NL8802014A

NL8802014A - Werkwijze voor de enzymatische bereiding van optisch aktieve aminozuren.

Info

Publication number: NL8802014A
Application number: NL8802014A
Authority: NL
Original assignee: Stamicarbon
Priority date: 1988-08-03
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1990-03-01

Description

WERKWIJZE VOOR DE ENZYMATISCHE BEREIDINGVAN OPTISCH AKTIEVE AMINOZUREN

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de enzy¬matische racemisatie van een met aminozuur anti de de algemene formule

waarin R een al dan niet gesubstitueerde alkyl- of arylqroepvoorstelt.

Tevens heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voorde enzymatische bereiding van optisch aktieve aminozuren uit amino-zuuramiden.

Met de werkwijze volgens de uitvinding kunnen zowel optischactieve L-aminozuren als optisch actieve D-aminozuren worden verkre¬gen.

Er bestaat een sterke behoefte aan efficiënte werkwijzen voorde industriële bereiding van optisch aktieve verbindingen. Het belangvan de industriële bereiding van optisch aktieve verbindingen wordtbepaald door de groeiende vraag naar selektieve produkten in defarmaceutische-, voedings- en agrochemische-industrie. De reden hier¬van is gelegen in het feit, dat slechts één van beide optische iso-meren bij de gewenste toepassingen een duidelijke werking vertoont.

Het andere optische isomeer echter kan hierbij geen, nauwelijks akti-viteit, of zelfs ongewenste nevenaktiviteit vertonen. Er bestaatderhalve behoefte aan stereoselectieve bereidingswijzen voor deze ver¬bindingen.

Bekende bereidingswijzen voor optisch aktieve verbindingenzijn o.a. fermentatie, asymmetrische synthese en chemische of enzyma- tische resolutie-processen. Een en ander is beschreven in reviews,zoals in Biotechnology, Ed. H.-J. Rehm en G. Reed, Verlag Chemie,Florida-Basel, vol 6a, door G. Schmidt-Kastner en P. Egerer, p.

387-421 (1984) en in de Symposium Proceedings: 'Biocatalysts in orga-nic syntheses', Noordwijkerhout, April 14-17, 1985; ELsevier SciencePublishers door E,M. Meijer e.a.

Met betrekking tot één klasse van optisch aktieve verbin¬dingen, namelijk de optisch aktieve aminozuren, kan gezegd worden, dat- voor zover het de in de natuur voorkomende aminozuren, de zgn. 'na¬tuurlijke aminozuren' betreft (bijna alle met uitsluitend de L-configuratie) - met name microbiële fermentatie een geschiktebereidingswijze is naast een aantal enzymatische resolutiemethodes enenzymatische asymmetrische syntheses.

De natuurlijke aminozuren, worden met name in de voedingsin¬dustrie toegepast en in de farmaceutische industrie bijvoorbeeld alscomponent in infuusvloeistoffen.

Het is bekend, dat bepaalde microorganismen, zoalsAspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Mycobacterium phlei,Aeromonas proteolytica. Bacillus subtilis. Bacillus stearother-mophilus, Enterobacter cloaca en Pseudomonas putida enzymen kunnenvormen, die in staat zijn aminozuuramiden in een waterig milieu tehydrolyseren onder vorming van een aminozuur.

Een uitstekend voorbeeld van een enzymatische resolu-tiemethode, gebruikmakend van een enzymaktiviteit uit één van de hier¬boven genoemde species is beschreven in US-A-3.971.70Q, US-A-4.172.846en in US-A-4.080.259. Daarbij wordt, 2oal.s weergegeven in schema I,het racemisch D,L-aminozuuramide in contact gebracht met een L-stereoselectief aminopeptidase bevattend preparaat. Alleen het L-aminozuuramide wordt gehydrolyseerd en er ontstaat een mengsel van L-aminozuur en D-aminozuuramide. Hieruit kan het L-aminozuur gewonnenworden via een aantal methodes zoals bijvoorbeeld kristallisatie,extractie en met behulp van een ionenwisselaar. Ook kan het D-aminozuuramide door omzetting met bijv. benzaldehyde als Schiffse baseworden neergeslagen. Na winning van de Schiffse base kan het D-aminozuuramide worden teruggewonnen en dan kan daaruit zowel door che¬ mische (zure) hydrolyse als door enzymatische hydrolyse het D-aminozuur gewonnen worden (zie bijv- EP-A-179.523).

Bij de bereiding van een gewenst enantiomeer verkrijg menmede een gelijke hoeveelheid ongewenst enantiomeer. Wanneer het D-aminozuur het gewenste enantiomeer is, dan is bovendien de bereidingomslachtig.

Schema I: D,L-aminozuuramide L-aminopeptidase

P-aminozuuramiHe

L-aminozuur

D-Schiffse base D-aminozuur

Naast de hierboven genoemde natuurlijke aminozuren zijn zekerook de niet-natuurlijke aminozuren van industriëel belang. Onder deniet-natuurlijke aminozuren worden zowel de optische antipoden(D-aminozuren) van de natuurlijke aminozuren verstaan als de amino-zuren, die gezien hun chemische samenstelling (afhankelijk van de R”substituent) niet in de natuur voorkomen. Het name de genoemde D-aminozuren zijn vaak interessant vanwege het feit, dat ze kunneninterfereren met het normale celmetabolisme. Hierdoor kunnen dezeniet-natuurlijke aminozuren vaak gebruikt worden als bouwstenen voorfarmaceutische- en agrochemische produkten. Zo worden bijvoorbeeld D-fenylglycine en D-p-hydroxy-fenylglycine gebruikt als bouwstenen voorbreed-spectrum antibiotica als resp. Ampicilline en Amoxycilline.

Er zijn nog geen bereidingswijzen bekend om gebruikmakend van een stereoselectief D-aminopeptidase rechtstreeks het D-amino2Uur tebereiden analoog aan de hierboven beschreven bereidingswijze voor L-aminozuren.

In NL-A-88.01864 van Aanvraagster is een werkwijze beschrevenvoor de bereiding van biokatalysatoren met stereoselectieve enzymak-tiviteit. Naast de constitutief aanwezige L-aminopeptidase aktiviteitin Pseudomonas putida ATCC 12633 kan een induceerbare stereoselectieveD-aminopeptidase aktiviteit worden verkregen (de betreffende mutant isgedeponeerd bij NCIB onder nr.......).

Middels klassiek genetische technieken zoals UV-bestraling ofalkylerende reagentia (bijv. nitrosoguanidine) of recombinant-DNAtechnieken kan van de hierboven beschreven mutant wederom een mutantworden verkregen met uitsluitend de induceerbare D-aminopeptidaseaktiviteit (L-aminopeptidase-negatieve mutant).

Toepassing van een dergelijke L-aminopeptidase negatievemutant met uitsluitend D-aminopeptidase aktiviteit of van gezuiverdeenzymfracties met uitsluitend D-aminopeptidase aktiviteit, afkomstigvan de oorspronkelijk verkregen mutant, leidt - analoog aan de voor deL-aminopeptidase beschreven werkwijze - tot rechtstreekse vorming vanD-aminozuren uit racemische D,L-aminozuuramiden.

In beide gevallen, blijft het nadeel bestaat dat maximaal 50%van het racemische uitgangsmateriaal benut kan worden voor de winningvan het overeenkomstige L- of D-aminozuur.

Enzymatische bereidingswijzen worden met voorkeur toegepastgezien de - in tegenstelling tot de chemische methodieken - mildereaktieomstandigheden van deze enzymatische processen, de hogestereoselectiviteit en de meestal brede substraatspecificiteit. Ditlaatste betekent, dat eenzelfde enzympreparaat gebruikt kan wordenvoor de bereiding van meerdere verschillende aminozuren.

Verrassenderwijze werd nu gevonden dat onder meer via dewerkwijze zoals beschreven in NL-A-88.01864 van Aanvraagster een bioka-talysator kan worden verkregen die een aminozuuramide racemase activi¬teit bezit.

Een dergelijke activiteit was niet bekend. Op basis van deracemase activiteit kunnen optisch actieve aminozuren veel efficiënter worden geproduceerd dan volgens de stand van de techniek.

De werkwijze volgens de uitvinding voor de enzymatischebereiding van een optisch aktief aminozuur uit een overeenkomstig ami-nozuuramide wordt gekenmerkt, doordat men het aminozuuramide in con¬tact brengt met een biokatalysator, die aminozuuramide racemase akti-viteit bezit in combinatie met stereoselectieve D- of L-aminopeptidaseaktiviteit.

Aanvraagster is er zodoende in geslaagd om langs enzymatischeweg en met 100% benutting van beide enantiomeren van een aminozuura¬mide daaruit naar behoefte een D-amino2uur of een L-aminozuur met eenhoge mate van optische zuiverheid (meer dan 98% enantiomere overmaat)te bereiden. Zie hiervoor schema II.

Schema II: D,L-aminozuuramide aminozuuramide aminozuuramide racemase racemase + +l-ami nopept i dase D-ami nopept idase

L-aminozuur D-aminozuur

Voordeel van deze werkwijze is dat men zowel uit mengsels vanenantiomeren, met inbegrip van racemische mengsels, van een aminozuuramide, maar ook uit optisch zuiver D- of L-aminozuuramide, stereose-lectief een optisch zuiver D- of L-aminozuur kan bereiden, waarbij hetaminozuuramide volledig wordt omgezet in het gewenste aminozuur.

In het bijzonder biedt de combinatie van een biokataly¬sator met D-aminopeptidase aktiviteit en een biokatalysator met verge¬lijkbaar hoge aminozuur amide racemase aktiviteit, en bij voorkeur éénbiokatalysator met beide, vergelijkbaar hoge aktiviteiten, eengeschikte bereidingswijze voor optisch zuivere D-aminozuren uitgaande van niet optisch zuivere D- of L-aminozuuramiden. Hetzelfde geldtmutatis mutandis voor de combinatie van een L-aminopeptidase en eenaminozuuramide racemase bij voorkeur in één biokatalysator met verge¬lijkbaar hoge aktiviteiten, wat betreft de bereiding van optischzuivere L-aminozuren uit bovengenoemde grondstoffen.

Een voorbeeld van een enzymsysteem, waarin de combinatie vanaminozuuramide racemase aktiviteit en aminopeptidase voorkomt/ is dedoor aanvraagster gedeponeerde mutant van Pseudomonas putida ATCC12633 (depotnr.....).

Het tot expressie brengen van de induceerbare D-aminopeptidase aktiviteit geschiedt door de verkregen mutant aan teenten in een kweekmedium waarin een D-aminozuuramide/ bij voorkeur D-fenylglycinamide (al dan niet als N-bron) aanwezig is.

De combinatie van aminozuuramide racemase aktiviteit en L-aminopeptidase aktiviteit kan worden verkregen door de gedeponeerdePseudomonas putida mutant te kweken in afwezigheid van een D-aminozuuramide, waardoor de D-aminopeptidase aktiviteit niet tot expressiewordt gebracht.

De combinatie van aminozuuramide racemase aktiviteit en D-aminopeptidase aktiviteit kan bijvoorbeeld worden verkregen door vande gedeponeerde Pseudomonas putida mutant middels genoemde genetischetechnieken een L-aminopeptidase-negatieve mutant te bereiden en dezedan te kweken in aanwezigheid van een D-aminozuuramide (al dan nietals N-bron). Ook is het mogelijk om met behulp van enzymzuiveringgezuiverde fracties in handen te krijgen met enerzijds D-aminopeptidase aktiviteit en anderzijds aminozuuramide racemase akti¬viteit. Combinatie van deze fracties levert dan de gewenste biokata¬lysator op voor de bereiding van optisch zuivere D-aminozuren.

Waar in deze aanvrage gesproken wordt over één biokatalysa-tor, waarin gecombineerde enzymaktiviteit aanwezig is, wordt hierondervanzelfsprekend ook verstaan een mengsel van biokatalysatoren/ die elkafzonderlijk een van de te combineren enzymaktiviteiten bevatten.

Bij uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding brengtmen, al naar gelang het gewenste produkt een optisch zuiver D- of L-aminozuur is, een aminozuuramide (in optisch zuivere vorm of een al dan niet racemisch mengsel van de enantiomeren daarvan) in contact meteen biokatalysator die, in het geval van een optisch zuiver D-aminozuur als gewenst produkt, een D-aminopeptidase aktiviteit bevatin combinatie met een aminozuuramide racemase aktiviteit/ respec¬tievelijk in het geval van een optisch zuiver L-aminozuur als gewenstprodukt/ een L-aminopeptidase aktiviteit bevat naast de genoemde ami¬nozuuramide racemase aktiviteit.

Het contact van het aminozuuramide met de biokatalysatorvindt bij voorkeur plaats in een waterig medium bij een temperatuurtussen 0 en 60 nc, in het bijzonder tussen 20 en 40 nc, en bij een pH-waarde tussen 6 en 12, in het bijzonder tussen 7,5 en 9,5. Buiten dezegebieden is de aktiviteit en/of stabiliteit van de biokatalysator inhet algemeen onvoldoende voor een bevredigende opbrengst. De biokata-Lysator kan, indien noodzakelijk/ nog op bekende wijze worden geak-tiveerd of gestabiliseerd, bijvoorbeeld door toevoeging van eenmetaalverbinding, zoals van kalium, magnesium, mangaan of zink.

Indien gewenst kunnen ook organische oplosmiddelen aan hetreactiemengsel worden toegevoegd om de oplosbaarheid van de reactantente verhogen. Hiervoor kunnen bijvoorbeeld de volgende oplosmiddelengebruikt worden: alcolholen, zoals ethanol, isopropanol of t-butanol,oftewel organische oplosmiddelen zoals N,N-dimethylformamide,dimethylsulfoxide of hexamethylfosfor triamide. Ook kan de reactieworden uitgevoerd in een twee-fasen systeem, daarbij gebruikmakend vantwee niet-mengbare oplosmiddelen of een volledige organische fase vaneen hydrofoob, met water verzadigd, organisch oplosmiddel.

De in de reactie gebruikte biokatalysator kan zowel eengezuiverd enzym zijn als een ruwe enzym oplossing, als een(gepermeabiliseerde) microbiële cel, welke de gewenste aktiviteitbezit of eventueel een homogenaat van cellen met een dergelijke akti¬viteit. Ook kan de toegepaste biokatalysator geïmmobiliseerd of che¬misch gemodificeerd worden, dit om ervoor te zorgen, dat een goedestabiliteit en reactiviteit van de biokatalysator onder de reactiecon-dities gehandhaafd blijft.

De gewichtsverhouding van de biokatalysator t.o.v. hetsubstraat kan sterk variëren tussen ruime grenzen afhankelijk van de specifieke aktiviteit van de gebruikte enzymfractie* microbiële cellen als biokatalysator, en afhankelijk van de verhouding van deverschillende enzymaktiviteiten in de biokatalysator, m.n. deverhouding tussen de aminozuuramide racemase aktiviteit en de D- ofL-aminopeptidase aktiviteit. Zo kan bijvoorbeeld zelfs een variatievan de gewichtsverhouding tussen de biokatalysator en het substraatvoorkomen van 4 : 1 tot 1 : 500.

Biokatalysatoren, welke bij de werkwijze volgens de uit¬vinding kunnen worden toegepast, kunnen worden verkregen zowel uitplanten- als uit dierlijke cellen en bij voorkeur uit microorganismen,zoals bacteriën, gisten en schimmels. Een aantal voorbeelden vangeschikte genera van micoorganismen voor toepassinq als biokatalysatorbij bovengenoemde werkwijze zijn: Al caligenes, Arthrobacter,Aspergillus, Bacillus, Cryptococcus, Flavobacterium, Mycobacterium,Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus of Staphylococcus.

Voor het vinden van een biokatalysator met de geschikteenzymaktiviteit kan men gebruik maken van voor de vakman eenvoudigvoor dit doel vast te stellen mutagenese- en screeningstechnieken,alsmede van de werkwijze voor de bereiding van biokatalysatorenbeschreven in NL-A-88.01864 van Aanvraagster. Voor een overzicht vandeze technieken zie bijvoorbeeld. Enzyme Microb. Technol. £ (1984)pag. 3-10 en 9_ (1987) pag. 194-213. Hiervoor hoeft men zich echtergeenszins te beperken tot bovengenoemde genera. Ook combinaties vanmicroorganismen zijn mogelijk en eventuele nieuwe mutanten daarvan.

Bij voorkeur zijn de gecombineerde gewenste aktiviteiten inéén microorganisme in t.o.v. elkaar voldoende hoge aktiviteitaanwezig. Cellen van een dergelijk microorganisme (eventueel geper-meabiliseerd) kunnen dan als biokatalysator gebruikt worden.

De werkwijze volgens de uitvinding is geschikt voor hetbereiden van optisch zuivere D- of L- aminozuren, zoals het D- of L-enantiomeer van alifatische aminozuren, bijvoorbeeld valine, leucineen alanine, of van aromatische aminozuren, bijvoorbeeld fenylglycine,para-hydroxyfenylglycine en fenylalanine, maar uiteraard is de uit¬vinding daartoe niet beperkt.

De uitvinding wordt nu verder verduidelijkt door de volgendeexperimenten, zonder echter daartoe te worden beperkt.

Experiment I;

De door de aanvraagster bereide mutant van Pseudomonas putidaATCC 12633 (depot nr.....) werd overnacht gekweekt in een YCB (10 g/l)medium met D-fenylglycinamide als N-bron (1 g/l). Na oogsten van decellen door centrifugeren en wassen werd telkens 120 mg natgewichtingezet met een 5 ml 1% (w/v) oplossing van resp. D- en L-fenylglycineamide en D- en L-fenylglycine als substraat. De reactie werd 20 uuruitgevoerd onder schudden in een vaatje bij 37 «C en pH 8,5.

De verschillende reacties gaven de volgende resultaten:

Substraat Biokatalysator Conversiepercentages naar D-fenylglycine en L-fenylglycine D-fenylglycinamide aanwezig 77% 14% L-fenylglycinamide aanwezig 7% 89% D-fenylglycinamide afwezig <1% <1% L-fenylglycinamide afwezig <1% <1% D-fenylglycine aanwezig -- < 1% L-fenylglycine aanwezig <1% —

De bovengenoemde resultaten, die berekend zijn na analyse vande verkregen reactiemengsels m.b.v. chirale HPLC, laten duidelijkzien, dat deze biokatalysator naast de bereide D-aminopeptidase akti-viteit een aminozuur amide racemase aktiviteit voor fenylglycinamidebezit. Racemisatie treedt namelijk niet op het niveau van het geprodu¬ceerde aminozuur op. Enkel met het overeenkomstige amide als substraat(zowel het D- als het L-fenylglycinamide) wordt in gelijktijdige aan¬wezigheid van het (constitutieve) L-aminopeptidase en het(induceerbare) D-aminopeptidase, zowel D-fenylglycine als L-fenylglycine gevormd.

Experiment II:

De door de aanvraagster bereide mutant van Pseudomonas putida

ATCC 12633 (depot nr.....) werd overnacht bij 28 nc gekweekt in een YCB

medium (10 g/l) met D-fenylglycinamide als N-bron (1 g/l). Na oogstenvan de cellen door centrifugeren en wassen werden de cellen gedesin¬tegreerd met behulp van French-press, waarna door centrifugeren eenzgn. celvrij extract verkregen werd.

Daar vele reacties/ vergelijkbaar met de racemisatie van eenaminozuur amide, zoals racemisatie van S-bevattende aminozuren en bij¬voorbeeld transaminase reacties, pyridoxal 5-fosfaat(PLP) als cofactorhebben, werd dit ook voor de racemisatie van aminozuur amiden nage¬gaan.

In het geval dat het aminozuuramide racemase inderdaad PLP-afhankelijk zou zijn, moet de reactie door een, voor PLP- afhankelijkereacties, specifieke inhibitor zoals hydroxylamine geremd worden.

De reacties werden 16 uur uitgevoerd met D-fenylglycinamide5 ml 1%(w/v) als substraat bij 37 oc, pH 8.5 en 0,5 ml van hetcelvrije extract als biokatalysator. De volgende resultaten werdenhierbij verkregen:

Hydroxylamine sulfaat Reactieproducten 0,2 mmol/ml D-fenylglycine L-fenylglycine afwezig + +++ 10 μί + ++ 50 μl + +

Additionele PLP geeft in deze racemisatie reacties eenverhoging van de aminozuuramide racemase aktiviteit.

Deze resultaten tonen inderdaad aan dat de racemisatie vanaminozuur amiden een PLP-afhankelijke reactie is, die met behulp vanhydroxylamine geremd kan worden.

Experiment III:

De door de aanvraagster bereide mutant van Pseudomonas putida ATCC 12653 (depot nr.....) werd overnacht bij 28 bq gekweekt in een 30

Itr. bioreactor (MBR), pH 7,1, met een mediuminhoud van 20 Itr. zonderdat aan dit medium een D-aminozuuramide (bijv- D-fenylglycinamide),was toegevoegd. De op deze wijze gekweekte biokatalysator bezit daar¬door uitsluitend L-aminopeptidase en aminozuur amide racemase aktivi-teit en geen D-aminopeptidase aktiviteit. Na oogsten van deze cellen,door achtereenvolgens ultrafiItratie, centrifugeren, wassen envriesdrogen toe te passen, werden deze cellen als biokatalysatorgebruikt - in verschillende verhoudingen ten opzichte van hetsubstraat - bij de hierna beschreven enzymatische reacties. Alssubstraat hierbij werd 50 ml van een 2%(w/v) D,L-fenylglycinamideoplossing, pH 8,6 gebruikt. De reacties werden uitgevoerd bij 40 ac.

Het conversiepercentage werd bepaald op grond van de gevormdehoeveelheid ammoniak, die door de enzymatische hydrolyse van het ami-nozuuramide in het overeenkomstige aminozuur werd gevormd. Dezebepaling van de ammoniak concentratie in het reactiemedium werd uitge¬voerd met behulp van een iorrselectieve ammoniak electrode (Orion).

Biokatalysator E/S verhouding Reactietijd Conversiepercentagemg uren van het substraat (aminozuuramide) 100 1:10 24 52% 50 53% 72 58% 500 1:2 24 53% 50 57% 72 63% 2000 2:1 24 65% 50 74% 72 80%

Hoewel uit deze resultaten duidelijk blijkt, dat de aminozuuramide racemase aktiviteit de limiterende enzymatische aktiviteit is inde hydrolyse van het aminozuuramide, wordt hiermee wel aangetoond dat door de enzymatische racemisatie van het aminozuuramide als substraatvoor de reactie een conversiepercentage kan worden verkregen dat hoqerligt dan 50%, Daarnaast werd met chirale TLC analyses aangetoond/ datuitsluitend L-fenylglycine werd gevormd en geen D-fenylglycine, waar¬door deze bereidingswijze uitstekend geschikt is voor de bereiding vanoptisch zuiver L-fenylglycine.

Experiment IV:

Daar de bereidingswijze, beschreven in experiment III, eenlange reactietijd nodig heeft om tot de verkregen conversiepercentageste komen, zou tijdens deze lange reactietijd mogelijk inductie van deD-aminopeptidase aktiviteit kunnen optreden, daar in het reac-tiemengsel naast L-fenylglycinamide ook D-fenylglycinamide aanwezigis. Om dit te voorkomen werd dezelfde reactie uitgevoerd in aan¬wezigheid van een eiwitsynthese remmer, in dit geval tetracycline, enwel in een concentratie, die volledig inhiberend is (10 Mg/ml). Dereactie werd uitgevoerd bij 40 «C, pH 8,15 en met een 2% (w/v) race-misch D,L-fenylglycinamide mengsel (40 ml) als substraat. Zo werden devolgende resultaten verkregen.

Biokatalysator E/S verhouding Reactietijd Conversiepercentagemg uren van het substraat 403 1:2 17,5 52% 47.5 56% 72 58% 1600 2:1 17,5 58% 47.5 69% 72 75%

Daar de nu verkregen conversiepercentages op hetzelfde niveauliggen als bij experiment III, waar geen inhibitor van de enzym-synthese aan het reactiemengsel was toegevoegd, moet geconcludeerdworden, dat door door de aanwezigheid van een aminozuuramide racemasede eerder genoemde conversiepercentages boven 50% liggen.

Experiment V:

Daar het ook mogelijk moet zijn om uitgaande van optischzuiver D-fenylglycinamide als substraat, in aanwezigheid van eenbiokatalysator met aminozuur amide racemase aktiviteit gecombineerdi met L-aminopeptidase aktiviteit, L-fenylglycine te verkrijgen als pro-dukt, werd dit in een analoog experiment (vergelijk experimenten IIIen IV) uitgevoerd. De zoals in experiment III op dezetfde wijze ge¬kweekte cellen van de Pseudomonas putida ATCC 12633 bereide mutant wer¬den ingezet als biokatalysator (300 mg) in een 30 ml 1%(w/v) waterigeI oplossing van D-fenylglycinamide. De reactie werd uitgevoerd bij 40 Ken pH 9,0. Het conversiepercentage werd eveneens weer bepaald viameting van de geproduceerde hoeveelheid ammoniak met behulp van eenion-selectieve ammoniakelectrode. Hierbij werden de volgende resulta¬ten verkregen.

Reactietijd Conversiepercentage uren van het substraat 17 9% 43 26%

Ook dit experiment levert weer een bewijs voor de enzyma¬tische racemisatie van een aminozuuramide, in dit geval het optischzuivere D-fenylglycinamide, met daarmee gelijktijdige hydrolyse vanhet gevormde L-fenylglycinamide naar optisch zuiver L-fenylglycine.

Experiment VI;

Om de substraatspecificiteit van het aminozuur amide racemasete bepalen werden zowel twee aromatische als twee alifatische D-aminozuur amiden als substraat gebruikt (5 ml 1%(w/v) waterigeoplossing). Als biokatalysator werden gevriesdroogde cellen gebruikt,op dezelfde wijze verkregen als de in experimenten III, IV en Vbeschreven. De reactie verliep 17 uren bij 38**C en een pH van 8,1. Alsaromatische aminozuuramiden werden D-fenylglycinamide en D-homofenylalaninamide genomen en als alifatische aminozuuramiden D- valinamide en D-leucinamide. Als reactieprodukten werden in allegevallen uitsluitend de overeenkomstige L-aminozuren gevormd, wat metbehulp van chirale TLC geanalyseerd werd. hit is een bewijs voor debrede substraatspecificiteit van het aminozuuramide racemase, datzowel voor aromatische aminozuur amiden als voor alifatische aminozuuramiden een racemiserende enzymaktiviteit bezit.

Claims

1. Werkwijze voor de racemisatie van een aminozuuramide met de alge¬mene formule:

waarin R een al dan niet gesubstitueerde alkyl- of arylgroepvoorstelt/ met het kenmerk, dat men het aminozuuramide in contactbrengt met een biokatalysator met aminozuuramideracemase aktiviteit.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het amino¬zuuramide tevens in contact brengt met een biokatalysator met L- aminopeptidaseactiviteit, resp. D-aminopeptidase aktiviteit en zoeen L-aminozuur resp. een D-aminozuur bereidt.

3. Werkwijze volgens één der conclusies 1-2, met het kenmerk, dat menhet aminozuuramide in contact brengt met een van een mutant vanPseudomonas putida ATCC 12633 verkregen enzympreparaat.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men het amino¬zuuramide in contact brengt met de onder nummer ........ gedepo¬ neerde mutant van Pseudomonas putida ATCC 12633.

5. Werkwijze zoals beschreven in de beschrijving en/of de voor¬beelden.