NL9102009A - Produktie van bioactieve peptiden met recombinante cellen. - Google Patents

Description

Titel: Produktie van bioactieve peptiden met recombinante cellen

De vinding ligt op het gebied van de genetische manipulatie en betreft meer in het bijzonder een werkwijze voor het produceren van een bioactief peptide met behulp van recombinante cellen, die door middel van genetische manipulatie voorzien zijn van genetische informatie coderend voor het bioactieve peptide en in staat zijn om het bioactieve peptide tot expressie te brengen en uit te scheiden.

Een dergelijke werkwijze is door de ontwikkelingen op het gebied van de recombinant DNA techniek mogelijk geworden, maar is in de praktijk niet altijd even succesvol. Met name bestaan er gevallen waarin de vouwing en/of secretie van de te produceren heterologe eiwitten niet correct of inefficiënt verloopt. Een dergelijk probleem doet zich vooral voor in gevallen van een zeer sterke expressie van het heterologe eiwit, waarin de cel niet voldoende capaciteit heeft om een correcte vouwing en secretie van het in een grote hoeveelheid geproduceerde eiwit te verzekeren.

Voor de biotechnologische produktie van biologisch actieve stoffen is het vaak een groot probleem dat deze stoffen worden geproduceerd in eukaryotische cellen die niet of in onvoldoende mate een gereguleerde route van eiwittransport binnen de cel hebben. Daardoor zullen deze stoffen niet de juiste post-translationele modificaties ondergaan die ze nodig hebben om als volledig biologisch actieve stof te kunnen werken. Dit geldt in het bijzonder voor bioactieve stoffen die onder normale (in vivo) omstandigheden worden geproduceerd en afgegeven via gereguleerd eiwittransport. Hierbij valt bijvoorbeeld te denken aan het op de juiste plaats klieven van prohormonen tot de bioactieve hormonen of het acetyleren/amideren van de splitsingsproducten. Het is dus essentieel voor een efficiënte produktie van bioactieve stoffen, dat deze de juiste route binnen de cel volgen. Gebeurt dit niet, dan komen de eiwitten niet in de juiste micro-omgeving voor post-translationele veranderingen.

De uitvinding biedt een oplossing voor dergelijke problemen, inhoudende dat men de cel door middel van genetische manipulatie tevens voorziet van genetische informatie welke de cel in staat stelt om het eiwit 7B2 tot expressie te brengen.

Het eiwit 7B2 en de daarvoor coderende genetische informatie zijn beschreven in de Europese octrooiaanvrage EP-A-0 315 254. Het komt voor in neuronen en endocriene cellen en wordt in de genoemde octrooiaanvrage en de wetenschappelijke literatuur beschreven als een mogelijk GTP-bindend eiwit dat als zodanig, evenals vele andere kleine GTP-bindende eiwitten, betrokken zou kunnen zijn bij het fuseren van twee membranen van organellen binnen de cel of van een organelmembraan met de celmembraan. Omdat bij de produktie van heterologe eiwitten door recombinante cellen geen behoefte bestaat aan een transformatie van de cel met genetische informatie welke in de vorming van GTP-bindende eiwitten resulteert, is niet eerder voorgesteld om de cel tevens 7B2 tot expressie te doen brengen.

De onderhavige uitvinding is nu gebaseerd op verder onderzoek dat heeft uitgewezen dat 7B2 geen GTP bindt, maar de functie van een moleculair chaperonine eiwit heeft.

Moleculaire chaperone eiwitten zijn essentieel voor het goed functioneren van cellen omdat ze er voor zorgen dat eiwitten, die door de cellen worden geproduceerd, op een juiste manier worden gevouwen. Een juiste vouwing is nodig voor een goed transport van deze eiwitten naar de juiste bestemming binnen de cel. Specifieke chaperone eiwitten zijn bijvoorbeeld beschreven voor het eiwit-transport vanuit het cytoplasma van de cel naar celorganellen zoals het mitochondrion, de chloroplast, de celkern en het endoplasmatisch reticulum (ER). De produktie van vele van deze eiwitten wordt geïnduceerd in cellen die een hitte-shock ondergaan en chaperone eiwitten zijn dan ook vaak "heat-shock proteins". Dit is waarschijnlijk het geval omdat in cellen, die aan hitte zijn blootgesteld, relatief veel onjuist gevouwen eiwitten voorkomen waarvan de vouwing moet worden gecorrigeerd door de chaperones (voor details zie het artikel "Molecular chaperones", Annu. Rev.

Biochem. 60, 321-347, 1991). Een bekend voorbeeld van een in het ER voorkomend chaperone, dat aan alle secretie-eiwitten bindt, is het "binding protein" (BiP).

Er bestaan verschillende transportmechanismen van secretie-eiwitten binnen de cel. Alle secretiecellen hebben het vermogen om eiwitten af te geven: synthese bij het ER, transport via ER naar het Golgi apparaat (o.a. met behulp van de chaperone BiP) en van het Golgi apparaat naar zogenaamde transportgranula. De membraan van een transportgranulum versmelt met het plasmamembraan waarna de secretie-eiwitten de cel kunnen verlaten (exocytose waarbij het granulum wordt geleegd). Wanneer secretie-eiwitten worden gemaakt, worden ze ook afgegeven, m.a.w. er is geen regulatie van de eiwitafgifte. Dit eiwittransport wordt dan ook aangeduid als de constitutieve route en is aanwezig in alle cellen van prokaryoten, hogere eukaryoten en lagere eukaryoten (incl. gist).

In een beperkte groep cellen wordt de afgifte van bepaalde secretie-eiwitten gereguleerd. Tot deze cellen behoren neuronen en endocriene cellen, m.a.w. cellen die precursoreiwitten (voorlopers) voor bioactieve peptiden maken. In deze cellen vindt synthese bij het ER plaats, transport van ER naar Golgi (als bij constitutieve cellen) maar nu van Golgi naar secretiegranula. In deze secretiegranula is nu de juiste omgeving aanwezig voor de specifieke post-translationele modifikaties van de precursoreiwitten. Dit type van eiwittransport wordt aangeduid als de gereguleerde route. De exocytose (uitscheiding) van de bioactieve peptiden vindt slechts plaats wanneer de cel een juiste externe stimulus ondervindt. Dit type cellen zijn derhalve gereguleerde cellen. Het is uitsluitend in deze gereguleerde cellen dat 7B2 voorkomt en actief is.

Daarbij is 7B2 het enige tot nu toe bekende chaperonine dat voorkomt in de gereguleerde route van gereguleerde cellen en dus het enige chaperonine dat specifieke interactie zal hebben met precursoreiwitten. Waarschijnlijk is het zo dat precursoreiwitten specifieke domeinen binnen hun struktuur hebben die herkend worden door 7B2 en betrokken zijn bij de interactie. Daarentegen worden alle secretie-eiwitten herkend door BiP.

Het lijkt kenmerkend voor de produktie van precursoreiwitten voor bioactieve peptiden dat ze gesorteerd worden uit de groep van de secretie-eiwitten, waarbij ze worden gescheiden van de overige (constitutieve) secretie-eiwitten en een route volgen waarbij ze uiteindelijk terecht komen in de gereguleerde granula. Het is voor dit sorteringsmechanisme dat 7B2 nodig is.

Er zijn diverse redenen om aan te nemen dat het 7B2 eiwit een chaperone eiwit is, behorend tot de groep van de chaperonines, dat verantwoordelijk is voor het goed laten verlopen van het transport van secretie-eiwitten vanuit het ER via het Golgi apparaat naar de secretiegranula van cellen. Het lijkt er op dat het 7B2 eiwit nodig is voor het goed laten functioneren van de gereguleerde route van eiwittransport binnen neuronen en endocriene cellen.

Voor deze veronderstelling is de vinding, dat de struktuur van het 7B2 eiwit verwant is met die van de chaperonines, essentieel. In de literatuur is geen enkel eiwit gesuggereerd dat als chaperone in de secretieroute naar secretiegranula zou kunnen dienen. Wel werd een consensus-sequentie gevonden binnen de struktuur van prohormonen die zou kunnen dienen als signaal voor de sortering van secretie-eiwitten naar de gereguleerde route van afgifte ("A motif found in propeptides and prohormones that may target them to secretory vesicles", Biochem. Biophys. Res. Commun. 174, 586-592, 1991). Prohormonen zijn grote eiwitten die opgesplitst worden tot de biologisch actieve peptiden in de secretiegranula van de cel. Een voorbeeld van een prohormoon is het precursoreiwit proopio-melanocortine (POMC). POMC is een "multifunctioneel" prohormoon dat geknipt kan worden tot diverse bioactieve peptiden zoals adrenocorticotroop hormoon (ACTH), het opiaatachtige peptide β-endorfine en het melanoforen-stimulerende hormoon (MSH).

Huidige aanwijzingen voor de stelling, dat het 7B2 eiwit een chaperonine is in de gereguleerde route van eiwittransport, zijn: 1. Strukturele verwantschap van het eiwit 7B2 met chaperonines (Figuur 1).

2. Net als alle andere moleculaire chaperones is 7B2 een heat-shock eiwit.

3. De 7B2 precursor bevat een signaalpeptide aan de NH2-terminus en passeert dus het membraan van het ER om in de secretieroute van de cel terecht te komen. Met immunocyto-chemische methoden is aangetoond dat het 7B2 eiwit inderdaad in de secretiegranula van de cel voorkomt. Verder is ook aangetoond dat het 7B2 eiwit door de cel wordt afgegeven.

4. Het 7B2 eiwit komt uitsluitend voor in cellen met secretiegranula, dus in cellen met een gereguleerde afgifte. Anderzijds blijkt het zo te zijn dat wanneer cellen secretiegranula vormen, ze het 7B2 eiwit produceren.

5. Het polypeptide 7B2 komt tot co-expressie met het prohormoon POMC, m.a.w. wanneer in de cel de produktie van POMC wordt verhoogd, wordt ook de produktie van het 7B2 verhoogd. Dit betekent dat wanneer de cel een grotere behoefte heeft aan produktie en afgifte van een hormoon, het 7B2 eiwit in een grotere hoeveelheid wordt aangemaakt. Ook wanneer cellen (bijvoorbeeld de groeihormoon-prolactine producerende cellijn GH4) worden aangezet tot het vormen van meer secretiegranula, wordt de hoeveelheid van het 7B2 eiwit verhoogd.

De strukturele overeenkomst tussen 7B2 en chaperonines is met de hand gevonden en wordt door de computer aangegeven als niet significant. Dit betekent dat de vinding niet kon worden gedaan door een uitgebreide computeranalyse (d.w.z. vergelijking van de structuur van 7B2 met de tot nu toe bekende eiwitten en nucleotidensequenties in de computer databanken van bijv. EMBL, NBRF of GenBank). Gezien de geringe homologie tussen 7B2 en chaperonines is het buitengewoon verrassend dat 7B2 als chaperonine kan worden gebruikt in de produktie van heterologe, bioactieve peptiden door recombinante cellen. De vaststelling dat 7B2, net als alle andere moleculaire^chaperones, een heat-shock eiwit is, is eveneens zeer verrassend aangezien 7B2 een secretie-eiwit is (d.w.z. de cel verlaat door uitscheiding via exocytose) terwijl alle tot nu toe bekende heat-shock eiwitten binnen de cel gelocaliseerd zijn en dus niet worden uitgescheiden.

Het unieke van 7B2 is dat dit chaperonine precursoreiwitten voor bioactieve peptiden specifiek bindt en naar de gereguleerde route van eiwittransport brengt. Een dergelijk chaperonine is niet beschreven en 7B2 is het enige tot nu toe bekende chaperonine dat een secretie-eiwit is (dus de cel kan verlaten). Het feit dat 7B2 wordt geproduceerd door slechts een beperkte groep van cellen (namelijk de gereguleerde cellen) geeft eveneens het unieke aan. Het eiwit 7B2 is het eerste chaperonine dat de cel verlaat; alle andere chaperones hebben hun funktie binnen de cel en blijven binnen de cel. Anderzijds is 7B2 het enige neuroendocriene eiwit dat een chaperone-functie vervult. De vinding brengt dus twee gegevens, die in eerste instantie geen enkel verband met elkaar leken te hebben, bij elkaar: het neuroendocriene polypeptide 7B2 is een chaperonine.

De vinding berust dus op het nieuwe inzicht dat het bekende 7B2 tot de moleculaire chaperonine eiwitten behoort en kennelijk een rol speelt bij het transport van bepaalde secretie-eiwitten vanuit het ER via het Golgi apparaat naar de secretiegranula van cellen. De eiwitten die voor een goed transport afhankelijk zijn van 7B2 zijn de precursoreiwitten voor bioactieve peptiden zoals peptide hormonen en neuropeptiden, m.a.w. eiwitten die getransporteerd worden en de cel verlaten via de gereguleerde route van eiwit-transport zoals die optreedt in zenuwcellen en endocriene cellen. Dit nieuwe inzicht kan worden aangewend in gevallen waarin de vouwing en/of secretie van deze eiwitten niet correct of inefficiënt verloopt bij de produktie van heterologe eiwitten in een recombinante gastheer, waarbij door co-expressie van het 7B2 met het te produceren bioactieve eiwit wordt verzekerd dat het eiwit de juiste route volgt. Het volgen van de juiste route is vooral voor precursoreiwitten van bioactieve peptiden van groot belang omdat deze eiwitten in de juiste micro-omgeving binnen de cel moeten komen (namelijk in de secretiegranula van de gereguleerde route) om de zeer specifieke post-translationele modificaties op de juiste manier te kunnen ondergaan (zoals het knippen van precursoreiwitten op paren van basische aminozuren die over het algemeen de bioactieve peptiden NH2- en COOH-terminaal begrenzen binnen de struktuur van het precursoreiwit; acetylering; amidering). Co-expressie van het eiwit 7B2 met het te produceren precursor-eiwit is in het bijzonder nodig om vouwingsproblemen in overproducerende cellen te voorkomen of op te heffen; m.a.w. in gevallen dat de cel zelf niet voldoende capaciteit heeft om het (over)geproduceerde eiwit op de juiste manier te vouwen voor correct transport naar de gereguleerde granula.

De uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor het produceren van een bioactief peptide door recombinante cellen te kweken, die door middel van genetische manipulatie voorzien zijn van genetische informatie coderend voor een precursor van het bioactieve peptide en in staat zijn om deze precursor tot expressie te brengen, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat cellen worden gekweekt die door middel van genetische manipulatie tevens voorzien zijn van genetische informatie welke de cellen in staat stelt om het eiwit 7B2 tot expressie te brengen, waarbij de cellen de precursor van het bioactieve peptide tot expressie brengen en zodanig bewerken dat het bioactieve peptide, eventueel na stimulering van de cellen tot afgifte, wordt uitgescheiden, en het door de cellen uitgescheiden bioactieve peptide wordt gewonnen.

Voorts verschaft de uitvinding recombinante cellen die door middel van genetische manipulatie voorzien zijn van genetische informatie coderend voor een precursor van een bioactief peptide en in staat zijn om deze precursor tot expressie te brengen, met het kenmerk, dat de cellen door middel van genetische manipulatie tevens voorzien zijn van genetische informatie welke de cellen in staat stelt om het eiwit 7B2 tot expressie te brengen, waarbij de cellen in staat zijn om de precursor van het bioactieve peptide tot expressie te brengen en zodanig te bewerken dat het bioactieve peptide, eventueel na stimulering van de cellen tot afgifte, wordt uitgescheiden.

Met het eiwit 7B2 wordt niet alleen het humane 7B2 bedoeld dat in de eerder genoemde Europese octrooiaanvrage EP-A-0 315 254 is beschreven, maar tevens een corresponderend eiwit van een ander organisme. Behalve het humane 7B2 is eveneens de struktuur van het 7B2 eiwit van de muis, rat, rund en de klauwpad Xenopus laevis beschreven. Uit een vergelijking van de aminozuursequenties van de 7B2 eiwitten van deze verschillende species blijkt dat met name het NH2-terminale gedeelte van 7B2 sterk geconserveerd is. Voorts blijken de stukken die overeenkomst vertonen met de chaperonines (Figuur 1) steeds identiek te zijn tussen de 7B2 strukturen van de species, terwijl de verschillen tussen de species overeenkomen met niet-geconserveerde stukken tussen 7B2 en de chaperonines.

Zowel in prokaryotische als eukaryotische cellen zal de co-expressie van 7B2 tot een verkleining van de vouwingsproblemen van geproduceerde precursoreiwitten leiden. Voor de biotechnologische toepassing is echter vooral het gebruik van 7B2 in eukaryotische cellen, en speciaal cellen met gereguleerd eiwittransport, van belang. Hoewel de uitvinding derhalve ook van toepassing is op een microbiologische produktie van heterologe eiwitten in recombinante prokaryotische cellen, heeft het de voorkeur dat gebruik wordt gemaakt van recombinante eukaryotische cellen, en daarvan vooral die van het gereguleerde type.

Het kan wenselijk zijn om afgifte van het bioactieve peptide door de cellen te stimuleren. Welke stoffen voor een dergelijke stimulering gebruikt kunnen worden, hangt enigszins af van het type cel dat voor de produktie wordt gebruikt. Een vrij algemeen bruikbaar middel voor het stimuleren van deze afgifte is cAMP of derivaten daarvan, zoals 8-Br-cAMP.

Het 7B2 eiwit zal alleen en specifiek interacties aangaan met precursoreiwitten voor bioactieve peptiden, die in de gereguleerde secretie-route worden geproduceerd. De met behulp van 7B2 eiwit te produceren recombinante eiwitten zijn dus de bioactieve peptiden. Tot de groep van de bedoelde biologisch actieve peptiden behoren peptide hormonen en neuropeptiden (insuline, adrenocorticotroop hormoon ACTH, schildklierhormoon, groeihormoon, prolactine, etc.) en mogelijk ook groeifactoren (TNF, NGF), stollingsfactoren en andere bloedeiwitten (factor VIII, tPA en van Willebrandsfactor).

De werkwijze volgens de uitvinding, die een co-expressie van 7B2 en een heteroloog eiwit in een genetisch gemanipuleerde gastheercel inhoudt, kan op een op zichzelf bekende wijze worden uitgevoerd, bijvoorbeeld op de wijze zoals door anderen voor het plantaardige chaperonine rubisco is beschreven.

De uitvinding zal aan de hand van de volgende beschrijving van experimenten en de figuren nader worden toegelicht.

Figuur 1 toont een vergelijking van de aminozuursequentie van het humane 7B2 met die van verscheidene bekende chaperonines van uiteenlopende organismen zoals worm, plant, bacterie en mens. De identieke aminozuren zijn in het zwart en conservatieve aminozuur-veranderingen in hokjes weergegeven.

Figuur 2 toont de constructie van de pGEX-2T-7B2 kloon. De BamHI site in de MCS van de vector pGEX-2T werd opgevuld met behulp van Klenow-polymerase, waarna in de Smal/EcoRI sites een EcoRV-EcoRI fragment van het h7B2-cDNA (uit pABl) werd gekloneerd. In de aminozuursequentie van het fusie-eiwit is in het overgangsgebied tussen Sj26 en 7B2 een herkenningssite voor thrombine aanwezig.

Figuur 3 toont de constructie van de prokaryotische expressievector pGEX-KG, welke afgeleid is van de vector pGEX-2T door in de EcoRI site een linker met meerdere kloneringsplaatsen in te voegen.

Het humane 7B2 cDNA is in een eukaryotische expressievector gekloneerd. Deze 7B2-bevattende vector is getransfecteerd naar de hypofyse-afgeleide muizetumor cellijn AtT20, die is uitgerust met zowel de constitutieve als de gereguleerde manier van eiwit-transport. Inderdaad bleek 7B2 tot overexpressie te komen in deze getransfecteerde cellen: zowel op RNA als op eiwitniveau bleek een 20- tot 30-voudige verhoging van 7B2 op te treden. Deze verhoging werd aangetoond met Northern blots (RNA) en immunoprecipitatie (eiwit). Deze 7B2-overproducerende AtT20 cellen zijn door middel van een analoge transfectie met een eukaryotische expressievector, welke cDNA coderend voor het precursoreiwit proopiomelanocortine bevat, voorzien van de genetische informatie nodig om ze in staat te stellen om het POMC tot expressie te brengen.

Als controle werd de POMC cDNA-bevattende expressievector ook getransfecteerd naar AtT20 cellen die getransfecteerd waren met de expressievector zonder 7B2 cDNA.

De produktie van ACTH door de cellen, die zowel met POMC als met 7B2 waren getransfecteerd, kon met behulp van een ACTH radioimmunoassay worden vergeleken met de ACTH produktie van de alleen met POMC getransfecteerde cellen.

Het recombinante 7B2 eiwit werd, evenals recombinant POMC eiwit, geproduceerd met standaard moleculair-biologische technieken. Voor dit doel werd het 7B2 cDNA gekloneerd in de pro-karyotische expressievector pGEX-2T in-frame achter de sequentie coderend voor glutathion-S-transferase (GST). Allereerst werd de 7B2 cDNA-bevattende kloon pABl opgegroeid en het 7B2 cDNA uit de vector verwijderd door digestie van pABl-DNA met EcoRV en EcoRI. Het 7B2 cDNA-bevattende 0,9 kb EcoRV-EcoRI fragment werd gekloneerd in de Smal-EcoRI sites van de vector pGEX-2T, waarvan eerst de BamHI site was opgevuld om het 7B2 in-frame met het GST te kunnen brengen (figuur 2). Deze kloon werd pGEX-2T-7B2 genoemd. Expressie van deze vector leverde een fusie-eiwit tussen GST en 7B2 dat, na inductie met IPTG, in grote hoeveelheden door E. coli werd geproduceerd. Het fusie-eiwit kon gemakkelijk worden gezuiverd door binding van het GST-7B2 aan glutathion-agarose korrels (Sigma), afdraaien van de korrels in een centrifuge, wegwassen van de E. coli eiwitten door herhaald resuspenderen van de korrels en centrifugeren, en verwijderen van het fusie-eiwit van de korrels door behandeling met een overmaat vrij glutathion (Sigma). Voor het verkrijgen van 7B2 los van GST werd het aan de korrels gebonden fusie-eiwit behandeld met het enzym thrombine dat een specifieke herkenningsplaats heeft tussen GST en 7B2. Daardoor wordt het 7B2 losgeknipt van het GST terwijl het GST aan de agarose-korrels blijft zitten. Het supernatant bevat het zuivere 7B2 .

Analoog werd door klonering van POMC cDNA in de vector pGEX-KG het zuivere POMC verkregen. De vector pGEX-KG is een gemodificeerde versie van de pGEX-2T vector waarin een linker is gebracht met meerdere kloneringsplaatsen (figuur 3). Hiervan werd gebruik gemaakt door een POMC cDNA-bevattende pBluescript kloon, geïsoleerd uit een hypofyse bank, op te groeien en het POMC cDNA uit deze kloon te verwijderen door digestie met EcoRI en Xhol. Dit 1 kb EcoRI-XhoI fragment werd gekloneerd in de EcoRI en Xhol sites van de vector pGEX-KG. Deze kloon werd pGEX-KG-POMC genoemd. Expressie van deze kloon leverde zuiver GST-POMC fusie-eiwit en na klieving met thrombine zuiver POMC.

Met deze eiwitten (7B2 en POMC) kunnen functionele studies worden uitgevoerd, o.a. de interaktie tussen 7B2 en POMC (complex-vorming) worden bestudeerd met gelelectroforese, kolomchromatogra-fie en spectroscopische methoden.

Voor de produktie van 7B2 en POMC in eukaryotische cellen werd de eukaryotische expressievector pECV5-Xho gebruikt. Deze vector met een lengte van 6,8 kb is afgeleid van de vector pECV5 die beschreven is in het artikel "Construction and properties of an Epstein-Barr-virus-derived cDNA expression vector for human cells", P.B.G.M. Belt et al., Gene 84, 407-417 (1989). De SstI knipplaats in de kloneringssite van pECV5 is in de vector pECV5-Xho vervangen door een Xhol knipplaats.

De vector pECV5-Xho bevat de Rous Sarcoma Virus (RSV) promoter gevolgd door kloneringsplaatsen en een β-globine intron en polyadenyleringssignaal voor efficiënte polyadenylering. De RSV promoter is in het algemeen sterk actief en zeker in de gebruikte AtT20 cellen. De pECV5-Xho vector maakt cellen na transfectie resistent tegen het antibioticum hygromycine doordat het binnen de struktuur een hygromycine-resistentie gen heeft.

Een 0,8 kb humaan 7B2 cDNA fragment, coderend voor het volledige eiwit 7B2, werd door digestie met Kpnl en Xhol uit de 7B2 cDNA-bevattende vector pABl geknipt en geligeerd in de Kpnl-Xhol sites van de pECV5-Xho vector. Dit leverde de kloon pECV5-Xho-7B2. Analoog werd een 1,1 kb EcoRI-EcoRI POMC cDNA fragment, coderend voor het volledige POMC eiwit, in de EcoRI site van de vector pECV5-Xho geplaatst in de goede oriëntatie achter de RSV promoter. Dit leverde de kloon pECV5-Xho-POMC. De constructen pECV5-Xho-7B2 en pECV5-Xho-POMC werden getransfecteerd naar AtT20 cellen door electroporatie van 2-15 μg DNA. AtT20 is een tumor-cellijn afgeleid van de hypofyse-achterkwab van de muis. Een dag na de transfectie werd gestart met selectie door incuberen van de cellen in hygromycine-bevattend (80 μg/ml) kweekmedium. Twee weken later konden individuele klonen worden geïsoleerd en deze groeiden uit tot stabiele getransfecteerde AtT20 cellijnen.

Met behulp van Northern blot analyse en immunoprecipitatie met monoclonale en polyclonale antilichamen kon worden vastgesteld dat er een overproductie van 7B2 en POMC plaatsvond in deze cellen, en wel een 20- tot 30-voudige vermeerdering zowel op RNA als eiwitniveau. De transfecties van deze constructen hadden geen invloed op de groeisnelheden van de cellen. Zoals verwacht werd er in de cellen, die met 7B2 cDNA waren getransfecteerd, meer opslag van 7B2 geconstateerd hetgeen er op wijst dat meer 7B2 naar de gereguleerde route is gegaan; dit 7B2 zal dus pas de cel verlaten wanneer deze wordt gestimuleerd tot afgifte. Dit werd inderdaad gevonden na stimulatie van de cellen met 5mM 8-Br-cAMP.

Melanotrope cellen van de pars intermedia van de hypofyse zijn cellen die het prohormoon POMC gecoördineerd met het 7B2 tot expressie brengen, d.w.z. wanneer POMC verhoogd tot expressie komt, zal ook 7B2 in verhoogde mate worden aangemaakt. Voor de bestudering van de mogelijkheid dat 7B2 een heat-shock eiwit is, werden melanotrope cellen van de hypofyse van de klauwpad Xenopus laevis geïncubeerd bij de normale incubatie-temperatuur van deze cellen (namelijk 21°C) en een zelfde hoeveelheid cellen bij 30°C (heat-shock) gedurende een uur in de aanwezigheid van [3H]-lysine. De hoeveelheid geproduceerde POMC was ongeveer gelijk in de beide cellen, maar in de heat-shock cellen werd beduidend meer 7B2 (ongeveer vijf maal meer) aangemaakt; het geproduceerde 7B2 eiwit werd specifiek aangetoond met een monoclonaal antilichaam tegen 7B2. Dit laat zien dat 7B2 inderdaad een heat-shock eiwit is.

In de heat-shock cellen kon tevens de produktie van andere eiwitten met een molekuulgewicht van 60-90 kDa worden waargenomen; deze 60-90 kDa eiwitten corresponderen waarschijnlijk met bekende heat-shock eiwitten (onder andere BiP, een 70 kDa eiwit, en chaperonine-60). In de controle cellen waren deze eiwitten niet waarneembaar.

Volgens een op zichzelf bekende synthese techniek zijn stukken synthetisch enkelstrengs DNA (oligonucleotiden), gericht tegen de nucleotidesequentie van het eiwit-coderende gedeelte van 7B2 mRNA (d.w.z. 7B2 antisense oligonucleotiden), gemaakt. Deze antisense oligo's kunnen worden gebruikt om de translatie van het 7B2 mRNA tot 7B2 eiwit in de cel te blokkeren: doordat het antisense bindt aan het mRNA kan het eiwit niet worden afgelezen of wordt het RNA afgebroken in de cel door specifieke RNases. Aldus kan worden bestudeerd wat voor invloed deze blokkering van de produktie van 7B2 heeft op de produktie van biologisch aktieve stoffen.

Claims (12)

1. Werkwijze voor het produceren van een bioactief peptide door recombinante cellen te kweken, die door middel van genetische manipulatie voorzien zijn van genetische informatie coderend voor een precursor van het bioactieve peptide en in staat zijn om deze precursor tot expressie te brengen, met het kenmerk, dat cellen worden gekweekt die door middel van genetische manipulatie tevens voorzien zijn van genetische informatie welke de cellen in staat stelt om het eiwit 7B2 tot expressie te brengen, waarbij de cellen de precursor van het bioactieve peptide tot expressie brengen en zodanig bewerken dat het bioactieve peptide, eventueel na stimulering van de cellen tot afgifte, wordt uitgescheiden, en het door de cellen uitgescheiden bioactieve peptide wordt gewonnen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat cellen worden gebruikt die door middel van genetische manipulatie voorzien zijn van genetische informatie welke de cellen in staat stelt om humaan 7B2 tot expressie te brengen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat eukaryotische cellen worden gebruikt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat eukaryotische cellen met een gereguleerd eiwittransport worden gebruikt.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het bioactieve peptide gekozen wordt uit de groep peptide hormonen, neuropeptiden, groeifactoren en stollingsfactoren.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het bioactieve peptide een peptide hormoon of een neuropeptide is.

7. Recombinante cellen die door middel van genetische manipulatie voorzien zijn van genetische informatie coderend voor een precursor van een bioactief peptide en in staat zijn om deze precursor tot expressie te brengen, met het kenmerk, dat de cellen door middel van genetische manipulatie tevens voorzien zijn van genetische informatie welke de cellen in staat stelt om het eiwit 7B2 tot expressie te brengen, waarbij de cellen in staat zijn om de precursor van het bioactieve peptide tot expressie te brengen en zodanig te bewerken dat het bioactieve peptide, eventueel na stimulering van de cellen tot afgifte, wordt uitgescheiden.

8. Cellen volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat ze door middel van genetische manipulatie voorzien zijn van genetische informatie welke ze in staat stelt om humaan 7B2 tot expressie te brengen.

9. Cellen volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het eukaryotische cellen zijn.

10. Cellen volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het eukaryotische cellen met een gereguleerd eiwittransport zijn.

11. Cellen volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het bioactieve peptide gekozen wordt uit de groep peptide hormonen, neuropeptiden, groeifactoren en stollingsfactoren.

12. Cellen volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het bioactieve peptide een peptide hormoon of een neuropeptide is.