NO173548B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av teraprutisk aktive glykokonjugater av fosforamidsennep eller ifosfamidsennep - Google Patents

Description

Kreftsykdommer befinner seg i Forbundsrepublikken Tyskland på andreplass i dødelighetsstatistikken etter hjerte-karsykdommene. Til de etablerte terapier for kreftsykdommer regnes i dag ved siden av operasjon og bestråling også antineoplastisk kjemoterapi.

Til tross for fremragende operasjonsteknikk, for-bedret stråleterapi og nyutviklede kjemoterapeutika har det hittil i løpet av de siste år ikke lykkes å forbedre helbred-elsesgraden for maligne tumorer, selv om det ved enkelte tumortyper, som f.eks. morbus Hodgkin, er oppnådd meget gode resultater.

Det gjenstår følgelig også det ønske å muliggjøre grunnleggende forbedringer i kjemoterapien, basert på stadig voksende kunnskap om biokjemien til tumorcellene.

Hovedmålet for nyutvikling av antineoplastisk virk-ende kjemoterapeutika er forbedringen av selektiviteten og dermed en reduksjon av uønskede bivirkninger.

Riktignok er det i mellomtiden blitt kjent mange bio-kjemiske forskjeller mellom tumorceller og normale celler, men disse forskjeller er ikke altfor signifikante.

Et flertall av de i dag anvendte stoffer disponerer derfor allerede over en viss selektivitet og følgelig en bruk-bar terapeutisk indeks, men allikevel er man fjernt fra en absolutt selektivitet.

En mulighet for å nå dette mål, er anvendelse av "prodrugs", dvs. legemidler som aktiveres spesielt på eller i målcellene, eller som spesielt sterkt detoksifiseres av ikke-målceller. Ifølge en annen anvendelsesform er det forsøkt å avstenge legemidlet på eller i målcellene, eller i det minste anrike legemidlet på eller i målcellene ("Drug Targeting").

Mange planer for Drug Targeting baserer seg på en spesifikk binding av et farmasøytisk middel på målcellen eller på forskjellige opptaksmekanismer mellom ikke-målceller og målceller. Også kvantitative forskjeller kan hermed utnyttes.

Således er man ved hjelp av hybridiseringsteknikken (Kohler og Milstein, 1975, Nature 256, 495) i stand til å til-føre målrettede monoklonale antistoffer og ved deres hjelp å kunne gjenkjenne tumorassosierte antigener.

Glykosidesterne som skal tilføres er tilgjengelige ved hjelp av kjente metoder, spesielt gjennom den videreutvik-lede Koenigs-Knorr-reaksjon eller imidatmetoden.

Et sammendrag av disse metoder, så vel som av den stereoselektive glykosylering, for hvilken det ifølge den i dag ønskede stereokjemi for sammenkoblingen er tilgjengelig tre grunnleggende metoder, finnes spesielt i Paulsen, 1984, Chem. Soc. Rev. 13, 15.

Det er imidlertid kjent at, til tross for de mange tilgjengelige glykosyleringsmetoder, ikke alle de ønskede forbindelser kan fremstilles stereoselektivt med tilfredsstill-ende utbytter. Hver glykosyloverføring representerer et individuelt problem, og universelle reaksjonsbetingelser er ofte ikke angitt (Schmidt, 1986, Angew. Chem. 98, 213).

Foreliggende oppfinnelse angår følgelig en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive glykokonjugater av fosforamidsennep eller ifosfamidsennep, omfattende: a-D-glukopyranosyl-N,N'-di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid,

p-D-glukopyranosyl-N,N' -di-( 2-kloretyl)-fosforsyrediamid,

a-D-glukopyranosyl-N,N'-di-(2-kloretyl) -fosforsyrediamid,

a-D-mannopyranosyl-N, N' -di- (2-kloretyl)-fosforsyrediamid,

p-D-mannopyranosyl-N,N'-di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid,

4-0-(p-D-galaktopyranosyl)-a-D-glukopyranosyl-N, N' - di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid, ,

4-0-(p-D-galaktopyranosyl)-N, N' -di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid,

4-0-(p-D-galaktopyranosyl)-p-D-glukopyranosyl-N, N' - di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid,

4-0-(p-D-glukopyranosyl)-a-D-glukopyranosyl-N, N' -di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid,

4-0-( p-D-glukopyranosyl)-p-D-glukopyranosyl-N, N' -di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid,

som spesifikt virksomme antitumormidler til anvendelse som antineoplastiske midler hvor aktiviteten for en stor grad er opprettholdt, mens toksisiteten er sterkt nedsatt.

Analogifremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at de beskyttede bromsukkerforbindelser, spesielt benzylbeskyttede bromsukkerforbindelser konjugeres med de tilsvarende fosforforbindelser, og de erholdte forbindelser befris fra beskyttelsesgruppene.

Som typiske eksempler fremstilles ved hjelp av de angitte fremgangsmåter konjugater med de følgende generelle formler.

Sukker

og sukker

hvorved forbindelsen mellom sukkeret og fosforamidsennepsgass-funksjonen fortrinnsvis finner sted i 1-stillingen. Som de viktigste sukkerforbindelser skal nevnes: galaktose, mannose, glukose, mannan, galaktan, glukan, så vel som forgrenede sukkerforbindelser, spesielt i 3- og 6-posisjonen, imidlertid hvorved prinsipielt alle sukkerforbindelser, nemlig mono-, di-eller polysakkarider i alle eksisterende isomere og enantio-raere former kan innføyes.

Rx og R2 kan være like eller forskjellige og ha de følgende betydninger: hydrogen, C^-C^-lavere-alkyl, Cj^-Cg-halo<g>enalk<y>l, fortrinnsvis C^-C^-halogenalkyl, og spesielt C2-halogenalkyl.

Som beskyttende grupper kan alle generelle vanlige beskyttelsesgrupper for 0H-funksjoner anvendes, f.eks. benzyl-, acetyl-, tritylgrupper, og avspaltingen foregår likeledes på kjent måte - enzymatisk, hydrogenolytisk, sur eller alkalisk.

Generelt kan den ønskede og innføyde glykosylkoblede fosfamidsennep og ifosfamidsennep fremstilles på følgende måte: Fosforforbindelsene i form av sammenkoblede enheter kan fremstilles etter arbeidsskjemaet ifølge Lorenz og Wiessler, 1985, Arch. Pharm. 318, 577.

Disse to forbindelser kan eventuelt erholdes med beskyttende bromsakkarider ifølge eksemplet for forbindelsen 28 0, glukose-Ø-IPM, hhv. disakkaridforbindelsene 50 og 51 i overensstemmelse med arbeidsskjemaet ifølge de medfølgende figurene 1 og 2.

En beskyttet sukkerforbindelse A omsettes med en fos-forsyreforbindelse B i et løsningsmiddel, fortrinnsvis et polart løsningsmiddel, f.eks. acetonitril, CH2C12, eller toluen, i et temperaturområde fra 20°C til 120°C i et tidsrom av 1 time til 48 timer, under tilsetning av en hjelpebase, f.eks. Et3N, Et(i-prop)2N. Den generelle fremgangsmåtebeskriv-else kan representeres ved hjelp av det følgende formelskjema.

Reaksjonen med ifosfamid foregår på tilsvarende måte.

Rs = en beskyttende gruppe, f.eks. benzyl,

x = en reaktiv gruppe, f.eks. brom.

Med utgangspunkt i 1-0-metylpyranosidene til glukose, galaktose og mannose kan de tilsvarende 2,3,4,6-tetra-0-benzyl-a-D-glukopyranosylbromider ifølge figur 1 fremstilles.

Den etterfølgende benzylering foregår på kjent måte, f.eks. i dioksan med benzylklorid under tilstedeværelse av KOH for metyl-a-D-gluko- hhv. -galaktopyranosid, mens metyl-a-D-mannopyranosid omsettes i f.eks. i benzylklorid/NaH. De benz-ylerte metylglykosider 10, 11 og 12 hydrolyseres i tilslutning til dette f .eks. med H2S04/HOAc til forbindelse 13 hhv. med HCl/HOAc til forbindelsene 14 og 15. Forbindelsen 13 og den isomere mannose 15 kan deretter derivatiseres, f.eks. med p-nitrobenzoylklorid i diklormetan/pyridin, til de angitte 2,3,4, 6-tetra-0-benzyl-l-0-p-nitrobenzoyl-D-glukopyranoser 16 og 18, som begge lett kan renses ved omkrystall iser ing. Da denne rensing ikke er så godt mulig for p-nitrobenzoatet av 2, 3,4, 6-tetra-0-benzylgalaktose, foretrekkes i dette tilfelle derivatisering med fenylisocyanat i pyridin til krystalliser-bar 2,3,4, 6-tetra-0-benzyl-l-0-(N-fenyl-karbamoyl) -D-galakto-pyranose 17 (Kronzer og Schuerch, 1974, Carboh. Res. 33, 273).

De benzylbeskyttede a-bromhalogenoser 19, 20 og 21 kan f.eks. dannes ved behandling av HBr i CH2C12 og innsettes i den etterfølgende glykosyleringsreaksjon etter vanlig opp-arbeidelse, nemlig avfiltrering av p-nitrosobenzosyre hhv. anilinbromid og fjerning av overskytende HBr, uten videre rensing.

De benzylbeskyttede glykosyldonorer har nå ingen sub-stituenter på C-2 som kan utøve en dirigerende innflytelse på glykosyleringen. De bromerte sukkerforbindelser som er forsynt med benzylbeskyttende grupper, omsettes deretter med fosforamid hhv. ifosfamid i diklormetan/trietylamin. Utbyttet av omsetningen av 16, 17 og 18 til 22, 23 og 24 er angitt i tabell 1, og i tabell 1 er også angitt anomerforholdet og elueringsmidlet ved søylekromatograferingen. Atskillelsen ut-føres f.eks. ved hjelp av søylekromatografi.

Ved HPLC-analysen må det tas hensyn til den meget sterke konsentrasjonsavhengighet for retensjonstidene, og likeså den sterke tailing av konjugatene. Bestemmelsen av strukturen og stereokjemien fulgte deretter ved hjelp av <1>H- og <13>C-NMR-spektroskopi.

Til fremstilling av større mengder anvendes en fremgangsmåte, ved hvilken det dannes en foretrukket anomer ved hjelp av stereoselektiv syntese, noe som medfører at det kan avstås fra en HPLC-rensing.

Ifølge Schmidt, 1986, Angew. Chem. 98, 213, kan det tilsettes benzylbeskyttede O-glykosyltrikloracetimidater som glykosyldonorer for stereoselektive synteser. Syntesen av tri-kloracetimidatene følger den beskrevne fremgangsmåte i litteraturen, med utgangspunkt i tetra-O-benzylglukosene 13, 14 og 15.

Under anvendelse av kaliumkarbonat som base erholdes fra forbindelse 13 i en kinetisk kontrollert reaksjon p-imidatet 25p, med NaH oppnås en rask anomerisering til termo-dynamisk stabil 25a. Analogt erholdes fra forbindelse 14 galaktosylimidatet 26a, fra forbindelse 15 erholdes mannosyl-imidatet 27a. Disse imidater utviser i forhold til de bromak-tiverte benzylglukoser den fordel at de har høyere stabilitet; de kan lett isoleres og er lagringsstabile.

På denne måte omsettes imidatene under forskjellige reaksjonsbetingelser med IPM 4b. Som løsningsmiddel anvendes f.eks. diklormetan eller acetonitril, som katalysatorer f.eks. BF3.dietyleter eller HC1 i diklormetan.

Reaksjonen foregikk hurtigere i CH3CN enn i CH2C12. Mannosyl-imidatet 27a reagerte med forbindelse 4b selektivt til mannosid 24a.

De beskyttede glykosider kan avbeskyttes, f.eks. ved hjelp av katalytisk hydrering med Pd/aktivt kull ved romtemperatur. Forløpet av hydreringen kan følges ved hjelp av tynnsjiktskromatografi. Påvisningen kan utføres ved hjelp av metanolisk svovelsyre, mer følsom er imidlertid påvisningen med 4-(p-nitrobenzyl)-pyridinreagens (NBP).

Etter avslutning av reaksjonen avfiltreres katalysa-toren, filtratet sentrifugeres ned og tørkes i høyvakuum. Ved anvendelse av glykosidene 22, 23 og 24 i form av rene anomerer erholdes de beskrevne glykosider 28, 29 og 30 likeledes i form av rene anomerer (fig. 2).

De beskrevne fosforamidkonjugater, så vel som konjugatene av derivatene av formel

kan erholdes på den beskrevne måte.

En rensing av de dannede produkter i form av klare, fargeløse, høyviskøse oljer er ikke nødvendig. Skulle det imidlertid dannes biprodukter ved hydreringen, så kan disse atskilles ved hjelp av en kort søylekromatografi på kiselgel (acetonitril-/metanolblanding).

HPLC-analyse tillater bestemmelsen av anomerforhold-ene i tilfelle av glykosidet 28 og mannosidet 30.

Identiteten av forbindelsene kan fastslås ved hjelp av FAB-MS og <1>H-NMR-spektroskopi. Konfigurasjonen av sukker-resten kan dessuten bekreftes ved hjelp av enzymatiske reaksjoner. Som eksempel er det i fig. 3 angitt FAB-spektret (negativt) av Glc-p-IPM 28 p.

Under anvendelse av glyserol som matriks gav så vel negative som positive FAB-spektra vesentlige informasjoner. Fra alle seks forbindelser kunne signalene til de negative molekyltopp-ioner (M-H)" hhv. de positive molekyltopp-ioner (M+H)<*> observeres. Det fremkom iblant tre topper i et karak-teristisk forhold, et fenomen som inntraff ved at molekylet inneholdt to kloratomer, klor forekommer i naturen imidlertid ikke isotoprent, men i forholdet <35>Cl:37Cl-3:1, noe som betinger et forhold mellom isotoptoppene på tilnærmet 9:6:1* Således ble det for ionene (M+H)<+> funnet de ventede verdier m/e = 383, 385, 387, og for (M-H)- de tilsvarende verdier m/e = 381, 383 og 385. Et karakteristisk fragment, nemlig fragmentet til det alkylerende aglykon IPM, ble entydig påvist ved hjelp av signalene m/e = 221, 223, 225 for (IPM+H) + , så vel som m/e = 219, 221 og 223 for (IPM-H)"; også her finnes den typiske for-deling av isotoptoppene. I avbildning 4 kan begge tripletter til ionene (M-H)' og (IPM-H)" fra Glc-p-IPM 28p tydelig på-vises. Signalene m/e = 91 og 183 stammer fra den anvendte glyserolmatriks.

Koordineringen av konfigurasjonen til det anomere sentrum lykkes ved hjelp av <1>H-NMR, som ved de beskyttede eduk-ter over de typiske koblinger til protonet H-l og dennes kjem-iske forskyvning; denne parameter sammenfattes i tabell 3.

Isomeren PM 4a til IPM reagerte med 2,3,4,6-tetra-0-benzyl-a-D-glukopyranosid 19 og den tilsvarende mannosyldonor 21 i diklormetan/trietylamin under dannelse av 2,3,4,6-tetra-O-benzyl-D-glukopyranosyl-N,N-bis- ( 2-kloretyl)-fosforsyrediamid 31 hhv. til 2-epimeren 32 (fig. 4).

For fremstilling av glykosyl-PM-konjugatene 5 eller 31 er enda ytterligere synteseveier mulige, som vises i figur 5. På tilsvarende måte (eksemplene 1 og 2) erholdes over hepta-O-benzylglukosene 43 og 44 disakkarid-IPM-konjugaténe 50 og 51

Også her bestemmes identiteten til alle fire dia-stereomere forbindelser ved hjelp av 2D-NMR-C0SY. Figur 6a/6b representerer 2D-spektret for de beskyttede cellobiose-IPM-konjugater 51a og 510.

Også her ble strukturen til sukkerrestene bekreftet ved hjelp av enzymatiske reaksjoner, dvs. laktose hhv. cellobiose.

Ved oppbygging av disakkaridkoblede IPM-konjugater har anvendelsen av naturlig forekommende disakkarider, som laktose eller cellobiose, som edukt en fordel i forhold til en konjugatoppbygging av monosukker ved at glykosidbindingen mellom sukkerforbindelsene er gitt på forhånd, og dermed kan et stereoselektivt syntesetrinn innspares. Følgelig anvendes den tidligere beskrevne syntesefremgangsmåte også ved frem-stillingen av disakkaridkoblede IPM-konjugater. Det behøves altså først et benzylbeskyttet disakkarid hvis 1-O-posisjon enten kan aktiveres ved hjelp av hydrogenbromid eller trikloracetonitril. Således kan det fra laktose og cellobiose, i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge S. Koto [Koto et al., 1982, Nihon-Kagakkai: Nihon-Kagaku-Kaishi (J. Chem. Soc. Jpn.) 10,1651] syntetiseres disakkaridbyggestenene 2,3,6-2',3',4',6'-hepta-O-benzyl-laktose og det isomere cellobiose-derivat 44 (fig. 7).

Dersom glykosidene inkuberes i HEPES eller vann med tilsvarende glykosidase, kan den raske spalting av glykosidbindingen observeres.

Konjugatene Lac-IPM 50 og Cel-IPM 51 viste seg stabile i metanolisk løsning, på samme måte som monosakkarid-konjugatene 28-30, ved romtemperatur (DC-analyse). Fordi det både i forbindelse 50 og 51 foreligger to glykosidbindinger, som oppviser lik (510) eller forskjellig konfigurasjon (f.eks. 50a), anvendes i tillegg til enkeltvise glykosidaser også enzymblandinger til undersøkelse av den enzymatiske frigivelse av IPM. Den enzymatiske spalting av de anomer-rene konjugater 50 og 51 ble fulgt ved hjelp av tynnsjiktskromatografi; det ble ved hjelp av NBP enten påvist intakte konjugater eller spaltingsproduktene 28a, 280 eller IPM.

Ved hjelp av tilsvarende glykosidaser ble alle konjugater hurtig spaltet, og f.eks. metabolitter med den generelle formel 1 hhv. la kunne frigis.

Ved disakkaridkonjugatene 50 og 51a var spaltingen av to forskjellige glykosidbindinger nødvendig for å oppnå IPM-frigivelse. Kun 510, som oppviser to likt konfigurerte bind-inger, kunne spaltes fullstendig ved hjelp av ett enkelt enzym, nemlig Ø-glukosidase.

Dette ble bekreftet ved hjelp av målingen av den bio-logiske aktivitet, nærmere bestemt den celletoksiske aktivitet in vitro ved undersøkelse av et retotelsarkom hos mus og brysttumorcellelinjer hos rotte, så vel som av Eb/ESb-celle-linjer.

Det ble deretter foretatt undersøkelser på P388-leukemi hos mus og på lC32-tumor hos rotte. Resultatene av undersøkelsene in vitro og in vivo er vist i figurene 8-13.

Måling av toksisitet viste at ved en intraperitoneal dose på 100 mg/kg hhv. 1000 mg/kg Glc-Ø-IPM til CDzF^hannmus kunne ingen akutt toksisitet observeres. Disseksjon av dyrene etter 28 dager gav ingen resultater. Også BD6-rottene med transplantert lC32-tumor som ble behandlet med Gal-IPM (5-122,5 hhv. 5-245 mg/kg), gav ingen påviselig toksisitet. Dis-seksjonsproduktet (bl.a. lever, nyrer, milt, hjerne, benmarg) brakte ingen resultater ved den 15. dag etter innledningen av

behandlingen.

Sammenfatningsvis kan det altså konstateres at under-søkelser in vitro på et retotelsarkom viser celletoksisiteten av både Aglyka PM og IPM, som også av monosakkarid-IPM-konjugatene med generell formel 1 hhv. la, og også disakkaridkonjugatene med generell formel 1 hhv. la. Ved tester in vitro viser det seg ved brysttumorcellelinjene 1C29, 1C32 og 1C39 visse graderinger, mens Gal-p-IPM bestandig er den mest virksomme forbindelse. Også ved forsøk in vivo ble det påvist en god virksomhet på P388-modellen og på den solide lC32-bryst-tumor, og det uten akuttoksisitet. Etter at også benmargstok-sisiteten, som f.eks. ble undersøkt for Glc-p-IPM, kun er meget liten, er en viktig betingelse ved utviklingen av nye antineoplastisk virksomme kjemoterapeutika oppfylt.

De følgende eksempler illustrerer spesielt fremstil-lingen av forskjellige eksempelvise forbindelser.

Eksempel 1

Generell arbeidsbeskrivelse for fremstilling av benzylbeskyttet glykosyl- fosforsyrediamid

Arbeidsbeskrivelse A: Aktivering ved hjelp av hydrogenbromid

4,35 mmol av en på kjent måte beskyttet p-nitro-benzylglukose (f.eks. 3,0 g 16) hhv. N-fenylkarbamoylderivatet 17 ble etter tørking over P205 løst i 10 ml absolutt CH2C12 (trehalset kolbe). Under tørt nitrogen ved -20°C ble 30 ml av en HBr-mettet CH2C12-løsning langsomt innsprøytet. Etter få sekunder utfeltes p-nitrobenzosyre. Etter oppvarming ved romtemperatur (i mindre enn 30 min) ble omrøringen fortsatt i enda 1 time ved romtemperatur, og deretter ble innholdet suget over i en andre trehalset kolbe. Etter avdamping av CH2C12 (omrøring med magnetrører, vannstrålevakuum, vannbad, romtemperatur) ble det tilsatt to porsjoner å 5 ml dietyleter, og løsningen ble inndampet som beskrevet tidligere for å fjerne HBr-rester. Den erholdte gule til orangefargede olje ble løst i 20 ml CH2C12, og 1,0 g 4a eller 4b eller 54 (4,6 mmol) og 0,85 ml trietylamin (6 mmol) ble tilsatt. Etter 3 dagers om-røring ved romtemperatur ble løsningen filtrert, vasket to ganger med et lite volum vann, den organiske fase ble tørket

over Na2S04 og rotasjonskonsentrert. Deretter fulgte søyle-kromatografering av den nesten gule, høyviskøse olje, og det ble erholdt anrikninger av de eventuelle anomerer i tidlige hhv. sene fraksjoner. Fullstendig anomer-renhet kunne i alle tilfeller oppnås ved hjelp av HPLC, i flere tilfeller også ved hjelp av krystallisering.

Alle arbeidstrinn ble gjennomført under tørt nitrogen, med tørre løsningsmidler og under utelukkelse av lys.

Arbeidsbeskrivelse B: Omsetning av fosforsyrediamider med glvkosvlimidater

1,0 mmol glykosylimidat (f.eks. 25) ble løst i 20 ml acetonitril. Etter tilsetning av 1,0 mmol fosforsyrediamid ble løsningen oppvarmet under tilbakeløpskjøling i 6 timer (utelukkelse av lys). Etter filtrering og rotasjonsinndamping ble produktet kromatografert på kiselgel på kjent måte.

Arbeidsbeskrivelse C: Avspalting av de benzylbeskyttende grupper

0,1 mmol av de benzylbeskyttede monosakkaridderivater 22, 23, 24 eller 55 hhv. disakkaridkonjugatene 48 eller 49 ble løst i 15 ml MeOH. Etter tilsetning av ca. 5 mg Pd/aktivt kull (oksidert form, inneholdende 10 % Pd) pr. 0,1 mval avspaltbar benzylgruppe (dvs. f.eks. 20 mg katalysator pr. 0,1 mmol 22, 35 mg pr. 0,1 mmol 48) ble hydreringen fortsatt ved romtemperatur til avspaltingen av alle beskyttende grupper kunne på-vises ved hjelp av analytisk tynnsjiktskromatografi (etter 1-4 timer). Øyeblikkelig etter avbruddet av hydreringen ble det avbeskyttede produkt erholdt i ren tilstand etter filtrering og rotasjonsinndamping. Ved unødig lang reaksjonstid dekompo-nerte det avbeskyttede glykosid, og det ble dannet IPM 4b. I dette tilfelle kunne det ønskede produkt isoleres etter søyle-kromatografering (kiselgel, CH3CN:MeOH = 70:30). Tynnsjiktskromatograf!:

Kiselgel, CH3CN:MeOH = 30:70, Rf ( 28a) = 0,58,

Rf (4b) = 0,18.

Kiselgel, CH3CN:MeOH:H20 = 75:20:5.

Rf-verdier: 0,44 (28a), 0,48 ( 28B)

0,43 (29a), 0,45 ( 29B)

0,43 (30a), 0,41 ( 30B)

0,29 (50 og 51), 0,13 (4b).

Til påvisning ble produktet sprøytet med NBP-reagens (2,5 % NBP i aceton), oppvarmet til 120°C i 10 min og etter avkjøling til romtemperatur sprøytet med 0,5 M NaOH. IPM-kon-jugatet ble farget dypblått, mens IPM selv ble lyseblått.

Fosforamidsennep og ifosfamidsennep ble fremstilt etter kjente arbeidsmåter beskrevet i litteraturen.

Monosakkarid- PM/ IPM- konjuqat

(Analog 6)

Startmateriale:

0,55 g 4a (2,5 mmol) (N,N-di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid )

1,03 g ABG (2,5 mmol).

Utbytte: 30 rag 5 i form av gulaktig, klar olje (2,2 % teor.),

diastereomerblanding (A+B, s. NMR-spektrum). Analyse C^H^Cip^P (551,3):

(med D20, -NH2), 3,35-3,70 (m, 8 H, 2x -CH2CH2C1), 3,82 (m, 1 H, H-5), 4,148 (dd, H-6a (A), J5 6a = 5,0 Hz, <J>6a.6b = 12,5 Hz), 4,208 (dd, H-6a (B), J56a<=><4>,9 Hz, J6a.6b = 12,5 Hz), 4,244 (dd, H-6b (A), J5 6b <=><2>,1 Hz, J6a.6b = 12,5 Hz), 4,288 (dd, H-6b (B), J56b <=><2,>1 H<z>), <J>6a.6b = 12,5 Hz), 5,02-5,12 (m, 2 H), 5,21 og 5,23 (2 t, til sammen 1 H, (B+A), J = 9,5 Hz), 5,298 og 5,316 (2 t, til sammen 1 H, H-l (A) og H-l (B),

Jl.2 J1.P<=> 7'<8><HZ>)'

MS: m/e = 331 (M-PM).

2. 3, 4, 6- tetra- 0- acetvl- 3- D- qlukopyranosyl- N, N'- di-( 2- klor-etvl)- fosforsyrediamid 6

Til en blanding av 1,1 g 4b (5 mmol) og 2,05 g aceto-bromglukose (5 mmol) i 50 ml tørt aceton ble det tildryppet 0,5 g trietylamin (5 mmol). Det ble omrørt i 48 timer ved romtemperatur under utelukkelse av lys. Etter filtrering og rotasjonsinndamping ble bunnfallet oppløst i CH2C12, tilsatt et lite volum 0,1 M HC1, vasket med NaHC03-løsning og vann, tørket over Na2S04 og kromatografert på kiselgel (aceton:n-heksan = 40:60). Det ble erholdt 80 mg 6 (2,9 % teor.) i form av klar, fargeløs olje, som krystalliserte etter måneder ved +4°C. Sm.punkt: 91°C.

Tynnsjiktskromatografi:

Kiselgel, aceton:n-heksan = 1:1, Rf = 0,13.

Analyse C^H^C^C-nP (551,3):

Penta- O- pivaloyl- B- D- qlukose 7

(Etter Kunz og Harreus, 1982, Liebigs Ann. Chem. 41)

Startmateriale:

29 g D-glukose (0,16 mol)

121,2 g pivaloylklorid (1,0 mol)

200 ml kloroform, 120 ml pyridin.

Utbytte: 66 g 7 (69 % teor.).

Sm.punkt: 154°C (Lit.: 156-158°C).

Analyse C31H52011 ( 600, 8 ):

2, 3, 4, 6- tetra- O- pivaloyl- g- D- qlukopyranosylbromid 8

(Etter Kunz og Harreus, 1982, Liebigs Ann. Chem. 41)

Startmateriale:

12 g 7 (20 mmol)

20 ml HBr i iseddik (33 %)

20 ml diklormetan.

Utbytte: 6,4 g 8 (55,5 % teor.).

Sm.punkt: 142°C.

Analyse C26H43<B>r09 (579,5):

(J23 = 9,5 Hz), 5,21 og 5,64 (2 t, 2 H, J = 9,5 Hz, H-4 og H-3), 6,62 (d, 1 H, H-l, 312 = 4,2 Hz).

2, 3, 4, 6- tetra- 0- pivaloyl- B- D- qlukopyranosyl- N, N'- di-( 2- kloretyl )- fosforsyrediamid 9

Til en blanding av 0,38 g 4b (1,725 mmol) og 1,0 g

(1,725 mmol) i 50 ml aceton ble det ved romtemperatur tilsatt 0,5 g Ag2C03 (1,8 mmol). Etter 24 timers omrøring (utelukkelse av lys) ved romtemperatur ble løsningen filtrert, inndampet og kromatografert på kiselgel (aceton:n-heksan = 25:75). Det ble erholdt 160 mg 9 (12,9 % teor.) i form av klar, fargeløs olje, som krystalliserte etter måneder ved +4°C.

Sm.punkt: 94°C.

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, aceton:n-heksan = 1:1, Rf = 0,43.

Analyse C30<H>54Cl2N2O2P ( 719, 54 ):

Metyl- 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- a- D- qlukopyranosid 10

(Etter fremgangsmåter i Carbohydrate Chemistry, 1972)

Startmateriale:

50 g metyl-a-D-glukopyranosid (257 mmol)

250 g KOH (pulverisert)

150 ml dioksan

318 ml benzylklorid (2,76 mol).

Utbytte: 116 g 10 (81,3 % teor.) som høyviskøs, gul, klar

olje.

Analyse C35H3806 (554,68):

Metyl- 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- a- D- qalaktopyranosid 11

(Analog 10)

Startmateriale:

40 g metyl-a-D-galaktopyranosid (206 mmol) 200 g KOH (pulverisert)

200 ml dioksan

280 ml benzylklorid.

Utbytte: 102 g 11 (89,3 % teor.) som gul, klar olje. Analyse C35H38<0>6 (554,68):

Metyl- 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- g- D- mannopyranosid 12

(Etter Koto et al., 1976)

Råutbytte: Etter vaskeprosessen dannet det seg to faser. Etter atskillelse av den øvre fargeløse fase (hvit olje) ble det erholdt 52 g gul, lett opak olje, som uten videre rensing ble omsatt til 15.

En del av oljen ble kromatografert (kiselgel, EE:PE = 40:60): gul, klar olje.

<X>H-NMR: 90 MHz, CDC13

6 = 3,31 (s, 3 H, -OMe), 3,65-4,15 (m, 6 H, sukkerprotoner), 4,43-5,10 (m, 9 H, H-l- og 4x -CH2-Ph), 7,1-7,45 (m, 20 H, 4x -Ph).

2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- a- D- qlukopyranose 13

(Etter fremgangsmåter i Carbohydrate Chemistry, 1982)

Startmateriale:

115 g 10 (207 mmol).

Utbytte: 54 g 13 (48,3 % teor.).

Sm.punkt: 152°C (omkrystallisert fra metanol).

Analyse C34H36<0>6 (540,66):

2, 3, 4. 6- tetra- O- benzvl- a- D- qalaktopyranose 14

(Etter Kronzer og Schuerch, 1974, Carboh. Res. 33, 273)

Startmateriale:

30 g 11 (54 mmol)

500 ml eddiksyre (80 %)

150 ml 1 N HC1.

Utbytte: 28,6 g 14 (98 % teor.), gul, klar olje.

<X>H-NMR: 90 MHz, CDC13

6 = 3,47 (d, 1 H, utbyttbar med D20, -OH), 3,5-4,3

(m, 6 H, sukkerprotoner), 4,35-5,05 (m, 8 H, 4x -CH2-Ph), 5,28 (dd, 1 H, H-l, J12 = 3,2 Hz), 7,1-7,5 (m, 20 H, 4x -Ph).

2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- D- mannopyranose 15

50 g av blanding 12 (ca. 90 mmol, ennå inneholdende noe hvit olje) ble oppløst i 800 ml iseddik og oppvarmet til 80-85°C. I løpet av 60 min ble 120 ml 2 N HC1 tildryppet; etter ytterligere 90 min ble det tilsatt 200 ml vann, blandingen ble avkjølt til romtemperatur og deretter ekstrahert med 3200 ml toluen. Den organiske fase ble vasket med mettet NaHC03-løsning og vann, tørket over Na2S04 og rotasjonsinndampet. Den erholdte brune sirup ble kromatografert (kiselgel, EE:PE = 30:70) og gav 33,2 g 15 (68,3 % teor.) i form av gul olje. <1>H-NMR: 90 MHz, CDC13 6 = 3,5-4,3 (m, 7 H, 1 H, utbyttbar med D20, -OH og 6

sukkerprotoner), 4,35-5,05 (m, 8 H, 4x -CH2-Ph), 5,22 (d, 1 H, H-l, 312 ca. 2 Hz), 7,05-7,4 (m, 20 H, 4x - Ph).

2, 3, 4, 6- tetra- O- benzvl- l- O- p- nitrobenzovl- D- qlukopyranose 16

(Etter fremgangsmåter i Carbohydrate Chemistry, 1972)

Startmateriale:

15,5 g 13 (28,7 mmol)

6 g p-nitrobenzoylklorid (32,3 mmol)

3,75 ml pyridin.

Utbytte: 15,6 g 16 (78,8 % teor.) som hvitt pulver.

Sm.punkt: 93-98°C (fra etanol).

Ny omkrystallisering fra diisopropyleter gav 16a som nåler.

Sm.punkt: 122°C.

Analyse C41<H>39N09 (689,76):

(fra 16( 3 krystallisert fra morluten).

2, 3. 4. 6- tetra- 0- benzyl- l- 0-( N- fenylkarbamoyl)- D- qalaktopyranose 17

(Etter Kronzer og Schuerch, 1974, Carboh. Res. 33, 273)

Startmateriale:

18,7 g 14 (34,6 mmol)

50 ml pyridin

5,4 ml fenylisocyanat.

Utbytte: 8,0 g 17 (35 % teor.), (a:B = 35:65). Sm.punkt: 120-122°C (fra etanol).

Analyse C41H41N07 (659,78):

fra 17a krystallisert fra morluten, sm.punkt 143°C.

2. 3. 4. 6- tetra- O- benzyl- l- O- p- nitrobenzovl- a- D- mannopyranose 18

(Etter Koto et al., 1976, Bull. Chem. Soc. Jpn. 49, 2639)

Startmateriale:

9.8 g 15 (18,1 mmol)

4.9 g p-nitrobenzoylklorid

50 ml pyridin.

Utbytte: Etter flashkromatografi (kiselgel 60, EE:PE = 25:75)

krystalliserte 7,7 g 18 (61,7 % teor.) fra diisopropyleter.

Sm.punkt: 105°C.

Analyse C41H39N09 (689,76):

2, 3. 4, 6- tetra- 0- benzyl- N, N'- di-( 2- kloretyl)- fosforsyrediamid 22

1) etter arbeidsbeskrivelse A

Startmateriale:

3,0 g 16 (4,35 mmol)

1,0 g 4b (4,6 mmol).

Utbytte: Etter søylekromatografi (kiselgel, EE:PE = 60:40)

2,2 g 22 (68 % teor.), anomerblanding: a:B = 5:4 (<1>H-NMR).

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, EE:PE = 60:40, Rf = 0,28, Rf (a)>Rf (B). HPLC, analyse: Kiselgel, EE:heksan = 75:25, strømningshastighet 1,0 ml/min, Rt (a) = 12,53', Rt (p) = 14,04'. HPLC, prep.: Kiselgel, EE:heksan:MeOH = 58:42:0,5, strømnings-hastighet 10,0 ml/min, Rt (a) = 45', Rt (P) = 55'. Analyse C38H45C12N207P (743,60):

2) etter arbeidsbeskrivelse B

Startmateriale:

4.5 g 25a (6,57 mmol)

1,45 g 4b (6,57 mmol).

Utbytte: Etter søylekromatografi (som ovenfor) 2,06 g 22

(42,2 %) teor.), anomerforhold a:p ca. 1:20) (etter

^-NMR og HPLC).

Startmateriale:

50 mg 25B (0,073 mmol)

16,1 mg 4b (0,073 mmol).

Tynnsjiktskromatografi viser et produkt med Rf = 0,28 og lite innhold av tetrabenzylglukose 13 så vel som lite innhold av edukt 25_B_, anomer forhold a:p = 1:1,1 (HPLC). 2 , 3 . 4 , 6- tetra- O- benzyl- D- qlukopvranosyl- N, N'- di-( 2- kloretyl)-fosforsyrediamid 23

1) etter arbeidsbeskrivelse A

Startmateriale:

2.6 g 17 (3,94 mmol)

0,9 g 4b (4,07 mmol).

Utbytte: Etter søylekromatografi (kiselgel, EE:PE = 60:40)

1,9 9 23 (65 % teor.), anomerblanding: a:p = 1:1 (<1>H-NMR).

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, EE:PE = 60:40, Rf = 0,27, Rf (a)>Rf (B). HPLC, analyse: Kiselgel, EE:heksan = 75:25, strømningshastighet 1,0 ml/min, Rt (a) = 14,26', Rt (B) = 18,03'. HPLC, prep.: Kiselgel, EE:heksan:MeOH = 58:42:0,5, Rt (a) = 51', Rt (p) = 62'.

Analyse C38H45C12N207<P> (743,60):

2) etter arbeidsbeskrivelse B

Startmateriale:

685 mg 26a (1,0 mmol)

221 mg 4b (1,0 mmol).

Utbytte: I den filtrerte reaksjonsblanding utgjorde anomerforholdet a:B = 55:45 (HPLC). Etter søylekromatografi (som ovenfor) ble det erholdt 260 mg 23 (38 % teor.).

2, 3. 4, 6- tetra- O- benzyl- D- mannopyranosyl- N. N'- di-( 2- kloretyl)-fosforsyrediamid 24

1) etter arbeidsbeskrivelse A

Startmateriale:

2,3 g 18 (3,33 mmol)

0,75 g 4b (3,39 mmol).

Utbytte: Etter søylekromatografi (kiselgel, EE:PE = 80:20)

1,16 g 24 (47 % teor.), anomerblanding: a:B = 55:45

(<1>H-NMR).

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, EE:PE = 60:40, Rf (a) = 0,23, Rf (B) =

0,19.

HPLC, analyse:

Kiselgel, EE:heksan = 75:25, strømningshastighet

1,0 ml/min, Rt (a) = 13,05', Rt (p) = 21,61'.

HPLC, prep.:

Kiselgel, EE:heksan:MeOH = 64:36:0,5, strømnings-hastighet 10,0 ml/min, Rt (a) = 45', Rt (B) = 70'. Analyse C38H45C12N207P (743,60):

2) etter arbeidsbeskrivelse B

Startmateriale:

3,2 g 27a (4,67 mmol)

1.04 g 4b (4,70 mmol).

Utbytte: Tynnsjiktskromatografi viser nesten kvantitativ omsetning til 24a med Rf = 0,23. I den filtrerte reaksjonsblanding befinner seg kun a-anomeren (HPLC). Etter søylekromatografi ble det erholdt 1,6 g 24g (45 % teor.).

0- ( 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- a- D- qlukopvranosyl)- trikloracetimidat 25a

(Etter Schmidt og Stumpp, 1983, Liebigs Ann. Chem. 1249)

Startmateriale:

9,2 g 13 (17 mmol)

7,7 ml trikloracetonitril

680 mg NaH.

Utbytte: 10,9 g 25a (93,6 % teor.), fargeløs, klar olje. Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, PE:E = 1:1, Rf = 0,44.

<1>H-NMR: 90 MHz, CDC13

6 = 3,6-5,1 (m, 14 H), 6,51 (d, 1 H, H-l, J1>2 =

3.5 Hz), 6,95-7,55 (m, 20 H, 4x -Ph), 8,55 (s, 1 H, -NH-).

0- ( 2, 3. 4, 6- tetra- 0- benzyl- P- D- glukopyranosyl)- trikloracetimidat 253

(Etter Schmidt et al., 1984, Liebigs Ann. Chem. 680)

Startmateriale:

1.3 g 13 (2,4 mmol)

1,25 g K2C03 (tørket)

1,25 ml trikloracetonitril.

Utbytte: Etter kiselgelfiltrering: lys, gulaktig olje (1,6 g,

97 % teor., a:p = 1:5); etter søylekromatografi

(kiselgel, E:PE = 2:3) ble det erholdt 25B i form av

fargeløs olje (50 mg, 30 % teor.).

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, PE:E = 1:1, Rf = 0,37.

<X>H-NMR: 90 MHz, CDC13

6 = 3,55-3,90 (m, 6 H), 4,40-5,05 (m, 8 H), 5,82 (d, 1 H, H-l), 7,1-7,5 (m, 20 H, 4x -Ph), 8,70 (s, 1 H, -NH-).

0- ( 2. 3. 4. 6- tetra- O- benzyl- D- qlukopyranosyl)- trikloracetimidat 26

(Etter Schmidt et al., 1984, Liebigs Ann. Chem. 1343)

Startmateriale:

1,5 g 14 (2,77 mmol)

1.4 ml trikloracetonitril

80 mg NaH.

Utbytte: Etter kiselgelfiltrering ble anomerforholdet bestemt til a:B = 4:1 (<1>H-NMR: 90 MHz, CDC13, nr. H14208, 6 = 5,72 (d, 0,2 H, H-l (B), J1>2 = 8, 0Hz), 6,52 (d, 0,8 H, H-l (a), J1>2 = 3,7 Hz), 8,51 (s, 0,8 H, -NH- (a), utbyttbar med D20), 8,60 (s, 0,2 H, -NH- (p), utbyttbar med D20). Etter søylekromatografi (kiselgel, E:PE = 1:1) ble det erholdt to fraksjoner:

Fl: 1130 mg 26a (59,5 % teor.) som fargeløs olje, <1>H-NMR: 500 MHz, CDC13, nr. H14112. F2: 320 mg 26 (16,8 % teor.) som lys, gulaktig olje (a:p = 2:1), ^-NMR: 500 MHz, CDC13, nr. H14113. Tynnsj iktskromatografi: Kiselgel, PE:E = 1:1, Rf (a) = 0,43, Rf (p) = 0,34.

0- ( 2. 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- a- D- mannopvranosyl)- trikloracetimidat 27a

(Etter Schmidt et al., 1984, Liebigs Ann. Chem. 1343)

Startmateriale:

4,5 g 15 (8,27 mmol)

4 ml trikloracetonitril

45 mg NaH.

Utbytte: Etter søylekromatografi 4,45 g 27a (65 % teor.) som

fargeløs olje.

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, E:PE = 3:2, Rf = 0,51.

<1>H-NMR: 90 MHz, CDC13

6 = 3,65-5,0 (m, 14 H), 6,33 (d, 1 H, H-l, J12 ca. 1,5 Hz), 7,0-7,5 (m, 20 H, 4x -Ph), 8,52 (s, 1 H, -NH-).

g- D- qlukopyranosyl- N, N'- di-( 2- kloretyl)- fosforsyrediamid 28a Hydrering av 22g etter arbeidsbeskrivelse C

<X>H-NMR: 500 MHz, D20, nr. 13943

6 = 3,25-3,32 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,488 (t, 1 H, J =

9,5 Hz), 3,61-3,67 (m, 5 H med 2x -CH2), 3,719 (t, 1 H, J ca. 9,5 Hz), 3,75-3,90 (m, 3 H), 5,605 (dd, 1 H,

H-l, <J>12<=> 3,4 Hz, J1>p = 7,8 Hz).

FAB-MS: Nr. MSN 13608

positiv: m/e = 383, 385, 387 (M+H)<*>

221, 223, 225 (IPM+H)\

B- D- qlukopyranosyl- N, N' - di- ( 2- kloretyl) - f osf orsyrediamid 28B Hydrering av 223 etter arbeidsbeskrivelse C

Analyse C10<H>21C12N207P (383,10):

g- D- qalaktopyranosyl- N, N' - di-( 2- kloretyl)- f osf orsyrediamid 29g Hydrering av 23a etter arbeidsbeskrivelse C <1>H-NMR: 500 MHz, D20, nr. 13945 6 = 3,26-3,32 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3, 635-3, 665 (m, 4 H, 2 -CH2-), 3,74-4,05 (m, 5 H), 4,098 (m, 1 H),

5,642 (dd, 1 H, H-l, J12 = 3,1 Hz, 31P = 7,8 Hz). FAB-MS: Nr. MSN 13612

positiv: m/e = 383 (M+H)<+>

221, 223, 225 (IPM+H)<+>.

negativ: m/e = 381, 383, 385 (M-H)"

219, 221, 223 (IPM-H)".

3- D- qalaktopyranosyl- N, N'- di-( 2- kloretyl)- fosforsyrediamid 29B Hydrering av 23B etter arbeidsbeskrivelse C

<1>H-NMR: 500 MHz, D20, nr. 13946 6 = 3,26-3,32 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,605 (d, 1 H),

3,63-3,67 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3, 692 (dd, 1 H, J = 3,5 og J = 10,0 Hz), 3,70-3,95 (m, 4 H), 4,950 (t, 1 H,

H_1»<J>i.2<=> ji.p = 8,° Hz)-

FAB-MS: Nr. MSN 13613

negativ: m/e = 381, 383, 385 (M-H)"

219, 221, 223 (IPM-H)".

g- D- mannopyranosyl- N, N'- di-( 2- kloretyl)- fosforsyrediamid 30a Hydrering av 24a etter arbeidsbeskrivelse C

<1>H-NMR: 500 MHz, D20, nr. 13947 6 = 3,26-3,32 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,5-4,0 (m, 9 H med 4 H ved 3,63-3,67, 2x -CH2-), 4,018 (dd, 1 H), 5,564

(dd, 1 H, H-l, J12 = 2,0 Hz, Jlp = 8,0 Hz).

FAB-MS: Nr. MSN 13614

negativ: m/e = 381, 383, 385 (M-H)"

219, 221, 223 (IPM-H)".

g- D- mannopyranosyl- N, N'- di-( 2- kloretyl)- fosforsyrediamid 30a Hydrering av 24B etter arbeidsbeskrivelse C

^-NMR: 500 MHz, D20, nr. 13948 6 = 3,26-3,33 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,45 (m, 1, H-5),

3,604 (t, 1 H, H-4, J3 4 = J4 5 = 9,8 Hz), 3,63-3,67 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,703 (dd, 1 H, H-3, J2 3 = 3,2 Hz, J3 4 = 9,8 Hz), 3,754 (dd, 1 H, H-6a, J5 6a = 6,2 Hz, J6a6b ca. 12,5 Hz), 3,931 (dd, 1 H, H-6b, J5 6b = 2,1 Hz, J6a 6b ca. 12,5 Hz), 4,052 (dd, 1 H, H-2, J12 ca. 1,1 Hz, J23 = 3,2 Hz), 5,282 (dd, 1 H, H-l, 312 ca. 1,1 Hz, J1>p = 8,6 Hz).

FAB-MS: Nr. MSN 13615

negativ: m/e = 381, 383, 385 (M-H)"

219, 221, 223 (IPM-H)".

Di-( 2- kloretyl)- fosforsyreamid- diklorid 33

(Etter Friedman og Seligman, 1954, J. Am. Chem. Soc. 76, 655)

Startmateriale:

130 ml P0C13 (1,4 mol)

50 g bis-(2-kloretyl)-amin-hydroklorid.

Utbytte: 53 g 33 som hvite krystaller.

Sm.punkt: 54°C (fra aceton/PE).

Analyse C4H8C14N0P (258,9):

Eksempel 2

Disakkarid- IPM- konjuqat

Okta- 0- acetyl- laktose 35

En blanding av 100 g laktose (147 mmol), 400 ml acet-anhydrid og 25 g vannfritt natriumacetat ble omrørt i 60 min. ved 120-135°C. Etter avkjøling ble blandingen helt over i is-vann og ekstrahert med CH2C12. Den organiske fase ble vasket med mettet NaHC03-løsning og vann, tørket over Na2S04 og rotasjonsinndampet. Krystallisering fra etanol gav 153 g 35. (80 % teor.).

Sm.punkt: 79-92°C.

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, toluen:2-butanon = 10:4, Rf = 0,43.

Analyse C28H30<0>19 ( 678, 6 ):

Allyl- 4- 0-( 2, 3, 4, 6- tetra- 0- acetyl- 3- D- qalaktopyranosyl)- 2, 3. 6-tri- O- acetyl- D- qlukopyranosid 37

(Etter Koto et al., 1982, J. Chem. Soc. Jpn. 10, 1651)

34 g 35 (50 mmol) ble løst i 60 ml CHC13. 20,6 ml acetylbromid (276 mmol) og 4,56 ml H20 ble tilsatt ved 0°C. Etter 2,5 timers omrøring ved romtemperatur ble den gule, klare løsning rotasjonsinndampet ved 30°C, og det ble erholdt et gult skum (hepta-O-acetyl-a-D-laktosylbromid) med ^i-NMR: 90 MHz, CDC13 6 = 1,95-2,20 (m, 21 H, 7x -OAc), 3,7-5,65 (m, 13 H,

sukkerprotoner), 6,51 (d, 1 H, H-l, 312 = 4 Hz).

Skummet ble løst i 400 ml allylalkohol ved 35°C. Etter tilsetning av 30 g sølvkarbonat ble blandingen omrørt i én dag ved romtemperatur (utelukkelse av lys), deretter ble blandingen filtrert og rotasjonsinndampet. Bunnfallet ble ekstrahert med eter, og etter ny filtrering og rotasjonsinndamping ble produktet kromatografert på kiselgel 60 (toluen:2-butanon = 10:1 - > 10:3). Det ble erholdt 18,2 g 37 (53,8 % teor.) i form av klar olje.

Allyl- 4- 0-( 2, 3, 4, 6- tetra- O- acetyl- p- D- glukopyranosyl)- 2, 3, 6-tri- O- acetyl- D- glukopyranosid 38

(Analog 37)

Startmateriale:

29 g a-D-cellobiose-oktaacetat (42,6 mmol) (Ega-kjemi)

17,6 ml acetylbromid

3,9 ml H20.

Mellomprodukt:

Hepta-O-acetyl-a-D-cellobiosylbromid.

<X>H-NMR: 90 MHz, CDC13

6 = 6,51 (d, 1 H, H-l, 3l2 = 4 Hz).

Utbytte: Etter søylekromatografi (kiselgel, EE:PE) og krystallisering fra diisopropyleter ble det erholdt 16,5 g

38 (57 % teor.).

Sm.punkt: 179°C.

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, toluen:2-butanon = 10:4, Rf = 0,49. Analyse C29H40O18 ( 679, 62 ):

Allyl- 4- 0-( 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- B- D- qalaktopvranosyl)- 2, 3, 6-tri- O- benzyl- D- qlukopyranosid 39

(Etter Koto et al., 1982, J.. Chem. Soc. Jpn. 10, 1651)

Startmateriale:

19,5 g 37 (28,8 mmol)

800 ml benzylklorid

105 g KOH, pulverisert.

Utbytte: Etter søylekromatografi (kiselgel, toluen:2-butanon =

100:1 -> 10:1 og krystallisering fra EE/heksan ble det

erholdt 21,3 g 39 (73 % teor.) i form av nåler. Tynnsj iktskromatografi: Kiselgel, toluen:2-butanon = 10:1, Rf = 0,50. Sm.punkt: 73°C.

Analyse C64<H>68<O>n (1013,24):

Allyl- 4- 0-( 2, 3, 4, 6- tetra- 0- benzyl- B- D- qlukopyranosyl)- 2, 3, 6-tri- O- benzyl- D- qlukopyranosid 40

(Analog 39)

Startmateriale:

2,65 g 38 (3,92 mmol)

100 ml benzylklorid

14,3 g KOH, pulverisert.

Utbytte: Etter søylekromatografi og krystallisering fra diisopropyleter/heksan ble det erholdt 2,82 g 40

(71 % teor.).

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, toluen:2-butanon = 10:1, Rf = 0,50. Sm.punkt: 102°C.

Analyse C64H680u (<1>013,24):

4- 0-( 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- B- D- qalaktopyranosyl)- 2, 3. 4- tri- 0-benzyl- D- qlukopyranose 43

A) Isomerisering med t-BuOK til 1-propenyleter 4_1

En blanding av 4,9 g 39 (4,84 mmol) og 1,3 g t-BuOK i 30 ml DMSO ble omrørt under nitrogen i 2 timer ved 110°C. DMSO ble rotasjonsavdampet, bunnfallet ble løst i en blanding av eter/vann. Eterfasen ble fjernet, den vandige fase ble deretter ekstrahert to ganger med eter. De forente eterfaser ble tørket over Na2S04 og rotasjonsinndampet. Det ble erholdt 4,02 g 41 (4,13 mmol) i form av brun olje (råutbytte 85 %). Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, toluen:2-butanon = 10:1, Rf = 0,62.

B) Hydrolyse av 1-propenyleteren 41 med HgCl2 til 43

(etter Gigg og Warren, 1968, J. Chem. Soc. (C), 1903)

Til en blanding av 4,02 g 41 (4,13 mmol) og 1130 mg HgO i 10 ml aceton/vann (10:1) ble det i løpet av 5 min tildryppet 1150 mg HgCl2 i 10 ml aceton/vann (10:1). Etter 1 times omrøring ved romtemperatur ble blandingen filtrert gjennom "Celite", rotasjonsinndampet og tilsatt eter. Eterfasen ble vasket med 10 ml av en halvmettet KJ-løsning og med vann. Etter tørking over Na2S04 og rotasjonsinndamping ble produktet kromatografert på kiselgel (toluen:2-butanon = 100:1 -» 10:5). Det ble erholdt 43 i form av gul olje, som krystalliserte fra eter/PE: 2,6 g (55 % teor. i forhold til 39, anomerblanding, a:B tilnærmet 2:1 etter 13C-NMR).

Sm.punkt: 103°C.

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, toluen:2-butanon = 10:1, Rf = 0,22. Analyse C61<H>64<O>n (973,17): 4- 0-( 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- B- D- qlukopvranosyl)- 2, 3,4-tri-0-benzyl- D- qlukopyranose 44 1) analog 43: Isomerisering med t-BuOK til 1-propenyleter 42 etterfulgt av hydrolyse med HgCl2.

Utbytte: 47,7 % teor. (etter søylekromatograf!).

2) Isomerisering med tris(trifenylfosfin)rhodiumklorid (RhCl-(PPh3)3) etterfulgt av hydrolyse med 1 N HC1

(etter Corey og Suggs, 1973, J. Org. Chem. 38, 3224)

125 mg 40 (0,123 mmol) ble kokt i 3 timer i 30 ml Et-OH/vann (10:1) med 3 mg diazabicyklo[2.2.2]oktan (0,027 mmol) og 12 mg RhCl(PPh3)3 (0,009 mmol). Deretter ble 6 ml 1 N HCl tilsatt, og blandingen ble kokt i ytterligere 2 timer. Etter avkjøling ble blandingen tilsatt NaHC03-løsning og ekstrahert med eter. Den organiske fase ble vasket med vann, tørket over Na2S04 og rotasjonsinndampet. Etter søylekromatografering (kiselgel, toluen:2-butanon = 100:1 -> 100:5) ble det erholdt 109 mg 44 (91 % teor. i forhold til 40, anomerblanding, a:B tilnærmet 3:1 etter 13C-NMR) i form av fargeløs olje. Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, toluen:2-butanon = 10:1, Rf = 0,22.

4I-NMR: 90 MHz, CDC13

6 = 3,05 og 3,25 (2 d, 1 H, -OH (a og 0), utbyttbar

med D20), 3,3-5,2 (m, 28 H), 7,1-7,5 (m, 35 H, 7x

-Ph).

<13>C-NMR: Nr. C14897, CDC13

6 = 91,38 (s, C-la), 97,42 (s, C-10), 102,68 (s, C-1' )•

FAB-MS: Nr. 13689 (pos., glyserol, DMF/HC1)

m/e = 973 (M+H) + .

4- 0-( 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- B- D- qalaktopyranosyl)- 2, 3, 6- tri- O-benzyl- l- O- p- nitrobenzoyl- D- qlukopyranose 45

Til 480 mg 43 (0,49 mmol) i 20 ml CH2C12 ble 2 ml av en løsning av 130 mg p-nitrobenzoylklorid og 0,3 ml pyridin i CH2C12 tildryppet ved romtemperatur. Etter 20 timer*: omrøring ved romtemperatur ble det etter tynnsjiktskromatografering på kiselgel (toluen:2-butanon = 10:1) påvist en meget liten mengde 43 (Rf = 0,22) og to produkter med Rf = 0,42 og 0,49. Etter vasking med 0,5 N HCl, 1 N NaHC03 og vann og tørking over Na2S04 ble det erholdt en høyviskøs olje. Fra etanol krystalliserte 435 mg 45 (79 % teor., anomerblanding, a:p = 3:7 etter 1H-NMR) .

Sm.punkt: 112°C.

Analyse C68H67014N (1122,28):

4- 0- ( 2. 3, 4., 6- tetra- O- benzyl- B- D- qlukopyranosyl) - 2, 3, 6- tri- O-benzyl- l- O- p- nitrobenzoyl- D- qlukopvranose 46

(Analog 45)

Startmateriale:

520 mg 44 (0,534 mmol)

150 mg p-nitrobenzoylklorid

0,4 ml pyridin.

Utbytte: Etter 20 timer viste tynnsjiktskromatografering (kiselgel, toluen:2-butanon = 10:1) to produkter med Rf = 0,43 og 0,49 blant en meget liten mengde edukt med Rf = 0,22. Etter søylekromatografering (kiselgel, toluen:2-butanon = 20:1) ble det erholdt 320 mg 46 i form av olje (53,4 % teor.). Fra diisopropyleter

krystalliserte 46a.

Sm.punkt: 169°C.

Analyse C68<H>67014N (1122,28):

0- f4- 0-( 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzvl- B- D- qlukopyranosyl)- 2, 4, 6- tri-O- benzvl- a- D- qlukopvranosvn - trikloracetimidat 47

(Analog 25a)

Startmateriale:

130 mg 44 (0,133 mmol)

60 ul trikloracetonitril

5,3 mg NaH.

Utbytte: Etter søylekromatografi (kiselgel, E:PE = 2:3) ble det erholdt 120 mg 47 (80 % teor.) som klar, fargeløs

olje.

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, E:PE = 3,2, Rf = 0,49.

<1>H-NMR: 90 MHz, CDC13

6 = 3,3-5,2 (m, 27 H), 6,44 (d, 1 H, H-l, J12 = 4 Hz), 7,1-7,4 (m, 35 H, 7x -Ph), 8,57 (s, 1 H, -NH-,

utbyttbar med D20).

CeaHwClaNOn (1117,56).

4- 0-( 2 , 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- B- D- qalaktopyranosyl )- 2 , 3 . 6- tri- O-benzvl- D- qlukopyranosvl- N, N' - di- ( 2- kloretyl) - f osf orsyrediamid 48

Etter arbeidsbeskrivelse A

Startmateriale:

100 mg 45 (0,089 mmol)

21 mg 4b (0,095 mmol).

Utbytte: Etter søylekromatograf i (kiselgel, EE: PE = 40:60

70:30) ble det erholdt to fraksjoner:

Fl: 7 mg 48, 3>>a (6,7 % teor.)

F2: 40 mg 48, a>>B (38,2 % teor.).

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, EE/PE = 80:20, Rf (a) = 0,37, Rf (B) =

0,42.

C65H73C12<N>2012P (1176,18).

^-NMR: Nr. H15189, 90 MHz, CDC13, a>>B

Nr. H15326, 90 MHz, CDC13, B>>a.

HPLC, analyse:

Kiselgel, EE:heksan:MeOH = 72:28:0,7, strømnings-hastighet 1,0 ml/min, Rt (a) = 10,32', Rt (B) =

8,73'.

HPLC, prep.:

Kiselgel, EE:heksan:MeOH = 64:36:0,5, strømnings-hastighet 10,0 ml/min, Rt (a) = 35', Rt (B) = 27'.

4- 0- ( 2, 3, 4, 6- tetra- O- benzyl- B- D- qlukopvranosyl)- 2, 3, 6- tri- 0-benzvl- D- qlukopyranosyl- N, N' - di-( 2- kloretyl)- f osf orsyrediamid 49

Etter arbeidsbeskrivelse B

Startmateriale:

40 mg 47 (0,036 mmol)

9 mg 4b (0,041 mmol).

Utbytte: Etter søylekromatografi (kiselgel, EE:PE = 60:40) og prep. HPLC ble det erholdt to fraksjoner (klar, fargeløs olje):

Fl: 18 mg 49£ (42,5 % teor.)

F2: 7 mg 49a (10,9 % teor.).

Tynnsj iktskromatografi:

Kiselgel, EE/PE = 80:20, Rf (a) = 0,35, Rf (p) =

0,42.

C65H73C12N2012P (1176,18).

HPLC, analyse:

Kiselgel, EE:heksan:MeOH = 72:28:1, strømningshastig-het 1,0 ml/min, Rt (a) = 7,03', Rt (B) = 5,89'. HPLC, prep.: Kiselgel, EE:heksan:MeOH = 64:36:0,5, strømnings-hastighet 10,0 ml/min, Rt (a) = 35', Rt (p) = 25'.

4- 0-( B- D- qalaktopyranosyl )- a- D- qlukopyranosyl- N, N' - di-( 2- kloretyl )- fosforsyrediamid 50a

Hydrering av 48a etter arbeidsbeskrivelse C

C16<H>31C12N2012P (541,31).

^-NMR: 500 MHz, D20, nr. H15701

6 = 3,27-3,34 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,563 (dd, 1 H, H-2', Jr 2. = 8,0 Hz, J2, 3. = 9,8 Hz), 3,65-4,0 (m, 15 H med 4 H ved 3,65-3,68, 2x -CH2-), 4,478 (d, 1 H, H-1', Jr 2. = 8,0 Hz), 5,623 (dd, 1 H, H-l, J12<=> 3,6

Hz, J1 _p = 7,8 Hz) .

FAB-MS: Nr. MSN 14075

positiv: m/e = 221, 223, 225 (IPM+H)<+>

545, 547, 549 (M+H)\

4- 0-( B- D- qalaktopyranosyl)- p- D- qlukopvranosyl- N, N'- di-( 2- kloretyl )- fosforsyrediamid 50p

Hydrering av 48p etter arbeidsbeskrivelse C

C16<H>31C12N2012P (541,31).

<X>H-NMR: 500 MHz, D20, <1>H-<1>H-2D-C0SY, nr. 15834

6 = 3,27-3,34 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,43 (dd, 1 H, H-2,

Jx. 2. = 8,0 Hz), 3,558 (dd, 1 H, H-2', Jr 2. = 8,0 Hz, J2. 3. = 10,0 Hz), 3,65-3,68 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,68-3,90 (m, 8 H), 3,938 (dd, 1 H, J = 3,4 og J ca. 1,0 Hz), 3,989 (dd, 1 H, J = 1,9 og J = 12,6 Hz), 4,473 (d, 1 H, H-l', Jr>2. = 8,0 Hz), 5,049 (t, 1 H, H-l, <J>i.2 <=><j>i.p = 8/° Hz)-

FAB-MS: Nr. MSN 14076

positiv: m/e = 221, 223, 225 (IPM+H)<*>

545, 547, 549 (M+H) + .

4- 0-( B- D- qlukopyranosyl)- a- D- glukopyranosyl- N, N'-di-(2-kloretyl )- fosforsyrediamid 51a

Hydrering av 49a etter arbeidsbeskrivelse C

C16<H>31C<1>2N2012P (541,31).

<X>H-NMR: 500 MHz, D20, ^^H-20-COSY, nr. 15856

6 = 3,27-3,32 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,333 (dd, 1 H, H-2', Jr 2. = 7,9 Hz, J2. 3. = 9,4 Hz), 3,40-3,45 (m, 2 H), 3,64-3,68 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,69 (dd, 1 H, H-2) 3,70-3,99 (m, 6 H), 4,537 (d, 1 H, H-l', Jx. 2. = 7,9 Hz), 5,622 (dd, 1 H, H-l, J12 = 3,6 Hz, Jlp = 7,8

Hz) .

FAB-MS: Nr. MSN 14077

positiv: m/e = 221, 223, 225 (IPM+H) +

545, 547 (M+H)\

4- 0-( B- D- qlukopyranosyl)- B- D- qlukopyranosyl- N, N'- di-( 2- kloretyl )- fosforsyrediamid 51B

Hydrering av 49B etter arbeidsbeskrivelse C

<C>16<H>31C12<N>2012P (541,31).

<1>H-NMR: 500 MHz, D20, ^^H-20-COSY, nr. 15857

6 = 3,27-3,32 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,33 (dd, 1 H, H-2', Jr 2. = 8,0 Hz, J2. 3. ca. 10 Hz), 3,428 (dd, 1 H, H-2, J1>2 = 8,0 Hz, J2 3 = 10,0 Hz), 3,44-3,54 (m, 3 H), 3,64-3,68 (m, 4 H, 2x -CH2-), 3,69-3,72 (m, 3 H), 3,745 (dd, 1 H, H-6'a, J5. 6.a <=> 5,8 Hz, J6.a.6.b= 12,3 Hz), 3,855 (m, 1 H, H-6b), 3,928 (dd, 1 R, H-6'b, J5. 6.b = 2,1 Hz, J6.a6.b ca. 12,3 Hz), 3,990 (dd, 1 H, H-6a, <J>56a = 2,0 Hz, J6a6b = 12,2 Hz), 4,532 (d, 1 H, H-l', Jr 2. = 8,0 Hz), 5,044 (t, 1 H, H-l, J, 2 = J1>p =

8,0 Hz).

FAB-MS: Nr. MSN 14078

positiv: m/e = 221, 223, 225 (IPM+H)<+>

545, 547, 549 (M+H)<*>.

Eksempel 3

Maltotriose peracetyleres (natriumacetat/acetan-hydrid), (Rf = 0,48, CHCl3/eddikester 1:1, kiselgel), produktet omsettes med HBr/iseddik ved 0°C til 1-bromidet (Rf = 0,58, samme betingelser som ovenfor); produktet omsettes med allylalkohol/Ag2C03 til 1-alkyl-maltotriosidet (Rf = 0,60, samme betingelser som ovenfor). Produktet omsettes med benzoylklorid/ KOH ved 120°C til alkyl-2,3,6,2' , 3' , 6 • , 2 ' ', 3 ' ' , 4 ' ' , 6 ' <*->deka-0-benzyl-maltotriosid (Rf = 0,51, toluen/eddikester 10:1, kiselgel). Etter isomerisering av dette produkt til enoleter, for-såpning til 1-OH-forbindelse med 1 N HCl (Rf = 0,17, toluen/ eddikester 10:1, kiselgel). Fra dette produkt dannes trikloracetimidat ved omsetning med NaH og trikloracetonitril (Rfa = 0,48, samme betingelser som ovenfor). Produktet omsettes i acetonitril med ifosfamidsennep under tilbakeløpskjøling til glykokonjugatet (Rf = 0,24, eddikester/heksan 6:4, kiselgel). Benzylgruppene avspaltes ved hydrering med 10 %-ig Pd/aktivt kull i CH30H ved romtemperatur (Rf = 0,22, CHCl3/metanol 1:1, kiselgel).

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive glykokonjugater av fosforamidsennep eller ifosfamidsennep , omfattende:

   a-D-glukopyranosyl-N, N' -di- ( 2-kloretyl) -f osf orsyrediamid, p-D-glukopyranosyl-N, N' -di- ( 2-kloretyl) -f osf orsyrediamid, a-D-glukopyranosyl-N,N'-di- (2-kloretyl)-fosforsyrediamid, a-D-mannopyranosyl-N, N' -di- (2-kloretyl) -f osf orsyrediamid, p-D-mannopyranosyl-N, N' -di- (2-kloretyl) -f osf orsyrediamid, 4-0-(p-D-galaktopyranosyl)-a-D-glukopyranosyl-N, N' - di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid, 4-0-(B-D-galaktopyranosyl)-N,N'-di-(2-kloretyl) -f os-forsyrediamid, 4-0-(p-D-galaktopyranosyl)-p-D-glukopyranosyl-N, N' - di-(2-kloretyl)-fosforsyrediamid, 4-0-(p-D-glukopyranosyl)-a-D-glukopyranosyl-N, N' -di- ( 2-kloretyl)-fosforsyrediamid, 4-0-(B-D-glukopyranosyl) -p-D-glukopyranosyl-N,N'-di- ( 2-kloretyl)-fosforsyrediamid, karakterisert ved at de beskyttede bromsukkerforbindelser, spesielt benzylbeskyttede bromsukkerforbindelser konjugeres med de tilsvarende fosforforbindelser, og de erholdte forbindelser befris fra beskyttelsesgruppene.