DD210304A5 - Verfahren zur herstellung eines replikablen vektors - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein gentechnisches Verfahren zur Herstellung von Leukozyten-Interferon, was auch Ziel der Erfindung ist. Erfindungsaufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines replikablen Vektors, der in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptids mit der Aminosaeuresequenz eines reifen Human-Leukozuten-Interferons bewirkt, bereitzustellen. Erfindungsgemaess verbindet man eine dieses Polypeptid codierende erste DNS-Sequenz operabel mit einer zweiten DNS-Sequenz, die die fuer die Expression notwendigen Codons enthaelt.

Description

Berlin, den 9.12.1983 62 991/12/37 Ausscheidung II aus AP C 12 K/231 371 59 477/12

Verfahren zur Herstellung eines replikablen Vektora

Anwendungsgebist der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekombi nanten DNS-Technologie, d· h· Verfahren, die auf'diesem Gebiet verwendet werden und Produkte, die mit diesen Verfahren erhalten werden»

Genauer gesagt, betrifft; die vorliegende -Erfindung peptide, insbesondere die Herstellung reifer Human-Leukozyten-Interferone. . _:

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Human-Leuko'a^t'in-Interferon (LeIP)' wurde zuerstrvöh;'" Isaäce, and.LindehrnanhCProc. R, SoC B 147, 253-267 (1957); ü· S. P. 3»699.222) entdeckt und in ?orni der rohen Präzipitate hergestellt. Die seit dieser Zeit andauernden Anstrengungen,, das Material zu reinigen und zu charakterisieren, haben zur. Herstellung relativ homogener Leukozyten-Interferone aua normalen Leukozyten oder aus Leukozyten von leukäaischen Spendern geführt (z. B, Deutsche Offenlegungsschrift ilr. 2.947.134)· üiese. Interferone gehören zu einer Familie von Proteinen, die die bekannte Eigenschaft besitzen, bestimmten .Zellen einen Virus-resistenten Zustand zu verleihen. Darüber hinaus kann Interferon die Zell-Proliferation·hemmen;, und die Iromunantwort. modulieren» Diese Eigenschaften haben dazu geführt, daß Leukozyten-Interferon klinisch als therapeutisph^s· Mit^el ,zur Behandlung_;:virale.r Infektionen und; .Krankheiten.eingesetzt wurde.

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In der Vergangenheit wurde Leukozyten-Interferone im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt (Rubinstein et al. j Proc· latl.. Acad· Sei· U.S.A. J£> 640-644 (1979); Zoon et al., ibid. 76, 56O1-56G5 (1979)). Me berichteten Molekulargewichte liegen im Bereich von etwa 17.500 bis etwa 21.000. Die spezifischen Aktivitäten dieser Präparate

Ο Q

sind bemerkenswert hoch mit 2 χ 10^ bis ί χ TO^ Einheiten pro mg Protein, aber die aus den Zellkulturen erhaltenen Ausbeuten sind bisher entmutigend niedrig. Trotzdem gelang durch verfeinerte Proteinsequenzierungsmethoden die Bestimmung von Aminosäurepartialsequenzen (Zoon et al, Science 207* 527 (1980); Lev? et' al., 2roc. Hat!.,:- Acad:. Sei., U. S.. A. 77, 5102-5104 (1980)). Die Präge der Glycosylierung der verschiedenen Leukozyt en-Interferone ist bis^: j etz.t noch nicht völlig abgeklärt,. aber es ist soviel klar, daß Unterschiede in den Molekulargewicht en.= nicht allein, durch GIycösylierung hervorgerufen werden. Es ist auch klar, daß die Leukozyten-Interferöne" deutlich⁵ unterschieden^ sind-voneinander: durch unterschiedliche Aminosäurezusammensetzung und -sequenz und die Aminosäurehomologie ist in manchen Pällen niedriger als 80 %,

Während das aus¹ Spender-Leukozyten isolierte homogene Leukozyten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakterisierung_:und zu limitierten klinischen Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für breite klinische Prüfungen und die anschließende prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung notwendig sein werden* Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Euman-Leukozyten-Interferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit . < 1 %) und die langen Heiten, die nötig'sind',· um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten haben zu

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einer starken Jerzöger.ung von Untersuchungen in größerem Maßstab,: geführt.,,.

Durch rekombinante DITS-Technologie ist es jedoch inzwischen gelungen, eine große Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert raikrobiell herzustellen· So existieren inzwischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, daß sie die Herstellung von Polypeptiden wie Somatostatin, den A und B Ketten des Human-Insulins und Human-Wachstumshorraon gestatten (Itakura et- al,:* Science JJS8_?; .1056-10ö3 (1977); Goeddel. et. al.,._; Hat ure 281,, 544-5W( 1979)). Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DHS-Technik die bakterielle Herst e 11 ung von Pro ins ul in und T hymo s in alp ha 1 'und verschiedene Autoren haben berichtet, daß es ihnen gelungen ' : ist, Himan-Leiikoz;yt en-Interf eron :i^ s^Äfeheslie» - i^üt^:eln'S&. ΐϊϊ|ΐ'ϊ L eiakös^t en- In^e^f öronafet Iy it ät ^. au erhalten (Sagata et al., Nature 264, 316-320 (1980); Mantei et al., Gene K), 1-10 (1980)j Taniguchi et al., Uature 285, 547-549 (1980)).

Daa. Zugpferd der rekoGibinanten DIiS-Technologie ist das^: Plasmid, eine nicht-chrooaosoinale Schleife doppelst rängiger DUS, die in·Bakterien und anderen Mibroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasmid-DlTS enthaltene Information umfaßt diejenige.zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d. h. ein "Replicon") und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Charakteristiken wie, im Pail von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das interessierende Plasniid enthalten, zu ernennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die'Nützlichkeit· der Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktions-Endonucleäse (auch

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Restriktionsenzym genannt) gespalten Werden können, wobei 3ede Bndonuclease.eine andere Stelle der Plasmid-D¥S erkennt, Heterologe Gene oder Genfragmente können in das Plasmid an den Spaltstellen oder anschließend an die Spaltstellen rekonstruierte Enden eingefügt werden* Die. DITS-Rekombination wird außerhalb der Zelle durchgeführt aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt und große Mengen an heterologe Gene enthaltenden, rekomb.inierten Plasmiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden«.Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d, h. operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plaamids eingefügt, die für die Transcription und Translation der kodierten DlS-iäachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene rekombinierte Plasmid (Expressionsvektor,.Vektor) zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden, daß durch das heterologe Gen kodiert wird« Dieser Prozeß wird als Expression bezeichnet. .

Die Sspression wird aasgelöst in der Promoter-Region, die durch RUS-PoIymerase erkannt und gebunden wird. In einigen-Fällen, wie z. B," beim Tryptophan- oder ⁿtrp"-Promoter, der in.Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promotor-Regionen von sogenannten Operator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Operator, Operatoren sind DNS-Sequenzen, die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren. Die Polymerase wandert an der DJSS entlang und überschreibt die Information, die der kodierende Strang enthält, vom 5\ - zum 3*-Sn.de in

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die dann wiederum in das Polvpeptid mit der durch die DIS kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird» Jede Aminosäure eines Polypeptids wird innerhalb des sogenannten Strukturgens durch ein lukleotid-Triplett oder Codon kodiert, Nach der Bindung an den Protnotor transkribiert die RSTS-Polymerase zunächst rJukleotide, die eine Ribosomen-Bindungssteile kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der mRHS zu AOG wird) und schließlich die KTukleotid Sequenzen des Strukturgens selbst. Am Ende des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weiter© mRliS-Sequenzen bilden kann, die aber- wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden« Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRItfS an, in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend . am Translations-Startsignal· und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal, Das gewünschte Produkt wird hergestellt_} wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle kodieren richtig liegen in Bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase sind. Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lvse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise«

Der vorliegenden Erfindung lag der Gedanke zugrunde, daß die Anwendung der recombinant en DIiS-Technolοgie (d, h* die Srfindung von Interferongenen in mikrobielle Vektoren und deren Expression unter der Kontrolle mikrobiel-•ler genregulatorischer. Elemente) der wirkungsvollste Weg zur Gewinnung großer Mengen Leukozyt en-Interferon wäre, welches trotz, der Tatsache,, :daß es nicht gl.yk0.s7lie.rt ist, wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behänd-

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lung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden könnte«

Ziel der Erfindung;

Ss ist Ziel der Erfindung, Leukozyten-Interferon unter Einsatz der Gentechnik herzustellen«

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines replikablen Vektors bereitzustellen, der in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Leuközyten-Interf er one bewirkt:..

Ein erstes Leukozyten-Interferon-Gen wurde erfindungsgemäß durch die folgenden Maßnahmen erhalten;

(1) AminosäurepartialSequenzen von homogenem Humanleukozyten-Interferon wurden verwendet., um synthetische DiJS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt aller möglichen ludeotidkombinationen repräsentierten, durch die die Aminosäure— partialsequenzen kodiert werden können»

(2) Sa wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DBS (cD^S) aus induzierter mElS enthielten. Andere induzierte und radioaktiv markierte mfiiJS wurde mit Plasmid-cDNS aus dieser Bank hybridisiert, Hybridisierende mPJtfS wurde eluiert und auf Translation in Interferon im Oozyten-Test getestet. Plasmi.d-BIiS aus Kolonien, die in diesem Te3t Interferonaktivität besaßen, wurden ferner auf. Hybridisierung mit Sonden, die nach (1) erhalten wurden, getestet«

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(3) Parallel zu dem Vorgehen unter (2.) wurde mittels indizierter mRÜFS erhaltene cMS in Plasmiden dazu verwendet, eine unabhängige Bank transformierter Kolonien zu bilden« Die gemäß (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDHSverwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden. Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induziert er "tnRiiS als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte cDliS zu bilden« Xn dieser Weise erhaltene·⁰ Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDIfS hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kpdie—_:, renden Gens, Jedes gemäß (1) oder (2) erhaltehe, möglicherweise eine Teilsequenz des Interferons kodierende GenfFragment kann als Sonde für ein ungekürztes Gen verwendet werden«

(4) Das so erhaltene ungekürzte Gen.wurde maßgeschneidert. unter Verwendung synthetischer DiJS, um jegliche Leader-Sequenz, die die mikröMelle Expression des reifen .Polypeptide verhindern könnte, auszuschliessen und um es in einem. Vektor in die richtige Position bringen au können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines mikrohiellen Promoters· Das experimierte Interferon wurde soweit gereinigt, daß es charakterisiert und seine Aktivität best inimt werden konnte,

(5) Das auf diese Weise erhaltene Interferon-Genfragment konnte seinerseits als Sonde für die Isolierung (mittels Hybridisierung.) von weiteren Genen für andere, teilweise homologe Leukozyt en-Interferone verwendet .werden«·.

Durch die Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DUS-Technologie, wurde die

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mikrobielle Herstellung der Pamilie homologer Leukozyten-Interferone (in nicht-glykoaylierter Form) als reife Polypeptide, d. h. im wesentlichen frei von entsprechenden Präsequenzen oder Teilen davon, erreicht. Diese Interferone können, direkt esprimiert, isoliert und soweit gereinigt werden, daß sie für die Verwendung zur Behandlung viraler und bösartiger Krankheiten von Tieren und Menschen geeignet sind·

Einzelne Glieder der Interferon-Familie, soweit aie exprimiert wurden, waren in in vitro-Tests wirksam und, in einem ersten derartigen Versuch, ebenfalls in einem in vivo-Test, wobei es sich bei letzterem um die Prüfung des ersten mikrobiell hergestellten reifen Leukozyten-Interferons handelte.

Der Aufdruck "reifes Leukozyten-Interferon", der im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung Verwendet wird, definiert ein mikrobiell (z. B. bakteriell) hergestelltes Interferonmolekül, das keine Glykosylgruppen trägt« Reifes Leukozyten-Interferon, gemäß vorliegender Erfindung, wird von einem Translations-Startsignal (ATG) direkt vor dem ersten Aminosäurecodon des natürlichen Produktes exprimiert« Das "reife" Polypeptid kann daher als erste Aminosäure seiner Sequenz Methionin (für das ATG codiert) enthalten, ohne daß damit sein Charakter wesentlich geändert würde. Andererseits kann der mikrobielle Wirt aus^: dem. unmittelbaren Translationsprodukt das Methionin abspalten. Reifes Leukozyten-Interferon kann zusammen mit einem konjugierten Protein, das nicht ein üblicher Leader, ist exprimiert werden,' wobei das Konjugat spezifisch intra- oder eztrazellulär gespalten werden kann (vergleiche britische Patentanmeldung-Ur. 2007676 A), Schließlich kann das reife

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Interferon zusammen mit einem mikrobiellen "Signal-Peptid" hergestellt werden, daa das Konjugat an die Zellwand transportiert, wo die Signalsequenz abgespalten and das reife Polypeptid sezerniert wird· Expression von reifem Leukozyten-Interferon bedeutet bakterielle oder andere mikrobielle Herstellung eines Interferonmoleküls, das weder Glykosylgruppen noch, eine Präsequenz enthalt.

Die Aminosäuresequenzen der einzelnen Leukozyten-Interferone (Figuren 4 und 9) wurden auf Grund der DNS-Sequenzen der entsprechenden Gene (Figuren 3 und 8) ermittelt. .Für all e_: die se_: einzelnen Le ukosyt'en-Interferone existieren natürliche, von Individuum zu Indeviduum Unterschiedliche alleische Varianten, Diese Varianten können gekennzeichnet sein durch Austausch (Substitution, Inversion), Deletion oder Insertion einzelner oder mehrerer,.. Aminosäuren in der Sequenz, Derartige allelisehe Variationen der erfin&ungsgemäßen Leukozyten-Interferone A bis J^: sind von den .jeweiligen Formeln (LeIF A bis LeIF J)-mitumfaßt und ebenfalls Gegenstand der.·.vorliegenden Erfindung*

Beschreibung der Figuren

Figur 1 beschreibt zwei Minosäurepartialsequenzen, die allen Interferonspezies, die aus menschlichen Leukozyten isoliert und bis zur Homogenität gereinigt wurden, gemeinsam 3ind« Sie sind T-1 und T-13 bezeichnet. Es sind alle, möglichen mRlTS-Sequenzen, die diese Peptide kodieren, dargestellt, ebenso wie die entsprechendencDliS-Sequenzen« Die Buchstaben A, T, G, G und U bezeichnen die Nucleotide mit den Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil. Der Buchstabe S. "be.de ut et. A, G, G oder U, Die "Polynucleotide.

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sind vom 5'-Ende (links) zum 3^J-Ende (rechts) angegeben und wo sie doppelsträngig dargestellt sind, ist die untere ΏΕ3 (nicht-kodierender Strang) von 3'- in 5'-Riehtung. wiedergegeben,

Figur 2 stellt ein Autoradiogramm .dar,.'das die Hybridosierung von -möglichen- LeIF-Plasmiden mit ^J p-markiej synthetischen Deoxyoligonukleotiden zeigt.

Figur 3 gibt die Hukleotidsequenzen (kodierende Stränge) von acht isolierten Genfragmenten (bezeichnet A-H) wieder, die für die Expression von Leukozyten-Interferönen verwendet werden können. Der ATG Translations-Start-Codon und die Stoptripletts für jedes LeIF sind unterstrichen. Auf die Stoptripletts folgen unübersetzte Sequenzen, Dem vollständigen Gen für LeIF A fehlt ein Godon in der Position 200 bis. 202-, der bei den anderen LeIFs vorhanden ist· Vor der Leader-Sequenz liegen ebenfalls unübersetzte Sequenzen, Dem isolierten Fragment E fehlt die volle Leader-Präsequenz, aber es enthält das vollständige Gen für ein etwaiges reifes LeIF E, Dem isolierten Fragment G hingegen fehlt ein Teil der kodierenden Sequenz,

Figur 4 gibt einen Überblick über die aus den bestimmten Ziukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzenvon.8 Leukozyten-Interferonen (A bis H). Die für die Bezeichnung der einzelnen Aminosäuren verwendeten großen Buchstaben sind die von der IUPAG-IUB Kommission für biochemische Nomenklatur empfohlenen, Bs bedeuten; A Alanin; G Cystein; D Asparaginsäure; E Glutaminsäure\ F Phenylalanin; G Glycin; H Histidin; I Isoleucin; S Lysin; L Leucin; M Methionin; Ii Asparagin; P Prolin; Q Glutamin; R Arginin; S Serin; T Threonin; 1 Valin; W Tryptophan; und Y Tyrosin, Die Zahlen geben die Position

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der Aminosäuren an (S bezieilt sich, auf das Signal-Peptid), Der Bindestrich, in der 165 Aminosäuren umfassenden Sequenz von LeIP A in Position 44 wurde eingeführt, um die'Sequenz' des LeIP A in Übereinstimmung mit den 166 Aminosäuren der anderen Leukozyten-Interferone zu bringen, Pur die Pestlegung der Aminosäuresequenz des LeIP S wurde das ITukleotid in Position 187 (Pigur 3) nicht berücksichtigt. Die Sterne (Sequenz von LeIP 3) stellen in-Phase-befindliche Stopcodons dar. Aminosäuren, die allen LeIPs (mit Ausnahme des Pseudogens LeIP S) gemeinsam sind, sind in Zeile "All" dargestellt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch im

Pigur 5 gibt die Re strikt ions en donucl ease-liar ten der klonierten cDÜSs von 8 .verschiedenen Leukozyt en-Int erferonen wieder (A bis H), Die hybriden Plasmide· wurden nach der, dCsdG-iailing-iäethode (Goeddel, D,V₄ et al, Mature 282^ . 411-416 (1980) hergestellt. Die. cDIü'S-Einsätze können ^: daher mit·PatI· herausgeschnitten werden. Die Linien an den Enden jedes cDHS-Sinsatzes stellen,die anschliessenden homopolymeren dC;dG-3chwänze dar. Dia, Lage der PvuII-, EcoRI- und BgI 11-B.e strikt ionssteil en sind angegeben. Schattierte Regionen in der Pigur stellen kodierende Sequenzen für reife LeIPs dar? die schräg-gestrichelten Re- gionen bezeichnen kodierende Sequenzen für Signalpeptide, während die weißen Regionen nicht-kodierende Sequenzen darstellen.

In.Pigur 6 wird schematisch die Konstruktion eines -Gens, das die direkte mikrobielle Synthese von reifem LeZB¹ A kodiert, dargestellt. Es werden die Restriktionsstellen (PstI, usw,) sowie die verwendeten Bruchstücke gez-eigt. Die Abkürzung "b.p." bedeutet Basenpaare,

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Figur 7 (nicht maßatabgerecht) stellt schematisch die Restriktions-Karte von 2 Genfragmenten dar, die zur Expression von reifem LeIP B verwendet wurden. Die bezeichneten Hukleotid-Codons sind, die Enden der kodierenden Stränge, die durch Behandlung mit dein Restriktionsenzym Sau3a in den beiden dargestellten Fällen entstehen«

Die Figuren 8 und 9 geben die DlJS- und Aminosäureaetaenzen der Leukozyten-Interferone A, G, H, I und J wieder. In Figur 9 bedeutet der Stern einen Stopcodon in der entsprechenden DJJS-SequenZj während der Bindestrich in der Sequenz von LeIF; A die benachbarten Aminosäuren, Phenylalanin und. Glycin miteinander verbindet,.

Beschreibung, der bevorzugten Ausführungsformen Die., verwendeten MikroorganisDien,

Die beiden folgenden Mikroorganismen wurden verwendeti Ξ. coli σ 1776» wie beschrieben in U.S.P» 4.190,495, und E, coli K-12 Stamm 294 (end A₅ thi", hsr", hsm^), wie in der britischen Patentanmeldung Hr. 2055382 A beschrieben. Beide Organismen wurden bei der American Type Culture Collection deponiert unter den ATCG Irr, 31537 und 31446. Die gesamte -Arbeit wurde unter Beachtung- der Richtlinien des-' National Institute of Health durchgeführt.

Außer den beiden oben genannten Ξ« coli-Stämmen können aber auch andere Stämme, beispielsweise B. coli 3 oder weitere Mikroben-Stämme, verwendet werden, von denen die meisten an einem Depositorium, wie der American Type Culture Collection, hinterlegt worden sind und allgemein zugänglich sind. Vergleiche auch Deutsche Offenlegungs-"' schrift 2644432.. Weitare Mikroorganismen, die erfindungs-

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gemäß verwendet werden können, sind z. B, Bacilli, wie Bacillus 3ubtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem Salmonella tvphimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die unter Verwendung von replikablen Plasmiden heterologe Gene zur Expression bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise in Saccharomyces cerevisiae, können Interferongene zur Expression gebracht werden, unter der Kontrolle einea Hefepromotors»

B. Quelle und Reinigung; ron LeIP mRUS

LeIP mfiUS kann von Human-Leukozyten gj

von CHL-Patienten), die zur Produktion von Interferon"'mit" Sendai-Virus oder JSfDV, wie beispielsweise in der. deutschen Qffenlegungsschrift Ur, 2947134 beschrieben, angeregt wurden, erhalten werden. Eine besonders bevorzugte und für die vorliegende Arbeit verwendete Quelle ist: eine Zelllinie, die KG-1 bezeichnet ist und sich von einem Patienten mit akuter nivelogener Leukämie ableitet. Die Zelllinie, beschrieben von Xoeffler, H.P. und Golde, D.W., Science 200, 1153 (1978), wächst schnell in einem Medium enthaltend RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) I64O mit 10· ιί> PCS (fötales Salberserum), hit ζ einaktiviert, 25 mM HSPSS-Puffer (H-2-Hydro2:vethvl-piperazin-lJ^t-2-ethan-sulfonsäure) und 50/ig/ml Gentamicin, Die Zellen können in¹ dem vorstehend beschriebenen Medium nach Zusatz von 10 % Dimethvl3Ulfoxid eingefroren werden. Die KG-1 Linie ist bei der American Tvpe Culture Collection unter der ATCC Nr. CRL 8031 deponiert worden.

•'Die KGr-T-ZeIlen wurden nach der von Rubinstein et al. in" (Pro c. iiatl. Δ cad· Sei. U.S.A. 76, 640-644 (1979) be-

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achrieb en en Weise mit Sendai-Virus oder ITDV zur Produktion von Leukozyten-Interferon-aRUS angeregt. Die Zellen wurden 5 Stunden nach der Induktion geerntet und die mRJJS wurde nach der GuanidiJithiocyanat-Guanidinhydrochlorid-Methode (Ghirgwin et al·, Biochemistry JS,. 5294-5299 (1979) hergestellt, RJJS aus nicht-indizierten Zellen wurde in der gleichen Weise isoliert, Oligo-deozythymidin CdT)-CeIIuIoSe-Chromatographie und. Saccharose-Gradient-Ultrazentrifugation wurden benutzt, um die 12S Fraktion von PoIy(A)-ERIiS, wie von Green et al. (Arch. Bio ehem. Biophys. 172, 74-89 (1976)) und Okuyuma et al. (Arch. Blöchern· Biophys. 188, 98-104 (1989)) beschrieben, zu erhalten. Diese jnRi'JS hatte einen Interferontiter von 8000-10,000 Einheiten pro Mierοgraam im Xenopua laevis Qozytentest (Cavalierl et al«, Prop» iJatl, Acad·. Sei· U.S.A. 74.,' 3287-3291 (1977)).

C. Herat ellung von ,Koloniebänken, die LeIP-cI)IJS-Seqa'en'zen enthalten .

5/ug mRiJS wurde zur Herstellung doppelsträngiger nach Standardmethoden (Wickens et al., J. Bio!·· C he ca· 253, 2483-2495 (1978) und Goeddel et al,, Hature 281, 544-548 (1979).verwendet· Die cDECS wurde der Größe nach fraktioniert durch Elektrophorese an einem 6 $ Polyacrylamidgel und 230 ng des Materials mit 500-1500 Basenpaaren wurden durch Elektroelution isoliert, 100 ng dieser cD13 wurden mit Deosycytidin (d'G)-Resfcen nach der von Chang et al. (lature 275, 617-624 (1978)) beschriebenen Biethede verlängert, verbunden mit 470 ng des-Plasmids p3R 322, welches mit Deosyguanosin (dG)-Rest en an der Pstl-Spaltstelle (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 (1977)) verlängert worden war und zur Transformation von Ξ. coil χ 1776 verwendet. Es wurden etwa 130 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche Transformanten pro ng cDiJS erhalten·

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In einem zweiten ähnlichen Experiment-wurden etwa 1000 Tetracyclin-reaiatente, Ampicillin-empfindliche S. coli K-12 Stamm 294-Tr ans formant en pro ng cDiiS erhalten. In diesem PaIIe- lag die Größe des fraktionierten cDJtfS-Materials zwischen 600 und 1300 Basenpaaren« Ss wurde durch Elektroelution für die Verlängerung mit Deoxycytidin(dC) gewonnen.

D, Herstellung; synthetischer Qligonucleotide und deren Verwendung . . .

Die Kenntnis der Aminosäuresequenzen verschiedener tryptischer- Fragitfent^ von humaiien Letikozyten-Interferonen ,erlaubte, die Synthese von Depxyoligonukleotiden, die ...be-, stimmten; Regionen der LeIP wRBS komplementär;waren, Die beiden tryptischen Peptide T1 und T13 wurden ausgewählt, weil ihre Aminosäuresequenzen die Synthese von nur 12. bzw. 4 ündecameren erforderte, um alle möglichen iJucleotidsequenzen- zu erfass en (Figur..: 1)«. 4 Sätze ,von Deosynukleotidsonden wurden für jede Sequenz synthetisiert, die entweder 3. (Τ-1Δ, B, C, D) oder ein (T-13A, B, G, D) Oligonucleotid enthielten. Die bezeichneten komplementären Deoxvoligonucleotide aus jeweils 11 Basen wurden chemisch synthetisiert nach der Phosphortriestermethode (Crea et al., Proc. latl. Acad. Sei. U.S.A. 25» 5765-5769 (1978)). In der T-13 Serie wurden 4 individuelle Sonden hergestellt. Die zwölf T-1 Sonden wurden in vier Pools zu 3Sonden, wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt.

Die vier individuellen Sonden der T-13 Serie und die zwölf T-1 Sonden, hergestellt in je vier Gruppen zu 3 Sonden, 'wurden verwendet, um die Synthese radiomarkiarter einsträngiger cDUS zum Gebrauch als Hybridisierungssonden zu starten. Die Matriaen-mRIiS war- entweder 12S RiJS von mit Sendai-Virus induzierten KG-1 Zellen (8000 Einheiten IP-

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Aktivität per/ag) oder gesamte PoIy(A)-BiRIS aus nicht induzierten Leukozyten (10 Einheiten pro/Ug)* ^ p-markierte cDJSS wurde aus diesen Startern hergestellt unter Verwendung bekannter Reaktionsbedingungen (IJoyes et al., Proc. Natl. Acad, Sei. U„S.A. 76, 1770-1774- (1979)). Die 60yul-Reaktionen wurden durchgeführt in 2OmM Tris-HCl (pH 8,3), 2QmM KCl, 8mMgCl₂ und 3OmM ß-Mercaptoethanol, jeweils mit 1 /ag jedes Startes (d. h. 12/üg insgesamt für die T-1 Serie, 4/ug insgesamt für die 1-13 Serie), 2,ug induzierter 12 S mRlJS (oder 10/ug nicht induzierter Poly (A)-BiR-JJS), 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 uCi (i*³²p)dCTP (Ani.ersham, 2-3OOÖ Gi/nmole) und 60 Einheiten reverser Trahskriptase (Bethesdä Research liabbratories). Das Produkt wurde von nicht-markiert em Material durch Gelfiltrationen an einer TO sil-Sephades^; G-50 Säule getrennt,. Minuten bei 7.0 ⁰G mit'0,3 U if a OH, zur Zerstörung der. RHS, behandelt und mit HCl· neutralisiert. Die Hybridisierungen wurden wie von Kafatos et al. (Hucleic Acids Hes. 7_} 1,541-1552 (1979) beschrieben, durchgeführt*

S. Identifizierung; der Klone -pLI-pIQQ

Die Methode von Birnboim et al·».,-. Uucleic Acids- Res,... J, 1513-1523 (1979), zur schnellen Isolierung von Plasmiden wurde verwendet, um 1/Ug Plasmid-DiJS; aus jeder der 500 individuellen E. coli K-12 Stamm 294-iransformanten (vergleiche-G) zu gewinnen« Jede DKS-Probe wurde denaturiert und auf Uitrocellulosefilter in dreifacher Ausführung, nach der Methode von Kafatos et al., (siehe oben), aufgebracht»

Die drei Sätze der litrocellulosefilter,; die 500 Plasmidproben enthielten, wurden hybridisiert.mit

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a) induzierter cDITS, gestärkt mit einem T-1 St art er sat ζ _t

b) T-13 gestarteter induzierter cDIS and

e) nicht induzierter cDHS, hergestellt unter Verwendung, beider Startersät ze. Klone wurden als positiv angesehen,

wenn·'sie'- stärker hybridisierten ^:miteiner oder beiden

der indizierten cDUS-Sonden als mit der gesamten nicht induzierten Sonde» 30 positive Klone (pl1-pL30)-wurden aus den 500 zur weiteren Analyse ausgesuchte

?.· Identifikation der Klone pL-31-pI»39« Isolierung;' eines Pläsmlds ('Hr. 104), das' elnflelFSSeH^; fragment ent hie It. :

Tranaformanten von E* coli χ 1776 wurden nach der Koloniehybridisierüngsmethöde· von' Grunsteinund'Hogneäs' (Proc, latl, Acad. 3ci> U.S.A. J2₅ 3961-3965" OS7$))^: ge--:

.· ' 'i"'. -3^~" ' ' " ' ' ' -^;i '^r"' -

testet, unter Verwendung von p-marsierter induzierter mEiJS als Sonde (Lillenhaug et al., Biochemistry,. TJ₁,- 1858-1865 (1976)). Nichtmarkierte mRJilS von nicht-induziert en Zellen wurde mit der Sonde in einem Verhältnis von 200:1 gemischt,

um^:su konkurrieren mit in dem p-markierten Präparat vorhandener nicht-induzierter mRiiS, Die Hybridisierung markierter mRHS sollte vorwiegend bei Kolonien erfolgen, die induzierte Sequenzen enthalten. Drei Klassen von Tranaformanten. wurden erhalten:

' 32

(1) 2-3 % der Kolonien hybridisierten sehr stark.mit p-

mRliS, . .

(2) . T:0,:.,%- hybridisier c en signifikant schwächer als die erste • Klasse und

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(3) der Rest lieferte kein erkennbares Hybridisierungssignal.

Die positiven Kolonien (Klassen (1) und (2) ) wurden auf dia Anwesenheit Interferon-spezifischer Sequenzen mittels eines Assays geprüft, der auf der spezifischen Hybridisierung von Interferon-aiRjJS an Plasmid-DITS beruht. Zunächst wurden 60 der stark positiven Kolonien (Klasse (1) ) individuell in 100 ml M9-Medium, das ergänzt war mit Tetracyclin (20/üg/ml), Diaminopimelinsäure (100/ug/ml), Thymidin (20/ug/ml) und d-3iotin (1 /ug/ml), gezüchtet, Das M9-Medium enthält pro Liter; Ha₂HPO₇, (6g), KH₃PO₄ <3, g), HaGl (0,5 g) und IELCl (1 g), lach Autoklavieren wurde 1 ml steriles 1M MgSO,, und 10 ml· steriles 0,01 M CaCIp.. zugesetzt„Jeweils 10 der 60 Kulturen wurden zusammengefaßt und die Plasinid-DNS wurde, wie von CIewell et, al., .Biochemistry J)s. 442S-440 (1970), beschrieben, isoliert. lO^ug jedesPlasinid-DiiS-Pools wurden mit Hindill gespalten, denaturiert und kovalent an DBM-Papier (Diazοbenzyloxymethylpapier) gebunden« 1 /\ig gereinigter mRliS aus induzierten Zellen wurde an jedes filter hybridisiert. Ilicht-hybridisiert e . mRITS wurde durch Waschen entfernt. Die spezifisch hybridisierte mRxJS wurde eluiert und in Xenopus laevis Oozyten überführte In diesem Assay waren.alle sechs·-Pools· negativ. Aus 59 schwach positiven Kolonien (Klasse (2) ) wurden fünf Pools zu je 10 Kolonien und 1 Pool zu 9 Kolonien gebildet und nach der oben beschriebenen Methode geprüft. Unter den sechs Pools hybridisierte einer (K10) jedesmal, wenn er geprüft wurde, signifikant stärker ala die übrigen, Uni den spezifischen Interferon-cDHS-Klon zu identifizieren, wurde aus jeder der im Pool K10 zusammengefaßten neun Kolonien Piasmid-DüTS hergestellt und individuell geprüft. Zwei der neun Plasmide (är. 101 und 104) banden Interferon-mRIiS

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stärker als die anderen» Aus dem Plasmid IJr. 104 wurde ein besonderes BgI II-Restriktionsfragment, das 260 Basen-

32 paare enthielt, isoliert, ^ p-markiert nach der von Taylor et al·, Biochim. Biophys. Äcta 442, 324-330 (1976), beschriebenen Methode und als Sonde verwendet, um 400 'S, coli 294-Transformanten nach eines in eitu-Kolonie-Screeningverfahren (Grünstein und Hogness, Proc· Nati. Sei, U.S.A. 72, 3961-3965 (1975) ) zu testen. Heun Kolonien (pL31-pL39) wurden identifiziert, die in verschieden starkem Masse mit dieser Sonde hybridisierten.

Zusätzlich wurde das.,markierte 260-B/isenpaar-Fragment, verwendet, um 4000 Ξ* coli 294-Transfirmaiiten in derselben Weise zu testen. 50 Kolonien konnten identifiaiert werden, die in unterschiedlichem Masse mit dieser Sonde hybridisierten« Sine enthielt das LeIP G-Pragment., eine enthielt das* LeIP H-Pragsnent- und. eine enthielt ein Pragrneht.. das als LeIP H1 bezeichnet wurde (offensichtlich ein AUeI von LeIP H). Die hybriden Plasmide, die erhalten wurden, wurden "Lei?'.G", "pLeIP H", usv/., bezeichnet,

G, Isolierung und Sequenzierung eines ersten vollständigen LeIP Gens.

Plasmid DlTS wurde aus allen 39 potentiellen LeIP-cDJtfS-Klonen hergestellt und nochmals mit der gleichen 260 Basenpaare-enthaltenden DSB-Sonde getestet, unter Verwendung des Hybridisierungsprozederes von Xafatos et al. (siehe oben). Drei Plasrnide (pL4, pL31, pL34) gaben sehr ..starke Hybridisierungssignale, vier (pL13, pL30, pL32, pL36) hybridisierten mittelmäßig.,während drei (pL6, pL8, pL14) hur schwach mit der Sonde hybridisierten.

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Die 39 potentiellen LeIF cDNS Rekombinant-Plasmide -

32 γ/urden ebenfalls u£i;er Y^pw-indung der p-snarkierten synthetischen Undecameren (individuelle T-1 Starterpools oder individuelle T-13 Starter) als Hybridisierungssonden getestet· Die Hybridisierungsbedingungen wurden so ausgewählt, daß eine perfekte Basen-Paarung notwendig war, um feststellbare Hybridisierungssignale zu erhalten (Wallace et al·,.nucleic Acids Res. β, 3543-3557 (1979)). Auf diese Weise wurde Plasmid-DUS aus den 39 Klonen nach einer Standardmethode (Clewell et al., siehe oben) hergestellt und mittels Biorad Agarose A-50 Säulenchromatographie gereinigt. Proben von je 3 /ig jedes Präparates wurden durch Behandlung mit EcoBI linearisiert, mit Alkali dehaturiert und auf 2 litrocellulosefilter getüpfelt (1,5/UgZS¹IeCk) wie von Kafatos et al·, (siehe oben) beschrieben« Die individuellen synthet is chen Deoxyoligonucleötid-Stärter

'..': ' · .'32 ' ' ·

und Starterpools wurden mit ( γ ρ)ATP folgendermaßen phosphoryliert: 50 pmol Oligonucleötid und 100 pMöl - f -^²P ATP (Hew England nuclear, 2500 Ci/mMol) wurden mit 30 /al 50 mMol ,Tris-Hcl, 10 mMol MgCl₂ und 1 5mMol ß-Mercaptοethanol versetzt. Es wurden 2 Einheiten T4 Polynucleotid-Kinase zugesetzt und nach 30 Minuten bei 37 C wurden die. p-markierten^ .Starter durch Chromatographie an 10 ml Sephadex^ G-50-3äulen gereinigt. Die Hybridisierungen wurden unter Verwendung von 10 cpm Starter T-13C oder 3x10 cpm Starterpool T-1C durchgeführt und zwar bei 15 ⁰C während 14 Stunden in β χ SSC (1 χ SSC =0,15 M HaCl, 0,015 M Uatriumcitrat, pH 7,2),. 10 χ Denhardt's Lösung (0,2 fo Hinderserumalbumin, 0,2 % Polyvinylpyrolidon, 0,2'% Jicoll), wie von Wallace et al. (siehe oben) beschrieben. Die P_:ilter wurden während 5 Minuten bei 0 ⁰C in 6 χ SSC,.gewaschen,, getrocknet und. Röntgenfilm ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 für p-

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Starterpool T-13C und Starter 1-1C dargestellt.

Die Plasmid-DJSiS aus Klon 104 lieferte bemerkenswerte Hybridisation mit Starterpool T-1C und Starter T-13C, während'Hybridisation, mit den anderen Undecameren nicht festgestellt werden konnte. Wie in Figur 2 dargestellt, hybridisierten verschiedene der 39 potentiellen LeIP-O Plasmide (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) mit diesen beiden Sonden, Die Restriktionaanalyse zeigte jedoch, daß nur 1 der Plasmide, pl31, auch ein 260 Basenpaare-enthaltendes BgI H-Fr agment enthielt. Pst !--Behandlung von pL31 zeigte, d^B^dle^Gr/öß^ BsBenpSäre . ·

war, '. . .

Der gesamte PatI Abschnitt von pL31 wurde sowohl nach der /chemischen. Methode von Maxam-Gilbert (Methods Snzymöl, ,65, 499-560 (1980) ) wie nach der Dideosy-Kettenbruehmetnode (Smithy-köthods. Snzymol, .€£, 560-580 (1980)) darcligefüiirt,, nachdem die Sau3a-1?ragmente in einen M13-Vektor ^;unter-, kloniert worden waren. Die DSS-Seqaenz ist in Pigur 3 --'' ("A") gezeigt» Aus dieser, Sequenz wurde die gesamte Aminosäuresequenz des LeIP A vorhergesagt, einschließlich des Prä- oder Signalpeptids. Der erste ATG Trahslatiohs-Start- ; codon befindet sich 60 -Htdcl-eotide vom 5'-Ende der Sequenz , entfernt und wird nach 188 Godona von einem TGA Stoptriplett gefolgt, Ss gibt 342 nicht übersetzte nucleotide am 3'-Ende, die schließlich von einer Poly (A)-Sequen3 gefolgt werden. Das mutmaßliche Signalpeptid (wahrscheinlich beteiligt an der Sekretion von reifem. LeIP aus Leukozyten) ist'23 Aminosäuren lang» Das aus 165 Aminosäuren bestehende reife -LeIP A hat ein berechnetes Molekulargewicht von 19,390,:Der Pigur 4 kann entnommen: werden, daß die trypti-' sehen Peptide T-I und T-13 den Aminosäuren ·1Λ5-Η9 und' ^: 57-61 des LeIP A entsprechen. Die tatsächlichen DUS-Sequenzen,

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die in diesen beiden Regionen gefunden wurden, werden durch den Starterpool H-G und den Starter T13-C (Figur 8) dargestellt.

H. Direkte. Expression von reifem Leukozyten-Interferon A (Lei? A) .

1· Allgemeines

Die Methode, nach der das reife LeIP A direct exprirniert wurde, ist eine. Variante der früher bereits für das menschliche Wachstumshormon angewandten CGoeddel. et al·, Iature 281.« 544-548 (1979)), insofern es eine Kombination von synthetischer (Sf-terminal) und komplementärer, MS darstellte·

Wie in 3?igur 6 gezeigt, befindet sich zwischen den Codons 1 und 3 von LeIF A eine Sau.3a-Restriktionsendo^:- nuclease-Steile* Es wurden 2 synthetische Deoxvol!nucleotide geschaffen, die einen ATG-Translaticns-Startcodon enthalten, den Godon für die Aminosäure 1 (Gestein) wiederherstellen und ein BcoEI kohäsives Inde schaffen». Diese Oligomeren wurden an ein Sau3a-AvaII Fragment von pL31, das aus 34 Basenpaaren bestand, gehängt, Bas entstandene 45 Basenpaare_enthaltende Produkt.wurde an 2. zusätzliche DiT5-3?ragmente gehängt, so daß ein künstlich-natürliches Hybridgen aus 865 Basenpaareü. entstand,. das LeIP A kodierte und welches durch EcoRI- und PstI-Restriktionssteilen begrenzt ist. Dieses Gen wurde zwischen die ScoRI- und Pstl-Restriktionssteilen des Plasmids pBR322 eingefügt und lieferte das Plasmid pLelP AT»

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2. Konstruktion des Tryptophan-Kontrollelement3 (enthaltend den Έ* coli trp Promoter« Operator und die trp-Leader«- Riboaomenbindaagastelle ohne die AQ)G-Se quenz für den Translationsbeginn).

Das Plasmid pQMI trägt das E, coli-Tryptophan-Qperon mit der Deletion. ÄLE1413 (Miozzari et al., J. Bateriolog;? 133, 1457-1466 (197s) ) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp B-PoIyρeptids (im folgenden LB^f genannt), sowie dem vollständigen trp D-Polypeptid, und zwar; unter: der Xontrolle des : trp-Pröinotor-Qperator-Systems* Das Plasmid (20/og) wurde mit dem Restriktionsenzym. PvuII an 5 Stellen gespalten« "Die Genfragmente wurden dann mit EcoRI-Verbindungssequenzen (bestehend aus einer selbstkomplementären Polynukleotidsequena pGAiGAATTCATG) bombiniert, um eine BcoRI-Spaltsteile für das spätere--Älpnieren in ein Plasmid mit. einer·-solAhen^gcpfiI^A ' Spaltstelle z\x schaffen. Die 20 yUg der aus pGM1 erhaltenen DNS-Pragmente wurden mit 10 Einheiten T. DUS-Ligase in Gegenwart von 200 pMol des 5^}-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTGATG ,in 2QpI T₄ DIS-Ligase-Puffer (20 mkol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol AIP, 10 mMol-MgCl₂, 5 mMol Dithiothreit) bei 4 ⁰G über !lacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70 ⁰G erwärmt» Die Verbindungssequenzen wurden mit BcoRl gespalten und die Fragmente, die nun ScoRI-Snden enthielten,.worden mittels 5 % Polyacrjlamidgelelektrophorese:(PAGE) aufgetrennt. Die drei größten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Bthidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen, aus dem Gel herausgeschnitten, Jedes Gelfragment wurde mit 300 Microliter 0,1 χ TBB in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1. χ TBE-Puffer der

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Elektrophorese bei 100 YoIt ausgesetzt (TBE-Puffer enthält: .10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Ha₂EDTA in 1 Liter HpO). Die wässrige Lösung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, und 0,2M an ETatriumchlorid gemacht. Die DNS wurde nach Ethanolfällung in wässriger Lösung erhalten* Das den trp-Promoter-Qperator enthaltende Gen mit EcoRT"kohäsiven Enden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht, daß man- Fragmente in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promotor-Operators Tetracyclin-resistent werden*

Das Plasmid pBRHI (Rodriguez et al«, Kucleic Acids Res· S₉ 3267-3287 (1979) ) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyciinresistenz, aber,, weil kein zugehöriger Promoter existiert\, exprimiert diese Resistenz nicht» Das Plasmid ist daher Tetrac^clinempfindlich. Durch Einfügung eines Promoter-Operator^· Systems an der ScoRl-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden,

pBRHI _;wurde mit ScoRI behandelt und das Enz^m durch Phenolextraktion und Chloroformextrakt ion entfernt· Das nach Ethanolpräzipitation in Wasser erhaltene DIJS-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen ,kombiniert mit jedem der drei DITS-Fragmente, die oben erhalten wurden und mit T, D3JS-Ligase, wie bereits beschrieben, verbunden« Die DIS des Reaictionsgeaischs wurde zur Transformation kompetenter E. col: £-12 Stamm 294-Organismen nach Standardmethoden (Eershfield et al., Proc. Nati. Acad· Sei. U.S.A. Tt, 3455-3459 (1974)) verwendet. Die Bakterien wurden auf LB"(Luria-Bertani)-Platten gebracht, die 20/ug/ml. Ampicillin und 5 yug/ml Tetra-, cyclin enthielten. Es wurden verschiedene Tretacyelin-resti-

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stente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DUS isoliert und das Vorhandensein des gewünschten iragsnent es durch Re strikt ionsenzymanalysen bestätigt* Das entstandene Plaamid wurde pBRHtrp genannt.

Ein ScoRJ und BamHI Digesticnsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoEI und BamHI Spalt3tellen des Plasniids pGHö eingefügt (Goeddel et al.., Bat ure .281,, 544 (1979) ), wodurch das Plasraid pHS32 entstand· Das Plaamid pHS32 wurde mit Ibal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und der: Sthanolpräzipitatioh uhterworfen. Es wurde- dann-mit 1 /il Bi coli DltfS-Polymerase I, Klenow fragment [(Boehringer-Mannheim), in 30/ul Polymerase-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7.4, 7mM MgCl₂, 1 mM ß-Mercaptοethanol), enthaltend 0,1 mli dTTP und 0,1 ml-i dCTP, während 30 Minuten bei 0 ⁰C und 2 Stunden bei 37 oC behandelt♦ Durch diese Behandlung wurde di# XbaX Spaitsteile' folgendermaßen- y-aränaert i,

5' CTAGA—' 5' CTAGA—

31

Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten» Das große Plasmidfragment wurde vom kleinen EcoRI-Xbal-Pragment abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelutlon isoliert. Dieses DliS-Fragment von pflS32 (0,2 /üg) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den obenbeschriebenen an das EcoRI-Taql-Fragment des' Tryptophanoperons (etwa 0,01/Ug) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes:

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T GTAGA-— —TGTAGA—

— AGG + TGT---. - — AGCTCT"-

mit der unge?iöhnlichen Basenpaaruiig T-C. Ein Teil des.Reaktionsgemische a wurde in E. coli 294-Zellen transformiert,· hitzebehandelt und auf L£-Platten, die Ampicillin enthielten, gebracht. Es wurden 24 Kolonien ausgewählt, in 3 ml LB-Mediam aufgezogen und das Plasmid isoliert, Ss wurde festgestellt, daß sechs davon die Xbal-Spaltstellen im E, coli durch katalysierte DHS-iLüsbesserung und Replication regeniert hatten in folgender Weise:

-TGTAGA - -TOTAGA-

-AGGTGT- -AGATCT-

Diese Plasmide, gönnten ,auch-, mit EcoSI., und:,HpaZ ge,s,palten werden und lieferten die erwarteten Hest'jjilc't'ionsfragniente» Sin^: Plasmid, pTrpl14 bezeichnet, wurde für die Expression heterologer Peptide,' wie im folgenden beschrieben, verv/endet.

Das Plasmid pflGH. 107 (Goeddel et al., lature .281,,. 544, (1979)/) enthält ein Qeja für das menschliche Wachstumshormon, bestehend aus 23 synthetischhergestellten Aminosäurerecodons und 153 Aniinosäurecodons., die von cDUS über reverse Transcription der mRHS erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequehs des menschlichen Wachstumshormons nicht enthält, besitzt ein ATG-Translations-Startcodon« Das Gen wurde aus 1OyUg pHGH 107 isoliert.nach Behandlung mit EcoRI und E,. coli DjJA Polymerase I IClenow-Pragment, sowie dTTP und dATP, wie oben beschrieben, iiach Phenol- und Ghloroformextrairtion sowie St hanoipräzipitat ion wurde das Plasmid mit BamHI behandelt«

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Das daa HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DiJS-Pragment enthält auch die ersten 35Q lukleotide des Tetracyelineresistenz-yerleihenden Strukijurgehs, aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promoter-Operator-System, so daß wenn es anschließend in ein Expressionaplasmid kloniert wird, diejenigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene-Tetracyclinresiatenz identifiziert werden können» Weil das ScoRI-Ehde des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein Sxpresaion-aplasraid-: eingefügt^wird^;»

Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben hergestellt wurde,, yorbereitet. pTrpl4 wurde mit Xbal behandelt und die "shtste^eHdeW kohasifeh' Enden wurden nach dem ülenow-Polymerase; I-Verfahren'' anter^!r"Verwendung 7on aASP, dTTP, dGT'P'und^rt; dGTP auf gefällt» Ua ch Phenol- und Chloroforsi-Bxtraiction sowie. Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DHS mit BamHI behandelt: und das. entstandene groß Plasmidfragnient wurde durch PAGE und Elektroelution eluiert« Dieses Fragment besaß ein stumpfes und ein kihäsives Ende und erlaubte die Rekombination in der-richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde.

Das das'HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpl4 ^Xba-3amHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbunden unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind* Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Snden wurden die Xbal- und ScoEI-Restrikt ionssteilen -..wiö-&e-r_;/,hergestellt;. ·

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Xbal aufgefüllt ScoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang -TGTAG . AATTCTATG- ' -TGTAGAATTCTATG-

• -AGATC TTAAGATAC- -AGATCTTAAGATAC-

Xbal BcoRI

Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promoter, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promoter) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGE 207, die Expression des Gens für Tetracyciinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Qperators« Das erhaltene Gemisch wurde in Ξ. coli 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5 /ig/ral Tetracyclin enthielten, selektioniert,

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit ScoRT behandelt und ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment wurde durch PAGS und Slektroelution erhalten, das den trp-Promoter, Operator und die trp-Leader-EibosomenbLadungsstelle enthielt, dem aber eine ATG-Sequenz für den Start der Translation fehlte. Dieses DHS-Pragment wurde in. die EcoHI-Spaltstelle von pLeIP A kloniert« SJtpressionsplasmide, die das so modifizierte trp-Regulon (S, coli-Operon, dem die Attenu.ator-Sequenz fehlt, so daß die Expression erhöht ist) können bis su vorgegebenen Konzentrationen herangezüchtet werden in einem Medium, das genügend Tryptophan enthält, um das Promoter-Operatorsystem au unterdrücken. Wird dann das Tryptophan entzogen und das System entblockiert, so wird das gewünschte Produkt exprimiert.

Im vorliegenden Pail und wie in Figur β dargestellt, wurden 250/ig des Plasmids pl31 mit Pstl behandelt und das 1000 Basenpaare-enthaltende Teilstück durch Gelelektrophorese

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an einem 6 % Polyacrvlamidgel isoliert» Es wurden etwa 40 lag des Teilstücka aus den Gel durch Elektret el lit ion erhalten und in 3 gleiche Teile für.die weitere Behandlung aufgeteilt: a) Eine-16/ug-Probe des Fragments wurde teilweise gespalten mit 40 Einheiten von BgIII während 45 Minuten bei 37 ⁰C und das Reaktionsgemisch wurde an einem 6 % Polya.crylamidgel gereinigt »Etwa 2/ug des gewünschten 670 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden erhalten« b) Eine andere Probe (8/Ug) des ' 1000 Basenpaare-enthaltenden Pstl-Bruchstücks wurde mit Avail und BgIII behandelt. 1 yug des in Figur 6 gezeigten 150 Basenpaare enthaltenden Fragments wurden nach Gelelektrophorese erhalten, c) 16 /ig des 1000 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden mit Sau3a und Avail behandelt, lach Elektrophorese an 10 % Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25/ig (10 pMol) des 34 Basenpaare-enthaltenden Fragments erhalten« Die zwei angegebenen Deosy öl inucl eot ide, 5'-dAATTGATGTGT (Fragment 1) und 5^fdGA'T CA CA CATG (Fragment 2) wurden nach der phosphotriestermethb.de-. synthetisiert,,- Das Fragment" 2 „.wurde folgendermaßen . pho-sphoryliert j 200 jul (etwa. 40 pH) von ( ^ P) ATP (Amersham, 5000 Ci/mM) wurden zur Trockne gebracht und in 30/ü 60 mM Tris-HCl (pH 8)_s^ 1OmM MgCl₂, 15 mM ß-Mercaptoethanol, 100 pM des DHS-Fragments und 2 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase resuspeh'diert* Uach-15 Minuten bei 37 ⁰C wurde 1 pi 1OeM ATP hinzusetzt und die Reaktion weitere 15 Minuten laufengelassen. Das Gemisch wurde dann während 15 Minuten auf 70 ⁰C erwärmt, mit 100 pM des 5'-OH-Fragments 1 und 10 pM des 34 Basenpaareenthaltenden Sau3a-AvaII-Fragments versetzt. Die Verbindung wurde bei 4 ⁰C während 5 Stunden in 50 ml 2OmM Tris-HCl (pH 7,5), 1OmM Mg Cl₂, 1OmM Dithiothreit, 0,5mM ATP und 10 Einheiten T4 DifS-Ligase hergestellt. Das Gemisch; wurde der Elektrophorese an einem 6;o Polyacrvlamidgel unterworfen und das 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde durch Slektroelution erhalten. Etwa 30 ng (1 pM)- des 45 Basenpaare-enthaltenden Produkts wurden mit 0,5/ug (5 pM) des 150 Basenpaare-ent-

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haltenden Avail - Bglll-Fraginents and 1 yag (2 pM) des 670 Basenpaare-enthaltenden BgIII -Pst!-Fragments vereint« Die Bindung wurde bei. 20 ⁰G während. 16 Standen, unter Verwendung von 20 Einheiten T 4 DSB-Ligase hergestellt. Die Ligaae wurde dann durch Erhitzen auf.65 ⁰C während 10 Minuten inaktiviert und das. Gemisch wurde mit EeoRl und Pstl behandelt zwecks Spaltung von Polymeren dea Gens. Das ^ Gemisch wurde dann durch. PAGE (6 %) gereinigt. Es wurden etwa 20 ng (0,04 pM) des 865 Basenpaare-enthalt enden Produkts isoliert. Eine Hälfte davon (10 ng) wurde zwischen die BcoRI- und PstI-Spaltsteilen von pBR322 (0,3/Ug) eingefügt. Die Transformation von B, coli lieferte 70 Tetracyclin-resistentej Ampicillin-empfindllche Transf ormant en.»

Die aus 18 dieser Transf ormant en isolierte Plasinid-D-ffS wurde- mit BcoHI und Pstl behandelt. 16 der 18 Plasmidebe- saßen ein ScoRI - Pstl—Fragment, das 865 Base paare lang war. 1 /ug eines dieser Plasmide (pLeXFAl) wurde·^>:mit' EcoRl behandelt und an das 300 Basenpaare enthaltende EcoRI-Pragment (0,1 /Ug), das den E, coli trp-Promoter und die trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthielt, gebunden. Die den trp-Prp£noter enthaltenden Transformant en wurden unter Verwendung einer trp-Sonde nach der Grünstein-Hpgness/Kolonie-Screening-Methode identifiziert. Eine asymmetrisch sitzende Xbal-Spaltstelle in dein trp-Pragment erlaubte die Bestimmung von Rebombinanten, in denen der trp-Promoter in der Richtung des LeIP Α-Gens orientiert^; war,

I« In vitro und in vivo Aktivität von LeIP -A

Extrakte für den IP-Assay wurden folgendermaßen hergestellt j 1 oil-Kulturen wurden In L-Brühe, enthaltend 5 /ug/ml Tetracyclin, bis zu einem A^^_Q-Wert von etwa 1,0 auf-

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gezogen, dann mit 25 ml M9-Medium, enthaltend 5/ng/ml Tetracyclin verdünnt, Wenn der Α,-,-Q-Wert 1,0 erreicht hatte, wurden jeweils 10 ml-Proben zentrifugiert und die Zellkuchen in 1. nil 1 Seiger Saccharose, 50 ml-Tris-HCl (pH 8,0 und 50 mM SDTA suspendiert» 1 mg Lysozym wurde zugesetzt und nach 5-minütiger Aufbewahrung bei 0 G wurden die Zellen durch Ultrabeschallung zerstört. Es wurde 10 Minuten zentrifugiert (15»000 U/min) und die Interferon-Aktivität im überstand wurde bestimmt durch Vergleich mit LeIP-Standard nach dem CPE-Hemmtest. Zur Bestimmung der Anzahl von IP-MoIekiilen pro Zelle wurde eine spezifische LeIP-Aktivität von 4 χ 10

Wie in Tabelle 1 gezeigt, liefert Klon'pie 1.2? A trp 25, in dem der trp-Promoter in der richtigen Richtung orientiert ist, hohe Aktivitäten (bis zu 2,5 χ 10 Einheiten pro Liter), Wie in Tabelle 2 gezeigt, verhält sich das . von¹ E, coli K-1-2 Stääffi-294/pLeIS; A«trp⁴ 25:- he^gesteilte -Interf eron wie; authen~- tisches Humen-LelPj es ist bei pH 2 stabil und wird durch Kanmchen-anti-Huznan-Leukozvten-Antikörper neutralisiert, Das Interferon hat ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20.OOO»

Der nachweis von in vivo-Aktivitat von Interferon macht die Gegenwart von Makroρnagen und natürlichen Killerzellen (NK) notwendig, und es scheint, daß diese Zellen stimuliert werden» Bs war daher möglich, daß das von E. coli 294/pleIP A 25 produzierte Interferon, das im Zellkultur-As say antivirale Aktivität zeigte, an infizierten Tieren inaktiv ist, Ferner ist es durchaus möglich, daß sich die antivirale in vivo-Aktivität des bakteriell hergestellten, nicht-glykosylierten LeIP A von der des glykoaylierten Inter-

9.12,1983 ' 62 991/12/37

ferons, das aus menschlichen Leukozyten gewonnen wird, unterscheidet, Ba wurden daher die biologischen Aktivitäten von bakteriell hergestelltem. LeIP A (2 /o.rein) und von aus Leukozyten isoliertem LeIP (8 j> rein) miteinander verglichen und zwar an Hand der lethalen, Snzephalomyocarditia (BMG) bei Totenkopfäffchen (Tabelle 3).

Tabelle 1: Interferon-Aktivität in Extrakten von B, coli

E,coli K-I2 Stamm 294 tranformiert durch

Zeildichte (Zellen/ml)

IP-Aktivität E/ml Kultur

LeIP-MoIe-

k-üle'pro

Zelle

A trp 25 3,5. x 10'

pLelP A trp 25 1,8 χ 10'

36,000 250,000

9.000

12.000

Tabelle 2i ?ergleich der Aktivität von Extrakten aus ώ· coli 294/pLeIP A 25 mit Standard-LelP x)

294/pLeIP A trp 25-

Extrakt LelP-Standard

Interferon-Aktivität (E/ml)

unbehandelt pH 2

Kaninchen-ant i-Huaian-Leukoavt en-Antikörper

500

500

500

500

< 10

Der 250,000 E/ml enthaltende Extrakt von E. coli 294/ pLeIP A trp 25, der in Tabelle 1 beschrieben wird, wurde auf das 500-fache verdünnt mit Minimalmedium, so daß er eine

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spezifische Aktivität von 500 3/ml aufwies. Sin vorher gegen ΙΪΙΗ-Leukozyten-Interferon-Standard titrierter Leukocyten-Interferon-Standard (Wadley Institute) wurde ebenfalls auf eine Endkonzentration von 500-B/ml verdünnt« Aliquote Teile (jeweils 1 ml) wurden mit 1 H HCl auf pH 2 gebracht, 52 Stunden bei 4 ⁰C inkubiert, durch Zusatz von.IaOH neutralisiert und die IS-Aktivität nach dem Standard-CPE-Hemmtest bestimmt» Aliquote Teile (25/ul) der 500 E/ml-iroben (unbe-.handelt) wurden mit 25/Ul Kaninchen-anti-Human~Leukozvten-Interferon während 60 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert, zentrifugiert mit 12,000 χ g während 5 Minuten und der Überstand getestet, .

Tabelle 3: Antiviraler Effekt verschiedener LeIP-Präparate

gegen BMG Virus - Infektionen bei Totenkopf-. äffchen

Behandlung

Se r urti

lebende

Tag 2

las}

Tag 4

Kontrolle

(Bakterienproteine)

Bakterielles LeIP A

L e U'-S t andar d

0/3

3/3

3/3

10	0	3x10
ο	0	0
OJ	0	0
	0	0
,3	0	0
		0
0
0

10

10-

r,2oo

0 0 0 0 0

3.42

10

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62 991/12/37

Alle Äffen waren männlichen Geschlechts (mittleres Gewicht 713 g) und besaßen keine EMG Virus-Antikörper Tor der Infektion. Die.Affen wurden intramuskulär mit 100 χ LD_C/,

EMC-Virus (bestimmt an Mäusen) infiziert. Die Eontrolltiere starben 134, 158 und 164 Stunden nach der Infektion« Die Interferon-Behandlung mit 10° Einheiten erfolgte intravenös und zwar -4, +2, 23,, 29,, 48,, 72,,, 1β8. und 240 Stunden nach der Infektion, Bei dem bakteriellen Leukozyten-Interferon, handelte es sich um eine Säulenchromatographie-Fraktion eines Lysats aus E. coli 294/pLeXF A 25 mit einer spezifischen-Aktivität 'von 7,4 ζ 10 E/mg Protein. Die bei den Kontrollen verwendeten Bakterien-Proteine waren der Säulenfräktion. des Lysatsvon S. coil 294/p3R322 bei doppelter Gesamtproteinkonzeßtration äquivalent* Bei dem Leukozyten-Interferon-Standard handelte es sich.um...durch Sendai-Virus induziertes Interferon aus normalen-menschlichen Zellen,, das chromatographisch auf eine spezifische Aktivität von 32 χ 10 E/mg Protein gereinigt war.

Die Kontrolltiere verloren das Gleichgewicht, zeigten progressive Lethargie, schlaffe Lähmung der hinteren Gliedmassen und wässerige Augen, beginnend etwa 8 Stunden vor dem Tod. Die mit Interferon behandelten Affen zeigten keine dieser Abnormalitätenj sie blieben während.der gesamten Zeit aktiv'und'entwickelten.keine -Virämie, Der:eine- Affe der Kontrollgruppe, der innerhalb von 4 Tagen keine Yirämie entwickelte, starb, zuletzt (164 Stunden nach.der Infektion), aber zeigte nach dem Tode hohe Virus-Titer im Herzen und Gehirn« Die Interferon-behandelten Affen entwickelten keine Antikörper gegen EMC-Viren, was 14 und 21 Tage nach der Infektion festgestellt wurde. Die Ergebnisse zeigen somit, daß der antivirale Effekt der LelP-Präparate an den infizierten Tieren lediglich der Wirkung 'des. Interferons zugeschrieben werden kann, da die kontaminierenden Proteine des bakteriel-

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len und des aus Leukozyten gewonnenen Interferons völlig un terschiedlich sind. Außerdem deuten die Ergebnisse daraufhin, daß für eine in vivo antivirale Aktivität von LeIP A eine Glykosylierung nicht notwendig ist»

J. Isolierung von QJ)HS für weitere -Leukozyten-Interferone

DHS aus dem Plasiaid, das DUS für das vollständige LeIF A enthält, wurde mit PstI herausgeschnitten, elektro-

32 phoretisch isoliert und mit ρ markiert. Die erhaltene

markierte' DHS- wurde alB Sonde für das Screening, von -..zusätzlichen. E. coli 23^-1ran.aforma.nten verwendet, die in der gleichen Weise, wie in 'Teil C beschrieben, erhalten wurden (nach der in-situ-Kolonie-Testmethode von Grunstein und Hogness (siehe oben) ). Die mit der Sonde hybridisierenden Kolonien wurden isoliert, Plasmid-DliS aus diesen. Kolonien sowie-aus den zehn hybridisierenden Kolonien,; die in Teil G oben erwähnt wurden, wurden durch Behandlung mit PstI herausgeschnitten und nach drei verschiedenen ^{.._J Methoden charakterisiert. Zunächst wurden diese Pstl-Fragmente durch die Abbauprodukte, die durch Behandlung mit der Restiktions-Endonucleasen BgIII, PvuII und EcoSI entstanden, charakterisiert. Die Analyse erlaubte die Klass-Klassifisierung von mindestens acht unterschiedlichen Typen (LeIP A, LeXF B, LeIP G, LeIP D, LeIP Ξ, LeIP P, LeIP G und LeIP H), dargestellt in Figur 5, wie einen überblick über die Lage der verschiedenen Restriktiona— stellen relativ zu der bis jetzt bekannten Präsequenz und der kodierenden Sequenz von LeIP A gibt. Ein Typ von diesen, LeIP D, ist anscheinend identisch mit dem von lagata et al., Hat ure' '28Ji, 316-320 (1980), beschriebenen

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Ferner worden verschiedene DHSs mit dem von 'Cleveland et al. (Cell 20, 95-105 (1980)) beschriebenen Hybridisations-Selektions-Test untersucht auf ihre Fähigice it, LelF-mlllB selektiv von PoIy-A enthaltender RIS aus KG-1 Zellen au entfernen« In diesem Test waren LeIP A, B, C und F positiv. Schließlich wurden letztere PstI-Fragmente in Plasmide eingefügt, B. coil 294 wurde mit' diesen Plasmiden transformiert und die Fragmente wurden expriiniert. Die exprimierten Produkte, von denen man annahm, daß sie Präint erferone wären, waren im CPE-Aas.ay auf Interferon-Aktivität alle positiv, wobei nur das LeIF F-Fragment geringfügige Aktivität aufwies. Im übrigen wurden alle LeIF-Typen sequenziert.

K. Direkte Repression eines zweiten reifen Leukozyten-. Interferons (LeIF B)

Die Sequenz des isolierten DITS-Fragments, welches das Gen für reifes LeIF B enthält, zeigt, daß die ersten vierzehn Nucleotide für LeIF A und B identisch sind« Folglich wurde ein Fragment aus pLelF A 25, das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle und . den Beginn des LeIF A (=B)—Gens enthielt, isoliert und mit dem Rest der B-Sequenz in einem Sxpressions-Plasmid ' kombiniert. Die Restriktionskarten für die Pst-Fragmente von pL4 (ein Plasmid, enthaltend das LeIF B-Gen aus Figur 5) und pLelF A 25 sind in. den'· Figuren;'7a und 7b dargestellt.

Um das etwa 950 (=Basenpaare) lange Sau3a-Pstl-Fragment aus der Sequenz, die in Figur 7a dargestellt ist, zu erhalten, waren mehrere Schritte notwendig wegen des Vorkommens weiterer, in.diesem Bereich liegender Sau3a-'Restriktionsstellen. Es wurde folgendermaßen vorgegangen:

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1· Die folgenden Fragmente wurden isoliert:

a) 110 b.p. aas Sau3a-EcoRI,

b) 132 b.p· eua ScoRI-Xbaj

c) 700 b.p. aas Xba-Pst.

2. Die Fragmente (1a) und (1b) wurden mit einander verbunden und mit Xbä und BgIII behandelt, um Selbstpolymerisation über die Sau 3a- und Xba-Enden sa verhindern (die entsprechende Sau 3a-Spaltstelle lag innerhalb einer Bglll-Spaltstellej Bglll-Schnitte hint erlassen: ein Sau:3a kohäsives Ende). Ss wurde ein 242 b.p. enthaltendes Fragment isoliert»

3· Das Produkt von (2) wurde mit (1c) verbanden und mit Pstl und BgIII behandelt, wieder um Selb st polymer i-_: sation zu verhindern. Sin etwa 950, b„p,,, enthalteiia'esiFragÄ. ment, 3au 3a~PstI (siehe Figur 7a) wurde isoliert. Dieses Fragment enthielt denjenigen Teil'des LeIF B-Gens, der keine Entsprechung beim LeIF A hatte.

4. Bin etwa 300 b.p. enthaltendes Fragment (Eindlll-Sau3a), das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenb!Ladungsstelle, das ATG-Startsignal und den Cystein-Godon von LeIF Ä enthielt, wurde aus pLeIF A25 isoliert.

5. Sin etwa 3600 b.p« enthaltendes Fragment (Pstl-Hindlll) wurde aus p3R322 isoliert. Ss enthielt das Replikon, das Tetracvclin-Resistenz, nicht aber Ampicillin-Resistena kodiert.

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6» Die Fragmente, die gemäß 3, 4 und 5 erhalten wurden, warden miteinander verbunden und mit dem resultierenden Plasmid wurde E. coli K-12 Stamm 294 transformiert*

Die Transformanten wurden einem Minitest unterzogen (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. J, 1513-1523 (1979) ) und Plasmidproben wurden mit ScoRI behandelt. Der Abbau lieferte folgende drei Fragmente: 1) Sin BcoRI-EcoRI trp Promoter-Fragment j 2) das innere ScoRI-EcoRI-Fragment von pL4 und 3) das Fragment vom Translations-Startsignal bis zur EcpR.I-Spaltatelle von pl4V

Im CPE-Ässay zeigen Bakterienextrakte aus Klonen, . die in der vorstehend beschriebenen Weiseν erhalten werden, Aktivitäten von 10; χ 10 Einheiten Interferon pro Liter bei Aj-CQ ⁼ ^* ²^ repräsentativer Klon» der in dieser Weise hergestellt wurde, ist E* coli 29'4/pL'e IF'3 trp' 7.

L· Direkte Expression weiterer reifer Leukozyten Interferone (LeIF G, D, F, H, I und J)

Weitere Genfragmente in voller Länge von anderen LeIF-Ty ρ en können geschneidert und in Vektoren eingebaut werden zwecks 'Expression in Analogie zu der für das LeIF A beschriebenen Weise« Durch vollständige Sequenzierung in konventioneller Weise kann festgestellt werden, ob eine Restriktionsstelle genügend nahe an dem ersten Amlnosäurecodon des reifen Interferons liegt, so daß die im Teil H beschriebene Methode für die Expression von reifem LeIF A verwendet werden kann, d« h· die Eliminierung der Präsequenz durch einen Restriktionsschnitt und Ersatz der aminoendstandig zusammen mit der Präsequens verlorenen

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Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DUS-Fragments· Sollte dies nicht der Pail sein, so kann die folgende Methode angewandt werden. Hierbei wird das die Präsequenz kodierende Fragment präzis an der Stelle abge trennt, an der der Codon; für die erste Aminosäure des reifen.Polypeptide beginnt, und zwar dadurch, daß

1· in der Umgebung dieses Punktes die doppelsträngige DiIS in einst rängige DHS übergeführt wird;

2,_ αι.3 im' eisten, Schritt-: gebildete^: einsträngige, Region mit' einer komplementären Starter-SeqÜehzT einer einsträngigen DHS hybridisiert wird, deren 5V-Ende gegenüber dem Hukleotid liegt, das an die beabsichtigte Spaltst eile grenzt»

3*. derjenige Teil des. in, 3^!-Richtung des liegenden zweiten Stranges, der in (1) eliminiert wurde, durch Umsetzung mit DUS-PoIymerase in Gegenwart von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Gytosin-haltigen Deoxynucelotid-triphosphaten wieder hergestellt wird und _:

4. die -verbleibende einsträngige DIiS-S equenz., die über die beabsichtigte Spaltst eile hinausreicht, abgebaut wird«

Sine kurz synthetische DlS-Sequenz, die am 3'.-Ende des kodierenden Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann verbunden werden, z. B« über stumpfe Süden, mit-, dem zurechtgeschnittenen Gen. für, die reifen

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Interferone· Die Gene können in ein Plasmid eingefügt und unter die Kontrolle einea Promoters und.seiner zugehörigen Ribosomenbindungsstelle gebracht werden«

In ähnlicher Weise,, wie es in Abschnitt: K oben beschrieben ist, wurden Genfragmente, die für LeIP C und LeIPB' kodieren aufgebaut, zwecks direkter Expression in Bakterien, Bei der Strategie, die zur Expression dieser weiteren Leukozyten-Interferone führte, wurde in jedem Falle auf das etwa 300 Basenpaare-enthaltende: Fragment (HindIII-Saü3a), das den trp-Promoter-Qperator, die Sibosomenbinduagssteile, das A2G Startsignal und' den· G^stein-Cödöh yon LeIP A aus PLeIP A25 enthielt, zurückgegriffen. Dieses Pragment wurde kombiniert mit den Pragmenten anderer Interferone, die die entsprechendenAminosaure.aequenzen, die auf den allen gemeinsamen Cy st eiiire Erfolgen, kodieren. Jedes erhaltene Plasmid wurde zur Transformation γόη B, coli £-12 Stamm 294^: verwendet.

Pur die einzelnen Gene waren folgende Schritte notwendig:

LeIP G

tu .

Isolierung'der' folgenden Pragniente aus" pLeiP-G: '

(a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Pragment Sau 3a - Sau 3β\

(b) ein mehr als 900 Basenpaare-enthaltendes Pragment Sau 96 - Pst Ij

(c) Isolierung eines etwa 300 Basenpaare-ent-

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haltenden Fragments (Hind III - Sau3a) aus pleIP. A-2'5.» wie in Teil K (4) oben be- achrieben;

(ά) Isolierung des etwa 3600 Basenpaare-enthalt enden Praginent s aus'Λ Abschnit t; K ,(5) oben. ;

Kons traction:

(1) Verbindung von (a) mit (c)· Spaltung mit BgIII, Hindill - und Isoi'i'§.'|;un^

Produictesi"" ^:

(2). Verbindung der unter (1), (b) und (d) erhaltenen Bruchstücke und Trsnäförmierüng von^S* coli;mit dem Fe-sultlerenden Plasoaid*

Sih repräsentativer i£lon der auf diese Weise erhalten wurde, ist S_e coli K-12 Stamm 294/pLeIP G trp 35.

LeIP D

Aus pLelP D-wurden isoliert,;

a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Sau3a-AvaII)i . .

b) ein 150 Basenpaare-enthaltendea Praginent (Aväll-Bglll) und

c)- ein "etwa 700 Basenpaare-enthaltendes Pragment (Bglll-Pstl).

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Aas pLeIP A 25 wurde isoliert: "

d) ein 300 Basenpaare-enthalt endea Fragment (HindIII-Sau3a).

Aus p3R322 wurde isoliert:

e) ein etv/a 3600 3a s enpaare-ent haltendes Fragment. (Eindlll-Pstl), .

.Konstraktion

(V) Die Verbindung von (a)init (b), Spaltung mit BgIII und Ere in igung'liefert ein 185 Basenpaare-enthaltendes

Produkt, _:

(2) Die Verbindung/Ton. .(.V) mit Cd), Spaltung, mit. Hindill und: Bgl.II, und;.,. Reinigung liefert' ein etwa 3asenp§are enthaitendes Produkt»

/ (3) Die Fragmente (2), (c) und (e) wurden miteinander verbunden und B« coli mit· dem erhaltenen Plasmid transformiert» .

Bin in dieser Weise erhaltener repräsentativer Klön ist E. coli K-12 Stamm 294/plerB¹ D trp. 11 .. _:

LeIP F.

Bei der Konstruktion eines vollständigen LeIP ? Gens und der direkten Expression des entsprechenden Interferons kann man sich die Homologie der Aminosäuren 1-13 zwischen LeIP B und LeIP P zunutze machen. Sin den trp Promotor ent-

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haltendes Fragment (A) mit geeignet konstruierten Enden wird aus pHGH2O7 erhalten, das oben beschrieben ist,, über die Behandlung.mit Pat I und Xba I und anschließende Isolierung eines ca. 1050 Basenpaaren enthaltenden Fragments· Ein zweites Fragment (B) steht in dem größeren der beiden durch Behandlung des Plasmids pHky 10 mit PstI und BgIII entstandenen Fragmente zur Verfügung» Das Fragment A enthält etwa das halbe die Ämpicillinresistenz kodierende Gen,, während Fragment B den Rest dieses Gens und das vollständige Gen für die .Tetrac^clinresistenz bis auf den zugehörigen Promptor enthaltv ;Die* Fragmente- As uiid^Bs Werden mittels TA Ligäse konibiniert^und, das erhaltene,.produkt_:i,wird .mit Xbal UrId₁BgIII behandelt, um Dimer is ierungen auszuschließen,. So entsteht das Fragment (c), welches den trp Promoter-Operator, sowie die Gene für die Tetracyclin- und Ampicillin-aesistenz e.nt-

Bin.Fragment (d) mit etwa 580 Basenpaaren wird durch Behandlung von pLeIF F mit Avail und BgIIl erhalten« Dieses Fragment enthält die Godons für die Aminosäuren 14-166 von LeIF F.:

Ein Fragment Ce) (49 Basenpaare) wird durch Behandlung von plelF B mit Xbal und Avail erhalten. Dieses Fragment kodiert die Aminosäuren 1-13 von LeIF F,

Die Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von T4 Ligase miteinander verbunden« Die kohäslven Enden der entsprechenden Fragmente sind so beschaffen, daß das entstehende Plasmid in der richtigen ?/eise gebildet wird, wobei das Gen für Tetracvclin-Resiatenz unter die Kontrolle des trp:Promoter-Operators gebracht wird, zusammen mit dem Gen fur reifes LeIF F, so daß die damit transformierten

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Bakterien auf Grund ihrer Tetracyclin-Resistens selektioniert γ/erden können,. Bin auf diese Weise erhaltener repräsentativer Klon ist 3» Goli K-I2 Stamm 294 pLeIP P trp 1₉

LeIF H

Das für die Expression von reifem LeIP H geeignete Gen kann...folgendermaßen hergestellt werden:

1# Plaamid pie H¹ H wird der Behandlung mit Haell und RsaI- unterworfen und ein 816 Basenpaare-enthaltendes fragment wird isoliert, welches den Bereich von der Aminosäure. 10 des Signalpeptids bis. zur 3' nicht codierenden Region kodiert.

2. Das Pragment wird denaturiert und_:der Reparatursyn- . these mit dem- Klenow^Pragment der, DITA. Polymerase I (Klenow et al., Proc. latl. Äcad. Sei. U.S.A. 6£, 168 (1970) ) unterworfen, bei der der synthetische Deoxvribooiigonucleotid-St art er 5'-dATG '2QT AAT GTG TCT verwendet wird.

3.: Das erhaltene-Produkt wird mit Sau3a gespalten und ein 452 Basenpaare-enthaltendes Pragment, das die Aminosäuren 1-150 kodiert, wird isoliert,

4,. Die Behandlung von pLeIP H mit Sau3a und PstI und die Isolierung eines 500 Basenpaare-enthalt enden Pragments führt zu einem Gen, das die Aminosäuren 150 bis zum Ende der Sequenz kodiert.

5. Die in (3) und (4) isolierten Fragmente werden verbunden zu dem folgenden Pragment

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1 166

Met Cys _i Asp Stop

AIG TGT*.

GAT TGA-....-— Pst I,

Sau3a,

das die 166 Aminosäuren des LeIP H kodiert,

6, pleIP A trp 25 wird zunächst mit Xbal, dann mit DiiA Polymerase I und schließIieil mit Pst I behandelt» Das resultierende große Fragment kann isoliert und mit dem Produkt aus (5) verbunden werden zu einem Piasmid, mit dein. Si coli K-12 Stamm 294 oder, ein ander e;s-· Bakt er ium" transformiert werden kann, das dann in' der Lage ist ,'reifes LeXF H zu exprimieren.

LeIF 1

Die Ton Lawn et al», (Gell jj5, 1157 197§) konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen. R Charon 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen, untersucht, wobei die von Lawn,et al. (siehe oben) und Maniatis et al♦ (Cell 15» 687 0978)) angegebenen Verfahren verwendet wurden. Eine von der cDJtfS des LeIF A-IQons abgeleitete radioaktive LeIP-Sonde .wurde verwendet, um et v/a 5000,000 Plaques zu testen. Sechs LelF-Xlone wurden bei diesem Screening erhalten« !lach nochmaligem. Screening und Plaque-Reinigung wurde einer dieser Klone, HLeIF2, für die weitere Analyse ausgewählt.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode ' ·

können andere Sonden verwendet werden, um weitere pLelF-Klone aus dem menschlichen Genom zu isolieren. Diese wiederum können verwendet werden, um weitere Leukozyten-Lnterferon-/ Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen.

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1. Das 2000 Basenpaare-enthalt ende EcoRI-Fragment des Klons HLeI?2 wurde an der EcoRI-Spaltstelle in pBR325 kloniert. Das resultierende Plasmid Lei? wurde mit EcoRI gespalten und das 2000 Basenpaare-enthalt ende Fragment isoliert. Das Deoz^oligonukleotid dAATTCTGCAG (ein EcoRI - Pstl-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaare-enthaltende BcoRI-Fragment' gebunden und das-resultierende Fragment mit PstI gespalten, so daß man ein 2000 Basenpaareenthaltendes Fragment mit Pstl-Enden erhielt. Dieses wurde mit Sau96 gespalten und ein Fragment aus 1100 Basenpaaren wurde isoliert, welches ein PstI- und ein Sau96-Ende besaß·

2. Das -^lasmidpLelF C trp 35 wurde mit PstT und Xbal behandelt. Das große Fragment wurde isoliert,

3. Das keline Xbal - Pstl-Fragnient aus pLeIF G trp 35 wurde mit Xbal und Sau96 behandelt» Ein 40' Baseiipaare-ent~-- haltendes Xbl-Sau96-Fragment Vi/urde isoliert,

4. Die unter (1), (2) und (3) isolierten Fragmente wurden verbunden au dem Plasmid pLeIP I trp 1 ·

LeIF

1. Das Plasmid pLeIF J enthält ein aus 3300 Basen bestehendes- Hindlll-Fragment des menschlichen Genoms, welches die LeIF J Gensequenz umfaßt. Ein 76O Basenpaare-enthaltendes Ddel - Rsal-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert»

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2· Das Plasmid pie IP B trp 7 wurde mit HindIII und Ddel gespalten und ein 340 Basenpaare-enthaltendes Hindlll-Ddel-Fragment isoliert,

3. Das Plasmid pBR322 wurde mit Pstl gespalten, die Enden wurden abgespalten durch Inkubation mit DUA-PoIymerase I (Klenow Fragment) und schließlich wurde' mit' HindIII behandelt. Das große, etwa 3600 Bäsehpaare-enthaltende Fragment wurde isoliert·

4. Die Fragmente aus (1), (2) und (3) wurden mitein--

andär,, vgrbqLaden zu dem Plasmid: pLelF J/trp; 1.»

M»''Reinigung

Der Leukozyten-Interferon-Gehalt von Bakterienextrakten kann durch die folgenden 'Maßnahmen in der angegebenen Seihenfolge erhöht werden:

1» Poiyethyleniminfällung, bei der der größte Teil der cellulären Proteine, einschließlich des Interferons, im Überstand verbleibt.

2. Ajnoniumsulf at fraktionierung, wobei das Interferon bei einer Sättigung von 55 % mit. Ammoniumsulfat aus der Lösung ausfällt.

3. Suspendierung des Ammoniumsulfatkuchens in 0,06 M Kaliumphosphat, 10 mM Tris-HCl (pH 7_S2) und Dialyse gegen 25 mM Tris-HGl (pH 7,9), wobei die Interferonaktivität in der Lösung bleibt.

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4. Chromatographie des Überstandes, auf ein pH von

8,5 eingestellt, an einer DEAE-CeIlulose-Säule (Elution mit einem linearen Gradienten von 0 bia 0,2 M 3JaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 8,5)· '

5. Adsorption an Cibachrom Blau-Agarose bzw. Hydroxylapatit und Elation*mit 1,5 M".KCl bzw, 0,2 M Phosphatlösung (fakultativ).

6« Fraktionierung an einer Sephadex ^ G-75 Säule*

7.· Kationenaustauschchromaiiggraphie an' CM-C.ellulo.se

in 25 mM Ammöniuriläcetat bei pH 5|0 mit einem Ammoniumacetatgradienten (bis zu 0,2 M Atnmoniumacetat).

lach dem; vorstehend airgegebenen Terfahren erhält man ein Material von einer Reinheit- mit. über 95 %·

Das Material kann auch gereinigt werden durch GröSenausschluß-Chromatographie, HPLC an umgekehrten Phasen (RP-8) oder Affinitätschromatographie an immobilisierten Antiinterferon-Antikörpern.

-Perner kann das nach Absatz 4 oben erhaltene Material auf eine Säule monoklonaler Antikörper gebracht werden, die, wie von Milstein in Scientific American 243» 66 (1980) beschrieben, hergestellt wird und mit 0,2 MEssigsäure^ 0,1 % Triton und 0,15 M UaCl eluiert -werden.

In einem anderen, bevorzugten Verfahren kann das erfindungsgemäße erhaltene Interferon folgendermaßen gereinigt werden j

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1» Gebrorenes Zellmaterial wird mechanisch zerkleinert. Die teilweise aufgetauten Zellen werden in dem vierfachen Volumen des Puffers A, enthaltend 0,1 M" Tris (pH 7,5-8,0), pH 7,5-8,0), 10 % (w/v) Saccharose, 0,2 M HaCl, 5mM EDTA, 0,1 ml PMSP und 10-100' mM MgGl₂, suspendiert« Die Suapension wird dann 2 χ bei 4 C unter einem Druck von etwa 400 und weniger als 70 Atmosphären durch einen•Homogenisator gegeben und schließlich in einem Sisbad gekühlt,

2. Dem Homogenisat wird langsam Polyethylenimin bis

zu einer konzentration von etwa 0,35 % zugesetzt. Das Gemisch, wird stehengelassen und die lest· stoff β; werden" durch/ Zentrifugieren' und" Filtration getrennt. Bei diese'm" Schritt wird die Temperatur unter 10 ⁰G gehalten* Der überstand· (bzw. das 3?iltrat) wird durch Ultrafiltration auf etwa ein.Zehntel des ursprünglichen Volumens konzentrierte Die* Lösung;;.wird notfalls no'cii elnmai' durch eine mikroporöse Membran filtrierte

3. Die klare Lösung wird direkt auf eine Säule monoklonaler Antikörper bei einer Durchflußrate von 5-8. cm/ Stunde (z. 3. 25-40 ml pro Stunde bei einem Säulendurchmeaser von 2,6 cm) gegeben. Bs wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 25 mM Tris-HCl (pH 7,5-8,5), 0,5 M liaGl und 0,2 % eines Detergenzes, wie Triton X-100 enthält, gewaschen. Anschließend wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 0,15 M IaGl und 0,1 % eines Detergenzes, wie Triton X-100, enthält gespült. Die Säule .wird dann mit 0,2 M Essigsäure, enthaltend 0,1 % eines Detergenzes, wie Triton X-100, eluiert. Die r>rot e inhalt igen Fraktionen werden zusammengefaßt und

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mit 1 U HaOH oder 1,0 M Tris-Base auf einen pH von etwa 4,5 gebracht.

4· Diese Fraktion wird dann auf einen Kationenaustauscher, beispielsweise Whatmann GM52-Cellulose, der vorher mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise¹ Ammoniumacetat, pH 4,5 (50 mM), äquilibriert wurde, gebracht. Ss wurde dann mit dem Puffer so lange gewaschen, bis die UV-Absorption im -Bloat konstant war. Die Säule wurde dann mit 25 mM Ammoniumacetat/0,12 M Natriumchlorid eluiert und das Bluat wurde in üblicherweise aufgearbeitet.

Die in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten monoklonalen Antikörper können nach dem von Staehelin et al., Proc. Hat1. Acad. Sei. U.S.A. 78, 1848-52.(1981) beschriebenen Verfahren hergestellt .werden. Die Reinigung und Bindung der monoklonalen Antikörper ah Äffigel-10 wird im folgenden beschrieben«

Gewinnung und Reinigung monoklonal.er Antikörper aus Aszites-Flüasigkeit

Fünf weibliche Bälb/c Mäuse wurden Jeweils mit; 5-10 χ 10 Hybriddomzellen aus der Mitte dei¹ logarithmischen Wachstumsphase inokuliert. Weitere Mäuse (10 oder mehr) wurden jeweils mit 5 x 10° lebensfähigen Zellen, die aus der von inokulierten Mäusen hergestellten Flüssigkeit gewonnen wurden, intraperitoneal inokuliert.

Die Aaaites-Flüssigkeit jeder Maus wurde gesammelt» Die Flüssigkeit wurde zunächst 15 Minuten mit 500-1000 χ g und dann 90 Minuten mit 18000 Umdrehungen pro Minute

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zentrifugiert. Der Überstand wurde gefroren und bei -20 ⁰C aufbewahrt, lach dem Auftauen wurde weiteres festes Material durch 90 minütiges Zentrifugieren mit 35000 Umdrehungen pro Minute entfernt. Die von jeder-Maus erhaltenen einzelnen Batches wurden auf spezifische Antikörperaktivität nach einem Festphasenantikorperbindungstest (Staehelin et al.,.siehe oben) getestet und, wenn möglichy zusammengefaßt. ' -· - : ; . · .· .

Die Proteinkonzentrationen der Lösungen wurden annäherungsweise bestimmt, wobei man davon ausging, daß in einer 1 cm-Küvette T mg Protein eine:Absorption; von; 1,2 bei 280 nm lieferte. Aszites-Flüssigkeiten mit^::eiriern hohen Antikörpergehalt enthielten 30-35 mg Protein/ml,-Dies entspricht, etwa 4-7 mg spezifischem Antikörper/ml. Die Flüssigkeit wurde verdünnt mit PBS (0,01 M ilatriumphosphat, pH 7,3» '0,15'M HaCl-) auf eine Proteinkonzentration von 10-12 mg/ml.

Zu je 100 ml der verdünnten Lösungen wurden bei 0: G unter starkem Rühren langsam 90 ml von bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben.' Die Suspension wurde während 40—70 Minuten in Bis aufbewahrt, dann während 15 Minuten bei 4 ⁰C mit 10.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Der Proteinkuchen wurde in 0,02 M Tris-HCl . (pH 7,9)/O,O4 M Ha Cl (Puffer I) gelöst und die Proteinlösung während 16-18 Stunden bei Raumtemperatur gegen 100 Volumina des Puffers I dialvsiert. Die dialysierte Lösung wurde 10 Minuten mit 15,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Etwa 30-35 % des ursprünglichen Gesamtproteingehalts der Aszites-Flüssigkeit wurde wiedergefunden mittels ^Messung, der Absorption bei 280 nm.

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Eine Lösung, enthaltend 30-40 mg Protein/ml wurde dann auf eine DSAS-Gellulosesäule, die mit Puffer I äquilibriert war, gegeben, wobei für jeweils 1 g Protein mindestens ein Sau!envoiumen von 100 ml verwendet wurde. Der Antikörper wurde von der Säule mit einem linearen SaCl-Gradienten (0,04 M - 0,5 M) in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9) eluiert. Die Fraktionen mit einem UaCl-Gehalt'von 0,06-0,1 M wurden zusammengefaßt, konzentriert und mit bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Es wurde zentrifugiert, der Proteinkuchen wurde in 0,2-M HaHGO₃ (pH etwa 8,0)/0,3 M NaCl (Puffer II) gelöst und bei Raumtemperatur gegen diesen Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 15 Minuten lang mit 20,000 sg zentrifugiert und der Proteingehalt wurde auf 20-25 mg/ml mit Puffer II eingestellt.,

Her 5 te 1 Itihgf^{: :}vön-Immuna'ds or b ent i en

Affigel-10 (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien) wurde auf einem gesinterten Glasfilter dreimal mit eiskaltem Isopropanol und dreimal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel, das noch etwa 50 % Wasser enthielt, wurde in Plastikröhrchen übergeführt und-durch-kurzes Zentrifugieren sedimentiert· Der'Überstand wurde verdunstet. Das gepackte Gel wurde mit einem gleichen Volumen gereinigter Antikörperlösung gemischt und während 5 Stunden bei 4 ⁰G Bnde-über-Snde rotieren gelassen, Nach der Reaktion wurde das Gel zentrifugiert und zweimal mit Puffer III (0,1 M HaHCOT/0,15 M HaGl) gewaschen, um nicht-gebundene Antikörper zu entfernen. Die Prote Lobest isoiung zeigte, daß mehr als 9Oi des Antikörpers an das Gel gebunden worden war.

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Uni noch freie, reaktive Bindangasteilen abausättigen, wurde das Gel mit einem gleichen Volumen 0,1 M Ethanolamin-HGl (pH 8) gemischt.αηά während 60 Minuten bei Raumtemperatur Snde-über-Ende rotieren gelassen. Schließlich wurde das Gel mit PBS gewaschen und bei 4 ⁰G in PBS in Gegenwart von 0,02 % (w/v) iJatriumazid aufbewahrt,

Cl '

^* Parenterale Applikation

LeIP kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an. solcjhe, die immunsuppresive. Zustände, aufweisen« Die Dosierung der erfindungsgemäßen interferone kann sich an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen Materials, das aus menschlichen Leukozyten gewonnen wurde, anlehnen und kann z. B. etwa 1-10 χ 10° Einheiten pro Tag, im Fall von'Material mit einer Reinheit, die größer'ist'

als 1" fo, bis zu etwa 5 x 10 Sinhe it en· pro- Tag betragen.

,'·--. Sin für die parent erale Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß . man 3 mg bakteriell hergestelltes LeIP mit einer spezifisehen Aktivität von etwa 2 s 10 Einheiten pro mg in 25 ml 5 . humanem Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 χ 10 Einheiten reines Interferon enthält· Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20 ⁰G) aufbewahrt.

Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die erfindungsgemäße Verbindungen enthalten, kann' nach den allgemein bekannten Methoden der Galenik unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägermaterialien, wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen.

Claims (16)

-54- ' . 9.12.1983 62 991/12/37 Erf in dung s ana pr uc Ji

1· Verfahren zur Herstellung eines replikablen, in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptides mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Leukozyten-Interferone bewirkenden Vektors, gekennzeichnet dadurch, daß man eine dieses Polypeptid codierende erste DHS-Sequenz operabel mit einer zweiten DlS-Sequenz, die die für die Expression notwendigen Codons enthalt, verbindet»

2.. Verfahr en nach Punkt 1,, gekennzeichnet dadurch, daß die zweite DJSS-Se quenz die Express ion in einem Bakterium bewirkt·

3» Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium E» coli ist.·

4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz eines aminoendständig um Methionin verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons besitzt,

5, Verfahren nach einem der Punkte .1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz eines aminoendständig um ein abspaltbares Konjugat oder ein mikrobielles Signalprotein verlängertes, reifes Human-Leukozyten—Interferon besitzt,

' '· · ι

6* Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid-die Aminosäurepartialsequenz Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser enthält.

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7· Verfahren nach eineoi der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch., daß das Polypeptid die in Pig. 4 in Zeile "All" angegebenen Aminosäuren an den angegebenen Stellen der ' Aminosäuresequenz enthält»

8· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid Hujnan-Leukozyt en-Interferon (LeIP) A, B, C-, D, P, H, I oder J iat.

9· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis'3, gekennzeichnet dadurch, daß Human-Leukoz^ten-Interferon A (LeIP A) exprimiert wird·

10» Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß Human-Leukoz^ten-Interferon B (LeIP B) exprimiert wird«

11» Verfahren nach einender^vPunkte T" bis.' 3, gekennzeichnet dadurch, daß Human-Leukoz^ten-Interferon G (LeIP G) exprimiert wird»

12« Verfahren nach einem dar Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch, daß Human-Leukozyten-Interferon D (LeIP D) exprimiert wird· ·

13. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß Human-Leukozjten-Interferon P (LeIP P) exprimiert wird».

14. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet ' dadurch, daß Human-Leukozyten-Interferon H (LeIP H) exprimiert wird»

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15· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3j gekennzeichnet dadurch, daß Humen-Leukozyten-Interferon I (LeIF I) exprimiert wird.

16. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3_} gekennzeichnet dadurch, daß Human-Leukozyten-Interferon J (LeIP J) exprimiert wird*

itefiu jOielfes Zeichnungen"