NL193263C

NL193263C - Werkwijze voor het vervaardigen van een bloeddichte kunstader die een geneesmiddel afgeeft.

Info

Publication number: NL193263C
Application number: NL8500239A
Authority: NL
Original assignee: Meadox Medicals Inc
Priority date: 1984-01-30
Filing date: 1985-01-29
Publication date: 1999-05-06
Also published as: CA1250235A; JPS6192672A; JPH0636817B2; NL193263B; GB2187192A; GB2153235A; DE3503126A1; FR2558720B1; CH670380A5; SE8500422D0; GB2153235B; AU575617B2; AU3819685A; GB8502156D0; FR2558720A1; GB2187192B; IL74180A; SE8500422L; GB8708756D0; NL8500239A

Description

1 193263

Werkwijze voor het vervaardigen van een bloeddichte kunstader die een geneesmiddel afgeeft

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het vervaardigen van een bloeddichte kunstader die een geneesmiddel afgeeft, waarbij men vanaf de binnenzijde een soepel, poreus, buisvormig 5 kunsttransplantaat impregneert en bekleedt met een complex van collageenfibrillen met een geneesmiddel vermengd met een weekmaker, en de collageenbekleding droogt.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit GB 1.213.054. Dit document beschrijft het aanbrengen op een substraat met een porositeit van 5000 ml/min.cm2 van een bekleding van collageenfibrillen. Na het aanbrengen bevindt het collageen zich zowel op het binnenoppervlak van het substraat als in de poriën 10 ervan.

Het vervangen van delen van menselijke bloedvaten door kunstaders is tegenwoordig algemeen aanvaard. Kunstaders kunnen zeer uiteenlopende vormen aannemen en worden van zeer uiteenlopende materialen gemaakt. Onder de goed aanvaarde en succesvolle kunstaders zijn die met daarin een biologisch aanvaardbaar materiaal en met een open ruimte waardoor het bloed kan stromen nadat de 15 kunstaders geïmplanteerd is. De kunstaders kunnen van biologisch aanvaardbare vezels zoals Dacron en Teflon gemaakt zijn, ze kunnen geweven of gebreid zijn, en ook gemaakt van monofilament-, multifilament-of stapelvezelgaren.

Een belangrijke factor bij de keuze van een substraat voor kunstaders is de porositeit van de wand van het weefsel waaruit die ader bestaat. De porositeit is belangrijk omdat het de neiging tot bloedingen tijdens 20 en na het implanteren bepaalt en ook het naar binnengroeien van weefsels in de wand daarvan bepaalt. Het is wenselijk dat het substraat van kunstader voldoende bloeddicht is om bloedverlies tijdens het implanteren te voorkomen, maar ook moet de structuur voldoende poreus zijn om het naar binnen groeien van fibroblasten en cellen van gladde spieren toe te laten zodat het transplantaat met het omringende weefsel vergroeit.

25 Bloeddichte kunstaders met een versterking van absorbeerbaar collageen zijn bekend. Zij worden bijvoorbeeld beschreven in DE 1.491.218. Hier wordt een zelfdragende collageenbuis ingebracht in een buisvormig substraat met een porositeit groter dan 2000 ml/min.cm2. Doordat de collageenbuis zelfdragend is en, ook na samenvoegen met het substraat, blijft, resulteert een buis van een collageenmassa met daaromheen een textielsubstraat. Het collageen dringt hierbij niet door in de poriën van het substraat.

30 US 3.425.418 beschrijft een transplantaat bestaande uit een textielsubstraat met een porositeit groter dan 10.000 ml/min.cm2 met daarop aangebracht twee lagen collageen. Door de hoge porositeit dringt het collageen als vanzelf in de poriën van het substraat.

De hiervoor beschreven kunstaders worden gezegd voor vele toepassingen geschikt te zijn. Maar het blijft wenselijk over een soepel buisvormig transplantaat te kunnen beschikken waarvan de porositeit nul is 35 en dat toch voldoende vatbaar is voor het naar binnengroeien van omringend weefsel en dat ook kan dienen als reservoir voor langzaam af te geven geneesmiddelen nadat de implantatie verricht is. Dit kan worden bereikt met behulp van een substraat met een lage porositeit waarbij het collageen zich in de poriën van het substraat bevindt.

De onderhavige uitvinding voorziet nu in een werkwijze zoals omschreven in de aanhef, gekenmerkt 40 doordat het kunsttransplantaat een porositeit van 2000 tot 3000 ml/min.cm2 (zuiver water, 120 mm kwik) heeft en dat de collageenfibrillen worden aangebracht vanuit een waterige collageenbrij en in het kunsttransplantaat worden gemasseerd en vervolgens gedroogd en verknoopt.

Het aldus verkregen kunsttransplantaat kan na implanteren dienen als reservoir voor het langzaam afgeven van geneesmiddelen. Het toegevoegde geneesmiddel kan een middel tegen bacteriën, tegen 45 virussen of tegen bloedstollingen zijn dat het transplantaat tegen infectie beschermt.

Bij voorkeur worden de stappen van het opbrengen van een waterige collageenbrij, in het kunsttransplantaat masseren en drogen ten minste driemaal herhaald. Met nog meer voorkeur worden de stappen van het opbrengen van een waterige collageenbrij, in het kunsttransplantaat masseren en drogen ten minste vijfmaal herhaald.

50 Het is voorts voordelig indien de collageenbrij 0,5 tot 5,9 gew.% met voldoende geneesmiddel gecom-plexeerd collageen en 4 tot 12 gew.% weekmaker en voor de rest water bevat. Met nog meer voorkeur bevat de collageenbrij 1,5 tot 4,0 gew.% met voldoende geneesmiddel gecomplexeerd collageen en 6 tot 10 gew.% weekmaker en voor de rest water.

Het collageengeneesmiddelcomplex kan verknoopt worden door blootstellen aan formaldehydedamp.

55 De bij deze uitvinding bruikbare poreuze buisvormige kunsttransplantaten zijn bij voorkeur gemaakt door breien of weven van Dacron multifilament garens welke bij zulke producten gebruikelijk zijn.

Het inwerken van collageenbrij in het kunsttransplantaat kan uitgevoerd worden door het kunst- 193263 2 transplantaat te vullen met een brij van collageenfibrillen en met de hand te masseren. Na drogen en verknopen van de laatste laag hebben de volgens de uitvinding beklede transplantaten in wezen een porositeit nul.

5 De uitvinding wordt nu nader toegelicht aan de hand van de hierbij behorende tekening, waarvan figuur 1 een met collageen beklede kunstader volgens de uitvinding weergeeft, gedeeltelijk in dwarsdoorsnede, figuur 2 een vertakte kunstader van het in figuur 1 afgebeelde type weergeeft, ook gedeeltelijk in dwarsdoorsnede, 10 figuur 3 een grafiek is die de geleidelijke afgifte van tetracycline uit een collageensuspensie in konijnen toelicht, figuur 4 een grafiek is die het geleidelijk afgeven van tetracycline bij verschillende collageenconcentraties weergeeft, en figuur 5 een grafiek is die de geleidelijke afgifte van tetracycline uit een collageengel bij verschillende 15 concentraties en doseringen weergeeft.

Een kunstader 10 volgens de uitvinding is weergegeven in figuur 1. Kunstader 10 heeft een buisvormig substraat 12 van biologisch aanvaardbare draadvormige kunststof, bij voorkeur van een polyethyleenerefta-laat zoals Dacron. Substraat 12 is een poreus, gerend gebreid Dacron weefsel met een binnen- en 20 buitenoppervlak van velours zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.047.252. Deze buis 12 mag echter ook van ieder ander biologisch aanvaardbaar draadvormig materiaal gemaakt zijn mits men van dat materiaal een poreuze structuur kan maken die naar binnengroeien van weefsel toelaat en ruimte voor bloeddoorstroming openlaat.

Het buisvormige deel 12 heeft op het binnenoppervlak een bekleding van collageen 16. Collageen 25 bekleding 16 is opgebouwd uit ten minste drie lagen opgebrachte collageenfibrillen. Figuur 2 laat een vertakte met collageen beklede kunstader 20 zien. Het transplantaat 20 heeft een hoofdbuis 22 met twee takken 24. De hoofdbuis 22 en de takken 24 zijn gemaakt van Dacron breiwerk 26 waarvan het binnenoppervlak bekleed is met collageen 29, opgebouwd uit ten minste drie lagen collageenfibrillen.

De bij deze uitvinding bruikbare poreuze buissubstraten zijn bij voorkeur gemaakt door breiden of weven 30 van Dacron muitifilament garens welke bij zulke producten gebruikelijk zijn. In het algemeen varieert de porositeit van het Dacron substraat tussen 2000 en 3000 ml/min.cm2 (zuiver water, 120 mm kwik). De binnenbekleding van verknoopt collageen wordt aangebracht door een buisvormig substraat te vullen met een suspensie van collageenfibrillen met weekmaker en met de hand te masseren, waarna overmaat vloeistof verwijderd wordt en men de afgezette dispersie laat drogen. Na een laatste maal opbrengen wordt 35 de collageenbekleding verknoopt door hem aan formaldehydedamp bloot te stellen, wordt hij aan de lucht en onder vacuüm gedroogd om vocht en resten formaldehyde te verwijderen. De volgens de uitvinding beklede transplantaten hebben in wezen een porositeit nul.

De nu komende, niet beperkende voorbeelden lichten en bereiden van gezuiverd collageen uit runder-huid toe en het maken van beklede kunstaders volgens de uitvinding.

40

Voorbeeld I

Verse kalverhuiden werden mechanisch losgesneden en in een draaiend vat met koud stromend water uitgewassen totdat ze vrij van vloervuil, bloed en weefsels waren. De onderhuid werd mechanisch ontdaan van resten weefsels, waaronder vetweefsel en bloedvaten. Vervolgens werden de huiden in de lengterich-45 ting tot ongeveer 12 cm brede stroken versneden die in een houten of plastic kuip geplaatst werden, zoals in de leerindustrie gebruikelijk is. De huiden werden onthaard door ze 25 minuten in contact te houden met 1 M Ca(OH)2. (Ook kunnen de huiden op mechanische wijze onthaard worden of door een combinatie van chemische en mechanische behandeling.) Na het behandelen werden de huiden in stukjes van ongeveer 2½ cm x 2½ cm versneden en met koud water uitgewassen.

50 Na het wassen werd 120 kg runderhuid geplaatst in een vat met 260 liter water, 2 liter 50% NaOH en 0,4 liter 35% H202. De inhoud werd 12 tot 15 uur langzaam bij 4°C geroerd en daarna 30 minuten met veel kraanwater uitgespoeld, wat gedeeltelijk gezuiverde huiden gaf. Deze gedeeltelijk gezuiverde huiden werden nu 5 minuten behandeld met een oplossing van 1,2 liter 50% NaOH en 1,4 kg CaO in 260 liter water, onder langzaam roeren. Deze behandeling werd gedurende 25 dagen tweemaal per dag uitgevoerd. De oplossing 55 werd iedere keer afgeschonken en weggedaan en tenslotte werden de huiden 90 minuten onder voortdurend roeren met veel kraanwater uitgewassen.

De huiden werden aangezuurd door ze onder hevig roeren met een mengsel van 14 kg 35% HCI en 70 3 193263 liter water te behandelen. Het zuur liet men ongeveer 6 uur in de huiden binnendringen. Na het aanzuren werden de huiden ongeveer 4 uur met veel kraanwater gewassen totdat een pH van 5,0 bereikt was. De pH van de huiden werd met azijnzuur dat 0,5% conserveringsmiddel bevatte weer op 3,3-3,4 ingesteld. De gezuiverde huid ging dan door een vleesmolen en werd daarna door een serie filterzeven met steeds 5 kleinere maaswijdte geëxtrudeerd. Het eindproduct was een witte, homogene, gladde pasta van zuiver, uit runderhuid verkregen collageen.

Om de transplantaten in droge toestand voldoende soepelheid te geven wordt voor het opbrengen aan de waterige collageensuspensie een biologisch aanvaardbare weekmaker toegevoegd. In een collageensuspensie met tussen 0,5 en 5 gew.% collageen zit tussen 4 en 12 gew.% weekmaker. Tussen 10 en 25% 10 ethanol kan aanwezig zijn om het verdampen van het water te versnellen.

De belangrijkste verandering die optreedt bij het bekleden van een buisvormig kunsttransplantaat met collageen en weekmaker volgens de uitvinding is dat de porositeit van het poreuze substraat tot ongeveer nul daalt. Ter vergelijking: de porositeit van 20 lukraak gekozen niet beklede kunstaders van Meadox Microvel hadden een gemiddelde porositeit voor water van 1796 ml/min.cm2 bij 120 mm kwik, met een 15 standaarddeviatie van 130. Na bekleden volgens de uitvinding is de porositeit tot nul teruggebracht. Het volgende voorbeeld licht dat toe.

Voorbeeld II

Een injectiespuit van 50 ml werd gevuld met een waterige suspensie van 2% gezuiverd runderhuid-20 collageen, bereid zoals beschreven in voorbeeld I. De collageensuspensie bevatte 8% glycerol, 17% ethanol met de rest water, en had een viscositeit van 30.000 cps. De spuit werd geplaatst in één uiteinde van een Dacron kunstader ’’Meadox Medical Microvel” van 12 mm lengte en 8 mm doorsnede. De suspensie werd in deze kunstader geïnjicieerd en die werd met de hand gemasseerd zodat het gehele binnenoppervlak met de collageensuspensie bedekt werd. Een beetje overmaat collageensuspensie werd door één van de open 25 uiteinden afgevoerd. Men liet de kunstader ongeveer een Vz uur bij kamertemperatuur drogen. Het bekleden met drogen werden driemaal herhaald.

Nadat de vierde bekleding aangebracht was werd de collageenbekleding verknoopt door hem 5 minuten aan formaldehydedamp bloot te stellen. De verknoopte kunstader werd 15 minuten aan de lucht gedroogd en dan 24 uur onder vacuüm om vocht en resten formaldehyde te verwijderen.

30

Voorbeeld III

De bloeddichtheid van de volgens voorbeeld II verkregen met collageen beklede kunstaders werd als volgt bepaald. Een microvel transplantaat van 8 mm x 12 cm werd over de uitlaat van een bloedreservoir gespannen; op dit vel stond dankzij de hydrostatische hoogte een druk van 120 mm kwik. Met heparine 35 gestabiliseerd bloed werd door dat vel geleid. Men ving het doorgelopen bloed op en berekende de doorlaatbaarheid in ml per min.cm2. Bij vijf proeven vond men een porositeit van 0,04, 0,0, 0,0, 0,04 en 0,03. Dit betekent een gemiddelde porositeit van 0,022 ml/min.cm2, wat men met nul gelijk mag stellen, daar het binnen de experimentele fout van dit onderzoek lag.

Ter vergelijking werd die doorlaatbaarheidsmeting ook uitgevoerd op een niet bekleed stuk microvel; de 40 gemiddelde porositeit was nu 36 ml/min.cm.

Voorbeeld IV

Dat de porositeit van een transplantaatweefsel met drie collageenbekledingen tot ongeveer 1% teruggebracht wordt werd als volgt met een standaard porositeitsproef gedemonstreerd. Men liet gedurende een 45 minuut water onder een druk van 120 mm kwik door een met weefsel afgesloten opening van een Vz cm2 stromen. Men mat de opgevangen hoeveelheid water en berekende de doorlaatbaarheid per minuut per cm2. Aan elk monster werden meerdere bepalingen uitgevoerd. De porositeit van een microvel transplantaatweefsel was ongeveer 1900 ml/min.cm2. Na bekleding vond men: 50 Aantal bekledingen Porositeit 0 1900 1 266 2 146 55 3 14 4 5 193263 4

Aantal bekledingen Porositeit 5 5 2,2 6 0

In al deze gevallen was de collageenbekleding verkregen uit een suspensie volgens voorbeeld II en was het 10 collageen afkomstig uit runderhuid. Afgaande op deze uitkomsten verdient het de voorkeur een collageenbekleding uit drie of vier laten fibrillen op te bouwen, en nog beter uit vier of vijf lagen, met tussentijds drogen en tenslotte verknopen zodat de bekleding aan het substraat vastgelegd wordt.

Behalve dat de met collageen beklede kunstaders minder poreus zijn zijn zij ook minder thrombogeen dan onbeklede transplantaten.

15 Volgens onderhavige uitvinding worden van elke collageenbekleding althans de laatste twee lagen chemisch gemodificeerd door er een geneesmiddel in op te nemen (bijvoorbeeld een middel tegen thromboso zoals heparine) waarmee infectie en bloedstolling aan de binnenoppervlakken van die kunst-aderen tegengegaan worden. Zoals opgemerkt kan collageen met uiteenlopende geneesmiddelen complexen vormen, waaronder met middelen tegen bacteriën, microben en schimmels. Voorbeelden van 20 volgens de uitvinding te gebruiken anti-bacteriële stoffen zijn oxacilline, gentamycine, tetracycline, cefalospo-rine e.d., die voor het bekleden van het transplantaat met het collageen gecombineerd kunnen worden.

De antimicrobiële werking van een volgens de uitvinding met collageen bekleed kunsttransplantaat werd als volgt aangetoond:

25 Voorbeeld V

Overeenkomstig voorbeeld I werd een homogene suspensie van uit runderhuid verkregen collageen aangemaakt die 1% collageen, 8% glycerol en 17% ethanol bevatte, de rest was water. Aan deze suspensie werd per ml 20 mg Ceclor (een cefalosporine van de firma Eli Lilly & Co. dat de groei van Staphylococcus aureus en Escherichia coli remt) toegevoegd. De collageensuspensie met daarin het Ceclor werd onder 30 massage aangebracht op beide kanten van een dubbel velours Dacron weefsel, met tussen de bekledingen een half uur drogen. Dit leidde tot het opbrengen van 3,1 mg collageen per cm2.

Ter vergelijking werd een dubbel velours Dacron weefsel ook geïmpregneerd met dezelfde collageensuspensie waaruit Ceclor weggelaten was. Deze blanco had een bekleding van 4,1 mg collageen per cm2.

Beide stukken bekleed weefsel werden 1 minuut ondergedompeld in een oplossing van 4% formaldehyde 35 en 10% glycerol en dan 64 uur onder vacuüm gedroogd en met γ-straling gesteriliseerd.

De anti-microbiële werking van het met collageen beklede Dacron transplantaat dat ook Ceclor bevatte werd met een agar-diffusieproef bepaald. Stukjes van 1 cm2 werden geplaatst op beënte agar-oppervlakken wat tot remmingszones leidde waaruit af te leiden viel dat het anti-bioticum werkte tegen S. aureus (zone van 34 mm) en tegen E. coli (zone van 29 mm). De blanco vertoonde geen enkel anti-microbieel effect. De 40 uitkomsten zijn nog eens samengevat in tabel A.

TABEL A

Doorsneden der remmingszones 45 - A1. Met collageen bekleed weefsel met Ceclor Plaat 1 Plaat 2 Plaat 3 Gemiddeld S. aureus 36 mm 31 mm 35 mm 34 mm E. coli 33 mm 28 mm 27 mm 29 mm 50 A2. Met collageen bekleed weefsel zonder Ceclor Plaat 1 Plaat 2 Plaat 3 Gemiddeld S. aureus 0 0 0 0 E. coli 0 0 0 0 55 -

Claims

5 193263 Voorbeeld VI Een volgens voorbeeld I bereide collageensuspensie die blijkens zijn hydroxyprolinegehalte 13,2% collageen bevatte werd 1 ;3 met water (W) gemengd tot een homogeen 3,3 gew.% collageengel (G). De pH daarvan werd op 3,8 ingesteld en per ml gel werd 20 mg tetracycline (TC) toegevoegd. Direct voor de injectie 5 daarvan in twee konijnen werd het collageen-tetracyclinecomplex met glutaaraldehyd behandeld (0,3 ml 3% glutaaraldehyd per ml gel) en dan met injectienaalden no. 18 subcutaan ingespoten. Twee konijnen dienden als blanco, zij kregen dezelfde hoeveelheden tetracycline en water, per kg lichaamsgewicht 20 mg TC/ml water. Om het vrijkomen van het tetracycline uit de injectieplaats na te gaan werd op diverse tijden na het 10 injecteren uit een oorader van elk konijn bloed afgetapt. Het TC-gehalte in het bloed werd bepaald met de methode van Wilson c.s. (Clin. Chem. Acta. 36 (1972) 260). De uitkomsten van de TC-bepaling in bloed bij de vier konijnen in monsters die tussen 2 uur en 7 dagen na injiceren getrokken waren, staan in figuur 3. Figuur 3 laat zien dat na injectie van TC in water het serumgehalte aan antibioticum in twee uur zijn maximum bereikte, zie lijn A. Na 11 uur was het TC niet meer aantoonbaar. Toen tetracycline toegediend 15 werd in met glutaaraldehyd verknoopt collageengel (10G + 30W) bleef het serumgehalte aan TC gedurende 6 dagen constant, zie lijn B. Toedienen van TC in collageengel verlengde het effectieve vrijkomen van het geneesmiddel met een factor 25. Voorbeeld VII 20 De proef van voorbeeld V werd herhaald maar nu met collageengel van twee verschillende concentraties. Bovendien werd nu oxytetracycline toegediend in een dosis van 30 mg per ml en 1 ml per kg lichaamsgewicht, dus 50% meer aan tetracycline dan in het preparaat van voorbeeld V. De beproeving van dit preparaat gebeurde overeenkomstig voorbeeld VI, en de uitkomsten daarvan zijn weergegeven in figuur 4. Uit figuur 4 ziet men dat de collageenconcentratie van het gel het tempo waarmee OTC vrijkomt beïnvloedt, 25 Hoe dichter het collageengel, hoe langzamer het geneesmiddel vrijkomt. In dit voorbeeld volgde men de afgifte van het OTC over in totaal 124 uur bij in totaal 6 konijnen. Lijn A van figuur 4 laat zien dat het serumgehalte aan OTC kort na de injectie zijn top bereikt en dat OTC na 18 of 20 uur niet meer aantoonbaar is. Lijn B toont de serumconcentratie aan OTC dat vrijkwam uit een collageenmatrix bij een gewichtsverhouding van gel/water van 1:20, en lijn C hetzelfde toen die 30 verhouding 3:20 bedroeg. Het vrijkomen van OTC gaat sneller uit een minder geconcentreerd gel (lijn B). Voorbeeld VIII Twee porties collageen die 3% droge stof bevatten werden met tetracycline gemengd, tot concentraties van 50 en 100 mg TC per ml gel (resp. A en B). Na 10:3 mengen met 3% glutaaraldehyd werd preparaat A 35 geïnjiceerd in een dosis van 2 mg/kg lichaamsgewicht en preparaat B in een dosis van 1 mg/kg. Het vrijkomen van het TC uit deze preparaten is in figuur 5 met lijnen A en B weergegeven. Preparaat A werd ook in een dosis van 1 mg/kg geïnjiceerd, en het vrijkomen daaruit is afgebeeld met lijn C van figuur 5. Het verloop van de plasmagehalten aan tetracycline werd gedurende 5 dagen gevolgd. Uit de cijfers van figuur 5 ziet men zowel de feitelijke tetracyclineconcentraties als de invloed van de 40 vorm van het ingebrachte preparaat op het tempo waarmee het tetracycline uit het gel in het plasma terecht kwam. Men ziet dus dat de eerder genoemde oogmerken doeltreffend bereikt worden. 45 Conclusies

1. Werkwijze voor het vervaardigen van een bloeddichte kunstader die een geneesmiddel afgeeft, waarbij men vanaf de binnenzijde een soepel, poreus, buisvormig kunsttransplantaat impregneert en bekleedt met een complex van collageenfibrillen met een geneesmiddel vermengd met een weekmaker, en de collageen- 50 bekleding droogt, met het kenmerk, dat het kunsttransplantaat een porositeit van 2000 tot 3000 ml/min.cm2 (zuiver water, 120 mm kwik) heeft en dat de collageenfibrillen worden aangebracht vanuit een waterige collageenbrij en in het kunsttransplantaat worden gemasseerd en vervolgens gedroogd en verknoopt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de stappen van het opbrengen van een waterige collageenbrij, in het kunsttransplantaat masseren en drogen ten minste driemaal herhaald worden.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de collageenbrij 0,5 tot 5,9 gew.% met voldoende geneesmiddel gecomplexeerd collageen en 4 tot 12 gew.% weekmaker en voor de rest water 193263 6 bevat.

4. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het collageen-geneesmiddelcomplex verknoopt wordt door blootstellen aan formaldehydedamp. Hierbij 2 bladen tekening