NO171477B - Immunokjemisk reagens, syntetisk polypeptid, rekombinant dna og plasmid for fremstilling derav, vertscelle transformert med sistnevnte, og proevesett for immunologisk maaling - Google Patents
Immunokjemisk reagens, syntetisk polypeptid, rekombinant dna og plasmid for fremstilling derav, vertscelle transformert med sistnevnte, og proevesett for immunologisk maaling Download PDFInfo
- Publication number
- NO171477B NO171477B NO865094A NO865094A NO171477B NO 171477 B NO171477 B NO 171477B NO 865094 A NO865094 A NO 865094A NO 865094 A NO865094 A NO 865094A NO 171477 B NO171477 B NO 171477B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- immunochemical
- protein
- htlv
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 84
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 38
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 3
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 101710090322 Truncated surface protein Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 101710086578 Chaperone protein gp12 Proteins 0.000 claims 1
- 101710102575 Pre-neck appendage protein Proteins 0.000 claims 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 22
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 7
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 7
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 7
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 101710147327 Calcineurin B homologous protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 101100096227 Bacteroides fragilis (strain 638R) argF' gene Proteins 0.000 description 1
- 101100398597 Botryotinia fuckeliana lcc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 208000000832 Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 101100068374 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) GIP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101100354186 Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (strain California kid / ATCC 27343 / NCTC 10154) ptcA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150056313 argF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150011498 lad gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in epitope analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører et immunokjemisk reagens bestående av et syntetisk polypeptid for in vitro anvendelse, omfattende minst én aminosyre-sekvens med de immunokjemiske egenskapene til aminosyresekvensen av HTLV-III isolat HAT-3, deponert hos ATCC under deponeringsnr. 40213, et rekombinant DNA og et plasmid for anvendelse ved fremstilling derav, en vertscelle transformert med dette plasmidet, HTLV-III isolat HAT-3, og et prøvesett for bruk i en immunologisk måling.
Sykdommen AIDS (acquired immune deficiency syndrome) er
først nylig blitt erkjent som en rasktspredende epidemi med ofte dramatiske og knusende følger for offrene. Det er også funnet at AIDS spres ved virusinfeksjoner, og dette forårsakende virus har fått navnet HTLV-III (Science, 224, 497-508, 1984). Alternative navn så som LAV og ARV-2 ble også brukt av forskjellige forskere for å navngi deres isolater av viruset som forårsaker AIDS. I foreliggende søknad vil navnet HTLV-III brukes hele veien for å omfatte også LAV, ARV-2 og alle andre varianter som forårsaker AIDS. De således navngitte varianter ble vist å være meget nær beslektet med hensyn til sin genomiske organisasjon.
Ikke desto mindre ble det ved kloning og molekylær karak-terisering av HTLV-III også vist at uavhengige isolater av viruset har betydelige avvik i DNA-sekvens, hvilket reflekteres i forskjellene hos deres restriksjonsenzym-spaltningsmønstre. Disse observasjoner i kombinasjon med DNA-sekvensanalyse har ført til den generelle antagelse at punkt-mutanter som er ansvarlig for genetisk variasjon og genetisk forskyvning i HTLV-III, kan bidra til dette virusets patogenisitet. Slik genetisk forskyvning har vist å være ansvarlig for øket patogenisitet i Visna virusisolater (elements et al., PNAS, 77: 4454-4458, 1980). Likeledes kan gjentatte feberforekomster i encefalitis bevirket av hestedyrencefalitis-virus, være resultatet av mutasjoner som oppstår i den infiserte populasjon (Montelaro et al., Journal of Biological Chemistry, 259: 10539-10544, 1980). Viruset HTLV-III, selv om det er vist å være forskjellig fra andre RNA-virus ved nukleinsyre-sekvensbestemmelse, er tydelig
et medlem av retrovirus-familien.
Den generelle genomiske organisasjon av HTLV-III-virus-nukleinsyren er vist i figur 1. Denne figuren viser tre hoved-gener av viruset. Ga<g> er gruppen kapsid-antigen-forstadiums-genet; pol er reverstranskriptase-genet; og env er forstadiets gen til hylseglykoproteinet. To ytterligere åpne leserammer (ORF's), merket 1 og 2, er vist. Genet for den transaktiverende faktor av HTLV-III tilsvarer 0RF1. Funksjonen av ethvert geneprodukt fra 0RF2 er ukjent. Bokseområdene ved endene av figur 1 representerer de virale langterminale gjentagelser (LTR'er).
Produktene av de tre hovedvirusgener kan karakteriseres kort som følger:
I. gag Geneprodukter.
Plassert ved 5'enden av genomet koder gag åpen leseramme-sekvensen for et 55K Mr (molekylmasse) forstadiumsprotein. Dette forstadium viderebehandles til tre ferdige proteiner. Aminosyrene 1 til og med 132 tilsvarer et 17K virion-protein og inngår sannsynligvis i morfogenesen. Det neste ferdige protein er hovedkapsel-strukturproteinet, p24. Resten av <g>a<g> poly-proteinet (pl5), et meget basisk protein, inngår sannsynligvis i nukleinsyrebinding.
II. pol Geneprodukter.
Den forutsagte aminosyresekvens av den andre lange åpne leseramme fra HTLV-III viser homologi og likhet med andre pol gener av andre retrovirus. Denne 3.044 nukleotid lange åpne leseramme har evnen til å kode for et 1.015 aminosyre-forstadiumprotein for den reverse transkriptase som foreligger i HTLV-III virion. I tillegg til 5' reverstranskriptase informasjonen, foreligger 3' genetisk informasjon, sannsynligvis involvert i endonuklease- og integrasefunksjoner som er nødvendige for virusreplikasjonen.
III. env Geneprodukter.
env-lor -området av HTLV-III koder for et forstadiumprotein ca. 863 aminosyrer langt. Dette primære geneprodukt, Mr 160K, kan også påvises i infiserte celler. Dette forstadiet spaltes i to
produkter, et hydrofilt utvendig protein (gpl20) som er glyko-sylert og et hydrofobt transmembransegment. Virionet gp41 tilsvarer transmembranproteinet. Det er en høy konserveringsgrad av aminosyresekvens ved transmembranprotein behandlingspunktet. Områdene utenfor dette er mindre godt konservert og viser betydelig forskjell i nukleotid og aminosyresekvensnivå når forskjellige virusisolater sammenlignes.
Så snart forskjellige isolater fra HTLV-III hadde blitt klonet av forskjellige forskere, ved segmenter av genomet som
ble definert ved DNA-sekvensanalyse gjort til mål for genesløyd. Publisert arbeide inneholder genesløyd og ekspresjon i E. coli av forskjellige segmenter av env-genet av HTLV-III. Virusisolat BH-10 ble uttrykt i åpne leserammevektorer (Chang et al., Science.
228: 93-95, 1985; Chang et al., Biotechnolo<g>y. 3_: 905-909, 1985). På lignende måte ble env-genet av virusisolatet HXB-3 klonet og uttrykt i E. coli av Crowl et al. (Cell, 41: 979-986, 1985) .
For å stoppe den nåværende observerte sterke spredning av AIDS, innføres rutineundersøkelser av blant annet blod med hensyn til nærvær av virus eller antistoffer mot det i meget stor skala. Forsøkene som for tiden er i bruk for påvisning av antistoffer mot HTLV-III, bygger på et eller flere immuno-reagenser inneholdende antigenmateriale som stammer fra den naturlige virus.
Et minst like viktig instrument for å stoppe spredningen av sykdommen vil være en vaksine som effektivt beskytter risiko-gruppene i kontakt med viruset mot infeksjon med HTLV-III. For immuno-diagnostiske formål er det et anerkjent behov for effektivt antigenmateriale som stammer fra en trygg kilde, og følgelig ikke stammer direkte fra den naturlige virus.
Den aktuelle fremgangsmåte for fremstilling av dette (polypeptid) antigenmateriale er følgelig den syntetiske vei, spesielt i organisk-kjemisk syntese eller ved rekombinant DNA-teknologi.
Det er et formål for foreliggende oppfinnelse å frembringe et immunokjemisk reagens som kan settes i bruk for de ovenfor nevnte formål.
Dette immunokjemiske reagens er karakterisert ved at det omfatter en kombinasjon av to eller flere syntetiske polypeptidsekvenser valgt fra gruppen bestående av
en polypeptidsekvens som etterligner minst én antigendeterminant av gag-antigenet som befinner seg mellom to Pst I restriksjonsenzym-spaltningsseter av
HTLV-III isolatet HAT-3 (figur 2.1.)»* ;en polypeptidsekvens som etterligner minst én antigendeterminant av glykoproteinet gpl20 som befinner seg mellom to Pst I restriksjonsenzym- spaltningsseter av HTLV-III-isolatet HAT-3; og ;en polypeptidsekvens som etterligner minst én antigendeterminant av glykoproteinet gp41 som befinner seg mellom Kpn I og Pst I restriksjons-spaltningssetene av HTLV-III-isolat HAT-3, hvilket HTLV-III isolat HAT-3 er deponert hos ATCC under deponeringsnr. 40213. ;Med en kombinasjon av polypeptidsekvenser menes her enhver fysikalsk eller kjemisk sammensetning av disse polypeptider, så som et enkelt syntetisk polypeptid som inneholder de to eller flere polypeptidsekvenser, eller en blanding av syntetiske polypeptider som hver inneholder minst en av polypeptidsekvensene. ;Som vist ovenfor betyr uttrykket syntetisk her at det stammer fra en annen kilde enn den naturlige. Følgelig medfører dette blant annet: fremstilt ved organisk-kjemisk syntese (spesielt medfører dette for foreliggende polypeptider en av de velkjente metoder for polypeptidsyntese, så som fastfasemetoden ifølge Merrifield), eller fremstilt ved ekspresjon av et rekombinant polynukleotid som inneholder en polynukleotid-sekvens, som koder for et eller flere av de foreliggende polypeptider i en verts-mikroorganisme. ;Polypeptidsekvensene som etterligner antigendeterminantene kan foreligge som sådanne i det immunokjemiske reagens ifølge oppfinnelsen, de kan være bundet til hverandre og/eller til ytterligere polypeptidsekvenser, og/eller til en egnet bærer o.s.v. Dette er sterkt avhengig av den tilsiktede bruk av det immunokjemiske reagens (vaksinasjon eller immuno-diagnose). ;For bruk i en immunokjemisk målemetode kan det immunokjemiske reagens enten påføres fritt i løsning, eller kan omfatte en fast enhet eller en merkingsenhet. Den faste enhet kan f.eks. være en mikrotitreringsplate eller et rør, en pinne, en stav, et filter, en kule eller en fast partikkel så som en latekspartikkel, en erytrocytt eller en partikkel av en sol av et fargestoff, et metall eller en metallforbindelse. Som en markørenhet kan man for eksempel anvende et radioaktivt atom eller forbindelse, en fluorescerende forbindelse, en fosfore-scerende forbindelse, et enzym eller en liten fast partikkel så som en partikkel av en sol av et fargestoff, et metall eller en metallforbindelse. I forbindelse med foreliggende oppfinnelse anses en antigendeterminant som det minimale strukturelle element av et antigen som muliggjør samvirke med andre stoffer som også gjenkjenner det naturlige antigen. For antigendetermi-nanten som ved en isolert enhet, medfører dette at den bør være tilstede permanent eller forbigående i samme rommelige anordning som det samme element har i det naturlige antigen. ;En slik polypeptid-antigendeterminant omfatter generelt minst ca. 4 eller 5. aminosyrer. I en lineær antigendeterminant er disse minst 4 eller 5 aminosyrer anordnet som en relativt kort polypeptidkjede, mens i en konformasjonsbestemt antigen-determinant er det minst 4 eller 5 aminosyrer som danner determinanten generelt fordelt spredt over en betydelig lengde av en polypeptidkjede som folder seg og bøyer seg på en slik måte at de relevante aminosyrer er plassert i nærheten av hverandre. Begge disse typer antigendeterminanter utgjør en del av foreliggende oppfinnelse. ;Polypeptidsekvensene som etterligner antigendeterminantene i gag-antigenet, glykoproteinet gpl20 og glykoproteinet gp41, henholdsvis, bør i det vesentlige være fri for naturlig forekommende <g>ag, gpl20 og gp41 proteiner. Likevel kan det immunokjemiske reagens ifølge oppfinnelsen eventuelt også inneholde ett eller flere av de naturlig forekommende HTLV-III proteiner. ;Fortrinnsvis kan en eller flere av polypeptidene omfatte bare en relevant del av de respektive proteiner. Spesielt kan antigendeterminantene i glykoproteinene gpl20 og gp41 ifølge oppfinnelsen være hensiktsmessig etterlignet av en del av disse proteinene som omfatter minst ca. 4 til ca. 160 aminosyrer. ;Disse deler kan velges ved enhver av de kjente metoder på området utvalg av antigen-determinant-polypeptidsekvenser, eller ved å anvende metoden som er beskrevet i de etterfølgende eksempler. ;Etter å ha valgt de relevante deler av polypeptider som er fordelaktig ved fremgangsmåten som skal beskrives nedenunder, kan disse utvalgte polypeptider fremstilles syntetisk som allerede forklart ved organisk-kjemisk kobling av aminosyrene eller ved å anvende velkjent rekombinant DNA-teknologi. I begge de to tilfeller kan i det minste to polypeptider ifølge oppfinnelsen fremstilles som isolerte polypeptider eller som sammensmeltede polypeptider. Disse sammensmeltede polypeptider kan enten omfatte minst to av de to eller flere syntetiske polypeptider i en sekvens, eller kan omfatte en ikke-beslektet polypeptidsekvens eller en kombinasjon av begge. En passende ikke-beslektet polypeptidsekvens kan f.eks. være et enzym, som i en enzymatisk-immunologisk-måling kan tjene som markøren. ;I undersøkelsen som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse ble det gjort bruk av en metode for systematisk studium av virusgen-antigenisitet ved å uttrykke deler av disse gener som fusjonsproteiner i transformerte celler. De forskjellige fusjonsproteiner ble prøvet ved bruk av forskjellige metoder (Western blot, Elisa) for å bestemme deres reaktivitet i forhold til forskjellige antisera (anti-p24, anti-p41 og anti pl2 0). Selvom de følgende eksempler som ble brukt, transformerte E. coli for å illustrere oppfinnelsen, kunne enhver transformert cellelinje som effektivt uttrykker foreliggende fusjonsprotein brukes ifølge velkjente teknikker for en fagmann. Selvom foreliggende metode har noen likheter med dem som er beskrevet i de tidligere gjengitte HTLV-III kloningsstudier, tillater ingen av disse publikasjoner å sette sammen et systematisk bilde av antigendeterminanter. De tidligere publiserte data ved bruk av rekombinante antigener foretatt i E. coli demonstrerer immuno-reaktivitet med sera fra pasienter med AIDS. Til forskjell fra undersøkelsene som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse, kunne imidlertid ingen konklusjoner trekkes om områdene for env-genet som ikke er representert i de gjengitte kloner. ;Utgangspunktet for denne undersøkelsen var et nytt isolert HTLV-III med navn HAT-3. DNA'et i dette virus ble klonet i en fagavledet vektor som beskrevet i de senere følgende eksempler. ;I figur 1 er restriksjonspunktene for denne X HAT-3 profag vist. Stavene A, B og C viser til segmenter av <g>a<g> og env genene som er klonet i eksemplene. Tallene viser til størrelsen av disse DNA-fragmenter i kilobaser. Sekvensinformasjon for disse deler av X HAT-3 finnes på figur 2 og 3. ;I figur 2 er DNA-sekvensen og polypeptidsekvensen som stammer fra denne i fragment A (se figur 1) fra gag presentert. ;DNA-sekvensen av hele p24 strukturgenet er gitt. Utstrekningen av DNA i fragment A er vist ved områdene mellom de to PstI ( CTGCAG) restriksjons-enzympunkter. Figur 3 gjengir DNA-sekvensen og den utledede polypeptidsekvens av fragmentene B og C (se figur 1) fra env. DNA-sekvensen av hele env-genet er angitt. Fragment B spenner over DNA'et mellom de to viste Pstl punkter. Fragment C starter ved det (andre) viste Kpnl punkt og slutter ved det samme Pstl punkt som fragment B. Understrekte punkter innbefatter Pstl = CTGCAG, K<p>nl = GGTACC og Bglll = AGATCT. Til tross for lignende størrelse og lengde med andre env-gener som er blitt sekvensbestemt, foretok oppfinneren systematiske undersøkelser ved bruk av dette genet. ;Som et resultat av den her beskrevne undersøkelse, var man istand til å identifisere flere immunologisk dominante avsnitt av proteinet som ble kodet av env-genet. Det ble funnet at immunokjemiske reagenser ifølge oppfinnelsen med fordel kunne omfatte peptider som tilsvarte eller etterlignet de immunologisk-dominante avsnitt. ;En passende immunologisk-dominant del ble identifisert til å ligge innenfor aminosyresekvensen som strakk seg mellom aminosyre nr. 30 og til og med 181 av den env åpne leseramme av HAT-3 (stav A på bunnen av figur 7) , og som for eksempel tilsvarer aminosyrene nr. 38 til og med 188 av HTLV-III (Råtner et al., Nature 313. 277-284; 1985); aminosyrene nr. 38 til og med 187 av ARV-2 (Sanchez-Pescador et al., Science 227., 484-492; 1985) og aminosyrene nr. 38 til og med 193 av LAV (Wain-Hobson et al., Cell 40, 9-17; 1985). Disse aminosyresekvenser er vist i figur 8. ;Et annet passende immunologisk-dominant avsnitt ble identifisert å ligge innenfor aminosyresekvensen som strakk seg mellom aminosyrene 463 og til og med 520 og spesielt mellom aminosyrene nr. 483 og til og med 520 av HAT-3 (stav B og B<1> henholdsvis på bunnen av figur 7), som for eksempel tilsvarer aminosyrer nr. 463-519 (spesielt nr. 482-519) av HTLV-III, aminosyrene 461-518 (spesielt nr. 481-518) av ARV-2, og aminosyrene nr. 468-524 (spesielt nr. 487-524 av LAV) (figur 9A og og henholdsvis 9B). ;Et annet immunologisk-dominant avsnitt ble identifisert å ligge innenfor aminosyresekvensen som strekker seg mellom aminosyrene nr. 473-642 av den env åpne leseramme av HAT-3 (stav C på bunnen av figur 7) som for eksempel tilsvarer aminosyrene nr. 571-640 av den env åpne leseramme av HTLV-III, aminosyrene nr. 571-640 av den env åpne leseramme av ARV-2, og aminosyrene nr. 576-645 av den env åpne leseramme av LAV. Disse fire tilsvarer sekvenser som er vist i figur 10. ;Et ytterligere immunologisk-dominant avsnitt ble identifisert til å ligge innenfor aminosyresekvensen som strekker seg mellom aminosyrene nr. 643-692 og spesielt mellom aminosyrene nr.643-683 av den env åpne leseramme av HAT-3 (stav D og D<1 >henholdsvis på bunnen av figur 7), som for eksempel tilsvarer aminosyre nr. 641-690 (spesielt nr. 641-681) av den env åpne leseramme av HTLV-III, aminosyrene nr. 641-690 (spesielt nr. 641-681) av den env åpne leseramme av ARV-2, og aminosyrene nr. 646-695 (spesielt nr. 646-686) av den env åpne leseramme av LAV. Disse fire tilsvarende sekvenser er representert i henholdsvis figur 11A og 11B. ;Enda et annet immunologisk-dominant avsnitt ble identifisert å ligge innenfor aminosyresekvensen som strakk seg mellom aminosyrene rir. 693-739 og spesielt mellom aminosyrene nr. 716-739 av den env åpne leseramme av HAT-3 (stav E og E<1>, henholdsvis på bunnen av figur 7), som for eksempel tilsvarer aminosyrer nr. 691-737 (særlig nr. 714-737) av den env åpne leseramme av HTLV-III, aminosyrene nr. 691-737 (spesielt nr. 714-737) av den env åpne leseramme av ARV-2, og aminosyrene nr. 696-742 (spesielt nr. 719-742) av den env åpne leseramme av LAV. Disse fire tilsvarende sekvenser er vist i henholdsvis figur 12A og 12B. ;Plasmider p24-10SB.3, pENVKPN45 og pGAG8 og HTLV-III isolat HAT-3 virus ble deponert hos American Type Culture Collection, 123 01 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 den 17.desember 1985 før innsendelse av denne patentsøknad og fikk ATCC deponeringsnr. 53375, 53374, 53373 og 40213 henholdsvis. ;Plasmidene p2-10SB.5, p28-23EB.4, p28-EB.l og p45ESI.3 ble deponert hos American Type Culture Collection den 18.juli 1986 før innsendelse av foreliggende søknad og tilkjent 'TCC deponeringsnr. 67159, 67157, 67158 og 67160 henholdsvis. ;Eksempel 1 ;Vertsstamme ;DH5 A (lac)U169. Denne E. coli stamme er et derivat av DH1 (ATCC, Rockville, Maryland), som er lac<+> (Hanahan, D., J. Moi. Biol. (1983) 166: 557). ;Genetiske E. coli standardteknikker ble brukt for å introdusere A (lac)U169 delesjonen. Denne delesjon fjerner fullstendig genene til lac operonet og enhver homologi med plasmidene. Den opprinnelige stamme DH5 er et spontant isolat av DH1 som har en 10 ganger høyere transformasjonsfrekvens sammenlignet med DH1. Den fullstendige genotypen til denne stammen er: DH5, FA (argF - lac)U169 endAl hsdR17(rk<+>) SUPE44 thi- 1 X - reCAl qyrA96 relAl. ;Eksempel 2 ;Kloningsvektor ;Kloningsvektorene som ble brukt i disse eksperimenter er derivater av pBR322 (ATCC, Rockville, Maryland). Alle HTLV-III kloner stammer fra plasmidet pMLB1113.IGI. Dette plasmid bærer en del av E. coli lac operonet klonet mellom EcoRI punktet (nukleotid 4361) og Aval punktet (nukleotid 1425) av pBR322. Lac genene er orientert i urviserens retning i en standard pBR322 avbildning. LacZ genefragmentet stammet fra plasmid pMLB1034 (Berman et al., Patent 4.503.142. Det siste lad genefragmentet stammet fra plasmid pMC9 (Calos, Nature, 274, 762-765; 1978). Disse gener klones fra et naturlig for^k^-mmende HincII punkt forut for lacl genet til et naturlig forekommende Aval punkt ved kodon 70 i lacY. Dette tilsvarer nukleotidene (n.t.) 13-4667 av pMLB1113.IGI-sekvensen. (Den kommenterte sekvens av lac operonet er blitt satt sammen i tillegg M, side 273-281 av Silhavy et ;al., supra.) ;I denne vektoren er flere forandringer innført i lac genene gjennom standardiserte genesløydteknikker. Det er en punktmutasjon i promotoren for lacl (W.T. C -*■ T; n.t. 28 av pMLB1113.IGI) som fører til 10 ganger høyere nivåer av repressorsyntese (lac_Iql) . Ved kodon 5 i lacZ genet er de multiple kloningspunkter fra plasmid PUC8 (Vieira and Messing, Gene, 19: 259-268, 1982) tatt inn (n.t. 1310-1345 av pMLB1113.IGI). Det naturlig forekommende EcoRI punkt ved kodon 1006 av lacZ er fjernet ved en punktmutasjon (W.T. C -»• A; n.t. 4352 av pMLB1113.IGI.
I tillegg til forandringene i lac-genene er en enkeltkjedet 1 fag-opprinnelse blitt innsatt i pBR322-sekvensen. Et 514 basepar-fragment fra bakteriofag M13 (ATCC, Rockville, Maryland) er blitt klonet mellom to tilstøtende Ahalll punkter fjernt-liggende fra bla-genet (PBR322 n.t. 3232 til n.t. 3251 erstattet med M13 n.t. 5488 til n.t.6001; n.t. 6472 til n.t. 6985 av pMLB1113.IGI). Dette M13-område virker ved å frembringe enkeltkjedet DNA fra pBR322 derivatet i nærvær av en hjelper Ml3 fase (Zagursky and Berman, Gene (1984) 27; 183-191) .. Disse funksjoner har ingen virkning på normal pBR322 replikering eller opprett-holdelse og er bare aktive under M13-fag-infeksjon.
Den parenterale kloningsvektor, pMLB1113.IGI, medfører ampicillin-resistens og sterkt regulert syntese av naturlig galaktosidase til vertscellen DH5 A ( lac) . Et lac" derivat av denne vektor ble brukt for flere av de aktuelle kloningseksperi-menter. Dette derivat ble forandret ved BamHI punktet (n.t. 1320) ved spaltning og innfylling med DNA-polymerase. Dette plasmid kalles pMLB1120.IGI. Alle forandringene i disse kloningsvektorene er blitt bekreftet ved DNA-sekvensanalyse av de rekombinante områder.
De to kloningsvektorer (pMLB1113.IGI og pMLB1120.IGI) som ble brukt i denne undersøkelsen er oppført i figur 4. Tette bokser representerer lac-genene i E. coli. M13 mellomgen-området er vist med den stripede boks. Genet som koder for ampicillin-resistens ( bla) og opprinnelsen for replikasjon ( ori) fra pBR322 er vist. En rammeskift-mutasjon (+1) ble innført ved det multiple kloningspunkt som vist. Denne mutasjonen ble bekreftet ved bestemmelse av DNA-sekvensen ved kloningspunktet.
Eksempel 3
HTLV- III DNA
Et genomisk klon (X HAT-3) av en HTLV-III profag i bakteriofag ble brukt. Dette spesielle klon inneholder et omtrent 9Kb HTLV-III DNA-fragment fra to naturlig forekommende Sstl punkter i det virale LTRs. Et forenklet restriksjonsenzym-punktkart av dette klon er vist i figur 1. Ikke-publisert DNA-sekvensinformasjon fra gag og env genområdene er tatt med her (figur 2 og 3). Dette gjorde det mulig å oppnå bestemte restriksjonsenzym-fragmenter fra det opprinnelige klon og forskjellige underkloner konstruert i oppfinnerens laboratorium (figur 5). Et spesielt kart er vist i topplinjen av figur 5. Punktene for EcoRI-fragmentene av dette området av klonen er vist. Disse fragmenter ble underklonet i plasmidvektoren pMLB1113.IGI. Klon 29 inneholder 8,3 Kbp EcoRI fragmentet fra fagen. Klon 26 inneholder 3,0 Kbp og 1,1 Kbp EcoRI-fragmentene. Spaltning av disse underkloner med de tilsvarende enzymer (som vist) ga de tre utgangsplasmider som er innelukket i boksene.
Eksempel 4
Plasmid PGAG8 ( se figur 5)
Dette klonet stammer fra plasmidet pMLB1120.IGI ved inn-setting av e<J-> ' isopar Pstl-fragment fra p24 kodeområdet av HTLV-III (se figur 2). Dette DNA koder for et 169 aminosyrers polypeptid i p24 delen av gag, som representerer ca. 70% av p24 genproduktet.
Etter induksjon av operonet med 10"<3>M isopropyltiogalaktosid (IPTG), ble 134K MW hybridproteinet produsert i en mengde på ca. 10-15% av totalt cellulært protein. En tilsvarende mengde av galaktosidase-monomer av naturlig størrelse ble også syntetisert. I ultralydbehandlete celleinnhold sentrifugert ved lav hastighet (~10.000 x g), kunne hybrid Gag-LacZ protein isoleres i uløselig form i klumpen.
Dette protein ble gjenoppløst i 7M guanidin-HCl og holdt i løsning av 0,05M guanidin-HCl.
Eksempel 5
Plasmid pENVPSTI
Dette klon ble utledet fra plasmid pMLB1120.IGI ved inn-setting av et 2339 basepar Pstl-fragment fra env genet av HTLV-III (se figur 3). Dette fragment representerer 94% av det virale kodeområde. (Kodesekvensene for gp41 bæres også på dette frag-
ment, se ovenfor.)
Dette klon er den dårligste produsent av HTLV-III hybridproteiner. Etter induksjon produserer den ca. 1% Env-LacZ hybrider. Fusjonsproteinene med full størrelse (206K MW) er det minst utbredte, men reagerer sterkt med positivt pasientserum. Et hovedhybridprotein viser seg ved 149K MW immuno-reaktivt bånd. To ytterligere /3-galaktosidase-hybrider syntetisert i forskjellige mengder viser seg i 133K og 124K MW stillingene. Til slutt, er et betydelig bånd tilstede i posisjonen for / 3-galaktosidase. Alle fire klasser av hybridproteiner reagerer med anti-/3-galaktosidase-antiserum, mens de to typer med høyest molekylvekt reagerer med HTLV-III positivt pasientserum.
Eksempel 6
Plasmid pENVKPN24 og beslektede plasmider
Dette klon stammer fra et innvendig Kpnl - Pstl fragment klonet i fag M13mpl8 Gene 33., 103-109; 1985 og etterpå underklonet (ved bruk av EcoRI - Hindlll) i pMLB1113.IGI. Det resulterende klon (pENVKPN) er LacZ" på grunn av translasjons-rammen til env og lacZ, som ikke er den samme. Forskjellige spontane mutanter kalt "pop-ups" ble isolert ved bruk av en publisert forskrift (Berman and Jackson, J. Bacteriol.. 159: 750-756, 1984). En av disse, pENVKPN24, syntetiserte ca. 5% mengder av Env-LacZ hybridet. Dette klon adskilte seg fra pENVPSTI klonet ved at 152 kodoner er blitt fjernet fra mellom 5' Pstl og K<p>nl punktene (delesjon av 457 n.t.). DNA-sekvensanalyse av dette klonet avslørte en delesjon av en A-rest som befant seg ved n.t.3225 av pENVKPN24 som gjeninnretter env kodeområdet med lacZ kodesegmentet. Til forskjell fra pENVPSTI klonet produserer pENVKPN24 hydbrider med nesten full størrelse (~200K MW) og et andre mindre utbredt protein ved ~ 149K MW. Dette plasmid ble overført til LacZ" ved enzymatisk innføring av en rammeskift-mutasjon ved Hindlll punktet tilstøtende lacZ. Igjen ble forskjellige LacZ<+> derivater utvalgt. (Se figur 6).
Et andre Lac<+> derivat av plasmid pENVKPN utvalgt på samme måte er plasmid pENVKPN45. Dette plasmidet syntetiserte ca. 10-15% mengder av Env-LacZ hybrid. I dette klonet avslørte DNA-sekvensanalyse en delesjon av 1024 n.t.
Et tredje Lac<+> derivat av plasmid pENVKPN fra denne seleksjonen er plasmid pENVKPN28. Dette plasmid syntetiserte store mengder av et 20OK M.W. hybrid i lignende mengder som pENVKPN24. Den samme metode som bruktes for pENVKPN24, ble brukt til å konstruere et LacZ" derivat av pENVKPN28. Forskjellige Lac<+ >mutanter led av delesjoner av env genetisk materiale. DNA-sekvensanalyse av disse derivater viste at alle Lac<+> mutanter led av delesjoner av env genetisk materiale. Graden av disse delesjoner er sammenfattet i figur 6 og 7.
Et fjerde Lac<+> derivat p45ESI.3 ble konstruert ved å skifte ut EcoRl- Stul 587 bp fragmentet fra klon pENVPSTI med 118 bp EcoRl- Stul fragmentet fra pENVKPN45.
Eksempel 7
Høynivåproduksion av rekombinante antigener tilsvarende ( g) pl20f ( g) p41 og p24 virusgen- produkter.
Flere in vitro delesjoner ble innført enzymatisk i LacZ<+ >klonene for å oppnå høye nivåer (1-15% av totalt cellulært protein) av rekombinante hybrider. Nivå for proteinproduksjon fra plasmidet pGAG8 var tilstrekkelig som konstruert. Dette plasmid produserer ekvivalenten av rekombinant p24 fra søkerens spesielle virusisolat.
Plasmid pENVKPN45 produserer ekvivalenten av (g)pl20 som et j3-galaktosidase-hybrid i en 10-15% mengde. Plasmidene pENVKPNH3 28-45 og p45ESI.3 er ytterligere kilder for de rekombinante g(pl20) hybridproteiner. pENVKPBH3 28-45 og p45ESI.3 klonene uttrykker /3-galaktosidase-hybridproteiner i 5-10% av totalt cellulært protein.
Plasmidene pENVPSTH3 2-10 og pENVKPNH3 24-10 ble underkastet restriksjonsnuklease-spaltning og religering. (Se figur 6.)
Toppen av figur 7 representerer et kart av env genet av
HTLV-III. De tre stripede områder er hydrofobe områder som tilsvarer signalsekvensen (helt til venstre), et område ved N-enden av p41 forstadiet, og et transmembran-ankersegment (helt til høyre). Loddrette linjer ved kodonstillingene 30, 144 og 810 svarer til kloningspunktene Pstl, Kpnl og Pstl, representert som nukleotidstillinger 112, 544, 2454 henholdsvis på figur 3. Punktet for proteolytisk spaltning som gir pl20 (helt til venstre) og p41 er vist ved V -symbolet.
Kolonnen helt til høyre viser tallet til klonet (henvisning til figur 6). De åpne staver viser graden av DNA fra env i de enkelte kloner. Tallene inne i disse staver viser det første kodon i env og det siste kodon i env (ved bruk av pENVPSTI sekvensen som en referanse). Disse detaljer ble bestemt ved å bruke DNA-sekvensinformasjon.
De fire staver p28EBl.l, p28-23EB4.1, p2-10SB.5 og p24-10SB.3 representerer "DNA" som koder for fire ytterligere genprodukter fra pENVPSTI (nr. 1) . Innvendig påbegynnelse av proteinsyntese begynner ved det naturlig forekommende metioninkodon 483, representert ved de prikkede loddrette linjer. Denne er representert med (M) på figuren. Alle andre staver representerer nøyaktige forandringer av DNA-sekvensen som fører til produksjon av hybridproteiner med den viste molekylvekt. Alle hybridproteiner viser en positiv reaksjon med anti-/3-galaktosidase-antiserum. Cysteinrester er representert ved c'er over env kartet. De loddrette brudte linjer viser plasseringen av to Bqlll punkter som brukes for genesløyd. (Se figur 6.)
Eksempel 8
Immunokiemisk prøvin<g> av HAT- 3 env- utledede polypeptider
De env-utledede polypeptider som fremstilles ifølge eksempel 7 ble prøvet med hensyn til deres immunokjemiske egenskaper både ved bruk av ELISA og Western blot. For disse prøver gjorde man bruk av solubilisert materiale fra de høstede celler.
A. Solubilisering av env- utledede rekombinante polypeptider
Høstede celler oppslemmes i en buffer inneholdende 50 mmol/1 Tris, 0,1 mmol/1 PMSF, pH 7,8 i et forhold på 1 gram celler: 4 ml av bufferen. Cellene lyses ved bruk av en French trykkcelle og et innvendig arbeidstrykk på 1360 atm. Den lysede cellesuspensjon evakueres fra trykkcellen med en strømnings-hastighet på 15 dråper pr. minutt i en avkjølt beholder og sentrifugeres ved 48.000 xg i 30 minutter ved 4°C. Det resulterende klumpemateriale (kalt (Px) vaskes med en løsning inneholdende 50 mmol/1 Tris og 0,1 mmol/1 PMSF og sentrifugeres som beskrevet ovenfor. Det passerte Px klumpemateriale oppslemmes deretter homogent ved bruk av en spatel eller gummiskraper i en løsning inneholdende 8 mmol/1 urea, 50 mmol/1 Tris, 10 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 DH, 0,1 mmol/1 PMSF med en pH på 8,1; forholdet av gram opprinnelige celler brukt for Px: ml av løsningsbuffer er 1:4. Denne suspensjon ultralydbehandles ved bruk av et ultralyd-vannbad ved romtemperatur i 45 min. Løsningen sentrifugeres ved 200.000 xg i 45 minutter ved 4°C. Den resulterende supernatant kalt S2 kan dialyseres mot PBS eller mot en løsning inneholdende 50 mmol/1 Tris, 10 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 DH og 0,1 mmol/1 PMSF med pH 8,1 for å fjerne urea, eller kan få stå i ureabuffer. Den således fremstilte fraksjon S2 ble brukt for ELISA og Western blot analysen.
B. ELISA
ELISA utføres i henhold til de følgende trinn:
1. Brønnene på en mikrotitreringsplate belegges med 100 \ i± antigen erholdt ved dialyse av S2 fraksjonen erholdt ifølge A mot 0,05 mol/l natriumkarbonat/bikarbonatbuffer, pH 9,6. Beleggingen utføres ved 4°C med 0,5-10 y^g/ml i løpet av
1-3 dager, avhengig av antigenpreparatet.
2. Antigenet suges av og brønnene blokkeres med Rlotto ( 5% ikke-fet tørrmelk i dH20). Dette belegges i 45 minutter ved
romtemperatur.
3. Mens platene er blokkert, inkuberes antisera som inneholder antistoffer spesifikke mot HTLV-III antigener som er blitt fortynnet 1:100 med Blotto + 10% geiteserum/PBS + 1% Triton X-100 i 30 minutter ved 37°C med et S2 preparat av E.coli som ikke inneholder en vektor som koder for HTLV-III
antigener.
4. Blotto suges av fra brønnene, 100 /xl av det absorberte fortynnede antiserum tilsettes og mikrotiteringsplaten
inkuberes i 90 minutter i en varmeblokk ved 37°C.
5. Serumet suges av og brønnene vaskes tre ganger med 1% glycerol + 0,05% Tween 20. 6. Deretter tilsettes 100 fil av en konj ugat løsn ing inneholdende 0,143 )Ltg geite-anti-human IgG(H+L)/HRP (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) pr. ml av 10% geiteserum/PBS + 10% Triton X-100 til hver brønn,
og inkuberes i 60 min. i en varmeblokk ved 37°C.
7. Konjugatet av_--s av og brønnene vaskes seks ganger.
8. 100 pl TMB tilsettes til hver av brønnene på mikrotiteringsplaten og får reagere i 30 min. ved romtemperatur. Deretter stoppes reaksjonen ved tilsetning av 100 jul av en 4N H2S0A løsning og absorbansen avleses ved 450 nm.
C. Western blotanalyse
For denne analysen blir HTLV-III antigenene fra S2 først skilt ved SDS-PAGE ved bruk av metoden til Laemmli (Nature 227, 680-5; 1970), og de således adskilte antigener overføres deretter til nitrocelluloseplater, ifølge metoden som er beskrevet av Towbin et al. (Proe.Nati.Acad.Sei. 76, 4350-4).
D. Reaktivitet av hybridproteiner
Hybridproteiner uttrykt ved plasmider oppført i den første spalte av tabell I ble lagt på mikrotitreringsplater og viste reaktiviteten som er angitt i tabell I med serum 1- og serum 2-holdige antistoffer mot gp41 og både gp4l og gpl20 proteiner henholdsvis, i forsøkssystemet som er beskrevet under B. Disse resultater bekrefter reaktiviteten av peptidsekvenser som er vist ved stavene A, B, B<1> og C i figur 7. Hybridproteinene med høyere molekylvekt illustrerer proteinsyntese som begynner ved lac operonet (f.eks. 2 06 M.W. hybridet) og de lavmolekylære hybrider er proteiner for hvilke syntesen begynner med det naturlig forekommende metioninkodon 483.
E. Bruken av en kombinasjon av rekombinante proteiner i en undersøkelsesmålinq for antistoffer mot HTLV- III
a. Et antall sera fra personer med risiko for å få en infeksjon med HTLV-III ble undersøkt i en ELISA ved bruk av fremgangsmåten som er beskrevet under B. Platene ble belagt med HTLV-III rekombinante proteiner (S2-fraksjoner fremstilt som beskrevet under A). Platene a. ble belagt med proteiner (2,5 /xg/ml) fra klon 24-10SB.3, platene b. ble belagt med proteiner (1,5 Atg/ml) fra klon gag-8 og platene c. ble belagt med en blanding av de to proteiner (2,5 /Ltg/ml 24-10SB.3 pluss 1,5 /ig/ml gag-8) .
Resultatene ble sammenlignet med data oppnådd ved Western blot (WB) teknikken beskrevet under C., og en kjøpt ELISA (Vironostika), som begge anvendte naturlig viruslysat som antigenkilde (Tabell II).
Dataene ovenfor viser at et forsøkssystem hvor en kombinasjon av de to antigen-polypeptider ifølge oppfinnelsen anvendes, virker mer pålitelig enn et forsøkssystem med en eneste type antigen-polypeptid.
b. Platene d. ble belagt med en kombinasjon av S2-fraksjoner av tre rekombinante proteiner (klonene gag-8 (1,5 /xg/ml) , 24-10SB.3 (2,5 /^g/ml) og p45 ESL3 (2,5 /ug/ml) ved ovenfor beskrevne metoder. En rekke sera som forut var analysert på anti-HTLV-III-antistoffer ved Western blot og ELISA (Vironostika) teknikker, ved bruk av naturlig viruslysat som nitrogenkilde, ble prøvet på
disse platene, samt på plater med gag-8 og 24-10SB.3 antigen (plate c. beskrevet).
Det viser seg således at et forsøkssystem hvor kombi-nasjonen av tre antigen-polypeptider ble anvendt, skårer betydelig mer av prøvene enn det som ble funnet å være positivt ved Western blot-analyse.
F. Virkningen av lengden av polypeptidkieden til p41 rekombinant- proteinet
Plater ble belagt med S2 preparater av de følgende kloner: plater e. med 2-10 SB.5 (2,5 /ig/ml) , plater f. med 28 EF1.1 (2,5 Hg/ ml) og plater g. med 28,33 EB4.1 (2,5 ^ig/ml).Sera ble prøvet ved å bruke disse plater i fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor. Resultatene (tabell IV) er sammenlignet med slike man fikk på plater a. (belagt med klon 24-10 SB3) og med Western blot.
Disse data viser at noen av seraene som er ikke-reaktive med plate a., viser positiv reaksjon med platene e., f. og g. Fra dette resultatet konkluderes at det ekstra polypeptidfragment i klon 2-10 SB.5 (stav D i figur 7) er ansvarlig for bindingen av en ekstra klasse antibiotika, og følgelig at dette polypeptidfragment omfatter en annen antigendeterminant.
En annen forskjell påvises med prøve 14, som var negativ både med plate a. og og signifikant positiv med begge platene f. og g. Dette resultatet tyder på nærvær av en annen antigen-determinant som ligger innen det ekstra polypeptidfragment i klon 28 EB1.1 sammenlignet med klon 2-10 (stav E i figur 7).
Videre er det fristende.å anta at transmembransegmentet av gp41 (det skyggelagte område i den øverste stav på figur 7 mellom aminosyre nr. 684 og 715) ikke vil inngå i bindingen av antistoffer in vivo. Fra denne antagelse sluttes at antigen-determinanten av D og E ligger i segmentet som er vist med stavene D<1> og henholdsvis E<1>.
Claims (28)
1. Immunokjemisk reagens,
karakterisert ved at det omfatter en kombinasjon av to eller flere syntetiske polypeptidsekvenser valgt fra gruppen bestående av: en polypeptidsekvens som etterligner minst én
antigendeterminant av gag-antigenet som befinner seg mellom to Pst I restriksjonsenzym-spaltningsseter av HTLV-III isolatet HAT-3 (figur 2. 1.) ; en polypeptidsekvens som etterligner minst én
antigendeterminant av glykoproteinet gpl20 som befinner seg mellom to Pst I restriksjonsenzym-spaltningsseter av HTLV-III-isolatet HAT-3; og - en polypeptidsekvens som etterligner minst én antigendeterriinant av glykoproteinet gp41 som befinner seg mellom Kpn I og Pst I restriksjons-spaltningssetene av HTLV-III-isolat HAT-3, hvilket HTLV-III isolat HAT-3 er deponert hos ATCC under deponeringsnr. 40213.
2. Immunokjemisk reagens ifølge krav 1,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som det karboksyterminale ca. 58 aminosyrer lange polypeptid av gpl2 0-proteinet.
3. Immunokjemisk reagens ifølge krav 2,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som et polypeptid av sekvensen som er vist i figur 9A.
4. Immunokjemisk reagens ifølge krav 1,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som det karboksyterminale ca. 38 aminosyrer lange polypeptid av gpl20-proteinet.
5. Immunokjemisk reagens ifølge krav 4,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som noen av polypeptidene av sekvensene som er vist i figur 9B.
6. Immunokjemisk reagens ifølge krav 1-5, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som den partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom omtrent aminosyre nr. 53 og omtrent aminosyre nr. 122 av gp41-proteinet.
7. Immunokjemisk reagens ifølge krav 6,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som et polypeptid av sekvensen som er vist på figur 10.
8. Immunokjemisk reagens ifølge krav 1-7, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som den partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom aminosyre nr. 12 3 og aminosyre nr. 172 av gp41-proteinet.
9. Immunokjemisk reagens ifølge krav 8,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som et polypeptid av sekvensene som er vist i figur 11A.
10. Immunokjemisk reagens ifølge krav 1-7, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som den partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom aminosyre nr. 123 og aminosyre nr. 163 av gp41-proteinet.
11. Immunokjemisk reagens ifølge krav 10,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som et polypeptid av sekvensen som er vist på figur 11B.
12. Immunokjemisk reagens ifølge krav 1-11, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som de partielle aminosyresekvenser som strekker seg mellom aminosyre nr. 173 og aminosyre nr. 217 av gp41-proteinet.
13. Immunokjemisk reagens ifølge krav 12,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som et polypeptid av sekvensene som er vist på figur 12A.
14. Immunokjemisk reagens ifølge krav 1-11, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som den partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom aminosyre nr. 196 og aminosyre nr. 217 av gp41-proteinet.
15. Immunokjemisk reagens ifølge krav 14,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som et polypeptid med sekvensene som er vist i figur 12B.
16. Immunokjemisk reagens ifølge 1-15,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som aen partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom aminosyre nr. 30 og aminosyre nr. 181 av gpl20-proteinet.
17. Immunokjemisk reagens ifølge krav 16,
karakterisert ved at det omfatter et polypeptid med de samme immunokjemiske egenskaper som et polypeptid med sekvensen som er vist på figur 8.
18. Syntetisk polypeptid for in vitro anvendelse, omfattende minst én aminosyre-sekvens med de immunokjemiske egenskapene til aminosyresekvensen av HTLV-III isolat HAT-3, deponert hos ATCC under deponerings-nummer 40213, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av: det karboksyterminale ca. 38 aminosyrer lange polypeptid av
gp12 0-prote inet; - den partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom aminosyre nr. 53 og aminosyre nr. 122 i gp41 proteinet; - den partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom aminosyre nr. 123 og aminosyre nr. 163 i gp41-proteinet; - den partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom aminosyre nr. 196 og aminosyre nr. 217 i gp41-proteinet;
og den partielle aminosyresekvens som strekker seg mellom
aminosyre nr. 30 og aminosyre nr. 181 i gpl20-proteinet.
19. Syntetisk polypeptid ifølge krav 18,
karakterisert ved at det omfatter minst én av aminosyresekvensene som er vist på figurene 8, 9A, 9B, 10, 11A, 11B, 12A og 12B.
20. Et rekombinant DNA for anvendelse ved fremstilling av det immunologiske reagens ifølge krav 18 eller 19, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for produksjonen av et polypeptid ifølge krav 18 eller 19.
21. Plasmid for anvendelse ved fremstilling av et immunologisk reagens,
karakterisert ved at det omfatter et rekombinant DNA ifølge krav 20, og er istand til å uttrykke polypeptidet ifølge krav 18.
22. Plasmid ifølge krav 21,
karakterisert ved at det er utledet fra HTLV-III-isolat HAT-3 med ATCC deponeringsnr. 40213.
23. Plasmid ifølge krav 22,
karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av p24-10SB.3, pENVKPN45, pGAG8, p2-10SB.5, p28-23EB.4 og p28-EB.l.
24. Plasmid ifølge krav 22,
karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av pENVPSTI, pENVPSTH3, pENVPSTH3 1-2, pENVPSTH3 2-10, p2-10 EB.3, pENVKPN, pENVKPN24, pENVKPNH3 24, pENVKPNH3 24-10, pENVKPN 28, pENVKPNH3 28, pENVKPN3 28-23, pENVKPN3 28-24 og pENVKPNH3 28-45.
25. Vertscelle,
karakterisert ved at den er transformert med et plasmid ifølge krav 21, og er istand til å uttrykke polypeptidet ifølge krav 18.
26. HTLV-III isolat HAT-3,
karakterisert ved at det er deponert hos ATCC under nr. 40213.
27. Polypeptid for anvendelse in vitro,
karakterisert ved at det uttrykkes av en vertscelle ifølge krav 25 transformert med et plasmid ifølge krav 21-24.
28. Prøvesett for bruk i en immunologisk måling, karakterisert ved at det omfatter et immunokjemisk reagens ifølge krav 1-17.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80987285A | 1985-12-17 | 1985-12-17 | |
| US86190086A | 1986-05-08 | 1986-05-08 | |
| US88729486A | 1986-07-18 | 1986-07-18 | |
| US92757786A | 1986-11-14 | 1986-11-14 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO865094D0 NO865094D0 (no) | 1986-12-16 |
| NO865094L NO865094L (no) | 1987-06-18 |
| NO171477B true NO171477B (no) | 1992-12-07 |
| NO171477C NO171477C (no) | 1993-03-17 |
Family
ID=27505837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO865094A NO171477C (no) | 1985-12-17 | 1986-12-16 | Immunokjemisk reagens, syntetisk polypeptid, rekombinant dna og plasmid for fremstilling derav, vertscelle transformert med sistnevnte, og proevesett for immunologisk maaling |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0227169B1 (no) |
| JP (1) | JP2587414B2 (no) |
| AT (1) | ATE87103T1 (no) |
| DE (1) | DE3688051T2 (no) |
| DK (1) | DK610786A (no) |
| ES (1) | ES2054616T3 (no) |
| FI (1) | FI91282C (no) |
| NO (1) | NO171477C (no) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987002775A1 (en) * | 1985-10-24 | 1987-05-07 | Southwest Foundation For Biomedical Research | Synthetic peptides and use for diagnosis and vaccination for aids and arc |
| US4772547A (en) * | 1986-02-03 | 1988-09-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | HTLV-III envelope peptides |
| US4879212A (en) * | 1986-04-02 | 1989-11-07 | United Biomedical Inc. | Peptide composition and method for the detection of antibodies to HTLV-III |
| DE3722272A1 (de) * | 1986-07-08 | 1988-01-21 | Bio Rad Laboratories | Differenzierung des krankheitszustandes bei aids-antikoerpertests |
| EP0255190A3 (en) * | 1986-08-01 | 1990-08-29 | Repligen Corporation | Recombinant polypeptides and their uses, inclusing assay for aids virus |
| US4861707A (en) * | 1987-02-02 | 1989-08-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Human immunodeficiency virus antigen |
| US5141867A (en) * | 1987-02-02 | 1992-08-25 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleotide sequence encoding a human immunodeficiency virus antigen |
| GB8714802D0 (en) * | 1987-06-24 | 1987-07-29 | Proteus Biotech Ltd | Synthetic polypeptides |
| EP0316495A1 (en) * | 1987-11-19 | 1989-05-24 | Iaf Biochem International Inc. | Synthetic peptides useful for the detection of aids-related antibodies in human sera |
| US5204259A (en) * | 1988-05-06 | 1993-04-20 | Pharmacia Genetic Engineering, Inc. | Methods and systems for producing HIV antigens |
| GB2220939B (en) * | 1988-06-10 | 1992-02-26 | Medical Res Council | Peptide fragments of hiv and their use in vaccines and diagnosis |
| CU22222A1 (es) * | 1989-08-03 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes |
| US6248574B1 (en) | 1989-12-13 | 2001-06-19 | Avigdor Shaffermann | Polypeptides selectively reactive with antibodies against human immunodeficiency virus and vaccines comprising the polypeptides |
| JPH03271233A (ja) * | 1990-03-19 | 1991-12-03 | Inst Pasteur | ウイルスエンベロープ糖タンパク質及びその糖タンパク質の中和エピトープに対応するペプチドの間の相乗作用による、ウイルス性感染に対する防御の誘発 |
| US5876724A (en) * | 1990-03-19 | 1999-03-02 | Institut Pasteur | Induction of neutralizing antibody against viral infection by synergy between virus envelope glycoprotein and peptides corresponding to neutralization epitopes of the glycoprotein |
| DE69231705T2 (de) * | 1992-06-04 | 2001-10-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, Suita | Gag-Env Fusion-Antigen aus HIV |
| DE4405810A1 (de) | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
| WO1997014436A1 (en) * | 1995-10-20 | 1997-04-24 | Duke University | Synthetic vaccine for protection against human immunodeficiency virus infection |
| AU731367B2 (en) | 1996-08-09 | 2001-03-29 | Viral Technologies, Inc. | HIV p-17 peptide fragment, compositions containing and methods for producing and using same |
| US6093400A (en) * | 1996-08-09 | 2000-07-25 | Cel Sci Corporation | Modified HGP-30 peptides, conjugates, compositions and methods of use |
| CA2679332A1 (en) * | 2007-03-23 | 2008-10-02 | Sanofi Pasteur | Polypeptide recognized by anti hiv-1 gp41 antibodies isolated from highly hiv-1 exposed, non infected women |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341423C (en) * | 1984-10-31 | 2003-03-04 | Paul A. Luciw | Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome |
| WO1986006099A1 (en) * | 1985-04-08 | 1986-10-23 | Genetic Systems Corporation | EXPRESSION AND DIAGNOSTIC USE OF gag ENCODED PEPTIDES WHICH ARE IMMUNOLOGICALLY REACTIVE WITH ANTIBODIES TO LAV |
| EP0226903B1 (en) * | 1985-12-20 | 1990-09-26 | Abbott Laboratories | Immunoassay for antibodies to htlv-iii |
| US4925784A (en) * | 1986-04-04 | 1990-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
-
1986
- 1986-12-08 AT AT86202213T patent/ATE87103T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-08 DE DE8686202213T patent/DE3688051T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-08 EP EP86202213A patent/EP0227169B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-08 ES ES86202213T patent/ES2054616T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-16 NO NO865094A patent/NO171477C/no unknown
- 1986-12-16 JP JP61299775A patent/JP2587414B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-16 FI FI865123A patent/FI91282C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-12-17 DK DK610786A patent/DK610786A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0227169A3 (en) | 1989-07-12 |
| FI865123A0 (fi) | 1986-12-16 |
| DK610786A (da) | 1987-06-18 |
| AU6651986A (en) | 1987-07-02 |
| AU612315B2 (en) | 1991-07-11 |
| EP0227169A2 (en) | 1987-07-01 |
| NO865094L (no) | 1987-06-18 |
| JPS62240863A (ja) | 1987-10-21 |
| FI91282B (fi) | 1994-02-28 |
| JP2587414B2 (ja) | 1997-03-05 |
| NO171477C (no) | 1993-03-17 |
| ATE87103T1 (de) | 1993-04-15 |
| FI865123L (fi) | 1987-06-18 |
| NO865094D0 (no) | 1986-12-16 |
| DE3688051T2 (de) | 1993-06-24 |
| DK610786D0 (da) | 1986-12-17 |
| EP0227169B1 (en) | 1993-03-17 |
| FI91282C (fi) | 1994-06-10 |
| ES2054616T3 (es) | 1994-08-16 |
| DE3688051D1 (de) | 1993-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0227169B1 (en) | Immunochemical reagent | |
| US5985641A (en) | Non-infectious, replication-impaired, immunogenic human immunodeficiency virus type 1 retrovirus-like particles with multiple genetic deficiencies | |
| Griffiths et al. | Hybrid human immunodeficiency virus Gag particles as an antigen carrier system: induction of cytotoxic T-cell and humoral responses by a Gag: V3 fusion | |
| JP3073752B2 (ja) | Ｈｉｖエンベロープタンパク質およびそれを用いたｈｉｖ抗原に対する抗体の検出方法 | |
| Haigwood et al. | Importance of hypervariable regions of HIV-1 gp120 in the generation of virus neutralizing antibodies | |
| Andeweg et al. | Both the V2 and V3 regions of the human immunodeficiency virus type 1 surface glycoprotein functionally interact with other envelope regions in syncytium formation | |
| EP0219106A2 (en) | Polypeptides that elicit antibodies against AIDS virus | |
| US5817318A (en) | Synthetic peptides for an HIV-1 vaccine | |
| EP0201716B1 (en) | Expression of immunologically reactive viral proteins | |
| US5912338A (en) | Nucleic acids encoding self-assembled, non-infectious, non-replicating, immunogenic retrovirus-like particles comprising modified HIV genomes and chimeric envelope glycoproteins | |
| AU588462B2 (en) | Non-cytopathic clone of human t-cell lymphotropic virus type iii | |
| JP3095219B2 (ja) | ＬＡＶに対する抗体と反応性であるｇａｇによりコードされたペプチド及びその使用 | |
| EP1606397A1 (en) | Adenovirus serotype 24 vectors, nucleic acids and virus produced thereby | |
| Reyburn et al. | Expression of maedi-visna virus major core protein, p25: development of a sensitive p25 antigen detection assay | |
| EP1611237A1 (en) | Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby | |
| WO1990013564A1 (en) | Synthetic peptides for an hiv-1 vaccine | |
| Charbit et al. | Immunogenicity and antigenicity of conserved peptides from the envelope of HIV-1 expressed at the surface of recombinant bacteria | |
| Mattiacio et al. | Dense display of HIV-1 envelope spikes on the lambda phage scaffold does not result in the generation of improved antibody responses to HIV-1 Env | |
| Samuel et al. | Bacterial expression and characterization of nine polypeptides encoded by segments of the envelope gene of human immunodeficiency virus | |
| Windheuser et al. | Use of trpE/gag fusion proteins to characterize immunoreactive domains on the human immunodeficiency virus type 1 core protein | |
| Madaule et al. | A peptide library expressed in yeast reveals new major epitopes from human immunodeficiency virus type 1 | |
| Lawoko et al. | Continuity and discontinuity in the anti-V3 IgG response of human immunodeficiency virus type 1-infected persons in a cross-sectional and longitudinal study using synthetic peptides | |
| Quintana et al. | Antibody response in rabbits against two HIV-1 multi-epitope polypeptides bearing different copies of V3 epitopes fused to the N terminal fragment of N. meningitidis P64K protein | |
| WO1991004038A1 (en) | Antigen and immunoassay for human immunodeficiency virus type 2 | |
| JP2000333678A (ja) | 弱毒生エイズワクチン用の組換えｖｚｖ／ｈｉｖとその作製方法 |