NL2000715C2

NL2000715C2 - Penem-prodrugs.

Info

Publication number: NL2000715C2
Application number: NL2000715A
Authority: NL
Inventors: Katherine Elizabeth Brighty; Anthony Marfat; Dale Gordon Mcleod; John Paul O'donnell
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2006-06-28
Filing date: 2007-06-19
Publication date: 2008-03-11
Also published as: DE602007011622D1; KR101060448B1; MA30568B1; US20080009474A1; TW200816999A; SV2008003139A; GT200700050A; JP2010013468A; KR20090015147A; AU2007263519A1; EP2044085A2; JP5152527B2; US20090042853A1; TNSN08537A1; JP2009542616A; CA2655485A1; US7795243B2; CR10467A; DK2044085T3; MX2009000116A

Description

Penem-prodrues 5 Gebied en achtergrond

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op antiinfectieuze verbindingen, antibiotica, orale antibiotica en prodrugs, in het bijzonder sulopenem-prodrugs, hun bereiding en toepassing.

10 In het Amerikaanse octrooischrift 5013729 wordt sulopenem beschreven, dat een breedspectrum antibioticum is, dat als (5R,6S)-6-[(lR)-l-hydroxyethyl]-7-oxo-3-[[(1 R,3S)tetrahydro-l -oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-l -azabicyclo[3.2.0]hept-2-een-2-carbonzuur kan worden aangeduid.

Andere penems en prodrugs worden in bv. de Amerikaanse octrooischriften 15 4.952.577 en 5.506.225, en in WO 1992/003444 en WO 2004/067532 beschreven.

Verscheidene preklinische en klinische onderzoeken zijn met sulopenem en bepaalde prodrugs daarvan uitgevoerd. Sulopenem zelf is niet op merkbare wijze oraal biobeschikbaar. In het Amerikaanse octrooischrift 5.013.729 worden ook sulopenem-prodrugs beschreven, waaronder het pivaloyloxymethylprodrug van sulopenem (sulo-20 penem-POM-ester). Wanneer de POM-ester oraal als een mengsel van twee stereo-isomeren wordt toegediend, bleek de POM-ester bij de mens oraal biobeschikbaar te zijn. Zie Foulds c.s., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, biz. 665-671 (april 1991). POM-ester-prodrugs staan echter in verband met camitine-depletie in weefsel na hydrolyse en afgifte van pivalinezuur of trimethylazijnzuur. Zie Brass, Pharmacological 25 Reviews, 54,589-598 (2002).

Samenvatting

De onderhavige uitvinding richt zich op de behoefte aan nieuwe sulopenem-30 prodrugs die een of meer van: een hoge orale blootstelling of biobeschikbaarheid, het niet neigen carnitine in weefsel te depleteren, fysico-chemische eigenschappen, zoals kristalliniteit, smeltpunt, oplosbaarheid in water en permeabiliteit, die zeer geschikt zijn voor praktische farmaceutische formulering en toepassing, combineren.

2000715 2

Volgens sommige oogpunten omvat de onderhavige uitvinding de verbindingen met formule I:

OH

1-, 0 \ '—o ,— 5

Volgens andere oogpunten omvat de onderhavige uitvinding de verbindingen met formule II: 'W-Ck _ '—O O" " V-- o' 10

De uitvinding omvat verder formuleringen en de toepassing van de verbindingen om bacteriële infectie te behandelen of te voorkomen.

Verbindingen 15

De onderhavige uitvinding omvat de prodrugs met de formules I en II, zoals hierboven is weergegeven en beschreven. Alle stereo-isomeren en mengsels daarvan worden beoogd en omvat, zoals door middel van de bovenstaande tekeningen wordt weergegeven, die zowel de R- als de S-confïguraties bij de stereocentra mogelijk maken en 20 omvatten.

Een voorkeursconfiguratie van de verbindingen met formule I en II is: 3 on o'

In het bijzonder bezit de oxothiolanylgroep bij voorkeur de lR,3S-configuratie, zoals hieronder wordt weergegeven.

5

OH

__( Η H

(R)\ w Γ -S , yPV)—* <y~°\ '—o λ*

Er wordt bijvoorbeeld (2-ethyl-l-oxobutoxy)methyl(5R,6S)-6-[(lR)-l-hydroxyethyl]-7-oxo-3-[[(lR,3S)-tetrahydro-l-oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-l-azabicyclo-10 [3.2.0]hept-2-een-2-carboxylaat (verbinding 1 in dit document) verschaft, die hieronder wordt weergegeven: oh 0 \ 15 Door een ander voorbeeld wordt (2-ethoxy-2-methyl-l-oxopropoxy)methyl- (5R,6S)-6-[(l R)-l -hydroxyethyl]-7-oxo-3-[[( 1 R,3S)-tetrahydro-1 -oxido-3-thienyl]thio]- 4-thia-l-azabicyclo[3.2.0]hept-2-een-2-carboxylaat (verbinding 2 in dit document) ver schaft, die hieronder wordt weergegeven: 4

OH

Jl Η H

^fïVs-0>, 0^°\

.V

Ί 5

De prodrugs volgens de onderhavige uitvinding kunnen amorf zijn of kunnen ills verschillende kristalvormen of polymorfen, waaronder solvaten en hydraten, voorkomen. Polymorfen van prodrugs vormen een deel van deze uitvinding en kunnen door middel van kristallisatie van een prodrug volgens de onderhavige uitvinding onder verscheidene 10 omstandigheden worden bereid. Polymorfen kunnen ook door middel van verwarmen of smelten van een prodrug gevolgd door een geleidelijke of snelle afkoeling worden verkregen. De aanwezigheid van polymorfen kan door middel van vaste-stof-NMR-spectroscopie, IR-spectroscopie, differentiële scanning calorimetrie, röntgendiffractie aan een poeder of andere van zulke werkwijzen worden bepaald. Aldus biedt een omschrij-15 ving van een verbinding als zodanig de mogelijkheid voor de polymorfen ervan, waaronder water of oplosmoleculen die daarmee verbonden zijn.

Bereiding 20 De prodrugs volgens de onderhavige uitvinding kunnen bv. uit het vrije zuur van sulopenem volgens bekende werkwijzen worden bereid, zoals die werkwijzen welke in dit document of in de Amerikaanse octrooischriften 3.951.954; 4.234.579; 4.287.181; 4.452.796; 4.342.693; 4.348.264; 4.416.891; 4.457.924 en 5.013.729 zijn beschreven, waarbij alle octrooischriften door middel van referentie in hun geheel worden opgeno-25 men.

5

Toepassing

Prodrugs volgens deze uitvinding kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid 5 van infecties die in een ziekenhuis en onder de bevolking zijn opgelopen, zoals luchtweg-infecties, chirurgische infecties, infecties aan het centraal zenuwstelsel, gastro-intestinale, genitale, gynaecologische infecties, huidinfecties & infecties aan het zachte weefsel en oculaire infecties en onder de bevolking opgelopen longontsteking bij de mens, te behandelen. De antibacteriële werkzaamheid van de prodrugs kan eveneens met voordeel voor 10 preventieve toepassing worden gebruikt. Aan orale toepassing wordt de voorkeur gegeven. De gegevens met betrekking tot de biologische werkzaamheid wordt hieronder gegeven.

De minimale hoeveelheid toegediende prodrug is een minimale, therapeutisch werkzame hoeveelheid. De maximale hoeveelheid toegediende prodrug is die hoeveel-15 heid welke toxicologisch aanvaardbaar is. Bij sommige uitvoeringsvormen is de hoeveelheid toegediende sulopenem-prodrug die hoeveelheid, welke de antibiotische concentratie van sulopenem in plasma hoger dan de (90% minimale remmende concentratie) MIC90S (bv. ongeveer 0,5 pg/ml of ongeveer 1 pg/ml) van de infecterende pathogenen gedurende ten minste ongeveer 30% (bv. ten minste ongeveer 3,6 uur voor BID 20 (2x/dag) dosering of 2,4 uur voor TID (3x/dag) van het interval tussen de doseringen handhaaft.

In het algemeen kan een dagelijkse dosis van de sulopenem-prodrug voor volwassenen in het bereik van ongeveer 500 mgA (equivalent aan mg sulopenem) tot ongeveer 6 gA, of in het bereik van ongeveer 1 gA tot ongeveer 5 gA, liggen. Een regiem 25 van de sulopenem-prodrug voor volwassenen kan in het bereik van ongeveer 500 mgA tot ongeveer 1500 mgA liggen, die twee keer per dag met tussenpozen van ongeveer 12 uur wordt toegediend. Een regiem kan gedurende een periode van ongeveer één week tot ongeveer twee weken worden toegediend. Voor bepaalde infecties kan het noodzakelijk of gewenst zijn doseringen buiten deze parameters te gebruiken.

30 Een dagelijkse dosering van de prodrug volgens de onderhavige uitvinding kan gewoonlijk dagelijks 1-4 keer, gewoonlijk met gelijke doses, worden toegediend. Bij sommige uitvoeringsvormen kan de dosering van de prodrug in het bereik van ongeveer 500 tot ongeveer 2500 mg BID of TID liggen; in het bereik van ongeveer 800 mg 6 tot ongeveer 1 g BID; of ongeveer 2 g BID of TID voor ernstiger infecties. Bij sommige uitvoeringsvormen kan de dosering in het bereik van ongeveer 7 tot ongeveer 25 mg/kg BID; in het bereik van ongeveer 17 tot ongeveer 45 mg/kg BID; of in het bereik van ongeveer 17 tot ongeveer 45 mg/kg TID liggen.

5 Bij sommige uitvoeringsvormen wordt de behandeling intraveneus met sulope- nem zelf of een ander antibioticum geïnitieerd en de behandeling wordt vervolgens met een orale prodrug volgens de onderhavige uitvinding voortgezet.

Zoals hieronder verder wordt besproken, bleek de prodrug volgens verbinding 1 gedurende 3,18-4,84 uur na orale toediening van 1000 mg (equivalent aan ongeveer 10 730 mg sulopenem) van de prodrug gehaltes hoger dan 0,5 pg/ml in het humane bloed te verschaffen. Bij een ander experiment bleek de prodrug volgens verbinding 1 gedurende 4,28-5,94 uur na orale toediening van 2000 mg (equivalent aan ongeveer 1460 mg sulopenem) van de prodrug gehaltes hoger dan 1 μg/ml in het humane bloed te verschaffen.

15 De prodrug kan tezamen met andere werkzame middelen worden gebruikt. Sulo penem of de sulopenem-prodrug kan tezamen met probenecide of een gelijksoortig werkend middel dat een remmend effect op renale tubulaire secretie bezit, worden gebruikt.

20 Formulering

De onderhavige uitvinding omvat farmaceutische samenstellingen van de pro-drug(s) volgens de uitvinding die voor orale toediening met of zonder een of meer hulpstoffen en/of een of meer andere werkzame bestanddelen is (zijn) geformuleerd.

25 De prodrug kan in een solvaat- of hydraatvorm aanwezig zijn.

Orale doseringsvormen volgens de onderhavige uitvinding kunnen tabletten zijn, waaronder kauwtabletten, capsules, pillen, zuigtabletten, pilletjes, poeders, siropen, elixirs, oplossingen en suspensies, en dergelijke, overeenkomstig de farmaceutische standaardwerkwijze. De farmaceutische samenstelling volgens de onderhavige uitvin- 30 ding kan ook door middel van een nasogastrische sonde rechtstreeks aan het gastro-intestinale kanaal worden afgegeven.

Een orale doseringsvorm kan bij sommige uitvoeringsvormen in het bereik van ongeveer 800 tot ongeveer 2500 mg van de prodrug bevatten.

7

Hulpstoffen kunnen op basis van de beoogde doseringsvorm worden gekozen. Niet-beperkende voorbeelden omvatten polyvinylpyrrolidon, hydroxypropylmethylcel-lulose, hydroxypropylcellulose, sucrose, gelatine, acacia, dragantgom of maïszetmeel; vulmiddelen zoals microkristallijne cellulose, lactose, natriumcitraat, calciumcarbonaat, 5 dibasisch calciumfosfaat, glycine en zetmeel; desintegranten zoals maïszetmeel, aardappelzetmeel, alginezuur, natriumzetmeelglycolaat, croscarmellosenatrium en bepaalde silicaatcomplexen; glijmiddelen zoals magnesiumstearaat, natriumlaurylsulfaat en talk; en zoetstoffen zoals sucrose, lactose of sacharine. Wanneer een vorm van de gebruikseenheid een capsule is, kan de capsule, naast materialen van het bovenstaande type, een 10 vloeibare drager zoals een vetolie bevatten. Hulpstoffen kunnen ook hulpstoffen voor het suspenderen zoals xanthaangom of hydroxypropylmethylcellulose, glijmiddelen zoals colloïdaal siliciumdioxide, verdunningsmiddelen en volstoffen zoals siliciumdi-oxide, smaakstoffen, in het bijzonder in het geval van orale suspensies en sachets voor kinderen, omvatten. Stabilisatoren zoals bamsteenzuur kunnen ook worden gebruikt. 15 Verscheidene andere materialen kunnen als coatings aanwezig zijn of om de fysische vorm van de doseringseenheid te modificeren. Tabletten kunnen bijvoorbeeld met schellak, suiker, of beide worden gecoat. Gemodificeerde vormen voor gereguleerde afgifte worden eveneens beoogd.

De prodrug(s) zijn in de farmaceutische samenstelling met een hoeveelheid aan-20 wezig die voldoende is om de gewenste therapeutische doseringshoeveelheid in het in dit document beschreven bereik te verschaffen. De proportionele verhouding van pro-drug tot hulpstoffen hangt natuurlijk van factoren zoals de chemische aard, de oplosbaarheid en stabiliteit van de werkzame bestanddelen, evenals de beoogde doseringsvorm af. Normaliter kunnen de farmaceutische samenstellingen volgens de onderhavige 25 uitvinding in het bereik van ongeveer 20% tot ongeveer 95% prodrug per gewicht bevatten.

Biologische werkzaamheid van sulopenem 30 Sulopenem is tegen een breed bereik van pathogenen, waaronder ziekenhuispa- thogenen, werkzaam. Dit omvat een krachtige werkzaamheid tegen leden van de Ente-robacteriaceae die extended-spectrum β-lactamasen tot expressie brengen, die resistentie tegen cefalosporinen verschaffen (K. Pneumoniae, ESBL+). Bovendien zijn veel 8 van deze isolaten ook tegen fluorchinololonen resistent. Sulopenem is zeer werkzaam tegen veel klinisch relevante species van anaëroben.

De in-vitro-werkzaamheid van sulopenem (het moederzuur (5R,6S)-6-[(lR)-l-hydroxyethyl]-7-oxo-3-[[(lR,3S)tetrahydro—l-oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-l-5 azabicyclo[3.2.0]hept-2-een-2-carbonzuur) werd tegen pathogenen die bij infecties onder de bevolking en in het ziekenhuis zijn betrokken, zoals in tabel 1 wordt samengevat, beoordeeld.

Tabel 1. MICon-waarden (pe/mf) voor sulopenem 10

Staphylococcus aureus oxacilline-S 0,125

Staphylococcus saprofyticus 0,5

Alloiococcus otitidis 1

Streptococcus pyogenes (Groep A) 0,03

Streptococcus agalactiae (Groep B) 0,125

Streptococcus bovis (Groep D) 0,06

Viridans Streptococcus groep 0,25

Streptococcus pneumoniae penicilline-ontvankelijk 0,03

Streptococcus pneumoniae penicilline-tussenproduct 0,25

Streptococcus pneumoniae penicilline-resistent 1

Streptococcus pneumoniae levofloxacine-resistent 0,5

Listeria monocytogenes 0,125

Corynebacterium spp (niet C. jeikeium) 2

Citrobacter diversus 0,06

Citrobacter freundii 0,25

Enterobacter aerogenes 0,5 9

Enterobacter cloacae 1

Escherichia coli 0,06

Klebsiella oxytoca 0,125

Klebsiella pneumoniae 0,125

Klebsiella pneumoniae ESBL+ 0,25

Morganella morganii 2

Proteus mirabilis 0,5

Salmonella/Shigella 0,125

Haemophilus influenzae β-lactamase- 0,25

Haemophilus influenzae P-lactamase+ 0,5

Moraxella catarrhalis β-lactamase- 0,03

Moraxella catarrhalis p-lactamase+ 0,125

Legionella pneumofilia 0,06

Neisseria meningitides 0,06

Bacteroides fragilis 0,5

Clostridium perfringens 0,06

Prevotella spp 0,125

Aldus is sulopenem tegen een breed bereik van pathogene werkzaam, waaronder ziekenhuispathogenen die tegen cefalosporinen en fluorchinolonen resistent zijn. Het spectrum staaft de brede toepassing ervan in het ziekenhuis, waarbij de infecterende 5 pathogeen wordt geïdentificeerd en de ontvankelijkheid voor sulopenem wordt bevestigd. Dit omvat een brede lijst respiratoire indicaties en chirurgische indicaties, waarbij gemengde flora waarschijnlijk zijn betrokken, vooral als een deel van een multidrug-regiem wanneer gemengde infecties worden verdacht.

10 Orale werkzaamheid van de prodrug

De verbindingen werden bij drie verschillende modellen voor in-vivo-infectie op orale werkzaamheid gekenmerkt. De bacteriële pathogenen die werden gebruikt om elke infectie te bepalen, werden op basis van hun resistentieprofielen en mogelijkheden 15 om infectie te veroorzaken bij modellen die voor een humane ziekte relevant zijn, gekozen. De Klebsiella pneumoniae isolaten 1109 en 6485 zijn uit een collectie van re- 10 cente klinische isolaten van extended-spectrum β-lactamase-positieve (ESBL+) stammen en bezitten verhoogde MICs voor ciprofloxacine en ceftazidime evenals andere β-lactam-antibiotica. Beide isolaten vertoonden het vermogen om een lethale systemische infectie bij muizen te veroorzaken. Streptococcus pneumoniae 1095 is een penicilline-5 resistente, macrolide-resistente stam die pathogeen is bij systemische modellen voor muizen en modellen voor luchtweginfecties. De Haemofilus influenza stam Rd/AH5-3 werd uit de laboratoriumstam Rd verkregen; een gerichte puntmutatie in PBP3 maakt deze β-lactamase negatieve stam ampicilline-resistent (BLNAR). Deze stam is in staat middenoorontsteking bij een ziektemodel voor een Mongoolse woestijnrat te veroorza-10 ken. De resultaten worden hieronder in tabel 2 samengevat.

Model voor acute systemische infectie bii muizen: Voor dit model werden CF-1-muizen door middel van een intraperitoneale injectie van een lethaal vaccin van hetzij K. pneumoniae 1109, 6485, hetzij S. pneumoniae 1095 geïnfecteerd. Vier dosisgroepen 15 bestaande uit 8-10 muizen per groep werden geïnfecteerd en behandeld, waarbij een ruim bereik van dosisgehaltes werd bestreken. De muizen werd een BID-therapie bij hetzij 30 minuten/vier uur na de infectie, hetzij bij 1/5 uur na de infectie toegediend; de PD50 (de dosis waarbij 50% van de geïnfecteerde, behandelde muizen overleefde) werd op basis van de aantallen overlevende dieren op dag vier na de infectie berekend.

20

Model voor de luchtweeinfectie bii muizen: Dit model werd met een intranasale inenting van een lethale challenge van S. pneumoniae 1095 geïnitieerd, hetgeen longontsteking tot gevolg had. Vier dosisgroepen bestaande uit 8-10 muizen per groep werden geïnfecteerd en behandeld, waarbij een ruime reeks dosisgehaltes werd bestreken. De 25 BID-therapie werd achttien uur na de infectie geïnitieerd en gedurende twee dagen voortgezet. Het aantal muizen die elke dosisgroep op dag tien na de infectie overleefde, werd gebruikt om de PD50 te bepalen.

Model voor oorontsteking bii een woestijnrat: Teneinde oorontsteking te bepalen, wer-30 den Mongoolse woestijnratten door middel van intrabullaire inenting met een BLNAR-stam van H. influenzae geïnfecteerd. Vier dosisgroepen bestaande uit vijf woestijnratten per groep werden geïnfecteerd en behandeld, waarbij een ruime reeks dosisgehaltes werd bestreken. De TID-therapie werd achttien uur na de infectie geïnitieerd en gedu- 11 rende twee dagen voortgezet. Op dag vier na de infectie werden de dieren gedood, wassingen met vloeistof van het middenoor werden verzameld, en het aantal bacteriën dat zich daarin bevond, werd bepaald. ED50S werden op basis van de bacteriegehaltes berekend; monsters van de vloeistofwassing van het middenoor met tellingen lager dan 100 5 kolonievormende eenheden/ml werden als geklaard beschouwd.

De gegevens werden voor de verbindingen volgens de verbindingen 1 en 2; voor verbinding A (hieronder weergegeven) en voor verbinding BI, die de pivaloyloxyme-thylester (POM-ester) van sulopenem is ((lR,3S)oxothiolaan stereochemie) die hieronder wordt weergegeven, verzameld. Verbinding B2 is het diastereo-isomere mengsel 10 (hieronder weergegeven).

Verbinding A:

Η H

<y~\ '—o 15

Verbinding BI:

OH

__f Η H

0

'—O

y- o 20 Verbinding B2: 12

OH OH

JÖV-KX

jy m ^o- o' \

o'M

'—0 '—o o' o' 13

Tabel 2. In-vivo-werkzaamheid (PD;n of EDsn in mg/kg~) Model Verbinding 1 Verbinding 2 Verbinding A

Muizen 25,1 (13,6-36,6) 12,5 (12,4-12,6) 10,1 (3,8-16,4) acute systemische infectie versus K. pneumoniae 1109 (PD50) “ 9,0 (8,7-9,3) 16,2(15,9-16,6) 15,3 (9,0-2

Muizen 88,6 (87,8-89,4) 88,3 (68,5- 108,2) 40,7 (29,1-52,: acute systemische infectie versus K. pneumoniae 6485 (PDso) ” 63,4 (2,1-124,6) 32,7 (23,7-41,7) ~ _ : 63,4 (58,5-68,3) ~

Muizen 12,5(12,4-12,6) 7,9 (7,3-8,5) 9,0 (8,7-9,3) acute systemische infectie versus S. pneumoniae 1095 (PDso) ” 6,3 (1,5-11,1) 6,3 (3,4-9,1) 15,3 (9,0-21,6) 14 ü : 11,0(8,6-13,5) ~

Muizen 16,4 (9,8-23,0) 19,7(18,2-21,2) 17,8 (0-38,6) luchtweginfectie versus S. pneumoniae 1095 (PD50) ~ 12,5 (5,6-19,4) 38,5 (37,7-39,3) 20,8 (8,7-50,1) ~ 9,5 (4,0-15,0) - ~

Woestijnrat 8,7 (8,4-9,0) 5,7 (3,6-7,7) 6,9 (4,4-9,4) oorontsteking versus H. influenzae BLNAR (ED50) ~ 4,5 (4,4-4,6) 12,6 (6,8-18,3) 8,7 (8,4-9,0) 15

Klinische farmacokinetiek van de prodrues

Gegevens van de klinische farmacokinetiek (PK) van gezonde humane vrijwilligers voor de sulopenem-prodrugs volgens verbinding 1, verbinding B2 (gegevens van Foulds 5 c.s.) en verbinding A worden in de onderstaande tabel 3 samengevat. Verbinding B2 is een diastereo-isomeer mengsel, waarvan het diastereo-isomeer met de configuratie (1R,3S) op de oxothiolanylgroep verbinding BI is (zie de bovenstaande tekeningen). Voor de prodrug verbinding 2 zijn geen klinische gegevens beschikbaar.

Voor verbinding 1 en verbinding A ontvingen zes patiënten doses op een toene-10 mende wijze. Gehele bloedmonsters werden vóór het doseren en na 0,5, 1, 2, 3, 4,6, 8 en 12 uur na de dosis verkregen en voor plasma bewerkt. Serum- en plasmamonsters werden vervolgens onder gebruikmaking van gevalideerde HPLC-werkwijzen kwantitatief bepaald. Tmax-gegevens voor verbinding A worden als een mediaan en een bereik gegeven.

15 Een totaal van tien patiënten werden enkelvoudige doses van verbinding B2 toege diend. Zie Foulds c.s., hierboven. Bloedmonsters werden vóór het doseren en na 0,08, 0,17,0,33,0,5,1,1,5, 2, 3,4,6 en 8 uur verkregen en voor serum na orale toediening van verbinding B2 met 500 mg equivalent van de sulopenem moederverbinding (vijf patiënten) en 1000 mg equivalent van de sulopenem moederverbinding (vijf patiënten) be-20 werkt. Foulds c.s. bepaalden ook de bijdragen aan de PK uit de 1R,3S- (verbinding BI) en lS,3R-diastereo-isomeren die bij verbinding B2 aanwezig zijn.

25 16

Tabel 3. Klinische farmacokinetiek van verbinding 1. verbinding B2 en verbi Orale prodrug Dosis Dosis Cmax Tmax AU

(mg) sulopenem- (ng/ml) (uur) (uui equivalent (mg)

Verb. 1 4ÖÖ 292 1464 ±442 1,17 ±0,93 i ~ 6ÖÖ 438 1508 ±340 1,33 ±0,82 ! ~ ÏÖÖÖ 730 2860 ±570 0,83 ±0,41 6 ~ ÏÖÖÖ Ï46Ö 4667 ±1181 1,33 ±0,82 ïi _____

273 205 1180 ±280 NC

(Foulds c.s.)

~ 544 409 1790 ±490 NC

Verb. A 3ÖÖ Ï96 715 ±303 1,0 (0,5-1,5) “ ÏÖÖÖ 654 1380 ±372 0,5 (0,5-1,0) ~ lOOO fed 654 fed 1130 ±300 1,0 (0,5-3,0) “ 3ÖÖÖ 1960 2260 ±335 1,0 (0,5-1,5) i 17

De blootstelling aan sulopenem na orale toediening van verbinding B2 werd door middel van vergelijking met intraveneuze AUCs binnen hetzelfde onderzoek (tabel 4, Foulds c.s.) als geabsorbeerde fractie uitgedrukt. De geabsorbeerde fractie lag in het bereik van 38,5 tot 33,5% voor verbinding B2 bij equivalente sulopenemdoses in het bereik 5 van 205 tot 409 mg. Onder gebruikmaking van dezelfde intraveneuze gegevens in tabel 4 volgens Foulds c.s. kan een geabsorbeerde fractie van 37,1 en 28,0% bij equivalente sulopenemdoses van respectievelijk 292 en 438 mg voor verbinding 1 worden bepaald.

Hoewel verschillende dosisequivalente werden toegediend, is de trend voor de pro-drugs minder dan evenredig met de dosis toenamen bij systemische blootstelling. De ge-10 gevens van verbinding A tonen aan, dat ten minste een verhoogde lipofiliciteit van de prodrug zich niet noodzakelijkerwijs vertaalt naar verbeterde orale blootstelling. De lipofiliciteit (ClogP) werd onder gebruikmaking van ACD Labs 9.0 software (LogP/DB; www.acdlabs.coml met de onderstaande resultaten berekend: verbinding 1: -0,29; verbinding A: 0,83; verbinding BI: -1,0; verbinding B2: -1,0. Een verdere bepaling van ver-15 binding A toonde de inherente instabiliteit ervan in het gastro-intestinale kanaal. Een verbeterde gastro-intestinale stabiliteit zoals in vitro bij verbinding 1 onder gebruikmaking van humaan darmsap is aangetoond, staat in verband met een toename van orale blootstelling met betrekking tot de dosis.

20 Beoordeling en keuze van de prodrug

Prodrugs werden beoordeeld met de ultieme doelstellingen van het identificeren van verbindingen die een of meer van de onderstaande zaken bezitten of waarvan met kan voorspellen dat zij deze bezitten: een gunstige PK zoals een hoge blootstelling of 25 biobeschikbaarheid bij mensen na orale toediening; een gebrek aan neiging om carnitine in weefsel te depleteren; en fysico-chemische eigenschappen die gunstig zijn voor praktische farmaceutische formulering en toepassing.

Bepaling van verbinding A, naast andere zaken, leidde tot de conclusie dat men kan voorspellen dat de gastro-intestinale stabiliteit van de prodrug een belangrijke rol bij de 30 orale biobeschikbaarheid speelt. Nieuwe prodrugs werden, zoals hieronder gedetailleerd wordt beschreven, op stabiliteit in aanwezigheid van porcine pancrelipase (PPE) en stabiliteit in humaan darmsap (HIJ) beoordeeld en gerangschikt. De efficiëntie van de omzetting tot sulopenem in humaan leverhomogenaat werd ook als een belangrijke parameter 18 met betrekking tot de orale biobeschikbaarheid van de prodrug beschouwd. In-vitro-eindpunten voor lever S9, PPE en HIJ worden in tabel 4 samengevat. De prodrugs werden volgens de onderstaande algemene werkwijzen beproefd.

5 De efficiëntie van de omzetting van lever S9

Prodrugs werden op stabiliteit en omzettingsefficiëntie in humaan leverhomogenaat (S9-fractie) beoordeeld. Lever S9 werd voor elke volledige analyse vers uit stukken lever bereid, die bij -70°C waren opgeslagen. Ongeveer 5 g ingevroren leverweefsel werd in 15 10 ml ijskoud 100 mM kaliumfosfaatbuffer (pH= 7,4) tot uniformiteit gehomogeniseerd. Het homogenaat werd vervolgens gedurende 20 min bij 5°C bij 9000 g gecentrifugeerd, waarbij de S9 supernatant werd geïsoleerd. Elke incubatie werd bij een 1:10 verdunning van de S9-supematant in 100 mM kaliumfosfaatbuffer (pH= 7,4) uitgevoerd. De reacties (1 ml) werden door middel door middel van het toevoegen van substraat (50 μΜ eind-15 waarde) bij 37°C geïnitieerd. Porties (75 μΐ) werden na 0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 en 20 min verkregen en in 150 μΐ 80/20 acetonitril /100 mM ammoniumacetaat, pH= 4,5, die een interne standaard bevatte (ampicilline, 5 pg/ml), afgeschrikt. De monsters werden gedurende 10 min bij 3000 g gecentrifugeerd en de supernatants werden naar injectieampullen overgedragen. De eerste-orde ontleding van de prodrug werd, zoals hieronder wordt be-20 schreven, door middel van LC/MS/MS gevolgd. De omzetting tot sulopenem werd als een percentage van het molaire equivalent (50 μΜ) in een versterkt monster uitgedrukt. De verbindingen die een omzettingsefficiëntie van ongeveer 75% of meer bereikten, werden in het algemeen voor verdere beoordeling gebruikt.

25 Stabiliteit

Bij deze experimenten werd de inhoud van één ku-zyme® HP (USP pancrelipase-preparaat, bestaande uit: lipase 8000 USP eenheden, protease 30.000 USP eenheden en amylase 30.000 USP eenheden; Schwarz Pharma Inc., Milwaukee, WI), capsule in 50 ml 30 100 mM kaliumfosfaat, pH= 7,4, geroerd en tot uniformiteit gemengd. Elke incubatie (1 ml) werd bij 37°C uitgevoerd en werd door middel van het toevoegen van substraat (50 μΜ) geïnitieerd. Porties (100 μΐ) werden na 0, 0,5,1, 2, 3, 5,10 en 20 min na het toevoegen van het substraat genomen en met 200 μΐ 80/20 acetonitril/100 mM ammoniumace- 19 taat, pH= 4,5, die een interne standaard (ampicilline, 5 pg/ml) bevatte, afgeschrikt. De monsters werden gedurende 10 min bij 3000 g gecentrifugeerd en de supematanten werden naar injectieampullen overgedragen. Eerste-orde ontleding van de prodrug werd, zoals hieronder wordt geschreven, door middel van LC/MS/MS gevolgd. De verbindin-5 gen die een halveringsstabiliteit van ongeveer 10 min of meer bereikten, werden voor verdere beoordeling gebruikt.

In tabel 4 geven de enkelvoudige waarden een gemiddelde van twee duplobepalin-gen weer. Wanneer verdere bepalingen voor een bepaalde verbinding werden uitgevoerd, worden de gegevens als een gemiddelde en standaarddeviatie uitgedrukt. Alle verbindin-10 gen werden onder gebruikmaking van een eerste partij (Lot 1) van ku-zyme uitgevoerd.

De verbindingen 1, A, BI en B2 werden ook onder gebruikmaking van een tweede partij ku-zyme (Lot 2) beoordeeld, waarvoor de gegevens tussen haakjes worden weergegeven.

Bij de HIJ-experimenten werd HIJ van vier afzonderlijke patiënten (1 ml van elke 15 patiënt) met 1 ml 600 mM kaliumfosfaatbuffer, pH= 7,4, samengevoegd. Porties van 300 μΐ x 6 van het gebufferde humane darmsap werden na versterking van het substraat bij concentraties van 300, 100, 30, 10, 3 en 1 μΜ bij 37°C geïncubeerd. Twee prodrugs konden tegelijkertijd worden bepaald. Monsters van 35 μΐ werden na 0, 0,5, 1,2, 10 en 20 min genomen en met 70 μΐ 80/20 acetonitril/100 mM ammoniumacetaat, pH= 4,5, die 20 een interne standaard (ampicilline, 5 pg/ml) bevatte, afgeschrikt. De monsters werden gedurende 10 min bij 3000 g gecentrifugeerd en de supematanten werden naar injectieampullen overgedragen. Eerste-orde ontleding van de prodrug werd, zoals hieronder is beschreven, door middel van LC/MS/MS gevolgd. Het percentage prodrug dat achterbleef versus de tijd werd bij elke concentratie tot een vervalfunctie van de eerste orde 25 geschikt gemaakt teneinde de snelheidsconstante of kdep van de substraatdepletie te bepalen. Een grafiek van de lineaire log kdep versus de concentratie kan met de onderstaande vergelijking worden verkregen, waarin: k -k .(i__I3_l

Kdep - «'deplS |=0 1 rcl „ V + 30 20

De waarde van k<jep van een infinitesimaal lage substraatconcentratie (waarbij k<jep ~ kdep[si=o) geeft de maximale verbruikssnelheid of de intrinsieke klaring van het systeem weer en de Km is de concentratie, waarbij de helft van de maximale snelheid (Vmax) van het systeem wordt bereikt. In termen van Michaelis-Menton geeft de intrinsieke klaring 5 CLint de verhouding van Vmax/Km weer, wanneer [S] ruim onder de Km-waarde ligt. Sub-straateenheden voor deze Km-onderzoeken worden in μΜ en de intrinsieke klaring (CLini) in ml/min vermeld. In het algemeen werden de verbindingen met een intrinsieke klaring van <0,1 ml/min of een Km die drievoudig lager was dan de oplosbaarheid ervan in water (teneinde de enzymatische werking te verzadigen) voor verdere beoordeling onderzocht.

10

Oplosbaarheid

De oplosbaarheid bij evenwicht werd in 25 mM fosfaatbuffer (pH= 5) bij omgevingstemperatuur bepaald. Medicijnflesjes met overmaat prodrug in fosfaatbuffer werden 15 maximaal gedurende 48 uur geroteerd. Na de evenwichtsperiode werden de monsters getrokken, door een 0,45 pm Gelman Acroisc Nylon filter voor een injectiespuit gefiltreerd en onder gebruikmaking van HPLC op de concentratie van het geneesmiddel geanalyseerd. De HPLC-omstandigheden waren: kolom: Cl8, SymmetrieShield RP, Waters, 4,6x150 mm, 3,5 micron; mobiele fase A: acetonitril; mobiele fase B: 0,1% TFA in 20 water; stroomsnelheid: 1 ml/min; duur van het experiment: 30 min; injectievolume: 20 μΐ; detectie: 210 nm; oplosmiddel: acetonitril/water (50:50 v:v). De resultaten worden in tabel 4 weergegeven.

Gebruikte gradiënt:

25 Tijd %A %B

0 min 5 95 25 min 95 5 27 min 5 95 30 30 min 5 95 21

Smeltpunt

De smeltpunten werden door middel van een MEL-TEMP 3.0 capillair smeltpunt-5 apparaat bepaald en zij zijn niet gecorrigeerd.

Kwantitatieve bepaling van de prodrue

Afgeschrikte monsters van deze in-vitro-experimenten werden onder gebruikma-10 king van LC/MS/MS kwantitatief bepaald. De scheiding werd over een Phenomonex Primesphere C18-HC kolom (5 pm, 30 x 2,0 mm) onder gebruikmaking van een binaire gradiënt van oplosmiddel A (95% water / 5% acetonitril / 0,1% azijnzuur) en oplosmiddel B (5% water / 95% acetonitril /0,1 azijnzuur) volbracht. Het injectievolume bedroeg 20 μΐ. De kolom werd in evenwicht gebracht en de gradiënt werd met 100% A bij een 15 stroomsnelheid van 1000 μΐ/min geïnitieerd. De gradiënt werd binnen 0,4 min tot 100% B verhoogd, en vervolgens in 0,9 min tot 100% A teruggebracht. Ampicilline werd als een interne standaard (5 pg/ml) gebruikt. De effluent werd door middel van een massa-spectrometer (Sciex API 3000) voorzien van een turbo ionspray interface geanalyseerd en werkte met positieve ionen met een ontclusteringspotentiaal van 10 V, een tempera-20 tuur van 400°C en een botsingsenergie van 25 V. Alle prodrugs, sulopenem en ampicilline werden door middel van MRM-overgangen van de geprotoneerde moedermassa naar een hoofdfragmention in de door een botsing geïnduceerde dissociatiespectra gevolgd. Het kenmerkende dynamische bereik van de test lag in het bereik van 10,0 tot 10.000 ng/ml.

25

Tabel 4 22

Verb. Structuur S9 % omzetting PPE halveringstijd (min) HIJ H

(gem.) Km (n (μΜ) (g (gem.) 1 'Yh—Ck 0 jL ^ 100 11,7 ±3,8 (17,9 portie 2) 91 k 2 J\. “ 76 19,1 105

X

_ — 100 3,9 ±1,1 (6,3 portie 2) 300 _______ /i^-3~Ck BI ° 100 (22,5 ±0,6 portie 2) 29

θ' V

| m | |_|__ 23 -5^-0.

B2 Τ ^ 94 Π’6 (19,6 portie 2) 40 C " 2,4 21,1 o' \_ D >Λ

Jl Η H

E ° }>~-o - 6,4 1 h- I 1_L__ 24 p - 4,7 _______ G Λ 100 21,2 390 <y~°\ y o' — ifb-ck H cF \ - 6,8 chL____ #H £ I ° Vo 95 14,4

0 A

25 J Λ 86,8 11 rc_____ ___¥ H ±1 vry~c\ K & \ ^ 47,2 14’5 &Λ-

'—ο I

^______ __f H i) L 0

OH

H £ jxVs-0·^ M ° A—g 20,4 39,4

0 A

26 — — J -H tl N H,1 11,1 er on H £ O 0 /~8 - 8,3 '—0 Λ-ς —

Jt Η H

JÖ^O^ p ° y„ - ί,2

1^1 I

27

ÖH

-"Λ. »H =1 Q ° }~γ_ - 4,8 on __F Η η

R

° y~0 ° 5’3 ° \ S /^~Q 6,3

M 1 M

28

ÖH

J Η H

T 0 A-o - 7,7

° '-o V

>£____ U ·ίΜ_„ - 6,4 V 0 - 10,5

_I

29 _ _ J' H .Η W 0 /-o - 7,6

OH

__/ H H

X ° - 4,7 λ

OH

___f Ή H

'^fxy~s~Q^0.

Y ° - 8 ^1 30 Z °^λ ÖH “

AA

Or \_.

31

Camitine-depletie

Kleine alkaanzuren zoals pivalinezuur die op het koolstofatoom alfa ten opzichte van het carboxylaat volledig zijn gesubstitueerd, zijn door middel van β-oxidatie niet 5 voldoende gekataboliseerd. Dientengevolge wordt carnitine geacyleerd en acylcamitine accumuleert in het weefsel en de bloedstroom, waarbij vrije concentraties camitine worden gedepleteerd. Als zodanig verschaffen zuren die op het alfa-koolstofatoom volledig zijn gesubstitueerd de mogelijkheid om camitine die in het lichaam is opgeslagen te verlagen. Zie Brass, hierboven. Dit is bij therapieën met een korte duur met pivalinezuurbe-10 vattende prodrugs aangetoond, waarbij camititine-depletie een verminderde vetzuuroxi-datie en verminderde ketogenese tot gevolg heeft. Zie Abrahamson c.s., Biochem. Med. Metab. Biol., 52, 18-21 (1994). Een zijketen van een prodrug die snel en veilig wordt geëlimineerd en die camitine niet depleteert en in het lichaam wordt opgeslagen, zou gewenst zijn. De metabolische omzetting van bepaalde kleine alkaanzuren naar hun glu-15 curonide-conjugaten verschaft een efficiënt pad voor de eliminatie uit het lichaam. Val- proïnezuur blijkt bijvoorbeeld door middel van glucuronidatie extensief te worden geëlimineerd (zie Zaccara c.s., Clin. Pharmacol., 15, 367-389 (1988)), terwijl pivalinezuur bij de mens praktisch geheel als het acylcamitineconjugaat ervan wordt uitgescheiden. Zie Totsuka c.s., Antimicrob. Agents and Chemother., 36, 757-761 (1992). Men ziet in dat 20 subtiele veranderingen in de structuur zich tot aanzienlijke verschillen in metabolische dispositie van deze alkaanzuren kunnen vertalen.

De metabolische omzetting van bepaalde kleine alkaanzuren tot hun glucuronide-conjugaten verschaft een efficiënt eliminatiepad uit het lichaam. Valproïnezuur blijkt bijvoorbeeld door middel van glucuronidatie extensief te worden geëlimineerd (zie Zac-25 cara c.s., Clin. Pharmacol., 15, 367-389 (1988)), terwijl pivalinezuur bij de mens praktisch geheel als het acylcamitineconjugaat wordt uitgescheiden.

Van belang was een vergelijking tussen verbinding 1 en verbinding BI met betrekking tot de neiging van de zijketens van de prodrug of het ontbreken daarvan om camitine in plasma te depleteren na het metabolisme van de intacte prodrug. Dit werd onder 30 gebruikmaking van een serieus model van camitine-depletie bij Sprague-Dawley-ratten in vivo bepaald. Teneinde de mogelijke invloed in vivo te begrijpen, werden radiogela-beld pivalinezuur (zijketen van verbinding BI) en 2-ethylboterzuur (zijketen van verbinding 1) gedurende vier dagen oraal met een dosis van 200 mg/kg BID aan twee afzonder- 32 lijke groepen dieren toegediend. Het pivalinezuur werd met 14C op het carbonylkoolstof-atoom (1-plaats) gelabeld, en bezat een specifieke activiteit van 0,482 pCi/mg. Het 2-ethylboterzuur werd met ,4C op het koolstofatoom naast het carbonylkoolstofatoom (2-plaats) gelabeld, en bezat een specifieke activiteit van 0,503 pCi/mg. De doses werden in 5 100 mM natriumfosfaat, pH= 6,6, met een dosisvolume van 10 ml/kg toegediend. De bloedmonsters werden met tussenpozen van 24 uur na het begin van het onderzoek verkregen, voor plasma bewerkt en door middel van LC/MS/MS op camitinegehalte getest. Een controle met een vehiculum, bestaande uit orale toediening van een gelijk buffervo-lume zonder verbinding werd als een vergelijking van de basislijn voltooid. Zoals in fi-10 guur 1 is weergegeven, vertoonden dieren die 200 mg/kg BID pivalinezuur ontvingen verlaagde gehaltes van carnitine in plasma ten opzichte van de controle met een vehiculum. Daarentegen vertoonden dieren die dezelfde dosis 2-ethylboterzuur in de loop van vier dagen ontvingen statistisch niet-significante veranderingen van carnitine in plasma, hetgeen suggereert dat deze verbinding geen camitine-depletie veroorzaakt.

15 Een afzonderlijk onderzoek onder gebruikmaking van een enkelvoudige dosis van 200 mg/kg van elke radiogelabelde verbinding (pivalinezuur en 2-ethylboterzuur) werd aan ratten toegediend teneinde de systemische blootstelling van de dosis na orale toediening te bepalen. De orale toedieningsroute werd gekozen omdat men verwacht dat de meerderheid van de hydrolyse van de prodrugs binnen het darmkanaal vóór het binnen-20 gaan van de systemische circulatie zal optreden. Plasmamonsters werden vóór het doseren en op 0,25, 0,5, 1, 4, 8 en 24 uur na de dosering verkregen. De monsters werden voor de radioactiviteit door middel van een vloeistof-scintillatieteller kwantitatief bepaald en de pulsen werden tot pg equivalenten/ml omgezet. Zoals in tabel 5 en figuur 2 wordt weergegeven, wordt, zodra de verbinding is geabsorbeerd, de radioactiviteit in verband 25 met 2-ethylboterzuur 4,5 keer sneller dan pivalinezuur geklaard, hetgeen een efficiënte metabolische verwerking en uitscheiding van de verbinding reflecteert.

Bijgevolg verwacht men niet dat orale toediening van prodrug 1 camitine-depletie tot gevolg heeft, terwijl toediening van verbinding BI dat wel doet.

30 33

Tabel 5. Farmacokinetiek van de totale radioactiviteit bii Spraeue-Dawlev-ratten na orale toedienii ethvlboterzuur met een dosis van 200 me/kg (100 uCi/kgl

Toegediende verbinding Cmax Halveringstijd AUC

(μg eq./ml) (uur) (uur*pg eq./ml) pivalinezuur 247 ±36 13,8 ±6,7 6624 ±2948 2-ethylboterzuur 158 ±47 5,7 ±0,8 1332 ±402 34

Andere eigenschappen

Voor doeleinden van een geschikte formulering en geschiktheid als een farmaceutisch product is de verbinding bij sommige uitvoeringsvormen bij voorkeur vast bij ka-5 mertemperatuur, en vormt bij voorkeur gemakkelijk een kristallijne vaste stof, en is vrij stabiel tegen ontleding.

Discussie 10 Verbinding 1 bleek een gunstige combinatie van eigenschappen te bezitten. Naast de eigenschap dat verbinding 1 kristallijn en voldoende oplosbaar in water is, werd verbinding 1 bij de lever S9 experimenten volledig tot sulopenem omgezet, bezat een relatief lange halveringstijd voor PPE en een relatief lage intrinsieke klaring en verzadiging van intestinale enzymen in humaan darmsap. Op basis van deze gegevens werd voorspeld 15 dat verbinding 1 een gunstige klinische PK bezit, die door middel van de hierboven beschreven klinische gegevens werd bevestigd. Bovendien bezit verbinding 1, zoals door middel van de structuur ervan en het in dit document beschreven onderzoek naar carnitine, niet een gevoeligheid voor carnitine. Aldus combineert verbinding 1 ten minste alle van: goede orale biobeschikbaarheid, geen gevoeligheid voor carnitine en gunstige fysi-20 sche eigenschappen. Daarentegen was van andere prodrugs, in het bijzonder andere pro-drugs met alkylzijketens, niet te verwachten met deze eigenschappen overeen te komen. Verscheidene van de verbindingen C tot AA bezitten bijvoorbeeld een tertiair koolstof-atoom alfa ten opzichte van de carbonylgroep van de ester van de pro-groep (bv. verbinding C). Men kan verwachten dat deze verbindingen een mogelijke gevoeligheid voor 25 carnitine zullen bezitten. Andere van de testverbindingen bezaten een betrekkelijk lage PPE-stabiliteit en/of S9 omzetting, voorspelbaar voor een lagere GI-stabiliteit en orale biobeschikbaarheid. Nog andere verbindingen werden niet beproefd vanwege moeilijkheden bij het verkrijgen van gemakkelijk beproefbare monsters. Zie tabel 4.

Prodrug 2 bleek eveneens gunstige eigenschappen te bezitten, die de verwachte GI-30 stabiliteit en biobeschikbaarheid ervan en de fysische eigenschappen omvatten. Zie tabel 4.

35

Voorbeelden van de verbindingen

De onderhavige uitvinding wordt verder door middel van de onderstaande niet-beperkende voorbeelden toegelicht. Kristallijne sulopenem, die bij de onderhavige toe-5 lichting werd gebruikt, werd volgens voorbeeld 11 volgens het Amerikaanse octrooi-schrift 5.013.729 bereid.

Voorbeeld 1: (2-Ethyl-l -oxobutoxy)methyl(5R,6S)-6-[( 1R)-1 -hydroxyethyl]-7-oxo-3-[[(1 R,3S)tetrahydro-l -oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-1 -azabicyclo[3.2.0]hept-2-een-2-10 carboxylaat (verbinding 1).

De titelverbinding werd volgens het onderstaande schema en de onderstaande beschrijving bereid.

„ _ LZna*<CH,0>e —V O

—\P SOCI* —v, p *>H Cl : ii- Destillatie i. Nal, aceton IL HjO, iUjSjOj EtOAc r 1 T» (Ψ r vervolgens, n-heptaan 0 \

° HjO, NajSjOj 0^°H

° J NaCI, MgSO,

•geactiveerde koolstof EtOAc, MtBE

© θ

EtOAc OH /Sj-O

MtBE u ΡΛ Η Λ \ l ** TVVs^o o ^ 15 Stap 1: 2-Ethylboterzuur (1500 g) werd gedurende 1 uur aan een oplossing van thionylchloride (1800 g) in dichloormethaan (0,75 1) toegevoegd. Het mengsel werd onder terugvloeikoeling gekookt en door middel van GC (gaschromatografie) gevolgd. Na ongeveer 2 uur werd het reactiemengsel door middel van destillatie bij atmosferische druk geconcentreerd. Het mengsel werd vervolgens tot 22°C afgekoeld, dichloormethaan 20 (0,75 1) werd toegevoegd en het mengsel werd opnieuw bij atmosferische druk geconcen treerd. Vanwege de extreme corrosieve eigenschappen van de gebruikte reagentia liet men alle aiVoergassen door een vochtige basische gasreiniger passeren.

36

Stap 2: Ondertussen werd een mengsel van zinkchloride (18 g) en paraformaldehyd (480 g) bereid. Het halfruwe, pure zuurchloride werd gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur onder mechanisch roeren aan dit mengsel toegevoegd. Na een kleine induc-tieperiode werd een aanzienlijk exotherme reactie waargenomen. De temperatuur van het 5 reactiemengsel nam in 5 min van omgevingstemperatuur (25°C) tot 50°C toe. De snelheid van het toevoegen werd vertraagd om de exotherme reactie te beheersen en het reactiemengsel op 50°C te houden. Na volledige toevoeging liet men het reactiemengsel afkoelen en het reactiemengsel werd gedurende een extra 18 uur bij omgevingstemperatuur geroerd.

10 n-Heptaan (4 1) en een oplossing van 10% natriumbicarbonaat in water (9 1) werden vervolgens geladen en de fasen werden gescheiden. De waterfase werd met n-heptaan (3,4 1) geëxtraheerd. De samengevoegde organische fasen werden gefiltreerd en onder vacuüm gedestilleerd, waarbij het ruwe product werd verkregen. Het product werd door middel van vacuümdestillatie (10-20 mg Hg) gezuiverd, waarbij 587 g 2-15 ethylboterzuurchloormethylester werd verkregen.

Stap 3: 2-Ethylboterzuurchloormethylester (700 g) werd in aceton (3 1) opgelost. Aan deze oplossing werd natriumjodide (1,0 kg) toegevoegd. Het resulterende reactiemengsel werd onder terugvloeikoeling gekookt (2 uur, gevolgd door GC), totdat de reactie voltooid was. De oplossing werd vervolgens tot omgevingstemperatuur afgekoeld, 20 waarbij tert-butylmethylether (7 1) en 5% natriumthiosulfaat in water (4 1) werden toegevoegd. De fasen werden gescheiden en de organische fase werd met natriumthiosulfaat in water (4 1), water met een lage pyrogeniteit (4 1) en een oplossing van 10% natriumchlo-ride gewassen. De organische laag werd boven magnesiumsulfaat (350 g) gedroogd, gefiltreerd en de filterkoek werd met tert-butylmethylether (2 x 0,7 1) gewassen. Het filtraat 25 werd tot een klein volume (ca. 2 1) ingedampt, waarbij 2-ethylboterzuuijoodmethylester als een oplossing in tert-butylmethylether werd verkregen.

Stap 4: De halfruwe tert-butylmethyletheroplossing van 2- ethylboterzuurjoodmethylester uit stap 3 werd aan een suspensie van sulopenem (750 g) in aceton (5,9 1) toegevoegd. Ν,Ν-Diisopropylethylamine (DIEA) (319 g) in aceton (0,5 30 1) werd toegevoegd en het mengsel werd bij omgevingstemperatuur geroerd totdat de reactie was voltooid. Water met een lage pyrogeniteit (6,5 1) en heptaan (3,75 1) werden toegevoegd en de fasen werden gescheiden. De waterlaag werd eerst met heptaan (5 1) en vervolgens met ethylacetaat (2x61) geëxtraheerd. De ethylacetaatextracten werden sa- 37 mengevoegd en met een oplossing van 5% natriumthiosulfaat in water (6 1), water met een lage pyrogeniteit (6 1) en een oplossing van 10% natriumchloride in water (6 1) gewassen. Het organische extract werd met geactiveerde koolstof (75 g) en magnesiumsul-faat (150 g) behandeld en vervolgens gefiltreerd. De filterkoek werd met ethylacetaat (2 5 x 1 1) gewassen en het filtraat werd drooggedampt, waarbij het ruwe product (0,8 kg) werd verkregen. Ethylacetaat (2,4 1) werd toegevoegd en de oplossing werd verwarmd (45°C) teneinde een oplossing te bereiken. Deze oplossing werd vervolgens warm gefiltreerd en tert-butylmethylether (4,7 1) werd toegevoegd. De resulterende suspensie werd gedurende 10 min bij 40°C-50°C gegranuleerd en werd vervolgens langzaam tot minder 10 dan 10°C afgekoeld. De resulterende vaste stof werd verzameld, met een 1:2 mengsel van ethylacetaat en tert-butylmethylether (4 x 0,5 1) gewassen en onder vacuüm bij maximaal 50°C tot constant gewicht gedroogd, waarbij 0,57 kg van het gewenste product (opbrengst 60%) werd verkregen.

Stap 5: Het halfruwe product (0,55 kg) werd bij omgevingstemperatuur in ethylace-15 taat (1,65 1) gesuspendeerd. De temperatuur werd vervolgens op ca. 50°C ingesteld, waarbij een oplossing werd bereikt. Deze oplossing werd warm gefiltreerd, waarbij onoplosbare verontreinigingen werden verwijderd en vervolgens werd tert-butylmethylether (3,6 1) toegevoegd. De resulterende oplossing werd langzaam tot lager dan 5°C afgekoeld teneinde kristallisatie te initiëren. Het vaste product werd verzameld, met een 1:2 meng-20 sel van ethylacetaat en tert-butylmethylether (4x150 ml) gewassen en onder vacuüm bij maximaal 50°C tot constant gewicht gedroogd, waarbij 0,48 kg van het gewenste product (opbrengst 86%) werd verkregen. Het kristallijne materiaal bleek niet gesolvateerd te zijn.

‘H NMR (DMSO-dö, 400 MHz): 5,71 (m, 3H), 5,19 (d, 1H, J= 4,56 Hz), 3,92 (m, 25 2H), 3,81 (m, 1H), 3,70 (m, 1H), 2,96 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 2,65 (m, 2H), 2,36 (m, 1H), 2,19 (m, 1H), 1,45 (m, 4H), 1,10 (d, 3H, J= 6,22 Hz) en 0,78 (t, 6H).

Smp.: 105°C; massaspectrum: (M+H)+ 478.

Molecuulgewicht: 477,92 g/mol; molecuulvorm: C19H27NO7S3.

Oplosbaarheid in water (pH= 5, fosfaatbuffer, 25°C): 1209 pg/ml.

30 Kristallen van verbinding 1 die volgens de wijze volgens stap 5 werden bereid, werden röntgendiffractie van een poeder onderworpen. De monsters werden geanalyseerd door middel van een Siemens D500 Automated Powder Diffractometer die van een grafiet monochromator en een Cu (λ= 1,54 A) röntgenbron die bij 50 kV, 40 mA werkte, 38 was voorzien. 20-ijking werd onder gebruikmaking van een NBS-mica-standaard uitgevoerd. De monsterbereiding werd onder gebruikmaking van een monsterplaat met een achtergrond van nul uitgevoerd. Het dififractiepatroon van deze kristallen van verbinding 1 wordt in figuur 3 weergegeven en in figuur 5 tabellarisch gerangschikt.

5

Voorbeeld 2: (2-Ethoxy-2-methyl-l-oxopropoxy)methyl(5R,6S)-6-[(lR)-l-hydroxy- ethyl]-7-oxo-3-[[(lR,3S)tetrahydro-l-oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-l-azabicyclo[3.2.0]-hept-2-een-2-carboxylaat (verbinding 2).

De titelverbinding werd volgens het onderstaande schema en de onderstaande be-10 schrij ving bereid.

Stap 1 „ ,, 0 o Stap2 or'-f-»iro Ξ=· (47%) * o ^3 oJ> s«k>4 “W'Vl ,.c .1 ^ H3C (CHs |l J “** H3C^°'xyN)H TOWH80* NaMCOs

Ss^wi^ 55 psi u ** pu **

¢82¾) HaC CHa DCMUjO

(72%)

Stap 5 Η^)λ-α H3C CHa Aceton h&\h* (73%) ^ ^ D1E7Ï7acetonitril H3C 'f (22%) Sm,

Bij de stappen 1-4 werd 2-hydroxy-isoboterzuur met benzylbromide beschermd, 15 met ethyljodide gealkyleerd, ontschermd en veresterd, waarbij 2-ethoxy-isoboterzuurchloormethylester werd verkregen.

Bij stap 5 werd in een geschikte rondbodem natriumjodide (23,9 g, 159,45 mmol, 1,6 eq.) in aceton (96 ml) opgelost. 2-Ethoxy-isoboterzuurchloormethylester (18 g, 99,65 39 mmol, 1 eq.) werd vervolgens als een oplossing in extra aceton (18 ml) toegevoegd, en het resulterende reactiemengsel werd gedurende ongeveer 2 uur onder een stikstofatmos-feer onder terugvloeikoeling gekookt. De reactie werd door middel van GC gevolgd. Na de volledige omzetting liet men het reactiemengsel onder roeren tot kamertemperatuur 5 afkoelen. Het reactiemengsel werd vervolgens over heptaan (120 ml) en een oplossing van 10% natriumthiosulfaat in water (105 ml) verdeeld. De inhoud van het reactievat werd gedurende ten minste 5 min geroerd, en vervolgens werden de fasen gescheiden. De lichte organische fase werd opzij gezet en de zware waterfase werd weggegooid. De organische fractie werd vervolgens met een tweede portie oplossing van 10% natriumthio-10 sulfaat in water (105 ml) gewassen, en de zware fase werd opnieuw na het scheiden weg gegooid. De organische laag werd vervolgens met een oplossing van 10% natriumchlori-de in water (105 ml) gewassen. De zware waterfase werd weggegooid, en de organische fase werd onder verminderde druk (<35°C) geconcentreerd. Dit verschafte 16,26 g 2-ethoxy-isoboterzuuqoodmethylester die bij de erop volgende reactie zonder extra zuive-15 ring (test: -60%) werd gebruikt.

Bij stap 6 werden aan een geschikt reactievat onder een stikstofatmosfeer sulope-nem (13,92 g, 39,83 mmol, 1 eq.) en aceton (110 ml) toegevoegd. 2-Ethoxy-isoboterzuuqoodmethylester (16,26 g, 59,9 mmol, 1,5 eq. bij 100% werking) in aceton (14 ml) werd vervolgens toegevoegd, en de suspensie werd gedurende een minimum van 20 10 min geroerd. N,N-Diisopropylethylamine (5,11 g, 39,54 mmol, 1 eq.) in aceton (14 ml) werd vervolgens toegevoegd, waarbij een interne temperatuur van < 35°C (exother-me reactie) werd gehandhaafd. Het reactiemengsel werd overnacht bij omgevingstemperatuur geroerd (na ca. 2 uur was de sulopenem opgelost). Het reactiemengsel werd vervolgens over heptaan (80 ml) en water (129 ml) verdeeld en de inhoud van het reactievat 25 werd gedurende 5 min geroerd. De fasen werden gescheiden en de lichte organische fase werd weggegooid. De zware fase werd met extra heptaan (80 ml) gewassen. De fasen werden opnieuw gescheiden en de lichte organische fase werd weggegooid. De inhoud van het reactievat werd vervolgens onder verminderde druk tot ongeveer 50% geconcentreerd, terwijl een interne temperatuur van minder dan 35°C werd gehandhaafd. Ethylace-30 taat (120 ml) werd toegevoegd en de inhoud van het reactievat werd gedurende ongeveer 5 min geroerd. De fasen werden gescheiden en de lichte organische fase werd opzij gezet. De zware waterfase werd met extra ethylacetaat (2x 120 ml) geëxtraheerd. De samengevoegde organische fasen werden met een oplossing van 10% natriumthiosulfaat in 40 water (120 ml), water (120 ml) en een oplossing van 10% natriumchloride in water gewassen. De organische fase werd vervolgens bij omgevingstemperatuur met geactiveerde koolstof (2,9 g), celiet (2,9 g) en magnesiumsulfaat (MgSC>4) (8,2 g) behandeld en gedurende ten minste 1 uur geroerd. Na verwijdering van deze vaste stof door middel van 5 filtratie werd de oplossing onder verminderde druk geconcentreerd, terwijl een interne temperatuur van minder dan 45°C (kookpunt ethylacetaat 76,5-77,5°C) werd gehandhaafd.

Stap 7: De resulterende ruwe verbinding 2 (23 g) in ethylacetaat (100 ml) werd tot praktisch de temperatuur waarbij de oplossing onder terugvloeikoeling kookt, verwarmd 10 teneinde de vaste stof op te lossen, en vervolgens werd tert-butylmethylether (100 ml) geleidelijk toegevoegd, waarbij een interne temperatuur in het traject van 60°C tot de temperatuur waarbij de oplossing onder terugvloeikoeling kookt, werd gehandhaafd. Het resulterende mengsel werd gedurende 5 min langzaam bij een temperatuur in het traject van 60°C tot de temperatuur waarbij de oplossing onder terugvloeikoeling kookt, geroerd 15 en werd vervolgens gedurende minimaal 1 uur bij 5-15°C gegranuleerd. Het witte tot gebroken-witte product werd gefiltreerd, met methyl-t-butylether (MTBE) (28 ml) gewassen, en gedurende ten minste 16 uur bij omgevingstemperatuur onder vacuüm gedroogd (opbrengst 12,57 g, 63,9%).

Kristallen van dit product werden aan röntgendiffractie van een poeder onderwor-20 pen. De monsters werden geanalyseerd door middel van een Siemens D500 Automated Powder Diffractometer die van een grafiet monochromator en een Cu (λ= 1,54 A) rönt-genbron die bij 50 kV, 40 mA werkte, was voorzien. 20-ijking werd onder gebruikmaking van een NBS-mica-standaard uitgevoerd. De monsterbereiding werd onder gebruikmaking van een monsterplaat met een achtergrond van nul uitgevoerd. Het difïrac-25 tiepatroon wordt in figuur 4 weergegeven en in figuur 6 tabellarisch gerangschikt.

'H NMR: (de-DMSO, 400 MHz): 5,83 (d, 1H, J = 5,81 Hz) 5,73 (m, 2H), 5,20 (m, 1H), 3,92 (m, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,70 (m, 1H), 3,28 (q, 2H, J = 7,05 Hz), 2,96 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 2,65 (m, 2H), 2,36 (m, 1H), 1,29 (s, 6H), 1,10 (d, 3H, J = 6,63 Hz) en 1,00 (t, 3H, J = 6,63 Hz).

30 Smp.: 111-113°C.

Molecuulgewicht: 493,62 g/mol; Molecuulvorm: C19H27NO8S3.

Oplosbaarheid in water (pH= 5, fosfaatbuffer, 25°C): 2900 pg/ml.

41

Tekst figuren:

Fig. 1

Carnitine Concentration (pg/ml): Camitineconcentratie (pg/ml) 5 Pivalic Acid: Pivalinezuur

Vehicle: Vehiculum 2-Ethylbutyric Acid: 2-Ethylboterzuur

Pre-Dose: Pre-dosis 96 hr: 96 uur 10 Rat#: Ratten#

Fig. 2

Cone., μg equiv./ml: Cone., μg equiv./ml 2-ethylbutyric acid: 2-ethylboterzuur 15 pivalic acid: pivalinezuur

Time, hr: Tijd, uren

Fig. 3 + Fig. 4

Lin (Counts): Lin (pulsen) 20 2-Theta-Scale: 20-schaal

Fig. 5 en Fig. 6 d value: d-waarde 2-Theta0: 20° 25 Intensity: Intensiteit 2 00071 5

Claims

1. Verbinding met de formule: OH o \ '—o -- 5

2. Verbinding volgens conclusie 1, die (2-ethyl-l-oxobutoxy)methyl(5R,6S)-6-[(1R)-1 -hydroxyethyl]-7-oxo-3-[[( 1 R,3S)-tetrahydro-l-oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-1 -azabicyclo[3.2.0]hept-2-een-2-carboxylaat is. 10

3. Verbinding volgens conclusie 1, die (2-ethyl-l-oxobutoxy)methyI(5R,6S)-6-[(1R)-1 -hydroxyethy l]-7 -oxo-3 - [[(1 R,3 S)-tetrahydro-1 -oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-l-azabicyclo[3.2.0]hept-2-een-2-carboxylaat in de kristallijne vorm is met een röntgendiffractiepatroon van de poeder die nagenoeg dezelfde is als die, 15 welke in de figuren 3 en 5 wordt weergegeven.

4. Verbinding met de formule: OH /=I>-S-Ovo. o' \ ___ '—O O ^ y\- o' 20

5. Verbinding volgens conclusie 4, die (2-ethoxy-2-methyl-l-oxopropoxy)methyl-(5R,6S)-6-[( 1R)-1 -hydroxyethyl]-7-oxo-3-[[( 1 R,3S)-tetrahydro-1 -oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-l -azabicyclo[3.2.0]hept-2-een-2-carboxylaat is. 000715 • >

6. Verbinding volgens conclusie 4, die (2-ethoxy-2-methyl-l-oxopropoxy)methyl-(5R,6S)-6-[(lR)-l-hydroxyethyl]-7-oxo-3-[[(lR,3S)-tetrahydro-l-oxido-3-thienyl]thio]-4-thia-l-azabicyclo[3.2.0]hept-2-een-2-carboxylaat in de 5 kristallijne vorm is met een röntgendifiractiepatroon van de poeder die nagenoeg dezelfde is als die, welke in de figuren 4 en 6 wordt weergegeven.

7. Farmaceutische samenstelling, omvattende de verbinding volgens een of meer der conclusies 1-6, die voor orale toediening met of zonder een of meer 10 hulpstoffen en/of een of meer andere werkzame bestanddelen is geformuleerd.

8. Farmaceutische samenstelling, omvattende de verbinding volgens een of meer der conclusies 1 -6 en probenecide die voor orale toediening met of zonder een of meer hulpstoffen en/of een of meer andere werkzame bestanddelen is 15 geformuleerd.

9. Farmaceutische samenstelling, omvattende in het bereik van ongeveer 800 mg tot ongeveer 2,5 g van een verbinding volgens een of meer der conclusies 2, 3, 5 of 6, die voor orale toediening met of zonder een of meer hulpstoffen en/of een 20 of meer andere werkzame bestanddelen is geformuleerd.

10 Verbinding volgens een of meer der conclusies 1-6 voor gebruik in een werkwijze voor het behandelen van een bacteriële infectie, omvattende het oraal toedienen van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van die 25 verbinding aan een mens dat daaraan behoefte heeft.

11. Verbinding volgens een of meer der conclusies 1-6 en probenecide voor gebruik in een werkwijze voor het behandelen van een bacteriële infectie, omvattende het oraal toedienen van een therapeutisch werkzame hoeveelheid 30 van die verbinding en probenecide aan een mens dat daaraan behoefte heeft.

12. Toepassing van een verbinding volgens een of meer der conclusies 1-6 bij de bereiding van een geneesmiddel voor het behandelen van een bacteriële infectie bij een mens dat daaraan behoefte heeft door middel van orale toediening.

13. Verbinding volgens een of meer der conclusies 2, 3, 5 of 6 voor gebruik in een werkwijze voor het behandelen van een bacteriële infectie, omvattende het oraal toedienen van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van die verbinding aan een mens dat daaraan behoefte heeft.

14. Verbinding volgens conclusie 13, waarbij de verbinding met een hoeveelheid in het bereik van ongeveer 500 tot ongeveer 2500 mg BID of TID oraal wordt toegediend.

15. Verbinding volgens conclusie 13, waarbij de verbinding met een dosis in het 15 bereik van ongeveer 800 tot ongeveer 100 mg BID oraal wordt toegediend.

16. Verbinding volgens conclusie 13, waarbij de verbinding met een dosis van ongeveer 2000 mg BID oraal wordt toegediend.

17. Verbinding volgens conclusie 13, waarbij de verbinding met een dosis van ongeveer 2000 mg TID oraal wordt toegediend.

18. Verbinding volgens conclusie 13, waarbij de verbinding met een dosis in het bereik van ongeveer 7 tot ongeveer 25 mg/kg BID oraal wordt toegediend. 25

19. Verbinding volgens conclusie 13, waarbij de verbinding met een dosis in het bereik van ongeveer 17 tot ongeveer 45 mg/kg BID oraal wordt toegediend.

20. Verbinding volgens conclusie 13, waarbij de verbinding met een dosis in het 30 bereik van ongeveer 17 tot ongeveer 45 mg/kg TID oraal wordt toegediend. 0 0 0 7 1 5