NL8103151A - Polypeptiden, farmaceutische preparaten, die deze poly- peptiden bevatten en werkwijzen ter bereiding ervan. - Google Patents

Description

s 1 ' 7 * / ' N.0. 30.249

Polypeptiden, farmaceutische preparaten, die deze polypeptiden bevatten en werkwijzen ter bereiding ervan._

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebied van recombinant DNA technologie, dat wil zeggen op werkwijzen, die worden toegepast in de recombinant DNA technologie en op produkten verkregen volgens deze werkwijzen.

5 Meer in het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrek king op polypeptiden, in het bijzonder op "ontwikkelde" menselijke leucocyt interferonen, op farmaceutische preparaten, die deze inter-feronen bevatten en op een werkwijze ter bereiding ervan, welke werkwijze wordt gekenmerkt door een cultuur van een mieroorganisme, 10 getransformeerd met een repliceerbare microbiële expressie-drager, die in staat is deze polypeptiden uit te drukken, te laten groeien en de polypeptiden te laten uitdrukken. De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op de expressie-dragers, die bij deze werkwijze worden gebruikt en de nieuwe microorganismen, die deze 15 expressie-dragers bevatten, alsmede de werkwijzen ter bereiding ervan. Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op DNA volgorden, die volgorden bevatten, die de aminozuur-volgorde van een ontwikkeld menselijk leucocyt interferon coderen.

Menselijk leucocyt interferon (LelF) werd eerst ontdekt en 20 bereid in de vorm van zeer onzuivere precipitaten door Isaacs en Lindenraann (Proc. H. Soc. B 147. [1957] 258-267; N.S.P. 3.699.222. Pogingen om het materiaal te zuiveren en t.e kenmerken zijn voortgaande sinds die tijd en hebben geleid tot de bereiding van relatief homogene leucocyt interferonen afkomstig van normale of leu-25 kemische donor-leucocyten (Duits Offenlegungsschrift 2.94^.134)· **

Deze interferonen zijn een familie van proteïnen, waarvan bekend is dat zij het vermogen bezitten een virus resistente toestand aan hun doelcellen te verlenen. Bovendien kan interferon de celproliferatie remmen en de immuunreactie regelen. Deze eigenschap-30 pen hebben het klinische gebruik van leucocyt interferon als therapeutisch middel voor de behandeling van virus-infecties en kwaadaardige ziekten aangemoedigd.

Leucocyt-interferonen zijn gezuiverd tot in hoofdzaak homogeniteit (Rubinstein c.s·, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76.

35 (1979) 640-644; Zoon c.s., ibid. £6» (1979)» 5601-5605» en mole- cuulgewichten zijn vermeld die variëren van ongeveer 17*500 tot ongeveer 21.000. De specifieke activiteit van deze preparaten is 81 03151 * » 2 v ' 8 9 v opmerkelijk hoog, 2 x 10 tot 1 x 10^ eenheden/mg proteïne, maar opbrengsten uit celcultuurmethoden zijn ontmoedigend gering. Desalniettemin hebben vorderingen in proteïne volgorde regelingstech-nieken de vaststelling van partiële aminozuur-volgorden mogelijk 5 gemaakt (Zoon c.s., Science 207. [19Ö0], 527; Levy c.s. Proc. Natl. Acad. Sci. Ü.S.A. 22» [Ί9^0], 5102-5104). Opheldering van de glycosylering van verschillende leucocyt interferonen is op dit moment niet volledig, maar het is nu duidelijk, dat verschillen in glycosylering onder familieleden niet alleen het spectrum van 10 waargenomen molecuulgewichten verklaart. In plaats daarvan verschillen de leucocyt-interferonen opmerkelijk in aminozuursamenstelling en volgorde en aminozuur-homologie is in sommige gevallen minder dan 80 %,

Terwijl isolering uit donor-leucocyten voldoende materiaal 15 geleverd heeft voor partiële karakterisering en beperkte klinische studies met homogeen leucocyt-interferon, is het een totaal ongeschikte bron voor de hoeveelheden interferon vereist voor klinische proeven op grote schaal en voor een profylactisch en/of therapeutisch gebruik daarna op ruime schaal. In werkelijkheid zijn 20 de huidige klinische onderzoekingen onder toepassing van van menselijk leucócyt afkomstige interferonen bij antitumor en antivirus beproeving in hoofdzaak beperkt tot onzuivere (minder dan 1 procent zuiver) preparaten van het materiaal en lange aanvoer-tijden voor de bereiding van voldoende hoeveelheden, zelfs op niet 25 realistische prijsniveaus, hebben kritisch onderzoek op een uitgebreid front uitgesteld.

Met de komst van de recombinant DNA technologie echter is de gecontroleerde microbiële produktie van een enorme variëteit ge- ^ schikte polypeptiden mogelijk geworden. Reeds in handen zijn bac-30 teria, die met deze technologie gemodificeerd zijn, voor het mogelijk maken van de produktie van polypeptide-produkten zoals soma-tostatine, de A- en B-ketens van menselijke insuline en menselijk groeihormoon (Itakura c.s., Science 1.98« [1977]» 1056-r1063;

Goeddel c.s., Nature 281, [1979], 544-548. Meer recent zijn 35 recombinant DNA technieken gebruikt om de bacteriële produktie te veroorzaken van proinsuline en thymosine alfa 1 en verschillende auteurs hebben gerapporteerd over het verkrijgen van DNA codering voor menselijk leucocyt interferon en over resulterende proteïnen met leucocyt interferon activiteit (Nagata c.s., Nature 284.

4O- [1980] 316-320; Mantei c.s., Gene 1_2» [1980] 1-10; Taniguchi c.s.,

9Q6986LC

8103 151 3 * '

Nature 285, [198Ο] 5k7-5k9.

Het werkpaard van de recombinant DNA technologie is het plasmide, een niet-chromosomale lus van DNA met dubbele streng aangetroffen in bacteriën en andere.microben, vaak in veelsoortige 5 copieën per cel. Opgenomen in de informatie gecodeerd in het plasnide DBA is de informatie vereist om het plasmide in dochtercellen (dat wil zeggen een "replicon") en gewoon lijk een of meer selectie karakteristieken zoals in het geval van .. te reproduceren bacteriën, bestandheid tegen antibiotica ^ die het mogelijk maken 10 klonen van de gastheercel, die het plasmide van belang bevat, te doen herkennen en bij voorkeur in selectieve media te doen groeien.

De bruikbaarheid van plasmiden ligt in het feit, dat zij specifiek -gesplitst kunnen worden door een of ander restrictie endonuclease of "restrictie enzym", waarvan elk een verschillende plaats van het 15 plasmide-achtige DNA herkent. Daarna kunnen heterologe genen of gen-fragmenten opgenomen worden in het plasmide door eindstandige vereniging bij de splitsingsplaats of bij opnieuw geconstrueerde einden grenzend aan de splitsingsplaats. DNA recombinatie wordt buiten de cel uitgevoerd, maar het verkregen "recombingati* plasmide 20 kan er in worden ingevoerd volgens een werkwijze, die bekend is als transformatie en grote hoeveelheden van het heterologe gen bevattende recombinant plasmide worden verkregen door de transfor-*mant te doen groeien. Bovendien kan, wanneer het gen op geschikte wijze is opgenomen met betrekking tot gedeelten van het plasmide, 25 die de transcriptie en vertaling van de gecodeerde DNA boodschap regeren, de verkregen expressie-drager gebruikt worden om feitelijk de polypeptide volgorde te produceren, waarvoor het opgenomen gen codeert, een werkwijze, die als expressie wordt aangeduid.

Expressie wordt geïnitieerd in een gebied, dat bekend is als 30 de promotor, die herkent en gebonden wordt door RNA polymerase.

In sommige gevallen, zoals in de tryptofan of "trp" promotor, die in de praktijk van de onderhavige uitvinding de voorkeur verdient, worden promotor-gebieden overlapt door "operator" gebieden onder vorming van een gecombineerd prcmotor-operator. Operators zijn DNA 35 volgorden,' die herkend worden door zogenaamde repressor proteïnen, die dienst doen om de frequentie van de transcriptie initiëring bij een bijzondere promotor te regelen. De polymerase reist langs het DNA, transcribeert de informatie aanwezig in de coderingsstren-gen van het 5M tot 3" einde in boodschapper RNA, die op zijn beurt 40 vertaalt in een polypeptide met de aminozuur volgorde, waarvoor het 8103151 T if DNA codeert. Elk aminozuur wordt gecodeerd door een nucleotide triplet of "codon" in wat voor onderhavige doeleinden kan worden uitgeduid als het "structurele gen", dat wil zeggen dat deel, dat de aminozuur volgorde van het uitgedrukte produkt codeert. Na bin-5 ding aan de promotor transcribeert het RNA polymerase eerst nu- cleotiden, die een ribosome bindingsplaats coderen, vervolgens een vertalingsinitiëring of "start" signaal (gewoonlijk ATG, dat in de verkregen boodschapper RNA AUG wordt), dan de nucleotide codons in het structurele gen zelf. Zogenaamde stop codons worden ge-10 transcribeerd aan het einde van de structurele gen, waarna het polymerase een additionele volgorde van boodschapper RNA kan vormen, die, vanwege de aanwezigheid van het stop signaal, niet vertaald zal blijven door de ribosomen. Ribosomen binden aan de bindingsplaats verschaft op de boodschapper RNA, in bacteriën gewoon-15 lijk wanneer het mRNA gevormd wordt, en produceren zelf het gecodeerde polypeptide, beginnende bij het vertalingsstartsignaal en eindigen bij het hiervoor vermelde stopsignaal. Het gewenste produkt wordt geproduceerd, wanneer de volgorden,die de ribosome bindingsplaats coderen, op geschikte wijze zijn geplaatst met betrek-20 king tot het AUG initiëringscodon en wanneer alle overblijvende codons het initiëringscodon in fase volgen. Het verkregen produkt kan verkregen worden door de gastheercel te lyseren en het produkt te winnen door geschikte zuivering van ander bacterieel proteïne. Wij namen waar, dat toepassing van recombinant DNA technolo-25 gie (dat wil zeggen de opname van interferon genen in microbiële expressied’ragers en hun expressie onder de controle van microbiële gen regelingselementen) de meest effectieve weg zou zijn voor het verschaffen van grote hoeveelheden leucocyt interferon die, niette-genstaande de afwezigheid in aldus bereid materiaal van het gly-30 cosyleringskenmerk van van de mens afkomstig materiaal, klinisch kan worden toegepast bij de behandeling van een groot aantal virusziekten en neoplastische ziekten. ,

De benadering voor het verkrijgen van een eerste leucocyt gen volgens de onderhavige uitvinding hoadt de volgende trappen in: 35 (1) Partiële aminozuur volgorden van menselijk leucocyt in terferon gezuiverd tot homogeniteit werden gebruikt om stellen synthetisch DNA tasters te construeren, waarvan de codons, alle mogelijke nucleotide combinaties voorstelden, die in staat waren de partiële aminozuur volgorden te coderen. ifO (2) Bacteriële koloniegroepen werden bereid, die complemen- 8103 151 5 tair DNA (cDNA) bevatten afkomstig van boodschapper RNA. Ander teweeg gebracht mRNA, dat radio-gemerkt was werd gehybridi-seerd tot plasmide cDNA van deze groep. Hybridiserend mRNA werd geëlueerd en onderzocht op vertaling in interferon in de oocyt 5 proef. Plasmide DNA van koloniën, die teweegbrenging van interferon activiteit op deze wijze vertoonden, werden verder onderzocht op hybridisering tot tasters, bereid zoals beschreven in (1) hiervoor.

(3) Parallel tot de benadering in deel (2) hiervoor, werd 10 door geïnduceerd mRNA afgeleid cDNA in plasmiden gebruikt voor het vormen van een onafhankelijke groep van transformant koloniën. De tasters van deel (1) werden gebruikt voor het voorbereiden van de synthese van radio-gemerkt eenstrengig cDNA voor gebruik als hy- bridiseringstasters. De synthetische tasters werden gehybridiseerd 15 met geïnduceerd mRNA als mal en werden uitgebreid door omgekeerde transcriptie onder vorming van geïnduceerd, radio-gemerkt cDNA.

op

Klonen van de koloniegroep, die hybridiseerden tot Heze wijze verkregen radio-gemerkt cDNA werden verder onderzocht voor het bevestigen van de aanwezigheid van een interferon coderend gen met 20 volle lengte. Elk genfragment met vermeende partiële lengte verkregen bij de delen (1) of (2) kan zelf gebruikt worden als een taster voor het gen met volle lengte.

Ca) Het gen met volle lengte zoals hiervoor verkregen werd pasklaar gemaakt onder toepassing van synthetisch DNA voor het 25 elimineren van eventuele hoofdvolgorde, die microbiële expressie van het ontwikkelde polypeptide zou kunnen voorkomen en om een geschikte positionering mogelijk te maken in een expressie-drager met betrekking tot startsignalen en de ribosoom bindingsplaats * van een microbiële promotor. Ilitgedrukt interferon werd gezuiverd 30 tot een punt, dat bevestiging mogelijk maakt van het karakter ervan en de bepaling van de activiteit ervan.

(5) Het interferon gen fragment bereid op de voorafgaande wijze werd zelf gebruikt bij het tasten, door hybridisering, voor andere partieel homologe leucocyt interferon soorten.

35 Bij het toepassen van methoden van recombinant DNA technolo gie, zoals hiervoor uiteengezet, werd de microbiële produktie met hoge opbrengst en zuiverheid van de familie van homologe leucocyt interferonen (niet geglycosyleerd) als ontwikkelde polypeptiden, in hoofdzaak niet vergezeld door de overeenkomstige voor-volgorde b0 of een of ander deel daarvan, bereikt. Deze interferonen kunnen 8103151 6 • f direkt. worden uitgedrukt, gewonnen en gezuiverd tot niveaus, die deze geschikt maken voor .gebruik bij de behandeling van virusziekten en kwaadaardige ziekten bij dieren en mensen. Familieleden, die tot dusverre van een expressie zijn voorzien, zijn 5 doelmatig gebleken bij in vitro beproeving en bij de eerste van een dergelijke demonstratie van zijn soort eveneens bij beproeving in vivo, welke laatstgenoemde het eerste ontwikkelde leucocyt interferon inhield, dat microbieel was voortgebracht.

De uitdrukking "ontwikkeld leucocyt interferon", gebruikt in 10 de context van de onderhavige aanvrage, definieert een microbieel (bijvoorbeeld bacterieel) voortgebracht interferon-molecuul, vrij wordt van glycosylgroepen. Ontwikkeld leucocyt interferon * volgens de onderhavige uitvinding onmiddellijk van een expressie voorzien van een vertalingsstartsignaal (ATG) juist voor het eerste aminozuur 15 codon van het natuurlijke produkt. Het "ontwikkelde" polypeptide kan derhalve als het eerste aminozuur in zijn volgorde methionine bevatten (waarvoor ATG codeert) zonder in hoofdzaak het karakter ervan te veranderen. Anderzijds kan de microbiële gastheer het translatieprodukt bewerken om het oorspronkelijke methionine te 20 annuleren. Ontwikkeld leucocyt interferon kon tezamen met een geconjugeerd proteïne anders dan het gebruikelijke hoofd van een expressie worden voorzien, waarbij het geconjugeerde produkt specifiek splitsbaar is in een intra- of extracellulaire omgeving (zie het Britse octrooischrift 2.007.676A). Tenslotte kon ontwik-25 Held interferon bereid worden tezamen met een microbieel "signaal" peptide, dat het geconjugeerde produkt naar de celwand transporteert, waar het signaal wordt weg verwerkt en het ontwikkelde polypeptide wordt afgescheiden. "Expressie" van ontwikkeld leudöcyt -interferon betekent de bacteriële of andere microbiële produktie 30 van een interferon molecuul, dat geen glycosylgroepen of een'voorniet volgorde bevat, die onmiddelIijkAmRNA translatie van een menselijk leucocyt interferon genom gepaard gaat.

Bijzondere leucocyt interferon proteïnen hiervan zijn gedefinieerd door middel van gedetermineerd DNA gen (fig. 3 en 8) en 35 deductieve aminozuur volgorde bepaling (fig. h en 9). Het zal duidelijk zijn, dat voor deze bijzondere interferonen in feite alle hierdoor omvatte individuen van de familie van leucocyt interferon proteïnen, natuurlijke allelische variaties bestaan en^van individu tot individu voordoen. Deze variaties kunnen worden aan- k0 getoond door een aminozuurversch.il of aminozuurverschillen in de 8103 151 7 έ * totale volgorde ©f door doorhalingen, substituties, opnamen, inversies of addities van een aminozuur of aminozuren in deze volgorde. Voor elk leucocyt interferon proteïne hiervan, gemerkt LelF A tot en met LelF J, zijn dergelijke allelische variaties op-5 genomen binnen de omvang van het merkteken of de uitdrukking, die zulks definieert en derhalve de onderhavige uitvinding.

Beschrijving van de figuren

Fig. 1 stelt twee aminozuur-volgorden voor, die gemeenschappelijk waren voor alle interferon-soorten geïsoleerd uit menselijk 10 leucocyt en gezuiverd tot homogeniteit, aangeduid als T-1 en T-13·

Alle potentiële mRNA volgorden, die voor deze peptiden coderen, worden getoond, evenals de overeenkomstige DNA volgorden. De letters A, T, G, C en D betekenen respectievelijk de nucleotiden, die de basen adenine, thymine, guanine, cytosine en ura'cil bevatten.

15 De letter N betekent elk van de nucleotiden A. G. C en U. Poly- nucleotiden worden voorgesteld als lezende van de 5' (linker) naar de 3* (rechter) richting en, wanneer dubbel strengig ("d.s·") DNA wordt voorgesteld, vice-versa vanaf de onderkant of niet-code-rende streng.

20 Fig· 2 is een autoradiogram, die de hybridisering laat zien van potentiële LelF plasrniden met ^ P-gemerkte synthetische deoxyoligonucleotiden.

Fig. 3 stelt de nucleotide volgorde (coderende strengen) voor van acht gen-fragmenten, geïsoleerd als kandidaten voor gebruik *25 bij de expressie van leucocyt interferonen, respectievelijk aangeduid als uAn tot en met "H”, Het ATG vertalende initieringscodon en het eindstandige triplet voor elk LelF is onderstreept. De stop-codons of eindstandige triplets worden gevolgd door 3’ onvertaalde gebieden. Het opgenomen gen met volle lengte voor LelF A 30 mist een codon, dat wordt aangetroffen in de voorgestelde anderen, zoals aangegeven in de derde A regel van fig. 3· 5* niet vertaalde gebieden gaan vooraf aan de hoofd-volgorden. Zoals geïsoleerd ontbreekt bij fragment E de volledige volgorde van het hoofd, maar omvat het totale gen voor het vermeende ontwikkelde LelF E. Bij 35 fragment G ontbreekt in geïsoleerde toestand de volledige code-ringSYolgorde.

Fig. 4 is een vergelijking van de acht LelF proteïne volgorde voorspeld uit nucleotide volgorden. De een-letterige afkortingen aanbevolen door de IUPAC-IUB commissie voor biochemische nomen-40 clatuur worden gebruikt: A, alanine; C, cysteïne; D, asparagine- 8103151 » * 8 zuur; E, glutaminezuur; F, fenylalanine; G, glycine; H, histidine; I, isoleucine; K, lysine; L, leucine; M, methionine; N, asparagine; P, proline} Q, glutamine; R, arginine; S, serine; T, treonine; V, valine; W, tryptofaan en Y, tyrosine. De getallen verwijzen naar 5 aminozuurposities (S verwijst naar signaal peptide). Het streepje in de 1Ö3 aminozuur LelF A volgorde op positie kk is ingevoerd om . de LelF A volgorde op een lijn te brengen met de 166 aminozuur-volgorden van de andere LelF's· De LelF E volgorde werd bepaald door negering van het extra nucleotide (positie 187 van fig. 3) 10 in het coderende gebied ervan. De sterretjes geven de in-fase eindstanüge codons aan. Aminozuren, die gemeenschappelijk zijn voor alle LelF's (onder uitsluiting van het pseudogen LelF E) zijn eveneens voorgesteld. De onderstreepte residues zijn aminozuren, die eveneens aanwezig zijn in menselijk fibroblast interferon.

15 Fig. 5 stelt restrictie endonuclease kaarten voor van de acht typen LelF gekloonde cDNA's (A tot en met H). De hydride plasmiden werden geconstrueerd volgens de dC:dG staartmethode (Goeddel, D.V, c.s., Nature 287, [1980] Üf11-41é. Daarom kunnen de cDNA opnamen worden weggenomen onder toepassing van Pst I. De lij-20 nen aan het einde van elke cDNA opname stellen de flankerende homopolymere dC:dG staarten voor. De posities van PvuII, EcoRI en BglII restrictieplaatsen zijn aangegeven. Geschaduwde gebieden van de figuur stellen de coderingsvolgorden voor van ontwikkelde LelF's; de van kruisarceringen voorziene gebieden geven signaal 25 peptide coderingsvolgorden aan en de open gebieden laten 3’ en 5' niet-coderende gebieden zien.

Fig. 6 geeft schematisch de constructie aan van een gen codering voor de direkte microbiële synthese van ontwikkeld LelF A. Restrictieplaatsen en residuen zijn zoals aangegeven ("Pst I", 30 enz.). De uitdrukking "b.p." betekent "basis paar").

\ Fig. 7 (niet op schaal te bewerken) stelt schematisch een restrictie-kaart vpor van twee gen-fragmenten toegepast bij het tot expressie brengen van het ontwikkelde leucocyt interferon LelF B. De aangegeven codon-volgorden zijn de coderingsstreng-35 einden resulterend uit ontsluiting met het restrictie enzym Sau3a in de twee voorgestelde gevallen.

De fig. 8 en 9 verschaffen de DNA en aminozuur (zie fig. 4 hiervoor voor de overeenkomstige een-letterige afkortingen) volgorden van vijf LelF proteïnen ervan, met inbegrip van de typen I ifO en J. In fig. 9 geeft het sterretje een eindstandige codon aan in 8103151 —--------- 9 de overeenkomstige DNA volgorde en de streep een doorhaling of tussenruimte in de volgorde.

Beschrijving van de voorkeursuitvoeringsvormen A. Toegepaste microorganismen 5 Het beschreven werk houdt het gebruik in van twee microorga ni smen: E. coli x 1776» zoals beschreven in het Amerikaanse oc-trooischrift 4·190.495 en E. coli K-12 stam 294 (einde A, thi , hsr , hsm*), beschreven in heb Britse octrooischrift 2.055.3½ A. Elk is gedeponeerd Mj the American Type Culture Collection (ATCC 10 toelating no. 31537 respectievelijk 31446). Alle recombinat DNA werk werd uitgevoerd overeenkomstig de toepasselijke richtlijnen van de National Institutes of Health.

-De uitvinding wordt in de het meest de voorkeur verdienende uitvoeringen beschreven met referentie aan E. coli,.'met inbegrip 15 van niet alleen de stammen E. coli x 1776 en E. coli K-12 stam 294» zoals hiervoor gedefinieerd, maar ook andere bekende E. coli stammen zoals E. coli B of andere microbiële stammen, waarvan vele gedeponeerd en beschikbaar zijn bij erkende .microörganisme depone-ringsinstituten, zoals the American Type Culture Collection. Zie 20 ook het Duitse Offenlegungsschrift 2.644*432. Tot deze andere mi-croörganismen behoren bijvoorbeeld Bacilli, zoals Bacillus subtilis en andere enterobacteriaceae waaronder als voorbeelden Salmonella typhimurium en Serratia mareescens vermeld kunnen worden, onder toepassing van piasmiden, die hetercloge gen-volgorden 25 daarin kunnen repliceren en tot expressie brengen. Gist, zoals

Saccharomyces cerevisiae, kan ook met voordeel als gastheerorganis-me worden toegepast voor de bereiding van de interferon proteïnen ervan door het tot uitdrukking brengen van genen codering daarvan onder controle van een gist-promotor.

30 B. Bron en zuivering van LelF mRNA

LelF mRNA kan verkregen worden uit menselijke leucocyten, gewoenlijk die van patiënten met chronische myelogene leukemie, die zijn geïnduceerd tot het voortbrengen van interferon met Sendai of Newcastle ziekte virus, zoals bijvoorbeeld beschreven in 35 het Duitse Offenlegungsschrift 2.947*134· Een bron, die in het bijzonder de voorkeur verdient, en toegepast in het hiervoor vermelde werk, is een celreeks aangeduid als KG-1 afkomstig van een patiënt met acute myelogene leukemie. De celreeks, beschreven door Koeffler, H.P. en Golde, D.W., Science 200, (1978), 1153 groeit 40 gemakkelijk in een cultuurmilieu, dat RPMI (Rosewell Park Memorial 8103151

* V

-10-

Institute) 1640 plus 10% 3FCS (foetaal kalfsserum) met warmte geïnactiveerd, 25 mM HEPES buffer (N-2-hydroxyethyl-piperazine-N’-2-ethaansulfonzuur) en 50 yug/ml gentamicine bevat en tweemaal per week j.n 1 tot 3 verdelingen aan een subcultuurbehandeling is onder-' 5 worpen. Cellen kunnen uit het hiervoor vermelde groeimilieu plus 10°% dimethylsulfoxide bevroren worden. KG-1 is gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (ATCC-toelating nr. CEL 8031)· KG-1 - cellen werden geïnduceerd tot het voortbrengen van leuco-cyt interferon mRNA met Sendai of Newcastle ziektevirus volgens de 10 methode beschreven door Rubinstein c.s. (Proc. Natl. Acad. Sci.

ÏÏ.S.A. 26, [1979] 640 - 644 Cellen werden 5 uren na induktie geoogst en RNA werd bereid volgens de guanidine thiocyanaat-guanidine-hydrochloride methode (Chirgwin c.s., Biochemistry 1_8 [1979] > 5294 -5299)· RNA van niet-geïnduceerde cellen werd op dezelfde wijze ge-15'isoleerd. Oligodeoxythymidine (dT) - cellulosechromatografie en su-crosegradiënt ultracentrifugering werd gebruikt voor het verkrijgen van de 12S-fraktie van poly (A) mRNA zoals beschreven door Green c.s. (Arch. Biochem. Biophys. 172 [1976], 74 - 89) en Okuyuma c.s. (Arch. Biochem. Biophys. 188 [1978], 98 - 104)- Dit mRNA had een interfe-20 rontiter van 8000 - 10.000 eenheden per microgram bij de Xenonlus laevis oocyte-proef (Cavalieri c.s., Proc. Natl. Acad. Sci. ÏÏ.S.A.

IA [1977], 5287 - 3291).

C. Bereiding van koloniegroenen, die LelF cBNA-volgorden bevatten.

5 yug mRNA werden gebruikt voor de bereiding van dubbelstren-25 gig cDNA volgens standaardmethoden (Wiekens c.s., J. Biol. Chem. 255. [1978], 2483 - 2495 en Goeddel c.s., Nature 2§1 [1979], 544 - 548).

Het cDNA werd naar grootte gefraktioneerd door elektroforeae. op een ^ 6% polyacrylamidegel en 230 ng materiaal in grootte variërend van 500 - I5OO b.p. werden door elektroëlutie gewonnen. T00 ng Van dit 30 cDNA werd met deoxycytidine (dC) residuen van een staart voorzien zoals beschreven door Chang c.s., Nature 275 (.1978), 617 - 824, getemperd met 470 ng plasmide pBR322, dat met deoxyguanosine (dG) residuen op de Pstl-plaats van een staart was voorzien (Bolivar c.s.,

Gene 2, [ 1977]» 95 - 115)» en gebruikt voor het transformeren van 35 E. coli x 1776. Ongeveer 130 tegen tetracycline bestand zijnde, voor ampicilline gevoelige transformanten werden per ng cDNA verkregen.

In een tweede soortgelijk experiment werden ongeveer 1000 tegen tetracycline bestand zijnde, voor ampicilline gevoelige E. coli K-12 stam 294 trans formant en per ng cDNA verkregen. In dit geval werd 40.naar grootte gefraktioneerd cDNA-materiaal, in grootte variërend van 81 03151 -11- «, J - - 600 - 1300 b.p. gewonnen door elektroëlutie voor de dC staartvorming.

3). Bereiding van synthetische oligonucleotiden en hun gebruik.

Be kennis van de aminozuurvolgorden van verschillende trypti-sche fragmenten van menselijk leueocyt interferon maakte het ont-5 werp mogelijk van synthetische deoxyoligonucleotiden, die complementair zijn ten opzichte van verschillende gebieden van Bell* mENA. Be twee tryptische peptiden T1 en T13 werden gekozen, omdat zij een aminozuurvolgorde hadden die de synthese van slechts 12 respectievelijk 4 undeeameren vereisen, om alle mogelijke coderingsvolgorden 10 te verantwoorden (fig. 1). Vier stel deoxyoligonucleotidetasters werden gesynthetiseerd voor elke volgorde, die elk drie (T-1A, B, C, B) of één (T-13A, B, C, B) oligonucleotide bevatten. Be 11 bases lange aangegeven complementaire deoxyoligonucleotiden werden chemisch gesynthetiseerd volgens de fosfotriëstermethode (Crea c.s., 15 Proc. Natl. Acad. Sci. ÏÏ.S.A. [1978], 5765 - 5769). Vier afzonderlijke tasters werden bereid in de T-13 reeks. Be twaalf T-1 tasters werden bereid in vier poules van drie tasters zoals aangegeven in fig. 1.

Be vier afzonderlijke tasters van de T-13 reeks en de twaalf 20 T-1 tasters bereid in vier poules van drie voorbereiders elk werden gebruikt om de synthese van radio-gemerkt éénstrengig. cBNA voor te bereiden voor gebruik als hybridiseringstasters. Be mal mENA was hetzij het 12S ENA van met Sendai geïnduceerde KG-1 cellen (8000 eenheden IE activiteit per pxg) of totaal poly (A) mENA van niet-25 geïnduceerde leucocyten (minder dan 10 eenheden per ^ug). Met ^2P gemerkt cBNA werd uit deze voorbereiders bereid onder toepassing van bekende reactie-omstandigheden (Noyes c.s., Proc. NatlvAcad.

Sci. ÏÏ.S.A. J6 [1979]» 1770 - 1774)· Be 60 yul reacties werden uitgevoerd in 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 20 mM KC1, 8 mm MgCl2, 30 mM |3-30 mercaptoëthanol. Be reacties omvatten één pxg van elke voorbereider (dat wil zeggen 12 yug totaal voor de T-1 reeks, 4 yug totaal voor T-13 reeks), 2 pxg "geïnduceerde” 12S fraktie mENA (of 10yug niet-gelnduceerd poly (A) mENA), 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 yuCi (a^2p) dCTP (Amersham, 2-3000 Ci/mmol), en 60 eenheden omgekeerd trans-35 criptase (Bethesda Eesearch Laboratories). Het produkt werd gescheiden van niet opgenomen merk door gelfiltratie over een Sephadex G-50 kolom van 10 ml, behandeld met 0,3N NaOH gedurende 30 minuten bij 70°C voor het vernietigen van ENA en geneutraliseerd met HC1. Be hybrid!seringen werden uitgevoerd zoals beschreven door Kafatos c.s., 40 Nucleic Acids Ees. (1979), 1541 - 1552.

8103151 -12- E. IAentifioatie van klonen nL1-·ρΙι30.

De snelle plasmide isolatiemethode van Bimboim c.s., Eucleic Acids Res. 2 (1979) > 1513 - 1523» werd gebruikt ter bereiding van 1 yug plasmide DEA van elke van de 500 afzonderlijke E. coli K-12 5 stam 294 transformanten (zie C). Elk DEA-monster werd gedenatureerd en aangebracht op nitrocellulosefilters in drievoud volgens de methode van Kafatos c.s. (zie hiervoor).

De drie stel nitrocellulosefilters, die de 500 plasmidemonsters i bevatten, werden gehybridiseerd met 10 a) geïnduceerd cDEA voorbereid met het stel voorbereiders T-1, b) met T-13 voorbereid geïnduceerd cDEA, en c) niet-geïnduceerd cDEA bereid onder toepassing van beide stellen voorbereiders. Klonen werden als positief beschouwd, wanneer zij sterker hybridiseerden op één of beide van de geïnduceerde cDEA- 15 tasters dan de totale niet-geïnduceerde taster. Dertig "positieve” klonen (pI1-pL30) werden gekozen uit de 500 voor verdere analyse.

P. Identificatie van de klonen ρΙι51-τΡ59.

Isolatie van een plasmide (nr. 104). dat een lelP genfragment bevat.

20 Trans formanten van E. coli x 1776 werden aan een vergelijkend onderzoek onderworpen volgens de kolonie hybridiseringsmethode van

Grunstein en Hogness (Proc. Eatl. Acad. Sci. U.S.A. J2 [1975]»

3961 - 3965) onder toepassing van met gemerkt geïnduceerd mREA

als taster (iiillenhaug c.s., Biochemistry, 1_£ [1976], 1858 - I865).

25 Eiet-gemerkt mREA van niet-geïnduceerde cellen werd gemengd met de taster in een verhouding van 200 tot 1 om te concurreren met niet- 32 geïnduceerd mREA aanwezig in het met P gemerkte preparaatv Hybri- *-disering van gemerkt mREA dient bij voorkeur plaats te hebben met . koloniën, die geïnduceerde volgorden bevatten. Drie klassen trans-2Q formaten werden verkregen; (1) 2 - 3% van de koloniën hybriseerden zeer sterk tot 7 P-mREA, (2) '. 10% hybridiseren aanzienlijk minder dan klasse 1 en (3) de rest gaf geen waarneembaar hybridiseringssignaal.

De positieve koloniën (klassen (1) en (2)) werden onderzocht op de aanwezigheid van voor interferon specifieke volgorden door een bepaling, die afhangt van de hybridisering van interferon en mREA specifiek voor plasmide DEA* Aanvankelijk werden 60 sterk positieve koloniën, (klasse 1) afzonderlijk voortgebracht in 100 ml milieu aangevuld met tetracycline (20 yug/ml), diaminopimelinezuur (100 yug/ml), thymidine (20 yug/ml) en d-biotine (1 yUg/ml). Het M9 8f0 3 151 T ^ 7 ~~ * ' -13- medium bevat per liter NagHPO^ (6 g), ΈΞ^ΡΟ^ (3 g), NaCl (0,5 g) en NH^Cl (1 g). Na een autoclaafbehandeling worden 1 ml steriel 1M MgSO^ en 10 ml steriel 0,01 M CaClg toegevoegd. 10 Eultures werden verenigd en plasmide DNA werd geïsoleerd uit de zes poules zoals be~ 5 schreven door Clewell c.s., Biochemistry [1970], 4428 - 440.

10 ^ug van elke plasmide DNA poule werden gesplitst met HindlII, gedenatureerd en covalent gebonden op DBM-papier (diazobenzylozymethyl).

1 yug Gezuiverd mBNA van geïnduceerde cellen werd géhybridiseerd op elk filter. Niet-gehybridiseerd mRNA werd door wassen verwijderd.

10 Het specifiek gehybri dis eerde mRNA werd geëlueerd en vertaald in Xenoulus laevis oocytes. Volgens deze bepaling waren alle zes poules negatief. Vijf poules van tien koloniën elk en één poule van negen koloniën werden bereid uit 59 zwak-positieve koloniën, (klasse 2) en plasmiden werden uit de poules bereid en onderzocht zoals hiervoor 15 beschreven. Onder de zes onderzochte poules hybridiseerde één (Σ1θ) tot interferon mBNA bij niveau's, die aanzienlijk boven de nuleffekt-niveau's waren, elke keer dat dit werd onderzocht. Teneinde de specifieke interferon cDNA kloon te identificeren werden plasmide DNA's bereid uit de negen koloniën van poule K10 en afzonderlijk onder-20 zocht. Twee van de negen plasmiden (nr. 101 en nr. 104) bonden interferon mBNA goed boven de nuleffektniveau's. ïïit plasmide nr. 104 werd een uniek Bgl II restriktiefragment, dat 260 b.p. bevatte, ge- 32 isoleerd, gemerkt met P onder toepassing van de methode beschreven door Taylor c.s., Biochim. Biophys. Acta 442. (1976), 324 - 330, en 25 gebruikt als taster op onafhankelijk onderzochte 400 E. coli 294 transformanten volgens een in situ kolonie-onderzoekmethode (Grun-stein en Hogness, Proc. Natl. Sci. ÏÏ.S.A. J2, [1975]» 3961 3965.)· ^

Negen koloniën (pB31-pI39) werden geïdentificeerd, die in verschillende maten met deze taster hybridiseerden.

50 Voorts werd het gemerkte 260 b.p. fragment gebruikt om onafhan kelijk 4000 E. coli 294 transformaten op dezelfde wijze aan een ver-. gelijkend onderzoek te onderwerpen. Vijftig koloniën werden gelden-ificeerd, die in verschillende maten met deze taster hybridiseerden. Eén bevatte het LeI3? G fragment, één bevatte het LelP H frag-55 ment en één bevatte een fragment aangeduid als LelP E1, een schijnbaar allel van IeI3F H. De hybride-plasmiden, die resulteren, worden aangeduid met "pLelE H”, enz.

G. Isolering en volgorde-beualing van een eerste DelP-gen met volle lengte.

4q Plasmide DNA werd bereid uit alle 39 potentiële LelP cDNA klo- 81 03151 -14- nen en werd opnieuw aan een vergelijkend onderzoek onderworpen met dezelfde 260 b p. DM taster onder toepassing van de hybridise-ringsmethode van Kafatos c.s. (zie hiervoor). Drie p&smiden (pL4* pL31, pL34) gaven zeer sterke hybridiseringssignalen, vier (pL13» 5 pL30, pL32, pL36) hybridiseerden regelmatig en drie (pL6, pD8, pL14) hybridiseerden zwak met.de taster.

De 39 potentiële Lel]? cDM recombinant-plasmiden werden eveneens aan een vergelijkende proef onderworpen onder toepassing van ^2P gemerkte synthetische undecameren (afzonderlijke T-1 voorberei-•]0 derpoules of afzonderlijke T-13 voorbereiders) direkt als hybridi-seringstasters. De hybridiseringsomstandigheden werden zodanig gekozen, dat een perfekte basisparing vereist zou zijn voor waarneembare hybridiseringssignalen (Wallace c.s., Nucleic Acids Hes. 6,

[1979]» 3543 - 3557)· Derhalve werd plasmide DM bereid uit de 39 15 klonen volgens een standaard gezuiverde lysaatmethode (Clewell c.s., zie hiervoor) en gezuiverd volgens Biorad Agarose A-50 kolomchroma-tografie. Monsters (3 ^ug) van elk preparaat werden rechtlijnig gemaakt door behandeling met Eco EI, gedenatureerd in alkali en als vlek aangebracht op twee gescheiden nitrocellulosefilters, 1,5 yrug 20 per vlek (Kafatos. c.s., zie hiervoor). Afzonderlijke synthetische deoxyoligonucleotide voorbereiders en voorbereiderpoules werden ge-fosforyleerd met (jf^2 P)ATP als volgt: 50 pmol oligonucleotide en 100 pmol ()f^2P)ATP (New England Nuclear', 2500 Ci/mmol) werden gecombineerd in 30 ^ul 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgClg 15 mM R-mercaptoëtha- «c nol. Twee eenheden T4 polynucleotide kinase werden toegevoegd en na o 52 30 minuten bij 37 C werden P gemerkte voorbereiders gezuiverd door chromatografie over Sephadex G-50 kolommen van 10 ml. Uybrid'i- g seringen werden uitgevoerd onder toepassing van 10 cpm of voorbe- 6 -reider T-130 of 3^10 cpm voorbereider-poule T-1C. De hybridiserin- 2q gen werden uitgevoerd bij 15°C gedurende 14 uren in 6 x SSC [1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitraat, pH'7,2], 10 x Denhardt’s [0,2% runderserumalbumine, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Eicoll]-oplossing, zoals beschreven door Wallace c.s. (zie hiervoor). Filters werden 5 minuten (3 maal) bij 0°C in 6 x SSC gewassen, gedroogd en blootgesteld aan röntgenstraalfilm. De resultaten zijn vermeld in 35 52 fig. 2 voor P-voorbereider-poule T-13C en voorbereider T-1C.

Plasmide DM van kloon 104 bleek aanzienlijke hybridisering te geven met voorbereider-poule T-1C en voorbereider T-130, maar geen waarneembare hybridisering met de andere undecameren. Zoals aangege-ven in fig. 2 hybridiseerden verschillende van de 39 potentiële » 81 03151 -15-

LelE plasmiden (pL2, 4» 13, 17» 20, 50, 51» 34) met deze beide tasters. Echter toonde restriktie-analyse aan, dat slechts één van deze plasmiden, pL31» eveneens een 260 b.p. inwendig BglII-fragment bevatte. Pstl-ontsluiting van pL31 liet. zien, dat de grootte van 5 de cDNA-opname ongeveer 1000 b.p. was.

De gehele Pstl-opname van pL31 werd in volgorde gebracht volgens zowel de Maxam-Gilbert chemische methode (Methods Enzymol. 65,

[1980], 499 - 56o) als volgens de dideoxy keten-beëindigingsmethode (Smith, Methods Enzymol. 65, [1980], 560 - 580) na het subklonen 10 van Sau3a-fragmenten in een M13 vector. De DNA-volgorde is getoond ("A") in fig. 3· Het geschikte vertalingsaflezingsfreem kon voorspeld worden uit aanwezige proteïnevolgorde-informatie, het bekende trajekt van LelE molecuulgewichten en de relatieve inval van stop triplets in de drie mogelijke aflezingsfreems en dat maakte het op 15 zijn-'beurt mogelijk de gehele LelE aminozuurvolgorde te voorspellen, met inbegrip van een voor- of signaalpeptide. let eerste ATG verta-lingsinitiëringscodon blijkt 60 nucleotiden te zijn van het 5* einde van de volgorde en wordt 188 codons later gevolgd door een TGA eind-triplet; er zijn 342 niet vertaalde nucleotiden bij het 3’-einde, ge-20 volgd door een poly (A) volgorde, let vermeende signaalpeptide (waarschijnlijk opgenomen in de afscheiding van ontwikkeld LelE van leucocyten) is 23 aminozuren lang. De 165 aminozuren, die het orfc-wikkelde LelE vormen, hebben een berekend molecuulgewicht van 19*390.

Het LelE gecodeerd door pL31 is "LelE A " genoemd. ïïit de volgorde-25 gegevens ("A") in fig. 4 blijkt, dat de tryptische peptiden T1 en T13 van LelE B overeenkomen met de aminozuren 145 - 149 respectievelijk 57 - 61 van LelE A. De feitelijke DNA coderingsvolgorden aan- *-getroffen in deze twee gebieden zijn die voorgesteld door de voorbe-reider-poule T1-C en voorbereider T13-C (zie fig. 8).

30 H·. Direkte expressie van ontwikkeld leucocyt interferon A (LelE A).

1. Algemeen.

De gevolgde methode om LelE A direkt tot expressie te brengen als een ontwikkeld interferon polypeptide is een variant van de methode die vroeger is toegepast voor menselijk groeihormoon (Goeddel 35 c.s., Mature 281, [1979]» 544 - 548), voorzover het betrokken is bij de combinatie van synthetische (l-eindstandig) en complementaire DNA's.

Zoals getoond in fig. 6 wordt een Sau3a restriktie endonuclea-seplaats gemakkelijk geplaatst tussen codons 1 en 3 van LelE A. Twee 40 synthetische deoxyoligonucleotiden werden ontworpen, die een ATG

8103 151 * _ -16- vertalingsinitiëringscodon doen opnemen, het codon herstellen voor aminozuur 1 (cysteine) en een EcoRI klevend einde vóórtbrengen. Deze oligomeren werden afgebonden tot een 34 b.p. Sau'3a - Avail fragment van pL31· Het verkregen 45 b.p. produkt werd afgebonden tot twee 5 additionele DNA-fragmenten voor het construeren van een 865 b.p. synthetisch-natuurlijk hybride gen, dat codeert voor LelP A en dat gebonden wordt door EcoRI en Pst! restriktieplaatsen. Dit gen werd opgenomen in pBR322 tussen de EcoRI en PstI plaatsen voor het geven van het plasmide pLelP A1.

10 2. Constructie van het tryptofan controle-element (dat de E.

coli trp -promotor, operator en trp hoofdribosoom bindings-•plaats bevat, maar een ATG volgorde voor het initiëren van vertaling ontbeert).

Plasmide pGMI draagt het E. coli tryptofan operon, dat de door-15 haling ALe 1415 (Miozzari c.s.,· J. Bacteriology 155. [1978], 1457 - ”·' 1466 bevat en dientengevolge een fusieproteïne tot expressie brengt, dat de eerste zes aminozuren van de trp-leider en ongeveer het laatste derde deel van het trp E polypeptide (hierna in vereniging aangeduid als DE'), alsmede het trp D polypeptide in zijn gehéel bevat, 20 alle onder de controle van het trp promotor-operator-systeem. Het plasmide, 20 yug, werd ontsloten met het restriktie-enzym Pvuïl, dat het plasmide op vijf plaatsen splitst. De genfragmenten werden vervolgens gecombineerd met EcoRI verbinders (bestaande uit een zelf-complementair oligonucleotide van de volgordes pCATGAATTCATG), dat 25 een EcoRI splitsingsplaats'verschaft voor een latere kloonvorming in een plasmide, dat een EcoRI-plaats bevat. De DNA-fragment en van 20 yug verkregen uit pGM1 werden behandeld met 10 eenheden DNA. ligase bij de aanwezigheid van 200 pmol van het 5' -gefosforyleerd synthetisch oligonucleotide pCATGAATTCATG en in 20 yul T^ DNA ligase-buffer (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgClg, 5 mM dithio-treitol) gedurende een nacht bij 4°C· He oplossing werd vervolgens 10 minuten tot 70°C verwarmd op afbinding te stoppen. De verbinders werden gesplitst door EcoRI-ontsluiting en de fragmenten, nu met EcoRI-einden, werden gescheiden onder toepassing van 5% polyacryl-amidegelelektroforese (hierna PAGE) en de drie grootste fragmenten werden geïsoleerd uit de gel door eerst te kleuren met ethidiumbro-mide, de fragmenten met ultraviolet licht te lokaliseren en uit de gel de van belang zijnde gedeelten te snijden. Elk gelfragment, met 300 microliter 0,1 x TBE, werd in een dialysezak geplaatst en aan elektroforese onderworpen bij 100 Y gedurende één uur in 0,1 x TBE- , 8103151 -17- buffer (TBE-buffer bevat: 10,8 g Tris-base, 5»5 S boorzuur, 0,09 g NagEDTA in 1 liter water). De oplossing in water werd verzameld uit de dialysezak, met fenol geëxtraheerd, met chloroform geëxtraheerd en met 0,2 M natriumchloride behandeld en het MA werd in water ge-5 wonnen na precipitatie met ethanol. Het trp promotor-operator bevattende gen met EcoRI klevende einden werd geïdentificeerd met de hierna beschreven methode, die de opname van fragmenten in een voor tetracycline gevoelig plasmide inhoudt, dat na promotor-operator-opna-me tegen tetracycline bestand wordt.

10 Plasmide pBRHI (Rodriguez c.s., Nucleic Acids Res. 6, [1979]» 32β7 - 3287) brengt bestandheid tegen ampicilline tot expressie en bevat het gen voor bestandheid tegen tetracycline maar, aangezien er geen geassocieerde promotor is, brengt die bestandheid niet tot uitdrukking. Het plasmide is dientengevolge tetracycline sensitief.

15 Door het invoeren van een promotor-operator-systeem in de EcoRI-plaats, kan het plasmide tegen tetracycline bestand worden gemaakt.

pBRHI werd ontsloten met EcoRI en het enzym werd door fenolex-traktie verwijderd, gevolgd door chloroformextraktie en in water gewonnen na precipitatie met ethanol. Het verkregen DNA-molecuul werd, 20 in gescheiden reactiemengsels, gecombineerd met elk van de drie hiervoor verkregen DNA-fragmenten en afgebonden met DNA-ligase, zoals hiervoor beschreven. Het in het reactiemengsel aanwezige DNA werd gebruikt om toereikend E. coli K-12 stam 294 te transformeren volgens standaardtechnieken (Hershfield c.s., Proc. Natl. Acad. Sci.

25 ïï.S.A. 21, [1974], 3455 - 3459) en de bacteriën werden als bekleding aangebracht op DB (Luria-Bertani)-platen, die 20 ^ug/ml ampicilline en 5 yug/ml tetracycline bevatten. Verschillende tegen tetracycline bestand zijnde koloniën werden geselecteerd, plasmide DNA werd geïsoleerd en de aanwezigheid van het gewenste fragment werd bevestigd 30 door restriktie enzymanalyse. Het verkregen plasmide wordt aangeduid met pBRHtrp.

Een EcoRI en BamHI ontsluitingsprodukt van het virale genom van hepatitis B werd verkregen volgens gebruikelijke-methoden en tot kloon verwerkt in de EcoRI en BamHI plaatsen van plasmide pGH6 35 (Goeddel c.s., Nature 281. [1979]» 544) onder vorming van het plasmide pHS32. Plasmide pHS32 werd gesplitst met Xbal, met fenol geëxtraheerd, met chloroform geëxtraheerd en met ethanol neergeslagen.

Dit plasmide werd vervolgens behandeld met 1 yul E. coli DNA polymerase I, Klenow fragment (Boehringer-Mannheim) in.30 ƒul polymerase-40 buffer (50 mM kaliumfosfaat pH 7»4» 7 mM MgClg» 1 mM 0-mercapto- 8103 151 -18- bevat ethanol), .dat 0,1 mM dTTP en 0,1 mM dCTP-gedurende 30 minuten hij 0°C en vervolgens 2 uren bij 37°C. Deze behandeling is er de oorzaak van dat 2 van de 4 nucleotiden complementair ten opzichte van het 5' uitstekende einde van de Xbal splitsingsplaats worden opgevuld 5 tot 5' CTAGA- 5 ’ CTAGA-

Twee nucleotiden, dC en dT, werden opgenomen, waarbij een einde verkregen werd met de twee 5’ uitstekende nucleotiden. Dit li-10 neaire residu van plasmide pHS32 (na fenol en chloroformextraktie en winning in. water na precipitatie met ethanol) werd gesplitst met EcoRI. Het grote plasmidefragment werd gescheiden van het kleinere EcoRI-Xbal-fragment door PAGE en geïsoleerd na elektroëlutie. Dit DNA-fragment van pHS32 (0,2 ^ug), werd afgebonden onder omstandighe-15 den soortgelijk aan die hiervoor beschreven, tot het EcoRI-Taql fragment van het tryptofan operon (γμ/0,01 yug), afkomstig van pBRHtrp.

Bij de werkwijze voor het afbinden van het fragment van pHS32 tot het EcoRI - Taql fragment, zoals hiervoor beschreven, wordt het 20 Taql uitstekende einde afgebonden tot het Xbal achterblijvende uitstekende einde zelfs hoewel het niet volledig Watson-Crick-basis gepaard is; — T CTAGA — —TCTAGA— — AGG TCT — —AGCTCT— .

25 Een deel van dit afbindingsreactiemengsel werd getransformeerd in E. coli 294 cellen, met hitte behandeld en als bekleding aangebracht op DB-platen, die ampicilline bevatten. 24 Koloniën werden gekozen, gekweekt in 3 ml IiB (Luria-Bertani) media en plasmide werd geïsoleerd. Zes hiervan bleken de Xbal-plaats te hebben ontwikkeld 50 via E. coli gekatalyseerde DNA-herstelling en kopie; — TCTAGA — —TCTAGA — — AGCTCT — * —AGATCT —.

Deze plasmiden bleken ook beide te worden gesplitst met EcoRI en Hpal en de verwachte restriktiefragmenten te geven. Eén plasmide, 25 aangeduid pTrp14> werd gebruikt voor expressie van heterologe poly-peptiden, zoals hierna besproken.

Het plasmide pHGH 107 (Goeddel c.s., Mature 281, [1979], 544), bevat een gen voor menselijk groeihormoon opgebouwd uit 23 aminozuur-codons voortgebracht uit synthetische DNA-fragmenten en 163 aminzuur-codons verkregen uit complementair DNA voortgebracht via omgekeerde 8103151 -19- transcriptie van de menselijke groeihormoonboodschapper ENA. Bit gen, hoewel het de codons van de "voor" volgorde van menselijk groeihormoon ontbeert, "bevat een ATG-vertalingsinitiëringscodon. Het gen werd geïsoleerd uit 10 yug pHGH 107 na behandeling met EcoRI gevolgd 5 door E. coli DNA polymerase I Elenow fragment en dTTP en dATP zoals hiervoor beschreven. Na fenol en chloroform-extraktie en preeipita-tie met ethanol werd het plasmide behandeld met BamHI.

Het menselijk groeihormoon (HGïï) gen bevattende fragment werd geïsoleerd volgens PAGE gevolgd door elektroëlutie. Het verkregen 10 DNA-fragment bevat ook de eerste 350 nuoleotiden van het strukturele gen met bestandheid tegen tetracycline, maar ontbeert het tetracycline promotor-operator-systeem, zodat, wanneer vervolgens gekloond wordt tot een expressie-plasmide, plasmiden, die de opname bevatten, gelokaliseerd kunnen worden door het herstel van bestandheid tegen 15 tetracycline. Omdat het EcoRI-einde van het fragment is opgevuld volgens de Elenow polymerase I methode, heeft het fragment één stomp en één kleverig einde, waardoor een geschikte oriëntatie gewaarborgd wordt, wanneer later wordt opgenomen in eén expressieplasmide*

Het expressieplasmide pTrp14 werd vervolgens bereid voor het 20 ontvangen van het hiervoor bereide HGH gen bevattende fragment. Derhalve werd pTrpl4 ontsloten met Xbal en de verkregen kleverige einden opgevuld met de Elenow polymerase I methode onder toepassing van dATP, dTTP, dGTP en dCTP. Ha fenol en chloroform-extraktie en precipitatie met ethanol werd het verkregen DNA behandeld met BamHI 25 en het verkregen grote plasmidefragment werd geïsoleerd door PAGE en elektroëlutie. Het van pTrp14 afkomstige fragment bezat één stomp en één kleverig einde, waardoor recombinatie in geschikte ori-entatie wordt mogelijk gemaakt met het HGH-gen, dat het hiervoor beschreven fragment bevat.

50 Het HGH-genfragment en het pTrp14 Δ Xba-BamHI-fragment werden gecombineerd en tezamen afgebonden onder soortgelijke omstandigheden zoals hiervoor beschreven. Be gevulde Xbal en EcoRI bonden tezamen af door afbinding met stomp einde voor het herscheppen van zowel de Xbal en EcoRI-plaatsi 35 Xbal opgevuld in EcoRI opgevuld in HGH-geninitiëring — TCTAG + AATTCTATG —_^ —TCTAGAATTCTATG — — AGATC TTAAGATAC — —AGATCTTAAGATAC-

Xbal EcoRI

Beze constructie herschept eveneens het tegen tetracycline be-40 stand zijnde gen. Aangezien het plasmide pHGH 107 bestandheid tegen 8103151 -20- tetracycline tot expressie brengt vanaf een promotor, die stroomopwaarts ligt vanaf het HGH-gen (de lac-promotor), maakt deze constructie, aangeduid met pHGH 207, expressie mogelijk van het gen voor bestandheid tegen tetracycline onder de controle van de tryp-5 tof an promo tor-operator. Derhalve werd het afbindingsmengsel overgebracht naar E. coli 294 en koloniën, geselecteerd op LB-platen, die 5 yug/ml tetracycline bevatten.

Piasmide pHGH 207 werd met EcoEI ontsloten en een 300 b.p. fragment, dat de trp-promotor, operator en trp hoofdribosoom-binding 10 plaats bevatte, evenwel een ATG-volgorde voor vertalingsinitiëring ontbeerde, werd gewonnen door PAGE gevolgd door elektroëlutie. Dit DNA-fragment werd gekloond in de EcoRI-plaats van pLelF A. Expressie-plasmiden, die de hiervoor gemodificeerde trp-regulon bevat^t^·· coli _ trp operon waaruit de verzwakkingsvolgorde is doorgehaald tot het 15 controleerbaar versterken van expressieniveau’ s), kunnen tot vooraf' bepaalde niveau*s in voedingsmedia, die additief tryptofan bevatten in hoeveelheden voldoende om het promotor-operator-systeem te onderdrukken, gekweekt worden, vervolgens van tryptofan worden vrijgemaakt om het systeem te onderdrukken en-de expressie van het beoogde pro-20 dukt te veroorzaken.

Meer in het bijzonder en onder verwijzing naar fig. 6 werden 250 ^ug plasmide pL31 ontsloten met PstI en werd de 1000 b.p. opname geïsoleerd door gelelektroforese op een 6% polyacrylamidegel. Ongeveer 40 yflig van de opname werd gëëlektroëlueerd uit de gel en ver-25 deeld in drie evenmatige hoeveelheden voor verdere ontsluiting: a) een monster van 16 ^ug van dit fragment werd partieel ontsloten met 40 eenheden BglII gedurende 45 minuten bij 37°C en het reactiemeng- ^ sel werd gezuiverd op een 6% polyacrylamidegel. Ongeveer 2 yug van het gewenste 670 b.p. fragment werden gewonnen, b) Een ander monster 30 (ö yug) van de 1000 b.p. Pstl-opname werd beperkt met Avail en'

BglII. Eén yug van het aangegeven I50 b.p. fragment werd gewonnen na gelelektroforese. c) 16 yug van het 1000 b.p. stuk werd behandeld met Sau3a en Avail. Na elektroforese op een 10% polyacrylamidegel, werd ongeveer 0,25 /ug (1Q pmol) van het 34 b.p.-fragment gewonnen.

25 De twee aangegeven deoxyoligonucleotiden, 5 *-dAATTCATGTGT (fragment 1) en 5*-dGATGACACATG (fragment 2) werden gesynthetiseerd volgens de fosfotriëstermethode. Fragment 2 werd als volgt gefosforyleerd.

200 ^ul (^40 pmol) (y^P) ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol) werden gedroogd en opnieuw gesuspendeerd in 30 yul 60 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM MgCl2, 15 mM R-mercaptoëthanol, die 100 pmol DNA-fragment en 8103151 -21- twee eenheden polynucleotide kinase "bevatten. Na 15 minuten "bij 37°C werd 1 yul 10 mM ATP toegevoegd en werd de reactie nog eens 15 minuten voortgezet. Het mengsel werd vervolgens 15 minuten tot 70°C verwarmd, gecombineerd met 100 pmol 5'-OH-fragment 1 en 10 pmol van 5 het 34 b.p. Sau3a - Avail-fragment. He afbinding werd gedurende 5 uren uitgevoerd bij 4°C in 50 yul 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM Mg Cl2, 10 mM dithiotreitol, 0,5 mM ATP en 10 T4 ΠΝΑ ligase-eenhe-den. Het mengsel werd aan een elektroforese onderworpen op een 6% polyacrylamidegel en het 45 "b.p. produkt werd door elektroëlutie ge-10 wonnen. Ongeveer 30 ng (1 pmol) van het 45 b.p. produkt werden gecombineerd met 0,5 y'Ug (5 pmol) van het 150 b.p. Avail - BglII fragment en 1 ^ug (2 pmol) van het 670 b.p. BglII - PstI fragment. He afbinding werd gedurende 16 uren bij 20°C uitgevoerd onder toepassing van 20 eenheden T4 HNA-ligase. Het ligase werd geïnactiveerd door gedu-15 rende 10 minuten tot 65°C te verwarmen. Het mengsel werd vervolgens ontsloten met EcoEI en PstI voor het elimineren van polymeren van het gen. Het mengsel werd gezuiverd met 6% PAGE. Ongeveer 20 ng (0,04 pmol) van het 865 b.p. produkt werden geïsoleerd. He helft (10 ng) hiervan werd afgebonden tot pBH322 (0,3 ^ug) tussen de EcoEI 20 en PstI-plaatsen. Transformatie van E. coli 294 gaf 70 tegen tetracycline bestand zijnde, voor ampieilline gevoelige transformanten. Plasmide HNA geïsoleerd uit 18 van deze transformanten werd ontsloten met EcoEI en PstI. 16 Tan de 18 plasmiden hadden een EcoEI -PstI fragment 865 b.p. in lengte. Eén yug van één van deze, pLelP 25 A1, werd ontsloten met EcoEI en afgebonden op het 300 b.p. EcoRI-fragment (0,1 yug), dat de E. coli trp promotor en trp hoofdribo-soom bindingsplaats bevatte, bereid zoals hiervoor beschreven. Trans- formanten, die de trp-promotor bevatten, werden geïdentificeerd on- 32 der toepassing van een P-trp-r-taster in samenhang met de Grunstein- 30 Hogness kolonie vergelijkende onderzoekmethode. Een asymmetrisch geplaatste Xbal-plaats in het trp-fragment maakte bepaling van recombinanten mogelijk, waarin de trp-promotor georiënteerd was in de richting van het LelP A gen.

I. In vitro en in vivo activiteit van Heil?- A.

35 Extrakten voor iF-bepaling werden als volgt bereid: kweken van 1 ml werden gekweekt in I-vloeistof, die 5 yug/ml tetracycline bevatte, tot een A^-waarde van ongeveer 1,0, vervolgens verdund in 25 ml M9 media, die 5 /ug/ml tetracycline bevatten. Monsters van 10 ml werden door centrifugeren verzameld, wanneer Ac_- 1,0 bereikte 4q en celkorrels werden gesuspendeerd in 1 ml 15% sucrose, 50 mM Tris- 8103 151 ' -22- HC1 (pH 8,0), 50 nM EDTA. Eén mg' lysozyme werd toegevoegd en na 5 minuten bij 0°C werden cell-en verbroken door geluid. De monsters werden 10 minuten gecentrifugeerd (15*000 omwentelingen per minuut) en interferon-activiteit in de bovenstaande vloeistoffen werd be-5 paald door vergelijking met LelE-nomnen volgens de cytopathische effekt (CPE) remmingsbepaling. Yoor het bepalen van het aantal IP-

Q

moleculen per cel werd een LélF-specifieke activiteit van 4 x 10 eenheden/mg gebruikt.

Zoals aangegeven in tabel A geeft kloon pLelF A trp 25, waarin 10 de trp promotor was opgenomen in de gewenste oriëntatie, hoge acti-viteitsniveau's (zo hoog als 2,5 x 10 eenheden per liter). Zoals aangegeven in tabel B, gedraagt het IP, voortgebracht door E. coli E—12 stam 294/pDeIP A trp 25 zich als authentiek menselijk LelP; . het is stabiel ten opzichte van‘een behandeling bij eên pH van 2 en 15 wordt geneutraliseerd door anti-menselijk leucocyt-antiliehamen van konijnen. Het interferon heeft een schijnbaar molecuulgewicht van ongeveer 20.000.

De in vivo doelmatigheid van interferon vereist de aanwezigheid van macrofagen en natuurlijke doder (NE) cellen en de in vivo 20 wijze van werking schijnt stimulering van 'deze cellen in te houden.

Het bleef derhalve mogelijk, dat het interferon, voortgebracht door E. coli 294/51(6111 A 25, terwijl het voorzien was van anti virus activiteit in de celkweekbepaling, niet actief zou zijn bij gelnfekteer-de dieren. Bovendien zou de in vivo antivirusactiviteit van het bac-25 terieel voortgebrachte, niet geglycosyleerde LelF A verschillend kunnen .zijn van het geglycosyleerde lelF afkomstig van menselijke "leren kolder" leucocyten. Daarom werd de biologische activiteit-van- ^ bacterieel gesynthetiseerd LelF A (2% zuiver) vergeleken met leren kolder LelP zuiver) in lethale encefalo-myocarditis' (EMC) virus-" 20 infektie van eekhoomapen. (tabel C).

label A. · *

Interferon-activiteit in extrakten van E. coli.

E. coli K-12 Cel- IF-activiteit LelF-moleculen stam 294 dichtheid eenheden/ml per cel 22 getransformeerd door (cellen/ml) kweek pLelP A trp 25 3,5 x 108 . 36.000 9*000 .

pLelP A trp 25 1.8 x 109 250.000 12.000 8103151 -23-

Tabel B.

Vergelijking van activiteiten van extrakten van E.coli 294-/-DLeI!P A 25 met standaard LelE*._

Interferon activiteit (eenheden/ml) 5 oribehan- pH 2 konijnen' anti-menselijk deld leucocyt antilichamen 294/plelE A trp 25 500 500 <10 extrakt

LeïE standaard 500 500 O0 _ _______ __ ____________ __ 10 * Het 250.000 eenheden/ml extrakt van E. coli 294/pLeI3P A trp 25, beschreven in tabel A, werd 500-voudig verdund met minimaal essentieel medium, voor het geven van een specifieke activiteit van 500 eenheden/ml. Een leucocyt interferon standaard (Wadley Institute), die vooraf getitreerd was tegen de NIH leucocyt interferon standaard, 15 werd eveneens verdund tot een eindconcentratie van 500 eenheden/ml. Hoeveelheden van 1 ml werden met 1N HC1 op een pH van 2 ingesteld, 52 uren bij 4°C geïncubeerd, door toevoeging van NaQH geneutraliseerd en de IF-activiteit werd bepaald volgens de standaard CPE remmingsbepaling. Hoeveelheden van 25 ƒul van de monsters van de 20 500 eenheden/ml (onbehandeld) werden geïncubeerd met 25 /ul anti- en ' o menselijk leucocyt interferon van kcrtyn gedurende 60 minuten bij 57 C, bij 12.000 x g gecentrifugeerd gedurende 5 minuten en de bovenstaande laag werd bepaald.

Tabel C.

25 Antivirus-effekt van verschillende LelF-preparatie tegen ^ ~ί... ^ EMC virus infektie van eekhoomapen. _

Behandeling Over- Serum leven- plaat vormende eenheden/ml den--r-- 30 . dag 2 dag 3’ dag 4 controle 0/3 10 3x10^ 10^\ (bacteriële proteïnen) 0 >3 0 >10^ 1,200 />3,4x10^

oJ 0 j 0 J

bacterieel LelE A 3/50 0 0 35 0 0 0 0 0 0 lelF standaard 3/30 0 0 0 0 0 __L_0_0 0_ 8103 151 -24-

Alle apen waren mannelijk (gemiddeld gewicht 713 S) en hadden geen EMC-virus antilichamen voorafgaande aan de infektie. De apen werden intramusculair geïnfekteerd met 100 x IDj.0 EMC-virus (bepaald in muizen). De als controle behandelde apen stierven 134» 158 en 164 g 5 uren na de infektie. Interferonbehandelingen met 10 eenheden waren langs de intraveneuze weg op -4» +2, 23» 29, 48, 72, 168 en 240 uren met betrekking tot de infektie. Het bacteriële leucocyt interferon was een kolomchromatografiefraktie van een lysaat van E. coli 294/ pGelE A 25 bij een specifieke activiteit van 7,4 x 10 eenheden/mg 10 proteïne. De controle bacteriële proteïnen waren een equivalente ko-lomfraktie van een lysaat van E. coli 294/pBR322 met tweemaal de totale proteïneconcentratie. De leucocyt interferonstandaard was met Sendai virus geïnduceerd interferon van normale menselijke "leren kolder" cellen, ehromatografisch gezuiverd tot een specifieke acti- g 15 viteit van 32 x 10 eenheden/mg proteïne.

De controle-apen vertoonden toenemende lethargie, verlies van evenwicht, slappe paralyse van de achterpoten en wateren van de ogen, die ongeveer 8 uren voor de dood beginnen. De met interferon behandelde apen vertoonden geen van deze afwijkingen; zij bleven actief 20 op alle tijdstippen en ontwikkelden geen viremie. De ene aap in de controlegroep, die geen viremie ontwikkelde met 4 dagen stierf tenslotte (164 uren na infektie), maar vertoonde hoge gehalten virus in het hart en de hersenen na de dood* De met interferon behandelde apen ontwikkelden geen antilichamen voor EMC-virus zoals 14 en 21 25 dagen na infektie bepaald. Deze resultaten laten zien, dat de anti-viruseffekten van LelE-preparaten in de geïnfekteerde dieren alleen kunnen bijdragen aan interferon, omdat de verontreinigende prote-, ^ inen geheel verschillend zijn in de bacteriële en leren kolderprepa-raten. Daarnaast wijzen deze resultaten erop, dat glycosylering niet 50 vereist is voor de in vivo antivirusactiviteit van LelE A.

J. Isolatie van cDHA's voor additionele leucocyt interferons.

DHA voor het volledig gekenmerkte LelE A cDNA bevattende plas- mide werd weggenomen met Pstï, elektrofore.tisch geïsoleerd en ge-32 merkt met P. Het verkregen radioactief gemerkte DHA werd gebruikt 35 als een taster voor het vergelijkend onderzoeken van additionele E. coli 294 transformantsn, op identieke wijze verkregen als die in deel C, volgens de in situ vergelijkende kolonie-onderzoekmethode van Grunstein en Hogness (zie hiervoor). Koloniën werden geïsoleerd, die in verschillende hoeveelheden ' ten opzichte van de taster hybri-40 diseerden. Plasmide DHA van deze koloniën en de tien hybri dis erende 8103151 -25- koloniën, waarnaar verwezen wordt in deel G hiervoor werden geïsoleerd door Pst I, gesneden en gekenmerkt volgens drie verschillende methoden. Eerst werden deze Pst-fragmenten gekenmerkt door hun res-triktie endonuclease ontsluitingspatronen met de enzymen Bgl II, 5 Pvu II en Eco EI. Deze analyse maakte de klassifikatie mogelijk van ten minste acht verschillende typen (LelP A, LelP B, LelP C, LelP D,

LelP E, LelP P, LelP G en LelP , H), aangegeven in fig. 5» die de lokatie van verschillende restriktiesnijdingen met betrekking tot

Ji de thans bekende voorvolgorde en coderingsvolgorde van LelP A bena-10 dert. Eén daarvan, LelP D, wordt verondersteld identiek te zijn met die vermeld door Nagata c.s., ïfature 284, (1980), 316 - 520.

In de tweede plaats werden bepaalde BEA's onderzocht volgens de hybridiseringsselectiebepaling beschreven door Cleveland c.s.,

Cell 20, (-1980), 95 - 105 op het vermogen selectief LelP mEEA uit 15 poly-A bevattend KG-1 cel EEA te verwijderen. LelP A, B, C en P waren bij deze bepaling positief. In de derde plaats werden de laatste Pst-fragmenten opgenomen in een expressieplasmide, E. coli 294 werd getransformeerd met het plasmide en de fragmenten werden van een expressie voorzien. Be expressieprodukten, waarvan verondersteld wordt 20 dat deze voor-interferons waren, waren alle positief volgens de CPE-bepaling op interferon-activiteit, ofschoon marginaal actief in het geval van het LelP P fragment. Haast het voorgaande waren alle beschreven LelP-typen in volgorde gebracht.

K. Birekte expressie van een tweede ontwikkeld leucocvt interfe-25 ron (LelP B).

Be volgorde van het geïsoleerde fragment, dat het gen voor ontwikkeld LelP B bevat, laat zien dat de eerste veertien nucleotiden _ van de typen A en B identiek zijn. Bi onovereenkomstig werd een fragment van pLelP A25, dat de trp-promotor-operator, ribosoombindings-j0 plaats en de start van het LelP A (=B) gen bevat, geïsoleerd en gecombineerd met het overblijvende deel van de B-volgorde in een ex-pressieplasmide. Be opvallende restriktiekaarten voor het Pst-frag-ment van pL4 (een plasmide, dat het LelP B Pst eindstandlge gen voor- gesteld in fig. 5 bevat) en pLelP A25 worden respectievelijk in de 55 fig. 7a en Tb getoond.

Voor het verkrijgen van het geschikte 950 b.p. Sau5a tot Pstl-fragment van de volgorde getoond in fig. 7a waren verschillende trappen noodzakelijk vanwege de aanwezigheid van één of meer tussenbeide komende Sau3a restriktieplaatsen, dat wil zeggen: 40 1. Be volgende fragmente.n werden geïsoleerd: 8103151 - 26 - a) 110¾ b.p, van Sau3a tot EcoRI; b) 132 b.p. van EcoRI tot Xba; o)^700 b.p. van Xba tot Pst 2. Fragmenten (la) en (1b) werden afgebonden en afgesneden met 5 Xba en BglII, ter voorkoming van zelf-polymerisatie door San 3a. en Xba eindplaatsen (de relevante Sau 3a plaats was binnen een BglII plaats; BglII snijdt af en laat een Sau 3a kleverig einde achter).

Een 242 b.p. fragment werd geïsoleerd.

3. Het produkt van (2) en (Tc) werden afgebonden en gesneden met 10 Pstl en BglII, opnieuw ter voorkoming van zelf-polymerisatie. Een geschikt 950 b.p. fragment, Sau 3a tot Pstl van fig. 7a, werd geïsoleerd. Bit fragment bevatte dat deel van het LelF B gen dat niet gemeenschappelijk was met LelF A.

4· Een geschikt JOO b.p. fragment (HindlII tot Sau3a), dat de .

15 trp-promotor-operator, ribosoombindingsplaats, ATG startsignaal en cysteïnecodon van LelF A bevatte, werd geïsoleerd van pLelF A25· 5. Een geschikt.‘3600 b.p. fragment Pstl tot HindlII werd geïsoleerd van pBE322. Bit bevatte het replicon en gecodeerd tetracycline, maar geen bestandheid tegen ampicilline. · 20 6. Be fragmenten verkregen bij de trappen 3» 4 én 5 werden drie- .

voudig afgebonden en het verkregen plasmide werd getransformeerd tot E. coli E-12 stam 294*

Trans formant en werden aan een mini-ver gel ijkend onderzoek onderworpen (Birnboim c.s., Nucleic Acids Res. 2, [1979], 1513 - 1523), 25 en plasmidemonsters werden ontsloten met EcoRI. Ontsluitingen gaven drie fragment en karakteristiek voor: l) Het EcoRI-EcoRI trp promotor-fragment; 2) het inwendige EcoRI tot EcoRI fragment van pL4 en 3) proteïne vertaalbaar startsignaal tot EcoRI fragment van pL4. ^

Bij de CPE-bepaling leveren bacteriële extrakten van klonen .

30 vervaardigd op de hiervoor vermelde wijze gewoonlijk ongeveer 10 x 10 eenheden interferon-aetiviteit op per liter, bij A^q = 1. Eén representatieve kloon bereid op deze wijze is E. coli 294/pLeïF B trp 7· L. Birekte expressie van andere ontwikkelde leucocyt interferons..

35 (LelE C, B. F. Η. I en J).

Additionele genfragmenten met volle lengte, die andere typen LelF bevatten, kunnen pasklaar worden gemaakt en in expressiedragers worden geplaatst voor expressie zoals in het geval van LelF A. Volledige volgordevorming met conventionele middelen zullen openbaren of een restriktieplaats voldoende nabij het eerste aminozuurcodon 8103151 -27- van het ontwikkelde interferontype ligt om een geschikte toevlucht mogelijk te maken voor de "benadering toegepast in deel Ξ hiervoor, voor de expressie van ontwikkeld LelE A, dat wil zeggen eliminatie van de voorvolgorde door restriktie-afsnijding en vervanging van co-5 dons voor de N-eindstandige aminozuren verloren gegaan in voorvolg-orde-eliminatie door afbinding van een synthetisch DNA-fragment. Mislukt dit, dan kan de volgende methode worden toegepast. In het kort gez®d omvat deze splitsing van het voorvolgorde bevattende fragment juist voor het punt waarop het codon voor het eerste amino-10 zuur van het ontwikkelde polypeptide begint, door: 1. omzetting van het dubbelstrengige DNA tot enkelstrengig DNA in een gebied, dat dat punt omgeeft; 2. hybridisering aan het enkelstrengige gebied gevormd bij trap (a) van een complementaire voorbereiderlengte van en- 15 kelstrengig DNA, waarbij het 5'-einde van de voorbereider tegengesteld ligt aan het nucleotide, dat grenst aan de beoogde splitsingsplaats; 5- herstel van dat gedeelte van de tweede streng, die bij trap 1 is geëlimineerd, die in de 3'-richting ligt vanaf de voor-20 bereider door reactie met DNA polymerase bij aanwezigheid van adenine, thymine, guanine en cytosine bevattende deoxy-nucleotide trifosfaten; en 4* ontsluiting van de overblijvende enkelstrengige lengte van DNA, die zich uitstrekt buiten het beoogde splitsingspunt.

25 Een korte lengte van synthetisch DNA, dat bij het 3*-einde van de coderingsstreng met het vertalingsstartsignaal ATG eindigt, kan vervolgens worden afgebonden door, bijvoorbeeld stompeindige- afbin-ding aan het verkregen pasklaar gemaakte gen voor de ontwikkelde interferons en het gen opgenomen in een expressieplasmide en onder 30 controle gebracht van een promotor en de daarmee samenhangende ribo-soombindingsplaats.

Op een soortgelijke wijze als toegepast in deel K hiervoor, werden gen-fragmenten, die LelE C en LelE D coderen, op ge schikte wijze geconfigueerd voor direkte bacteriële expressie. De 35 expressiestrategie voor deze additionele leucocyt interferons omvatte in elk geval herstel tot het geschikte 300 b.p. fragment (HindlII tot Sau3a) dat de trp promotor-operator, ribosoombindings-plaats, ATG startsignaal en cystelnecodon van LelE A van pLelE A25, bevat. Hiertoe werden genfragmenten gecombineerd van de additionele 40 interferongenen, die hun respectievelijk aminozuurvolgorden buiten 8103151 -28- het oorspronkelijke cysteine, gemeenschappelijk voor allemaal, coderen. Elk resulterend plasmide werd gebruikt om E. coli K-12 stam 294 te transformeren. Afbindingen onder vorming van de respectievelijke genen waren als volgt: 5 LeXE__C_^

Isoleer de volgende fragmenten uit pLelE C: (a) 35 b.p. van Sau 3a tot Sau 96

(b) >900 b.p. Sau 96 tot Pst I

(c) isoleer een geschikt ‘300 b.p. fragment (Hind III - 10 Sau 3a) van pLelE A-25 zoals in deel E (4) hiervoor.

(d) Isoleer het geschikte 3^00 b.p. fragment van deel E

(5) hiervoor.

Constructie: (1) Bindt (a) en (c) af. Splits, met BglII, HindlII en isoleer 15 het geschikte 335 b.p. produkt.

(2) Bindt drievoudig (l) + (b) + (d) af en transformeer E. coli- met het verkregen plasmide.

Een representatieve kloon, op deze wijze vervaardigd, is E. coli E-12 stam 294/pbeXF C trp 35*

20 LelE D

Isoleer uit pLelE D: a) 35 b.p. van Sau3a tot Avail

b) 150 b.p. van Avail tot BglII

c) ongeveer 700 b.p. van BglII tot Pstl.

25 Isoleer uit pLelE A25: ! d) 300 b.p. van HindlII tot Sau3a.

Isoleer uit pBE322: -w. . . ^ e) ongèveer 3^00 b.p. van HindlII tot Pstl.

Constructie: · · - 30 (1) Bindt (a) + (b) af, snij met BglII en zuiver een 185 b.p.

produkt (1).

(2) Bindt (1) + (d) af, snij met HindlII, BglII en zuiver het ongeveer 500 b.p. produkt (2). .

(3) Bindt (2) + (c) + (e) af en transformeer E. coli met het 35 verkregen plasmide.

Een representatieve kloon, vervaardigd op deze wijze, is E. coli E-12 stam 294/ρ^θΙΡ D trp 11.

BelE F

Het LelE P bevattende fragment kan pasklaar gemaakt worden voor 40 direkte expressie door herverzameling gemakkelijk gemaakt door de 8103151 -29- volledige homologie van aminozuren 1-13 van LelF B en Lel!1 F. Een trp promotor Bevattend fragment (a) met geschikt geconfigueerde einden wordt verkregen uit pHGH207, hiervoor "beschreven, via Pst I en Xba I ontsluiting gevolgd door isolering van het ca. 1050 "b.p. frag-5 ment. Een tweede fragment (h) wordt verkregen als de grotere van de fragmenten afkomstig van Pst I en BglII ontsluiting van het plasmide pHKY 10. Fragment (a) "bevat ongeveer de helft van de gen coderende ampicilline-hestandheid; fragment ("b) "bevat de rest van dat gen en het gehele gen voor tetracycline-bestandheid behalve de geassocieer- 10 de promotor. Fragmenten (a)^en (b) worden gecombineerd via 3?4 ligase en het produkt wordt behandeld met Xbal en BglII voor het elimineren van dimerisatie, onder vorming van een fragment (c), dat de trp promotor-operator en de genen voor tetracycline en ampicilline-bestandheid bevat.

15 Een fragment (d) van ongeveer 580 b.p. wordt verkregen door

Avail en BglII ontsluiting van pLelF F. Bit bevat codons voor aminozuren 14-166 van LelF F.

Een fragment (e) (49 h.p·) wordt verkregen door Xbal en Avail ontsluiting van plelF B. Fragment (e) codeert aminozuren 1-13 van 20 LelF F.

Fragmenten (c), (d) en (e) zijn drievoudig afgebonden bij de aanwezigheid van T4 ligase. Be cohesieve einden van de respectievelijke fragmenten zijn zodanig, dat het plasmidesamenstel correct rond gaat, het tetracycline-bestandheids-gen onder de' controle 25 brengt van de trp promotor-operator tezamen met het gen voor ontwikkeld LelF F, zodanig dat bacteriën getransformeead met het gewenste plasmide geselecteerd kunnen worden op tetracycline bevattende pla- ^ ten. Een representatieve kloon, op deze wijze bereid, is E. coli K-12 stam 294/pLeIF F trp 1. . ..

30 LelF H.

Het volledige LelF Ξ gen kan voor expressie geconfigureerd worden als een ontwikkeld leucocyt interferon op de volgende wijze: 1. Plasmide pLelF H wordt aan Haell en Esal ontsluiting onderworpen met isolatie van het 816 b.p. fragment, dat zich uitstrekt 35 van het signaal peptideaminozuur 10 tot het 3* niet coderende gebied.

2. Het fragment wordt gedenatureerd en onderworpen aan herstel-synthese met Klenov fragment van BBA polymerase I (Klenow c.s., Proc.

Hatl. Acad. Sci. U.S.A. 6£ [197θ], 168), onder toepassing van de

40 synthetische deoxyribooligonucleotide voorbereider 5'-dATG TGT AAT

8103151 -30- CTG TCT.

3. Hei verkregen produkt wordt gesplitst met Sau3a en een 432 b.p. fragment, dat de aminozuren 1 - I5Ö voorstelt, wordt geïsoleerd.

5 4· Sau3a en PstI .ontsluiting van pLelF H en isolering van het verkregen 500 b.p. fragment geeft een gen, dat aminozuren 150 tot en met het einde van de coderingsvolgorde codeert.

5· Fragmenten geïsoleerd bij de trappen (3) en (4) worden afgebonden onder vorming van een fragment: 10 1 166 met cys asp stop

ATG TGT .. —j- ... GAT TGA — .. .—Pst I

Sau3a dat de 166 aminozuren van LelFH H codeert.

15 6. pLelF A trp 25 wordt ontsloten met Xbal, stompeindig voor zien van DNA polymerase I en het produkt wordt ontsloten met Pst I.

i'

Het grote resulterende fragment kan geïsoleerd en afgebonden worden met het produkt van trap (5) voor het vormen van een expressieplas-mide, dat na transformatie van E. coli K-12 stam 294 of andere gast-20 heerbacteriën in staat is ontwikkeld LelF H tot expressie te brengen.

LelF I.

De fase λ Charon 4A recombinants bibliotheek van het menselij— ke genom geconstrueerd door Lawn o.s., Cell 1j>, (1978), 1157> werd vergelijkend onderzocht op leucocyt interferon-genen volgens methoden 25 beschreven door lawn c.s.· (supra) en Maniatis c.s., Cell Ijjj., (-1978), 687. Een radioactieve LelF-taster afkomstig van de cDNA kloon lelE A werd gebruikt om ongeveer 500.000 platen vergelijkenderwijze te.. ^ onderzoeken. Zes Delf genom-klonen werden bij deze onderzoekmethode verkregen. Na hernieuwd vergelijkenderwijs onderzoek en plaatzuive- 30 ring werd één van deze klonen, ^HLei:F2> gekozen voor verdere analyse. . ·

Onder toepassing van de hiervoor beschreven methode kunnen andere tasters met voordeel gebruikt worden om additionele LelF-klonen uit het menselijke genom te isoleren. Deze kunnen op hun beurt wor-35 den toegepast voor de bereiding van additionele leucocyt interferon proteïnen volgens de onderhavige uitvinding.

1. Het 2000 b.p. EcoRÏ-fragment van kloon A.HDeIP2 werd aan een subkloonbehandeling tot pBR325 onderworpen op de EcoRI-plaats. Het verkregen plasmide LelF I werd gesplitst met EcoEI en het 2000b.p.

40 fragment werd geïsoleerd. Het deoxyoligonucleotide dAATTCTGCAG (een 81 03151 -31-

EcoRI — PstI convertor) werd afgewonden tot het 2000 b.p. EcoRI-fragment en het verkregen produkt werd gesplitst met PstI voor het geven van een 2000 b.p. fragment, dat Pstl-einden bevat. Pit werd gesplitst met Sau.96 en een 1100 b.p. fragment werd geïsoleerd, dat 5 één PstI en één Sau9é-einde bezat.

2. Het plasmide pXelE C trp 35 werd ontsloten met PstI en Xbal.

Het grote fragment werd geïsoleerd.

3- Het kleine Xbal - PstI fragment van pLelP C trp 35 werd ontsloten met Xbal en Sau96. Een 40 b.p. Xbal - Sau96 fragment werd ge-10 isoleerd.

4. De fragmenten geïsoleerd bij de trappen (1),(2) en (3) werden afgebonden onder vorming van het expressie-plasmide pLelP I trp 1.

LelP J.

15 1. Het plasmide pLelP J bevat een 3?8 kilobase HindlII fragment van menselijk genomisch DNA, dat de LeI3? J gen-volgorde bevat. Een 760 b.p. iDdel - Rsal fragment werd uit dit plasmide geïsoleerd.

2. Het plasmide pLelP B trp 7 werd met HindlII en Ddel gesplitst en een 340 b.p. HindlII - Ddel fragment werd geïsoleerd.

20 3· Het plasmide pBR322 werd met PstI gesplitst, van een stomp einde voorzien door inkubatie met DNA polymerase I (KI enow fragment), en vervolgens ontsloten met HindlII. Het grote (^3600 b.p.) fragment werd geïsoleerd.

4· Fragmenten geïsoleerd bij de trappen (1), (2) en (3) werden 25 afgebonden onder vorming van het expressie plasmide pLelF J trp 1.

M. Zuivering.

Het gehalte aan leucocyt interferon in bacteriële extrgkten kan - vergroot worden door achtereenvolgens: 1. polyethyleenimineprecipitatie, waarbij het meeste cellulaire proteïne, met inbegrip van het interferon, in de bovenstaande vloeistof achterblijft.

2. Ammoniumsulfaatfraktionering, waarbij interferon uit oplossing komt in 55% verzadigd ammoniumsulfaat.

3. Suspensie van de ammoniumsulfaatkorrel in 0,06 M kaliumfos-22 faat, 10 mM Tris-HCl, pH 7,2 en dialyse tegen 25 mM Tris-HCl, pH 7,9 (interferon activiteit blijft in oplossing).

4. · Chromatografie van de hiervoor vermelde bovenstaande vloeistof, pH ingesteld op 8,5, op een DEAE-cellulosekolom (èlutie met een lineaire gradiënt van 0 tot 0,2 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH

40 8-5)· 8103151 ' -32- 5- Adsorptie op Cibachroom blauw-agarose of hydroxylapatiet en elutie met 1,5 M EC1'of 0,2 M fosfaat-oplossing respectievelijk (eventueel).

6. Moleculaire fraktionering op een Sephadex G-75 kolom.

5 7· Eationuitwisselingschromatografie op CM-cellulose in 25 mM

ammoniumacetaat bij pH 5,0, ontwikkeld met een ammoniumacetaatgra-diënt (tot 0,2 M ammoniumacetaat).

De hiervoor vermelde werkwijze geeft materiaal met een zuiverheid van meer dan 95%· 10 Het materiaal kan ook gezuiverd worden door grootte'uit s lui tings - chromatografie, omgekeerde fase (lP-8) hoge druk vloeistofchromato-grafie of affiniteitschromatografie op geïmmobiliseerde anti-inter-feron antilichamen..

Ook kan het materiaal van trap 4 hiervoor aangebracht worden op 15 een monoklonale antilichaamkolom, bereid zoals beschreven door

Milstein, Scientific American 245« (1980), 66, en geëlueerd met 0,2M azijnzuur, 0,1% Triton en 0,15 M NaCl.

"Volgens een andere voorkeurs-uitvoeringsvorm kan het leucoeyt interferon, bereid volgens de hiervoor beschreven methode, gezuiverd 20 worden volgens de volgende trappen: 1· 1. Bevroren celkorrels, die het van een expressie voorziene leucoeyt interferon bevat, worden met de hand of door een geschikte fijnmakingsapparatuur gebroken. De partieel ontdooide cellen worden gesuspendeerd in 4 vol.dln buffer A, die 0,1 M Tris ingesteld op 25 pH 7,5 - 8,¾ 10% (gew./vol.) sucrose, 0,2 M NaCl, 5 mM'EDTA, 0,1 mM PMS F en 10 - 100 mM MgCl^ bevat. De suspensie wordt op ongeveer 4°C gehouden. ^

De suspensie wordt door een homogeniseerinrichting geleid bij ongeveer 42.000 kPa gevolgd door een tweede passage bij' minder dan 30 7000 kPa. Afvoerprodukt van de homogeniseerinrichting van beide passages wordt gekoeld in een ijsbad. . - 2. Polyethyleenimine wordt langzaam aan het gehomogeniseerde produkt toegevoegd tot een concentratie van ongeveer 0,35% en gedurende ongeveer 30 minuten bewaard. De vaste stoffen worden door cen-35 trifugeren of filtreren verwijderd. Deze trap wordt onder temperatuurregeling uitgevoerd·of voldoende snel uitgevoerd zodat de boven- * staande vloeistof (filtraat) op 'minder dan 10°C wordt gehouden. De bovenstaande vloeistof (filtraat) wordt geconcentreerd door ultrafiltratie tot ongeveer 1/10 van de het oorspronkelijke volume. Deel-40 tjesvormig_ produkt of troebeling in. het retentieprodukt kan verwij- 8103 151 -33- derd worden door een geschikte filter, zoals een microporeus membraan.

3. De gezuiverde oplossing wordt direkt op een monoklonale an-tilichaamkolom gebracht met een flux van 5 - δ cm/h (bijvoorbeeld 5 25 - 40 ml/h op een kolom met een diameter van 2,6 cm). Na het vullen wordt de kolom gewassen met ongeveer 10 kolomvolumina van 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 - 8,5, die NaCl (θ,5 M) en oppervlakactief produkt zoals Triton X-100 (0,2$) of een equivalent produkt bevatten. Na de t wasbehandeling wordt de kolom gespoeld met ongeveer 10 kolomvolumina 10 oplossing, die 0,15 M NaCl en oppervlakactief middel zoals Triton X-100 (0,1$) of een equivalent produkt bevat. De kolom wordt geëlu-eerd met 0,2 M azijnzuur, dat oppervlakactief produkt zoals Triton X-100 (0,1$) of een equivalent produkt bevat. De proteïnepiek van de monoklonale antilichaam-kolom (zoals bepaald door UV-absorptie of 15 een andere geschikte bepaling) wordt verzameld en de pH wordt ingesteld op ongeveer 4,5 met 1 N NaOH of 1,0 M Tris-base.

4· De verzamelde interferon-piek wordt op een kationogene uitwisselaar gebracht, zoals Whatman CM 52 cellulose of een equivalent produkt, die in evenwicht is gebracht met een geschikte buffer, zo-20 als ammoniumacetaat met een pH van 4,5 (50 mM). Na het vullen wordt de kolom gewassen met de evenwichtsbuffer tot de ÏÏV-absorptie van de afvoerstroom een plateau heeft bereikt, zodat weinig additioneel proteïne uit de kolom geëlueerd wordt. De kolom wordt vervolgens ge-elueerd met 25 mM ammoniumacetaat/0,12 M natriumchloride of een com-25 binatie, die winning van interferon optimaliseert en een gelyofili-seerde koek met bevredigend uiterlijk en bevredigende oplosbaarheids-eigenschappen verschaft. ^

De monoklonale antilichamen toegepast bij de voorkeurs-uitvoe-ringsvorm, zoals hiervoor beschreven, kunnen bereid worden volgens 50 methode beschreven door Staehelin c.s., Proc. Natl. Acad. Sei.

1T.S.A. 2§, (1981), 1848 - 1852. Monoklonale antilichamen worden gezuiverd en covalent gebonden aan Affigel-10, zoals hierna beschreven.

Bereiding en zuivering van monoklonale antilichamen van asoi-35 tisch fluïdum.

Vijf vrouwelijke Balb/c-muizen werden elk geïnoculeerd met 5 tot 10 x 10^ hybridoma-cellen van de midden-log groeifase. Ongeveer 5 x 10^ levensvatbare cellen verkregen uit het door de muis geproduceerde fluïdum werden intraperitoneaal geïnoculeerd in elk van 10 of 40 meer muizen. Het ascitische fluïdum werd herhaaldelijk verzameld (2 8103151 -34- tot 4 maal) uit elke muis. Tot drie overdrachten en verzamelingen kunnen worden uitgevoerd van de ene groep muizen tot de volgende groep. Ascitisoh fluïdum van muizen van elke overdracht werd/verzameld.

5 Cellen en overblijfselen werden uit het ascitische fluïdum ver wijderd door centrifugerSit lage snelheid (500 - 1000 x g) gedurende '15 minuten. Vervolgens werd een centrifugering uitgevoerd gedurende 90 minuten bij Ί8.000 omwentelingen per minuut. De bovenstaande vloeistof werd bevroren en bij -20°C opgèslagen. Na ontdooiing wer-10 den additionele fibrine en deeltjesvormig materiaal door centrifugeren bij 55*000 omwentelingen per minuut gedurende 90 minuten verwijderd. Ladingen van ascitisoh fluïdum van elke overdracht werden onderzocht op specifieke antilichaamactiviteit volgens een vaste fase antilichaam bindingsbepaling (Staehelin c.s., zie hiervoor) en ver-15 zameld indien bevredigend bevonden.

Concentratie van proteïne in de verzamelde oplossingen werd bepaald volgens de benadering dat 1 mg proteïne een absorptie geeft van 1,2 bij 280 nm in een cuvet met ëen weglengte van 1,0 cm. Ascites fluïda met een hoog niveau aan aatilichaam bevatten 50 - 35 mg 20 proteïne/ml. Dit is equivalent aan 4 - 7 specifiek antilichaam/ml.

Het fluïdum werd verdund met PBS (0,01 M natriumfosfaat, pH 7,3» 0,15 M NaCl) tot een proteïneconcentratie van 10 - 12 mg/ml.

9

Aan elke 100 ml verdunde oplossing werden 90 ml verzadigde am-moniumsulfaatoplossing van kamertemperatuur langzaam toegevoegd on-25 der krachtig roeren bij 0°C. De’suspensie werd 40 - 60 minuten in ijs gehouden, daarna 15 minuten bij 10.000 omwentelingen per minuut bij 4°C gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd gedioanteêrd ** en goed uitgelekt. De proteïnekorrels werden opgelost in 0,02 M Tris.

HC1 (pH 7,9)/0,04 M NaCl (buffer l). De proteïne-oplossing werd 16 -18 uren bij kamertemperatuur gedialyseerd tegen 100 vol.dln buffer I met ten minste één verandering van de buffer'. De gedialyseerde oplossing werd bij 15*000 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten gecentrifugeerd om niet opgelost materiaal te verwijderen. Ongeveer 50 - 35% van de oorspronkelijke hoeveelheid totaal proteïne in 25 het ascitische fluïdum werd gewonnen zoals bepaald door absorptie bij 280 nm.

De oplossing, die 30 - 40 mg proteïne per ml bevatte, werd vervolgens aangebracht op een kolom van DEAE-cellulose, in.'evenwicht gebracht met buffer I. Een kolombedvolume van ten minste 100 ml werd gebruikt'voor elke gram aangebracht proteïne. Het antilichaam werd 81 03151 -35- uit de kdom geëlueerd met een lineaire RaCl-gradiënt, die 0,02 H Tris.HCl, pH 7 »9» van 0,04 M tot 0,5 M RaCl bevat. Verenigde piek-frakties, die elueerden tussen 0,06 en 0,1 M NaCl, werden geconcentreerd door precipitatie met een gelijk volume verzadigd ammonium-5 sulfaat bij kamertemperatuur en centrifugeren. De proteïnekorrels werden opgelost in 0,2 M RaHCO^ (pHn_, 8,0)/0,3 M RaCl (Buffer II) gevolgd door dialyse tegen drie veranderingen van dezelfde buffer bij kamertemperatuur. De gedialyseerde oplossingen werden bij 20.000 x g gedurende 15 minuten gecentrifugeerd ter verwijdering van 10 eventueel onoplosbaar materiaal. De proteïneeoncentratie werd met buffer II ingesteld op 20 - 25 mg/ml).

Bereiding van immunoadsorptiemiddelen.

Affigel-10 (BioRad laboratories, Richmond, California) werd op een gesinterd glasfilter driemaal gewassen met met ijs gekoelde 15 isopropanol gevolgd door driemaal wassen met ijskoud gedestilleerd water. De gelsuspensie (ongeveer 50% in koud water) werd overgebracht naar kunststofbuizen en gesedimenteerd met een korte centrifugebéhan-deling. De bovenstaande vloeistof werd afgezogen. De gepakte gel werd gemengd met een gelijk volume gezuiverde antilichaamoplossing 20 en gedurende 5 uren bij 4°0 omwentelingsgewijze geroteerd. Ra reactie werd de gel gecentrifugeerd, vervolgens tweemaal met buffer III (0,1 M RaHCOj/0,15 M RaCl) gewassen ter verwijdering van niet gekoppeld antilichaam. Proteïnebepaling van de gecombineerde wasvloeistoffen gaf aan, dat meer dan 90% antilichaam aan de gel was gekoppeld.

25 Om niet-omgezette plaatsen te blokkeren werd de gel gemengd met een gelijk volume 0,1 M ethanolamine.HCl (pH 8) en omwent el ingsgewij-' ze bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten geroteerd. De gelsuspen-sie werd vrij van reagentia gewassen met PBS en in PBS opgeslagen bij aanwezigheid van 0,02 gev./vol.% natriumazide bij 4°C.

50 R· Parenterale toediening.

LelP kan parenteraal toegediend worden aan individuen, die een antitumor- of antivirusbehandeling nodig hebben en aan individuen, die immunosuppressieve toestanden vertonen. Dosering en doserings- snelheid kan parallel zijn met die thans bij klinisch onderzoek van 35 van mensen afkomstig materiaal in gebruik is, bijvoorbeeld ongeveer (1 - 10) x 106 eenheden dagelijks en in het geval van produkten met grotere zuiverheid dan 1%, op geschikte wijze tot bijvoorbeeld 5 x 7 10 eenheden dagelijks.

Als één voorbeeld van een geschikte doseringsvom voor in hoofd-^0 zaak homogeen bacterieel LelP in parenterale vorm kunnen 3 mg LeI3? 8103 151 * * - ' -36- c van specifieke activiteit van bijvoorbeeld 2 x 10® eenheden/mg worden opgelost in 25 ml 5 N menselijk serumalbumine, wordt de oplossing door een bacteriologisch filter geleid en wordt de gefiltreerde op- 6 lossing aseptisch onderverdeeld in 100 flesjes, die elk 6 x 10 een-5 heden zuiver interferon bevatten geschikt voor parenterale toediening. De flesjes worden bij voorkeur in de koude (-20OC) voorafgaande aan het gebruik bewaard.

De verbindingen van de onderhavige uitvinding kunnen volgens bekende methoden geformuleerd worden voor de bereiding van farmaceu-10 tisch bruikbare preparaten, waarbij het polypeptide ervan gemengd met een farmaceutisch aanvaardbare drager gecombineerd wordt. Geschikte dragers en hun formulering zijn beschreven in. Remmington's Pharmaceutical Sciences door E.W. Martin. Dergelijke preparaten zullen een werkzame hoeveelheid van het interferon proteïne ervan be-15 vatten tezamen met een geschikte hoeveelheid drager teneinde farma-teutisch aanvaardbare preparaten te bereiden, die geschikt zijn voor een.doelmatige toediening aan de gastheer. Een voorkeurs-toedienings-vorm is parenteraal. 1 8103151 - 4b»

Claims (59)

1. Polypeptide, dat de aminozuurvolgorde van een ontwikkeld menselijk leucocyt interferon, zonder een of andere volgorde bevat.

2. Polypeptide volgens conclusie 1, zonder geassocieerde glycosylering.

3· Polypeptide, dat de aminozuurvolgorde van een ontwikkeld menselijk leucocyt interferon bevat, en dat het aminozuurjmethionine gebonden aan het eindstandige stikstofatoom van het gewone eerste 10 aminozuur van het interferon bevat1·

4· Polypeptide, dat de aminozuurvolgorde van een ontwikkeld menselijk leucocyt interferon bevat, en dat een splitsbaar conjugaat of microbieel signaal proteïne bevat gebonden aan het eindstandige stikstofatoom van het gewone eerste aminozuur van het.1 interferon. . 15 51 Polypeptide volgens conclusies 1-4» met het ken- merk, dat de aminozuurvolgorde van het interferon de partiële volgorde Gys-Ala-Trp-Glu-Yal-Yal-Arg-Ala-Glu-11e-Met-Arg-Ser bevat.

6. Polypeptide volgens conclusies 1-4, met het kenmerk, dat de volgorde van het interferon de aminozuren, gespeci-20 ficeerd en geplaatst zoals aangegeven in de volgorde "All" van fig. 4,bevat.

7- Polypeptide volgens conclusies 1 - 6, gekozen uit de groep bestaande uit menselijk leucocyt interferon (LelF) A, B, C, D, 3?, H, I en J.

8. Menselijk leucocyt interferon A (LelF A).

9· Menselijk leucocyt interferon B (LelF B).

10. Menselijk leucocyt interferon C (LelF C). •w-

11. Menselijk leucocyt interferon B (LelF D). 1

12. Menselijk leucocyt interferon F (LelF F). 2Q 13· Menselijk leucocyt interferon H (LelF Ξ).

14· Menselijk leucocyt interferon I (LelF l)_.

15· Menselijk leucocyt interferon J (LelF j).

16. Polypeptide van menselijk leucocyt interferon volgens elk van de conclusies 1 - 15 op microbiële wijze bereid.

17. Polypeptide van menselijk leucocyt interferon volgens elk van de conclusies 1 - 15 op bacteriële wijze bereid.

18. Polypeptide van menselijk leucocyt interferon volgens elk van de conclusies 1-15 bereid met E. coli.

19· DNA-volgorde, dat de volgordecodering voor de aminozuurvolg-orde van een ontwikkeld menselijk leucocyt interferon bevat 8103 151 -58- It aonder ' een of andere voorvolgorde.

20. DM-vo Igor de, die de volgordecodering voor de aminozuur-volgorde van een ontwikkeld menselijk leucocyt interferon bevat en het aminozuuzjmethionine bevat gebonden aan het eindstandige stik- 5 stofatoom van het gewone eerste aminozuur van het interferon.

21. DNA-volgorde, die de volgordecodering voor de aminozuur-volgorde van een ontwikkeld menselijk leucocyt interferon bevat en een splitsbaar geconjugeerd produkt of microbieel .signaalproteïne bevat gebonden aan het eindstandige stikstofatoom van het gewone 10 eerste aminozuur van het interferon.

22. DNA-volgorde, volgens elk van de conclusies 19 - 21, die een volgordecodering bevat voor de partiële aminozuurvolgorde Cys-Ala-Trp-Glu-Yal-Yal-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser. ! . 23· DNA-volgorde volgens elk van de conclusies 1£ - 21, die. 15 codonscodering bevat voor de aminozuren van een interferon, gespecificeerd en geplaatst zoals aangegeven in de volgorde "All" van fig. 4-

24. DNA-volgorde volgens elk van de conclusies 19 - 21, coderend voor een polypeptide gekozen uit de groep bestaande uit mense- 20 lijk leucooyt interferon (lelF) A, B, C, D, F, Η, I en J.

25. DNA-volgordecodering voor menselijk leucocyt interferon A (LelF A).

26. DM-volgordecodering voor menselijk leucocyt interferon B (LelF B).

27. DNA-volgordecodering voor menselijk leucocyt interferon C (Lel? C).

28. DNA-volgordecodering voor menselijk leucocyt interferon D (Lel? D).

29. DNA-volgordecodering voor menselijk leucocyt interferon F . 30 (Lel? F). -

30. DNA-volgordecodering voor menselijk leucocyt interferon H (Lel? H).

31. DNA-volgordecodering voor menselijk leucocyt interferon I (Lel? I). 33 32· DNA-volgordecodering voor menselijk leucocyt interferon J (Lel? J).

33· DNA-volgorde gekozen uit de groep bestaande uit de volgorden A, B, G, D, F en Ξ van fig. 5·

34· DNA-volgorde gekozen uit de groep bestaande uit de volgor- An den A, C, Η, I en J van. fig. 8. 8103151 -39-

35. DNA-volgorde volgens elk van de conclusies 19 - 34» werkbaar verknoopt met een DNA-volgorde, die in staat is microbiële ex- · pressie van een polypeptide volgens elk van de conclusies 1-15 te bewerkstelligen.

56. DNA-volgorde volgens elk van de conclusies 19 - 34» werk baar verknoopt met een DNA-volgorde, die in staat is expressie van een polypeptide volgens elk van de conclusies 1 - 15 in een bacterie te bewerkstelligen.

57· DNA-volgorde volgens elk van de conclusies 19 - 34» werk- 4 10 baar verknoopt met een DNA-volgorde, de in staat is expressie van een polypeptide volgens elk van de conclusies 1 - 15 in E. coli te bewerkstelligen.

38. Repliceerbare, microbiële expressiedrager, die in staat is . in een transformant-microörganisme een polypeptide vo-lgens elk van 15 de conclusies 1-15 tot expressie te brengen. t

39. Repliceerbare, bacteriële expressiedrager, die in staat is in een transformant-bacterie, een polypeptide volgens elk van de conclusies 1-15 tot expressie te brengen.

40· Repliceerbare E. coli es^pre'ss ie drager, die in staat is in 20 een transformant E. coli een polypeptide volgens één van de conclusies 1 - 15 tot expressie te brengen.

41· Microbiële expressiedrager volgens elk van de conclusies 38-40, die een plasmide is.

42. Plasmide gekozen uit de groep bestaande uit pLelF Δ trp 25 $ 25 pDelF B trp 7 en pLelF P trp 1.

43· Plasmide gekozen uit de groep bestaande uit pLelF C trp 35 en pLelF D trp 11. ^

44· Plasmide gekozen uit de groep bestaande uit pLelF G en pLelF H. 50 45- Plasmide gekozen uit de groep bestaande uit pLelF I trp 1 en pLelF J trp 1.

46. MLcroörganisme getransformeerd met een drager volgens één of mea? van de conclusies 38 - 45 ·

47. Bacterie getransformeerd met een drager volgens één of meer 35 van de conclusies 38 - 45·

48. E. coli stam getransformeerd met een drager volgens één of meer van de conclusies 38-45·

49. E. coli K-12 stam 294 getransformeerd met een drager volgens één of meer van de conclusies 38 - 45· 40 50* "Voortbrengsel, dat een therapeutisch werkzame fraktie bevat 8103151 * fr · , ' -40- van een polypeptide, in hoofdzaak bestaande uit de aminozuurvolgorde vaneen ontwikkeld menselijk leucocyt interferon, waarbij de rest van het preparaat een oplosbaar microbieel proteïne bevat, waaruit het polypeptide kan worden gezuiverd tot een mate, die voldoende is 5 voor een effektieve therapeutische toepassing.

51. Bacterieel extrakt, dat meer dan ongeveer 95% zuiver polypeptide bevat, dat in hoofdzaak bestaat uit de aminozuurvolgorde vaneen ontwikkeld menselijk leucocyt interferon volgens-één of meer van de conclusies 1 - 18.

52. Farmaceutisch preparaat, dat een therapeutisch werkzame hoeveelheid bevat van een ontwikkeld menselijk leucocyt interferon volgens één of meer van de conclusies 1 - 18 en een dragermateriaal, dat geschikt is voor farmaceutische toediening.

53· Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 52 voor parente-15 rale toediening.

54· Kweek van microbiële cellen, die in staat is ontwikkeld menselijk leucocyt interferon voort te brengen.

55· Kweek volgens conclusie 54» die een kweek is van een micro-organisme volgens één of meer van de conclusies 46-49·

56. Gebruik van de verbindingen volgens één of meer van de con clusies 1-18 voor de behandeling van tumoren en virusinfekties of voor de bereiding van farmaceutische preparaten, die voor een dergelijke behandeling geschikt zijn.

57· Gebruik van de DNA-vplgorden volgens één of meer van de 25 conclusies 19 - 37 voor de microbiële bereiding van een verbinding volgens één of meer van de conclusies 1 - 15·

58. Gebruik van een expressiedrager volgens één of mees-van de conclusies 18-45 voor de microbiële bereiding van een verbinding volgens één of meer van de conclusies 1-15· 50 59* Gebruik van een mier©organisme volgens één of meer van de conclusies 46 - 49 of van een kweek van microb-iële cellen volgens conclusies 54 of 55 bij <3·® bereiding van een verbinding volgens één of meer van de conclusies 1—15·

60. Yerbinding volgens één of meer van de conclusies 1 - 18 25 voor gebruik bij de behandeling van tumoren en! virusinfekties of voor de bereiding van farmaceutische preparaten die voor een dergelijke behandeling bruikbaar zijn. 61. ΠΒΓΑ-volgorden volgens één of meer van de conclusies 19 - 37 ' voor gebruik bij de microbiële bereiding van een verbinding volgens één of meer van de conclusies 1 - 15· 8103151 -41-

62. Expressiedrager volgens één of meer van de conclusies 38 -45 voor gebruik bij de microbiële bereiding van een verbinding volgens één of meer van de conclusies 1 - 15·

65. Microörganxsme volgens één of meer van de conclusies 46 -5 94 of een kweek van microbiële cellen volgens conclusie 54 of 55 voor gebruik bij de bereiding van een verbinding volgens één of meer van de conclusies 1 - 15·

64. Werkwijze voor de . bereiding van een polypeptide volgens één of meer van de conclusies 1-15» met het kenmerk, 10 dat men een kweek van een microörganxsme, getransformeerd met een repliceerbare microbiële expressiedrager, die in staat is het polypeptide tot expressie te brengen, bereidt, het polypeptide doet groeien en tot expressie brengt en het polypeptide wint.

65. Werkwijze ter bereiding van microorganismen, die in staat 15 zijn een polypeptide volgens één of meer van de conclusies 1-15 tot expressie te brengen, met het kenmerk, dat men een microörganisme met een repliceerbare microbiële expressiedrager, die in staat is het polypeptide tot expressie te brengen, transformeert en het getransformeerde microörganxsme kweekt.

66. Werkwijze ter bereiding van een repliceerbare, microbiële expressiedrager, die in staat is in een transformant microörganxsme een polypeptide volgens één of meer van de conclusies 1-15 tot expressie te brengen, met het kenmerk, dat men een eerste DJTA-volgordecodering voor het polypeptide tot stand brengt 25 en op werkbare wijze de eerste DM-volgorde verknoopt met een tweede DNA-volgorde, die in staat is de microbiële expressie, van het polypeptide te bewerkstelligen. ^

67. Produkten en werkwijzen ter bereiding ervan zoals hiervoor beschreven. 30 8103151