NO129768B - - Google Patents

Description

Anvendelse av kallikrein-trypsin-inhibitor

eller potet-inhibitor til konservering av

dyriske organer og vev.

Ved oppbevaring av organer og vev, særlig slike som

ei' bestemt for transplantasjoner, oppstår det ofte vanskeligheter ved at disse organer og vev ved postmortal autolyse ødelegges mer eller mindre, og på denne måten blir ubrukelig for formålet. Også sopp og bakterier som inneholder proteaser kan ha samme uheldige innvirkning.

Nevnte uønskede virkninger kan riktignok forhindres mer eller mindre effektivt ved hjelp av de kjente konserveringsmidler, men ulempen ved slike metoder ligger i at mange av de vanlige konserveringsmidler har uheldige virkninger på organismen.

Man har nå funnet at organer og vev kan konserveres

med biologiske protease-inhibitorer, som den kjente kallikrein-trypsin-inhibitor og med protease-inhibitor fra-poteter.

Disse biologiske protease-inhibitorer har den store fordel at de mottas av organismen praktisk talt uten komplikasjoner. Fremfor alt har de imidlertid den ønskede konserveringsvirkning i utpreget grad.

De typer organer og vev som særlig har interesse for konservering i henhold til oppfinnelsen er lever, nyrer, hjerte, bukspyttkjertel, lunge, hud og benmarg.

Oppfinnelsen vedrører altså anvendelse av kallikrein-trypsin-inhibitor eller potet-inhibitor til konservering av dyriske organer og vev, fortrinnsvis i form av en vandig oppløsning hvori konsentrasjonen av inhibitoren er 1 til 50 mg pr. ml oppløsning.

De kjente inhibitorer benyttes fortrinnsvis i vandige oppløsninger. De organer og vev som skal konserveres kan nedlegges i disse vandige oppløsninger, eller de vandige oppløsninger kan injiseres i organer eller organene kan gjennomstrømmes med oppløs-ningene. Videre kan man benytte inhibitorene i fast form, even-tuelt blandet med bæresubstanser, og bringe inhibitorene i berøring med organene i denne form.

Hvis man benytter vandige oppløsninger for konservering

i henhold til oppfinnelsen, er det tilstrekkelig med små konsentrasjoner for å oppnå den ønskede virkning. I visse tilfeller kan det imidlertid være gunstig å bruke høyere konsentrasjoner.

Eksempel for fremstilling av potet- inhibitor.

Til fremstilling av kartin ekstraheres poteter med metanolisk-vandig perklorsyre. Perklorsyre-metanol-ekstraktet nøytraliseres med kaliumkarbonat, det utfelte kaliumperklorat frafiltreres, og filtratet konsentreres, dialyseres og frysetørkes. Det frysetørkede materiale inneholder rå-kartin med en virkning

på 1500-3000 EIE/mg. Utbyttet utgjør 1.000.000 EIE/kg poteter. Utbyttet er avhengig av potetens kvalitet og innhøstningstid.

1 EIE (uspesifikk elastase-enhet) er den inhibitor-ruengde hvorved 0,5^ug av en elastase-standardtilberedning hemmes 100%. Som elastase-standardtilberedning anvendes et elastase-preparat som har 50% av den proteolytiske aktivitet av renset elastase (bestemmelse med kasein som substrat).

Eksempel 1.

Friske nyrer fjernes fra friske rotter og deles ved et middelsnitt i to deler. Den ene gruppen av nyrehalvparter legges i fysiologisk koksaltoppløsning og den andre i koksaltoppløsning som er tilsatt kallikrein-trypsin-inhibitor'(KTI) i en konsentra-sjon på 8 mg/ml. Nyrehalvdelene oppbevares ved værelsetemperatur i disse oppløsninger under sterile forhold, tas ut sterilt etter forskjellige tidsrom fra forsøkets begynnelse og undersøkes ved hjelp av histologiske rutinemetoder og metoder innen fermenthisto-kjemien for å fastlegge forandringer og bedømme oppbevaringen. Vevstykkene skjæres enten med kryostat til bruk for den spesielle fermenthistokjemi eller fikseres med nøytral puffret formaldehyd eller etter Wolman. Det Wolman-fikserte materiale legges i para-fin over metylbenzoat og brukes til rutinehistologi. Det formaldehyd-fikserte materiale fryseskjæres og tjener til fremstilling av hydrolaser.

Følgende fermenter fremstilles: NADH-cytokrom-c-reduktase (NADH-C-R), laktatdehydrogenase (LDH), glukose-6-fos fat-dehydrogenase (G6PDH), succinodehydrogenase (SDH), cytokromoksy-dase (CO), uspesifikke esteraser (UE), alkaliske fosfataser (AP)

og sure fosfataser (SP). De histokjemiske påvisninger av hydrola-sene gjennomføres i henhold til A.G.E. PEARSE /f"Histochemistry ; Theoretical and Applied", 3. utgave, J.a.A. Chruchill Ltd. (London 19682/j og de øvrige enzymer påvises etter T. Barka og P.J. Anderson /"""Histochemistry , Teory , Practice, and Bibliography" , Harper and Row, Publishers, Inc., New York (196327. Preparatene farges med hematoxylin-eosin-farging (HE) eller Goldner-farging, når dette er aktuelt.

Etter 6 timers inkubering i fysiologisk koksalt-oppløsning ble plasmaet vesentlig svakere farget med HE, og tubuluscellene synes oppsvellet. Hele vevet var blitt betraktelig løsere i konsistens. Aktiviteten av LDH, NADH-C-R og SDH hadde ikke tydelig avtatt ennå, men man kan allerede se uregelmessig-heter i kornenes form og tetthet. For G6PDH finner man lignende forandringer, særlig i den uixtamedulære sone. CO-påvirkningen gir en flekket farging. For UE-typene får man i det tubulære apparat uregelmessig fargestoff-fordeling og klumpdannelse, og aktiviteten har avtatt. Farging av SP gir en redusert aktivitet og grovere korndannelse. Etter 6 timers oppbevaring i KTI-oppløsning, har man bare fått svært lite tap av fargingsevnen med HE, idet man får et klart bilde, og noen oppsvelling kan praktisk talt ikke iakttas. Lumina i tubuli er skarpere avgrenset. Fargingen for de nevnte enzymer gir generelt ingen forandring fra normalbildet. Aktiviteten er sterk og regelmessig fordelt. Fargestoffkornene

er generelt i god behold.

Etter 24 timer finner man uten KTI en videre utvikling av autolysen. Kjernene flyter ut og er for størstedelen, særlig i vevenes indre deler, ikke lenger fargbare. Tubuli har nå bare tynne vegger. Lumen er ikke lenger lukket. Hele vevområdet viser begynnende oppløsningstendenser, også det mellomliggende binde-vev er vidtgående oppløst. Etter farging for LDH, NADH-C-R, SDH og CO er fargestoffpartiklene sammenleiret til homogene masser,

og kjernene er ikke lenger tydelig avgrenset i fargestoffområdet. Aktiviteten av G6PDH er sunket sterkt. UE er forsvunnet helt.

AP er riktignok fremdeles tilstede delvis i sterk aktivitet, men bare i sammenklumpet, flekket form. SP viser en homogen farging med sterkt nedsatt aktivitet. Under KTI-innvirkning er kjerne-strukturene etter 24 timer i god behold. Man kan riktignok merke, de første tegn på autolyse, men vevet viser seg lukket og tett,

og interstitium i god behold. Fargestoff-fordelingen hos de fargede enzymer er generelt regelmessigere. Aktiviteten er vesentlig bedre. Riktignok har man ved G6PDH en fallende tendens, og UE kan ikke lenger påvises. Forskjellen i forhold til kontroll-prøve uten KTI er særlig tydelig ved SP, som fremdeles foreligger med god aktivitet og struktur.

Etter 5 dager er strukturene uten KTI i fullstendig oppløsning. Preparatet kan nesten ikke farges med HE, bare enkelte kjerner kommer til syne. Konturer kan ikke lenger fastlås. Farging med hensyn på LDH og NADH-C-R gir bare homogene masser.

CO og AP kan ikke lenger påvises. SP oppviser fremdeles aktivitet, men uten strukturering. Etter 5 dagers oppbevaring med KTI kan man fremdeles gjenfinne tydelige nyrestrukturer. Tubuli har for størstedelen fremdeles opprettholdt formen. Fargingen for LDH og NADH-C-R oppviser tydelige korn fremdeles. Ved LDH-fargingen er glomeruli fremdeles avgrenset ved dens negativitet. CO kan fremdeles tydelig påvises. Aktiviteten hos SP er sterkere og bedre fordelt enn hos kontrollprøvene.

Eksempel 2.

Levervev fra friske rotter skjæres i terninger med 5 mm kantlengde og oppbevares som i eksempel 1 i koksaltoppløsninger med eller uten tilsetning av KTI. Dens videre opparbeidelse og under-søkelse skjer som beskrevet i eksempel 1.

Etter 6 timer finner man ved LDH, NADH-C-R og SDH flekkformede aktivitetsfall. G6PDH har avtatt vesentlig i de fleste celler, struktureringen og kjernenes negativitet er imidlertid opprettholdt. Hos UE finner man flekkevis utfall. Hos SP er begrensningen av kapillarene uskarp og aktiviteten er uregelmessig fordelt. Etter 6 timers oppbevaring i KTI-holdig oppløsning oppviser hverken LDH, NADH-C-R, SDH eller G6PDH noen forandringer.

UE vise.r mindre bortfall. SP er skarpere begrenset og regelmessigere fordelt enn hos kontrollprøvene.

Etter 24 timer skjer det i vev uten KTI en struktur-oppløsning. Lappene er ikke lender tydelig avgrenset, sinus er uregelmessig begrenset og har dype innbuktninger. Aktiviteten av LDH, NADH-C-R, SDH og særlig G6PDH har avtatt. Ved fargepåvisnin; av SP finner man ved siden av en sterk aktivitetsminskning en begynnende oppløsning av kanalsystemene. Etter 24 timers oppbevaring i KTI-oppløsning er begrensningen av lappene og sinus regelmessigere. Aktiviteten av LDH, NADH-C-R, SDH og G6PDH er generelt sett fremdeles temmelig sterk. Også etter farging for SP er aktiviteten tydelig sterkere, og kanalsyternene bedre beholdt.

Etter 5 dager finner man uten KTI bare minimale homogene eller flekkvise aktivitetstegn av LDH, NADH-C-R og SDH. Bare SP viser fremdeles middels fargestoffopptak. Også ved oppbevaring i KTI-oppløsning har det nå inntrådt en viss strukturoppløs-ning. Imidlertid viser LDH, NADH-C-R og SDH fremdeles tydelig aktivitet. Aktiviteten hos SP er vesentlig sterkere enn hos kontrollprøvene.

E ksempel 3.

Fra den menneskelige sternum tar man med en punks jons-kanyle 2 - t ml benmarg. Denne suspenderes i det dobbelte volum tyrodeoppløsning som pr. ml er tilsatt 15 mg kallikrein-trypsin-inhibitor. Man oppbevarer suspensjonen ved ca. -20°C. Hvis man sammenligner suspensjonen etter 1 år med en tilsvarende suspensjon av benmargceller uten inhibitor tilsetning, men fremstilt på samme måten, finner man etter farging med-trypanblått eller eosin flere døde celler enn i preparatet som anvendes ifølge oppfinnelsen. Eksempel U.

En menneskelever som er beregnet for transplantasjon perfunderes gjennom portåren og Arteria heptatica med tyrodeoppløs-ning som er tilsatt 10 mg potet-inhibitor pr. ml. Levervevet holder seg bedre enn en annen lever som er ubehandlet. De histologisk synlige autolytiske forandringer holdes tydelig tilbake.

Claims (1)

1. Anvendelse av kallikrein-trypsin-inhibitor eller potet-inhibitor til konservering av dyriske organer og vev, fortrinnsvis i form av en vandig oppløsning hvori konsentrasjonen av inhibitoren er 1 til 50 mg pr. ml. oppløsning.