NO116870B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av et materiale som inneholder et pertussis antigen.

Foreliggende oppfinnelse angår en ny og forbedret fremgangsmåte ved fremstilling av et materiale som inneholder et pertussis antigen, fra celler av Bordetella. pertussis, hvilket åntigen-holdige materiale kan opparbeides for fremstilling av forbedrede

.énverdige eller flerverdige vaksiner.

Kikhoste er en akutt, meget smittsom, infeksjonssykdom som forårsakes av Bordetella. pertussis og som for barn under 4 år er farlig og åannsynligvis rangerer forst som årsak til spebarn-dodelighet. Immunisering mot denne sykdom har tidligere vuirt gjennoinfort ved injeksjon yv drept cellevaksine eller ekstrahert antigen. Imidlertid har hyppig inntrufne bivirkninger, s;j.soihfeber, irritabilitet, betennelse og nekrose, og sjeldne men nedrslående innberetninger dm hjernébetennelse ansporet tii videre j forskning for å komme frem til bedre vaksiner.

Det er kjent å fremstille et materiale innehold ude pertussLs antigen fra pertussisceller ved å sprenge pertussis-cellene og deretter underkaste den erholdte cellemasse diverse ekstraksjonsbe-I handlinger for å rense det antigenholdige materiale. Etter sprenj-! ningen eller oppbrytingen av cellene har man hittil brukt hele ; cellemassen eller de deler av denne som ikke er blitt avsatt ettsr I centrifugering, ved den påfolgende ekstraksjonsbehandling, slik j iat både celleveggmateriale og protoplasma har deltatt i ekstrak-I sjonsprosessen. Det har imidlertid nu vist seg at protoplasmaet i pinrnoetheoin ldei r hbly itke onav senantrtiagsejnonet , mseom n kaat n deft ordårersaimkoe t doindnen ehvoledd er fortoskoksisk

på laboratoriedyr, og har ubnskede bivirkninger når det er til-stede i vaksiner som administreres klinisk. Celleveggmaterialet, derimot, har vist seg,å ha et hbyt innhold av antigen, og det har videre vist seg at det antigenholdige celleveggmateriale kan gjdres fritt for toksiske substanser.

På grunnlag av disse erkjennelser tilveiebringes der nu en fremgangsmåte ved fremstilling av et materiale som inneholder et pertussis antigen, ved hvilken celler av Bordetella pertussis sprenges mekanisk og cellemateriale suspenderes i vann til en suspensjon inneholdende fra 100'til 2000 B/ml, suspensjonen til-

] settes fra 1 til 5 voituidéler av en væske valgt blant ketoner med j 2 - 4 carbonatomer, aldehyder med 2-3 carbonatomer og énverdige \ alkoholer med 2-4 carbonatomer, blandingen holdes ved en tém-peratur lavere enn romtemperatur i inntil 24 timer og væsken i hives, hvilken fremgangsmåte utmerker seg ved at man etter den

j mekaniske sprengning av cellene skiller celleveggmaterialet fra j protoplasmaet, utforer ekstraksjonsbehandlingen bare med celle-|. veggm8terialet og oppsamler det b.ehandlede celleveggmateriale i inneholdende det beskyttende antigen.

Ved hjelp av fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen skaffes dei

I således et materiale inneholdende et B. pertussis antigen av

i vesentlig forbedret renhet, som er i stand til å gi langvarig I immunitet mot kikhoste, og som ikke frembringer de ubnskede bi-1 virkninger som hefter ved vanlige kjente vaksiner.

Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsén består som nevnt i at mm bryter ned den intakte B. pertussis celle ag isolerer celleveggene ..ved....^ j De Isolerte cellevegger vaskes deretter praktisk talt fri for i cellemateriale og behandles med aceton eller en énverdig alkohol av lavere molekylvekt og som enten har en rettkjedet eller for-grenet molekylstruktur og inneholder fra 2-4 cajrbonatomer eller en hvilken som helst av de aldehyder eller ketoner av lavere molekylvekt som er blandbare med vann, såsom methylethylketon, acetsldehyd og lignende. Fra 1 til 5 volumdeler av det valgte keton, aldehyd eller alkohol tilsettes celleveggsuspensjonen, og blandingen holdes ved en temperatur lavere enn romtemperatur, så~

j som ved en temperatur mellom -20°C og romtemperatur, i et tids-

; rom opp til 24 timer. Den tid man lar blandingen stå, er avhengig av temperaturen. Ved hoyere temperaturer er et kortere tidsrom tilstrekkelig til å gjore celleveggmaterialet ufarlig for anvendelse som en vaksine, mens der ved lavere temperaturer kreves noe lengre tid. Eksempelvis oppnåes ved -20°C de beste resultater (hva angår sikkerhet og utbytte) i lopet av 18 - 24 timer, mens det ved en temperatur nær romtemperatur er tilstrekkelig med mindre enn 1 time for å gjore celleveggmaterialet i det alt vesentlige ufarlig for anvendelse, ennskjont dette skjer på bekostning av utbyttet av aktivt beskyttende antigen.

i

i Celler som anvendes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen,j kan"'dyrkes i et hvilket som helst av de kjente, egnede media, séj-som trekull-agar-mediet, væskemediet eller Cohen-Wheeler dyrknirlgs-mediet. Etter vekstperioden oppsamles cellene ved • sentrif ugeringf i og kan benyttes i denne form ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, eller cellepastaen kan fryses og lagres ved -30°C inntil i det er behov for den. Om onskes, kan de oppsamlede eller innhostjede celler lyofiliseres og deretter lagres inntil det er behov for j dem, eller cellene kan drepes med "Thimerosal" eller ved hjelp av andre metoder som det er kjent ikke bdelegger beskyttende B. pertussis antigen.

Cellene suspenderes påny i kaldt (2 - 5°C) destillert vann ; og underkasjtes eksplosiv trykkavlastning i et cellesprengningsapparat, spesielt i en "Ribi Cell Fract* ionator" ved 2110 kg/cm<2>og en temperatur av 20°C eller mindre.! Ennskjont gode resultater j oppnåes nårj ■ man anvender et trykk på 21■ 10 kg/cm 2 , har det vist seg at tilfredsstillende resultater oppnåes når der anvendes trykk i området omtrent fra 1055 til 3515 kg/cm 2 .Også "andre metoder til å nedbryte cellene og isolere celleveggene kan be nyttes, såsom lydoscillesjoner, mekanisk maling, osv., men er-faringene viser at nevnte cellesprengningsapparat gir de hoyesté utbytter av rent veggmateriale. For bruk er det fordelaktig å i sterilisere cell'esprengningsapparatet ved st hele dens rorsystenj

i bringes i kontakt med ethylenoxyd i et tidsrom av 24 timer og deretter spyles med steril nitrogengass. Trykkenheten sterili- j seres i 1 time, fortrinnsvis ved at alle dens deler bringes i kontakt med p-proplolacton (0,5 %) og deretter spyles med sterilt, destillert vann. Et "multifase"-bokterietilbakeholdelsesfilter eller onnet egnet filter forbinder trykkavlastningskammeret med-en nitrogenoeholder. \

Suspensjonen av B. pertussis celler ledes til kompresjons- i kammeret i nevnte "Ribi Cell Fractionator", hvor de utsettes foi et trykk fra 105b til 351-5kg/cm<c>' som tvinger cellene inn i trykkavlastningskammeret, hvor de nedbrytes eksplosivt. Trykkavlastningskammeret holdes ved 20°C eller mindre ved hjelp av f orhåndsk jbli| nitrogengass som ledes gjennom "Multifase"-filteret og inn i : kammeret. Avlopet fra trykkavlastningskammeret, som inneholder celleveggene og protoplasma, oppsamles i en steril beholder som. er neddykket i-et isbad.

Avlopet inneholdende det nedbrutte cellemateriale sentrifugeres, den ovenstående va;ske hives, og det tilbakeblivende celleveggmateriale kan vaske med kaldt, destillert vann for å fjerne: meget toksiske, opploseiige protoplasma bestanddeler. Enten vas-; kede eller uvaskede cellevegger suspenderes i en puffer til en konsentrasjon mellom ca. 100 B/ml (100 x lo^/ml) og 200 B/ml, ennskjont der for praktiske formål vanligvis benyttes en konsentrasjon av 500 B/ml. Celleveggkonsentratet blandes deretter langsomt med 1-5 volumdeler aceton eller en alkohol av lavere: molekylvekt eller et aldehyd eller keton av lavere molekylvekt som er blandbart med vann, og settes bort, fortrinnsvis ved -20 <C

1 18 - 24 timer. Ennskjont man med godt resultat har benyttet hoyere temperaturer, resulterer de lavere temperaturer i hoyerei utbytter av aktivt,beskyttende antigen. De behandlede vegger I ounnfelles deretter ved sentrifugering og kan vaskes med kaldt destillert vann. Bunnfellingen resuspenderes med kaldt destillert vann til en ekvivalens på 500 B/rnl og homogeniseres. Homogeni-seringen kan utfores ved at man forer blandingen gjennom en lydb-scillator såsom "Raytheon" 10 KC eller ved hjelp av forskjellige

Dlundere ei ler moller. i

Suspensjonen av beiir-mulede cellevegger konserveres deretter med en effektiv mengde konserveringsmiddel, såsom "Thimerosal", "Benzethoniumklorid", benzylalkohoi, gamma-picoliniumklorid ellar andre kjente formålstjenelige konserveringsmidler og fortynnes i onsket grad.

Celleveggene som inneholder beskyttende antigen og som er gjort ikke-toksiske ved den nye fremgangsmåte ifolge oppfinnelsen, kan anvendes for fremstilling av en vandig vaksine, eller materialet inneholdende antigenet kan forst adsorberes på hjelpemateria-ler såsom aluminiumhydroxyd eller -fosfat eller utfelles med alum og deretter opparbeides som en vaksine. Da det beskyttende antigen er foriikelig med andre antigener og/eller toksoider, kan det anvendes sammen med disse på konvensjonell måte for å skaffe en flerverdig vaksine i enhetsdoseform.

Den foreliggende oppfinnelse har mange klare fordeler. Produktet som fåes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, er fritt for alle protoplasmabestanddeler, av hvilke én, nemlig det varme-labile toksin, er kjent for å vture ytterst toksisk for laboratoriedyr og kan vajre årsaken for enkelte av bivirkningene på 'mennesker. Produktet er fritt for dyrkningsmedium og kjemiske fremmedstoffer. Produktet er forlikelig med andre antigen-mate-rialer som ofte kombineres med pertussis-antigen. Fremgangsmåten er enkel og lett å utfore og gir reproduserbare hoye utbytter av aktivt materiale.

Nedenfor beskrives fremstillingen av en hjelpevaksine ut fra et antigenholdig celleveggmateriale fremstilt ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen.

178 ml sterilt 10 %- ig kaliumalun tilsettes langsomt under rystning til en suspensjon av celleveggmateriale erholdt i hen-;

hold til nedenstående eksempel, og blandingen settes bort ved 2 - 5°C i 18 timer. Den klare væske over den flokkulerte bunn-felning kan dekanteres, og/eller bunnfellingen kan sentrifugeres kald ved 1000 - 2000 omdreininger pr. minutt og den ovenstående! væske hives. Bunnfellingen vaskes to ganger ved sentrifugering j med volumer av kaldt destillert vann lik 2-5 ganger volumet ai bunnfellingen, og den vaskede bunnfelling resuspenderes i steril pufret saltopplosning av pH 7,2, til et volum på 3100 ml ved en'

!. ekvivalens -, 258 B/ml. Vaksinekonsentrasjonen kan justeres til ;32 B/ml eller mindre ved tilsetning av steril saltopplbsning av ipH 7,2, eller 0,3 M glycinpuf fer. "Thimerosal" tilsettes som et konserveringsmiddel i en tilstrekkelig mengde til at der fåes en ;konsentrasjon på l:10ooo etter fortynning. Denne vaksine forblir 1 stabil når den lagres ved 2 - 5°C.

j

Det alunflokkulerte celleveggpreparat inneholder fortynnet :: til en ekvivalens på 32 B/ml, 15,7 beskyttelsesenhe"ter pr. total-kose for mennesker (1,5 ml) sammenlignet med N.I.H. nr. 6 stand-arden som inneholder 12 beskyttelsesenheter pr. totaldose for mennesker, og kan anvendes for fremstilling av hjelpevaksiner jeller flerverdige vaksiner.

Styrken av celleveggpreparatet og N.I.H.-standarden bestemmes |ved at man administrerer en rekke fortynninger av ekstrakten og jblindproven på flere grupper mus og deretter besmitte dyrene intra-Ikranielt med 0,03 ml av en fortynning av kjent, ondartet B. per-I :tus3is inneholdende 10 5 organismer pr. ml. Resultatene av flere jslike forsok og middelverdien av disse er gjengitt nedenfor:

i Hjelpevaksinen ble funnet å være ikke-toksisk ifblge N.I.H.-istandardene, som krever at der ved intraperitoneal injeksjon av:det halve av en enkeltdose for mennesker på mus ikke finner sted

: |noe vekttap i 3 dager, at der finner sted en netto vectokning på i 3 g i lopet av 7 dager, og at der ikke inntrer mer enh 5 % dbde-■ lighet for de dyr som studeres. Ved intrateritoneal injeksjon av ' ,0,25 ml av ekstrakten av det beskyttende antigen på 10 mus ble I ',det obserbert en midlere vektbkning på 2,4 g etter 3 dager, og en midlere vektbkning på 4,7 g etter 7 dager, ute n at noen dbda-

I fall var inntruffet etter endt forsøksperiode.

i Vaksinen besto også sikkerhetsproven på dyr ved at der ikke i inntraff noe dodsfall og der ikke viste seg noen symptomer da det j halve av en enkeltdose for mennesker ble injisert i hver av to 20 g<*>s mus og det tredobbelte av en enkeltdose for mennesker ble injisert i hver av de' 350 g's marsvin.

i Konvensjonelle sterilitetsprover viste at ekstrakten var f i i!for mugg og bakterier.

i

j Elektroforetisk analyse og Ouchterlony-analyse viste at vaksinen var fri for størstedelen av de antigener som i tillegg til det beskyttende antigen finnes i de opprinnelige hele cellei .

j Den endelige vaksine inneholder en tredjedel eller mindre av del j totale nitrogeninnhold som finnes i konvensjonelle vaksiner.

! Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen illustreres i det neden-

( stående eksempel.

Eksempel

Cellene fra en 48 timers dyrkning av B. pertussis i et Coh^n-Wheeler medium oppsamles ved justering av mediets pH til 7,0 mec konsentrert saltsyre og sentrifugering i en "Sharples" sentrifuge. Den erholdte cellepasta resuspenderes i destillert vann, ledesj

j gjennom en 200-mesh nylonsikt for å fjerne store partikler, og filtratet innstilles til en konsentrasjon av 500 B/ml. Cellekoni ; ! sentrasjonen bor fortrinnsvis være i området 100 - 1000 B/ml.I\

i 1600 ml av cellekonsentratet ledes til en på forhånd steri^i-

\ sert "Ribi Cell Fractionator" og utsettes for et trykk på 2110'■ 1 ; I kg/cm 2 . Cellene u^.der trykk o ekstruderes inn i trykkavlastnings-j' ! j kammeret, som holdes ved 20 C eller ved lavere temperatur ved

I hjelp av avkjolt nitrogengass,.hvor cellene nedbrytes eksplosiv ;.

i Cellematerialet renner fra trykkavlastningskammeret til en ster|.l beholder neddykket i et isbad. Det fåes 1600 ml avlbp.

I Avlopet sentrifugeres i et "Spinco" 18 000 bolleformet rotor-hode for satsvis drift ved 16 000 omdreininger pr. minutt i 3 timer. Også andre sentrifugeringsapparater kan anvendes, såsom I f.eks. "Sh8rplés" sentrifugen. Den ovenstående væske dekanteres

j fra rotorhodet, og hodet kan påfylles og kjores en eller flere j ganger, om Snakes, uten at man fjerner residuet. Den ovenstående I væske som fjernés og hives, inneholder den meget toksiske proto-

:plasmafraksjon av cellekonsentratet.

Residuet som blir tilbake i rotorhodet, fjernes fortrinnsvis ved tilsetning av stålkuler til rotorhodet og forsiktig rystning I av hodet ved at det anbringes på en mekanisme som gir en rullende* bevegelse. Imidlertid kan også andre kjente metoder anvendes for i å ta residuet ut av rotorhodet. '

Residuet vaskes ut av rotorhodet med omtrent 1600 ml kaldt destillert vann (2 - 5°C) . 3 Voluiudeler aceton (som holdes kaldt ;

ved hjelp av et bad av tbrris og aceton) tilsettes under stadig omrbring, og blandingen settes bort ved -20°C i 18 timer. Kon-sentrasjonen av cellevegger og aceton kan gjerne justeres til en: pertussis-konsentrasjon svarende til 100 - 2000 B/ml, og der kan'

anvendes aceton eller en énverdig alkohol med 2-4 carbonatomer eller et hvilket som helst lavmolekylært aldehyd eller keton som tidligere nevnt. Materialet sentrifugeres deretter ved 2000 omdreininger pr. minutt i 30 minutter, og den ovenstående væske hives. Det bunnfelte materiale vaskes to ganger med kaldt destil-r lert vann (et volum svarende til den ovenstående væske som hives) ved sentrifugering og resuspenderes i kaldt sterilt destillert vann til en ekvivalens på 500 B/ml. Den vaskede bunnfeining homogeniseres deretter ved at den ledes gjennom en "Raytheon" lydo-scillator (10 KC) i 5 minutter. Den vaskede bunnfelling resuspenderes i steril pufret saltopplbsning av pli 7,2 til et volum av 1600 ml. Den kan lagres i det uendelige som sådan ved 2 - 5°C.

Dette preparat kan fortynnes i henhold til de standarder som forf utskrives av N.I.H. og anvendes for fremstilling av vandige hjelpevaksiner eller flerverdige vaksiner.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling' av et materiale som inneholder et pertussis antigen, ved hvilken celler av Bordetella pertussis. sprenges mekanisk og cellemateriale suspenderes i vann til en suspensjon inneholdende fra 100 til 2000 B/ml, suspensjonjen tilsettes fra 1 til 5 voluiudeler av en væske valgt blant ketoner! med 2-4 carbonatomer, aldehyder med 2-3 carbonatomer og én^j verdige alkoholer med 2-4 carbonatomer, blandingen holdes ved<1>en temperatur lavere enn romtemperatur i inntil 24 timer.og j væsken hives,karakterisert vedat man etter deri J mekaniske sprengning av cellene skiller celleveggmaterialet fra i protoplasmaet, utforer ekstraksjonsbehandlingen bare med cellevejg-j materialet og oppsamler det behandlede celleveggmateriale inne-

   j holdende det beskyttende antigen.