NL9300976A

NL9300976A - Werkwijze voor het wijzigen van de kinetiek van een reactie waarbij ten minste een macromolecuul is betrokken waarbij men het macromolecuul behandelt met elektromagnetische energie, toepassing van deze werkwijze voor het optimaliseren van processen waar het macromolecuul bij is betrokken en een macromolecuul met gewijzigde reactiviteit.

Info

Publication number: NL9300976A
Application number: NL9300976A
Authority: NL
Original assignee: Inst Voor Agrotech Onderzoek
Priority date: 1993-06-07
Filing date: 1993-06-07
Publication date: 1995-01-02

Description

Werkwijze voor het wijzigen van de kinetiek van esn reactie waarbij ten minste een macromolecuul is betrokken waarbij men het macromolecuul behandelt met elektromagnetische energie, toepassing van deze werkwijze voor het optimaliseren van processen waar het macromolecuul bij is betrokken en een macromolecuul met gewijzigde reactiviteit.

Gebied van de uitvinding

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het onder invloed van elektromagnetische energie wijzigen van de kinetiek van een reactie waarbij ten minste een macromolecuul is betrokken. De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op toepassing van deze werkwijze voor het optimaliseren van processen waarbij het macromolecuul is betrokken. Tevens heeft de uitvinding betrekking op een macromolecuul met gewijzigde reactiviteit, welke gewijzigde reactiviteit is teweeggebracht onder invloed van elektromagnetische energie. Ook heeft de uitvinding betrekking op toepassing van een dergelijk molecuul in chemische en/of biologische processen.

Achtergrond informatie

De effecten van elektromagnetische golven in het micro-golffrequen-tiegebied en van elektromagnetische golven in het radiofrequentiegebied op materialen en in het bijzonder biologische materialen zijn gedurende de afgelopen halve eeuw veelvuldig onderzocht. Tevens is gekeken naar thermische en eventuele niet thermische effecten van behandeling van biologisch materiaal met elektromagnetische energie.

Er is onderzoek verricht naar activiteitsverandering van microorga-nismen en activiteitsverandering van afzonderlijke eiwitten onder invloed van behandeling met elektromagnetische energie. De eiwitten werden onderzocht omdat zij met name voor vele processen bij levende wezens essentieel zijn.

Inactivatie van eiwitten

Thermische inactivatie van eiwitten met behulp van microgolven

Gevonden werd dat, wanneer inactivatie van eiwitten plaatsvond na behandeling met elektromagnetische energie, deze inactivatie te wijten was aan thermisch geïnduceerde inactivatie, d.w.z. inactivatie door verhitting. Er was geen sprake van directe effecten van de gebruikte microgolven. Met directe effecten worden specifieke effecten van elektromagnetische energie bedoeld, die niet enkel aan temperatuurstijging te wijten zijn (Belkhode et al., 197*1; Henderson et al., 1975; Ward et al., 1975; Yeargers et al., 1975; Allis en Fromme, 1979 en Galvin et al., 1981).

Zo vonden Henderson et al. aanzienlijke inactivatie van mieriks-wortelperoxidase na behandeling met elektromagnetische golven met een frequentie van 2450 MHz bij 25 eC, echter onder omstandigheden waarbij het optreden van temperatuurgradiënten in de monster niet kon worden uitgesloten.

Borchers et al., 1972; Pour-El et al., 1981 en Nelson et al., 1981 vonden dat de trypsineremmer in sojabonen kon worden geïnactiveerd na verhitting met behulp van microgolven onder toepassing van de vocht die van nature in sojabonen aanwezig is om hetzelfde resultaat te leveren als bij het gebruikelijke verhittingsproces met vocht. Wederom betreft deze werkwijze een inactivatie die te wijten is aan het thermische effect van de bestraling met elektromagnetische energie. Hetzelfde werd geconstateerd voor het eiwit lipoxygenase. Peroxidase bleek zelfs in het geheel tegen genoemde behandeling bestand en kon niet worden geïnactiveerd.

In de Nederlandse octrooiaanvrage 8702338 wordt een werkwijze voor het laten verlopen van (bio)chemische of (micro)biologische reacties onder toepassing van microgolven beschreven, waarbij men de temperatuurstijging beperkt, zodat fysiologische grenzen niet worden overschreden, d.w.z. de temperatuur niet hoger wordt dan 40-80 °C, zodat het preparaat niet te veel beschadiging oploopt. Het betreft hier in het bijzonder reacties in bloed en speeksel. Wederom is het thermische aspect van de behandeling met elektromagnetische straling nodig voor het beoogde effect.

IFT, 19895 Dietrich et al, 1970; Huxsoll et al., 1970 en Decareau, 1985. laten zien dat blancheren van groente en fruit onder toepassing van elektromagnetische energie geen aanwijsbare niet-thermische effecten leek te geven in vergelijking met het normale blancheerproces met stoom. Wederom betreft het hier de thermische gevolgen van elektromagnetische straling.

Thermische inactivatie van eiwitten met behulp van radiogolven

Senter et al., 1984 vonden dat behandeling van pecanen met elektromagnetische straling van 43 MHz in combinatie met stoombehandeling gedurende respectievelijk 1 è 2 minuten en 4 minuten effectief was bij het stabiliseren van de smaak gedurende opslag.

Niet thermische inactivatie van eiwitten

Er is ook gekeken naar de effecten van behandeling van eiwitten met elektromagnetische energie onder niet-thermische omstandigheden. Hoewel athermische effecten van microgolven in de literatuur zijn gesuggereerd, lijken de enige resultaten van interacties met voedingsmiddelen het gevolg te zijn van verhitting (Mertens en Knorr, 1992; IFT, 1989)· Tot heden is het niet gelukt activiteitsverandering van een eiwit te constateren na bestraling met elektromagnetische energie onder omstandigheden die aangeven dat de verandering specifiek aan de elektromagnetische energie te wijten is en niet bijvoorbeeld het gevolg is van thermische effecten van de bestraling.

Niet thermische inactivatie van eiwitten met behulp van radiogolven

Weliswaar hebben Bach, Luzzio en Brownell na bestraling met elektromagnetische energie met een frequentie van 13 MHz gamma-globuline met andere elektroforetische mobiliteit dan natieve gamma-globuline gevonden en hebben zij een verlaagde activiteit van alfa-amylase waargenomen na behandeling met elektromagnetische energie, maar geven zij zelf aan dat deze effecten waarschijnlijk niet alleen aan elektromagnetische energie te wijten zijn aangezien de energie te laag is om chemische bindingen aan te tasten.

Takashima, 1966, heeft de gevolgen van behandeling van alcohol-dehydrogenase en DNA met elektromagnetische energie met een frequentie van 60 MHz onderzocht. Hij constateerde dat zelfs langdurige behandeling met frequenties tussen 1-60 MHz niet tot activiteitsverandering leidde wanneer de gevolgen van verhitting werden voorkomen. Indien de maatregelen ter voorkoming van verhitting niet werden getroffen constateerde hij daarentegen wel een verlaagde activiteit. Takashima concludeerde derhalve slechts een thermisch effect voor elektromagnetische straling met radiofrequenties.

Beschrijving van de uitvinding

Gevonden is nu dat er een werkwijze bestaat waarbij de kinetiek van een reactie, waarbij een macromolecuul is betrokken, wel degelijk wordt gewijzigd onder toepassing van elektromagnetische energie met een frequentie in het gebied van 0,1-350 MHz onder zodanige omstandigheden dat de matrixtemperatuur nagenoeg constant blijft.

Onder "nagenoeg constant blijft" wordt verstaan: ten hoogste met 1°C varieert.

Onder "matrixtemperatuur" wordt verstaan: de macroscopisch waarneembare temperatuur, in dit geval de temperatuur van het reactiemengsel.

Onder "macromolecuul" wordt verstaan: een molecuul van biochemische of petrochemische oorsprong met een molecuulgewicht boven 2000 Dalton, zoals DNA, polypeptiden, proteïnen, glycoproteïnen, eiwitten, enzymen.

In het bijzonder is de werkwijze geschikt voor het beïnvloeden van macromoleculen die betrokken zijn bij biologische of biochemische processen. In het bijzonder vormen macromoleculen zoals DNA, RNA, eiwitten, enzymen en polypeptiden voorbeelden van te beïnvloeden macromoleculen waarop de werkwijze kan worden toegepast.

Hen kan bewerkstelligen dat de matrixtemperatuur tijdens de behandeling met elektromagnetische energie ongewijzigd blijft door simultaan aan toediening van elektromagnetische energie, het reactiemengsel door circulatie van een koelvloeistof door of rondom het reactiemengsel te koelen, op een dusdanige wijze dat de koelcapaciteit voldoende is (d.w.z. gelijk is aan de opwarmsnelheid) en het koelmedium de elektromagnetische energie niet of nauwelijks absorbeert.

In het bijzonder is gevonden dat verandering van de kinetiek van een reactie, waarbij een macromolecuul is betrokken, reversibel wordt gewijzigd tijdens toepassing van elektromagnetische energie met een frequentie in het gebied van 0,1-350 MHz onder zodanige omstandigheden dat de matrixtemperatuur nagenoeg constant blijft. Na beëindiging van de behandeling met elektromagnetische energie wordt dezelfde activiteit van het macromolecuul geconstateerd als voor de behandeling met elektromagnetische energie.

Het was bekend dat de interactie van een wisselend elektromagnetisch veld met een medium van bijvoorbeeld eiwitten in een waterige oplossing sterk afhangt van de diëlektrische eigenschappen van het medium. Een diëlektrische dispersiecurve, die karakteristiek is voor een biologische oplossing wordt weergegeven in figuur 1. Een dergelijke curve kan worden onderverdeeld in drie afzonderlijke dispersiezones. Een zone geeft de B-dispersie frequentie weer, welke B-dispersie wordt veroorzaakt door de rotatie van het molecuul als geheel en tussen enkele kHz en 100 MHz optreedt (Grant et al., 1978). Deze B-dispersie wordt ook de relaxatie van het molecuul genoemd en kan worden benaderd met de Debye-theorie, die hieronder nader wordt uiteengezet.

De tweede dispersiezone (figuur 1) wordt weergegeven bij de frequenties waarbij relaxatie van gebonden water en andere zijgroepen van het molecuul optreden en wordt de δ-dispersie genoemd.

De derde dispersiezone, de τ-dispersie, treedt op bij de frequentie van het vrije water, te weten bij een frequentie van 17 GHz.

Het was eveneens bekend dat de rotatie-relaxatietijd van een molecuul als geheel kan worden uitgerekend. Hierbij wordt van de volgende veronderstellingen uitgegaan. Elk molecuul beschikt volgens de theorie van permanente dipoolrotatie over een permanente dipool die in een elektrisch veld een oriënterende kracht van dat veld ondervindt. In een wisselend elektrisch veld, waarvan de frequentie boven de fluctuatiesnel-heid van de Brown-beweging van de moleculen komt, zal polarisatie plaatsvinden omdat de moleculen onvoldoende tijd hebben om zich te heroriënteren, waardoor een val in permitiviteit optreedt (Grant, 1978)· Met behulp van de theorie van Debye uit 1929 kan een benadering van de rotatie-relaxatietijd voor een bolvormig molecuul en voor een ellipsvormig molecuul worden gegeven. Uit de rotatie-relaxatietijd kan op simpele wijze de relaxatiefrequentie worden uitgerekend (Grant et al., 1978; Pethig, 1979)· Hieronder worden de benodigde formules voor deze berekening gegeven.

Wanneer het molecuul wordt beschouwd als een bol met een straal a en de oplossing een viscositeit η heeft, dan kan de relaxatietijd worden beschreven met:

of voor een meer ellips-vormig molecuul:

t = relaxatietijd [S] a = straal (m3); (b idem) η = viscositeit (Pa.s) u = const, van Boltzmann (J/k) T = temperatuur (°K)

Met behulp van deze gegevens is het mogelijk de werkwijze volgens de uitvinding met voordeel uit te voeren. Na berekening van de Debye-frequentie van het met de werkwijze volgens de uitvinding te beïnvloeden macromolecuul op de wijze die hierboven is uiteengezet, kan men een geschikt frequentiegebied voorspellen, waarbinnen interactie met het te beïnvloeden molecuul zal plaatsvinden onder invloed van elektromagnetische energie die de berekende molecuulspecifieke relaxatiefrequentie omvat. Bij de berekening van dit specifieke frequentiegebied kan men de te beïnvloeden molecuulsoort benaderen als een bol of ellips. Men kan voor beide vormen de frequentie uitrekenen en elektromagnetische energie toepassen die ten minste de twee berekende waarden en daartussen gelegen waarden van frequenties omvat. Door bestraling binnen dit specifieke frequentiegebied zal het molecuul als geheel of zullen delen van het molecuul specifieke interactie vertonen met het aangebrachte elektromagnetische veld en zal het molecuul specifiek energie absorberen. Het gaat hier om een relaxatiemechanisme, hetgeen in tegenstelling tot resonantie-verschijnselen een breedbandig verschijnsel is.

Met de werkwijze volgens de uitvinding kan men een reversibele of een irreversibele verandering in de kinetiek van een reactie aanbrengen, waarbij het te beïnvloeden of het beïnvloede macromolecuul betrokken is. Het resultaat van de behandeling van het macromolecuul met de elektromagnetische energie hangt af van de hittestabiliteit en grootte van het te beïnvloeden macromolecuul.

Een irreversibele verandering kan worden aangebracht indien onder invloed van rotatie ten gevolge van de aangebrachte elektromagnetische bestraling denaturatie plaatsvindt. Tot heden was men ervan uitgegaan dat denaturatie enkel mogelijk was ten gevolge van de thermische effecten die optraden.

Conformatieverandering van een eiwit (denaturatie bijv.) is niet alleen afhankelijk van de externe krachten die op het molecuul worden uitgeoefend, maar ook van de interne structuur van het eiwit (veel zwavelbruggen, en starre structuur). Grote eiwitten die vaak relaxatie-frequenties rond 1 GHz bezitten, hebben vaak een wat lossere structuur en zullen gemakkelijker te denatureren zijn. Dit blijkt vaak ook al uit het feit dat dergelijke grote moleculen minder hittestabiel zijn dan de kleinere compacte moleculen.

De kinetiek van een reactie waarbij een hittestabiel molecuul is betrokken, zal onder toepassing van de onderhavige werkwijze eerder reversibel worden gewijzigd dan irreversibel. De kinetiek van reacties waarbij grote moleculen betrokken zijn, zal onder toepassing van de onderhavige werkwijze eerder irreversibel dan reversibel beïnvloed worden, waarbij men elektromagnetische energie die de bijbehorende Debye-frequentie omvat, toepast. De werkwijze volgens de uitvinding zal bij kleine compacte moleculen die bij hogere frequenties relaxeren, reversibele verandering van de kinetiek geven wanneer elektromagnetische energie met de bijbehorende Debye-frequentie wordt toegepast, in het bijzonder bij toepassing van een frequentiegebied tussen 0,2-80 MHz.

Een eiwit met een molecuulgewicht boven 120.000 Dalton zal eerder irreversibel dan reversibel kunnen worden gewijzigd onder toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding.

De werkwijze volgens de uitvinding kan worden toegepast in processen waarbij selectief de kinetiek van een reactie met een reactant of component van biologische of petrochemische oorsprong als participant moet worden gewijzigd. De wijziging kan een activering maar ook een inactivering van het desbetreffende bestanddeel omvatten.

Men kan met de werkwijze volgens de uitvinding selectief ongewenste eiwitten, eiwitremmers of microorganismen inactiveren. Dit kan in het bijzonder bij de verwerking van produkten van natuurlijke oorsprong zoals bij de voedingsmiddelenindustrie. Uiteraard is een dergelijke toepassing ook bij processen waarbij geen voedingsmiddelen zijn betrokken eveneens mogelijk.

In principe kan de werkwijze volgens de uitvinding in elk proces waarbij een macromolecuul is betrokken, met voorkeur een proces waarbij thermische effecten nadelig zijn en vermeden dienen te worden, worden toegepast. Met name de werkwijze waarbij irreversibel een wijziging in de kinetiek kan worden aangebracht zonder de tot heden noodzakelijke bijkomende thermische effecten, is voordelig.

Eveneens kan men bepaalde eiwitten selectief activeren om gewenste reacties te laten verlopen onder omstandigheden, waarbij tot dusver dergelijke reacties niet verliepen. Men kan reacties sneller en/of effectiever laten verlopen. Men kan bijvoorbeeld voorkomen dat bepaalde ongewenste nevenreacties optreden.

Met de werkwijze volgens de uitvinding wordt het tevens mogelijk tijdelijk een bepaalde component specifiek te activeren of inactiveren. De aard en duur van een dergelijke reversibele inactivatie of activatie kan nauwkeurig worden gereguleerd door de behandeling met elektromagnetische energie op het juiste moment aan te vangen en zolang de activatie of inactivatie gewenst is uit te voeren en door de keuze van de frequentie waarmee de behandeling wordt uitgevoerd af te stemmen op het te beïnvloeden macromolecuul of macromoleculen.

Met de werkwijze volgens de uitvinding wordt een krachtig middel aangereikt om niet alleen biochemische reacties maar ook anorganische en organische reacties te optimaliseren. De werkwijze dient derhalve niet alleen te worden beschouwd als zijnde beperkt tot het aanbrengen van wijzigingen van biologische processen.

De werkwijze volgens de uitvinding kan overigens ook worden toegepast in combinatie met gebruikelijke stappen die thermische effecten teweeg brengen. Men kan bijvoorbeeld bewerkstelligen dat de produktkwali-teit verbetert doordat overbehandeling van het geheel overbodig wordt indien men specifiek de kinetiek van reactie van bepaalde componenten met de werkwijze volgens de uitvinding activeert of inactiveert die gebruikelijk onder meer langdurige of intensieve thermische behandeling, bijvoorbeeld een zeer hoge temperatuur slechts konden worden bereikt, welke hoge temperatuur leidde tot nadelige effecten. De activatie van pectine-esterase, waardoor gewenste versteviging van plantaardig weefsel wordt verkregen zonder het verlies van kleur, geur, smaak en nutriënten, die bij behandeling door middel van temperatuurverhoging optreedt, is hier een voorbeeld van.

In het algemeen kan de werkwijze volgens de uitvinding worden toegepast om de efficiëntie van reacties te verhogen en daarmee samenhangende reactietijden te verkorten, hetgeen resulteert in besparing van tijd en energie. Het wordt ook mogelijk een zuiverder eindprodukt te krijgen omdat nevenprodukten niet worden gevormd. Het is ook mogelijk een hogere opbrengst te realiseren.

In de onderstaande tabel wordt een indicatie gegeven van eiwitten die met behulp van de onderhavige werkwijze een wijziging van de kinetiek kunnen ondergaan. Tevens is aangegeven bij welke processen deze eiwitten i gewoonlijk zijn betrokken en wat de berekende relaxatiefrequentie is.

Onderstaande eiwitten zijn een selectie uit een enorm aantal eiwitten die geschikt zijn voor toepassing in de onderhavige werkwijze. Deze selectie dient niet als een beperking te worden beschouwd van de macromoleculen waarmee de werkwijze kan worden uitgevoerd, i Verder is in de tabel aangegeven op welke wijze de activiteit geme ten kan worden. Dit is met name belangrijk indien men de mate van wijziging in de kinetiek wil volgen en/of wil bepalen.

TABEL 1

De werkwijze volgens de uitvinding kan worden toegepast voor het beïnvloeden van oxidatieve bruinverkleuring in plantaardige produkten tijdens en na verwerking. De werkwijze kan eveneens worden toegepast voor het beïnvloeden van textuurveranderingen tijdens of na verwerking van plantaardige produkten. Ook kan de werkwijze een geschikte toepassing vinden voor het beïnvloeden van het ontstaan van ranzigheid en andere smaak- en geurafwijkingen door vetsplitsing of vetoxidatie in plantaardige produkten tijdens en na verwerking.

De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op een macromolecuul met gewijzigde reactiviteit, dat ontstaat na behandeling met elektromagnetische energie met een frequentie tussen 0,1-350 MHz. In het bijzonder op een macromolecuul met gewijzigde reactiviteit, dat ontstaat na behandeling met elektromagnetische energie met een dergelijk frequen-tiegebied dat ten minste de relaxatiefrequentie omvat.

De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op toepassing van het macromolecuul met gewijzigde reactiviteit in biologische en/of chemische processen. Door toevoeging van het macromolecuul kan het verloop van dergelijke processen gewijzigd worden. In het bijzonder wordt gedacht aan de toepassing in voedselverwerkingsprocessen. Dezelfde soort processen die eerder zijn beschreven waarbij de werkwijze volgens de uitvinding kan worden toegepast zijn geschikt voor wijziging door toevoeging van het macromolecuul met gewijzigde kinetische eigenschappen voor ten minste één reactie volgens de uitvinding.

In het onderhavige voorbeeld is uiteengezet hoe men de wijziging in de kinetiek onder toepassing van de onderhavige werkwijze teweeg kan brengen. Tevens is uiteengezet hoe men kan vaststellen dat er sprake is van een niet-thermische specifieke interactie van de elektromagnetische energie. In het onderhavige voorbeeld is een eiwit toegepast waarvan de kinetiek reversibel gewijzigd wordt met de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding.

Fieruurbeschrilving

Figuur 1 geeft het diëlektrisch spectrum weer van een eiwit in waterige oplossing (Grant 1978). e' is de diëlektrische constante e" is de verliesfactor.

Figuren 2a en 2b illustreren de inactivatiecurves die zijn verkregen voor trypsineremming (2a) en chymotrypsineremming (2b) door verwarming op conventionele wijze () en door middel van behandeling met elektromagnetische energie met radiofrequentie (4).

Figuur 3 geeft de experimentele opzet weer voor toevoer van energie met radiofrequentie bij constante temperatuur (25°C).

1) RF-generator (27 MHz) 2) elektrodeplaten 3) optische vezels voor temperatuurregistratie 4) koeleenheid 5) luchtstroom 6) inrichting voor het nemen van monsters.

Figuur 4a geeft de reactie weer van trypsine met ΒΑΡΑ bij aanwezigheid van BBI; het effect van behandeling met elektromagnetische energie.

onder conventionele omstandigheden (waterbad 25eC); 4 onder invloed van energie met radiofrequentie (25#C).

Figuur 4b geeft de reactie weer van chymotrypsine met BTPA bij aanwezigheid van BBI; het effect van behandeling met elektromagnetische energie.

onder conventionele omstandigheden (waterbad 25°C); 4 onder invloed van energie met radiofrequentie (25°C).

Figuur 4c geeft de reactie weer van trypsine met ΒΑΡΑ bij afwezigheid van BBI; het effect van behandeling met elektromagnetische energie.

onder conventionele omstandigheden (waterbad 25eC); 4 onder invloed van energie met radiofrequentie (25eC).

Figuur 5 geeft aan hoe op diverse tijdstippen de activiteit voor de chymotrypsine/BTPA/BBI-reactie afneemt nadat het monster uit het elektromagnetische veld is genomen.

reactie onder invloed van energie met radiofrequentie (25eC); Δ, ·, D, 4, 0 en ▼ reactie na verwijdering van het monster uit het veld en na plaatsing van het monster in een spectrofotometer bij 25eC.

Figuren 6a en 6b geven aan hoe bij diverse frequenties BBI werd behandeld bij constante temperatuur (25eC) voor trypsineremming (6a) en chymotrypsineremming (6b) en geven ook een vergelijking met behandeling op conventionele wijze.

in elektromagnetisch veld met radiofrequentie ° op conventionele wijze.

VOORBEELD I

1.1. INTERACTIE VAN ELEKTROMAGNETISCHE ENERGIE MET BOWMAN-BIRK PROTEASE-REMMER

In dit voorbeeld is de werkwijze uitgevoerd met een enzym-remmend eiwit, de Bowman-Birk remmer. Er is in situ gekeken naar het effect van elektromagnetische energie met radiofrequentie op het eiwit door het verloop van een enzym-substraat reactie te registreren. BBI werd als voorbeeld gekozen omdat het een klein, compact molecuul is, waarvan de activiteit gedurende de behandeling met elektromagnetische energie met radiofrequentie te volgen is. BBI remt zowel trypsine als chymotrypsine op kinetisch onafhankelijke bindingsplaatsen (Birk Y, 1985)· BBI heeft een molecuulgewicht van 8000 Dalton en bevat 7 disulfidebindingen.

Met behulp van de berekeningswijze die in de beschrijving reeds is uiteengezet, is de relaxatiefrequentie van het molecuul berekend. Uitgaande van de vuistregel dat de straal van een molecuul overeenkomt met de 3 ƒ (0.3 x molecuulgewicht) werd voor BBI een straal van 13.3 A berekend. Vervolgens werd bepaald dat de relaxatiefrequentie voor een ellipsvormig molecuul waarbij a=10 en b=l4, 26 MHz bedraagt en voor een bolvormig molecuul met a=12 30 MHz bedraagt. In dit model is uitgegaan van de veronderstelling dat de dipolaire moleculen in oplossing beschouwd kunnen worden als bollen waarvan de rotatie wordt tegengegaan door de viscositeit van het omringende oplosmiddel.

Voor BBI werd dus bepaald dat de rotatierelaxatiefrequentie ligt rond 2Ο-3Ο MHz. Vervolgens is een proef uitgevoerd waarbij werd vastgesteld dat energie met radiofrequentie geen directe niet-thermische irreversibele werking heeft op inactivatie van de Bowman-Birk remmer. De mate van inactivatie werd vergeleken met de conventionele inactivatie door verwarming.

In fig. 2a en 2b worden de inactivatiecurves geïllustreerd die zijn verkregen voor trypsineremming (2a) en chymotrypsineremming (2b) door zowel verwarming op conventionele wijze als door middel van behandeling met elektromagnetische energie met radiofrequentie.

De mate van inactivatie van BBI vertoont geen significante verschillen tussen de toegepaste wijze van verwarming. De remmende activiteit van chymotrypsine schijnt meer gevoelig te zijn voor verwarming dan trypsineremming aangezien de totale mate van inactivatie hoger ligt. Er is geen significant additioneel effect van energie met radiofrequentie op inactivatie van BBI waar te nemen. BBI is een voorbeeld van een zeer hittestabiel eiwit, in het bijzonder in waterige oplossing (DiPietro en Liener, 1989)

Bij deze proef werd een oplossing van 45 mg uit de sojaboon afkomstige Bowman-Birk remmer (Sigma) opgelost in 450 ml demi water (125pm) en gedurende 9 uur bij 90°C verwarmd. Bij de verwarming door middel van elektromagnetische energie met radiofrequentie werd de mate van verwarming geregeld door regeling van het vermogen (op 168 mW/cm3). De houder waarin zich het preparaat bevond, was rechthoekig van vorm met bijpassende elektroden, die zodanig waren gevormd dat de verdeling van het elektrisch veld in het preparaat homogeen kan worden geacht. Het preparaat werd continu geroerd door lucht door de houder te voeren. Temperatuur-registratie werd op vier verschillende plaatsen in het preparaat uitgevoerd onder toepassing van vier optische vezels (Luxtron), De mate van verwarming bleek bij de vier plaatsen identiek te zijn. Parallel-experi-menten met een conventionele verwarmingsbron werden uitgevoerd door identieke tijd-temperatuurbehandelingen van de BBI-oplossing onder toepassing van een elektrische kookplaat uit te voeren. Verdamping werd zowel bij de verwarmingsexperimenten op conventionele wijze als met energie met radiofrequentie geregeld door condensatie door een buis. In beide gevallen werden elk uur monsters van 1 ml verwijderd en onmiddellijk in vloeibaar stikstof ingevroren. De remmende werking van deze monsters werd onder toepassing van een aangepaste test volgens Kakade et al. (1974) onderzocht.

1.2. REVERSIBELE EFFECTEN VAN ENERGIE MET RADIOFREQUENTIE VAN 27 MHz OP BBI.

Om de effecten op de functionele eigenschappen van BBI te volgen, werd de remmende werking in situ geregistreerd. Hiertoe werd het effect van energie met radiofrequentie op de remming van respectievelijk de reactie tussen trypsine en chymotrypsine met hun substraten ΒΑΡΑ en BTPA vergeleken. De mate van remming door BBI werd bepaald door de hoeveelheid produktvorming, in casu p-nitroaniline, te volgen, welke produktvorming gevolgd kan worden door meting van absorptietoename bij 386 nm.

Het totale volume van het reactiemengsel bedroeg 450 ml. Enzym-, substraat- en remmeroplossingen werden aan een waterige bufferoplossing toegevoegd (0,05 M TRIS, 0,02 M CaCl2, pH 8,2). De uiteindelijke concentratie van BBI was 4,75 10"8 M bij trypsineremming en 2,0 ΙΟ-7 M bij chymotrypsineremming. Dit komt overeen met een remming van ongeveer 50%. De enzymconcentraties bedroegen 8,45 10'8 M voor trypsine en 3·0 10"7 M voor chymotrypsine. Voor de trypsinetest werd ΒΑΡΑ met uiteindelijke concentratie 5»7δ 10'4 M toegepast. Voor reactie met chymotrypsine werd 8,15 10'3 M BTPA toegepast (substraatdepletie).

De toegepaste chemicaliën TRIS (hydroxymethyl)-aminomethaan, CaCl2, trypsine afkomstig van runderpancreas, chymotrypsine afkomstig van run-derpancreas, ΒΑΡΑ (benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline-waterstofchloride) werden verkregen van Merck; Bowman-Birk-remmer afkomstig uit de sojaboon werd van Sigma verkregen en BTPA (benzoyl-L-tyrosyl-p-nitroaniline) werd van Boehringer verkregen.

Voor de uitvoering van de experimenten met behulp van elektromagnetische radiofrequentie werd het reactiemengsel tussen twee elektrode-platen gebracht van een radiofrequentie-eenheid (27 MHz).

In figuur 3 wordt de experimentele opzet uiteengezet. Een volume van 450 ml werd bestraald, terwijl continu werd gekoeld door demiwater van ongeveer leC door een teflonspiraal te circuleren. Demiwater werd toegepast om koppeling van de energie met radiofrequentie aan het koe-lingsmedium in plaats van met het preparaat te voorkomen. De temperatuur werd met vier optische vezels op verschillende plaatsen in de oplossing gevolgd. Het vermogen werd calorimetrisch berekend op 270 mW/g. Het preparaat werd geroerd door middel van een luchtstroom. Het effect van de energie met radiofrequentie op BBI-remming van trypsine en chymotrypsine werd in parallelexperimenten onderzocht. Omdat eerder onderzoek van van Liu en Markakis, 1989 en Meijer, 1991 hadden aangetoond dat er een effect van de mengvolgorde van reactanten kan plaatsvinden bij enzymremmeracti- viteit zijn in dit experiment twee verschillende voorschriften voor het mengen van reactanten toegepast: S-laatst en E-laatst.

In het geval van de S-laatst-experimenten worden enzym en remmer vantevoren geïncubeerd en wordt substraat als laatste toegevoegd; in het geval van E-laatst worden substraat en remmer van tevoren geïncubeerd en wordt enzym als laatste toegevoegd.

De reactie werd als volgt uitgevoerd: 1 ml BBI in demiwater werd aan 354 nil TRIS-buffer toegevoegd. In het geval van de S-laatst experimenten werd 4,5 ml (chymo)trypsine-oplossing in demiwater toegevoegd en werd het monster in het elektromagnetische veld geplaatst. In het geval van de E-laatst-experimenten werden 4,5 ml ΒΑΡΑ of BTPA in DMSO aan de TRIS-buffer toegevoegd voordat de oplossing in het elektromagnetische veld werd geplaatst. Mate van verwarming en mate van af koelen werden in evenwicht gebracht en de temperatuur werd bij 25eC + 0,5eC gehouden. Na een incubatieperiode van 5 minuten werd de laatste reactant hetzij BAPA/BTPA in het geval van S-laatst of (chymo)trypsine (E-laatst) toegevoegd door een buis in het monster dat in het elektromagnetische veld was geplaatst. De reactie werd spectrofotometrisch gevolgd door de absorptie bij 386 nm te meten van monsters die elke twee minuten uit de oplossing werden genomen. De reactie werd na exact 20 minuten beëindigd door toediening van 25 ml azijnzuur. De absorptie van het totale reactiemengsel werd eveneens bij 386 nm gemeten.

Bij de experimenten onder conventionele omstandigheden werden dezelfde reactieomstandigheden als bij de test met elektromagnetische energie van radiofrequentie toegepast. De monsters werden in de rechthoekig gevormde houders bewaard in een waterbad van 25eC. Temperatuurregeling en roeren werden op identieke wijze uitgevoerd.

Zowel de test met elektromagnetische energie als op conventionele wijze werd uitgevoerd bij afwezigheid van de Bowman-Birk-remmer als controle. Alle experimenten werden uitgevoerd met zes experimentele eenheden: 1. elektromagnetische energie met radiofrequentie - substraat als laatste toegevoegd (RF - S-laatst) 2. conventioneel - substraat als laatste toegevoegd (C - S-laatst) 3. elektromagnetische energie met radiofrequentie - enzym als laatste toegevoegd (RF - S-laatst) 4. conventioneel - enzym als laatste toegevoegd (C - E-laatst) 5. elektromagnetische energie met radiofrequentie - geen toegevoegde remmer (RF - blanco) 6. conventioneel - geen toegevoegde remmer (C - blanco)

De zes experimenten werden op dezelfde dag in willekeurige volgorde uitgevoerd. Elke experimentele eenheid werd viermaal uitgevoerd.

De enzymactiviteiten (d abs/min) waren in alle gevallen lineair. Analyse van de variatie werd uitgevoerd om de gegevens van de reactiesnelheden te vergelijken (a=0,05).

In figuur 4a (trypsineremming), 4b (chymotrypsineremming) en 4c (blanco toestand voor trypsine-activiteit; geen BBI aanwezig) worden kenmerkende grafieken van reactiesnelheden onder omstandigheden van verwarming door middel van elektromagnetische energie met radiofrequentie en onder gebruikelijke omstandigheden getoond. Activiteit wordt uitgedrukt als de toename in absorptie bij 306 nm gedurende 20 minuten reactietijd. De lineaire aard van de reactie met de tijd van de testen wordt getoond (R2 is 0,99 - 1.0).

In tabel 2 wordt een samenvatting gegeven van reactiesnelheden van de trypsine- en chymotrypsinetesten die berekend zijn uit de grafieken. De effecten van de volgorde van toediening van substraat en enzym (S-laatst en E-laatst) en radiofrequentie/conventionele energie worden getoond .

In het geval van trypsineremming wordt een verbeterde vorming van het reactieprodukt gevonden onder toepassing van elektromagnetische energie van radiofrequentie wanneer het enzym als laatste wordt toegevoegd; (RF - E-laatst).

De reactiesnelheid is ongeveer 1,3-1,5 maal hoger dan bij de controle. Verbeterde vorming van het reactieprodukt p-nitroaniline wijst op verlaagde remmende activiteit van BBI.

Het fenomeen dat geen hogere absorptie wordt gevonden onder toepassing van elektrische energie met radiofrequentie, wanneer het substraat als laatste wordt toegevoegd (RF - S-laatst), wordt verklaard door het feit, dat in dit geval een zeer snelle en stabiele complexvorming tussen enzym en remmer optreedt. Dit complex kan niet worden ontbonden onder invloed van het wisselend elektromagnetisch veld. Wanneer BBI vrij aanwezig is in de oplossing, zal het eiwit proberen de richting van het wisselende veld te volgen. Het molecuulgewicht van BBI is voldoende laag om de wisselingsfrequentie te volgen. De verlaagde remming kan worden verklaard door het feit dat BBI onder invloed van het veld beweegt en hierdoor koppeling van het enzym dat volgens een nauwkeurig slot-sleutelmechanisme verloopt, verhindert. Chymotrypsineremming wordt in beide gevallen beïnvloed door het veld met radiofrequentie, zowel wanneer het substraat als laatste wordt toegevoegd (RF - S-laatst) als wanneer het enzym als laatste wordt toegevoegd (RF - E-laatst). De reactiesnelheid neemt ongeveer 1,5-1.6-voudig toe. In het geval van chymotryp-sineremming werd geen invloed van mengvolgorde van reactanten gevonden, evenals Meijer in 1991 had bepaald. De complexvorming van chymotrypsine en BBI is waarschijnlijk gedeeltelijk reversibel. Er wordt geen aanzienlijke verandering in de reactiesnelheid van het enzym waargenomen onder invloed van elektromagnetische energie met radiofrequentie in de controle-experimenten waarbij BBI ontbreekt (RF - blanco en C - blanco). Dit wijst op directe koppeling van energie met radiofrequentie met BBI-eiwit.

TABEL 2

A. TRYPSINE-REMMING

B. CHYMOTRYPSINE-REMMING

1.3. HERSTEL VAN ACTIVITEIT NA TOEDIENING VAN ENERGIE MET RADIOFREQUENTIE Om aan te tonen dat de hierboven aangegeven koppeling een reversibel effect had op de remmende werking is het herstel van activiteit na behandeling met energie met radiofrequentie gemeten.

Figuur 5 toont hoe op diverse tijdstippen de activiteit voor de chymotrypsine/BTPA/BBI-reactie afneemt nadat het monster uit het elektromagnetische veld is genomen. Dit toont duidelijk aan dat de interactie van energie met radiofrequentie en het eiwit een reversibel effect geeft.

Om te demonstreren dat koppeling van energie met radiofrequentie resulteert in reversibele effecten op BBI-activiteit werd herstel van BBI-activiteit gemeten. Hetzelfde reactiemengsel als reeds is beschreven onder 1.2 werd toegepast. BBI-activiteit op chymotrypsinereactie met BTPA werd gevolgd. Energie met radiofrequentie werd aan het reactiemengsel toegediend dat evenals bij proef II bij 25*0 +/- 0,5*C werd gehouden. Monsters werden elke 2 minuten uit het reactiemengsel genomen en onmiddellijk bij 386 nm spectrofotometrisch onderzocht. Daarna werd op elk tijdstip hetzelfde monster in een andere spectrofotometer bij 25 *C geplaatst en werden de reactiesnelheden gedurende 20 minuten continu gemeten.

1.4. REVERSIBELE EFFECTEN VAN ENERGIE MET RADIOFREQUENTIES TUSSEN 0,1-2450 MHz

Analoog aan hetgeen in Voorbeeld 1.2 is beschreven, werd BBI behandeld met verschillende frequenties gelegen tussen 0,1-2450 MHz. De toegepaste versie is E-laatst uit voorbeeld 1.2. Teneinde de invloed van radiogolven van verschillende frequenties op de activiteit van de Bowman-Birk-remmer te onderzoeken, is energie met frequenties tussen 0,2 en 300 MHz toegevoerd aan het reactiemengsel dat onderwijl werd gekoeld en geroerd (Voorbeeld 1.2). Het reactievolume bedroeg hier echter 20 ml in plaats van 450 ml. De verhouding van de verschillende reactanten is hierbij echter gelijk gebleven aan die van Voorbeeld 1.2. Op dezelfde wijze zijn eveneens proeven uitgevoerd waarbij behandeld is met 2450 MHz (in een huishoudmicrogolfoven). De reactiesnelheid is gemeten en de resultaten op trypsineremming staan in fig. 6a en die op chymotrypsineremming staan in fig. 6b. Hieruit kan worden geconcludeerd dat de toename van reactiesnelheid onder invloed van toediening van energie met radiofrequentie over een vrij breed frequentiegebied optreedt. Een maximum effect kan worden waargenomen tussen 0,2 en 80 MHz. Bij hogere frequenties neemt de reactiesnelheid een niveau aan dat vergelijkbaar is met die van het referentiemonster waar geen energie met radiofrequentie is toegediend .

I. 5. EFFECT VAN VERMOGEN VAN TOEGEDIENDE ENERGIE OP ACTIVITEITVERANDERING

De invloed die de hoeveelheid toegevoerd vermogen heeft op BBI is met dezelfde variabele-frequentie-opstelling en op dezelfde wijze als in Voorbeeld IΛ is beschreven, bepaald. Er is gewerkt met een frequentie van 27 MHz en de hoeveelheid ingevoerd vermogen is op drie niveaus onderzocht. Uit figuur 7& voor trypsineremming en 7b voor chymotrypsineremming is af te leiden, dat een toename in toegediend vermogen leidt tot een verhoogde reactiesnelheid. De temperatuur werd constant gehouden, zodat de waargenomen resultaten duiden op een toenemende mate van interactie van de energie met radiofrequentie met het enzym BBI.

VOORBEELD II.

II. 1. INTERACTIE VAN ELEKTROMAGNETISCHE ENERGIE MET KUNITZ-TRYPSINE-REMMER (KTR).

Analoog aan de werkwijze van Voorbeeld I is de werkwijze volgens de uitvinding toegepast op KTR, waarbij de toegepaste frequentie 1 MHz bedroeg. In dit experiment is enkel gekeken naar reversibele effecten bij 1 MHz. De reactiesnelheid van trypsine en ΒΑΡΑ is gemeten zowel bij aanwezigheid als afwezigheid van de Kunitz-proteaseremmer volgens de werkwijze van Voorbeeld I. Hierbij werd eveneens veranderde reactiesnelheid waargenomen. De waarnemingen staan vermeld in Tabel 3· Reactiesnelheden van trypsine, ΒΑΡΑ en Kunitz-remmer, 20 minuten bij 25*C (dA 386 /min).

TABEL 3

Uit de resultaten valt af te leiden dat toediening van energie met radiofrequentie een verhoging van de reactiesnelheid tot gevolg heeft. Het feit dat de reactie zonder Kunitz-remmer niet wordt beïnvloed, duidt op een directe interactie met de proteaseremmer.

Referentielijst

Allis en Fromme, 1979· Activity of membrane-bound enzymes exposed to sinusoidally modulated 2450 MHz microwave radiation Radio Science 14 (6), 85-91-

Bach, S.A., A.J. Luzzio and A.S, Brownell, I960. Effects of radio frequency energy on human gamma globulin. In: "Biological effects of microwave radiation". M.F. Peyton (ed.), New York: Plenum, p. 117-133·

Belkhode et al., 1974. Thermal and athermal effects of 2.8 GHz microwaves on three human serum enzymes, J. of Microwave Power 9(1): 23-29.

Birk Y, 1985. The Bowman-Birk inhibitor trypsin and chymotripsin inhibitor from soy beans. Int. J. Peptide Protein Res. 25: II3-131.

Boon, M.E. en Kok, L.P., 1989. Microwave Cookbook of Pathology, the art of microscopic visualisation, Coulomb Press Leijden, Leiden, 280 p.

Borchers et al., 1972. Rapid improvement in nutritional quality of soybeans by dielectric heating. J. Food Sci. 37(2): 333“334.

Dietrich et al., 1970. Comparison of microwave with steam or water blanching of corn-on-the-cob. II. Peroxidase inactivation and flavor retention. Food Technol. 24: 293-296.

DiPietro en Liener, 1989· Heat inactivation of the Kunitz and Bowman Birk soybean protease inhibitors. J. of Agric. Food Chem. 37: 3944.

Galvin et al., 1981. Influence of 2.45 GHz microwave radiation on enzyme activity. Radiat. Environ. Biophvs. 19: 149*156.

Grant et al., 1978. Dielectric behaviour of biological molecules in solution. Clarendon Press, Oxford, 237 P·

Grant, E.H. en Gabriel, C., 1991» Biological effects of radiowaves and microwaves. In: Microwave and High Frequency, Nice 8-10 oktober 1991· Comité Franqais d'Electricité, Vol. I, Cours 873 Ρ·

Henderson et al., 1975· Effect of 2*150 MHz microwave radiation on horse radish peroxidase. J. of Microwave Power 10 (1): 27-35·

Huxsoll et al., 1970. Comparison of microwave with steam or water blanching of corn-on-the-cob. I. Characteristics of equipment and heat penetration. Food Technol. 24(3): 290-292.

IFT, 1989· Microwave food processing. A scientific Status Summary by the IFT Expert Panel on Food Safety and Nutrition. Food Technol. 43(1): 117" 126.

Kakade et al., 1974. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved method. Cereal

Chemistry 51: 376-382).

Liu en Markakis, 1989· Trypsin inhibition assay as related to limited hydrolysis of inhibitors. Analytical Biochemistry 178: 159“l65·

Meijer, M.M.T., 1991· Data not published.

Nederlandse octrooiaanvrage 8702338.

Nelson et al., 1981. Effects of 42- and 2450 MHz dielectric heating on nutrition-related properties of soybeans. J. Microwave Power 16(3 and 4): 313-318.

Pethig, R., 1979· Dielectric and electronic properties of biological materials. Wiley & Sons, Chichester ect., 376 p.

1 Pour-El et al., 1981. Biological properties of VHF- and microwave-heated soybeans. J. Food Sci. 46(3): 880-885.

Senter et al., 1984. Effects of dielectric and steam heating treatments on the storage stability of pecan kernels. J. Food Sci. 49(3): 893-895·

Takashima, 1966. Studies on the Effect of Radio-Frequency Waves on Biological Macromolecules, IEEE Transactions on Bio-Medical Engineering BME-13 (1): 28-31.

Ward et al., 1975· Measure of enzymatic activity coincident with 2450 MHz microwave exposure. J. of Microwave Power 10(3): 315~320.

Yeargers et al., 1975· Effects of microwave radiation on enzymes. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2^7: 301-304.

Claims

1. Werkwijze voor het wijzigen van de kinetiek van een reactie waarbij ten minste een macromolecuul is betrokken waarbij men ten minste het macromolecuul behandelt met elektromagnetische energie met een frequentie gekozen uit het gebied 0,1-350 MHz, welke wijziging ten minste gedeeltelijk bij nagenoeg constant houden van de matrixtemperatuur optreedt .

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij men elektromagnetische energie toepast met een frequentie die ten minste een relaxatiefrequentie 'van het macromolecuul omvat.

3. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij men bij aanwezigheid van het macromolecuul in situ van de reactie waarvoor verandering van de kinetiek gewenst is, de elektromagnetische energie behandelt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3. waarbij men bij aanwezigheid van het macromolecuul gedurende de periode waarin de verandering van de reactiekinetiek gewenst is, de elektromagnetische energie toedient.

5· Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij men een macromolecuul met een molecuulgewicht kleiner dan 120.000 Dalton met elektromagnetische energie behandelt.

6. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het macromolecuul een biologisch macromolecuul is.

7· Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het macromolecuul een eiwit is.

8. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het macromolecuul wordt gekozen uit de volgende groep eiwitten: protease remmers, esterases, oxidases, hydrolases.

9· Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het macromolecuul de Bowman-Birk proteaseremmer is.

10. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, waarbij het macromolecuul een pectine(methyl)esterase is.

11. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, waarbij het macromolecuul een polyfenoloxidase is.

12. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, waarbij het macromolecuul een lipase is.

13. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, waarbij het macromolecuul een lipoxygenase is.

14. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij men een frequentie van tussen 0,2-80 MHz toepast wanneer het macromolecuul zich in oplossing in water bevindt.

15. Macromolecuul met gewijzigde kinetiek voor ten minste een reactie, welke wijziging is verkregen na behandeling met elektromagnetische energie met een frequentie van 0,1-350 MHz onder zodanige omstandigheden dat de matrixtemperatuur nagenoeg constant is gebleven.

16. Toepassing van de werkwijze volgens een van de conclusies l-l4 en/of een macromolecuul volgens conclusie 15 voor het beïnvloeden van een biologisch en/of chemisch proces.

17. Toepassing van de werkwijze volgens een van de conclusies 1-14 en/of een macromolecuul volgens conclusie 15 voor het beïnvloeden van een voedselverwerkingsproces.

18. Toepassing van de werkwijze volgens een van de conclusies 1-14 en/of een macromolecuul volgens conclusie 15, voor het beïnvloeden van een oxidatieproces.

19. Toepassing van de werkwijze volgens een van de conclusies 1-14 en/of een macromolecuul volgens conclusie 15, voor het beïnvloeden van bruinverkleuring in plantaardige produkten tijdens en/of na verwerking.

20. Toepassing van de werkwijze volgens een van de conclusies 1-14 en/of een macromolecuul volgens conclusie 15, voor het beïnvloeden van het ontstaan van ranzigheid en andere smaak- en geurafwijkingen door vetsplitsing of vetoxidatie in plantaardige produkten tijdens en na verwerking.

21. Toepassing van de werkwijze volgens een van de conclusies 1-14 en/of een macromolecuul volgens conclusie 15. voor het beïnvloeden van textuurveranderingen tijdens en/of na verwerking.

22. Toepassing van de werkwijze volgens een van de conclusies 1-14 en/of een macromolecuul volgens conclusie 15, voor het beïnvloeden van de voedingswaarde van plantaardige produkten ten gevolge van activiteit van proteases en proteaseremmers.