NO154409B

NO154409B - Fremgangsmaate for bestemmelse av naervaeret av en forbindelse som er ubundet til protein, i en proteinholdig proeve.

Info

Publication number: NO154409B
Application number: NO792030A
Authority: NO
Inventors: Franklin Lim; Richard D Moss; Robert J Buehler; Teresa H Chan
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1978-06-20
Filing date: 1979-06-19
Publication date: 1986-06-02
Also published as: SE445680B; DE2924881A1; FR2432171A1; SE7905101L; CH647869A5; IT1119920B; IT7968303A0; NO792030L; DK256279A; FR2432171B1; GB2023816A; CA1120397A; GB2023816B; NO154409C

Description

Oppfinnelsen vedrører påvisning og bestemmelse av konsentrasjonen av ubundne forbindelser, f.eks. hormoner, i en flytende prøve, f.eks. serum. Mer spesielt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte som er velegnet for påvisning av frie forbindelser av den type som har evne til reversibel binding med protein i prøver som inneholder de frie substanser, bindingsproteinet og en konsentrasjon av forbindelse/proteinkompleks.

Den såkalte "competitive assay"-analyseteknikk for måling

av konsentrasjonen av forskjellige biologisk aktive forbindelser for diagnostiske formål er nå veletablert. Teknikken innebærer et reaksjonssystem hvor antistoff som er spesifikt for de forbindelser som skal bestemmes, inkuberes sammen med prøven og en alikvot av en analog av prøven som kan skjelnes. Analogen og de naturlige forbindelser konkurrerer om plasser for tilknytning til antistoffet, og etter separering av antistoffet fra resten av reaksjonssystemet, kan antistoffet eller supernatanten undersøkes med hensyn på analog. Mengden av analog som er knyttet til antistoffet, er en invers funksjon av konsentrasjonen av testforbind-elsene i prøven.

To vanlige metoder for utførelse av slike konkurrerende bestemmelser er kjent som "væskefase-radioimmuno-bestemmelse" og "fastfase-radioimmunobestemmelse". I hvert system må den immunogene forbindelse som er bundet til et antistoff fjernes fra ubundet immunogen forbindelse for at man skal kunne foreta en måling av mengden av merket analog på antistoffet. Ut fra denne måling bestemmes mengden av immunogen forbindelse i prøven.

I "væske"-fase-radioimmunobestemmelsessystemer inkuberes antistoffet, den merkede analog og den immunogene forbindelse som skal bestemmes, i løsning. Et antall antistoffbindings-

seter er tilgjengelige, og reaksjonstiden er kort. For å sepa-

rere den antistoff-kompleksdannede immunogene forbindelse fra den ikke-kompleksdannede immunogene forbindelse utfelles anti-stof f /immunogenkomplekset, sentrifugeres og dekanteres supernatanten .

"Fastfase"-radio-immunobestemmelsessystemer unngår utfel-lingstrinnet. Antistoffet bindes til en glass-"chip" eller inner-flate i et rør. Sentrifugering av glassbitene eller dekantering av de belagte rør vil separere den antistoff-kompleksdannede

forbindelse fra den ikke-kompleksdannede immunogene forbindelse. Imidlertid er reaksjonstiden relativt lang fordi et antall tilgjengelige aktive seter på antistoffet er blokkert av glassbiten ("chip"-en) eller røret.

Hormoner, f.eks. slike som utskilles fra skjoldbrusk-kjertelen, testes, ovariene, binyrebarken, og andre pattedyr-kjertler transporteres ofte gjennom sirkulasjonssystemet i tilknytning til hormonbindende proteiner eller globuliner. Ofte er det av diagnostisk betydning å være i stand til å bestemme nærvær og konsentrasjon av fritt hormon, i motsetning til proteinbundet hormon eller totalt hormon. Eksempelvis eksisterer tyroksin (T4) i blodstrømmen i et dynamisk likevektforhold som en forbindelse bundet til et transportprotein (tyroksin-bindende globulin, albumin eller prealbumin) og, i en liten fraksjon (potensielt 0,1% eller mindre), som en ubundet forbindelse ("fri" eller ubundet (T^). Fritt antas å være den aktive forbindelse i tyroidea-hormonsystemet. Dessverre er metodikken for bestemmelse av fritt T. omstendelig, komplisert, kostbar og forbundet med feilkilder på grunn av vanskeligheten med å standardisere materialer og måle små mengder av ubundet hormon i nærvær av overveldende mengder av hormon som er relativt løst bundet til protein. Den konkurrerende bestemmelsesprosess som er omtalt ovenfor, er ikke i stand til å bestemme konsentrasjoner av fri forbindelse.

Av metodene for måling av fritt T. og andre hormoner som eksisterer in vivo som proteinkomplekser, gir dialysemembran-metoden en høy grad av nøyaktighet. En dialysepose som inneholder kjente mengder av serum som skal testes, og merket hormon suspenderes i puffer. Det merkede hormon fordeler seg mellom de frie og bundne tilstander i de samme forhold som serumhormonet. Massen av merket hormon som tilsettes, må være overordentlig liten slik at man unngår alvorlig forstyrrelse i systemet, og allikevel må telleraten være så høy at påvisning av små mengder er mulig. Når det gjelder radioaktive merkinger krever dette at merket hormon med meget høy spesifikk aktivitet brukes. Etter en passende periode (ca. 24 timer) diffunderer det merkede og det naturlige hormon som ikke er bundet til protein gjennom den semipermeable dialysepose mens hormon som er bundet til protein (molekylvekt over 20 000) forblir i dialyseposen. For å bestemme mengden av fritt hormon som er til stede i serumet bestemmer man en alikvot av pufferen for merket hormon. Som et resultat av bestemmelsen kan den fraksjon av merket hormon som vandret inn i pufferen kalkuleres og den fraksjon av totalt hormon som eksisterer i fri tilstand utledes. For å omdanne denne fraksjon til masse-enheter (f.eks. ng/dl) av fritt hormon må en total hormonbe-stemmelse også gjøres på prøven.

Selv om dette systemet kan gi betydningsfulle resultater

i fritt T^- og andre fritt hormonbestemmelser, er det dårlig egnet for rutinebruk. To tester må foretas, og den nøyaktighet som det endelige resultat har, kan bli utsatt for et kompromiss ved hver av metodene. Ganske store mengder av radioaktivitet må anvendes for hver test. Interfererende forurensninger i det merkede hormon kan forårsake spesielle problemer, og det kreves lange inkubasjonstider. Bare serum kan anvendes, og det må

være friskt. Videre er oppsamlingen og standardiseringen av alle de materialer som er nødvendige for bestemmelsen, ikke en rutine-sak. Således er anvendelsen av fremgangsmåten blitt begrenset på grunn av den høye pris og arbeidsintensitet og at det er nød-vendig med faglært personale.

En annen metode for bestemmelse av fritt hormon innebærer reaksjonskinetikk og krever to separate tester. Hver test måler en kinetisk kurve som står i forhold til hvor hurtig et antistoff fanger opp hormon, f.eks. T^, vekk fra det motvirkende drag av det primære bindemiddel, f.eks. tyroksinbindende globulin.

I et slikt analysesystem blir unøyaktigheter resultatet fra flere patologiske betingelser. Hvis flere proteinbindings-seter er til stede enn vanlig, vil den effektive tiltrekning fra globulinet for hormonet være større og raten av binding til antistoff vil avta. Når det gjelder tyroksinanalyse, ville dette gi utseende av at prøven hadde lite mens det faktisk kunne være et høyt nivå av 1^, men alt i bundet form.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en immunoanalytisk fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en forbindelse som er ubundet til protein, i en proteinholdig prøve ved at prøven inkuberes med et antistoff som er komplementært til den nevnte forbindelse og en merket analog av nevnte forbindelse, og som inneholdes i mikrokapsler som har membraner med en tilstrekkelig permeabilitet til å tillate nevnte forbindelse og.dens merkede analog å vandre gjennom, men utilstrekkelig til å tillate pass-

asje av nevnte antistoff eller proteinbundne forbindelser som er til stede i prøven.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen erkarakterisert

ved at antistoffet separeres fra ubundet forbindelse og ubunden analog ved at det induseres en osmolalitetsforandring i reak-

sjonssystemet som får mikrokapslene til å klappe sammen, og mikrokapslene separeres fra resten av reaksjonssystemet; og mengden av den merkede analog som er bundet til antistoffet eller som ikke er bundet til antistoff, bestemmes.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan utføres i

nærvær av serumproteiner og bundet hormon. Således inkuberes semipermeable mikrokapsler som inneholder antistoff.som er kom-

plementært til hormonet eller andre forbindelser som skal på-

vises, med både en skjelnbar analog for hormonet og prøven. Ana-

logen kan innføres i mikrokapslene før inkuberingen i slike mengder at antistoffet mettes ved hormonbindingssetene. Mikro-kapselveggene omfatter membraner som separerer prøven fra anti-

stoffet, og har tilstrekkelig permeabilitet til å tillate pass-

asje av fri forbindelse og dens analog, men utilstrekkelig til å tillate passasje av antistoffet, naturlige proteiner eller proteinbundet hormon. Hvis en prøve tilsettes til en alikvot av mikrokapslene, diffunderer fritt hormon gjennom membranene og konkurrerer med dets analog for plasser for feste på antistoffet.

Således blir fordelingen av analog mellom antistoffet og resten

av reaksjonssystemet indikativt for mengden av fritt hormon som opprinnelig er til stede i prøven. Denne metode kombinerer den iboende nøyaktighet hos en konvensjonell væskefase-radio-immuno-bestemmelse og enkelheten og bekvemmeligheten til et fastfase-

system.

Deretter separeres antistoffet sammen med dets bundne hor-

mon (og den bundne analog) fra den frie forbindelse, og enten antistoffet eller resten av reaksjonssystemet bestemmes med hen-

syn på analog. Separeringen kan utføres ved å indusere en os-

motisk forandring slik at kapslene klapper sammen og ubundne hor-

moner migrerer ut av kapslene. Dette kan f.eks. gjennomføres ved å tilsette serum-albumin eller polyetylenimin til systemet som

fremkaller avløp av intrakapsulær væske. Alternativt kan fri forbindelse ganske enkelt bli vasket ut fra mikrokapslene. Resultatene tolkes ved sammenligning av analysen av analoginn-holdet med en standard, f.eks. en kurve for fritt hormon-konsentrasjon kontra radioaktiv telling, fluorescerende intensitet eller andre markeringskarakteristika som anvendes for indikering av nærværet av analogen.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for påvisning og/eller bestemmelse av konsentrasjon av fritt tyroksin, tri-jodotyronin, neonatalt tyroksin, testosteron, cortisol, andre steroidhormoner og andre forbindelser som binder seg reversibelt med protein. Fremgangsmåten kan også anvendes for påvisning av forbindelser som ikke binder seg til protein i noen signifikant grad, f.eks. droger, som digoksin. I det vesentlige kan ethvert slikt materiale bestemmes forutsatt at en komplementær bindings-forbindelse og en merket analog av forbindelsen er tilgjengelig eller kan produseres.

Fremgangsmåten kan utføres rutinemessig ved anvendelse av et prøvesett som omfatter analog, mikrokapsler som inneholder antistoffstandarder og blindprøver som inneholder forutbestemte konsentrasjoner av de angjeldende forbindelser, og et reagens for fjerning av ubunden forbindelse og analog fra kapslene etter fullførelse av inkuberingen. For kvalitetskontroll kan løsningen i mikrokapselen være farvet. En farvet supernatant, etter at kapslene er felt ut eller sedimentert via sentrifugering, ville være indikativt for mikrokapselbrudd og eventuell lekkasje av antistoff. Ulik konvensjonelle bestemmelser unngår denne metode tap av klinisk korrelasjon med diagnostiserte betingelser over et bredt område av konsentrasjoner av protein, hormon og interfererende forbindelser.

I og med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således en hurtig, enkel og reproduserbar metode for påvisning og/eller bestemmelse av konsentrasjon av forbindelse som er ubundet til protein i en væskeprøve. Oppfinnelsen kan også utnyttes for bestemmelse av fritt T. i prøver ekstrahert fra menneskeblod og som inneholder protein-bundet T^.

Videre er det ved hjelp av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen mulig å bestemme en immunogen forbindelse som kombi nerer fordelene ved fastfase-radioimmunobestemmelsessystemet og fordelene ved væskefase-radioimmunobestenunelsessystemet. Dess-uten oppnår man derved en meget pålitelig fremgangsmåte for bestemmelse av mengden av digoksin i serum. Disse og andre formål og trekk ved oppfinnelsen vil fremgå av den følgende beskrivelse. Fig. 1 illustrerer en standardkurve oppstilt ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Den består av et punkt for tellinger pr. minutt (x 10 3) pa en y-akse i lineær skala kontra konsentrasjonen av fritt T4i ng/dl på en x-akse i log.-skala (data, se tabell 1); Fig. 2 illustrerer en annen standardkurve for bestemmelse av fritt T4, i henhold til oppfinnelsen, i cpm (lineær) ctra. ng/dl fritt-T^(log.-skala). Data for denne figur finnes i tabell 2; 125 Fig. 3 er et diagram av cpm fra ( I) bundet til T^-antistoff som inneholdes i semipermeable mikrokapsler nedsunket 1 standardløsninger av fritt T. ctra. tid. Etter hvert som 125 serum-T^ erstatter ( I) ved T^-antistoffbindingsseter, avtar cpm som er igjen i tilknytning til antistoffet. Det be-merkes at utskiftingshastigheten er stort sett lineær inntil 2 timer inkubering ved 37°C; Fig. 4 illustrerer grafisk korrelasjonen mellom resultater mellom dialysebestemmelsesteknikken og mikroinnkapslingssystemet; Fig. 5 illustrerer grafisk det normale område for fritt slik det er etablert av det mikroinnkapslede bestemmelsessystem; Fig. 6 illustrerer grafisk korrelasjonen mellom kinetisk radioimmunobestemmelse og bestemmelsessystemet av mikroinnkapslet type; og Fig. 7 viser en digoksin-standardkurve i form av tellinger pr. minutt (cpm) bundet til antistoff, avsatt som punkter på den lineære skala, ctra. digoksin i nanogram/milliliter på log.-skalaen på 2 syklusers semilog.-papir (data fra tabell 5); Fig. 8 viser digoksin som % bundet (relativt) ctra. digok-sinkonsentrasjonen. % bundet (relativt) beregnes som % bundet (relativt) = gjennomsnitt cpm bundet) gjennomsnitt cpm bundet av 0 ng/dl digoksin standard x 100 (data fra tabell 8); og Fig. 9 er et diagram som viser retensjonen av antistoff og fri passasje av immunogen substans i mikrokapsler.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen krever at den prøve som inneholder den forbindelse som skal påvises, inkuberes med antistoff komplementært med forbindelsen (eller en annen forbindelse som er i stand til reversibel binding med forbindelsen) og en skjelnbar analog av forbindelsen, og at prøven og antistoffet separeres ved hjelp av en semipermeabel membran eller slike membraner som ekskluderer passasje av proteiner med høy molekylvekt.

Antistoffer til utvalgte forbindelser kan produseres i overensstemmelse med velkjente teknikker som innebærer injeksjon av hormonet i laboratoriedyr, eventuelt sammen med et hjelpe-stoff, og deretter ekstrahering og rensning av de produserte antistoffer. Mange slike antistoffer er kommersielt tilgjengelige, mange skjelnbare analoger av forbindelser som kan bestemmes ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, er også kommersielt tilgjengelige eller kan lages under anvendelse av kjente teknikker. Betegnelsen "skjelnbar analog" slik den her brukes, refererer til et molekyl som har antistoffbindende egen-skaper i likhet med, og fortrinnsvis identisk med, den forbindelse som skal påvises, og som erkarakterisert veden egenskap som tillater et mål på dens konsentrasjon og oppnås lett. Foretrukne analoger omfatter en prøve av den forbindelse som skal påvises, merket med en isotop. Eksempelvis kan skjoldbrusk-kjertelhormonet merkes med<125>I og kan deretter kvantifiseres ved måling av gammastråling. Imidlertid er det innforstått at andre typer av analoger kan anvendes, når bare analogen har en molekylvekt og resulterende dimensjoner som er godt under verdi-ene for naturlige proteiner og det antistoff som anvendes. Således kan analoger fremstilles ved merking av en prøve av forbindelsen som skal påvises med et relativt lavmolekylært enzym, en fluorescerende gruppe eller en annen gruppe som muliggjør kvantitativ måling av konsentrasjonen av analogen ad fysikalsk eller kjemisk vei.

For utførelse av bestemmelsesmetoden må antistoffet og analogen separeres fra prøven ved hjelp av en eller flere membraner som har en permeabilitet som utelukker passasje av antistoffer og naturlige proteiner (som ensartet har en molekylvekt i over-skudd av 20 000 dalton), men som tillater fri passasje av den forbindelse som skal påvises og dens analog. Det foretrekkes, ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, at membranene har form av semipermeable mikrokapsler som inneholder antistoffet og analogen.

Det er verdt å merke seg at de semipermeable mikrokapsler som anvendes, har en permeabilitet som er lik den for dialysemem-branene som er beskrevet ovenfor. Imidlertid er den semipermeable mikrokapselvegg 100 ganger så tynn som konvensjonelle dia-lysemembraner, og dens tilgjengelige overflateareal er av stør-relsesorden meget større pr. vektenhet. Fritt eller andre frie hormoner kommer fritt inn i mikrokapselen og forskyver, proporsjonalt med konsentrasjonen, merket fra T^-antistoffet. Således nærmer det seg en likevekt mellom fritt og merket T.

i kapselen under inkubasjonstiden.

Egnede metoder for innkapsling av biologiske materialer i membraner som har de forannevnte permeabilitetsegenskaper, er åpenbart i detalj i US-patentsøknader 606.166, 931.177, 30.847 og 24.600. Den for tiden foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av slike mikrokapsler gir semipermeable polyamidmembraner ved hjelp av en grenseflate-polykondensasjonsteknikk. Gjensidig ublandbare løsningsmidler eller løsningsmiddelsystemer utvelges, f.eks. vann og et cykloheksanbasert løsningsmiddel, og én monomer av et komplementærpar som danner en kopolymer oppløses i vannet sammen med det materiale som skal innkapsles. Det vandige løs-ningsmiddel som inneholder det materiale som skal innkapsles, emulgeres deretter i det annet løsningsmiddel for dannelse av en flerhet av adskilte dråper. Den annen komplementærmonomer tilsettes deretter til den kontinuerlige fase av emulsjonen for initiering av polymerisasjonen rundt dråpene ved fasegrensen. Membranpermeabilitet og ensartethet av polymeravsetninger regu-leres ved å variere affiniteten til den kontinuerlige fase av emulsjonen for den innkapslede monomer under polymerisasjonsfor-løpet og ved å regulere konsentrasjonen av de reagerende mono-merer og varigheten av polymerisasjonen.

I én utførelsesform er den kontinuerlige fase i utgangs-punktet et løsningsmiddel eller løsningsmiddelsystem som har relativt høy affinitet for den innkapslede monomer, 'slik at i et første polymerisasjonstrinn produseres et relativt tykt polymernettverk rundt dråpene. Deretter endres den kontinuerlige fase slik at dens affinitet for den første monomer avtar, f.eks. ved fortynning av den kontinuerlige fase med et annet løsningsmiddel eller ved å erstatte den kontinuerlige fase med friskt løsnings-middel. Etter tilsetning av den annen monomer inntreffer ytterligere polymerisasjon på foretrukken måte inne i det innledningsvis avsatte polymernettverk, hvilket vil lappe på makroporøse defekter og resultere i jevne kapselmembraner som tillater diffusjon av soluter under en viss molekylvekt.

I en annen utførelsesform utvelges den kontinuerlige fase innledningsvis slik at den har lav affinitet for den innkapslede monomer slik at tynne, relativt tette membraner danner seg i et første polymerisasjonstrinn. Deretter øker affiniteten til den kontinuerlige fase for den innkapslede monomer slik at det trekkes ytterligere mengder monomer gjennom membranen og det avsettes et annet, ytre sjikt av uløselig polymer.

Når den diskontinuerlige vandige dråpefase pufres for til-veiebringelse av et forlikelig miljø for labile biologiske materialer så som et antistoff, kan innkapslingen utføres på en måte som konserverer en stor prosentdel av det labile materialets biologiske aktivitet. Opererbarheten til det innkapslede materiale konserveres også ved tilsetning av annen monomer til den kontinuerlige fase i porsjoner i løpet av polymerisasjonens varighet slik at dens konsentrasjon på et gitt tidspunkt er relativt lav og antistoffet ikke er eksponert for høye konsentrasjoner av potensielt destruktive forbindelser.

I et foretrukket reaksjonssystem produseres vandige dråper som inneholder et diamin, et fyllstoffmateriale med høy molekylvekt og antistoffet i en kontinuerlig fase av cykloheksan hvis affinitet for monomeren som er oppløst i dråpefasen modifiseres ved tilsetning av kloroform som fortynningsmiddel. Tilsetningen av et disyrehalogenid til systemet resulterer i dannelse av semipermeable polyamidmikrokapsler. Denne mikroinnkapslingsutførel-sesform er effektiv for fremstilling av membraner som har en øvre permeabilitetsgrense i molekylvektsområdet 2000-30 000 dalton. Således kan kapslene lett bygges opp slik at de tillater diffundering av mange hormoner.

For å utføre bestemmelsen blandes prøven med mikrokapsler av den type som er beskrevet, og inkuberes, fortrinnsvis ved ca. 37°C. Før inkubasjonen kan kapslene suspenderes i en løsning av forbindelseanalogen av tilstrekkelig konsentrasjon til å belaste

antistoffet med en påviselig mengde av analogkonsentrasjonen.

imidlertid kan bestemmelsen utføres ved å tilsette analogen til reaksjonssystemet under eller etter inkuberingen med serum. Protein i prøven og protein/forbindelsekomplekser kan ikke gå

igjennom mikrokapselveggen.

Deretter separeres antistoffet fra resten av reaksjons-

systemet (eventuelt med utelukkelse av mikrokapselmembranene),

og enten antistoffet eller resten av systemet analyseres med hensyn på analogen. I en foretrukken fremgangsmåte for utfør-

else av separasjonen tilsettes et hydrofilt materiale med høy molekylvekt, f.eks. en løsning av polyetylenimin eller serum-

albumin, til det ekstrakapsulære volum. Dette induserer en osmolalitetsøkning som resulterer i sammenklapning av mikrokaps-

lene og migrering av intrakapsulært ubundet hormon og dets analog inn i supernatanten. Resultatet er en pakket pellet av innkaps-

let antistoff som, etter en eventuell sentrifugebehandling, kan isoleres ved aspirering eller dekantering av supernatanten.

Alternativt kan separasjonen utføres ved vasking av fri forbind-

else og analog fra kapselen.

Tabellene 1 og 2, og de tilsvarende figurer 1 og 2 i teg-

ningen, viser resultatene av bestemmelser som utgjør utførelses-

former av oppfinnelsen beregnet på å vise nærvær av fritt T.

125

under anvendelse av fritt T^-antistoff, I-merket tyroksin som analog, og løsninger av kjent fritt T^-konsentrasjon.

Tester av ukjente prøver løper parallelt med den anvendte frem-

gangsmåte slik at man får samlet data som kan tolkes under hen-

visning til standardkurvene.

Oppfinnelsen skal i det følgende illustreres.

Fremstilling av mikrokapsler

Heksandiaminkarbonat (pH = 8,5 i 0,1)-løsning fremstilles

ved blanding av 17,7 ml 1,6-heksandiamin med 32 ml vann, og bob-ling av CO 2 gjennom løsningen i ca. 1 time eller inntil pH-ni-

vået er nådd. Tereftaloylklorid (TC1)-løsning fremstilles ved tilsetning av 20 g TC1 i 200 ml av organisk løsningsmiddel som består av 4 deler cykloheksan og 1 del kloroform. TC1 oppløses ved kraftig omrøring, og løsningen sentrifugeres deretter i 10

minutter ved 2600 opm. Eventuelt utfellingsprodukt kastes.

750 ml cykloheksan blandes med 125 ml "SPAN-85" (emulgator, fettsyreester eller sorbitan) i en 2 liters mikser utstyrt med magnetisk rørerstav. Under røringen tilsettes en blandet løsning laget av 1 ml antiserum til tyroksin (4% i fosfatpufret saltvann), 25 ml polyvinylpyrrolidon - 4% okseserumalbumin, og 30 ml heksan-diaminkarbonatløsning til cykloheksanet. Når dråper av ønsket størrelse er produsert, tilsettes 70 ml TCl-løsning. 30 sekunder senere tilsettes 37,5 ml TC1. 60 sekunder senere tilsettes 25 ml kloroform. Tre ytterligere 25 ml-alikvoter av kloroform tilsettes med 30 sekunders intervaller.

Mikrokapslene utvinnes ved sentrifugering av tofasereak-sjonssystemet, dekantering av supernatanten og blanding av kaps-

lene med "TWEEN-20" (polyoksyetylenderivat av fettsyre-partial-

ester av sorbitolanhydrid - emulgator pufret med NaHCO^) og fos-

fatpufret saltvann. Kapslene bevarer polyvinylpyrrolidonet og okseserumalbuminfyllstoffmaterialene, såvel som tyroksin-anti-

stoffet.

Metning av antistoff med analog

Mikrokapsler fremstilt i overensstemmelse med ovennevnte fremgangsmåte kan mettes med tyroksin merket med<125>I ved

følgende trinn.

1. Tilsett til hver av 100 standardrør 0,5 ml mikrokapselsus-

125

pensjon og 1,0 mikroCurie av T^( I) (høy spesifikk aktivitet på 5-6000 mikro-Ci pr. mikrogram). Tillat inkubering ved 37°C

i minst 30 minutter.

2. Vask mikrokapslene med to ganger deres volum av fosfatpufret saltvann (0,15m NaCl, pH = 7,5, 0,015m fosfatpuffer). 3. Sentrifuger ved 2000 G i 15 minutter og dekanter den overstående væske.

4. Gjenta trinn 2 og 3 to ganger.

5. Fortynn mikrokapselsuspensjonen med 1,6 ganger dens volum av det fosfatpufrede saltvann som er nevnt ovenfor. Totalt volum blir da 80 ml. 0,8 ml mikrokapselsuspensjon anvendes pr. test. Således kan 100 tester utføres med kapslene.

Testmetode

1) Anbring 25 mikroliter prøver og 5 prøver med kjent konsentrasjon av fritt T^i separate rør. I standardkurven fra tabell 1 ble det anvendt konsentrasjoner på 0,5, 1,3, 3,0, 5,0 og 7,7 ng% av fritt T^, men hvilken som helst serie av fritt T^-konsentrasjoner kan tilpasses i henhold til velkjente eksperimentelle teknikker. Et kontrollrør som inneholder 25^ul saltvann kan også inkluderes som ytterligere kontroll av bestemmelsens nøyaktighet. 12 5 2) Pipetter 800^ul av T4( I) forhåndsmettede mikrokapsler (tilveiebragt som sådanne) inn i hvert rør.

3) Ryst hvert rør på Vortex-blander og inkuber i

120 minutter ved 37°C.

4) Etter inkuberingen tilsett 1,0 ml av 2,0 % polyetylenimin (M.V. 40-50 tusen) i fosfatpufret saltvann til hvert rør.

5) Inkuber i ytterligere 2 0 minutter.

6) Dekanter supernatanten.

7) Foreta telling i hvert rør i 1 minutt i en gamma-teller.

Beregning av resultatene

1) Hver gang en bestemmelse er utført av ukjent fritt T^-konsentrasjon i en eller flere prøver, må standarder måles for oppsetting av standardkurven. 2) Etter at bestemmelsen er ferdig lages en standardkurve som vist i fig. 2 eller 3 under anvendelse av verdier som oppnås fra de standarder som ble undersøkt samtidig med ukjente prøver. 3) Tellinger pr. minutt (cpm) for hver verdi kan avsettes i den lineære skala på 2 syklus-semilog.-diagrampapir ctra. fritt T^-konsentrasjon i nanogram % på log.-skalaen.

Et alternativ til punktavsetning av cpm ctra. fritt T^-konsentrasjon er å avsette % bundet (relativt) ctra. fritt T^-konsentrasjon.

Dette kan foretas ved beregning av % bundet (relativt) for hver standard, kontrollprøve eller ukjent prøve og avsetning av disse verdier på to-cyklus-semilog.-papir på en måte i likhet med den som er beskrevet tidligere for cpm. % bundet (relativt) beregnes på følgende måte: % bundet (relativt) = cpm bundet/gjennomsnittlig cpm bundet for standard av laveste fritt T^-konsentra-s jon.

Fig. 4 er en kurve som viser fritt T^-konsentrasjon

i ng% for ca. 200 prøver, hvorav hver ble undersøkt ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og dialysemetoden. Som vist er det en høy grad av korrelasjon mellom de to testmetoder. Fig. 5 er en kurve som viser frekvens av en gitt fritt T4~konsentrasjon ctra. fritt T4~konsentrasjon basert på ca. 200 prøver undersøkt i overensstemmelse med den fremgangsmåte som er angitt ovenfor. Fig. 6 er en kurve som viser fritt T4~konsentrasjon i ng% av ca. 100 prøver, hvorav hver ble undersøkt ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og den kinetiske radiobestemmelsestek-nikk. Som vist er det høy grad av korrelasjon mellom de to testmetoder .

Tabell 3 viser konsistensen av resultatene intra-bestemmelse.

Tabell .4 viser konsistensen av resultatene, inter-bestemmelse.

Mikrokapselen og prinsippet for dens virkemåte er angitt skjematisk i fig. 9. Som vist i fig. 9, fanges antistoff 9 som er spesifikt for digoksin innenfor veggen 10 i mikrokapselen 12. Veggene 10 i mikrokapselen 12 har imidlertid åpninger 14 som er små nok til å tillate fri passasje av digoksin. Således kan digoksin 16 fra prøven og merket digoksin 18 fritt passere gjennom veggene i mikrokapslene og konkurrere med hverandre om plassene på antistoff 9. Eventuelt ubundet digoksin 16 eller 18 kan vaskes ut fra mikrokapselen etter at inkuberingen er ferdig.

Som angitt ovenfor, er noe av digoksinet merket, og det er det merkede digoksin som konkurrerer med det umerkede digoksin

fra prøven når det gjelder plasser på antistoffet som er spesi-125 fikt for digoksin. Det foretrukne merkede digoksin er ( I) digoksin.

Testmetode

1. En eller flere prøver av serum som skal testes oppnås ved en fremgangsmåte som er velkjent på området. I dette eksempel anvendes kontrollprøver. 2. Pipetter ut 0,1 ml (100 pl) av hver standard, kontroll-prøve eller ukjent pasientserumprøve inn i tilsvarende merkede rør som inneholder 0,5 ml digoksin-antistoff-mikrokapselsuspensjon som fremstilt ovenfor. 125 3. Pipetter ut 0,5 ml (500 pl) av I-merket digoksin (i fosfatpufret saltvann) i hvert rør. Ryst på Vortex i minst 3-4 sekunder.

4. Inkuber alle reaksjonsrør i et vannbad (37°C) i minst

15 minutter. [Alternativt inkuber alle reaksjonsrør ved romtemperatur (20-25°C) i minst 30 minutter.] 5. Tilsett 0,5 ml (500 pl) vaskeløsning til hvert rør. Ryst på Vortex i minst 3-4 sekunder.

6. Inkuber alle reaksjonsrør ved romtemperatur (20-25°C) i

5 minutter.

7. Sentrifuger alle rør ved minst 1600 G, i 10 minutter ved romtemperatur (20-25°C), og dekanter supernatanten inn i en passende søppelbeholder, idet man oppfanger den siste dråpe på trekkpapir.

8. Tell alle rør i en gamma-teller justert for<1>25I i

1 minutt hver.

9. Avtegn punkter for standardkurve av kjente mengder av digoksin ctra. cpm og avles ukjente digoksinmengder fra denne kurve.

Anvendte reagenser

Digoksin/antistoffet er innkapslet i semipermeable nylonmikrokapsler suspendert i fosfatpufret saltvann som fremstilt ovenfor. For kvalitetskontroll inneholder antistoffmikrokapslene blått farvestoff (Comassie Blue R250^ " En ^>1^ supernatant,

etter at mikrokapslene er felt ut eller sedimentert via sentrifugering, ville indikere mikrokapselbrudd og eventuell antistoff-lekkasje.

^^ I- merket digoksin

125

Hver ml løsning inneholder lO^ug av I digoksin med mindre enn 4,2^uCi.

Pufferløsning

0,015 m fosfatpuffer, pH 7,5, inneholdende 0,15 m natriumklorid, 0,5 % okseserumalbumin (BSA), 0,1 % natriumazid.

Vaskeløsning

Polyetylenglykol 6000, 20 % løsning i 0,5 m barbitalpuf-fer, pH 8,9, inneholdende 0,15 m natriumklorid.

Beregning av resultater

Resultatene fra dette forsøk, en typisk test, er vist i tabell 5 og vist grafisk i figurene 7 og 8.

I fig. 7 er CPM avsatt på den lineære skala på 2-cyklus-semilog.-kurvepapir ctra. konsentrasjonen av digoksin i ng/ml (nanogram/milliliter) på logaritmeskalaen. Et alternativ til avsetning av CPM ctra. digoksin-konsentrasjon er å avsette % bundet (relativt) ctra. digoksin-konsentrasjon (se fig. 8). Dette kan utføres ved å beregne % bundet (relativt) for hver standard, kontrollprøve eller ukjent prøve og avsette disse verdier på 2-cyk-lus-semilog.-papir på lignende måte som beskrevet tidligere for CPM: % bundet (relativt) beregnet på følgende måte:

% bundet (relativt) = (gjennomsnittlig CPM bundet av 0 ng/ml digoksin-standard) x 100.

Analysesystemet i henhold til foreliggende fremgangsmåte har vist seg å være helt nøyaktig. Intrabestemmelsesvariasjonen er mindre enn 7 % og inter-bestemmelsesvariasjonen er mindre enn 9 %.

Intra- bestemmelsesvariasjon

Variasjonskoeffisientene, CV, for to kontrollprøver, hver analysert 2 5 ganger innen ett forsøk ble funnet å være:

Inter- bestemmelsesvariasjon

Variasjonskoeffisientene for to kontrollprøver, hver analysert tre ganger i 18 separate forsøk viste seg å være:

Tabell 6 viser den ekstremt høye spesifisitet for denne bestemmelse når det gjelder digoksin og til utelukkelse av andre potensielt interfererende forbindelser.

TABELL 6

Spesifisitet

% kryss-reaktivitet for forskjellige biokjemiske forbindelser med mikroinnkapslede antidigoksin-antisera:

Kvantitativ utvinning

Foreliggende fremgangsmåte har vist seg å være i høy grad kvantitativ, idet den reflekterer ikke mindre enn 96 % utvinning av de tilsatte digoksinprøver.

Det er av spesiell betydning å merke seg den høye grad av korrelasjon mellom resultatene ved foreliggende fremgangsmåte og digoksinbestemmelser foretatt ved andre analysemetoder.

Tabell 8 gir uttrykk for sammenlignende testresultater oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ctra.

resultater fra andre analyser.

Systemene A og C representerer væskebestemmelsessystemer med utfellingsreagensseparasjon, mens system B benytter fastfase-separasjon. Som vist er det en 0,97-0,98 korrelasjonskoeffisient.

Claims

1. Iiranunoanalytisk fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en forbindelse som er ubundet til protein, i en proteinholdig prøve ved at prøven inkuberes med et antistoff som er komplementært til den nevnte forbindelse og en merket analog av nevnte forbindelse, og som inneholdes i mikrokapsler som har membraner med en tilstrekkelig permeabilitet til å tillate nevnte forbindelse og dens merkede analog å vandre gjennom, men utilstrekkelig til å tillate passasje av nevnte antistoff eller proteinbundne forbindelser som er til stede i prøven,karakterisert vedat antistoffet separeres fra ubundet forbindelse og ubunden analog ved at det induseres en osmolalitetsforandring i reaksjonssystemet som får mikrokapslene til å klappe sammen, og mikrokapslene separeres fra resten av reaksjonssystemet; og mengden av den merkede analog som er bundet til antistoffet eller som ikke er bundet til antistoff, bestemmes.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat den nevnte forbindelse er L-tyroksin.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte forbindelse er digoksin.