NO170761B

NO170761B - Askorbat-2-polyfosfatforbindelser og fremgangsmaate til fremstilling derav

Info

Publication number: NO170761B
Application number: NO875277A
Authority: NO
Inventors: Paul A Seib; Ming-Long Liao
Original assignee: Univ Kansas State
Priority date: 1985-06-25
Filing date: 1987-12-17
Publication date: 1992-08-24
Also published as: NO170761C; HK6194A; NO875277D0; NO875277L

Description

Bakgrunn for oppfinnelse.

1. Oppfinnelsesområde.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører askorbat-2-polyfosfatestre samt fremgangsmåte til fremstilling av slike forbindelser og de tilsvarende salter derav. Nærmere bestemt ved-rører oppfinnelsen L-askorbat-2-trifosfat, som har vist seg å være en hittil ukjent, stabil form av vitamin C, og som kan fremstilles og utvinnes til lavere pris enn kjente stabile former av vitamin C, såsom monofosfatformen L-askorbat-2-fosfat.

2. Beskrivelse av teknikkens stilling.

L-askorbinsyre og D-isoaskorbinsyre er to stereoisomere askorbinsyrer med 6-karbonatomer. Disse syrer har mange anvendelser i farmasøytika, næringsmidler til dyr og mennesker og mange mindre betydningsfulle produkter. Anvendeligheten av L- askorbinsyre skyldes hovedsakelig dens vitamin C-aktivitet, dens evne til å virke kraftig reduserende og dens lave toksisitet, mens anvendelsen av D-isoaskorbinsyre avhenger av dens evne til å virke kraftig reduserende og dens lave toksisitet, mens anvendelsen av D-isoaskorbinsyre avhenger av dens evne til å virke kraftig reduserende og dens lave pris sammenlignet med L-askorbinsyre. Anvendelsen av D-isoaskorbinsyre i næringsmidler til dyr og mennesker er begrenset på grunn av dens lave vitamin C-aktivitet og dens antagonistiske virkning på absorbsjonen av L-askorbinsyre i fordøyelseskanalen. Som følge av at L-askorbinsyre reduserer oksygen går vitaminet ofte tapt når det kommer i kontakt med luft under behandling og oppbevaring av næringsmidler til dyr og mennesker. Ved langtidslagring i et surt medium, særlig i varme, dekomponeres L-askorbinsyre også av en annen pro-sess, som innebærer dehydratiskering av molekylet. Derfor har ernæringseksperter og næringsmiddelforskere lenge søkt etter en form av vitamin C som er stabil mot luft og oksygen, særlig mot luft.

To fremgangsmåter er tidligere blitt benyttet for å øke askorbinsyres stabilitet, nemlig innkapsling av de faste krystaller av L-askorbinsyre og kjemisk substitusjon av molekylets en-diol-funksjonelle gruppe. Fettinnkapslede former av vitamin C har adskillige ulemper. Jo større de krystaller av L-askorbinsyre som overtrekkes er, desto vanskeligere er det å fordele det overtrukne vitamin i et næringsmiddel til dyr eller mennesker, særlig dersom næringsmidlet er findelt. På den annen side gjelder at jo mindre krystallene av L-askorbinsyre er, desto mindre perfekt er innkapslingen. Typisk overtrekkes krystaller på 250-300nm med 15-50% tilsatt fettstoff. Under behandling av næringsmidlet til dyr eller mennesker kan det beskyttende fettovertrekk smeltes bort fra eller gnis av krystallene. Innkapslete partikler er overtrukket med triglyserider, som smelter ved 50-60°C, eller med voks, såsom caranauba, som smelter ved ca. 85°C. Det er sannsynlig at caranaubaovertrukket L-askorbinsyre ikke er fordøyelig og at den derfor er utilgjengelig for dyr. L-askorbinsyre er også blitt innkapslet med polymerer som langsomt oppløses, hvorved vitamin C frigjøres. Under behandling av næringsmidler til dyr eller mennesker kan disse typer overtrukne former gi vesentlige tap av vitaminet.

Kjemisk modifiserte former av L-askorbinsyre omgår proble-mene med stabilitet, partikkelstørrelse og biologisk tilgjenge-lighet av overtrukne former. De kjemisk modifiserte former er stabilisert mot oksygen ved substitusjon av 2- eller 3-hydroksyl-gruppen i L-askorbinsyre. Eksempler på disse derivater omfatter 2- eller 3-metyletrene, 2-sulfatesteren, 2-fosfatesteren og 2,2-bis-(L-askorbyl)-fosfatesteren. Av disse eksempler er det blitt påvist at 2-fosfatesteren av L-askorbinsyre er en aktiv form av vitamin C i aper og sannsynligvis i andre primater, såsom mennesker (L. J. Machlin et al., Am. J. Clin. Nutr., Vol 32, 1979, p. 325). 2-sulfatesteren er ikke en aktiv kilde for vitamin C i marsvin og aper (L. J. Machlin, Am. J. Clin. Nutr., Vol. 29, 1976, p. 825), men den er i fisk og muligens kreps (J. E. Halver et al., N.Y. Acad. Sei., Vol 258, 1975, p. 81). Metylestrene er bare ca. 5% aktive i marsvin (P.W. Lu et al., J. Ag. Food. Chem., Vol 32, 1984, p. 21). L-askorbat-2-fosfat (ASMP) har vært kjent siden 1961 da det første gang ble beskrevet av italienske forskere (E. Cutolo og A. Larizza, Gazz. Chim. Ital., Vol 91, 1961, p. 964). Andre forskere har siden bedret den kjemiske fremstilling L-askorbat-2-fosfat, slik at 8 6% av magnesiumsaltet kan isoleres i en nesten ren form uten kromatografisk rensing ved å starte med L-askorbinsyre (US-patentskrift 4.179.445). Fremgangsmåter til fremstilling av 2,2-bis-(L-askorbyl)fosfat gir bare middels gode resultater (ca. 30% utbytte, C.H. Lee et al., Carbohydrates Res., Vol 67, 1978, p. 127) men vitamin C-aktiviteten til diaskorbylfosfatet er ukjent. L-askorbat-2-pyrofosfat (L-askorbat-2-difosfat) er blitt fremstilt ved omsetning av fosforoksyklorid med 5,6-0-isopro-pyliden-L-askorbinsyre i en blanding av vann, aceton og pyri-din (H. Nomura et al., Chem. Phar. Bull., Japan, Vol 17, 1969, p. 381). Pyrofosfatesteren er blitt oppnådd i et utbytte på bare 5%, og den har måtte renses fra tre andre reaksjonspro-dukter ved anvendelse av ionebytterkromatografi. Det lave utbytte og den vanskelige rensing gjør L-askorbat-2-pyrofosfat til en upraktisk kilde for stabilt vitamin C for kommersielle formål.

I denne forbindelse skal det til slutt vises til JP-patent nr. 5 6-156272. I denne omtales det en løsning som inneholder cyklisk tri-metafosfat og askorbinsyre. Imidlertid er konsentrasjonen av det tilsatte salt henholdsvis aksorbinsyren altfor lav til at det skjer noen omsetning mellom disse. I tillegg til dette opereres det her med en for lav pH-verdi til at det kan initieres en reaksjon.

Sammenfatning av oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en hittil ukjent, stabil form av askorbinsyre, nemlig askorbat-2-polyfosfat (ASPP) og de tilsvarende salter derav, f.eks. alkalimetall-eller ammoniumsalter, selv om praktisk talt ethvert ønsket eller ammoniumsalter, selv om praktisk talt ethvert ønsket saltdannende kation kan anvendes. Askorbat-2-polyfosfatfor-bindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse har den generelle formel

hvor X og Y er forskjellige og hver er hydrogen eller hydroksy,

q er 1-4, og

Aj_, A2, A3, A4 og A5 hver er valgt blant hydrogen og saltdannende kationer.

Et spesielt foretrukket eksempel på en hittil ukjent forbindelse ifølge oppfinnelsen er L-askorbat-2-trifosfat, som i den ioniserte form har den generelle formel

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det dannes en reaksjonsblanding som inneholder respektive mengder av: 1) askorbinsyre eller et derivat derav, 2) et løselig salt av en metafosforsyre, 3) vann, samt 4) tilstrekkelig base til å gi blandingen en pH-verdi på minst ca. 9, og at blandingen får reagere til dannelse av askorbat-2-polyfosfat, idet reaksjonsblandingens pH-verdi under reaksjonen holdes på et nivå på minst ca. 9.

Deretter får blandingen reagere i et tidsrom som til-later at polyfosforyleringsreaksjonen skrider frem, f.eks. fra 1-24 timer, fortrinnsvis fra 1-12 timer. Under denne omsetning holdes reaksjonsblandingens pH-verdi imidlertid over ca. 9, vanligvis ved periodisk tilsetning av base. Det polyfosfory-lerte produkt kan anvendes direkte, eller spiselige salter derav kan lettvint utvinnes ved anvendelse av kolonnekromato-grafi.

De særlig foretrukne utførelser av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremgår av de etterfølgende krav 4-21.

Den særlig foretrukne forbindelse L-askorbat-2-trifosfat (ASTP) fremstilles ved omsetning av L-askorbinsyre (til å be-gynne med 1 molar oppløsning) med to ekvivalenter natriumtrimetafosfat i vann ved 32-35°C i nærvær av kalium- eller natriumhydroksid i en mengde som er tilstrekkelig til å holde reaksjonsblandingens pH-verdi på et nivå fra 10,5 til 12 i hele reaksjonstidsrommet. Nærmere bestemt er askorbinsyrefor-bindelsen fortrinnsvis valgt fra den gruppe som består av askorbinsyre, alkalimetallsalter av askorbinsyre, tertiære aminsalter av askorbinsyre og derivater av askorbinsyre, hvor det på Cg befinner seg en basestabil blokkeringsgruppe. Eksempler på denne sistnevnte type forbindelser er 5,6-acetal- og 5,6-ketalderivater av askorbinsyre, såsom 5,6-O-benzyliden-L-askorbinsyre og 5,6-0-isopropyliden-L-askorbinsyre. I den særlig foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen er askorbin-syrereaktanten valgt fra den gruppe som består av de fire stereoisomerer av forbindelsen med formelen

hvor

Z er valgt blant hydrogen, alkalimetaller, jordalkali-metaller og tertiære aminer,

n er valensen til Z, og

Q og M er forskjellige og velges blant hydrogen eller hydroksy samt forbindelser med formelen

hvor

Z]_ er valgt blant hydrogen, alkalimetaller, jordalkali-metaller og tertiære aminer,

n^L er valensen til Z-^, og

Y er cykloalkyl med 5-7 karbonatomer eller en gruppe med formelen

hvor er hydrogen, fenyl, furfural eller en alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, og R2 er hydrogen eller en alkylgruppe med 1-4 karbonatomer.

Fosforyleringsmidlet er et salt av metafosforsyre, M^PO^Jy/ som er et cyklisk polyf osf atanion med en negativ ladning y, en ringstørrelse med 2y atomer, og Mx er et metallion hvis kationiske nøytraliserer fosfatets negative ladning. Når y er 3 er fosforyleringsmidlet det lett tilgjengelige trimetafosfat, dvs.

Andre individuelle typer metafosfatsalter omfatter tetra-, penta- og heksametafosfatsalter. Et stort antall blandete meta-fosfater er mulige. De særlige foretrukne salter er alkalimetall-saltene, såsom natrium- eller kaliummetafosfat, selv om andre salter kan anvendes.

Reaktantene blandes fortrinnsvis i et vandig løsningsmiddel som ikke griper inn i den ønskede polyfosforyleringsreaksjon. Vann er det særlig foretrukne reaksjonsmedium. Tilstrekkelig base tilsettes, fortrinnsvis med mellomrom under reaksjonen, for at reaksjonsblandingens pH-verdi skal opprettholdes på minst ca. 9 under hele reaksjonen mellom bestanddelene. Dersom pH-verdien er for lav er dannelseshastigheten for ASPP langsom, mens de sterkt konsentrerte hydroksidioner, dersom pH-verdien er for høy (over ca. 13) vil reagere med metafosfatreaktanten istedenfor at denne reagerer med askorbat. Meget høy basisitet ødelegger således fosforyleringsmidlet. Dessuten begynner det ved en pH-verdi på over ca. 12 å akkumuleres et biprodukt, i reaksjonsblandingen, noe som fremgår av et ekstra absorbsjonsbånd ved 113 nm i sluttreaksjonsblandingens UV spektrum. Under en pH-verdi på 12 er sluttreaksjonsproduktets UV spektrum i alt vesentlig et enkelt absorbsjonsbånd med et absorbsjonsmaksimum ved 258 nm. Av disse årsaker er derfor det særlig foretrukne reaksjons-pH-verdiområde fra ca. 10 til ca. 12,5, særlig fra ca. 10,5 til 12, hvor det er tale om trifosforylering.

Den base som tilsettes til reaksjonsblandingen bør være praktisk talt blandbar med denne, ha en passende basestyrke for å oppnå den ønskede pH-verdi for reaksjonen og ikke bevirke utfel-ling av metafosfatreaktanten. Baser som består av alkalimetall-hydroksidene foretrekkes.

For å øke dannelsen av ASPP bør reaktantenes konsentrasjon reguleres i viss utstrekning. Når pH-verdien reguleres med natrium- eller kaliumhydroksid bør begynnelseskonsentrasjonen av askorbinsyre eller dens derivat (IV) være fra 0,5 til 4 M, mens det molare mengdeforhold mellom metafosfat og askorbat bør være fra 1,5 til 3. I den særlig foretrukne utførelsesform av fremgangsmåten til fremstilling av ASTP bør disse intervaller være 0,75-1,5 M med et molært mengdeforhold på 1,5-3.

Den øvre temperaturgrense for reaksjonen velges for å mini-malisere tapet av askorbinsyre under reaksjonen, for å minimali-sere biproduktet med UV-absorbsjon ved 313 nm og for å maksimali-sere UV-absorbsjonen av det ønskede ASPP ved 258 nm. Den nedre temperaturgrense er diktert av lengden av det reaksjonstidsrom som er nødvendig for å oppnå høy omdannelse av askorbat til fosfatesteren. Temperaturintervallet til fremstilling av L.-askorbat-2-trifosfat er 20-80°C med et foretrukket intervall på 25-55°C. Til fremstilling av 2-fosforylert askorbinsyre ut fra et metafosfat med høyere molekylvekt enn trimetafosfatet stiger den benyttede temperatur noe med metafosfåtets molekylstørrelse. Med heksametafosfat er reaksjonstemperaturen f.eks. 50-80°C. Reaksjonen utføres vanligvis slik at luft utelukkes for å unngå oksyda-tiv dekomponering av askorbinsyreutgangsmaterialet.

Den reaksjonstid som er nødvendig for å oppnå høye utbytter av ASPP avhenger av temperatur, pH-verdi og konsentrasjon av reaktanter. En høy pH-verdi, en høy temperatur og en høy konsentrasjon av reaktanter begunstiger korte reaksjonstider. Når f.eks 1,0 M L-askorbinsyre omsettes med 2,0 M natriumtrimetafosfat ved en pH-verdi på ca. 11 ved 55°C er praktisk talt all L-askorbinsyre omsatt i løpet av en time. Ved anvendelse av samme betingelser, bortsett fra at temperaturen er innstilt på 3 9°C, er 8 timer nødvendig for omsetning av alt L-askorbat. Når 1 M askorbinsyre omsettes med 2 M trimetafosfat ved 35°C og en pH-verdi på ca. 11 eller ca. 10, er det etter 8 timers forløp iaktatt en 2-fosforylering på henholdsvis 93% og 33%.

Etter at polyfosforyleringsreaksjonen er avsluttet, innstilles reaksjonsblandingens pH-verdi på 3-8, fortrinnsvis på en pH-verdi på 7, med en spiselig, uorganisk eller organisk syre. Den vandige reaksjonsblanding inneholder ingen skadelige løsningsmidler eller reaktanter, men den inneholder istedenfor uorganiske næringsstoffer, og når det er tale om polyfosfatestre av L-askorbinsyre, også vitamin C-aktivitet. En meget liten mengde askorbinsyre karamelliseres ved reaksjonsblandingens alkaliske pH-verdi, noe som gir en behagelig lukt og en lysegul farge. Det antas derfor at hele reaksjonsblandingen kan tilsettes til næringsmidler for dyr eller mennesker, med eller uten fjerning av reaksjonsvannet før den inntas som næring.

Dersom det ønskes et askorbat-2-polyfosfat som er uten uorganiske fosfatsalter, kan adskillelse og rensing lettvint oppnås ved anvendelse av ionebyttersøylekromatografi. F.eks. kan reaksjonsblandingen når det dreier seg om ASTP innstilles på en pH-verdi på 8,5 ved omrøring med en sterkt sur kationbytterharpiks i hydrogenioneformen. Kationbytterharpiksen fjernes hurtig ved filtrering, og blandingen tilsettes til toppen av en søyle av en sterkt basisk anionebytterharpiks i hydrogenkarbonatform. Eluering med 0,4 M ammoniumhydrogenkarbonat fjerner uorganiske fosfa-ter, og eluering med 0,5 M ammoniumhydrogenkarbonat eluerer rent askorbat-2-trifosfat. Inndampning av væsken fra søylen fjerner det meste av vannet og alt ammoniumhydrogenkarbonat. Deretter kan salter av ASTP med enhver ønskelig kation fremstilles ved å lede det gjenværende ammoniumsalt av ASTP gjennom en kationbytterharpiks i den valgte kationform. Rensing av ASTP kan også oppnås ved anvendelse av søylekromatografi med aktivt kull slik som beskrevet av Takeda Chem. Industries, Japan Kokai Tokyo Koho, JP 59 36, 539 (Chemical Abstracts, Vol. 101, 1984, 10695p).

Til rensing av andre 2-polyfosfatestre av askorbat utover ASTP kan det være nødvendig å innstille konsentrasjonen av eluer-ingssalt- og -baseløsninger i forhold til dem som anvendes for

ASTP.

2-polyfosfatestrene og askorbinsyre kan anvendes til fremstilling av 2-monofosfatesteren. I det sure området ved en pH-verdi på 0-1 hydrolyseres den uforgrenete fosfatkjede i et askor-

bat-2-polyfosfat fortrinnsvis mellom fosforylrester istedenfor mellom 0-2-stillingen på askorbatet og 2-fosforylresten. Trifosfatesteren hydrolyseres overveiende til L-askorbat-2-fosfat og litt L-askorbinsyre.

Som nevnt er hovedanvendelsen av de her omtalte forbindelser som en stabil kilde for vitamin C, som er motstandsdyktig mot oksidasjon og sur eller enzymatisk hydrolyse. De oppnådde produkter ved omsetning av L-askorbinsyre kan anvendes som tilsetnings-midler i næringmidler for dyr eller mennesker eller i farmakolog-iske preparater. Produkter oppnådd ved omsetning av D-isoaskorbinsyre kan anvendes i blanding ved kontrollerte mengder fosfataseenzym for å oppnå en vedvarende tilførsel av reduksjonsevne.

Det har overraskende vist seg at ASTP er mer stabil mot oksidasjon enn ASMP. Dessuten er L-askorbat stabilisert mot auto-oksidasjon av ASTP i vandig medium ved en pH-verdi på 7, sannsynligvis på grunn av evnen hos ASTP til å danne chelater av tover-dige mineralioner, såsom kobber og jern. Som sådanne har de hittil ukjente forbindelser ifølge oppfinnelsen bedre stabilitets-egenskaper enn det kjente monofosfatderivat.

Det laveste medlem av 2-polyfosfatestrene av L-askorbat fremstilt ifølge oppfinnelsen er 2-trifosfatesteren, som ligner adenosintrifosfat (ATP). ATP er til stede i alle celler, det er den kjemiske lagringsform for energi, og det deltar i utallige biokjemiske reaksjoner i levende organismer. Det er derfor mulig at ASTP ville kunne finne medisinske anvendelser dersom ASTP motvirker funksjonen til ATP i biokjemiske omdannelser.

2-trifosfatesteren av L-askorbinsyre er en aktiv form av vitamin C i marsvin, noe som er vist på tegningen, og nesten med sikkerhet i alle dyr. Fosfataseenzymer er til stede i fordøyel-seskanalen i alle dyr, og dette enzym fjerner tre fosfatrester fra ASTP på trinnvis måte inntil L-askorbinsyre er frigitt. Den trinnvise fjerning av fosfatrester fra adenosintrifosfat (ATP) med frigivelse av adenosin og uorganisk fosfat av fosfatase er blitt påvist flere ganger (K. L. M. Verheydes et al., J. Am. Chem. Soc, Vol. 87, 1965, p. 2257 og L. A. Heppel et al., J. Biol. Chem., Vol. 237, 1962, p. 841). Det antas derfor at ASTP vil finne anvendelse i næringsmidler for dyr og mennesker både til ernæringsmessige og sannsynligvis funksjonelle formål. ASTP kunne liksom ASMP også anvendes til stabilisering av helblod (G.

L. Moore et al., Transfusion, Vol. 21, 1981, p. 723).

Tre separate hydrolytiske trinn er nødvendig for å frigjøre L-askorbat fra ASTP, mot bare ett trinn for slik frigivelse fra askorbatmonofosfat (ASMP). Det er derfor fremsatt den teori at den økte hydrolyttiske stabilitet hos ASTP sammenlignet med ASMP kan nå forklares av denne faktor. Den økte oksidative stabilitet hos ASTP i forhold til ASMP er imidlertid overraskende, slik det er vist i tabell III nedenfor.

ASMP dekomponeres fullstendig ved hydrogenperoksidoksida-sjon, mens 55% ASTP blir tilbake under samme betingelser. Under alle omstendigheter antas det at ASTP og andre ASPP-estre kan danne en stabil kilde for vitamin C i næringsmidler for dyr og mennesker, hvor ASMP syre- eller enzymhydrolyseres til L-askorbinsyre med ledsagende tap av vitamin C-aktivitet. I andre systemer som inneholder begrensede mengder fosfatase vil en blanding av ASMP og ASPP kunne frembringe en langsom og vedvarende frigivelse av L-askorbinsyre i et tidsrom som er lenger enn for en ekvivalent mengde ASMP alene. I visse systemer kan det fosfat som frigis ved enzymatisk hydrolyse av ASPP være høyt nok for konkur-rerende inhibering av fosfataseenzymet, slik at tap av det 2-fosforylerte derivat ville kunne minskes og gi en meget langsom fri-givelseshastighet for askorbinsyre. Det oksydative tap av vitamin C i næringsmidler for dyr og mennesker som innholder ASPP ville også kunne forventes å være langsom sammenlignet med næringsmidler som inneholder ASMP.

Den medfølgende tegning viser et diagram over et marsvin-foringsforsøk utført for å bekrefte vitamin C-aktiviteten hos en foretrukket forbindelse ifølge oppfinnelsen, nemlig L-askorbat-2-trifosfat.

Beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer.

I de etterfølgende eksempler beskrives de særlig foretrukne fremstillingsmåter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Et 250 ml begerglass var utstyrt med en pH-elektrode, en magnetomrører, et nitrogentilførselsrør samt en byrette. Til begerglasset, som var plassert i et vannbad ved 33-35°C, ble det i rekkefølge tilsatt 55 ml vann, 10g (57 mmol, 1,03 M) L-askorbinsyre og 10 M kaliumhydroksid til en pH-verdi på ca. 11,0. Natrium- eller kaliumtrimetafosfat (95-97% renhet, ca. 114 mmol) ble tilsatt, reaksjonsblandingen ble spylt kontinuerlig med nitrogen, og pH-verdien ble holdt på 10,9-11,2 ved periodisk tilsetning av 10 M kaliumhydroksid. Reaksjonsblandingen ble omrørt kontinuerlig i en reaksjonstid på 8 timer. Reaksjonsblandingen, som hadde et samlet volum på ca. 100 ml, ble tynnet til et volum på 250 ml med vann, og en porsjon 5,0 ml ble øyeblikkelig filtrert ved 0,05 N vandig jod. Jodtiteren (2,82ml) viste 6,2% uomsatt L-askorbat.'En annen porsjon på 2,0 ml av den tynnede reaksjonsblanding ble tynnet ytterligere, 6250 ganger, i 0,01 M natriumkarbonatbuffer ved en pH-verdi på 10. Den tynnede blanding med pH-verdien på 10 ble hensatt i 2 timer. I løpet av dette tidsrom ble L-askorbatet dekomponert ved C^-oksidasjon som vist ved UV-utprøving i et separat forsøk. I dette separate forsøk ble reaktantene blandet uten pH-innstilling (noe som ga en pH-verdi ca. 3), blandingen tynnet ved pH-verdi på 10, og absorbsjonen avlest ved 258 nm og en pH-verdi på 10 var 0,004 etter henstand i 2 timer. Etter at den tynnede trifosforyleringsreaksjonsblanding med pH-verdien 10 hadde stått i 2 timer var UV-absorbsjonen ved 258 nm 0,537, noe som viste en 2-fosforylisering av L-askorbat på 92,3% (under antagelse avg^ på 16 ved en pH-verdi på 10 for 2-fosforylierte estre, se Lee et al., Carbohydrat Res., Vol. 67, 1978, p. 127). Forholdet mellom UV-absorbsjon ved 313 nm og ved 258 nm var 0,014, noe som viste en meget liten mengde biprodukter i reaksjonsblandingen.

Fosforsyre eller saltsyre tilsettes deretter til reaksjonsblandingen til en pH-verdi på 7,0, og blandingen inndampes til et lysegult fast stoff. Alternativt isoleres L-askorbat-2-trifosfat (ASTP) i ren form ved søylekromatografi. Reaksjonsblandingens pH-verdi (sluttvolum ca. 100 ml) innstilles på 8,5 ved tilsetning av en sterkt sur kationbytterharpiks (H -form), harpiksen fjernes, og blandingen tynnes deretter til 250 ml. En porsjon på 40 ml fylles i en søyle (5 x 40cm, 0,037- 0,074mm) av sterkt basisk anionbytterharpiks i hydrogenkarbonatformen. Uorganiske fosfatsalter, påvist ved hjelp av molybdatreagens, elueres først med 0,4 M ammoniumhydrogenkarbonat ved en strømningshastighet på 1-2 ml/minutt. Deretter elueres askorbat-2-trifosfat, påvist ved UV-absorbs jon ved 258 nm, med 0,5 M ammoniumhydrogenkarbonat. Etter kombinasjon av fraksjonene inndampes løsningene til tørr tilstand, vann tilsettes to ganger, og blandingen inndampes på nytt. Det sirupsaktige ammoniumsalt av ASTP løses i vann, ledes gjennom en sterkt sur kationbytterharpiks i natriumformen, og væskestrømmen fra søylen inndampes til et amorft fast stoff. Natriumsaltet ga den riktige elementæranalyse, ^<1>P-, ^"H- og ^C--NMR-spektre og UV-egenskaper i overenstemmelse med natrium-L-askorbat-2-trifosfat.

Analyse for CgH7015<P>3<N>a4<*>2H20:

Beregnet: C = 13,33%, H = 2,04%, P = 17,22%, Na = 17,04%

Funnet: C = 13,19%, H = 1,83%, P = 16,73%, Na = 17,84%.

EKSEMPEL 2

En annen trifosforyleringsreaksjon ble gjennomført slik som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at utgangsmaterialet var 12,3g av et 5,6-acetalderivat, nemlig 5,6-0-isopropyliden-L-askorbinsyre. Jodtitrering viste ca. 10% uomsatt L-askorbinsyre, og UV-absorbsjon ved 258 nm viste 86% 2-trifosforylering. For fjerning av den blokkerte isopropylidengruppe ble den tynnede reaksjonsblanding, 150 ml, behandlet med en sterkt sur kationbytterharpiks i hydrogenform til en pH-verdi på 3,0. Harpiksen ble hurtig fjernet ved filtrering, og fjerningen av 5,6-acetalet ble overvåket ved hjelp av tynnsjiktskromatografi. Når acetal-hydrolysen var avsluttet ble blandingen innstilt på en pH-verdi på 8,0 med natrium- eller kaliumhydroksid. Isolering av reak-sjonsproduktene ble avsluttet slik som beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 3

Trifosforyleringsreaksjonen ble gjennomført slik som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at det ble anvendt D-isoaskorbinsyre istenenfor L-askorbinsyre. Omdannelsen av D-isoaskorbinsyre til dens 2-trifosfatester foregikk i et utbytte på ca. 90%, og isoleringen av produktet ble gjennomført slik som beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 4

I dette forsøk ble pH-verdien av den i eksempel 1 beskrevne trifosforyleringsreaksjonen variert. Ved omrøring av 10g L-askorbinsyre med 3 6,6g (2 ekvivalenter) natriumtrimetafosfat var reaksjonsblandingen pH-verdi ca. 3. Etter 12 timers reaksjon ved 35°C har det ikke foregått noen fosforylering, noe som viste seg ved jodtitrering, UV-analyse og tynnsjiktskromatografi. Etter 10 døgns omrøring viste UV-undersøkelse ved 258 nm 5% 2-trifosforylering. Ved økning av reaksjonsblandingens pH-verdi og bibehold av denne på 10 i 8 timer ved anvendelse av natrim- eller kaliumhydroksid viste jodtitrering ca. 65% uomsatt L-askorbinsyre, mens UV-absorbsjon ved 258 nm viste ca. 33% 2-trifosforylering. Når reaksjonsblandingens pH-verdi ble holdt på 12,8-13,1 vist jodtitrering 40% uomsatt L-askorbinsyre, og UV-analyse viste 52% 2-trifosforylering. Ved gjennomføring av reaksjonen ved en pH-verdi på 12,8-13,1 var dessuten forholdet mellom UV-absorbsjonen ved henholdsvis 313 nm og 258 nm 0,12, noe som viste dannelse av et biprodukt i reaksjonsblandingen. Når reaksjonsblandingens pH-verdi ble holdt i det særlig foretrukne pH-intervall 10,5-12 ved hjelp av natriumhydroksid, viste jodtitrering 5% uomsatt L-askorbinsyre og UV-analyse 87% 2-trifosforylering.

EKSEMPEL 5

Fosforyleringsreaksjonen ble utført slik som i eksempel 1 bortsett fra at L-askorbinsyrekonsentrasjonen ble senket fra 1 M til 0,5 M. Etter 8 timers reaksjonstid viste jodtitrering 32% uomsatt L-askorbat, mens UV-analyse viste 65% 2-trifosforylering. Når konsentrasjonen av L-askorbat holdes på 1 M, men molekviva-lentene av trimetafosfat endres fra 2 til 3, stiger utbyttet av 2-trifosfat ikke over 93%.

Reaksjonstemperaturen i eksempel 1 ble også variert fra 20°C til 80°C. Ved temperaturer på over 60°C falt utbyttet av 2-

trifosfat, mens forholdet A,,, _/A~CQ _ vokste. Ved en reak-313 nm Zoo nm

sjonstemperatur på 20°C inneholdt reaksjonsblandingen etter 8 timers forløp 25% uomsatt utgangsmateriale og 75% 2-trifosfatester.

Det er også blitt bekreftet at oppførselen til 2-monofosfatesteren L-askorbat, ASMP, overfor enzymet fosfatase er for-skjellig fra oppførselen til 2-trifosfatesteren, ASTP. ASMP frigir L-askorbinsyre langt hurtigere enn ASTP når de behandles med en renset fosfatase av poteter, se tabell I. Dessuten er ASTP mer motstandsdyktig enn ASMP overfor syrekatalysert frigivelse av L-askorbat, se "blind"-reaksjonene i tabell I. I en buffer med en pH-verdi på 5,0 frigav ASTP intet L-askorbat etter 20 timers for-løp, sammenliknet med ca. 15% frigitt av ASMP.

TABELL 1

Enzymatisk hydrolyse av L-askorbat-2-fosfat (ASMP) og L-askorbat-2-trifosfat (ASTP) ved anvendelse av sur fosfatase fra poteter.

L-askorbat frigitt (%) under enzymolyse1^.

^ Enzymolyse ble gjennomført ved 25°C ved omrøring av 200

(imol magnesium-L-askorbat-2-fosfat eller ammonium-L-askorbat-2-trifosfat i 100 ml 0,05 M acetatbuffer (pH-verdi 5,0) innehold-ende ca. 400 mg komprimert bakerigjær og 2 enheter fosfatase (1 enhet aktivitet hydrolyserer 1 \ imol p-nitrof enylf osf at ved pH-verdi 4,8 og 37°C). Etter en gitt reaksjonstid uttas en porsjon på 5 ml, blandes med 5,0 ml 12% trikloreddiksyre/4% metafosforsyre, og blandingen filtreres. En porsjon på 5 ml av filtratet titreres med 2,6-diklorfenolindofenol til lyserødt sluttpunkt. Blindoppløsninger inneholder alle reagenser untatt fosfatase.

Den langt større stabilitet av ASTP i forhold til ASMP overfor fosfatase er også blitt iaktatt i et modellnæringsmiddel-system, slik som vist i tabell II. Omrørt med en tynnet suspen-sjon av hvetemel ved 25°C ble ASMP fullstendig hydrolysert i løpet av 1 time, mens ASTP krevde 10-20 timer til en hydrolyse på 95%.

TABELL II

Enzymatisk hydrolyse av L-askorbat-2-fosfat (ASMP) og L-askorbat-2-trifosfat (ASTP) i nærvær av hvetemel. L-askorbat frigitt (%)

DA

under enzymolyse

<1>) Enzymolyse og titrering av frigitt L-askorbat ble gjennomført som beskrevet i fotnoten til tabell I, bortsett fra at fosfatasen var den, som foreligger i hvetemel. 2 g hvetemel ble anvendt i 100 ml enzymolysereaksjonsblanding.

L-askorbat-2-trifosfat er ca. 2 ganger så vanskelig å oksidere som L-askorbat-2-monofosfat. Ved behandling av ASTP og ASMP under like betingelser (pH-verdi 7, 25°C) med hydrogenperoksid i 8 døgn blir 77% ASTP værende uomsatt, mens 44% ASMP blir

tilbake. Etter 14 døgns oksydasjon er det 0% ASMP tilbake sammenliknet med 55% ASTP. Stamforbindelsen, L-askorbinsyre, dekomponeres i løpet av mindre enn 1 time, slik det fremgår av tabell III.

Det er klart av ASTP er langt mer stabilt i næringsmidler til dyr og mennesker, som inneholder fosfataseenzym eller oksidasjons-midler, såsom oksygen.

^ Reaksjonsblandingen inneholdt 0,05 ml 30% prosentig vandig hydrogenperoksid og 200 (imol L-askorbat eller dets 2-f osf orylerte derivat i 100 ml 0,05 tris-buffer (pH-verdi 7,0). Etter en gitt reaksjonstid ble en porsjon på 1 ml av reaksjonsblandingen inne-holdende den 2-fosforylerte ester 10 tynnet ganger med tris-buffer ved en pH-verdi på 7, og blandingens UV-absjorbsjon ble avlest ved 258 nm. For å følge tapet av L-askorbinsyre ble en porsjon på 1 ml av reaksjonsblandingen tynnet med 2% prosentig metafosforsyre, og UV-absorbsjonen ble avlest ved 245 nm.

' ASMP = L-askorbat-2-fosfat; ASTP = L-askorbat-2-trifosfat.

EKSEMPEL 6

Engelske, korthårede marsvin ble anbrakt individuelt i et bur og foret med en Purina-marsvinrasjon i et akklimatiserings-tidsrom på en uke. De unge marsvin som veide 190 - 250 gram ble delt i fire grupper med 10 dyr i hver. Den ene gruppe ble foret méd en diett som var fri for vitamin C (Reid-Briggs-marsvindiett, U.S. Biochemicals, Cleveland, Ohio), den andre gruppe fikk samme diett, men supplert med 5,0 ml L-askorbinsyre pr. kg. legemsvekt pr. dag, den tredje gruppe fikk 15,4 mg renset tetranatrium-L-askorbat-2-trifosfat-dihydrat (L-askorbat-2-tri-PO^, renset) pr. kg. legemsvekt pr. dag, og den fjerde gruppe fikk 15,4 mg tetra-natrium-L-askorbat-2-trifosfat-dihydrat (L-askorbat-2-tri-P04, reaksjonsblanding) blandet med biproduktene i reaksjonsblandingen som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at den lille mengde uomsatt L-askorbinsyre i reaksjonsblandingen ble dekomponert ved 02-oksidasjon. 15,4 mg tetranatrium-L-askorbat-2-trifosfat-dihydrat er ekvivalent med 5,0 mg L-askorbinsyre. Vitamin C ble administrert oralt med en kalibrert sprøyte fra løsninger som ble holdt på 5°C, hvorved ny L-askorbinsyreløsning ble fremstilt daglig. Dyrenes vekt ble notert daglig, og det arimetriske middeltall for hver enkelt gruppe ble beregnet og angitt i figuren.

Dette forsøk er beregnet på å bekrefte vitamin C-aktiviteten av L-askorbat-2-trifosfat i marsvin.

Vitamin C-aktiviteten av ASTP er innlysende ut fra de kurver som er vist på tegningen. L-askorbat-2-trifosfat admini-streres til dyrende enten i ren form (kurve betegnet L-askorbat-2-tri-P04, renset) eller i blanding med alle produktene i trifos-foryleringsreaksjonsblandingen (kurve betegnet L-askorbat-2-tri-PO^, reaksjonsblading). De grupper av dyr som mottar begge disse former for ASTP, vokser med en hastighet som er lik hastigheten hos den gruppe som som fores med en ekvivalent mengde L-askorbinsyre. Den gruppe dyr som ikke mottok noen supplerende kilde for vitamin C tapte imidlertid vekt og vokste dårlig ved begynnelse omtrent den 14. dag av foringsforsøket. De dyr som fikk ASTP som kilde for vitamin C, hadde en fortreffelig helse under hele for-søket og vist ingen kliniske tegn på mangel på vitamin C.

EKSEMPEL 7

2-polyfosforyleringen av askorbinsyre ble utført slik som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at 1,0 M L-askorbinsyre (begynnelseskonsentrasjon) ble omsatt med 2,0 M natriumheksameta-fosfat ved 75-80°C og en pH-verdi på 11,5-12,0. Etter en reaksjonstid på 2 timer ble det påvist 42% uomsatt L-askorbat (jodtitrering) og 49% 2-fosforylering (UV-analyse). Det er således

10% av L-askorbatutgangsmaterialet som det ikke er gjort rede for, noe som tyder på en viss dekomponering av utgangsmaterialet ved den høye pH-verdi og temperatur ved reaksjonen.

Tynnsjiktskromatografi av reaksjonsblandingen ble foretatt ved anvendelse av en fleksibel film overtrukket med cellulose. Etter anbringelse av reaksjonsblandingen på den kromatografiske film, ble kromatogrammet fremkalt ved anvendelse av en 30:30:15:20:0,4:5-blanding (volum/volum/volum/volum/volum/vekt) av vann, etanol, isobutanol, isopropanol, konsentrert ammonium-hydroksid og trikloreddiksyre. Ved sprøyting av det tørkede kromatogram med en etanolisk løsning av jern-III-klorid (1%) gav reaksjonsblandingen seks lyserødt fargede komponenter. De mest intense flekker viste seg å ha en mobilitet som er lik mobilite-ten til 2-mono-, 2-di- og 2-trifosfatestrene av L-askorbat. De høyere fosfatestre av L-askorbat gav svake lyserøde flekker.

Claims

1. Askorbat-2-polyfosfatforbindelser, karakterisert ved at de har formelen hvor X og Y er forskjellige og hver er hydrogen eller hydroksy, q er 1-4, og A-j_, A2/ A3, A4 og A5 hver er valgt blant hydrogen og saltdannende kationer.

2. Forbindelse i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den er askorbat-2-trifosfat.

3. Fremgangsmåte til fremstilling av askorbat-2-polyfosfat-forbindelser, karakterisert ved at det dannes en reaksjonsblanding som inneholder respektive mengder av: 1) askorbinsyre eller et derivat derav, 2) et løselig salt av en metafosforsyre, 3) vann, samt 4) tilstrekkelig base til å gi blandingen en pH-verdi på minst ca. 9, og at blandingen får reagere til dannelse av askorbat-2-polyfosfat, idet reaksjonsblandingens pH-verdi under reaksjonen holdes på et nivå på minst ca. 9.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at reaktanten (1) velges blant askorbinsyre, alkalimetall- og tertiære aminsalter av askorbinsyre og derivater av askorbinsyre, som inneholder en basestabil, Cg-blok-kerende gruppe.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at reaktanten (1) velges blant de fire stereoisomerer av forbindelsen med formelen (III) hvor Z er valgt blant hydrogen, alkalimetaller, jordalkali-metaller og tertiære aminer, n er valensen til Z, og Q og M er forskjellige og velges blant hydrogen, hydroksy og forbindelser med formelen IV Z er valgt blant hydrogen, alkalimetaller, jordalkali-metaller og tertiære aminer, n-L er valensen til Z^_, og Y er cykloalkyl med 5-7 karbonatomer eller en gruppe med formelen V hvor R-L er hydrogen, fenyl, furfural eller en alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, og R2 er hydrogen eller en alkylgruppe med 1-4 karbonatomer.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2, karakterisert ved at reaktenten (2) er natrium- eller kaliumtrimetafosfat.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at pH-verdien holdes på et nivå fra 9 til 13.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 7, karakterisert ved at pH-nivået er fra 10 til 12,5.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 8, karakterisert ved at pH-nivået er fra 11 til 12.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at reaksjonen utføres ved en temperatur på fra 20 til 80°C.

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10, karakterisert ved at temperaturen er fra 30 til 50°C.

12. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at reaksjonen utføres i et tidsrom på fra 1 til 25 timer.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 12, karakterisert ved at tidsrommet er fra 1 til 12 timer.

14. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at reaktantens (1) sluttkonsentrasjon er fra 0,05 til 4 molar i reaksjonsblandingen, og at molforholdet mellom reaktanten (2) og reaktanten (1) er fra 1,5 til 3.

15. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at konsentrasjonen av den første vektenhet er fra 0,75 til 1,5 molar.

16. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at et trinn hvor reaksjonsblandingens pH-verdi innstilles ved tilsetning av en syre etter at reaksjonen er avsluttet.

17. Fremgangsmåte i samsvar med krav 16, karakterisert ved at syren er en spiselig mineralsk eller organisk syre.

18. Fremgangsmåte i samsvar med krav 16, karakterisert ved at syren tilsettes for å senke reaksjonsblandingens pH til ca. 7.

19. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at askorbat-2-polyfosfat utvinnes fra reaksjonsblandingen .

20. Fremgangsmåte i samsvar med krav 19, karakterisert ved at utvinningen utføres ved at reaksjonsblandingen ledes gjennom en ionebytterkolonne, og at et salt av askorbat-2-polyfosfat utvinnes.

21. Fremgangsmåte i samsvar med krav 16, karakterisert ved at askorbat-2-polyfosfatet behandles med syre til dannelse av fortrinnsvis L-askorbat-2-polyfosfat.