NO177308B

NO177308B - Analogifremgangsmåte ved fremstilling av anti-tumorforbindelser

Info

Publication number: NO177308B
Application number: NO932192A
Authority: NO
Inventors: George A Ellestad; William James Mcgahren; Martin Leon Sassiver; Philip R Hamann; Lois M Hinman; Janis Upeslacis
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1989-04-14
Filing date: 1993-06-14
Publication date: 1995-05-15
Also published as: DK0392384T3; FI100105B; SK284270B6; EP0392384A2; CN1110280A; DE69032051D1; CZ188490A3; NO901655D0; IL115770A; GR3026177T3; ATE163293T1; CN1109041C; FI901866A0; SK188490A3; NZ233148A; JPH02292294A; PT93716A; IL93733A0; NO176717B; NO932192L

Description

Oppfinnelsen angår en analogifremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt substituert disulfid med formelen Q-Sp-SS-W fra en forbindelse med formelen CH3-SSS-W som er et N-acylderivat av et antitumor-antibiotikum betegnet som LL-E33288a1-I, a2~ Br, a2- X, Øi- Br, Øx-I, Ti-Br, "Yi-I, S^ I, hvor

W er

Rx er R2 er R3 er H; RA er

R5 er CH3, C2H5 eller (CH3)2CH; X er et jod- eller bromatom; R'5 er alkanoyl,

Sp er en rettkjedet eller forgrenet ( C^ C^)-alknylengruppe;

Q er hydrogen eller

hvor n er 0 eller 1, eller

Disse disulfidforbindelsene er effektive midler mot svulster eller tumordannelser. Figur 1 Det ultrafiolette spektret av antitumorantibiotikumet betegnet som N-acetyl LL-E33288'y1<i.>

Figur 2 Det infrarøde spektret av antitumoranti-

biotikumet betegnet som N-acetyl LL-E33288'Y1<I.>

Figur 3 Det protonmagnetiske resonansspektret av antitumor antibiotikumet betegnet som N-acetyl LL-E33288'Y1<I. >Figur 4 Det karbon-13 kjernemagnetiske resonansspektret av antitumorantibiotikumet betegnet som N-acetyl LL-E33288T1<1>.

Gruppen av antibakterielle og antitumormidler kollektivt betegnet LL-E33288-komplekset, er beskrevet og patentsøkt i EPO-publikasjonsnummer 0182152A3 publisert 28. mai 1986, og er brukt for å fremstille de disvovelantitumormidler som er enkelte av utgangsforbindelsene for de målrettede formene av antitumormidler ifølge foreliggende oppfinnelsen.

Nevnte EPO-publikasjon nr. 0182152A3 beskriver LL-E33288-komplekset, og dets komponenter, nemlig, LL-E33288a1 , LL-E33288a1, LL-E33288a2 , LL-E33288a2, LL-E33288)81 ,

LL-E33288/3!<1>, LL-E33288-Yi , LL-E33288-Y1<1> og LL-E332885!<1>, samt fremgangsmåter for fremstilling ved hjelp av en aerob fermen-tering hvor man bruker en ny rase av Micromonospora echinospora ssp calichensis eller naturlig eller kunstig fremstilte mutanter av denne rasen. EPO-publikasjonsnr. 0182152A3 beskriver også visse foreslåtte strukturer for enkelte av de ovennevnte komponenter. Disse foreslåtte strukturer er angitt i tabell 1.

Ytterligere forbindelser i LL-E33288-komplekset er beskrevet og patentsøkt i EPO-publikasjon nr. 027485A2 publisert 3. august 1988, og kan på lignende måte brukes for fremstilling av disulfidderivatene og målrettede former av antitumormidler fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse.

De sistnevnte strukturer er angitt i tabell 2.

En annen gruppe av LL-E33288-komplekset av antitumorantibiotika er beskrevet i US-patent 5.079.233, og som også kan brukes for fremstilling av ytterligere målrettede former av antitumormidler. Denne søknaden beskriver N-acylderivater av flere forbindelser av LL-E3 3 288-komplekset som er blitt fremstilt på kjemisk måte. De foreslåtte strukturer er på lignende måte gjengitt i tabell 2.

R = hydrogen eller en grenet eller ugrenet alkyl(Ci-C^)- eller alkylentCi-Cxg) -gruppe, en aryl- eller heteroarylgruppe eller en alkyl (Ci-Cg) - eller heteroaryl-alkyl (Ci-Ca)gruppe, alle eventuelt substituert med én eller flere hydroksy-, amino-, karboksy-, halogen-, lavere (Cj-Ca)alkoksy- eller lavere (Ci-Cg) tioalkoksygruppe.

All informasjon hva angår BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E og CL-1724 som forefinnes i de ovennevnte referanser inngår her som referanse. De fullstendige strukturene for espera-miciner Alf A2 og Alb (BBM-1675-komplekset) og deres N-acetyl-derivater er angitt og inngår i tabellene 1 og 2. De fysiske egenskapene for andre av de ovennevnte antitumor-antibiotika indikerer at de alle er identiske eller meget like i struktur til esperamicinene, og at alle inneholder en metyltritio-funksjonell gruppe.

Som det fremgår av de strukturer som er angitt ovenfor, inneholder N-acylderivatene alf a2, filt ylr 6, LL-E33288-komplekset, samt deres N-acylmotstykker en metyltritiogruppe i sin struktur.

Man har nå oppdaget at reaksjonen med ethvert av de ovennevnte angitte antibiotika med et usubstituert eller substituert alkyl- eller arylmerkaptan resulterer i en eliminering av metylpertiolatanionet fra trisulfidgruppen, noe som resulterer i dannelsen av et stabilt disulfid (skjema I) nedenfor. Andre forbindelser hvor nevnte transformasjon virker er beskrevet i EPO publikasjon nr. 0313874A2 publisert

3. mai 1989. Forbindelsene i tabellene 1 og 2 kan ifølge oppfinnelsen omdannes med tiolholdige organiske molekyler til de innled-ningsvis nevnte forbindelser, ved at man omsetter et metyl-trisulfidantitumorantibiotikum valgt fra gruppen som er nevnt ovenfor, med et tilsvarende substituert merkaptan i acetonitril eller en kombinasjon av acetonitril og tetrahydrofuran eller acetonitril og dimetylformamid ved en temperatur mellom -20"C og +40°C i et tidsrom fra 1 time til 6 døgn, fortrinns-vis i nærvær av én ekvivalent av en tertiær aminbase eller en blanding av én ekvivalent av en tertiær aminbase og én ekvivalent av en organisk karboksylsyre.

Omdannelsen av de forbindelser som er angitt i tabellene 1 og 2 til en rekke disulfider kan oppnås ved hjelp av en rekke forskjellige tiolholdige organiske molekyler, hvorved man får fremstilt de nye antitumor og antibakterielle midler. Videre er produktene fra selve reaksjonene også lett å trans-formere ytterligere med nyinnførte sidekjeder, slik at man får fremstilt enda flere nye forbindelser med biologiske akti-viteter.

Så lenge som produktet fra skjema 1 inneholder minst én funksjonell gruppe som kan omdannes til eller som er direkte reaktiv med en målsøkende enhet (Tu), så kan man fremstille målsøkende former av antitumorantibiotika fra de ovennevnte patenter og søknader, som beskrevet i norsk patentsøknad 90.1655.

Forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som er betegnet som Q-Sp-SS-W, er aktive også som antibakterielle midler. Deres in vitro antibakterielle aktivitet kan bestemmes mot gram-positive og gram-negative bakterier ved standard agar fortynningsmetoden. Mueller-Hinton agar inneholdende to-dobbelt avtagende konsentrasjoner av anti-biotikumet som skal prøves helles over i petriskåler. Agaroverflåtene blir så inokulert med fra 1 til 5 x 10<4 >kolonidannende enheter av bakteriene ved hjelp av en Steers repliserende anordning. Den laveste konsentrasjonen av forbindelsen som hemmer veksten av en bakterierase etter ca. 18 timers inkubering ved ca. 36°C, blir angitt som den minimalt hemmende konsentrasjonen (MIC) for den prøvede rasen eller bakterien.

De disulfidforbindelser som er beskrevet ovenfor er også aktive antitumormidler.

Visse in vivo prøvingssystemer og protokoller er utviklet av the National Cancer Institute for prøving av forbindelser for å bestemme deres egnethet som antineoplastiske midler. Disse er blitt rapportert i "Cancer Chemotherapy Reports", Part III, Vol. 3, No. 2 (1972), Geran, et. al. Disse protokoller er etter hvert blitt etablert som standardiserte prøver som vanligvis følges for prøving av antitumormidler.

Av disse systemer så er spesielt lymfocytisk leukemi P388, melanotisk melanoma B16, L1210 leukemi og kolon 26 adenokarsinoma spesielt betydelige i foreliggende oppfinnelse. Disse neoplasmer brukes for prøving over for transplanterbare svulster i mus. Vanligvis så vil en betydelig ant i tumor aktivitet vist i disse prøver og protokoller som en prosentvis økning i midlere overlevelsestid for behandlede dyr (T) i forhold til kontrolldyrene (C) være en indikasjon på lignende resultater i human leukemi og faste svulster.

Lvmfocytisk leukemi P388 prøve

De dyr som ble brukt var BDFX hunnmus. Det var 5 eller 6 mus i hver prøvegruppe. Svulsttransplanteringen ble utført ved intraperitoneal injeksjon av 0,5 ml fortynnet ascitisk væske inneholdende 1 x 10<6> celler av lymfocytisk leukemi P388 på dag 0. Prøveforbindelsene ble tilført intraperitonealt i et volum på 0,5 ml i steril, pyrogenfri saltoppløsning på dag 1, 5 og 9 (i forhold til tumorinokulasjonen) i de angitte doser. Musene ble veid og overlevende individer ble notert på regelmessig basis i 30 dager. Den midlere overlevelsestiden og forholdet mellom overlevelsestid for behandlede (T)/kontroll (C) dyrene ble beregnet. Verdier på T/C større enn lik 125 anses å reflektere en betydelig antitumor-aktivitet. Resultatene er angitt i tabell 3.

Melanotisk melanoma B16 prøve

De dyr som brukes kan være BDF1 hunnmus. Det er 5 eller 6 mus pr. prøvegruppe. En én grams prosjon av en melanotisk melanoma B16 svulst ble homogenisert i 10 ml kald balansert saltoppløsning og en 0,5 ml porsjon av homogenatet ble implantert intraperitonealt i hver prøvemus. Prøveforbind-elsene ble tilført intraperitonealt på dag 1 til og med 9 (i forhold til svulstinokuleringen) ved de angitte doser. Musene ble veid og antall overlevende ble notert på regelmessig basis i 60 døgn. Man beregnet så den midlere overlevelsestiden og forholdet overlevelsestid for behandlede (T)/kontroll (C) dyrene. En verdi på T/C på større eller lik 125 anses å være indikasjon på en betydelig antisvulst-aktivitet.

Fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse ble brukt for å fremstillie monoklonale antistoffkonjugater fra forbin-

delsene i tabellene 1 og 2 og betegnet som

og disse gir god immunoreaktivitet med målcellelinjer som vist ved de følgende in vitro prøver:

Målceller

Alle målceller ble holdt i RPMI 1640 media supplert med 5% kalvefosterserum (FCS), ITS (Collaborative Research, Cat# 40351) , streptomycin (50 /xg/ml) , penicillin (50 enheter/ml) , gentamycinsulfat (50 /xg/ml) og glutamin (0,03%). Cellene ble holdt i en fuktig 5% C02 inkubator ved 37°C.

I. Immunoreaktivitetsprover

Fremgangsmåte I - Elisa

Passende målceller ble høstet, telt og suspendert i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS) ved en optimal konsentrasjon for de monoklonale antistoffer (MoAb) som skulle prøves. 0,1 ml av cellene ble utporsjonert i hver brønn i en steril vevskulturpolystren 96-brønnsplate. Platene ble sentrifugert i 5 min. ved 1.000 omdreininger pr. min., hvoretter supernatanten ble tatt vekk. Platene ble lufttørket over natten og kan lagres ved 4°C i opp til 3 måneder.

Ikke-spesifikke bindingsposisjoner ble blokkert ved å tilsette 200 /xl 1% gelatin i DPBS pr. brønn og inkubere platen 1 time ved 37°C i en fuktig inkubator. (Alle etterfølgende inkuberinger ble utført under tilsvarende betingelser). Platene ble vasket én gang med 250 /il 0,05% TWEEN-20 i DPBS (vaskeoppløsning) idet man brukte et automatisert ELISA-vaskesystem fra Dynatech (Ultrawash II). De prøver som skulle undersøkes, ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 3 /xg/ml MoAb-ekvivalenter i 0,1% gelatin-DPBS. Seks ytterligere 3-parallelle seriefortynninger ble fremstilt fra hver 3 /xg/ml prøve og 100 /xl ble tilsatt passende brønner i 3 paralleller. Bunnraden av brønner mottok bare 100 /xl 0,1% gelatin som bakgrunn. Platene ble inkubert i 45 min. og så vasket tre ganger. Alkalifosfatasekonjugert affinitetsrenset geit-anti-musimmunoglobuliner (Cappel Cat# 8611-0231) ble fortynnet 1:125 i 0,1% gelatin og 100 /xl ble tilsatt hver brønn. Platene ble inkubert i 45 min. og så vasket tre ganger. 200 /xl p-nitrofenylfosfatsubstratoppløsning (se nedenfor) ble tilsatt hver brønn. Etter 45 min. ved romtemperatur ble reaksjonen stoppet ved å tilsette 50 /xl 3M NaOH. Absorpsjonen, av innholdet i hver brønn ble avlest ved 405 nm i et automatisert spektrofotometer fra Dynatech (EIA Autoreader # EL-310) .

Substratdietanolaminbuffer ( 10%)

97 ml dietanolamin

800 ml vann

0,2 g NaN3

100 mg MgCl2 6H20

Reagensene ble oppløst ved kontinuerlig røring og IM HC1 ble tilsatt inntil pH er 9,8. Det totale volum ble fortynnet til 1 liter med vann og filtersterilisert i et 0,2 /x filter. Bufferen ble lagret i mørket ved 4°C. Umiddelbart før bruk ble p_-nitrofenylfosfat (Sigma, Cat# 104-40) oppløst i 10% dietanolaminbufferen (må være ved romtemperatur) slik at man fikk en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml.

Beregning av 0. D. verdier

Den prosentvise binding i hver prøve ble beregnet ved følgende ligning:

A = midlere O.D. for selve prøven

B = midlere O.D. for bakgrunnen

C = midlere O.D. for 3 /xg/ml umanipulert MoAb-kontroll

Prosentvis binding ble avsatt på en ikke-logaritmisk skala på et semi-logaritmisk diagram og MoAB-konsentrasjonen ble avsatt på den logaritmiske skalaen. BD50 (d.v.s. den dosen av antistoffet som er nødvendig for å gi 50% binding) for hver prøve ble avlest fra diagrammet, hvoretter man beregnet mengden av bibehold av immunoreaktiviteten ved følgende ligning:

Fremgangsmåte 2 - Indirekte RIA

Passende mengder av målceller i 0,2 ml 10% FCS media ble utporsjonert i 4 ml polystyrenrør. De prøver som skulle undersøkes ble fortynnet til en konsentrasjon av 2 /xg/ml MoAb-ekvivalenter i 10% FCS-media. Fem tre-gangers seriefortynninger ble fremstilt fra hver 2 iig/ml prøve og 0,2 ml ble tilsatt hvert rør i to paralleller. Bakgrunnsprøvene mottok bare celler og media. Cellene ble inkubert ved 4°C i 1 time og så vasket 2 ganger (alle RIA-vaskinger ble utført med et volum på 3 ml) med 2% FCS-media. 0,05 ml sau F(ab')2 anti-mus IgG

[<125>I] (DuPont, Cat# NEX 162-0142) inneholdende ca. 500.000 CPM ble tilsatt hvert rør; hvoretter cellene ble inkubert i ytterligere 1 time ved 4°C, vasket én gang med 2% FCS og to ganger med PBS. 0,5 ml PBS ble tilsatt hvert rør, cellene ble sentrifugert, overført til rene rør og telt 1 min. i en Packard Gamma 500.

% binding ved hver verdi ble bestemt og avsatt som beskrevet ovenfor for nevnte ELISA-ligning, bortsett fra at CPM ble innsatt istedenfor O.D. enheter og C = midlere CPM for 1/ig/ml umanipulert MoAb-kontroll. Den prosentvise beholdte immunoreaktiviteten for hver prøve ble beregnet som beskrevet tidligere.

Fremgangsmåte 3 - Direkte RIA

Passende mengder av målceller i 1 ml 10% FCS-media ble utporsjonert i 4 ml polystyrenprøverør, sentrifugert og supernatanten ble kastet. De prøver som skulle undersøkes, ble fortynnet til konsentrasjoner på 200 ug/ml MoAb-ekvivalenter i 10% FCS-media. Fem ytterligere fem-parallells seriefortynninger ble fremstilt fra hver 200 iig/ml prøve, og 0,05 ml ble tilsatt hvert rør i to paralleller. 0,05 ml 125I-MoAb ble tilsatt hvert rør (optimal mengde ble individuelt bestemt for hvert MoAb og porsjon). Positive kontrollprøver inneholdt celler, media og <1>25I-MoA<b.>akgrunnsprøvene inneholdt ikke-spesifikke celler, media og <125>I-MoAb. Cellene ble inkubert 1 time ved 4°C, vasket én gang med 2% FCS-media, to ganger med PBS, overført og telt som beskrevet tidligere.

Den prosentvise <125>I-MoAb bindingshemmingen for hver prøve ble beregnet ut fra følgende formel:

A = midlere CPM for prøven

B = midlere CPM for bakgrunn

C = midlere CPM for positiv kontroll

Diagram og prosentvis beholdt immunoreaktivitet for hver prøve ble beregnet som beskrevet tidligere, bortsett fra at BD50 i virkeligheten er BID50 (Dose av MoAb som er nødvendig for å gi 50% hemming for bindingen av 125I-MoAb) .

Noter

1) Rørene ble alltid kraftig sentrifugert umiddelbart etter tilsetningen av hver reagens i nevnte RIA. 2) En intern kontrollprøve som tilsvarte 50% av den umani-pulerte MoAb-kontrollen ble innsatt i hvert sett av prøver for å bekrefte hvorvidt fremgangsmåten var kvantitativ med hensyn til å forutsi konjugatets

tilbakeholdelse av immunoreaktivitet.

Resultatene av disse prøvene er angitt nedenfor i tabell 4.

De monoklonale antistoffkonjugater fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er aktive som anticancermidler. De prøver som er beskrevet nedenfor for å bedømme in vitro cytotoksisitet, viser den dramatiske preferanse for konjugatene i målcellelinjene i motsetning til ikke-målsøkende celler, og gir et mål for anvendelsen av de målsøkende former av forbindelser sammenlignet med deres ikke-målsøkende motparter.

Cytotoks i s itetsprøver

In vitro

De prøver som skulle undersøkes ble fortynnet til en konsentrasjon på 0,2 eller 0,02 /xg/ml pr. ekvivalenter av utgangsforbindelsene (startkonsentrasjonen er avhengig av den cellelinjen som skal undersøkes og styrken på utgangsforbindelsen). Tre eller fire ytterligere fem-gangers for-tynninger ble fremstilt fra den opprinnelige prøvefortynningen og 0,2 ml ble tilsatt sterile 15 ml polystyrenrør. Minst ett lignende konjugat bestående av utgangsforbindelsen og et irrelevant MoAb ble inkludert i hver prøve for å bestemme spesifisiteten på det relevante konjugatet. IO<5> passende målceller i 0,2 ml 10% FCS media ble utporsjonert i rørene og sentrifugert. I tillegg til dette utførte man en identisk prøve ved å bruke irrelevante celler som mål for ytterligere å bekrefte spesifisiteten på det relevante konjugatet. MoAb-kontrollene mottok bare ekvivalente mengder MoAb og positive kontrollprøver mottok bare 10% FCS-media.

Cellene ble inkubert ved 37°C i 7 min. og så vasket 4 ganger med 8ml 2% FCS-media. 0,1 ml 10% FCS ble tilsatt hvert rør, cellene ble sentrifugert og det ble tatt ut 0,2 ml fra hver brønn og overført til en steril 96-brønns polystyrens-vevskulturplate.

Platene ble dyrket i 2 døgn i en fuktig 37°C inkubator med 5% C02. Halvparten av media ble fjernet og erstattet med friskt media inneholdende 2 /tCi/ml <3>H thymidin (DuPont, NEN, Cat# NET-027). Inkubering ble fortsatt i 24 timer, cellene

ble frosset, tint og høstet ved hjelp av en PHD-celleinn-høstningsmaskin (Cambridge Technology, Inc.). Hver prøve ble telt i 1 min. i en Beckman LS 5800 scintillasjonsteller på

kanal 1.

Prosentvis hemming ble avsatt på en ikke-logaritmisk skala på et semi-loggdiagram mens konsentrasjonen av utgangsforbindelsen ble avsatt på loggskalaen. IC50 (konsentrasjon av utgangsforbindelsen som er nødvendig for å gi 50% hemming) for hver prøve ble avledet fra diagrammet, og man beregnet mengden av bibehold av cytotoksisitet ved hjelp av følgende ligning:

Resultatene fra prøven med hensyn til in vitro cytotoksisitet er angitt i tabell 5.

Det følgende prøvesystem ble brukt for å måle in vivo-aktiviteten av konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse.

In vivo-prøver for antisvulstaktivitet for de medisinske-monoklonale antistoffkonjugatene ble utført ved å bruke humane tumorxenografer hos athymiske (nakne) mus.

Burkitt lymphoma (Raji) og myeloma (HS Sultan) celler ble innhøstet fra dyrkningskolber og inokulert subkutunøst (> 80 x 10<6> Raji celler eller 40 x 10<6> HS Sultan celler) i prøvemus. Faste svulster, ovarie carcinoma (CA73, Ovcar-3), bryst-carcinoma (MX-1) og koloncarcinoma (LS174T) ble oppdyrket i athymiske mus, tatt ut, skåret opp i 2 mm<3> fragmenter og implantert subkutunøst hos prøvemus (5-8 fragmenter pr. mus).

Medisinsk aktive forbindelser, monoklonale antistoffer og de medisinske-monoklonale antistoffkonjugatene ble tilført intraperitonealt én gang hvert 3. døgn totalt 3 eller 5 injek-sjoner som startet på dag 2, 3, 4, 6, 7 eller 8. dag etter svulstimplanteringen. Svulstmålinger (lengden og bredden av svulsten) ble utført ved hjelp av et Fowler ultra CAL II elektronisk caliperapparat hvert 7. døgn i fra 4 til 6 uker etter tumorimplanteringen. Svulstmassen i mg ble beregnet ut fra følgende formel:

Svulstveksthemming ble beregnet for hver prøvegruppe med hensyn til prosent av en kontroll [midlere mg av behandlet (T) delt med midlere mg på kontroll (C) x 100]. En T/C-verdi < 42% i gruppene med > 65% overlevende dyr ble ansett for å være nødvendig å kunne angi aktivitet.

Resultatene av denne prøven er angitt i tabell 6.

Oppfinnelsen vil nå bli ytterligere beskrevet i forbindelse med de følgende ikke-begrensende eksempler.

Eksempel 1

3- merkaptopropionsyredisulfid av

LL- E33288V

En oppløsning av 90 mg LL-E3 3288'Y1:: i 90 ml acetonitril ble tilsatt 10,6 mg 3-merkaptopropionsyre i 1 ml acetonitril. Oppløsningen ble sentrifugert og lagret ved -20°C i 6 døgn. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum, og resten ble kromatografert over 10 ml silisiumdioksydgel i metylenklorid. Kolonnen ble utviklet med 50 ml metylenklorid, 50 ml 4% metanol i metylenklorid og til slutt 100 ml 8% metanol i metylenklorid. Fordampning av den siste fraksjonen ga en rest som ble oppløst i etylacetat ved hjelp av litt aceton og som deretter dråpevis ble tilsatt et overskudd av heksan. Bunnfallet ble oppsamlet og tørket, noe som ga 39 mg av det forønskede produktet (FABMS, M+H 1394).

De følgende syre-disulfid-derivater av N-acyl-LL-E33288 seriene er eksempler på N-acyl-derivater fremstilt ifølge fremgangsmåten i dette eksempel: 3-merkaptopropionsyre-disulf id av N-acetyl-LL-33288'y13-merkaptosmørsyre-disulfid av N-acetyl-LL-E33288'y13-merkaptoisovalerionsyre-disulfid av N-acetyl-LL-E33288'Y1p-merkaptodihydrokanelsyre-disulfid av N-acetyl-LL-E33288'Y1<I.>

Eksempel 2

N- hydroksvsucc inimidy1- 3- merkaptopropionatdisulfid

av LL- E33288V

En oppløsning av 5 mg av 3-merkaptopropionsyredisulfid-analogen av LL-E33288'y1 fra EPO-publikasjonen i 0,5 ml tetrahydrofuran, ble tilsatt 0,45 mg N-hydroksysuccinimid i 0,1 ml tetrahydrofuran, og deretter tilsatt 1,8 mg dicyklo-heksylkarbodiimid i 0,2 ml tetrahydrofuran. Reaksjons-blandingen ble rørt ved romtemperatur i 4 timer og reaksjonen stoppet med stort overskudd av heksan. Det faste produktet ble frafiltrert og oppløst i etylacetat. Den resulterende oppløsningen ble vasket tre ganger med saltoppløsning, tørket med magnesiumsulfat og fordampet til 5 mg av det forønskede produktet som et blekt brunt pulver som ble brukt videre uten ytterligere rensning. Tilbakeholdelsestid på reversert fase C18 HPLC: 15 min. med 40% acetonitril/0,1 M vandig ammonium-acetat (utgangsmateriale: 6,0 min.)

De følgende N-hydroksysuksinimidyl-disulfid-derivater fra N-acyl-LL-E33288-seriene er eksempler på N-acylderivater fremstilt ifølge fremgangsmåten i dette eksempel: N-hydroksysuksinimidyl-3-merkaptopropionsyre-disulfid av

N-acetyl-LL-E3 32 8 8"Y ^ /

N-hydroksysuksinimidyl-3-merkaptosmørsyre-disulfid av N-acety 1-LL-E 3 3 2 8 8T i1,

N-hydroksysuksinimidyl-3-merkaptoisovalerionsyre-disulfid av N-acetyl -LL-E3 3 2 8 8"Y ^,

N-hydroksysuksinimidyl-p-merkaptodihydrokanelsyre-disulfid av N-acetyl-LL-E33288'Y1<I.>

Eksempel 3

3- merkaptopropionylhydraziddisulfid av

N- acetvl LL- E33288V

10 mg N-acetyl LL-E33288'Y1 i 10 ml acetonitril ble ved -15°C tilsatt 1,5 ekviv. 3-merkaptopropionylhydrazid i 85 /il acetonitril. Man tilsatte én ekvivalent trietylamin. Blandingen ble rørt ved 0°C i 2 timer og oppløsningsmidlet fordampet. Resten ble krornatografert på silisiumdioksydgel med en 10-15% metanol-i-kloroformgradient, noe som ga det forønskede produktet. FABMS, m/z=1450 (M+H); tilbakeholdelsestid på C18 reversert fase HPLC:2,5 min. med 50% acetonitril/0,05 M vandig ammoniumdihydrogenfosfat (N-acetyl LL-E33288'Y1:6,6 min. i det samme systemet.

Eksempel 4

3- merkatoisovaler<y>lhvdraziddisulfid

av N- acetvl LL- E33288- Y,1

20 mg N-acetyll LL-E33288,y1 i 15 ml acetonitril ble ved -15°C tilsatt 3 ekvivalenter 3-merkaptosiovalerylhydrazid i 6,2 ml acetonitril. Én ekvivalent trietylamin ble så tilsatt. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer og oppløs-ningsmidlet fordampet. Resten ble krornatografert på silisiumdioksydgel med en 10-15% metanol-i-kloroformgradient, noe som ga det forønskede produktet. Tilbakeholdelsestid på C18 reversert fase HPLC:2,5 min. med 50% acetonitril/0,05 M vandig ammoniumdihydrogenfosfat (N-acetyl LL-E33288t1: 6,6 min. i det samme systemet).

Eksempel 5

3- merkaptobutvrvlhydraziddisulfid

av N- acetyl LL- E33288- Y!1

10 mg N-acetyl LL-E33288'Yi i 7,5 ml acetonitril ble ved -15°C tilsatt 3 ekvivalenter 3-merkaptobutyrylhydrazid i 5 ml acetonitril. Én ekvivalent trietylamin ble så tilsatt. Reaksjonsblåndingen ble rørt ved romtemperatur i 10 timer og oppløsningsmidlet fordampet. Resten ble krornatografert på silisiumdioksydgel med en 10-15% metanol-i-kloroformgradient, noe som ga det forønskede produktet. Tilbakeholdelsestid på C18 reversert fase HPLC:7,3 min. med 43% aetonitril/0,05 M vandig ammoniumdihydrogenfosfat (N-acetyl LL-E33288'Y1<1>:5,6 min. i det samme systemet).

Eksempel 6

p- merkaptodihvdrocinnamvlhydraziddisulf id

av N- acetvl LL- E33288' Y1I

10 mg N-acetyl LL-E33288-Y!<1> i 7,5 ml acetonitril ble ved -15°C tilsatt 3,0 ekvivalenter p-merkaptodihydrocinnamyl-hydrazid i 2,0 ml acetonitril. Én ekvivalent trietylamin ble så tilsatt. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer og oppløsningsmidlet fordampet. Resten ble kromatografert på silisiumdioksydgel med 10-15% metanol-i-kloroformgradient, noe som ga det forønskede produktet. Tilbakeholdelsestid på C18 reversert fase HPLC:7,3 min. med 43% acetonitril/0,05 M vandig ammoniumdihydrogenfosfat (N-acetyl LL-E33288ir1:5,6 min. i det samme systemet).

Eksempel 7

Ikke- spesifikk koniugering til proteiner Hydroksysuccinimidesteren beskrevet i eksempel 3 ble kovalent knyttet til antistoffer under svakt alkaliske betingelser. Det er i det etterfølgende beskrevet en generell fremgangsmåte som ble brukt for å fremstille de antistoffkonjugater som er angitt i tabell 7. Antistoff ved en konsentrasjon på 3-5 mg/ml i fosfatbuffer inneholdende 0,1M natriumklorid, pH 7,5, ble omsatt med 5-20 gangers molart overskudd av produktet fra eksempel 3 under røring ved romtemperatur i fra 1-4 timer. Det konjugerte proteinet ble avsaltet kromatografisk og samlet protein ble skilt fra monomerisk materiale ved hjelp av gelfiltrering HPLC. Mono-meriske fraksjoner ble slått sammen og konsentrert.

Eksempel 8

Fremstilling av posisionsspesifikke koniuaater

Den fremgangsmåte som ble brukt for å knytte hydrazid-derivatene av de aktive forbindelser til oksyderte antistoffer, er beskrevet i T.J. McKearn, et al, i U.S. patent nr. 4,671,958; Fremgangsmåten er blitt anvendt for å fremstille antistoffkonjugater fra produktene fra eksemplene 4 til 15 med de spesifikke modifikasjoner som er beskrevet nedenfor. Produktene fra disse reaksjonene og deres egenskaper er angitt i tabell 7.

(A) Antistoffoksydasjon Antistoff ved en konsentrasjon på fra 5 til 10 mg/ml ble dialysert over natten mot 200 gangers

større volum av 50mM natriumacetatbuffer, pH 5,5 inneholdende 0,1M natriumklorid (buffer A). Etter dialysen ble MoAb oksydert med 15mM til 200 mM perjodsyre i 0,2M natriumacetat. Oksydasjonen ble utført i mørket under røring ved 4°C i 45 min., hvoretter det oksyderte MoAb ble avsaltet i en Sephadex G-25 kolonne med > 5 sjikt. Graden av oksydasjon ble bedømt ved en reaksjon med p_-nitrofenylhydrazin og ved å sammenligne absorpsjonen av proteinet ved 280 mm i forhold til absorpsjonen av p_-nitrofenylhydrazin veerin<g> av det aktive hydrazid Det oksyderte MoAb ble omsatt med fra 10 til 200 gangers molart overskudd av det

aktive hydrazidet. Hydrazidene ble oppløst i dimetylformamid og tilsatt den vandige oppløsningen av MoAb. For å unngå en utfelling av sistnevnte justerte man sluttvolumet på dimetyl-formamidet slik at ikke dette oversteg 10% av det totale volum. Man lot reaksjonen skje i 3 timer ved romtemperatur under røring. For å unngå tverrbinding av uomsatte aldehyder

og en etterfølgende aggregering, tilsatte man et blokkerings-middel, dvs. acetylhydrazid i 100 gangers molart overskudd 3 timer etter at man hadde tilsatt det aktive hydrazidet. For å stabilisere Schiffbasebindingen mellom aldehyd og det aktive hydrazid (et hydrazon), ble produktet vanligvis redusert til et alkylhydrazin ved å tilsette lOmM natriumcyanoborhydrid i en reaksjonstid på 1 time eller mer (total konjugeringstid - 4 timer). Konjugatet ble kromatografisk avsaltet og dialysert i lang tid (minimum 48 timer) over i pH 6,5 fosfatbuffer for lagring og prøving.

Konjugatene ble analysert for nærvær av aggregater ved gelfiltrering HPLC og for innhold av det frie hydrazidet ved reversert fase HPLC. Innholdet av aktivt hydrazid ble bestemt spektroskopisk ved å bruke ekstinksj onskoeffisienter av både antistoffet og det aktive hydrazidet for derved å kunne beregne den molare konsentrasjonen av sistnevnte i konj ugatene.

Hydrazidkoniuaater fremstilt fra produktet fra eksempel 3

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt substituert disulfid med formelen Q-Sp-SS-W fra en forbindelse med formelen CH3-SSS-W som er et N-acyldericat av et antitumor-antibiotikum betegnet som LL-E33288a1-I, a2-Br, a2-I/ j9i-Br, Px- T, -Yi-Br, ^-1, Sx- T, hvor W er Rx er R2 er R3 er H; R4 er

R5 er CH3, C2H5 eller (CH3)2CH; X er et jod- eller bromatom; R'5 er alkanoyl,

Sp er en rettkjedet eller forgrenet (Cj-Cio) -alknylengruppe;

Q er hydrogen eller

hvor n er 0 eller 1,

karakterisert ved at man omsetter et metyl-trisulfidantitumorantibiotikum valgt fra gruppen som er nevnt ovenfor, med et tilsvarende substituert merkaptan i acetonitril eller en kombinasjon av acetonitril og tetrahydrofuran eller acetonitril og dimetylformamid ved en temperatur mellom -20°C og +40°C i et tidsrom fra 1 time til 6 døgn, fortrinns-vis i nærvær av én ekvivalent av en tertiær aminbase eller en blanding av én ekvivalent av en tertiær aminbase og én ekvivalent av en organisk karboksylsyre.