatie concurreren endogene en gemerkte vitamine voor het beperkte aantal bindingsplaatsen op basis van hun 25 relatieve concentraties. Het reactiemengsel wordt vervolgens 10 minuten bij 1500g gecentrifugeerd. De gemerkte en niet-gemerkte vitaminen die binden aan de geïmmobiliseerde bindingseiwitten worden geconcentreerd op de bodem van de buis in de vorm van een pellet en de 30 niet-gebonden vitaminen blijven in de bovenstaande vloeistof. De bovenstaande vloeistof wordt afgezogen en de radioactiviteit verbonden met de pellet wordt geteld. Standaardcurven worden samengesteld met vitamine B12-standaards in een menselijke serumalbuminebasis. De 35 concentratie van vitamine B12 in het plasmamonster wordt bepaald uit de standaardcurven. Standaardcurven werden ingetekend en onbekenden werden bepaald met AssayZap 1006764 11 universal assay calculator, versie 2.32 (Biosoft, Cambridge, Groot Brittannië).

Plasmamonsters moesten 10-50 maal worden verdund om ze in het meest gevoelige traject van de bepaling te 5 brengen.

Verqeliikinqsvoorbeeld 1

Een fermentatie werd uitgevoerd met Propionibacte-rium freudenreichii met een werkwijze bekend bij de 10 deskundigen (zie bijvoorbeeld Spalla et al, 1989 "Microbial production of vitamin B12", in: Biotechnology of vitamins, pigments and growth factors, E.J. Vandamme red., Elsevier, London, New York, biz. 257-284). Een geschikte P. freudenreichii-stam is verkrijgbaar bij de 15 American Type Culture Collection onder toegangsnummer ATCC 6207. Aan het eind van de fermentatie werd een kweekmengsel verkregen dat een 5'-desoxyadenosylcobalaminepotentie van 10 mg/1 had en een droge-stofgehalte van 7,5%. Sproeidrogen van dit 20 kweekmengsel leidde tot een product met een vitamine B12-concentratie van 0,01%.

Om een hogere vitamine B12-concentratie te verkrijgen werd een poging gedaan tot een vast- vloeistofscheiding van het kweekmengsel. Vitamine B12 is 25 intracellulair in P. freudenreichii, om welke reden verwijdering van (extracellulaire) mediumcomponenten en daaropvolgend sproeidrogen van de biomassa zou moeten leiden tot een gesproeidroogd product met een hogere vitamine B12-concentratie.

30 Op laboratoriumschaal werd een centrifugestap uitgevoerd bij een maximale g-kracht van 5000-6000*g.

Deze g-kracht is vergelijkbaar met de centrifugale

krachten van centrifuges die op industriële schaal gebruikt worden. Porties van 1000 ml kweekmengsel werden 35 10 minuten gecentrifugeerd in een Beckmann JM/6E

centrifuge bij 5000 opm. Er werd onder deze 1006764 ' 12 omstandigheden echter geen scheiding van biomassa en kweekmedium verkregen.

Omdat om economische redenen hogere centrifugale krachten op industriële schaal minder aantrekkelijk zijn, 5 hebben we getest of het mogelijk was de vloeistof en de vaste stof in het kweekmengsel te scheiden met ultrafiltratie.

2000 ml kweekmengsel met een aanvankelijke concentratie van 4,5 mg vitamine B12/1 (vitamine B12 op basis 10 van droge stof 0,02%) werd behandeld met ultrafiltratie door middel van een 30 kD AMICON spiraalsgewijs gewonden module (0,09 m2) met een voedingsdruk van 1 bar. Onder deze omstandigheden was het mogelijk om het monster van vitamine B12 vijfmaal te concentreren. De gemiddelde 15 permeaatflux was 30 l/m2h. De vitamine B12-concentratie in het concentraat was 20 mg/1, terwijl het in het permeaat minder dan 0,2 mg/1 vitamine B12 werd gedetecteerd. De vitamine B12-concentratie in het concentraat, wanneer uitgedrukt in termen van droge-stofgehalte was 0,05%, 20 vergeleken met 0,02% voor ultrafiltratie.

Om de titer van vitamine B12 op basis van droge stof verder te verhogen, hebben we vervolgens diafiltratie van de biomassa getest.

Het ultrafiltratieconcentraat zoals verkregen in 25 het hierboven geschreven experiment werd zesmaal gewassen met ionen-vrij water, hetgeen leidde tot een vitamine B12-potentie in het concentraat van 20 mg/1. In het diafiltraat werd geen vitamine B12-activiteit gedetecteerd. Daaropvolgend sproeidrogen van het 30 concentraat leidde tot een gesproeidroogd product met een vitamine B12-concentratie van 0,06%.

We concluderen uit de bovenstaande experimenten dat het niet mogelijk is een product te verkrijgen met een vitamine B12-concentratie hoger dan 0,06% op basis 35 van droge stof uitgaande van een kweekmengsel met een vitamine B12-titer van 5-10 mg/1.

.ub'764 i 13

Voorbeeld 2

Om de aanwezigheid van levensvatbare productieor-ganismen, dat wil zeggen levende cellen, in het gedroogde product te voorkomen wordt gedurende 30 minuten een 5 pasteurisatiestap van 65 °C uitgevoerd op een kweekmengsel dat was verkregen zoals beschreven in voorbeeld 1. Het behandelde kweekmengsel werd zoals boven beschreven behandeld met ultrafiltratie.

Een roze gekleurd permeaat werd waargenomen met 10 een vitamine B12-concentratie (op basis van droge stof) van 0,2-0,4%. Men denkt dat pasteurisatie lysis van (ten minste een deel van) . de P. freudenreichii-cellen en afgifte van het intracellulaire vitamine B12 in het medium veroorzaakt. Dit kan mogelijk maken dat men 15 gedroogde producten verkrijgt die vitamine B12 bevatten in concentraties variërend van 0,06% tot 0,3% (op basis van droge stof), door het combineren van het permeaat en het gepasteuriseerde kweekmengsel voorafgaand aan sproeidrogen.

2 0 In meer detail werd 350 ml van de met warmte behandelde kweekmengsels met ultrafiltratie behandeld onder de hierboven in voorbeeld 1 beschreven omstandigheden. Het concentraat werd behandeld met diafiltratie met 2500 ml ionen-vrij water. Het helder 25 roze gekleurde permeaat en het diafiltraat werden gecombineerd en gemengd met 750 ml gepasteuriseerd ultrafiltratieconcentraat. Het mengsel werd gesproeidroogd in een laboratorium Büchi-sproeidroger waarbij de inlaattemperatuur op 180 °C wordt ingesteld en 30 de uitlaat werd ingesteld op een temperatuur van 104 °C.

De vitamine B12-concentratie van het zo verkregen gesproeidroogde product was 0,13%.

35 Voorbeeld 3 1200 1 kweekmengsel met een vitamine B12-concen-tratie van 8 mg/1 werd verkregen in een 1006764 14 proeffabriekfermentatie van P. freudenreichii en werd behandeld met ultrafiltratie in een DDS-ultraf iltratiemodule M37 met 20 kD membranen en een aanvankelijke waterflux van 38 l/m2h. De temperatuur 5 tijdens ultrafiltratie werd op omgevingstemperatuur gehouden. De circulatiestroom was ongeveer 15 m3/h. De voedingsdruk werd ingesteld op ongeveer 7 bar. Het kweekmengsel werd 11,5 maal geconcentreerd (gemiddelde flux van 23 l/m2h) . Het concentraat werd gewassen met 500 10 1 ionen-vrij water bij omgevingstemperatuur tot een geleiding van ongeveer 3 mS/cm werd bereikt.

Het verkregen concentraat werd 6 uur bij 90 °C behandeld. Een deel van het met warmte behandelde concentraat werd met diafiltratie behandeld, hetgeen leidt tot 15 ongeveer 300 1 permeaat dat vitamine B12 bevat. Het retentaat werd bij 4 °C bewaard.

Het permeaat werd op proef fabriekschaal in een glazen verdamper bij 40 °C onder vacuüm geconcentreerd, hetgeen leidt tot ongeveer 6 1 concentraat.

20 Door het combineren en mengen van een geschikte hoeveelheid van het retentaat met het geconcentreerde permeaat, stelden we een mengsel samen dat werd gesproeidroogd in een NIRO-sproeidroger. De luchttemperatuur bij de inlaat werd ingesteld op 160 °C 25 en de uitlaattemperatuur werd geregeld op ongeveer 90- 95 °C. In een werktijd van 5 uur was ongeveer 45 1 van het mengsel gesproeidroogd (ongeveer 9 kg/uur). Dit leidde tot 1307 g gesproeidroogd materiaal met een vitamine B12-activiteit van 1100 mg/kg, dat wil zeggen 30 0,11%.

Voorbeeld 4

In een experiment gelijk aan het experiment zoals beschreven in voorbeeld 3 werd een fermentatie uitgevoerd 35 met de verbeterde P. freudenreichii-stam CBS 929.97. De verkregen vitamine B12-concentratie in het fermentatiebe-slag was 40 mg/1. De ultraf ilratie en dia filtratie 1 n;6764 1 15 werden in essentie uitgevoerd als beschreven in voorbeeld 3 .

Door middel van ultrafiltratie werd 100 1 van het 40 mg/1 fermentatie beslag geconcentreerd tot ongeveer 40 5 1. Dit concentrate werd gewassen met 200 1 ionen-vrij water. Het aldus verkregen gewassen concentraat had een vitamine B12 activiteit van 96,5 mg/kg en 6.72% droge stof (sproeidrogen van dit gewassen concentraat zou een vitamine B12 activiteit van 0,14 gegeven hebben).

10 Het gewassen concentraat werd vervolgens gelyseerd bij 90°C gedurende 5 minuten, gevolgd door een scheiding van opengebroken cellen-en vloeistof door ultrafiltratie. De potentiële vitamine B12 concentratie bereikte 0,87% op droge stof (berekend op basis van een vitamine B12 15 activiteit van 52.1 mg/kg en een droge stof gehalte van 0,6%). Na pre-concentratie van het permeaat onder vacuum bij 65°C, werden verschillende hoeveelheden permeaat en concentraat gecombineerd en gedroogd. De vitamine B12 activiteit van verkregen droge producten waren als volgt: 20 concentraat : permeaat vitamine B12 activiteit op droge stof 1 : 1 0,5% 3 : 7 0,65% 2 : 8 0,72% 25 8:2 0,29% P. freudenreichii CBS 929.97 werd op 10 juli 1997 gedeponeerd bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland.

30

Voorbeeld 5

Toepassing van natuurlijk vitamine B12 in diervoer

Een proef werd uitgevoerd met slachtkuikens om de werkzaamheid van natuurlijk vitamine B12 met 35 cyanocobalamine te vergelijken. Mannelijke slachtkuikens van 1 dag oud werden willekeurig toegekend aan kooien. Er werden 8 dieren per kooi gehouden. De kooien werden ':'"764 16 geplaatst in een kunstmatig verwarmde, geventileerde en verlichte slachtkuikenbatterij. De dieren werden ingeënt tegen pseudovogelpest als ze 1 en 14 dagen oud zijn. De dieren ontvingen vanaf dag 1 onbeperkt het experimentele 5 voer, de eerste tien dagen in de vorm van kruimels, later in de vorm van pellets. Water was vrij beschikbaar. Het experiment duurde 28 dagen. Op dag 28 werden de dieren gewogen, werd de voerconsumptie bepaald en werden bloedmonsters genomen. De bloedmonsters werden genomen 10 bij vier willekeurig gekozen slachtkuikens per kooi. Het bloed werd verzameld in gehepariniseerde buizen. De buizen werden gecentrifugeerd en het plasma werd bevroren (-18 °C) totdat vitamine B12-analyse werd uitgevoerd. Deze analyse werd uitgevoerd als bovenbeschreven onder 15 experimenteel (plasma B12-concentraties).

Dit experiment omvatte drie behandelingen: I. Basisvoer zonder toevoeging van vitamine B12 II. Basisvoer met toevoeging van cyanocobalamine (30 20 ppb actieve stof) III. Basisvoer met toevoeging van natuurlijk vitamine B12 (30 pp actieve stof)

Elke behandeling werd vijf maal herhaald.

25 De samenstelling van het basisvoer wordt weergegeven in tabel 1, de resultaten in tabel 2.

* w wü‘764 17

Tabel 1. Samenstelling van het basisvoedsel (in %) Maïs 55

Tapioca l

Sojaboonmeel 30 5 Sojabonen, met warmte behandeld 5

Verenmeel 1

Soja-olie 2

Dierlijk vet 3

Vitaminen*, mineralen, aminozuren 3 10

Berekende gehalten:

Metabolische energie 13,3 MJ/kg

Ruw eiwit 22,0%

Lysine (totaal) 1,27% 15 Methionine + Cysteine (totaal) 0,95% *: zonder vitamine B12.

20 Tabel 2. Effect van cyanocobalamine in natuurlijk vitamine B12 op gemiddelde groei, voeropname en voeromzettings-verhouding bij een leeftijd tussen 1 en 28 dagen en op bloedplasmagehalte van vitamine B12 op dag 28.

25 Groei Voer- Voer-om- Bloedplasma (g) opname zettings- vit. B12 (g) verhouding (ng/1)

Basisvoer 1139 1738 1,53 14

+ Cyanocobalamine 1264 1782 1,41 32 I

+ Natuurlijk vitami- 1261 1771 1,40 41 |

ne B12 I

30 'IUÜ67 64 18

Voorbeeld 6

Afscheiding van vitamine B12-activiteit van een drager

Afscheiding van de actieve verbinding van de drager kan worden veroorzaakt door deeltjesvorm, 5 dichtheid en bulkdichtheid, stromingsvermogen, hechtende en elektrostatische eigenschappen, vochtgehalte en hygroscopiciteit. Deze afscheidingsprocessen kunnen optreden tijdens vervaardiging van voorraengsels en mengvoer en tijdens daaropvolgend transport en bewaren.

10 Deze afscheiding is bijzonder kritisch in het geval van voormengsels die microcomponenten zoals vitaminen en sporenelementen, en macrocomponenten, zoals mineralen en dragers, bevatten.

De ontmengingseigenschappen van bestaande in de 15 handel verkrijgbare cyanocobalaminepreparaten (verkregen bij Rhone Poulenc onder het handelsmerk Microvit® B12) is vergeleken met een preparaat met natuurlijk vitamine B12 bereid als beschreven in voorbeeld 4.

Kalksteen wordt als een drager voor de bestaande 20 in de handel verkrijgbare cyanocobalaminepreparaten gebruikt .

Men liet de teststoffen via een vibrerend kanaal uit een opslagvat stromen zodat een berg wordt gevormd, zoals getoond in figuur 1.

25 Er werden drie monsters uit het midden genomen en gemengd. De procedure werd herhaald met monsters van de voet van de berg. De monsters werden zoals bovenbeschreven geanalyseerd op vitamine B12-activiteit en vergeleken met het oorspronkelijke homogene mengsel. 30 Afwijkingen in monsters van het oorspronkelijke homogene mengsel worden als volgt berekend:

Afwijking bij de basis (%) = {(concentratie aan de voet - concentratie oorspronkelijk 35 mengsel)/concentratie oorspronkelijk mengsel} * 100 ivvoï64 ^ 19

Afwijking in het midden (%) = {(concentratie in het midden - concentratie oorspronkelijk mengsel)/concentratie oorspronkelijk mengsel} 1 100 5 Vergelijking van de afwijkingen aan de voet van de berg en in het midden van de berg van preparaten en van cyanocobalamine en natuurlijk vitamine B12 van de uitvinding worden getoond in tabel 3.

10 Tabel 3

Teststof Scheidingstest {%) Scheidingstest (%) voet' berg midden berg —

Cyanocobalamine 0,1% < +10 < -10

Cyanocobalamine 1% +56 -78

Natuurlijk vitami- +8 -12 | 15 ne B12 (0,9%) fl 10 067 64

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van natuurlijk vitamine B12, gekenmerkt doordat de werkwijze omvat: (a) het kweken van microbiële cellen onder omstandigheden zodanig dat zij intracellulair natuurlijk 10 vitamine B12 produceren en (b) het lyseren of op andere wijze openbreken van de buitenmembraan van de microbiële cellen die natuurlijk vitamine B12 hebben geproduceerd, zodat het vitamine B12 wordt afgegeven.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat de lysis een lysaat produceert en de vaste en vloeibare fasen van het lysaat worden gescheiden, waarbij de vloeibare fase het natuurlijke vitamine B12 bevat.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, gekenmerkt 20 doordat deze verder het wassen van de vaste fase van het lysaat en het combineren van de wasvloeistof met de vloeibare fase van het lysaat omvat.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, gekenmerkt doordat het wassen van de vaste fase van het lysaat wordt 25 uitgevoerd met diafiltratie.

5. Werkwijze volgens één van de conclusies 2 tot 4, gekenmerkt doordat deze verder het toevoegen van ten minste een deel van de vaste fase van het lysaat aan de vloeibare fase die het natuurlijke vitamine B12 bevat, 3. omvat.

5 -CONCLUSIES-

6. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, gekenmerkt doordat deze verder het wassen van de microbiële cellen voorafgaand aan lysis omvat.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, gekenmerkt 35 doordat het wassen van de microbiële cellen voorafgaand aan lysis wordt uitgevoerd met diafiltratie. 1 j u b' 7 6 4

8. Werkwijze volgens één van de conclusies 2 tot 7, gekenmerkt doordat deze verder het drogen van de vloeibare fase die het natuurlijke vitamine B12 bevat, omvat.

9. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, gekenmerkt doordat de microbiële cellen cellen zijn van één of meer van de bacteriegeslachten Acetobacterium, Acetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium,

10. Werkwijze volgens conclusie 9, gekenmerkt doordat de microbiële cellen cellen zijn van het bacteriegeslacht Propionibacterium.

10 Corynebacterium, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Methanobacillus, Methanosarcina, Mycobacterium, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Salmonella, Serratia, Streptococcus, Streptomyces en Xanthomonas.

11. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, gekenmerkt doordat de lysis wordt veroorzaakt 20 door behandeling met warmte, pasteurisatie, behandeling met bacteriolytische enzymen, mechanisch openbreken of chemische behandeling, alleen of in combinatie met elkaar.

12. Werkwijze volgens één van de conclusies 2 tot 25 11, gekenmerkt doordat de scheiding van de vaste en vloeibare fasen van het lysaat wordt uitgevoerd met ultrafiltratie of microfiltratie.

13. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, gekenmerkt doordat het natuurlijke 30 vitamine B12 5'-desoxyadenosylcobalamine of methylcobalamine is.

14. Preparaat, gekenmerkt doordat het natuurlijk vitamine B12 in een hoeveelheid groter dan 0,1 gew.% op basis van het droge-stofgehalte van het preparaat omvat.

15. Preparaat volgens conclusie 13, gekenmerkt doordat het verkregen kan worden door de werkwij ze gedefinieerd in één van de conclusies 1 tot 13. 1006764

16. Preparaat volgens conclusie 14 of 15, gekenmerkt doordat het een droog preparaat is, waarin het natuurlijke vitamine B12 nagenoeg homogeen door het preparaat is verdeeld en waarin het vitamine B12 zich 5 niet afscheidt van de andere componenten wanneer blootgesteld aan zeven, windziften, gravitatiekrachten of elektrostatische krachten.

17. Preparaat volgens één van de conclusies 14 tot 16, gekenmerkt doordat het biomassa bevat.

18. Preparaat volgens conclusie 17, gekenmerkt doordat de biomassa afkomstig is van bacteriën van de geslachten Acetobacterium, Acetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Eubacterium, 15 Flavobacterium, Methanobacillus, Methanosarcina, Mycobacterium, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Salmonella, Serratia, Streptococcus, Streptomyces en Xanthomonas, afzonderlijk of in combinaties van twee of meer.

19. Preparaat volgens conclusie 18, gekenmerkt doordat het geslacht Propionibacterium is.

20. Preparaat volgens één van de conclusies 14 tot 19, gekenmerkt doordat het natuurlijke vitamine B12 5'-desoxyadenosylcobalamine of methylcobalamine is.

21. Gebruik van een preparaat volgens één van de conclusies 14 tot 20 bij de bereiding van een voedingssupplement.

22. Gebruik van een preparaat volgens één van de conclusies 14 tot 20 bij de bereiding van een cosmetisch 30 preparaat. ï ü u b' 7 6 4