NO178284B - Fremgangsmåte ved fremstilling av en blanding som induserer en binding - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en blanding for anvendelse ved indusering av binding mellom deler av levende mineralisert vev ved regenerering a mineralisert vev på i det minste én av delene.

Den foreliggende oppfinnelse medfører nye biologisk baserte teknikker som kan anvendes når det gjelder å indusere binding mellom deler av mineralisert vev, f.eks. tenner og ben. Selv om produktet av oppfinnelsen vanligvis"kan anvendes til å frembringe en slik binding, vil den i den foreliggende beskrivelse bli illustrert vesentlig i forbindelse med behandling av tenner som løsner, såkalt periodontitt. Det skal imidlertid bemerkes at denne prinsipielle illustrasjonen av oppfinnelsen ikke må tolkes på begrensende måte. Før teknikkene ifølge oppfinnelsen blir nærmere beskrevet, er det hensiktsmessig for å lette forståelsen av oppfinnelsen, å gi en kort bakgrunn for de biologiske tilstandene i forbindelse med tenner og beslektede forstyrrelser. Ved normal dental status er tennene forankret i spesielle hulrom, såkalte alveoler, i kjevebenet. Mellom tennenes røtter og kjevebenet er det plassert en såkalt periodontal membran. Tennenes røtter består hovedsakelig av et materiale som kalles dentin. Dette dentin er perifert belagt med et tynt sjikt av sementum, tykkelse ca. 0,01 til 1 mm. I denne sementum finnes blant annet kollagenfibre som strekker seg fra sementum gjennom den periodontale membranen, og som er forankret i kjevebenet. Sementum er derfor ytterst viktig for å feste tannen til kjevebenet. Den periodontale membranen har en tykkelse på ca. 0,2 mm og består av de ovennevnte kollagenfibre og kar og nerver som ligger mellom nevnte fibre og celler som hører til disse vevene.

Kjevebenet rekker ikke helt opp til tannens krone, og i den delen av roten som ikke er dekket av kjeveben, går fibre fra rotens sementum ut i den omgivende tanngommen, gingiva. Disse fibrene hjelper til å forankre tannen, og stabiliserer dessuten tanngommen. Tanngommen så vel som hele munnhulen er dekket av et tynt sjikt av epitel. Dette epitel danner en tett krave eller erme rundt tannen. Inntil tannen dannes det en grunn fure mellom tannen og epitelet.

Inflammatoriske forstyrrelser i vevene som fester tennene til kjevebenet er ganske hyppige, og rammer i varierende utstrekning størstedelen av befolkningen over hele verden. De anvendte behandlingsmetodene har hittil vært rettet mot å retardere en pågående sykdomsprosess og så langt som mulig, forhindre at tennene løsner. For tiden finnes ingen klinisk anvendbar jnetode som gir heling på en slik måte at_den gjør tannen i stand til å feste seg til kjevebenet igjen.

Ytterligere et problem innenfor dette området av inflammatoriske forstyrrelser utgjøres av medfødte defekter i tannfestet.

Pasienter med slike defekter utvikler symptomer på periodontitt i ung alder, såkalt juvenil periodontitt. Dens behandling medfører ofte uttrekking av tannen og erstatning med en brokonstruksjon til betydelige kostnader.

Bakteriene på tannens overflate forårsaker kronisk betennelse i tanngommene rundt tennene. Inflammatoriske celler skiller ut sine enzymer med det formål å drepe bakteriene, men som i dette tilfelle også angriper kollagenfibrene som fester tannen til tannkjøttet og kjevebenet. Cellene på overflaten av tannroten eller sementum, blir således gjenstand for ødeleggelse, og epitele fra munnens slimhinner vokser nedover langs tannen og frembringer en såkalt tannkjøttsprekk. I denne sprekken finner nye bakterier fordelaktige vekstbetingelser, og nye betennelsesceller invaderer dette området og setter i gang nedbrytningen av vevene i den periodontale membranen. SementumceIlene dør og bensubstansen i det alveolare området blir ødelagt. Denne prosessen er vanligvis svært langsom, men kan av og til foregå svært hurtig. Etter noen tid vil tennene som er gjenstand for angrep fullstendig miste sitt feste i kjevebenet. Dagens behandling er hovedsakelig rettet mot å fjerne bakteriebeleggene på tannoverflåtene. Når bakteriene er fjernet, vil betennelsen av tannkjøttet og den periodontale membranen gå tilbake, og nedbrytningsprosessen vil stoppe. Denne behandlingen sikter også mot å forhindre dannelsen av nye bakteriebelegg på tannoverflaten. Den fører derfor til stans i ødeleggelsen av tannfeste i kjevebenet, men ingen ny periodontal membran eller ny sementum vil dannes under helingsprosessen.

I forbindelse med den forskningen som den foreliggende oppfinnelse er et resultat av, har man anvendt den erkjennelse at dannelsen av sementum blir initiert av et tynt sjikt av en emaljeforløper som dannes ved utviklingen av roten langs hele rotens overflate. Det skal bemerkes at det ikke er vanlig kjent at emaljeforløperen kan indusere dannelse av sementum. Denne kunnskap er imidlertid beskrevet i parallelt innleverte patentsøknader, såsom europeisk patentsøknad nr. 87850264.0. Ytterligere forskning og eksperimenter omkring mekanismen for sementumdannelsen har overraskende vist at forløperen for dentalemalje, såkalt emaljematriks, som aktiv bestanddel inneholder en proteinfraksjon som kan fremstilles fra den organiske delen av nevnte emaljematrisk. Denne oppdagelse er desto mer overraskende siden den biologiske funksjonen av de proteinene som utgjør nevnte proteinfraksjon, blir antatt å finnes i dannelsen og spesielt mineraliseringen av tannemaljen (konferer Fischer, L. & Termine, D., Clinical Orthopaedics 200, 1985, 362-85). Proteinene i emaljematriksen er sammensatt av en høymolekylær del og en lavmolekylær del, og det er blitt funnet at deres aktive bestanddel utgjøres av den lavmolekylære delen av samme, men også kan utgjøres av en aktiv determinant derav. Nevnte lavmolekylære del av emaljematriksproteinene består av proteiner som kan ekstraheres med eddiksyre, og som vanligvis refereres til som amelogeniner som har en molvekt opp til ca. 40.000, men hovedsakelig en molvekt innenfor området ca. 5000 til ca. 25.000.

Når det gjelder uttrykkene "forløper for emalje" og "emaljematriks" som anvendt heri, henvises det til to referanser hvor betydningen av nevnte uttrykk er gjort fullstendig klar, nemlig: A.R. Ten Cate, Oral Histology, Development, Structure and Function, The CV. Mosby Co., St. Louis, USA (1980), sidene 182-82. I.A. Mjor, 0. Fejerskov, Human Oral Embryology & Histology, Munksgaard, Copenhagen (1986), sidene 44-45.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse er det blitt funnet at dersom dentin blir eksponert for cellene fra den periodontale membranen, f.eks. ved oppboring av en kavitet i tannoverflaten, foregår helingen i form av et benlignende vev som mangler de fibrene som fester den friske .tannen til omgivende vev. Dersom imidlertid den kunstig dannede kavitetsoverflaten blir dekket med en aktiv proteinfraksjon som skriver seg fra en forløper for dentalemalje, hvilken forløper for dentalemalje i det følgende blir kalt emaljematriks, finner man at det dannes normalt sementum-forankringsvev.

Emaljematriksproteinene fremstilles fortrinnsvis fra et pattedyr, såsom storfe eller svin. I eksperimentene er det blitt funnet av man kan indusere dannelse av sementum hos apekatter og mennesker ved å fylle en kavitet som er utboret i tannoverflaten med en proteinfraksjon fremstilt fra emaljematriksen fra en annen art, som f.eks. svin.

Oppfinnelsen som er beskrevet i det følgende muliggjør derfor nye teknikker for å indusere binding mellom deler av levende mineralisert vev ved nydannelse av mineralisert vev på i det minste en av delene. Disse teknikkene karakteriseres ved anvendelse av emaljematriksproteiner som skrive seg fra en forløper for dentalemalje, såkalt emaljematriks, for å indusere bindingen. Således tilveiebringes en blanding for. slik anvendelse, idet nevnte blanding inneholder slike emaljematriksproteiner som aktiv bestanddel eller aktiv determinant.

Blandingen fremstilles ifølge oppfinnelsen ved at tannkimer isoleres fra pattedyrskjever, medfølgende emaljeorgan fjernes herunder fra selve tannkimene, emaljematrisen utvinnes fra de gjenværende tannkimer, emaljetrisen homogeniseres, en proteinfraktsjon separeres, nemlig de proteiner som er ekstraherbare med eddiksyre og som generelt kalles amelogenier, fra den homogeniserte emaljematrisen, og eventuelt blandes proteinfraksjonen med en dentalt aksepterbar bærer, fortynningsmiddel eller bindemiddel.

Som tidligere vist, kan produktet av oppfinnelsen anvendes spesielt i forbindelse med dentalterapi, f.eks. ved behandling av periodontitt, dvs. at tennene løsner, ved transplantering av tenner eller gjeninnsetting av tenner som tilfeldigvis har løsnet. Oppfinnelsen kan imidlertid også anvendes til å gjøre det lettere å feste kunstige implantater, f.eks. tanninnplantater eller kunstige hofteledd. ^Oppfinnelsen kan også anvendes til å indusere dannelse av mineralisert vev på kunstige implantater hvor det er ønskelig å skaffe nye senefester.

Den proteinfraksjonen som brukes ved anvendelse av teknikkene ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan passende fremstilles fra emaljematriksen hos noen pattedyr, som har tenner under utvikling. En egnet kilde for emaljematriksen er slaktede dyr, f.eks. griser eller kalver, som ofte blir slaktet mens tennene fremdeles er under utvikling, når det gjelder svin ofte ved en alder på ca. et halvt år. Foretrukne pattedyr blir således valgt fra storfe- eller svinearter (dvs. kveg eller griser), men også andre arter blir overveiet, f.eks. sauer og gnagere som har tenner som vokser konti-nuerlig. Som en alternativ kilde for denne proteinfraksjonen kan man også anvende dyrkede celler eller bakterier modifisert ved rekombinant DNA-teknikk, konferer f.eks. US patent nr. 4.672.032.

Den blandingen som skal anvendes for terapi kan bestå av utelukkende en slik proteinfraksjon eller en aktiv determinant derav, passende tilblandet med vann, men blandingen kan også inneholde proteinfraksjonen sammen med en bærer, en fortynner eller et klebemiddel, såsom modifisert cellulose, agar, alginat eller gelatin som kan ogdkjennes for formålet. For dental anvendelse er det passende at bæreren eller fortynneren er dentalt akseptabel. Det foretrekkes for tiden å anvende en bærer omfattende vannløselige polymerer. Eksempler på slike polymerer, men uten begrensning til disse, er natriumkarboksy-cellulose, mikrokrystallinsk cellulose, hydroksyetylcellulose, hydroksypropylcellulose, metylcellulose, høymolekylær poly-akrylsyre, natriumalginat, propylenglykolalginat, xantangummi, guargummi, Johannes-brødgummi, modifisert stivelse, gelatin, pektin eller blandinger av disse. Etter innføring av den aktive proteinfraksjonen kan disse vannløselige polymerene eventuelt omdannes til geler eller filmer som fører til blandinger,som lett lar seg påføre på grunn av sine fordel-aktive fysiske egenskaper. Blandingen kan eventuelt inneholde stabilisatorer eller konserveringsmidler med det formål å øke lagringsstabiliteten.

Oppfinnelsen muliggjør en fremgangsmåte for behandling av periodontitt som fører til at tannen kan feste seg igjen ved å indusere dannelse av rotsementum og kjeveben og et fysiologisk kollagenfiberfeste mellom disse. Fremgangsmåten karakteriseres ved at epitelet, dersom det er tilstede, blir fjernet fra tannroten, og at roten deretter blir forsynt med et sjikt av den relevante proteinfraksjonen fremstilt fra emaljematriks .

I den foretrukne anvendelsen for behandling av periodontitt blir kollagenvevet (gingiva) tett opp til det tann-området som er utsatt for angrep, insisert for å eksponere overflaten av roten. Dersom det er tilstede blir epielet fjernet, og den rene rotoverflaten blir deretter belagt med et sjikt av nevnte proteinfraksjon eller en blanding som inneholder en slik proteinfraksjon som aktiv bestanddel, hvoretter kollagenvevet (gingiva) blir lagt på plass igjen og eventuelt fastsydd slik at helingen kan foregå.

Som tidligere nevnt, kan blandingen fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes, i tillegg til behandling av periodontitt, ved reimplantering eller transplantering av tenner. Det forekommer relativt hyppig at ungdommer i sine lavere tenår utsettes for ulykker som fører til dislokasjon av én eller flere tenner, hovedsakelig fortennene. Ved raskt å sette tilbake de løse tennene kan man oppnå god heling med normal festing til kjevebenet. I mange tilfeller kan slik gjeninnsetting av løse tenner ikke utføres umiddelbart, og tennene må oppbevares en tid i et uegnet medium utenfor munnen, feks. i luft. Dette vil ødelegge cellene i den periodontale membranen på overflaten av roten. Når tannen settes tilbake på plass i munnen, vil den ikke få tilbake et fysiologisk feste, men vil med tiden løsne. Opp til nå er ingen metode blitt utviklet hvorved man kan oppnå et permanent tannfeste ved nydannelse av bindevev.

I samsvar med teknikkene som oppfinnelsen muliggjør, kan man imidlertid fjerne den døde periodontale membranen på den løse tannen på en egnet måte ved mekaniske eller kjemiske midler, og blandingen som inneholder eller består av nevnte proteinfraksjon, blir deretter påført på den nakne rotoverflaten. Tannen blir deretter satt tilbake i sin fordypning i kjeven, og festet lett for noen uker. På grunn av proteinfraksjonen eller blandingen derav som er påført på rotoverflaten, vil det dannes et nytt sementumsjikt, og tannen vil derved oppnå et nytt feste.

Når det gjelder transplantering av tenner, dvs. over-føring av tenner fra ett individ til et annet, er det blitt funnet at vevene i transplanterte tenner blir angrepet av mottagerens immunforsvar og nedbrutt i løpet av et svært kort tidsrom. Det er blitt gjort forsøk på utføre transplantering mellom immunologisk forlikelige individer. Også resultatene av disse forsøkene har imidlertid vært skuffende. Siden langtidsbehandling med immunosuppresanter i den hensikt å vedlikeholde én eller flere transplanterte tenner, ikke er verdt den risiko som følger med, er det idag ingen klinisk anvendbar metode for transplantering av tenner med fordelaktig langtidsprognose.

Ved anvendelse av teknikkene som den foreliggende oppfinnelse muliggjør, kan det imidlertid utformes en slik fremgangsmåte, og problemet kan løses ved å ta ut de tennene som skal transplanteres fra donoren, fjerne den dentale pulpa, rense pulparommet og påføre et rotfyllemiddel i pulparommet. Den periodontale membranen blir mekanisk eller kjemisk fjernet, og tannroten blir belagt med den blandingen som inneholder den aktive proteinfraksjonen. Deretter blir tannen plassert på sin nye plass i mottagerens munn. Tannen blir holdt i en fast stilling i et tidsrom, og på grunn av proteinfraksjonen vil det induseres nydannelse av endogent mineralisert vev som dekker den transplanterte tannen og gir feste for denne.

Videre kan blandingen som inneholder den aktive proteinfraksjonen supplementeres med et vevsklebemiddel basert på fibrinogen, Faktor XIII (som er en plasma-avledet koaguler-ingsfaktor) og trombin. En slik supplementert blanding kan bestå av _en forblanding av emaljematriks og fibrinogen og Faktor XIII, slik at trombin blir tilsatt umiddelbart før påføring av blandingen til operasjonsstedet. Forblandingen kan eventuelt inneholde aprotinin for å redusere nedbrytnings-hastigheten. Et nyttig kommersielt produkt for anvendelse i slike supplementerte blandinger er Tisseel, et tokomponent fibrinforseglingsmiddel fremstilt og solgt av IMMUNO AG, Wien, Østerike. Ved bruk av slikt vevsklebemiddel blir forblandingen av proteinfraksjon, fibrinogen, Faktor XIII og eventuelt aprotini, blandet med en trombinløsning, og den resulterende blandingen blir deretter raskt påført på opersjonsstedet. Ved behandling av periodontitt vil denne teknikken i høy grad gjøre operasjonen enklere. Fastklebingen av blandingen til roten vil således bli bedre, blødningen blir stoppet og plasseringen av den muko-periosteale klaffen blir i høy grad forenklet, mens man eliminerer anvendelse av suturer.

Foreliggende produkter som foretrekkes for anvendelse i en supplementert blanding, er cellulosederivater og alginater, såsom karboksymetylcellulose og natrium- eller propylenglykolalginat.

Oppfinnelsen skal i det følgende ytterligere illustreres i forbindelse med spesielle eksempler. Eksemplene blir utført i forbindelse med dentale eksperimenter som gjennomføres på apekatter og mennesker. I disse eksemplene gjøres det hen-visning til den vedlagte tegningen som representerer en SDS-Page, separasjon ved polyakrylamidgel-elektroforese. De to hoveddelene av den proteinfraksjonen som er fremstilt fra emaljematriks basert på molekylvekt, blir kalt amelogenin (lav molekylvekt) og enamelin (høy molekylvekt).

EKSEMPEL 1

Fremstilling av ekstrakter for dyreforsøk

For å bringe på det rene hvilke komponenter i emaljematriksen som er aktive i dyremodellene, ble fremstilt følgende testsubstanser. Alle substansene skriver seg fra emaljematriks fra svin.

E 1 0,3 _g matriks (proteininnhold 27 + 4%) ble utgnidd i 3 ml 0,9% NaCl og homogenisert under avkjøling med is med en polytron i 1 minutt med intervaller på 10 sekunder. Homogenatet ble deretter frysetørket. Utbytte: 199 mg, proteininnhold ifølge Lowry 47% + 2%.

E 2 0,3 g matriks ble utgnidd og homogenisert som ovenfor, og deretter oppvarmet på vannbad i 4 minutter. Frysetørking ga et utbytte på 199 mg, innhold av løselig protein 13% + 3%.

E 3 0,3 g substans ble utgnidd i 3 ml 0,5 M eddiksyre (p.a.), homogenisert som ovenfor og fikk deretter stå under omrøring ved 4°C i 24 timer for proteinekstraksjon. Deretter ble sentrifugert kaldt ved 10.000 rpm i 10 minutter. Bunnfallet ble gjenvunnet og frosset, og supernatanten ble frysetørket. Utbytte av lyofilisat: 68 ml, proteininnhold 29% + 3%.

E 4 0,3 g matriks ble utgnidd i 3 ml 10% EDTA i 0,03 M Tris-buffer, pH 7,4, og homogenisert under avkjøling som ovenfor. Deretter foregikk ekstraksjonen kaldt ved omrøring i 24 timer, homogenisatet ble deretter frasentrifugert i kjølesentrifuge. Supernatanen ble dialysert mot destillert vann og frysetørket. Utbytte: 11 mg, proteininnhold 33% + 2%.

E 5 Bunnfallet etter sentrifugeringen (E 4) ble ekstrahert kaldt med ca. 10 volumer av 0,5 M eddiksyre under langsom omrøring i 24 timer. Deretter ble det gjennomført en ny sentrifugering, og supernatanten ble frysetørket. Utbytte: 109 mg, proteininnhold 15% + 3%.

E 6 Bunnfallet fra sentrifugeringen beskrevet under E 5 ble frysetørket. Utbytte: 37 mg> proteininnhold 18% + 4%.

E 7 0,3 g matriks ble utgnidd i 3 ml 10% EDTA i 0,03 M Tris-buffer, pH 7,4, med 0,4 mM proteinaseinhibitor PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid) og homogenisert og ekstrahert på samme måten som prøve E 4. Etter sentr i fuger ing og dialyse av supernatanten, foregikk frysetørking. Utbytte: 11 mg, proteininnhold 41% + 2%.

E 8 Bunnfallet fra sentrifugeringen beskrevet under E 7 ble ekstrahert med 0,5 M eddiksyre i 48 timer ved lav temperatur, sentrifugert, og supernatanten ble frysetørket. Utbytte:

101 mg, proteininnhold 17% + 1%.

E 9 Bunnfallet fra sentrifugringen beskrevet undejr E 8 ble frysetrøket. Utbytte: 40 mg, proteininnhold 30% + 3%.

De substansene som ble oppnådd i E 1-9 ovenfor ble karakterisert med hensyn til proteininnhold, proteinets molekylvektfordeling (SDS-Page med Phast), isoelektriske punkter for proteinene og karbohydratinnhold.

Tilsynelatende molekylvektsammenstninger av ekstrakter fra emaljematriks fra svin er vist i den vedlgte tegningen. Etter SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS 8-25%), Phast, Pharmacia) er proteinbåndene blitt transformert til topper med en laserscanner (LKB Ultroscan XL). Molekylvektene blir anslått ved kalibrering med proteinreferanser (14-90 kDa) og polypeptidreferanser (2-14 kDa) (Pharmacia). Diagrammer er gitt for ekstraktene E4 og E5, og disse og de andre ekstraktene er sammensatt nedenfor.

Hensikten med dette eksemplet er å vise den innvirkningen av substansene E 1 - E 9 som oppnås ved trinnvis ekstraksjon fra forløpervevet til dentalemalje (emaljematriks) ved heling av eksperimentelt frembragte marginale periodontale sår. Defekter i den marginale tannrothinnen på apekatt-tenner ble laget ved å flytte dentalsementum, periodontal membran og marginal alveolar bensubstans til en cerviko-apikal avstand på tilnærmet 5 mm med et tannlegebor. Substansene ble deretter påført på de eksperimentelt frembragte defektene, og såret fikk hele seg. Kontrolldefekter ble også laget, men fikk hele seg uten påføring av noen substans. Etter en helingsperiode på 8 uker ble resultatene evaluert histomorfomertrisk.

Resultatene av helingsprosessen er uttrykt i prosent av det opprinnelige nivået av sementum og bendekke (Tabell 1). Helingsprosessen omfatter dannelse av et klebende sjikt av ny sementum, periodontal membran og alveolar bensubstans (nytt feste).

Fastgjøring var således blitt resultatet etter påføring av substansene El, E3, E5 og E8. Dette var ikke tilfelle for kontrollen og tennene som var blitt behandlet med substansene E2, E4, E6, E7 og E9 hvor defekten fortsatt var tilstede, mens tennene bare var blitt dekket med oralt epitel. Disse resultatene viser at påføring av den lavmolekylære fraksjonen av proteindelen av emaljematriksen, vil befordre vevsfestingen ved behandling av periodontitt.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av avsaltet syreekstrakt fra emaljematriks

Et frysetørket preparat som ligner preparatet i det foregående eksemplet (E3) ble løst i 0,1 M eddiksyre og overført (144 mg/12 ml) til en 15 x 540 mm kolonne med Sephadex G-25 superfin i 0,1 M eddiksyre. Den første proteinrike fraksjonen (E10) ble oppsamlet og frysetørket. Utbyttet var 34 mg stoff som inneholdt ca. 72% protein som tilsvarer 85% protein i utgangsmaterialet. Restproteiner ble funnet i saltfraksjonen (63 mg frysetørket materiale med et proteininnhold på ca. 7%).

Den frysetørkede proteinfraksjonen fremstilt på denne måten ble fylt i 10 ml rør (20 mg i hvert) og strålings-sterilise^rt (35 kGy) før anvendelse til dyreforsøjcene.

Preparatene ble analysert som beskrevet i det foregående eksemplet. Resultatene er gitt i Tabell 2 nedenfor.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av rensede proteinfraksioner

200 mg frysetørket preparat E3 (identisk med det som ble anvendt i Eksempel 2) ble løst i 20 ml 0,1 M eddiksyre og påsatt på en 25 x 780 mm kolonne med Sephadex G-75 i 0,1 M eddiksyre ved 4°C. Kolonnen ble eluert med en hastighet på

55 ml pr. time, og 4 ml prøver ble oppsamlet. Eluatet ble kontrollert ved 280 nm (Uvicord), og de prøvene som inneholdt størstedelen av det eluerte materialet, ble slått sammen for å gi fem fraksjoner som ble analysert ved elektroforese (SDS-Page) for molekylvektfordeling som vist nedenfor. Fem topper fra elueringskromatogrammet (0-1 A).

Etter frysetørking ga toppene (2), (3) og (4) henholdsvis 10 mg, 7 mg og 12 mg av de høymolekylære, de midlere mole-kylære og de lavmolekylære amelogeninproteinene (proteininnhold > 90%).

Hensikten med dette eksperimentet var å vise innvirkningen av amelogeninsubstansene med høy, midlere og lav molekylvekt, ekstrahert fra forløpervev for emalje^ (emaljematriks) på helingen av eksperimentelle marginale periodontale sår. Eksperimentelle defekter i den marginale tannrothinnen på apekatt-tenner ble laget ved å flytte dentalsementum, periodontal membran og marginal alveolarbensubstans til en cerviko-apikal avstand på tilnærmet 5 mm med et tannlegeborr. Substansene ble deretter påført på de eksperimentelt frembragte defektene, og sårene fikk hele seg. Kontrolldefekter ble også fremstilt, men fikk hele seg uten anvendelse av noen substans. Etter en helingsperiode på 8 uker ble resultatene evaluert histomorfometrisk (Tabell 3).

Resultatet var således ny fastgjøring etter påføring av høymolekylær amelogenin og, i mindre grad, etter påføring av midlere molekylær amelogenin og lavmolekylær amelogenin. Disse resultatene indikerer at en påføring av den høymole-kylære fraksjonen av amelogenin fremstilt fra emaljematriks befordrer vevsfestingen mest effektivt ved behandling av peri odont itt.

EKSEMPEL 4

Fremstilling av svreekstrakt av emaljematriks

Underkjever fra slaktede griser (ca. 6 måneder gamle, slaktevekt ca. 80 kg) ble renskåret for bløtvev og frosset i slakteriet. Egnede tannmikrober ble eksisert fra frosne kjevehalvdeler etter delvis tining, og emaljematriks ble isolert. 38 g emaljematriks ble utgnidd i 780 ml 0,5 M eddiksye, pH 4,1, og homogenisert under iskjøling (Homogenisator Polytron PT 10-30). Homogenisatet ble omrørt kaldt i 22 timer for å ekstrahere protein løselig ved pH ca. 4. Uløselig materiale ble sentrifugert vekk, og eddiksyreløsningen ble frysetørket.

8,5| lyofilisat ble oppnådd, med et proteininnhold på ca. 20% tilsvarende ca. 50% proteinutbytte.

Det frysetørkede ekstraktet ble analysert med hensyn til vanninnhold, acetatinnhold, proteininnhold (Lowry), karbo-hydrat innhold (Antronreagens), aminosyresammensetning, elementæranalyse, proteinmolekylvektfordeling (SDS-Page) og isoelektrisk punkt for proteinene.

Før anvendelse til klinisk testing ble den proteinholdige eddiksyreløsningen sterilfiltrert ned i sterile 10 ml rør og frysetørket under sterile betingelser.

Formålet med dette eksemplet var å vise innvirkningen av substans E3 på heling ved behandling av marginal periodontitt hos mennesker. Etter godkjenning fra den svenske medisinal-styrelsen og den regionale etikk-komiteen ble preparatet anvendt som hjelpemiddel ved konvensjonell kirurgisk behandling av pasienter med marginal periodontitt. Pasientene ble operert for å fjerne dental kalkulus og granuleringsvev. Substansen E3 ble "påmalt" på de nakne rotoverflåtene og dekket med en muko-periostal klaff. Helingsresultatene ble evaluert ved periodisk klinisk inspeksjon, registrering av lommedybde, festingsnivå og tannkjøttindeks, samt undersøkelse av intraorale røntgenbilder. Resultatene ble sammenlignet med resultater oppnådd i tidligere kvantitative studier ved anvendelse av konvensjonell periodontal kirurgi og tilsvarende kontrollområder hos de samme pasientene.

Resultatene viste at substans E3 hadde befordret en signifikant økning av marginal alveolar benhøyde (område 4-8 mm) og festingsnivå (område 5-9 mm). Dette var et helings-resultat man aldri hadde sett etter konvensjonell periodontal kirurgi. Den generelle helingen syntes å foregå raskere både med hensyn til klinisk utseende og reduksjon av marginal lommedybde sammenlignet med tidligere studier av konvensjonell periodontal kirurgi. Disse resultatene viser at den lavmolekylære proteinfraksjonen fra emaljematriks har evnen til å befordre innfesting av nytt periodontalt vev hos mennesker, et resultat man ikke hadde opplevet med konvensjonell behandling.

Forbedring av helingen av bensubstans

Virkningen av "den lavmolekylære delen av proteinfraksjonen av emaljematriks" og benhelingen ble testet på eksperimentelle kaviteter i underkjevebenet og lårbenet hos voksne rotter. Vinkeldelene av underkjevebenene ble eksponert ved et vertikalt kirurgisk innsnitt i huden og ytre tygge-muskel. Et lite hull (2 mm i diameter) ble boret gjennom underkjevebenet under konstant strøm av fysiologisk saltvanns-løsning. På den samme måten ble laget hull av samme størrelse som i underkjevebenene gjennom det kompakte benet i den distale delen av lårbenene. I høyre underkjeveben og høyre lårben ble påført "den lavmolekylære delen av proteinfraksjonen_av emaljematriks", mens hullene i det venstre underkjevebenet og det venstre lårbenet ble anvendt til å kontrollere kavitetene.

"Den lavmolekylære delen av proteinfraksjonen av emaljematriks" ble påført i kavitetene enten som et frysetørket svamplignende materiale eller små gelatin sylindere. Kontrollhullene i underkjevebenet og lårbenet på den venstre siden av disse rottene ble fylt med gelatinsylindere uten "den lavmolekylære delen av proteinfraksjonen av emaljematriks". Intet ble påført i kontrollhullene i underkjevebenet og lårbenet på den venstre siden av rottene som fikk den tørre, frysetørkede "lavmolekylære delen av proteinfraksjonen av emaljematriks".

Rottene ble avlivet 1-5 uker etter påføringen av substansene. De eksperimentelle og kontrollområdene ble utatt, og forberedt for lysmikroskopisk undersøkelse.

Så tidlig som en uke etter påføringen av den lavmolekylære delen av proteinfraksjonen av emaljematriks i det borede hullet, var det fullstendig fylt med bensubstans, og i tillegg hadde det funnet sted en markert periosteal apposisjon av ben. I kontrollene som ikke var behandlet i samsvar med denne oppfinnelse hadde det også dannet seg ny bensubstans, men den var markert mindre, og det borede hullet hadde ikke helet seg.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en blanding for anvendelse ved indusering av binding mellom deler av levende mineralisert vev ved regenerering av mineralisert vev på i det minste én av delene, karakterisert ved at tannkimer isoleres fra pattedyrskjever, medfølgende emaljeorgan fjernes herunder fra selve tannkimene, emaljematrisen utvinnes fra de gjenværende tannkimer, emaljematrisen homogeniseres, en proteinfraksjon separeres, nemlig de proteiner som er ekstraherbare med eddiksyre og som generelt kalles amelogeniner, fra den homogeniserte emaljematrisen, og eventuelt blandes proteinfraksjonen med en dentalt aksepterbar bærer, fortynningsmiddel eller bindemiddel.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at isoleringen blir utført fra en kveg- eller svinekilde.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte bærer, fortynner eller klebemiddel er dentalt eller biologisk akseptabelt.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at den aktive bestanddelen omfatter den lavmolekylære delen av proteinfraksjonen eller en aktiv determinant derav.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den aktive bestanddelen omfatter proteiner som kan ekstraheres med eddiksyre, og som vanligvis kalles amelogeniner.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den aktive bestanddelen har en molekylvekt på opp til 40.000.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den aktive bestanddelen har en molekylvekt mellom 5000 og 25.000.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den aktive bestanddelen omfatter den høymolekylære fraksjonen av amelogenindelen av emalj ematriksen.