NO20111085L

NO20111085L - Isolert cytokin-zalphall-ligand-polypeptid, isolert Polynukleotid, ekspresjonsvektor, dyrket celle, fremgangsmate for fremstilling av peptidet, antistoff som binder til peptidet, anvendelse av preparat omfattende peptidet for fremstilling av medikament for behandling av sykdom, fremgangsmate for pavisning av peptidet i en biologisk prove samt polypeptidet for anvendelse innen medisin

Info

Publication number: NO20111085L
Application number: NO20111085A
Authority: NO
Inventors: Richard D Holly; Cindy A Sprecher; Scott R Presnell; Julia E Novak; Angela K Hammond; Jane A Gross; Donald C Foster; Janet V Johnston; Andrew J Nelson; Stacey R Dillon
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2001-11-09
Also published as: CN1827639A; CN100500846C; HUP0200418A2; BR0008772A; EP2295577A3; ZA017370B; IL145288A0; PL207350B1; RU2004126135A; KR100743640B1; DE60036930T2; HU229148B1; CA2366921C; CN1927883B; CA2366921A1; UA84387C2; KR20010103794A; CZ20013184A3; IL195713A; CN101575377B

Abstract

Oppfinnelsen vedrører et fusjonsprotein, en fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteinet, cellekulturmedium, transgen mus, knock-out-mus, fremgangsmåte for fremstilling av antistoff mot et zalpha 11-polypeptid, antistoff som binder til en zalpha 11-ligand, samt in vitro deteksjonsmetoder for påvisning av genetisk abnormitet eller kreft.

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Proliferasjon og differensiering av celler i multicellulære organismer kontrolleres av hormoner og polypeptid-vekstfaktorer. Disse diffunderbare molekylene muliggjør at cellene kommuniserer med hverandre og virke sammen for dannelse av celler, vev og organer, og å reparere skadet vev. Eksempler på hormoner og vekstfaktorer omfatter steroidhormonene (f.eks. østrogen, testosteron), paratyreoidhormon, follikkelstimulerende hormon, interleukinene, blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), epidermal vekstfaktor (EGF), granulocytt-makrofagkolonistimu-lerende faktor (GM-CSF), erytropoietin (EPO) og kalsitonin.

Hormoner og vekstfaktorer påvirker den cellulære metabolisme ved å bindes til reseptorer. Reseptorene kan være integrerte membranproteiner som er koblet til signalreaksjons-veier i cellen, f.eks. "second messenger"-systemer. Andre resep-torklasser er oppløselige molekyler, f.eks. transkripsjons-faktorene .

Cytokiner stimulerer generelt proliferasjon eller differensiering av celler fra den hematopoietiske linje eller deltar i immunresponsmekanismer og inflammatoriske respons-mekanismer i kroppen. Eksempler på cytokiner som påvirker hematopoesen, er erytropoietin (EPO), som stimulerer utvikling av røde blodceller; trombopoietin (TPO), som stimulerer utvikling av celler fra megakaryocyttlinjen; og granulocyttkolonistimuler-ende faktor (G-CSF), som stimulerer utvikling av nøytrofile celler. Disse cytokinene er anvendbare for å gjenopprette normalt nivå av blodceller hos pasienter som lider av anemi, trombocytopeni og nøytropeni, eller som gis kjemoterapi for cancer.

Interleukinene er en familie av cytokiner som formidler immunologiske responser, innbefattet inflammasjon. Interleukinene formidler en rekke inflammatoriske sykdomstilstander. Sentralt i en immunrespons står T-cellen, som produserer mange cytokiner og formidler adaptiv immunitet mot antigener. Cytokiner som produseres av T-cellen, er blitt klassifisert som type 1 og type 2 (Kelso, A., Immun. Cell Biol., 76:300-317, 1998). Type 1-cytokiner omfatter IL-2, IFN-y og LT-oc, og inngår i inflammatoriske responser, viral immunitet, intracellulær para-sittimmunitet og allotransplantatrejeksjon. Type 2-cytokiner omfatter IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 og IL-13, og deltar i humorale responser, immunitet mot ormer og allergisk respons. Cytokiner som er felles for typene 1 og 2, omfatter IL-3, GM-CSF og TNF-ot. Det foreligger noe materiale som antyder at type 1- og type 2-produserende T-cellepopulasjoner fortrinnsvis migrerer til forskjellige typer inflammert vev.

Modne T-celler kan aktiveres, det vil si med et antigen eller andre stimuli, til å produsere f.eks. cytokiner, biokjemiske signalmolekyler eller reseptorer som videre påvirker T-cellepopulasjonens skjebne.

B-celler kan aktiveres via reseptorer på celleoverflaten, innbefattet B-cellereseptoren og andre tilleggsmole-kyler, til å utføre tilleggscellefunksjoner som f.eks. produksjon av cytokiner.

Naturlige dreperceller ("natural killer cells", NK-celler) har en forløpercelle felles med T-celler og B-celler og spiller en rolle i immunovervåkning. NK-celler, som utgjør opptil 15 % av lymfocyttene i blodet, uttrykker ikke antigenresep-torer og anvender derfor ikke MHC-gjenkjenning som krav for binding til en målcelle. NK-celler deltar i gjenkjenning og dreping av visse tumorceller og virusinfiserte celler. In vivo antas NK-celler å kreve aktivering, in vi tro er imidlertid NK-celler vist å drepe noen typer tumorceller uten aktivering.

De påviste in vivo-aktiviteter til cytokinfamilien illustrerer det enorme kliniske potensialet av og behovet for andre cytokiner, cytokinagonister og cytokinantagonister. Foreliggende oppfinnelse tar fatt i disse behovene ved å tilveiebringe et nytt cytokin som stimulerer celler fra den hematopoietiske cellelinje, så vel som beslektede preparater og fremgangsmåter .

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse isolert polypeptid ifølge Kravene 1 til 7, hvor det isolerte polypeptidet omfatter en sekvens av aminosyrerester som er: a) minst 90 % identisk med aminosyrerestene fra 41 (Gin) til 148 (Ile), som vist i SEQ ID NO: 2, hvori aminosyreresten i posisjon 44 er Asp, aminosyreresten i posisjon 47 er Asp, og aminosyreresten i posisjon 135 er Glu, eller b) minst 90 % identisk med aminosyrerestene fra 32 (Glu) til 162 (Ser), som vist i SEQ ID NO: 2,

hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115.

I en utførelsesform av oppfinnelsen har det isolerte polypeptidet en sekvens av aminosyrerester som vist i SEQ ID NO: 2, fra aminosyrerest 1 (Met) til aminosyrerest 162 (Ser).

I en annen utførelsesform ifølge Krav 8 og 9, angår oppfinnelsen isolert polypeptid, hvor polypeptidet omfatter en sekvens av aminosyrerester som vist i SEQ ID NO: 56, fra aminosyrerest 23 (Gin) til aminosyrerest 146 (Ser), hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115. I en annen utførelsesform har det isolerte polypeptidet en sekvens av aminosyrerester som vist i SEQ ID NO: 56, hvor sekvensen er aminosyrerest 1 (Met) til aminosyrerest 146 (Ser).

I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen isolert polynukleotidmolekyl som består av en nukleotidsekvens som koder for ovennevnte polypeptid, hvori polypeptidet kodet for av polynukleotidet binder en zalfall-reseptor som vist i SEQ ID NO:l.

I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen ekspresjonsvektor omfattende DNA-segment som koder for et polypeptid ifølge kravene 1-9 samt en transkripsjonspromoter og en transkripsjonsterminator. En ytterligere utførelsesform angår dyrket celle som omfatter nevnte ekspresjonsvektor. I en ytterligere utførelsesform omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av et protein, hvor fremgangsmåten omfatter dyrking av en celle omfattende ovennevnte ekspresjonsvektor under betingelser hvor DNA-segmentet uttrykkes, og gjenvinning av proteinet som kodes av DNA-segmentet.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen antistoff som spesifikt binder et zalphall-ligandpolypeptid,hvor polypeptidet er utvalgt fra: (a) et polypeptid som består av aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 41 (Gin) til aminosyre nr. 148 (Ile), (b) et polypeptid som består av aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 32 (Gin) til aminosyre nr. 162 (Ser), (c) et polypeptid som består av aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 1 (Met) til aminosyre nr. 162 (Ser).

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen anvendelse av et preparat omfattende et polypeptid ifølge

kravene

1-9 for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom som oppstår fra feil i immunsystemet, og for fremstilling av et medikament for stimulering av en immunrespons i et pattedyr eksponert for et antigen eller patogen, hvori anvendelsen av medikamentet, nivået av antigen eller patogen til stede i pattedyret sammenlignes før og etter administrering av medikamentet, hvori en forandring i nivået er indikerende for stimulering av en immunrespons. Antigenet kan være en B-celletumor, virus, parasitt eller bakterie.

Yetterligere utførelsesformer av oppfinnelsen angår anvendelse av et peptid ifølge ethvert av kravene 1-9, for fremstilling av et medikament for behandling av en B- eller T-celleneoplasma ved reduksjon i proliferasjon av neoplastiske B-eller T-celler. I en utførelsesform omfatter medikamentet også minst et annet cytokin utvalgt fra gruppen bestående av IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3-ligand og stamcellefaktor.

I enda en utførelsesform omfatter oppfinnelsen anvendelse av et preparat som omfatter et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-9, for fremstilling av et medikament for stimulering av en immunrespons hos et pattedyr eksponert for et antigen eller patogen, hvori anvendelsen av medikamentet, nivået av antigen- eller patogenspesifikt antistoff til stede i nevnte pattedyr sammenlignes før og etter administrering av medikamentet, hvori en økning i antistoffnivå er indikerende for stimulering av en immunrespons.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-9 for fremstilling av et medikament for behandling av kreft.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen fremgangsmåte for ekspansjon av hematopoetiske celler og hematopoetiske cellerforløpere, som omfatter dyrkning av benmarg eller perifere blodceller med et preparat omfattende en mengde av polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-9 som er tilstrekkelig for å gi en økning i antall lymfoide celler i benmargen eller perifere blodceller sammenlignet med benmargen eller perifere blodceller dyrket i fravær av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-9.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelse av zalphall-ligand-RNA i en biologisk prøve,som omfatter trinnene: (a) en zalphall-ligandnukleinsyreprobe, ved hybridiserings-betingelser, bringes i kontakt med enten (i) test-RNA-molekyler isolert fra den biologiske prøve, eller (ii) nukleinsyremolekyler syntetisert fra de isolerte RNA-molekyler, hvori proben har et nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid ifølge krav 7 eller krav 9, eller er komplementært i denne, og (b) påvisning av dannelse av hybrider av nukleinsyreproben og enten test-RNA-molekylene eller de syntetiserte nukleinsyremolekyl er ,

hvori tilstedeværelse av hybridene indikerer tilstedeværelse av zalphall-ligand-RNA i den biologiske prøve og hvori nevnte zalphall-ligand er et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-9.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelse av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-9 i en biologisk prøve,hvor fremgangsmåten omfatter trinnene: a) den biologiske prøve bringes i kontakt med et antistoff, eller et antistoffragment ifølge krav 17, hvori kontakten utføres under betingelser som tillater binding av antistoffet eller antistoffragmentet til den biologiske prøve, og b) påvisning av det bundne antistoff eller bundne antistoff-fragment.

Videre omfatter oppfinnelsen polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-9, for anvendelse innen medisin.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 illustrerer en flersekvenssammenstilling av humant IL-2, humant IL-15, zalphall-ligand (SEQ ID NO: 2), humant IL-4, muse-IL-4, human GM-CSF og muse-GM-CSF.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Før oppfinnelsen beskrives i detalj kan det være nyttig for dens forståelse å definere følgende begreper: Begrepet "affinitetsmerkelapp" anvendes heri som be-tegnelse på et polypeptidsegment som kan kobles til et annet polypeptid for å lette rensing eller påvisning av det andre polypeptidet, eller tilveiebringe seter for tilkobling av det andre polypeptidet til et støttemedium. Prinsipielt kan ethvert peptid eller protein for hvilket et antistoff eller et annet spesifikt bindingsmiddel er tilgjengelig anvendes som affinitetsmerkelapp . Affinitetsmerkelapper omfatter et polyhistidin-strekk, protein A (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol., 198:3, 1991), glutation S-transferase (Smith og Johnson, Gene, 67:31, 1988), Glu-Glu-affinitetsmerking (Grussenmeyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:7952-4, 1985), substans P,"Flag"-peptid (Hopp et al., Biotechnology, 6:1204-10, 1988), streptavidinbindende peptid og andre antigenepitoper eller bindingsdomener. Se generelt Ford et al., Protein Expression and Purification, 2:95-107, 1991. DNA som koder for affinitetsmerkelapper, er tilgjengelige fra kommersielle leverandører (f.eks. Pharmacia Biotech, Piscataway,

NJ) .

Begrepet "allelisk variant" anvendes heri til å betegne enhver av to eller flere alternative former av et gen som besitter samme kromosomale sted. Allelisk variasjon oppstår naturlig ved mutasjon og kan føre til fenotypisk polymorfisme i populasjoner. Genmutasjoner kan være tause (ingen endring i det kodede polypeptid), eller de kan kode for polypeptider som har endret aminosyresekvens. Begrepet "allelisk variant" anvendes også heri til å betegne et protein som kodes av en allelisk variant av et gen.

Begrepene "aminoterminal" og "karboksyterminal" anvendes heri for å angi posisjoner i polypeptider. Dersom sammen-hengen tillater det, anvendes disse begrepene med henvisning til en gitt sekvens eller en del av et polypeptid for å angi nærhet eller relativ posisjon. For eksempel er en gitt sekvens som er plassert karboksyterminalt for en referansesekvens i et polypeptid, plassert proksimalt til karboksyenden av referanse- sekvensen, men ikke nødvendigvis i det fullstendige polypeptids karboksyterminale ende.

Begrepet "komplement-/antikomplementpar" betegner ikke-identiske grupper som danner et ikke-kovalent sammenbundet, stabilt par under egnede betingelser. For eksempel er biotin og avidin (eller streptavidin) prototypiske medlemmer av et komplement- /antikomplementpar. Andre eksempler på komplement-/antikomplementpar omfatter reseptor-/ligandpar, antistoff-/antigen(eller hapten- eller epitop)par, sense-/antisensepolynukleo-tidpar og lignende. Dersom påfølgende dissosiering av komplement- /antikomplementparet er ønskelig, har komplement-/antikomplementparet fortrinnsvis en bindingsaffinitet på < IO<9>M"<1>.

Begrepet "komplementær til et polynukleotidmolekyl" betegner et polynukleotidmolekyl med komplementær basesekvens og reversorientering, sammenlignet med en referansesekvens. For eksempel er sekvensen 5' ATGCACGGG 3' komplementær til 5' CCCGTGCAT 3'.

Begrepet "degenerert nukleotidsekvens" betegner en sekvens av nukleotider som omfatter ett eller flere degenererte kodoner (sammenlignet med et referansepolynukleotidmolekyl som koder for et polypeptid). Degenererte kodoner inneholder forskjellige tripletter av nukleotider, men koder for samme aminosyrerest (f.eks. koder GAU-tripletten og GAC-tripletten begge for Asp).

Begrepet "ekspresjonsvektor" anvendes for å betegne et lineært eller sirkulært DNA-molekyl som omfatter et segment som koder for et polypeptid av interesse, operativt koblet til tilleggssegmenter som sørger for transkripsjon av sekvensen. Slike tilleggssegmenter omfatter promoter- og terminatorsekvenser, og kan også omfatte én eller flere replikasjonsorigo, én eller flere selekterbare markører, en enhancer, et polyadenyler-ingssignal osv. Ekspresjonsvektorer er generelt avledet fra plasmid-DNA eller viralt DNA, eller de kan inneholde elementer fra begge disse.

Begrepet "isolert" anvendt på et polynukleotid angir at polynukleotidet er fjernet fra sitt naturlige genetiske miljø og således er fritt for andre utenforliggende eller uønskede kodende sekvenser, og at det foreligger i en form som er egnet for anvendelse i genetisk modifiserte proteinfremstillings- systemer. Slike isolerte molekyler er molekyler som er separert fra sitt naturlige miljø, og omfatter cDNA og genomiske kloner. Isolerte DNA-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse er fri for andre gener som de normalt er forbundet med, men kan omfatte naturlig forekommende 5'- og 3'-ikke-translaterte områder, f.eks. promoterer og terminatorer. Identifisering av de asso-sierte områder vil være åpenbar for en gjennomsnittsfagmann (se f.eks. Dynan og Tijan, Nature, 316:774-78, 1985).

Et "isolert" polypeptid eller protein er et polypeptid eller protein som foreligger i en tilstand som er forskjellig fra dets naturlige miljø, f.eks. fjernet fra blod og dyrevev. Ved en foretrukket form er det isolerte polypeptid i det vesentlige fritt for andre polypeptider, særlig andre polypeptider med opphav i dyr. Det foretrekkes at polypeptidene tilveiebringes i svært ren tilstand, det vil si mer enn 95 % rene, mer foretrukket mer enn 99 % rene. Anvendt i denne sammenheng utelukker begrepet "isolert" ikke nærvær av samme polypeptid i alternative fysiske former, f.eks. dimerer eller alternativt glykosylerte eller derivatiserte former.

Begrepet "neoplastisk" ved henvisning til celler angir celler som gjennomgår ny og unormal proliferasjon, fortrinnsvis i et vev hvori proliferasjonen er ukontrollert og progressiv, noe som fører til neoplasme. De neoplastiske cellene kan være enten ondartede, det vil si invasive og metastatiske, eller god-artede .

Begrepet "operativt sammenkoblet", anvendt på DNA-segmenter, angir at segmentene er arrangert slik at de fungerer sammen for sine påtenkte formål, f.eks. initieres transkripsjonen i promoteren og forløper gjennom det kodende segment til terminatoren.

Begrepet "ortolog" betegner et polypeptid eller protein erholdt fra en art som er det funksjonelle motstykke til et polypeptid eller protein fra en annen art. Sekvensforskjeller mellom ortologer er et resultat av artsdannelse.

"Paraloger" er forskjellige, men strukturelt beslektede proteiner som lages av en organisme. Paraloger antas å oppstå ved genduplisering. For eksempel er a-globin, (3-globin og myo-globin paraloger av hverandre.

Et "polynukleotid" er en enkelt- eller dobbelttrådet polymer av deoksyribonukleotid- eller ribonukleotidbaser avlest fra 5'- til 3'-enden. Polynukleotider omfatter RNA og DNA og kan isoleres fra naturlige kilder, syntetiseres in vi tro eller fremstilles fra en kombinasjon av naturlige og syntetiske molekyler. Størrelsen på polynukleotider uttrykkes som basepar (forkortet

"bp"), nukleotider ("nt") eller kilobaser ("kb"). Dersom sammen-hengen tillater dette, kan de to siste begrepene beskrive polynukleotider som er enkelttrådede eller dobbelttrådede. Dersom begrepet anvendes på dobbelttrådede molekyler, anvendes det for å angi totallengden, og vil forstås å være ekvivalent med begrepet "basepar". Fagfolk vil forstå at de to tråder i et dobbelttrådet polynukleotid kan være noe forskjellige i lengde, og at endene av trådene kan være forskjøvet i forhold til hverandre som en følge av enzymatisk kutting; således inngår ikke nødvendigvis alle nukleotider i et dobbelttrådet polynukleotidmolekyl i basepar.

Et "polypeptid" er en polymer av aminosyrerester sammenkoblet med peptidbindinger, fremstilt enten naturlig eller syntetisk. Polypeptider med mindre enn ca. 10 aminosyrerester betegnes vanligvis som "peptider".

Begrepet "promoter" anvendes heri i betydningen som er anerkjent innen faget for å betegne en del av et gen som inneholder DNA-sekvenser som muliggjør binding av RNA-polymerase og initiering av transkripsjonen. Promotersekvenser foreligger ofte, men ikke alltid, i de 5<1->ikke-kodende områdene i gener.

Et "protein" er et makromolekyl som omfatter én eller

flere polypeptidkjeder. Et protein kan også omfatte ikke-peptid-bestanddeler, f.eks. karbohydratgrupper. Karbohydrater og andre ikke-peptidsubstituenter kan adderes til et protein ved hjelp av cellen som proteinet fremstilles i, og vil variere med celle-typen. Proteiner defineres heri ut fra deres aminosyreryggrad-strukturer; substituenter som karbohydratgrupper spesifiseres generelt ikke, men kan likevel foreligge.

Begrepet "reseptor" betegner et celleassosiert protein som bindes til et bioaktivt molekyl (det vil si en ligand) og formidler ligandens virkning på cellen. Membranbundne reseptorer særpreges ved en multipeptidstruktur som omfatter et ekstra-cellulært ligandbindende domene og et intracellulært effektor- domene som typisk deltar i signaloverføring. Binding av ligand til reseptor fører til en konformasjonsendring i reseptoren som forårsaker en interaksjon mellom effektordomenet og ett eller flere andre molekyler i cellen. Denne interaksjonen fører i sin tur til en endring i cellens metabolisme. Metabolske begivenheter som er koblet til reseptor-ligandinteraksjoner, omfatter gentranskripsjon, fosforylering, defosforylering, økt produksjon av syklisk AMP, mobilisering av cellulært kalsium, mobilisering av membranlipider, celleadhesjon, hydrolyse av inositollipider og hydrolyse av fosfolipider. Generelt kan reseptorer være membranbundne, cytosoliske eller nukleære, monomere (f.eks. tyreoidstimulerende hormonreseptor, P-adrenerg reseptor) eller multimere (f.eks. PDGF-reseptor, veksthormonreseptor, IL-3-reseptor, GM-CSF-reseptor, G-CSF-reseptor, erytropoietinreseptor og IL-6-reseptor).

Begrepet "sekretorisk signalsekvens" betegner en DNA-sekvens som koder for et polypeptid (et "sekretorisk peptid") som som bestanddel av et større polypeptid styrer det større polypeptidet gjennom en sekretorisk reaksjonsvei i en celle i hvilken det syntetiseres. Det større polypeptidet kløyves vanligvis for fjerning av det sekretoriske peptid under trans-porten gjennom sekresjonsreaksjonsveien.

Begrepet "spleisevariant" anvendes heri for å betegne alternative former av RNA transkribert fra et gen. Spleise-variasjon oppstår naturlig ved anvendelse av alternative spleiseseter i et transkribert RNA-molekyl, eller mindre hyppig mellom separat transkriberte RNA-molekyler, og kan føre til transkripsjon av flere mRNA-typer fra samme gen. Spleisevarianter kan kode for polypeptider som har endret aminosyresekvens. Begrepet spleisevariant anvendes også heri for å betegne et protein som kodes av en spleisevariant av et mRNA transkribert fra et gen.

Molekylvekt og størrelse av polymerer bestemt ved unøyaktige analytiske fremgangsmåter (f.eks. gelelektroforese) vil forstås å være omtrentlige verdier. Dersom en slik verdi uttrykkes som "ca." X eller "omtrent" X, vil den angitte verdi for X forstås å være nøyaktig inntil ± 10 %.

Foreliggende oppfinnelse er delvis basert på oppdagel-sen av en ny DNA-sekvens som koder for et protein som har en fireheliksbunt-cytokinstruktur. Gjennom kloningsprosesser, proliferasjonsanalyser og bindingsundersøkelser som beskrives i detalj heri, er en polynukleotidsekvens som koder for et nytt ligandpolypeptid blitt identifisert, hvor liganden har høy spesifisitet for den hittil "foreldreløse" reseptor zalphall. Denne polypeptidligand, som betegnes zalphall-ligand, ble isolert fra et cDNA-bibliotek dannet fra aktiverte celler fra humant perifert blod (hPBc-er), som ble selektert for CD3. CD3 er en celleoverflatemarkør som er spesiell for celler med lymfoidopphav, særlig for T-celler.

I eksemplene som følger, ble en cellelinje som er avhengig av den"foreldreløse" zalphall-reseptorkoblede reaksjonsvei for overlevelse og vekst i fravær av andre vekstfaktorer, anvendt for søk etter en kilde for cDNA som koder for zalphall-liganden. Den foretrukne vekstfaktoravhengige cellelinje som ble anvendt for transfeksjon og ekspresjon av zalphall-reseptoren, var BaF3 (Palacios og Steinmetz, Cell, 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol., 6:4133-4135, 1986). Imidlertid er andre vekstfaktoravhengige cellelinjer som FDC-Pl (Hapel et al., Blood, 64:786-790, 1984) og M07e (Kiss et al., Leukemia, 7:235-240, 1993) også egnet for dette formål.

Aminosyresekvensen til zalphall-reseptoren viste at den kodede reseptor tilhørte klasse I-cytokinreseptorunderfamilien som omfatter, men ikke er begrenset til, reseptorene for IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF og G-CSF (for en oversikt, se Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily", i Cytokine, 5(2):95-106, 1993). Zalphall-reseptoren er fullt ut beskrevet i den felles eide PCT-patentsøknad nr. US99/22149. Analyse av vevsfordelingen av mRNA for zalphall-reseptoren viste ekspresjon i lymfeknute, leukocytter fra perifert blod (PBL-er), milt, benmarg og brissel. Videre var det rikelig av dette mRNA i Raji-cellelinjen (ATCC nr. CCL-86), som er avledet fra et Burkitts lymfom. Vevsfordelingen av reseptoren tyder på at et mål for den utledede zalphall-ligand er celler fra den hematopoietiske linje, fortrinnsvis lymfoide forløperceller og lymfoide celler. Andre fireheliksbunt-cytokiner som virker på lymfoide celler, omfatter IL-2, IL-4, IL-7 og IL-15. For en oversikt over fireheliksbunt-cytokiner , se Nicola et al., Advances in Protein Chemistry, 52:1-65, 1999, og Kelso, A., Immun. Cell Biol., 76:300-317, 1998.

Kondisjonert medium (CM) fra CD3"-selekterte, PMA-/"Ionomycin"-stimulerte humane celler fra perifert blod under-støttet vekst av BaF3-celler som uttrykte zalphall-reseptoren, og som ellers var avhengige av IL-3. Kondisjonert medium fra celler som ikke var: 1) PMA-/"Ionomycin"-stimulerte, eller som ikke var: 2) CD3-selekterte (med eller uten PMA-/"Ionomycin"-stimulering) understøttet ikke vekst av BaF3/zalphall-reseptorcellene. Kontrolleksperimenter viste at denne proliferative aktivitet ikke kunne tilskrives noen annen kjente vekstfaktorer, og at dette kondisjonerte mediums evne til å stimulere proliferasjon av zalphall-reseptoruttrykkende celler kunne nøytraliseres med en løselig form av reseptoren.

Proliferasjon av zalphall-reseptoruttrykkende BaF3-celler behandlet med CM fra CD3<+->selekterte, PMA-/"Ionomycin"-stimulerte celler fra humant perifert blod ble identifisert ved iakttakelse av kulturene og/eller ved en proliferasjonsanalyse. Mange egnede proliferasjonsanalyser er kjent innen faget og omfatter analyser for reduksjon av et fargestoff som "Alamar Blue"

(AccuMed International, Inc., Westlake, Ohio), 3-(4,5-dimetyl-tiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (Mosman, J. Immunol. Meth., 65:55-63, 1983); 3,(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-3-karboksy-metoksyfenyl-2H-tetrazolium; 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfo-fenyl)-5-[(fenylamino)karbonyl]-2H-tetrazoliumhydroksid; og cyanditolyltetrazoliumklorid (som er kommersielt tilgjengelig fra Polysciences, Inc., Warrington, PA); mitogeneseanalyser som måling av inkorporering av<3>H-tymidin; fargestoffeksklusjons-analyser ved anvendelse av f.eks. naftalensort eller trypanblått; fargestoffopptak ved anvendelse av diacetylfluorescein; og frigjøring av krom. Se generelt Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3. utgave, Wiley-Liss, 1994, som inkorporeres heri ved referanse.

Et cDNA-bibliotek ble fremstilt fra CD3<+->selekterte, PMA- og "Ionomycin"-stimulerte primærceller fra humant perifert blod. cDNA-biblioteket fra de CD3<+->selekterte, PMA- og "Ionomycin"-stimulerte cellene fra humant perifert blod ble oppdelt i porsjoner som inneholdt flere cDNA-molekyler og ble transfektert inn i en vertscellelinje, f.eks. BHK-570-celler (ATCC-aksesjons nummer 10314). De transfekterte vertscellene ble dyrket i et medium som ikke inneholdt eksogene vekstfaktorer, og kondisjonert medium ble oppsamlet. Det kondisjonerte medium ble analysert for evnen til å stimulere proliferasjon av BaF3-celler transfektert med zalphall-reseptoren. cDNA-blandinger som gav kondisjonert medium som stimulerte BaF3/zalphall-reseptorceller, ble identifisert. Dette blandede plasmid-cDNA ble elektroporert inn i E. coli. cDNA ble isolert fra enkeltkolonier og transfektert enkeltvis inn i BHK-57 0-eller. Positive kloner ble identifisert med et positivt resultat i BaF3/zalphall-reseptorproli-ferasjonsanalysen, og spesifisiteten ble analysert ved nøytrali-sering av proliferasjonen ved anvendelse av den løselige zalphall-reseptoren.

En positiv klon ble isolert, og sekvensanalyse viste at polynukleotidsekvensen som inngikk i plasmid-DNA var ny. Den sekretoriske signalsekvens består av aminosyrerestene 1 (Met) til 31 (Gly), og det modne polypeptid består av aminosyrerestene 32 (Gin) til 162 (Ser) (som vist i SEQ ID NO: 2).

Generelt forventes cytokiner å ha en struktur med fire-a-helikser, hvor helikser A, C og D er mest viktige for ligand-reseptorinteraksjonene og er mer konservert blant familiemedlem-mene. Med henvisning til aminosyresekvensen for human zalphall-ligand vist i SEQ ID NO: 2 og sammenstilling av aminosyresekvens til human zalphall-ligand, humant IL-15, humant IL-4 og human GM-CSFforventes det at heliks A i zalphall-ligand er definert ved aminosyrerestene 41-56, heliks B ved aminosyrerestene 69-84, heliks C ved aminosyrerestene 92-105, og heliks D ved aminosyrerestene 135-148, som vist i SEQ ID NO: 2. Strukturanalyse tyder på at A/B-løkken er lang, B/C-løkken er kort, og C/D-løkken er parallell lang. Denne løkkestrukturen fører til en opp-opp-ned-ned-heliksorganisering. Cysteinrestene er absolutt konservert i zalphall-ligand og IL-15, som vist i figur 1. Cysteinrestene som er konservert mellom IL-15 og zalphall-ligand, tilsvarer aminosyrerestene 71, 78, 122 og 125 i SEQ ID NO: 2. Konservering av noen av cysteinrestene finnes også i IL-2, IL-4, GM-CSF og zalphall-ligand, tilsvarende aminosyrerestene 78 og 125 i SEQ ID NO: 2, som vist i figur 1. Konsistent plassering av cystein er ytterligere en bekreftelse på fireheliksbunt-strukturen. Også høyt konservert i familien som omfatter IL-15, IL-2, IL-4, GM- CSFog zalphall-ligand er Glu-Phe-sekvensen som vist i SEQ ID NO: 2 mellom aminosyrerestene 13 6 og 138, som vist i figur 1.

Videre analyse av zalphall-liganden basert på fler-sekvenssammenstillinger (som vist i figur 1) tyder på at aminosyrerestene 44, 47 og 135 (som vist i SEQ ID NO: 2) spiller en viktig rolle for binding av zalphall-ligand til sin tilhørende reseptor. Videre viser den utledede aminosyresekvens for zalphall-ligand fra mus 57 % identitet med det utledede humane protein. Basert på sammenligning av sekvensene for zalphall-ligand fra menneske og mus ble godt konserverte aminosyrerester funnet i områdene som forventes å kode for a-heliksene A og D. De tilsvarende polynukleotider som koder for zalphall-ligand-polypeptidområder, -domener, -motiver, aminosyrerester og -sekvenser som beskrives heri, er som vist i SEQ ID NO: 1.

Detaljert mutasjonsanalyse er blitt utført for IL-4 og IL-2, som begge er nært beslektet med zalphall-ligand. Analyse av muse-IL-2 (Zurawski et al., EMBO J., 12:5113-5119, 1993) viser at aminosyrerester i heliksene A og C er viktige for binding til IL-2Rp; de avgjørende aminosyrerestene er Asp34, Asn99og Asnio3. Flere aminosyrerester i løkke A/B og heliks B i IL-2 fra mus er viktige for IL-2Ra-binding, mens kun en enkelt aminosyrerest, Glni4ii heliks D, er avgjørende for binding til IL-2R0C. På tilsvarende måte er heliksene A og C interaksj onsseter mellom IL-4 og IL-4Ra (som er strukturelt lik IL-2RCC) , og aminosyrerester i heliks D er avgjørende for interaksjonen med IL-2RCX(Wang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 54:1657-1662, 1997; Kruse et al., EMBO J., 11:3237-3244, 1992). Nærmere bestemt fører mutasjon av Tyri24til Asp i humant IL-4 til en antagonist som bindes til IL-4R(X, men ikke til IL-2R0C, og som derfor ikke kan signalisere (Kruse et al., ibid., 1992).

Mens heliks A er relativt godt konservert mellom zalphall-ligand fra menneske og mus, er heliks C mer divergent. Siden begge arter har et overskudd av sure aminosyrerester i dette området, kan forskjellene tilskrives artsspesifisitet i interaksjonen mellom zalphall-ligand og den tilhørende reseptor av "P"-type. Løkke A/B og heliks B i zalphall-ligand er godt konservert mellom forskjellige arter; selv om ingen reseptor-subenhet som tilsvarer IL-2Ra hittil er blitt identifisert, tyder konservasjonen i dette området på at det er funksjonelt signifikant. D-heliksene i zalphall-ligand fra menneske og mus er også svært konservert. Zalphall-reseptorantagonister kan utformes ved mutasjoner i heliks D i zalphall-liganden. Disse kan omfatte avkorting av proteinet fra aminosyreresten Glni45(SEQ ID NO: 2) eller mutasjoner av Glni45eller Ilei48(i SEQ ID NO: 2 ; tilsvarende Tyri24i humant IL-4) til aminosyrerester som Ala eller Asp. Enhver mutasjon som ødelegger heliksstrukturen i zalphall-ligand, kan forhindre binding til reseptoren og således inhibere signalisering.

Fireheliksbunt-cytokiner kan også grupperes ut fra lengden av de inngående helikser. Cytokiner med"lang heliks"-form inneholder generelt helikser som består av mellom 24 og 30 aminosyrerester og omfatter IL-6, ciliær nøytrotrofisk faktor (CNTF), leukemiinhiberende faktor (LIF) og humant veksthormon (hGH). Cytokiner med "kort heliks"-form inneholder generelt helikser på mellom 18 og 21 aminosyrerester og omfatter IL-2, IL-4 og GM-CSF. Zalphall antas å være et nytt medlem av cytokin-gruppen med kort heliks. Undersøkelser som benyttet CNTF og IL-6, viste at en CNTF-heliks kan erstatte den tilsvarende heliks i IL-6 og i CNTF-bindende egenskaper til det kimære molekyl. Det ser således ut til at funksjonelle domener i fireheliks-cytokinene avgjøres ut fra strukturell homologi, uavhengig av sekvensidentitet, og kan opprettholde funksjonell integritet i en kimære (Kallen et al., J. Biol. Chem., 274:11859-11867, 1999) . Heliksdomenene i zalphall-liganden vil derfor være anvendbare for fremstilling av kimære fusjonsmolekyler, særlig med andre cytokiner med kort heliks-form, for å bestemme og modulere den reseptorbindende spesifisitet. Av spesiell interesse er fusjonsproteiner utformet med heliks A og/eller heliks D, og fusjonsproteiner som kombinerer heliksdomener og løkke-domener fra andre cytokiner med kort heliks, f.eks. IL-2, IL-4, IL-15 og GM-CSF. Aminosyrerestene som utgjør heliksene A, B, C og D, samt løkkene A/B, B/C og C/D for zalphall-ligand, IL-2, IL-4, IL-15 og GM-CSF, er vist i tabell 1.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte polynukleotidmolekyler, innbefattet DNA- og RNA-molekyler, som koder for zalphall-ligandpolypeptidene beskrevet heri. Fagfolk vil lett forstå at ut fra den genetiske kodes degenererthet er betydelig sekvensvariasjon mulig blant disse polynukleotidmolekylene. SEQ ID NO: 3 er en degenerert DNA-sekvens som omfatter alle DNA-er som koder for zalphall-ligandpolypeptidet ifølge SEQ ID NO: 2. Fagfolk vil forstå at den degenererte sekvens i SEQ ID NO: 3 også tilveiebringer alle RNA-sekvenser som koder for SEQ ID NO: 2 ved å erstatte T med U. Således omfattes zalphall-ligandpolypeptidkodende polynukleotider som omfatter sekvensen fra nukleotid 1 eller 97 til nukleotid 486 i SEQ ID NO: 3, og RNA-ekvivalentene av disse, av foreliggende oppfinnelse. Tabell 2 beskriver enbokstavkoden som anvendes i SEQ ID NO: 3 for å angi degenererte nukleotidposisjoner. "Betydning" er nukleotidene som angis av en kodebokstav. "Komplementær" angir koden for det eller de komplementære nukleotid(er). For eksempel angir koden Y enten C eller T, og den komplementære kode R angir A eller G, hvor A er komplementær til T, og G er komplementær til C.

De degenererte kodoner som anvendes i SEQ ID NO: 3, som omfatter alle mulige kodoner for en gitt aminosyre, er beskrevet i tabell 3.

En gjennomsnittsfagperson vil innse at en viss ambi-guitet innføres ved bestemmelse av et degenerert kodon som skal kunne representere alle mulige kodoner som koder for en gitt aminosyre. For eksempel kan det degenererte kodon for serin (WSN) i noen tilfeller kode for arginin (AGR), og det degenererte kodon for arginin (MGN) kan i noen tilfeller kode for serin (AGY). Et lignende forhold foreligger mellom kodoner som koder for fenylalanin og leucin. Således kan noen polynukleotider som omfattes av den degenererte sekvens kode for varianter av aminosyresekvensen, men en gjennomsnittsfagperson kan lett identifisere slike variantsekvenser ved henvisning til aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2. Variantsekvenser kan lett analyseres for funksjonalitet, som beskrevet heri.

En gjennomsnittsfagperson vil også innse at forskjellige arter kan vise "preferensiell kodonbruk". Se generelt Grantham et al., Nuc. Acids Res., 8:1893-912, 1980; Haas et al., Curr. Biol., 6:315-24, 1996; Wain-Hobson et al., Gene, 13:355-64, 1981; Grosjean og Fiers, Gene, 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res., 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol., 158:573-97, 1982. Som anvendt heri, er begrepet"preferensiell kodonbruk" eller "preferensielle kodoner" et fagbegrep som viser til de proteintranslasjonskodoner som benyttes mest hyppig i celler fra en viss art, slik at én eller noen få representanter for de mulige kodoner som koder for en gitt aminosyre favoriseres (se tabell 3). For eksempel kan aminosyren treonin (Thr) kodes av ACA, ACC, ACG eller ACT, men i pattedyrceller er ACC det hyppigst anvendte kodon; i andre arter, f.eks. insektceller, gjær, virus eller bakterier, kan andre Thr-kodoner være foretrukket. Preferensielle kodoner for en gitt art kan innføres i polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse ved en rekke fremgangsmåter som er kjent innen faget. Innføring av preferensielle kodonsekvenser i rekombinant DNA kan f.eks. gi for-høyet produksjon av proteinet ved at proteintranslasjonen gjøres mer effektiv i en gitt celletype eller -art. Den degenererte kodonsekvens som gis i SEQ ID NO: 3, fungerer derfor som templat for optimalisering av ekspresjonen av polynukleotider i forskjellige celletyper og -arter som hyppig anvendes innen faget, og som beskrives heri. Sekvenser som omfatter preferensielle kodoner, kan analyseres og optimaliseres for ekspresjon i forskjellige arter og analyseres for funksjonalitet, som beskrevet heri.

Som tidligere angitt, omfatter de isolerte polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse DNA og RNA. Fremgangsmåter for fremstilling av DNA og RNA er vel kjent innen faget. Generelt isoleres RNA fra et vev eller en celletype som produserer store mengder zalphall-ligand-RNA. Slike vev og celler identifiseres ved Northern-blotting (Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 77:5201, 1980) eller ved analyse av kondisjonert medium fra forskjellige celletyper for aktivitet på målceller eller -vev. Når først aktiviteten eller den RNA-produserende celle eller det produserende vev er identifisert, kan total-RNA fremstilles ved anvendelse av guanidiniumisotiocyanatekstrak-sjon, fulgt av isolering ved sentrifugering i en CsCl-gradient (Chirgwin et al., Biochemistry, 18:52-94, 1979). Poly(A)<+->RNA fremstilles fra total-RNA ved anvendelse av fremgangsmåten til Aviv og Leder (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 65:1408-12, 1972). Komplementært DNA (cDNA) fremstilles fra poly(A)<+->RNA ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Alternativt kan genomisk DNA isoleres. Polynukleotider som koder for zalphall-ligandpolypeptider, identifiseres så og isoleres ved f.eks. hybridisering eller PCR.

En fullengdeklon som koder for zalphall-ligand, kan erholdes ved konvensjonelle kloningsfremgangsmåter.Kloner av komplementært DNA (cDNA) foretrekkes, selv om det for noen anvendelser (f.eks. ekspresjon i transgene dyr) kan være å foretrekke å anvende en genomisk klon eller å modifisere en cDNA-klon slik at den omfatter minst ett genomisk intron. Fremgangsmåte for fremstilling av cDNA-kloner og genomiske kloner er vel kjent og ligger innenfor det ordinære kunnskapsnivå innen faget, og omfatter anvendelse av sekvensen som beskrives heri eller deler av denne for analyse eller priming av et bibliotek. Ekspresjonsbiblioteker kan analyseres med antistoffer mot zalphall-reseptorfragmenter eller andre spesifikke bindings-partnere.

Zalphall-ligandpolynukleotidsekvensene som beskrives heri, kan også anvendes som prober eller primere for kloning av 5<1->ikke-kodende områder fra et zalphall-ligandgen. I lys av den vevsspesifikke ekspresjon som observeres for zalphall-ligand forventes dette genområdet å gi spesifikk ekspresjon i hematopoietiske celler og lymfoide celler. Promoterelementer fra et zalphall-ligandgen kan således anvendes for å styre vevsspesifikk ekspresjon av heterologe gener i f.eks. transgene dyr eller pasienter som behandles med genterapi. Kloning av 5'-flankerende sekvenser letter også produksjon av zalphall-ligandproteiner ved "genaktivering", som beskrevet i US patentskrift nr. 5 641 670. Kort beskrevet endres ekspresjonen av et endogent zalphall-ligandgen i en celle ved å innføre i zalphall-ligandstedet en DNA-konstruksjon som omfatter minst én målrettet sekvens, en regulatorisk sekvens, et ekson og et uparet spleisedonorsete. Den målrettede sekvensen er en 5'-ikke-kodende sekvens fra en zalphall-ligand som muliggjør homolog rekombinasjon mellom konstruksjonen og det endogene zalphall-ligandsted, hvorved sekvensene i konstruksjonen blir operativt koblet til den endogene zalphall-ligandkodende sekvens. På denne måten kan en endogen zalphall-ligandpromoter erstattes med eller suppleres med andre regulatoriske sekvenser som gir forsterket vevsspesifikk eller på annet vis regulert ekspresjon.

Tilsvarende polypeptider og polynukleotider kan finnes i andre arter (ortologer). Disse artene omfatter, men er ikke begrenset til, pattedyr, fugler, amfibier, reptiler, fisk, insekter og andre vertebratarter og invertebratarter. Av spesiell interesse er zalphall-ligandpolypeptider fra andre pattedyrarter, innbefattet mus, svin, sau, storfe, hund, katt, hest og andre primater. Ortologer av human zalphall-ligand kan klones ved anvendelse av informasjon og sammensetninger som tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse kombinert med konvensjonelle kloningsteknikker. For eksempel kan et cDNA klones ved anvendelse av mRNA erholdt fra et vev eller en celletype som uttrykker zalphall-ligand, som beskrevet heri. Egnede mRNA-kilder kan identifiseres ved analyse av Northern-blot med prober utformet fra sekvensene som beskrives heri. Et bibliotek fremstilles så fra mRNA fra et positivt vev eller en positiv cellelinje. Et zalphall-ligandkodende cDNA kan så isoleres ved en rekke fremgangsmåter, f.eks. ved analyse med et helt humant cDNA eller deler av dette, eller med ett eller flere sett av degenererte prober basert på de beskrevne sekvenser. Et cDNA kan også klones ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen eller PCR (Mullis, US patentskrift nr. 4 683 202) ved anvendelse av primere utformet fra den representative humane zalphall-ligandsekvens som beskrives heri. I ytterligere en fremgangsmåte kan cDNA-biblioteket anvendes for transformasjon eller transfeksjon av vertsceller, og ekspresjon av cDNA av interesse kan påvises med et antistoff mot zalphall-ligandpolypeptid, bindingsundersøkelser eller aktivitetsanalyser. Lignende teknikker kan også anvendes for isolering av genomiske kloner.

Polynukleotidsekvensen for museortologen til zalphall-ligand er blitt identifisert og vises i SEQ ID NO: 55, og den tilsvarende aminosyresekvens vises i SEQ ID NO: 56. NCBI, GENBANK, Aksesjonsnummer AA764063, 1998.01.27, viser en cDNA-sekvens på 535 basepar isolert fra thymus fra mus.

Det er 62 % identitet mellom musesekvensen og den humane sekvens over et område på 124 aminosyrer som tilsvarer aminosyrerestene 30-153 i SEQ ID NO: 2 og aminosyrerestene 23-146 i SEQ ID NO: 56. Den modne sekvens for zalphall-ligand fra mus begynner formodentlig ved Hisi8(som vist i SEQ ID NO: 56), som tilsvarer His25(som vist i SEQ ID NO: 2) i den humane sekvens. Siden en avkortet form av det humane polypeptid er aktiv, er det sannsynlig at et ekvivalent polypeptid fra zalphall-ligand fra mus (det vil si uten aminosyrerestene Hisistil Pro22i SEQ ID NO: 56) også er aktivt. Vevsanalyser viste at ekspresjon av zalphall-ligand i mus kan påvises i testis, milt og brissel.

Fagfolk vil innse at sekvensen som beskrives i SEQ ID NO: 1, representerer ett enkelt allel av human zalphall-ligand, og at allelisk variasjon og alternativ spleising kan forventes å forekomme. Alleliske varianter av denne sekvens kan klones ved å analysere cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer ifølge standardfremgangsmåter. Alleliske varianter av DNA-sekvensen som vises i SEQ ID NO: 1, innbefattende varianter som inneholder tause mutasjoner og varianter i hvilke mutasjonene fører til aminosyresekvensendringer, ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område, likeså proteiner som er alleliske varianter av SEQ ID NO: 2. cDNA dannet fra alternativt spleiset mRNA og som bibeholder egenskapene til zalphall-ligandpolypeptidet, ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område, likeså polypeptider som kodes av slike cDNA-er og mRNA-er.Alleliske varianter og spleisevarianter av disse sekvensene kan klones ved å analysere cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer eller vev ifølge standardfremgangsmåter som er kjent innen faget.

Zalphall-ligandgenet er blitt kartlagt til IL-2-ramme-verksmarkøren SHGC-12342, noe som plasserer zalphall-ligand ca. 180 kb fra IL-2-markøren. Anvendelse av omliggende markører plasserer zalphall-ligandgenet i 4q27-området i det integrerte LDB-kromosom 4-kart (The Genetic Location Database, University of Southampton). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også reagenser som kan brukes i diagnostiske anvendelser. For eksempel kan zalphall-ligandgenet, en probe som omfatter zalpha-11-ligand-DNA eller -RNA eller en subsekvens fra disse anvendes for å fastslå hvorvidt zalphall-ligandgenet foreligger i et humant kromosom, f.eks. kromosom 4, eller hvorvidt en genmuta-sjon har skjedd. Basert på beskrivelsen av et fragment av humant genomisk DNA som inneholder en del av genomisk zalphall-ligand-DNA (Genbank-aksesjonsbetegnelse AC007458) er zalphall-liganden lokalisert til 4q27-området i kromosom 4. Påvisbare kromosom-forstyrrelser i zalphall-ligandgenstedet omfatter, men er ikke begrenset til, aneuplodi, genkopitallendringer, tap av hetero-zygositet (LOH), translokasjoner, innføyelser, delesjoner, restriksjonsseteendringer og -rearrangementer. Slike forstyrrel ser kan påvises ved anvendelse av polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse ved å benytte molekylærgenetiske teknikker, f.eks. analyse av restriksjonsfragmentlengdepolymorfi (RFLP), analyse av korte tandemrepetisjoner (STR) ved anvendelse av PCR-teknikker, og andre analyseteknikker for genetisk kobling som er kjent innen faget (Sambrook et al., ibid. ; Ausubel et. al., ibid. ; Marian, Chest, 108:255-65, 1995).

Nøyaktig kunnskap om et gens posisjon kan være nyttig av mange grunner, innbefattet: 1) bestemmelse av hvorvidt en sekvens er del av et eksisterende "contig", og erholdelse av ytterligere omliggende genetiske sekvenser i forskjellige former, f.eks. som YAC-er, BAC-er eller cDNA-kloner; 2) erholdelse av et mulig kandidatgen for en arvelig sykdom som viser kobling til det samme kromosomale området; og 3) kryssreferanser til modellorganismer, f.eks. mus, som kan bidra til å fastslå hvilken funksjon et gitt gen kan ha.

Som allerede angitt, ligger det humane zalphall-ligandgen nær IL-2-genet, som foreligger i et område i kromosom 4q som er blitt vist å være koblet til følsomhet for inflammatorisk tarmsykdom (IBD) (innbefattet Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt) i noen familier (Hampe et al., Am. J. Hum. Genet., 64:808-816, 1999; Cho et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 55:7502-7507, 1998). I tillegg er zalphall-reseptorgenet kartlagt til 16pll, et annet genomisk område som er forbundet med følsomhet overfor CD (Hugot et al., Nature, 375:821-823, 1996; Ohmen et al., Hum. Mol. Genet., 5:1679-1683, 1996). CD er en kronisk inflammasjon av tarmen med hyppig systemisk omfang; selv om den nøyaktige etiologi er ukjent, er immunregulatorisk dysfunksjon som omfatter manglende toleranse overfor vanlige tarmantigener en hovedkomponent (for oversikter, se Braegger et al., Annals Allergy, 72:135-141, 1994; Sartor, Am. J. Gastroenterol., 52:5S-11S, 1997)). Flere undersøkelser har funnet unormal NK-aktivitet hos CD-pasienter (se f.eks. Egawa et. al., J. Clin. Lab. Immunol., 20:187-192, 1986; Aparicio-Pagés et al., J. Clin. Lab. Immunol., 25:119-124, 1989; van Tol et al., Scand. J. Gastroenterol., 27:999-1005, 1992)), og defekt dannelse av hukommel-ses-B-celler er også blitt dokumentert (Brogan et al., J. Clin. Lab. Immunol., 24:69-74, 1987). Siden zalphall-ligand spiller en rolle i immunreguleringen, og siden genene for både reseptor og ligand ligger innenfor CD-følsomhetsområder, er både reseptor og ligand kandidatgener for genetisk utsatthet for Crohns sykdom.

Bestemmelse av i hvilken grad zalphall-reseptor og/eller zalphall-ligand deltar i sykdomsutviklingen ved IBD, kan oppnås ved flere fremgangsmåter. Sekvensering av eksoner fra genomisk DNA kan avsløre kodende mutasjoner (innbefattet mis-sensemutajoner, nonsensemutasjoner og mutasjoner som forskyver leserammen), likeså kan sekvensering av cDNA. Ytterligere en fordel ved å sekvensere fra genomisk DNA er at spleiseoverganger også inngår i de sekvenserte fragmentene og kan avsløre spleise-unormaliteter som ikke foreligger i cDNA-prøver dersom f.eks. feilspleisede RNA-er degraderes hurtig. Den genomiske struktur av zalphall-ligand er blitt bestemt. Andre fremgangsmåter for analyse av zalphall-ligand og -reseptor i IBD-pasenter omfatter: (1) måling av ligandproduksjonen fra aktiverte T-celler fra pasienter sammenlignet med normale kontroller (det vil si ved bioanalyse); (2) in situ-hybridisering av zalphall-reseptor-RNA eller zalphall-ligand-RNA til vevssnitt fra inflammert tarm fra IBD-pasienter, sammenlignet med tilsvarende snitt fra normale kontroller; (3) immunhistokjemisk analyse av snitt fra IBD-pasienter sammenlignet med normale kontroller; og (4) måling av responsiviteten til perifere B-celler fra pasienten overfor zalphall-ligand, målt ved mitogeneseanalyser.

Et diagnostisk middel kunne hjelpe leger til å bestemme sykdomstypen og egnet behandling forbundet med denne, og kunne også være en hjelp ved genetisk rådgivning. Som sådanne kan anti-zalphall-ligandantistoffene, polynukleotidene og polypeptidene ifølge oppfinnelsen anvendes for påvisning av zalphall-ligandpolypeptid, -mRNA eller anti-zalphall-ligandantistoffer, og således fungere som markører og anvendes direkte for påvisning av genetiske sykdommer eller cancere, som beskrevet heri, ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget og som beskrives heri. Videre kan zalphall-ligandpolynukleotidprober anvendes for å påvise unormaliteter som omfatter kromosom 4q27, som beskrevet heri. Disse unormalitetene kan være forbundet med humane sykdommer eller tumorigenese, spontan abort eller andre genetiske forstyrrelser. Således kan zalphall-ligandpolynukleotidprober anvendes for å påvise unormaliteter eller genotyper som er forbundet med disse defekter.

Som diskutert ovenfor, kan defekter i zalphall-ligandgenet selv føre til en arvelig human sykdomstilstand. Molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. polypeptidene, antago-nistene, agonistene, polynukleotidene og antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan bidra til påvisning, diagnose, forebyggelse og behandling av sykdommer forbundet med en genetisk zalphall-liganddefekt. I tillegg kan zalphall-ligandpolynukleotidprober anvendes for å påvise alleliske forskjeller mellom syke og friske individer i det kromosomale sted for zalphall-ligand. Som sådanne kan zalphall-ligandsekvensene anvendes som diagnostiske midler i rettsmedisinsk DNA-profiler-ing.

Generelt er de diagnostiske fremgangsmåter som anvendes i genetisk koblingsanalyse for å påvise en genetisk unormalitet eller et genetisk avvik hos en pasient, kjent innen faget. De fleste diagnostiske fremgangsmåter omfatter trinnene: (i) erholdelse av en genetisk prøve fra en muligens syk pasient, en syk pasient eller en frisk, mulig bærer av et recessivt sykdoms-allel; (ii) dannelse av et første reaksjonsprodukt ved å inkubere den genetiske prøve med en zalphall-ligandpolynukleo-tidprobe, hvori polynukleotidet vil hybridisere til den komplementære polynukleotidsekvens, f.eks. i RFLP-analyse, eller ved å inkubere den genetiske prøve med "sense"- og "antisense"-primere i en PCR-reaksjon under egnede PCR-reaksjonsbetingelser;

(iii) synliggjøring av det første reaksjonsprodukt ved gelelektroforese og/eller andre kjente fremgangsmåter, f.eks. synlig-gjøring av det første reaksjonsprodukt med en zalphall-ligand-polynukleotidprobe, hvori polynukleotidet vil hybridisere til den komplementære polynukleotidsekvens i den første reaksjonsblanding; og (iv) sammenligning av det synliggjorte første reaksjonsprodukt og et andre kontrollreaksjonsprodukt fra en genetisk prøve fra et normalt individ eller et kontrollindivid. En forskjell mellom det første reaksjonsprodukt og kontroll-reaks jonsproduktet tyder på en genetisk unormalitet i den syke eller muligens syke pasient, eller nærvær av en heterozygotisk recessiv bærerfenotype for en frisk pasient, eller nærvær av en genetisk defekt i en tumor fra en syk pasient, eller nærvær av en genetisk unormalitet i et foster eller et preimplantasjons-embryo. For eksempel tyder en forskjell i restriksjonsfragment- mønsteret, lengden av PCR-produkter, lengden av repetitive sekvenser i det genetiske sted for zalphall-ligand og lignende på en genetisk unormalitet, et genetisk avvik eller en allelisk forskjell, sammenlignet med den normale kontroll. Kontrollene kan være fra friske familiemedlemmer eller fra ubeslektede individer, avhengig av analysen og tilgjengeligheten på prøver. Genetiske prøver for anvendelse innen foreliggende oppfinnelse omfatter genomisk DNA, mRNA og cDNA isolert fra ethvert vev eller en annen biologisk prøve fra en pasient, f.eks. men ikke begrenset til, blod, spytt, sæd, embryoceller, amnionvæske og lignende. Polynukleotidproben eller primeren kan være RNA eller DNA og vil omfatte en del av SEQ ID NO: 1, den komplementære sekvens til SEQ ID NO: 1 eller en RNA-ekvivalent av disse. Slike fremgangsmåter for å vise genetisk koblingsanalyse for humane sykdomsfenotyper er vel kjent innen faget. For en henvisning til PCR-baserte fremgangsmåter innen diagnose, se generelt Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc., 1991); White (red.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc., 1993); Cotter (red.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc., 1996); Hanausek og Walaszek (red.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998); Lo (red.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc., 1998); og Meltzer (red.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998) .

Mutasjoner forbundet med zalphall-ligandsted kan påvises ved anvendelse av nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse ved å benytte standardfremgangsmåter for direkte mutasjonsanalyse, f.eks. analyse av restriksjonsfragmentlengdepolymorfi, analyse av korte tandemrepetisjoner ved anvendelse av PCR-teknikker, analyse ved amplifikasjonsrefraktoriske muta-sjons systemer, påvisning av enkelttråd-konformasjonspolymorfi, RNase-kuttingsfremgangsmåter, denaturerende gradientgelelektro-forese, fluorescensassistert feiltilpasningsanalyse og andre genetiske analyseteknikker som er kjent innen faget (se f.eks. Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc., 1991); Marian, Chest, 108:255 (1995); Coleman og Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc., 1996); Elles (red.), Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996);Landegren (red.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press, 1996); Birren et al. (red.), Genome Analysis, vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998); Dracopoli et al. (red.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998); og Richards og Ward, "Molecular Diagnostic Testing," i Principles of Molecular Medicine. s. 83-88 (Humana Press, Inc., 1998). Direkteanalyse av et zalphall-gen for en mutasjon kan utføres ved å anvende genomisk DNA fra et individ. Fremgangsmåter for amplifisering av genomisk DNA, f.eks. erholdt fra lymfocytter fra perifert blod, er vel kjent blant fagfolk (se f.eks. Dracopoli et al. (red.), Current Protocols in Human Genetics,

s. 7.1.6-7.1.7 (John Wiley&Sons 1998)).

Intronposisjoner i zalphall-ligandgenet ble bestemt ved å identifisere genomiske kloner, etterfulgt av sekvensering av

intron-/eksonovergangene. Det første intron ligger mellom aminosyrerest 56 (Leu) og aminosyrerest 57 (Val) i SEQ ID NO: 2 og er 115 basepar langt. Det andre intron er det største med 4,4 kilobaser og ligger mellom aminosyrerest 68 (Glu) og aminosyrerest 69 (Thr) i SEQ ID NO: 2. Det tredje intron er på 2,6 kilobaser og ligger mellom aminosyrerest 120 (Leu) og aminosyrerest 121 (Thr) i SEQ ID NO: 2. Det siste intronet, som er 89 basepar langt, ligger mellom aminosyrerest 146 (Lys) og aminosyrerest 147 (Met) i SEQ ID NO: 2. Det fullstendige gen spenner over ca.

8 kb.

Strukturen til zalphall-ligandgenet ligner på strukturen til IL-2-genet (Fujita et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 80:7437-7441, 1983), selv om zalphall-ligandgenet inneholder et ekstra intron (intron 4). Mønsteret med et kort første intron og et langt andre og tredje intron er konservert mellom de to genene, selv om IL-2-genet totalt sett er noe mindre (ca. 6 kb). IL-15-genet derimot består av 8 eksoner og spenner over minst 34 kb (Anderson et al., Genomics, 25:701-706, 1995). Således er strukturen til zalphall-ligandgenet mer lik strukturen til IL-2-genet enn IL-15-genet.

I utførelser av oppfinnelsen kan isolerte zalphall-ligandkodende nukleinsyremolekyler hybridisere under stringente betingelser til nukleinsyremolekyler som har nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1, til nukleinsyremolekyler som har nukleotidsekvensen fra nukleotid 47 til 532 i SEQ ID NO: 1, eller til nukleinsyremolekyler som har en nukleotidsekvens som er komplementær til SEQ ID NO: 1. Generelt utvelges stringente betingelser slik at de ligger ca. 5 °C lavere enn det termale smeltepunkt (Tm) for den angjeldende sekvens ved definert ionestyrke og pH. Tm er den temperatur (under definert ionestyrke og pH) ved hvilken 50 % av målsekvensen hybridiserer til en perfekt tilpasset probe.

Et nukleinsyremolekylpar, f.eks. DNA-DNA, RNA-RNA og DNA-RNA, kan hybridisere dersom nukleotidsekvensene har en viss grad av komplementaritet. Hybrider kan tolerere feiltilpassede basepar i dobbeltheliksen, men hybridens stabilitet påvirkes av graden av feiltilpasning. Tm for den feiltilpassede hybrid reduseres med 1 °C for hver 1-1,5 % baseparfeiltilpasning. Variasjon av stringensen under hybridiseringsbetingelsene muliggjør kontroll over graden av feiltilpasning som vil foreligge i hybriden. Stringensgraden øker med økende hybridiseringstempe-ratur og avtakende ionestyrke i hybridiseringsbufferen.

En fagmann vil kunne tilpasse disse betingelsene for anvendelse med en gitt polynukleotidhybrid. Tm for en gitt mål-sekvens er den temperatur (under definerte betingelser) hvor 50 % av målsekvensen vil hybridisere til en perfekt tilpasset probesekvens. Betingelsene som vil påvirke Tm, omfatter størrelse og baseparinnhold i polynukleotidproben, ionestyrken i hybridi-seringsløsningen og nærvær av destabiliseringsmidler i hybridi-seringsløsningen. En rekke ligninger for beregning av Tm er kjent innen faget og er spesifikke for DNA, RNA og DNA-RNA-hybrider og polynukleotidprobesekvenser av varierende lengde (se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave (Cold Spring Harbor Press, 1989); Ausubel et al.

(red.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1987); Berger og Kimmel (red.), Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., 1987); og Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26:221 (1990)). Sekvensanalyse-programvare, slik som OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) og Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA), så vel som hjemmesider på Internett, er tilgjengelige verktøy for analyse av en gitt sekvens og beregning av Tm basert på bruker-definerte kriterier. Slike programmer kan også analysere en gitt sekvens under definerte betingelser og identifisere egnede

probesekvenser. Hybridisering av lengre polynukleotidsekvenser,

> 50 basepar, utføres typisk ved temperaturer som ligger ca. 20-25 °C under den beregnede Tm. For mindre prober, < 50 basepar, utføres hybridiseringen typisk ved Tm eller 5-10 °C under den beregnede Tm. Dette muliggjør maksimal hybridiseringshastighet for DNA-DNA og DNA-RNA-hybrider.

Etter hybridiseringen kan nukleinsyremolekylene vaskes for å fjerne ikke-hybridiserte nukleinsyremolekyler under stringente betingelser eller under svært stringente betingelser. Typiske stringente vaskebetingelser omfatter vask i en løsning av 0,5 x-2 x SSC, med 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) ved 55-65 °C. Det vil si at nukleinsyremolekyler som koder for et variant-zalphall-ligandpolypeptid, hybridiserer med et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (eller den komplementære sekvens) under stringente vaskebetingelser, hvor vaskestringensen tilsvarer 0,5 x-2 x SSC, med 0,1 % SDS ved 55-65 °C, innbefattende 0,5 x SSC med 0,1 % SDS ved 55 °C, eller 2 x SSC med 0,1 % SDS ved 65 °C. En fagperson vil lett kunne utforme ekvivalente betingelser, f.eks. ved å erstatte SSC med SSPE i vaskeløsningen.

Typiske svært stringente vaskebetingelser omfatter vask i en løsning av 0,1 x-0,2 x SSC, med 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) ved 50-65 °C. Med andre ord hybridiserer nukleinsyremolekyler som koder for et variant-zalphall-ligandpolypeptid med et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (eller den komplementære sekvens) under svært stringente vaskebetingelser, hvor vaskestringensen tilsvarer 0,1 x-0,2 x SSC, med 0,1 % SDS ved 50-65 °C, innbefattende 0,1 x SSC med 0,1 % SDS ved 50 °C, eller 0,2 x SSC med 0,1 % SDS ved 65 °C.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også isolerte zalphall-ligandpolypeptider som har en sekvens som i det vesentlige ligner sekvensen til polypeptidene ifølge SEQ ID NO: 2 eller deres ortolog, fra mus. Begrepet "sekvens som i det vesentlige ligner" anvendes heri for å betegne polypeptider som omfatter minst 90 %, minst 95 % eller mer enn 95 % sekvensidentitet med sekvensene vist i SEQ ID NO: 2 eller deres ortolog, fra mus. Foreliggende oppfinnelse omfatter også polypeptider som omfatter en aminosyresekvens med minst 90 %, minst 95 % eller mer enn 95 % sekvensidentitet med sekvensen mellom aminosyrerestene 1 og 162 eller 33 og 162 i SEQ ID NO: 2. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre nukleinsyremolekyler som koder for slike polypeptider. Fremgangsmåter for å bestemme prosent identitet beskrives nedenfor.

Variant-zalphall-ligandnukleinsyremolekyler kan identifiseres ved anvendelse av to kriterier: bestemmelse av graden av likhet mellom det kodede polypeptid og aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, og/eller en hybridiseringsanalyse som beskrevet ovenfor. Slike zalphall-ligandvarianter omfatter nukleinsyremolekyler som: (1) hybridiserer med et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (eller den komplementære sekvens) under stringente vaskebetingelser, hvor vaskestringensen tilsvarer 0,5 x-2 x SSC, med 0,1 % SDS ved 55-65 °C; eller (2) koder for et polypeptid med minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 % eller mer enn 95 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2. Alternativt kan zalphall-ligandvarianter karakteriseres som nukleinsyremolekyler som: (1) hybridiserer med et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (eller den komplementære sekvens) under svært stringente vaskebetingelser, hvor vaskestringensen tilsvarer 0,1 x-0,2 x SSC, med 0,1 % SDS ved 50-65 °C; og (2) koder for et polypeptid med minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 % eller mer enn 95 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

Prosent sekvensidentitet bestemmes ved konvensjonelle fremgangsmåter. Se f.eks. Altschul et al., Bull. Math. Bio., 48:603 (1986); og Henikoff og Henikoff, Proe.Nati. Acad. Sei., USA, 85:10915 (1992). Kort beskrevet sammenstilles to aminosyre-sekvenser slik at poengsummen for sammenstillingen optimaliseres ved anvendelse av en gapåpningsstraff på 10, en gaputvidelsesstraff på 1 og poengmatrisen "BLOSUM62", utarbeidet av Henikoff ogHenikoff { ibid.), som vist i tabell 4 (aminosyrene er angitt med standard enbokstavkoder).

Fagfolk vil vite at det finnes mange tilgjengelige etablerte algoritmer for sammenstilling av to aminosyresekven-ser. Likhetssøkalgoritmen "FASTA" utviklet av Pearson og Lipman er en egnet proteinsammenstillingsfremgangsmåte for å undersøke graden av identitet mellom en aminosyresekvens som beskrevet heri og aminosyresekvensen til en mulig zalphall-ligandvariant. FASTA-algoritmen beskrives av Pearson og Lipman, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 85:2444 (1988), og av Pearson,Meth. Enzymol., 183:63 (1990).

Kort beskrevet bestemmer FASTA først sekvenslikheten ved å identifisere områder som er felles for spørresekvensen (f.eks. SEQ ID NO: 2) og en analysesekvens, og som enten har den høyeste tetthet av identiteter (dersom variabelen ktup er 1) eller par av identiteter (dersom ktup = 2), uten å ta i betraktning konservative aminosyresubstitusjoner, -innføyelser eller

-delesjoner. De ti områdene med den høyeste tetthet av identiteter analyseres så på nytt ved å sammenligne likheten mellom alle parede aminosyrer ved anvendelse av en aminosyresubsti-tusjonsmatrise, og områdenes ender "trimmes", slik at de bare omfatter aminosyrerester som bidrar til den høyeste poengsum. Dersom det er flere områder med poengsummer som er høyere enn "grense"-verdien (beregnet ved en på forhånd bestemt formel basert på sekvensens lengde og ktup-verdien), undersøkes de trimmede utgangsområdene for å fastslå hvorvidt områdene kan sammenkobles slik at det dannes en tilnærmet sammenstilling med gap. Endelig sammenstilles områdene med den høyeste poengsum i de to aminosyresekvensene ved anvendelse av en modifikasjon av Needleman-Wunsch-Sellers-algoritmen (Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol., 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math., 26:181

(1974)), som muliggjør aminosyreinnføyelser og -delesjoner. Foretrukne parametere for FASTA-analyse er: ktup = 1, gapåpningsstraff = 10, gaputvidelsesstraff = 1 og substitusjons-matrisen = BLOSUM62. Disse parametere kan innføres i et FASTA-program ved å modifisere poengmatrisefilen ("SMATRIX"), som forklart i etterord 2 til Pearson, Meth. Enzymol., 183:63

(1990) .

FASTA kan også anvendes for å bestemme sekvensidenti-teten mellom nukleinsyremolekyler ved anvendelse av en brøk, som beskrevet ovenfor. For nukleotidsekvenssammenligninger kan ktup-verdien variere mellom 1 og 6, fortrinnsvis mellom 3 og 6, mest foretrukket 3, med standardverdier brukt for andre parametere.

Varianter av zalphall-polypeptider hvor sekvensen i det vesentlige ligner disse, særpreges ved at de har én eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -addisjoner. Disse endringene er fortrinnsvis av mindre avgjørende type, det vil si konservative aminosyresubstitusjoner (se tabell 5) og andre substitusjoner som ikke i vesentlig grad påvirker foldingen av eller aktiviteten til polypeptidet, små delesjoner, typisk på 1 til ca. 3 0 aminosyrer, og amino- eller karboksyterminale for-lengelser, f.eks. en aminoterminal metioninrest, et lite linker-peptid på opptil ca. 20-25 aminosyrerester eller en affinitetsmerkelapp. Polypeptider som omfatter affinitetsmerkelapper, kan videre omfatte et proteolytisk kløyvingssete mellom zalphall-ligandpolypeptidet og affinitetsmerkelappen. Foretrukne seter av denne typen omfatter trombinkløyvingsseter og faktor Xa-kløyvingsseter.

Identifisering av aminosyrerester som utgjør områder eller domener som er avgjørende for opprettholdelse av strukturell integritet.Innen disse områdene kan man identifisere spesifikke aminosyrerester som vil være mer eller mindre tolerante for forandring, samtidig som molekylets totale tertiær-struktur bevares. Fremgangsmåter for analyse av sekvensstruktur omfatter, men er ikke begrenset til, sammenstilling av flere sekvenser med høy aminosyre- eller nukleotididentitet, forut-sigelse av sekundærstruktur, binære mønstre, komplementær sammenpakking og begravde polare interaksjoner (Barton, Current Opin. Struct. Biol., 5:372-376, 1995, og Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol., 6:3-10, 1996). Ved utforming av modifikasjoner i molekyler eller identifisering av spesifikke fragmenter, vil, strukturbestemmelse generelt ledsages av en evaluering av de modifiserte molekylers aktivitet.

Aminosyresekvensendringer utføres i zalphall-ligandpolypeptider, slik at man minimaliserer forstyrrelser i den høyere ordens struktur som er avgjørende for biologisk aktivitet. Dersom f.eks. zalphall-ligandpolypeptidet omfatter én eller flere helikser, vil endringer i aminosyrerester utføres slik at heliksgeometrien ikke forstyrres, og heller ikke andre bestanddeler i molekylet hvor konformasjonsendringer fjerner en avgjør-ende funksjon, f.eks. binding av molekylet til dets bindings-partnere, f.eks. A- og D-helikser og aminosyrerestene 44, 47 og 135 i SEQ ID NO: 2. Virkningen av aminosyresekvensendringer kan f.eks. forutsies ved datamaskinassistert modellering, som beskrevet ovenfor, eller bestemmes ved analyse av krystall-strukturen (se f.eks. Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol., 2:266-268, 1995). Andre teknikker som er vel kjent innen faget, sammenligner folding av en proteinvariant med et standardmolekyl (f.eks. det native protein). Man kan f.eks. sammenligne cystein-mønsteret i en molekylvariant og standardmolekyler. Masse-spektrometri og kjemisk modifisering ved anvendelse av reduksjon og alkylering tilveiebringer fremgangsmåter for å identifisere cysteinrester som er forbundet med disulfidbindinger, eller som ikke har slike assosiasjoner (Bean et al., Anal. Biochem., 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sei., 2:1732-1748, 1993; og Patterson et al., Anal. Chem., 66:3727-3732, 1994). Det antas generelt at dersom et modifisert molekyl ikke har det samme cysteinmønster som standardmolekylet, vil foldingen påvirkes. En annen vel kjent og akseptert fremgangsmåte for måling av folding er sirkulær dikroisme (CD). Måling og sammenligning av CD-spektrene fra et modifisert molekyl og et standardmolekyl er rutinemessig (Johnson, Proteins, 7:205-214, 1990). Krystallo-grafi er en annen vel kjent fremgangsmåte for analyse av folding og struktur. Kjernemagnetisk resonans (NMR), peptidkartlegging etter kløyving og epitopkartlegging er også kjente fremgangsmåter for analyse av folding og strukturelle likheter mellom proteiner og polypeptider (Schaanan et al., Science, 257:961-964, 1992).

En Hopp/Woods-hydrofilisitetsprofil for zalphall-ligandproteinsekvensen, som vist i SEQ ID NO: 2, kan dannes (Hopp et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Met., 88:1-18, 1986, og Triquier et al., Protein Engineering, 21:153-169, 1998). Profilen er basert på et glidende vindu som omfatter 6 aminosyrerester. Begravde G-, S-og T-aminosyrerester og eksponerte H-, Y- og W-aminosyrerester ble ignorert. I zalphall omfatter f.eks. hydrofile områder aminosyrerestene 114-119 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 101-105 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 126-131 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 113-118 i SEQ ID NO: 2 og aminosyrerestene 158-162 i SEQ ID NO: 2.

Fagfolk vil forstå at hydrofilisitet eller hydrofobisi-tet må tas i betraktning ved innføring av modifikasjoner i aminosyresekvensen til et zalphall-ligandpolypeptid, slik at den totale strukturelle og biologiske profil ikke forstyrres. Av spesiell interesse for erstatning er hydrofobe aminosyrerester utvalgt fra gruppen bestående av Val, Leu og Ile, eller gruppen bestående av Met, Gly, Ser, Ala, Tyr og Trp. Aminosyrerester som tolererer substitusjon, kan f.eks. omfatte aminosyrerestene 100 og 103, som vist i SEQ ID NO: 2. Cysteinrestene i posisjonene 71, 78, 122 og 125 i SEQ ID NO: 2 vil være relativt lite tolerante for substitusjon.

Identiteten til avgjørende aminosyrerester kan også utledes fra analyse av sekvenslikheten mellom IL-15, IL-2, IL-4 og GM-CSF, og zalphall-ligand. Ved anvendelse av fremgangsmåter som "FASTA"-analyse, som beskrevet tidligere, identifiseres områder med høy grad av likhet i en proteinfamilie og anvendes for analyse av aminosyresekvensen i konserverte områder. En alternativ tilnærming for identifisering av en zalphall-ligandpolynukleotidvariant basert på strukturen er å fastslå hvorvidt et nukleinsyremolekyl som koder for en mulig zalphall-ligand-genvariant, kan hybridisere til et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1, som diskutert ovenfor.

Andre fremgangsmåter for identifisering av avgjørende aminosyrer i polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåter som er kjent innen faget, f.eks. setestyrt mutagenese eller alaninskanningsmutagenese (Cunningham og Wells, Science, 244:1081 (1989); Bass et al.,Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88:4498 (1991); Coombs og Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering" i Proteins: Analysis and Design, Angeletti (red.), s. 259-311 (Academic Press, Inc., 1998)). I denne siste teknikken innføres enkeltvise alaninmutasjoner i hver aminosyrerest i molekylet, og de resulterende mutante molekyler analyseres for biologisk eller biokjemisk aktivitet, som beskrevet nedenfor, for identifisering av aminosyrerester som er avgjørende for molekylets aktivitet. Se også Hilton et al., J. Biol. Chem., 271:4699 (1996).

Det kan også tilveiebringes funksjonelle fragmenter av zalphall-ligandpolypeptider og nukleinsyremolekyler som koder for slike funksjonelle fragmenter. En"funksjonell" zalphall-ligand eller et fragment av denne, som definert heri, særpreges ved proliferativ eller differensierende aktivitet, ved evnen til å indusere eller inhibere spesialiserte cellefunksjoner, eller ved evnen til å bindes spesifikt til et anti-zalphall-ligandantistoff eller en zalphall-reseptor (enten løselig eller immobilisert). Som beskrevet tidligere heri, særpreges zalphall-ligand ved en fireheliksbunt-struktur som omfatter heliks A (aminosyrerestene 41-56), heliks B (aminosyrerestene 69-84), heliks C (aminosyrerestene 92-105) og heliks B (aminosyrerestene 135-148), som vist i SEQ ID NO: 2. Fusjonsproteiner kan omfatte: (a) polypeptidmolekyler som omfatter én eller flere av heliksene beskrevet ovenfor, og (b) funksjonelle fragmenter som omfatter

én eller flere av disse heliksene. Den andre polypeptiddelen av fusjonsproteinet kan utgjøres av et annet fireheliksbunt-cytokin, f.eks. IL-15, IL-2, IL-4 og GM-CSF, eller av et ikke-nativt og/eller et ubeslektet sekretorisk signalpeptid som letter sekresjon av fusjonsproteinet.

Rutinemessige delesjonsanalyser av nukleinsyremolekyler kan utføres for å erholde funksjonelle fragmenter av et nukleinsyremolekyl som koder for et zalphall-ligandpolypeptid. Som en illustrasjon kan DNA-molekyler med nukleotidsekvensen i SEQ ID NO: 1 eller fragmenter av denne kuttes med nukleasen Bal3l for erholdelse av en serie med overlappende delesjoner. Disse DNA-fragmentene innsettes så i ekspresjonsvektorer i korrekt leseramme, og de uttrykte polypeptidene isoleres og analyseres for zalphall-ligandaktivitet eller for evnen til å binde anti-zalphall-ligandantistof f er eller zalphall-reseptor. Et alterna tiv til eksonukleasekutting er å anvende oligonukleotidstyrt mutagenese for innføring av delesjoner eller stoppkodoner for spesifisering av produksjon av et ønsket zalphall-ligandfragment. Alternativt kan gitte fragmenter av et zalphall-ligandgen syntetiseres ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen.

Standardfremgangsmåte for identifisering av funksjonelle domener er vel kjent blant fagfolk. For eksempel har undersøkelser vedrørende trunkering i én eller begge ender av interferoner blitt oppsummert av Horisberger og Di Marco, Pharmac. Ther., 66:507 (1995). Videre er standardteknikker for funksjonell analyse av proteiner beskrevet f.eks. av Treuter et al., Molec. Gen. Genet., 240:113 (1993); Content et al., "Ekspresjon and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", i Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (red.), s. 65-72 (Nijhoff 1987);Herschman, "The EGF Receptor", i Control of Animal Cell Proliferation, 1, Boynton et al. (red.), s. 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem., 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem., 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol., 50:1295 (1995); og Meisel et al., PlantMolec.Biol., 30:1

(1996) .

Substitusjon av flere aminosyrer kan innføres og analyseres ved anvendelse av kjente teknikker for mutagenese og analyse, f.eks. fremgangsmåtene beskrevet av Reidhaar-Olson og Sauer (Science, 241:53 (1988)), eller Bowie og Sauer (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:2152 (1989)). Kort beskrevet beskriver disse forfatterne fremgangsmåter for samtidig randomisering av to eller flere posisjoner i et polypeptid, seleksjon av funksjonelt polypeptid og sekvensering av de mutageniserte polypeptidene for å bestemme spekteret av tillatte substitusjoner i hver posisjon. Andre fremgangsmåter som kan anvendes, omfatter bakteriofagfremvisning (se f.eks. Lowman et al., Biochem, 30:10832 (1991); Ladner et al., US patentskrift nr. 5 223 409; Huse, internasjonal patentpublikasjon nr. WO 92/06204), og om-rådestyrt mutagenese (Derbyshire et al., Gene, 46:145, 1986; og Ner et al., DNA, 7:127 (1988)).

Varianter av de beskrevne zalphall-ligandnukleotid- og -polypeptidsekvensene kan også dannes via DNA-stokking, som beskrevet av Stemmer, Nature, 370:389 (1994); Stemmer, Proe.Nati.Acad. Sei. USA, 51:10747 (1994); og internasjonal patentpublikasjon nr. WO 97/20078. Kort beskrevet dannes DNA-molekyl-varianter ved homolog rekombinasjon in vitro av tilfeldige fragmenter av et utgangs-DNA, etterfulgt av gjenoppbygging ved anvendelse av PCR, noe som fører til tilfeldig innførte punkt-mutasjoner. Denne teknikken kan modifiseres ved å anvende en familie av utgangs-DNA-molekyler, f.eks. alleliske varianter eller DNA-molekyler fra forskjellige arter, for å innføre ytterligere variabilitet i prosessen. Seleksjon av eller gjennom-søking etter den ønskede aktivitet, etterfulgt av ytterligere gjentakelser med mutagenese og analyse, gir hurtig "evolusjon" av sekvenser ved at ønskede mutasjoner selekteres samtidig som det selekteres mot skadelige endringer.

Mutagenesefremgangsmåtene som beskrives heri, kan kombineres med automatiske gjennomsøkingsfremgangsmåte med høy kapasitet for å påvise aktivitet av klonede, mutageniserte polypeptider i vertsceller. Mutageniserte DNA-molekyler som koder for biologisk aktive polypeptider eller polypeptider som bindes til anti-zalphall-ligandantistoffer eller løselig zalphall-reseptor, kan gjenvinnes fra vertscellene og hurtig sekvenseres ved anvendelse av moderne utstyr. Disse fremgangsmåtene mulig-gjør hurtig bestemmelse av betydningen av de enkelte aminosyrerestene i et polypeptid av interesse, og kan anvendes for polypeptider med ukjent struktur.

I tillegg kan proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse (eller polypeptidfragmenter av disse) kobles til andre bioaktive molekyler, fortrinnsvis andre cytokiner, for erholdelse av multifunksjonelle molekyler. For eksempel kan én eller flere helikser fra zalphall-ligand kobles til andre cytokiner for å forsterke deres biologiske egenskaper eller gi mer effektiv produksjon.

Det kan tilveiebringes en serie med nye hybridmolekyler hvor et segment som omfatter én eller flere av heliksene i zalphall-ligand er fusjonert til et annet polypeptid. Fusjonen dannes fortrinnsvis ved spleising på DNA-nivå for å oppnå ekspresjon av kimære molekyler i rekombinante produksjons- systemer. De resulterende molekyler analyseres så for egenskaper som forbedret løselighet, forbedret stabilitet, forlenget levetid i organismen, forbedret ekspresjonsnivå og utskillelsesnivå og forbedrede farmakodynamiske egenskaper. Slike hybridmolekyler kan videre omfatte ytterligere aminosyrerester (f.eks. en poly-peptidlinker) mellom de inngående proteiner eller polypeptider.

Ikke-naturlig forekommende aminosyrer omfatter, men er ikke begrenset til, trans-3-metylprolin, 2,4-metanoprolin, cis-4-hydroksyprolin, trans-4-hydroksyprolin, N-metylglysin, allo-treonin, metyltreonin, hydroksyetylcystein, hydroksyetylhomo-cystein, nitroglutamin, homoglutamin, pipekolsyre, tiazolidin-karboksylsyre, dehydroprolin, 3- og 4-metylprolin, 3,3-dimetyl-prolin, tert.-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin og 4-fluorfenylalanin. Flere fremgangsmåter er kjent innen faget for innføring av ikke-naturlig forekommende aminosyrerester i proteiner. For eksempel kan det anvendes et in vitro-system i hvilket "nonsense"-mutasjoner undertrykkes ved anvendelse av kjemisk aminoacylerte suppressor-tRNA-er. Fremgangsmåter for syntese av aminosyrer og amino-acylering av tRNA er kjent innen faget. Transkripsjon og trans-lasjon av plasmider som inneholder "nonsense"-mutasjoner, ut-føres typisk i et cellefritt system som omfatter en E. coli-S3 0-ekstrakt og kommersielt tilgjengelige enzymer og andre reagenser. Proteinene renses ved kromatografi. Se f.eks. Robertson et al., J. Am. Chem. Soc., 113:2722 (1991); Ellman et al., Methods Enzymol., 202:301 (1991); Chung et al., Science, 255:806-9

(1993); og Chung et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 50:10145-9

(1993) .

Ved en andre fremgangsmåte utføres translasjonen i Xenopus-oocytter ved mikroinjeksjon av mutert mRNA og kjemisk aminoacylerte suppressor-tRNA-er (Turcatti et al., J. Biol. Chem., 271:19991 (1996)). Ved en tredje fremgangsmåte dyrkes

E. coli-celler i fravær av en naturlig aminosyre som skal erstattes (f.eks. fenylalanin) og i nærvær av den eller de ønskede, ikke-naturlig forekommende aminosyrer (f.eks. 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin eller 4-fluorfenylalanin). Den ikke-naturlig forekommende aminosyre innføres i proteinet i stedet for dets naturlige motstykke. Se Koide et al., Biochem., 33:7470 (1994). Naturlig forekommende aminosyre rester kan overføres til ikke-naturlig forekommende aminosyrerester ved kjemisk modifisering in vitro. Kjemisk modifisering kan kombineres med setestyrt mutagenese for ytterligere å utvide substitusjonsområdet (Wynn og Richards, Protein Sei., 2:395

(1993). Det kan være fordelaktig å stabilisere zalphall-liganden for å forbedre molekylets halveringstid, særlig for å utvide tidsrommet for metabolsk tilstedeværelse i en aktiv tilstand. For å oppnå forlenget halveringstid kan zalphall-ligandmolekyler modifiseres kjemisk ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrives heri. Pegylering er én fremgangsmåte som hyppig anvendes og som er blitt vist å forlenge halveringstiden i plasma, i økt løselighet og redusert antigenisitet og immunogenisitet (Nucci et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 6:133-155, 1991, og Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138, 1994).

Et begrenset antall ikke-konservative aminosyrer, aminosyrer som ikke kodes av den genetiske kode, ikke-naturlig forekommende aminosyrer og unaturlige aminosyrer kan erstatte aminosyrerester i zalphall-ligand.

Det kan også tilveiebringes polypeptidfragmenter eller peptider som omfatter en epitopbærende del av et zalphall-ligandpolypeptid, som beskrevet heri. Slike fragmenter eller peptider kan omfatte en "immunogen epitop" som er en del av et protein som utløser en antistoffrespons dersom hele proteinet anvendes som immunogen. Immunogene epitopbærende peptider kan identifiseres ved anvendelse av standardfremgangsmåter (se f.eks. Geysen et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, Sl:3998

(1983) ) .

I motsetning til dette kan polypeptidfragmenter eller peptider omfatte en "antigen epitop", som er et område i et proteinmolekyl som et antistoff kan bindes spesifikt til. Visse epitoper består av lineære eller kontinuerlige strekk med aminosyrer, og antigenisiteten av en slik epitop ødelegges ikke av denatureringsmidler. Det er kjent innen faget at relativt korte syntetiske peptider som kan etterligne epitoper i et protein kan anvendes for å stimulere produksjonen av antistoffer mot proteinet (se f.eks. Sutcliffe et al., Science, 215:660 (1983)). Følgelig er antigene, epitopbærende peptider og polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse anvendbare for frembringelse av antistoffer som bindes til polypeptidene som beskrives heri. Hopp/Woods-hydrofilisitetsprofiler kan anvendes for å identifisere de områder som har det høyeste antigenpotensialet (Hopp et al., 1981, ibid., og Hopp, 1986, iJbid.) I zalphall-ligand omfatter disse områdene: aminosyrerestene 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 og 158-162 i SEQ ID NO: 2.

Antigene, epitopbærende peptider og polypeptider inneholder fortrinnsvis minst 4-10 aminosyrer, minst 10-14 aminosyrer eller ca. 14-30 aminosyrer fra SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 56. Slike epitopbærende peptider og polypeptider kan fremstilles ved å fragmentere et zalphalll-ligandpolypeptid eller ved kjemisk peptidsyntese, som beskrevet heri. Videre kan epitoper utvelges ved bakteriofagfremvisning av tilfeldige peptidbiblioteker (s f.eks. Lane og Stephen, Curr. Opin. Immunol., 5:268 (1993); og Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:616 (1996)). Standardfremgangsmåter for identifisering av epitoper og fremstilling av antistoffer fra små peptider som omfatter en epitop, er f.eks. beskrevet av Mole, "Epitope Mapping", i Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (red.), s. 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", i Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter og Ladyman (red.), s. 60-84 (Cambridge University Press, 1995), og Coligan et al. (red.), Current Protocols in Immunology, s. 9.3.1-9.3.5 og s. 9.4.1-9.4.11 (John Wiley and Sons, 1997).

Uavhengig av den spesielle nukleotidsekvens til en zalphall-ligandpolynukleotidvariant koder polynukleotidet for et polynukleotid som særpreges ved sin proliferative eller differensierende aktivitet, sin evne til å indusere eller inhibere spesialiserte cellefunksjoner, eller ved evnen til spesifikt å bindes til et anti-zalphall-ligandantistoff eller til zalphall-reseptor. Nærmere bestemt vil zalphall-ligandpolynukleotid-varianter kode for polypeptider som viser minst 50 %, og mer foretrukket mer enn 70 %, 80 % eller 90 %, av aktiviteten til polypeptidet som er vist i SEQ ID NO: 2.

For ethvert zalphall-ligandpolypeptid, innbefattet varianter og fusjonsproteiner, kan en gjennomsnittsfagperson lett danne en fullt ut degenerert polynukleotidsekvens som koder for varianten ved anvendelse av informasjonen gitt i tabellene 1 og 2 ovenfor.

Det kan videre tilveiebringes en rekke andre fusjonspolypeptider (og beslektede multimere proteiner som omfatter én eller flere polypeptidfusjoner). For eksempel kan et zalphall-ligandpolypeptid fremstilles som en fusjon til et dimeriserende protein, som beskrevet i US patentskrifter nr. 5 155 027 og 5 567 584. Foretrukne dimeriserende proteiner i denne sammenheng omfatter konstant område-domener fra immunglobuliner. Immunglobulin-zalphall-ligand-polypeptidfusjoner kan uttrykkes i genetisk fremstilte celler (for fremstilling av en rekke multimere zalphall-ligandanaloger).Tilleggsdomener kan fusjoneres til zalphall-ligandpolypeptider for å styre dem til spesifikke celler, vev eller makromolekyler. For eksempel kan et zalphall-ligandpolypeptid eller -protein målstyres til en på forhånd bestemt celletype ved å fusjonere zalphall-ligandpolypeptidet til en ligand som spesifikt bindes til en reseptor på målcellens overflate. På denne måten kan polypeptider og proteiner målstyres for terapeutiske eller diagnostiske formål. Et zalphall-ligandpolypeptid kan fusjoneres til to eller flere grupper, f.eks. en affinitetsmerkelapp for rensing og et målstyringsdomene. Polypeptidfusjoner kan også omfatte ett eller flere kløyvingsseter, fortrinnsvis mellom domenene. Se Tuan et al., Connective Tissue Research, 34:1-9, 1996.

Ved anvendelse av fremgangsmåtene som diskuteres heri, kan en gjennomsnittsfagperson identifisere og/eller fremstille en rekke polypeptider som har en sekvens som i det vesentlige ligner sekvensen mellom aminosyrerestene 1 og 162 eller 33 og 162 i SEQ ID NO: 2 eller funksjonelle fragmenter og fusjoner av disse, hvori slike polypeptider eller fragmenter eller fusjoner bibeholder villtypeproteinets egenskaper, f.eks. evnen til å stimulere proliferasjon og differensiering, indusere spesialiserte cellefunksjoner eller å bindes til zalphall-reseptoren eller zalphall-ligandantistoffer.

Zalphall-ligandpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, og også funksjonelle fragmenter og fusjonspolypeptider, kan fremstilles i genetisk fremstilte vertsceller ifølge konvensjonelle teknikker.Egnede vertsceller er celletyper som kan transformeres eller transfekteres med eksogent DNA og dyrkes i kultur, og omfatter bakterier, soppceller og dyrkede høyere eukaryote celler. Eukaryote celler, fortrinnsvis dyrkede celler fra multicellulære organismer, foretrekkes. Teknikker for manipulering av klonede DNA-molekyler og innføring av eksogent DNA i en rekke vertsceller beskrives av Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; og Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

Generelt er en DNA-sekvens som koder for et zalphall-ligandpolypeptid, operativt koblet til andre genetiske elementer som er nødvendige for dets ekspresjon, generelt omfattende en transkripsjonspromoter og -terminator, i en ekspresjonsvektor. Vektoren vil også hyppig inneholde én eller flere seleksjons-markører og ett eller flere replikasjonsopprinnelsessteder, selv om fagfolk vil innse at i visse systemer kan seleksjonsmarkører foreligge på separate vektorer, mens replikasjonen av det eksogene DNA oppnås ved integrasjon i vertscellegenomet. Utvelgelse av promoterer, terminatorer, seleksjonsmarkører, vektorer og andre elementer er et spørsmål om rutinemessig utforming som ligger innenfor gjennomsnittsnivået innen faget. Mange slike elementer er beskrevet i litteraturen og er tilgjengelige fra kommersielle leverandører.

For å styre et zalphall-ligandpolypeptid inn i en vertscelles sekretoriske reaksjonsvei tilveiebringes en sekretorisk signalsekvens (også betegnet en ledersekvens, prepro-sekvens eller presekvens) i ekspresjonsvektoren. Den sekretoriske signalsekvens kan være signalsekvensen fra zalphall-ligand eller avledet fra et annet utskilt protein (f.eks. t-PA) eller syntetisert de novo. Den sekretoriske signalsekvens er operativt koblet til zalphall-ligand-DNA-sekvensen, det vil si at de to sekvensene er sammenkoblet i korrekt leseramme og plassert slik at det nysyntetiserte polypeptid styres inn i vertscellens sekretoriske reaksjonsvei. Sekretoriske signalsekvenser ligger vanligvis plassert 5' for DNA-sekvensen som koder for polypeptidet av interesse, selv om visse sekretoriske signalsekvenser kan være plassert andre steder i DNA-sekvensen av interesse (se f.eks. Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743; Holland et al., US patentskrift nr. 5 143 830).

Alternativt anvendes den sekretoriske signalsekvens som foreligger i polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse for å styre andre polypeptider inn i den sekretoriske reaksjonsvei.Et signalfusjonspolypeptid kan fremstilles hvori en sekretorisk signalsekvens avledet fra aminosyrerest 1-31 i SEQ ID NO: 2 kobles operativt til en DNA-sekvens som koder for et annet polypeptid ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget og beskrives heri. Den sekretoriske signalsekvens kan fortrinnsvis fusjoneres aminoterminalt til et tilleggspeptid for å styre tilleggspeptidet inn i den sekretoriske reaksjonsvei. Slike konstruksjoner har en rekke anvendelsesområder som er kjent innen faget. Disse sekretoriske signalsekvensfusjons-konstruksjonene kan f.eks. styre sekresjonen av en aktiv bestanddel av et normalt ikke-utskilt protein. Slike fusjoner kan anvendes in vivo eller in vitro for å styre peptider gjennom den sekretoriske reaksjonsvei.

Dyrkede pattedyrceller er egnede verter innen foreliggende oppfinnelse. Fremgangsmåter for innføring av eksogent DNA inn i pattedyrvertsceller omfatter kalsiumfosfatformidlet transfeksjon (Wigler et al., Cell, 14:725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics, 7:603, 1981: Graham og Van der Eb, Virology, 52:456, 1973), elektroporering (Neumann et al., EMBO J., 1:841-5, 1982), DEAE-dekstranformidlet transfeksjon (Ausubel et al., ibid.) og liposomformidlet transfeksjon (Hawley-Nelson et al., Focus, 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus, 15:80, 1993) og virale vektorer (Miller og Rosman, BioTechniques, 7:980-90, 1989; Wang og Finer, Nature Med., 2:714-6, 1996). Fremstilling av rekombinante polypeptider i dyrkede pattedyrceller beskrives f.eks. av Levinson et al.,

US patentskrift nr. 4 713 339, Hagen et al., US patentskrift nr. 4 784 950, Palmiter et al., US patentskrift nr. 4 579 821, og Ringold, US patentskrift nr. 4 656 134. Egnede dyrkede pattedyrceller omfatter cellelinjene COS-1 (ATCC nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC nr. CRL 1651), BHK (ATCC nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr. CRL 10314), 293 (ATCC nr. CRL 1573); Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977) og kinesisk hamsterovarium (f.eks. CHO-Kl; ATCC nr. CCL 61). Ytterligere egnede cellelinjer er kjent innen faget og tilgjengelige fra offentlige deponeringsinsti-tusjoner som American Type Culture Collection, Manassas, VA. Generelt foretrekkes kraftige transkripsjonspromoterer, f.eks. promoterer fra SV-40 eller cytomegalovirus. Se f.eks. US patentskrift nr. 4 956 288. Andre egnede promoterer omfatter promoterer fra metallotioneingener (US patentskrifter nr. 4 579 821 og 4 601 978) og den sene hovedpromoter fra adenovirus.

Medikamentseleksjon anvendes generelt for seleksjon av dyrkede pattedyrceller i hvilke fremmed DNA er blitt innført. Slike celler betegnes vanligvis som "transfektanter". Celler som er blitt dyrket i nærvær av seleksjonsmidlet, og som kan over-føre genet av interesse til sitt avkom, betegnes "stabile transfektanter". En foretrukket seleksjonsmarkør er et gen som koder for resistens mot antibiotikumet neomycin. Seleksjonen utføres i nærvær av et medikament av neomycintype, f.eks. G-418, eller lignende. Seleksjonssystemer kan også anvendes til å øke ekspresjonsnivået til genet av interesse, en prosess som betegnes "amplifisering". Amplifisering utføres ved å dyrke transfektanter i nærvær av et lavt nivå av seleksjonsmidlet og så øke mengden seleksjonsmiddel for å selektere celler som produserer høyt nivå av produktene fra de innførte gener. En foretrukket amplifiserbar seleksjonsmarkør er dihydrofolatreduktase, som gir resistens mot metotreksat. Andre medikamentresistensgener (f.eks. hygromycinresistens, multimedikamentresistens, puro-mycinacetyltransferase) kan også anvendes. Alternative markører som innfører en endret fenotype, f.eks. grønt, fluorescerende protein, eller celleoverflateproteiner som CD4, CD8, klasse I-MHC og alkalisk fosfatase fra placenta, kan anvendes til å sortere transfekterte celler fra ikke-transfekterte celler ved hjelp av FACS-sortering eller magnetkuleseparasjonsteknologi.

Andre høyere eukaryote celler kan også anvendes som verter, innbefattet planteceller, insektceller og fugleceller. En oversikt over anvendelse av Agrobacterium rhizogenes som vektor for ekspresjon av gener i planteceller gis av Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore), 21:47-58, 1987. Transformasjon av insektceller og produksjon av fremmede polypeptider i disse beskrives av Guarino et al., US patentskrift nr. 5 162 222 og WIPO-publikasjon WO 94/06463. Insektceller kan infiseres med rekombinant baculovirus, vanligvis avledet fra Autographa californica-kjernepolyhedrosevirus (AcNPV) . Se King, L.A. og Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; 0'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press, 1994; og Richardson, C.D., red., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Den andre fremgangsmåten for fremstilling av rekombinant baculovirus anvender et transposonbasert system beskrevet av Luckow (Luckow, V.A. et al., J Virol, 67:4566-79, 1993). Dette systemet selges i "Bac-to-Bac"-settet (Life Technologies, Rockville, MD). Dette systemet anvender en overførings-vektor, "pFastBacl" (Life Technologies), som inneholder et Tn7-transposon, for overføring av DNA som koder for zalphall-ligandpolypeptidet til et baculovirusgenom som opprettholdes i E. coli som et stort plasmid som kalles et"bakmid". Overføringsvektoren "pFastBacl" anvender AcNPV-polyhedronpromoteren for å styre ekspresjonen av genet av interesse, i dette tilfellet zalphall-ligand. "pFastBacl" kan imidlertid modifiseres i betydelig grad. Polyhedrinpromoteren kan fjernes og erstattes med den basiske proteinpromoter fra baculovirus (også betegnet Pcor-, ped-eller MP-promoter), som uttrykkes tidligere i baculovirusinfek-sjonen og som er blitt vist å være fordelaktig for ekspresjon av utskilte proteiner. Se Hill-Perkins, M.S. og Possee, R.D., J Gen Virol, 71:971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol., 75:1551-6, 1994; og Chazenbalk, G.D. og Rapoport, B., J. Biol. Chem., 270:1543-9, 1995. I slike overføringsvektorkonstruksjoner kan en kort eller lang versjon av den basiske proteinpromoter anvendes. Videre kan det konstrueres overføringsvektorer hvor den native sekretoriske signalsekvens fra zalphall-ligand er erstattet med sekretoriske signalsekvenser avledet fra insekt-proteiner. For eksempel kan en sekretorisk signalsekvens fra Ecdysteroid glukosyltransferase (EGT), honningbiemelittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) eller baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) anvendes i konstruksjoner for å erstatte den native sekretoriske signalsekvens i zalphall-ligand. I tillegg kan overføringsvektorer omfatte en fusjon med opprettholdt leseramme med DNA som koder for en epitopmerkelapp i C- eller N-enden av det uttrykte zalphall-ligandpolypeptid, f.eks. en Glu-Glu-epitopmerkelapp (Grussenmeyer, T. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 82:7952-4, 1985). Ved anvendelse av teknikker som er kjent innenfor faget, transformeres en overføringsvektor som inne holder zalphall-ligand inn i E. Coli, og det søkes etter bakmider som inneholder et avbrutt lacZ-gen, noe som tyder på rekombinant baculovirus. Bakmid-DNA som inneholder det rekombinante baculovirusgenom, isoleres ved anvendelse av vanlige teknikker og anvendes for transfeksjon av Spodoptera frugiperda-celler, £.eks. Sf9-celler. Rekombinant virus som uttrykker zalphall-ligand, dannes så. Lagersuspensjoner av rekombinant virus fremstilles ved fremgangsmåter som er vel kjent innen faget.

Det rekombinante virus anvendes for infeksjon av vertsceller, typisk en cellelinje avledet fra Spodoptera frugiperda (fall armyworm). Se generelt Glick og Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. En annen egnet cellelinje er "High FiveO"-cellelinjen (Invitrogen), avledet fra Trichoplusia ni (US patentskrift nr. 5 300 435).

Soppceller, innbefattet gjærceller, kan også anvendes i foreliggende oppfinnelse. Gjærarter av spesiell interesse i denne sammenheng omfatter Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris og Pichia methanolica. Fremgangsmåter for transformering av S. cerevisiae-celler med eksogent DNA og fremstilling av rekombinante polypeptider fra disse beskrives f.eks. av Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311; Kawasaki et al.,

US patentskrift nr. 4 931 373; Brake, US patentskrift nr.

4 870 008; Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743, og Murray et al., US patentskrift nr. 4 845 075. Transformerte cellelinjer selekteres ut fra fenotypen som bestemmes av selek-sjonsmarkøren, vanligvis medikamentresistens eller evnen til å vokse i fravær av et gitt næringsstoff (f.eks. leucin). Et foretrukket vektorsystem for anvendelse i Saccharomyces cerevisiae er POTl-vektorsystemet, som beskrives av Kawasaki et al.

(US patentskrift nr. 4 931 373), som muliggjør seleksjon av transformerte celler ved vekst i glukoseholdige medier.Egnede promoterer og terminatorer for anvendelse i gjær omfatter promoterer og terminatorer fra glykolyseenzymgener (se f.eks. Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311; Kingsman et al.,

US patentskrift nr. 4 615 974; og Bitter, US patentskrift nr.

4 977 092) og alkoholdehydrogenasegener. Se også US patentskrifter nr. 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 og 4 661 454.

Transformasjonssysterner for andre gjærarter, innbefattet Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis,Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii og Candida mal tosa, er kjent innen faget. Se f.eks. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132:3459-3465, 1986, og Cregg, US patentskrift nr. 4 882 279. Aspergillus-celler kan anvendes ifølge fremgangsmåtene til McKnight et al., US patentskrift nr. 4 935 349. Fremgangsmåter for transformering av Acremonium chrysogenum beskrives av Sumino et al., US patentskrift nr. 5 162 228. Fremgangsmåter for transformering av Neurospora beskrives av Lambowitz, US patentskrift nr. 4 486 533.

Anvendelse av Pichia methanolica som vert for fremstilling av rekombinante proteiner beskrives i WlPO-publika-sjonene WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 og WO 98/02565. DNA-molekyler for anvendelse ved transformering av P. methanolica vil vanligvis fremstilles som dobbelttrådede, sirkulære plasmider som fortrinnsvis lineariseres før transformasjonen. For fremstilling av polypeptider i P. methanolica foretrekkes det at promoteren og terminatoren i plasmidet er promoteren og terminatoren fra et P. methanoli ca-gen, f.eks. et P. methanolica-alkoholutnyttelsesgen ( AUGl eller AUG2). Andre anvendbare promoterer omfatter promoterer fra genene for dihydroksyaceton-syntase (DHAS), formiatdehydrogenase FMD) og katalase (CAT). For å lette integreringen av DNA i vertskromosomet foretrekkes det å ha hele ekspresjonssegmentet i plasmidet flankert i begge ender av verts-DNA-sekvenser. En foretrukket seleksjonsmarkør for anvendelse i Pichia methanolica er et P. methanolica- ADE2- gen, som koder for fosforibosyl-5-aminoimidazolkarboksylase (AIRC; EC 4.1.1.21), som muliggjør vekst av ade2-vertsceller i fravær av adenin. For industrielle prosesser i stor skala, hvor det er ønskelig å minimalisere anvendelsen av metanol, foretrekkes det å anvende vertsceller i hvilke begge metanolutnyttelsesgenene

{ AUGl og AUG2) er delert. For fremstilling av utskilte proteiner foretrekkes det vertsceller som mangler vakuolære proteasegener { PEP4 og PRB1). Elektroporering anvendes for å lette innføring av plasmid som inneholder DNA som koder for et polypeptid av interesse i P. jnethanolica-celler. Det foretrekkes å transfor-mere P. TTiethaiiolica-celler ved elektroporering under anvendelse

av et eksponentielt avtakende, pulset elektrisk felt med en feltstyrke fra 2,5 til 4,5 kV/cm, fortrinnsvis ca. 3,75 kV/cm, og en tidskonstant (£2) fra 1 til 40 millisekunder, mest foretrukket ca. 20 millisekunder.

Prokaryote vertsceller, innbefattet stammer av bakteriene Escherichia coli, Bacillus og andre slekter, er også anvendbare vertsceller innen foreliggende oppfinnelse. Teknikker for transformering av disse vertene og ekspresjon av fremmede DNA-sekvenser som er klonet i dem, er vel kjent innen faget (se f.eks. Sambrook et al., ibid.). Ved ekspresjon av et zalphall-ligandpolypeptid i bakterier som E. coli kan polypeptidet til-bakeholdes i cytoplasmaet, typisk i uløselige partikler, eller det kan styres til periplasmarommet ved hjelp av en bakteriell sekresjonssekvens. I det første tilfellet lyseres cellene, og partiklene gjenvinnes og denatureres ved anvendelse av f.eks. guanidinisotiocyanat eller urea. Det denaturerte polypeptid kan så gjenfoldes og dimeriseres ved å fortynne denatureringsmidlet, f.eks. ved hydrolyse mot en løsning av urea og en kombinasjon av redusert og oksidert glutation, etterfulgt av dialyse mot en bufret saltløsning. I det siste tilfellet kan polypeptidet gjenvinnes fra periplasmarommet i løselig og funksjonell form ved å bryte opp cellene (f.eks. ved ultralydbehandling eller osmotisk sjokk), slik at innholdet i periplasmarommet frigjøres, og gjenvinning av proteinet, slik at behovet for denaturering og gjenfolding ikke foreligger.

Transformerte eller transfekterte vertsceller dyrkes ifølge konvensjonelle fremgangsmåter i et dyrkningsmedium som inneholder næringsstoffer og andre bestanddeler som er nødven-dige for vekst av de valgte vertsceller. En rekke egnede medier, innbefattet definerte medier og komplekse medier, er kjent innen faget og omfatter generelt en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer og mineraler. Medier kan også inneholde bestanddeler som vekstfaktorer eller serum etter be-hov. Dyrkningsmediet vil generelt selektere celler som inneholder det eksogent tilførte DNA ved f.eks. medikamentseleksjon eller mangel på et essensielt næringsstoff som kompiementeres av den seleksjonsmarkøren som foreligger i ekspresjonsvektoren eller som kotransfekteres inn i vertscellen. P. methanolica-celler dyrkes i et medium som omfatter tilstrekkelige kilder for karbon, nitrogen og spornæringsstoffer, ved en temperatur fra ca. 25 °C til 35 °C. Flytende kulturer tilføres tilstrekkelig luft med konvensjonelle midler, f.eks. risting av små kolber eller gjennombobling av fermentorer. Et foretrukket dyrkningsmedium for P. methanolica er YEPD (2 % D-glukose, 2 % "Bacto"-pepton (Difco Laboratories, Detroit, Ml), 1 % "Bacto"-gjærekstrakt (Difco Laboratories), 0,004 % adenin og 0,006 % L-leucin).

Det foretrekkes å rense polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse til > 80 % renhet, mer foretrukket > 90 % renhet, enda mer foretrukket til > 95 % renhet, og spesielt foretrukket er en farmasøytisk ren tilstand, det vil si mer enn 99,9 % rent med hensyn til kontaminerende makromolekyler, fortrinnsvis andre proteiner og nukleinsyrer, og fritt for infeksiøse og pyrogene midler. Et renset polypeptid er fortrinnsvis i det vesentlige fritt for andre polypeptider, særlig andre polypeptider med opphav i dyr.

Uttrykte rekombinante zalphall-ligandpolypeptider (eller kimære zalphall-ligandpolypeptider) kan renses ved anvendelse av fraksjonering og/eller konvensjonelle rense-fremgangsmåter og -medier. Ammoniumsulfatutfelling og ekstraksjon med syre eller kaotrope midler kan anvendes for fraksjonering av prøver. Eksempler på rensetrinn kan omfatte hydroksyapa-titt-, størrelseseksklusjons-, FPLC- og reversfasehøyytelses-væskekromatografi. Egnede kromatografimedier omfatter derivatiserte dekstraner, agarose, cellulose, polyakrylamid, spesielle kiselgeler og lignende. PEI-, DEAE-, QAE- og Q-derivater foretrekkes . Eksempler på kromatografimedier omfatter de samme medier derivatisert med fenyl-, butyl- eller oktylgrupper, f.eks. fenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toypearl-butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), oktyl-Sepharose (Pharmacia) og lignende; eller polyakrylharpikser, f.eks. Amberchrom CG 71 (Toso Haas) og lignende. Egnede faste støttemidler omfatter glasskuler, kiselgelbaserte resiner, celluloseresiner, agarosekuler, kryssbundne agarosekuler, polystyrenkuler, kryssbundne polyakrylamidresiner og lignende, som er uløselige under betingelsene som de anvendes ved. Disse støttemidlene kan være modifisert med reaktive grupper som muliggjør tilkobling av proteiner via aminogrupper, karboksylgrupper, sulfhydrylgrupper, hydroksylgrupper og/eller karbohydratrester. Eksempler på kjemisk tilkobling omfatter cyanogenbromidaktivering, N-hydroksysuksinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydryl-aktivering, hydrazidaktivering og karboksyl- og aminoderivater for karbodiimidkobling. Disse og andre faste medier er vel kjent og anvendes hyppig innen faget, og er tilgjengelige fra kommersielle leverandører. Fremgangsmåter for binding av reseptorpolypeptider til støttemedier er vel kjent innen faget. Valg av en gitt fremgangsmåte er et rutinemessig spørsmål og avgjøres delvis av det valgte støttemiddels egenskaper. Se f.eks. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige, 1988.

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres ved å utnytte deres fysiske eller biokjemiske egenskaper. For eksempel kan immobilisert metallionabsorpsjons-dMAC) kromatograf i anvendes for å rense histidinrike proteiner, innbefattet proteiner som inneholder polyhistidinmerkelapper. Kort beskrevet lades en gel først med divalente metallioner slik at det dannes et chelat (Sulkowski, Trends in Biochem., 3:1-7, 1985) . Histidinrike proteiner vil adsorberes til dette støtte-middel med varierende affinitet, avhengig av det anvendte metallion, og vil elueres ved kompetitiv eluering, reduksjon av pH eller anvendelse av kraftige chelateringsmidler. Andre rense-fremgangsmåter omfatter rensing av glykosylerte proteiner ved lektinaffinitetskromatografi og ionebytterkromatografi (Methods in Enzymol., vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher (red.), Acad. Press, San Diego, 1990, s. 529-39), og anvendelse av den løselige zalphall-reseptoren. Ved ytterligere utførelser av oppfinnelsen kan en fusjon mellom polypeptidet av interesse og en affinitetsmerkelapp (f.eks. maltosebindende protein eller et immunglobulindomene) konstrueres for å lette rensingen.

Ved anvendelse av fremgangsmåter beskrevet innen faget konstrueres videre polypeptidfusjoner eller hybrid-zalphall-ligandproteiner ved anvendelse av områder eller domener fra zalphall-ligand ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med områder eller domener fra andre humane proteiner fra cytokinfamilien (f.eks. interleukiner eller GM-CSF) eller heterologe proteiner (Sambrook et al., ibid., Altschul et al., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-5, 1994, og referanser i denne). Disse fremgangsmåtene muliggjør bestemmelse av den biologiske betydning av større domener eller områder i et polypeptid av interesse. Slike hybrider kan endre reaksjonskinetikk og binding, begrense eller utvide substratspesifisiteten eller endre vevs-lokalisering og cellulær lokalisering av et polypeptid, og kan anvendes for polypeptider med ukjent struktur.

Fusjonsproteiner kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjent blant fagfolk, ved å fremstille hver bestanddel av fusjonsproteinet og konjugere dem kjemisk. Alternativt kan et polynukleotid som koder for begge bestanddeler i fusjonsproteinet i korrekt leseramme, dannes ved anvendelse av kjente teknikker og uttrykkes ved fremgangsmåtene som beskrives heri. For eksempel kan en del av eller en hel heliks som besitter en biologisk funksjon, utbyttes i zalphall-ligand ifølge foreliggende oppfinnelse med de funksjonelt ekvivalente heliksene fra et annet medlem av familien, f.eks. IL-15, IL-2, IL-4 eller GM-CSF. Slike bestanddeler omfatter, men er ikke begrenset til, den sekretoriske signalsekvens, heliksene A, B, C, D; løkkene A/B, B/C, C/D, fireheliksbunt-cytokiner. Slike fusjonsproteiner ville forventes å ha en biologisk funksjonsprofil som er den samme som eller ligner profilen til polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse, eller andre kjente medlemmer av fireheliksbunt-cytokinfamilien, avhengig av den konstruerte fusjon. Videre kan slike fusjonsproteiner vise andre egenskaper, som beskrevet heri.

Standardteknikker innen molekylærbiologi og kloning kan anvendes for å utveksle de ekvivalente domener mellom zalphall-ligandpolypeptidet og polypeptidene som de er fusjonert til. Generelt kobles et DNA-segment som koder for et domene av interesse, f.eks. heliksene A-D i zalphall-ligand eller andre domener som beskrives heri, operativt i ramme til minst ett annet DNA-segment som koder for et annet polypeptid (f.eks. et domene eller område fra et annet cytokin (f.eks. IL-2 eller lignende) og innsettes i en egnet ekspresjonsvektor, som beskrevet heri. Generelt fremstilles DNA-konstruksjoner slik at de forskjellige DNA-segmentene som koder for de tilsvarende områdene i et polypeptid, er operativt sammenkoblet med opprettholdt leseramme for dannelse av en enkelt konstruksjon som koder for hele fusjons proteinet eller en funksjonell del av dette. En DNA-konstruksjon vil f.eks. kode fra N-enden til C-enden et fusjonsprotein som omfatter et signalpolypeptid, etterfulgt av et modent fireheliksbunt-cytokin som inneholder heliks A, etterfulgt av heliks B, etterfulgt av heliks C, etterfulgt av heliks D. Slike fusjonsproteiner kan uttrykkes, isoleres og analyseres for aktivitet, som beskrevet heri.

Zalphall-ligandpolypeptider eller fragmenter av disse kan også fremstilles ved kjemisk syntese. Zalphall-ligandpolypeptider kan være monomerer eller multimerer, glykosylerte eller ikke-glykosylerte, pegylerte eller ikke-pegylerte, og de kan omfatte en innledende metioninaminosyrerest eller ikke. Polypeptidene kan f.eks. fremstilles ved peptidsyntese i fast fase, f.eks. som beskrevet av Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1963 .

Molekylaktiviteten ifølge foreliggende oppfinnelse kan måles ved anvendelse av en rekke analysemetoder som måler proliferasjon og/eller binding til celler som uttrykker zalphall-reseptoren. Av spesiell interesse er endringer i zalphall-ligandavhengige celler. Egnede cellelinjer som kan modifiseres til å bli zalphall-ligandavhengige, omfatter den IL-3-avhengige cellelinje BaF3 (Palacios og Steinmetz, Cell, 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol., 6:4133-4135, 1986), FDC-Pl (Hapel et al., Blood, 64:786-790, 1984) og M07e (Kiss et al., Leukemia, 7:235-240, 1993). Vekstfaktoravhengige cellelinjer kan etableres ifølge publiserte fremgangsmåter (se f.eks. Greenberger et al., Leukemia Res., 8:363-375, 1984; Dexter et al., i Baum et al., red., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol., 1979, 145-156, 1980).

Proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbare for å stimulere proliferasjon, aktivering, differensiering og/eller induksjon eller inhibering av spesialiserte cellefunksjoner i celler som deltar i homøostase av hematopoesen og immunfunksjonen. Nærmere bestemt er zalphall-ligandpolypeptider anvendbare for stimulering av proliferasjon, aktivering, differensiering, induksjon eller inhibering av spesialiserte cellefunksjoner i celler fra de hematopoietiske linjer, innbefattet, men ikke begrenset til, T-celler, B-celler, NK-celler, dendritt-celler, monocytter og makrofager, så vel som epitelceller. Proliferasjon og/eller differensiering av hematopoietiske celler kan måles in vitro ved anvendelse av dyrkede celler eller in vivo ved tilførsel av molekyler ifølge oppfinnelsen til en egnet dyremodell. Analyser som måler celleproliferasjon eller -differensiering, er vel kjent innen faget. Analyser som måler proliferasjon, omfatter f.eks. analyser som kjemosensitivitet for fargestoffet nøytralrødt (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs, 8:347-354, 1990, som inkorporeres heri ved referanse) , inkorporering av radioaktivt merkede nukleotider (Cook et al., Analytical Biochem., 179:1- 1, 1989, som inkorporeres heri ved referanse), inkorporering av 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) i DNA i prolifererende celler (Porstmann et al., J. Immunol. Methods, 82:169-179, 1985, som inkorporeres heri ved referanse) og anvendelse av tetrazoliumsalter (Mosmann, J. Immunol. Methods, 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res., 48:589-601, 1988; Marshall et al., GrowthReg., 5:69-84, 1995; og Scudiero et al., Cancer Res., 48:4827-4833, 1988; som alle inkorporeres heri ved referanse). Analyser som måler differensiering, omfatter f.eks. måling av celleoverflatemarkører som er forbundet med stadiumspesifikk ekspresjon i et vev, enzymatisk aktivitet, funksjonell aktivitet eller morfologiske endringer (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation, 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; som alle inkorporeres heri ved referanse).

Molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan analyseres in vivo ved anvendelse av virale tilførselssystemer. Eksempler på virus for dette formål omfatter adenovirus, herpes-virus, retrovirus, kukoppevirus og adenoassosiert virus (AAV). Adenovirus, et dobbelttrådet DNA-virus, er for tiden den best undersøkte genoverføringsvektor for tilførsel av heterolog nukleinsyre (for en oversikt, se T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol., 43:161-89, 1994; og J.T. Douglas og D.T. Curiel, Science Sc Medicine, 4:44-53, 1997).

Som en ligand kan aktiviteten av zalphall-ligandpolypeptidet måles med et silikonbasert biosensormikrofysiometer som måler den ekstracellulære surgjøringshastighet eller proton-utskillelsen som er forbundet med reseptorbinding og etter-følgende fysiologiske cellulære responser. Et eksempel på en slik innretning er"Cytosensor"-mikrofysiometeret som frem stilles av Molecular Devices, Sunnyvale, CA. En rekke cellulære responser, f.eks. celleproliferasjon, ionetransport, energi-produksjon, inflammatoriske responser, regulatorisk aktivering og reseptoraktivering og lignende, kan måles ved denne fremgangsmåten. Se f.eks. McConnel, H.M. et al., Science, 257:1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol., 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth., 222:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol., 346:87-95, 1998.

Videre kan zalphall-ligand anvendes for identifisering av celler, vev eller cellelinjer som responderer på en zalphall-ligandstimulert reaksjonsvei. Mikrofysiometeret som beskrives ovenfor, kan anvendes for hurtig identifisering av ligandrespon-derende gener, f.eks. celler som responderer på zalphall-ligand ifølge foreliggende oppfinnelse. Cellene kan dyrkes i nærvær eller fravær av zalphall-ligandpolypeptid. De celler som utløser en målbar endring i ekstracellulær surgjøring i nærvær av zalphall-ligand, responderer på zalphall-ligand. Slike celler eller cellelinjer kan anvendes for å identifisere antagonister og agonister av zalphall-ligandpolypeptid, som beskrevet ovenfor .

I lys av vevsfordelingen som er observert for zalphall-reseptoren, har agonister (innbefattet naturlig zalphall-ligand/ -substrat /-kof aktor/osv. ) og/eller antagonister et enormt potensial for anvendelser både in vi tro og in vivo. Forbindelser som identifiseres som zalphall-ligandagonister, er anvendbare for ekspansjon, proliferasjon, aktivering, differensiering og/eller induksjon eller inhibering av spesialiserte cellefunksjoner i celler som deltar i homøostase av hematopoese og immunfunksjon. Zalphall-ligand og agonistforbindelser er f.eks. anvendbare som bestanddeler i definerte celledyrkningsmedier, og kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre cytokiner og hormoner for å erstatte serum, som vanligvis anvendes ved celle-dyrkning. Agonister er således anvendbare for spesifikk fremming av vekst og/eller utvikling av T-celler, B-celler, NK-celler, cytotoksiske lymfocytter og andre celler fra den lymfoide linje og den myeloide linje i kultur.

Antagonister er også anvendbare som forskningsreagenser for å karakterisere seter for ligand-reseptorinteraksjon. Antagonister er anvendbare for inhibering av ekspansjon, prolifera sjon, aktivering og/eller differensiering av celler som deltar i regulering av hematopoese. Inhibitorer av zalphall-ligandaktivitet (zalphall-ligandantagonister) omfatter anti-zalphall-ligandantistoffer og løselige zalphall-ligandreseptorer, så vel som

andre peptider og ikke-peptider midler (innbefattet ribozymer).

Zalphall-ligand kan også anvendes for identifisering av inhibitorer (antagonister) av ligandens aktivitet. Analyse-forbindelser tilsettes analysene som beskrives heri for identifisering av forbindelser som inhiberer aktiviteten til zalphall-ligand. I tillegg til analysene som beskrives heri, kan prøver analyseres for inhibering av zalphall-ligandaktivitet i en rekke analyser som er utformet for måling av reseptorbinding, stimulering/ inhibering av zalphall-ligandavhengige cellulære responser eller proliferasjon av zalphall-reseptoruttrykkende celler.

Et zalphall-ligandpolypeptid kan uttrykkes som en fusjon med et konstant område fra immunglobulintungkjeden,

typisk et Fc-fragment, som inneholder to konstant område-domener og mangler det variable området. Fremgangsmåter for fremstilling av slike fusjoner beskrives i US patentskrifter nr. 5 155 027 og 5 567 584. Slike fusjoner utskilles typisk som multimere molekyler, hvori Fc-delene er disulfidbundet til hverandre og to ikke-Ig-polypeptider er plassert svært nær hverandre. Fusjoner av denne typen kan f.eks. anvendes for dimerisering, økt stabilitet og halveringstid in vivo, for affinitetsrensing av ligand, som in vitro-analyseredskap eller som en antagonist. For anvendelse i analyser bindes kimærene til et støttemiddel via Fc-området og anvendes i et ELISA-format.

Et zalphall-ligandbindende polypeptid kan også anvendes til rensing av ligand. Polypeptidet immobiliseres til et fast støttemiddel, f.eks. kuler av agarose, kryssbundet agarose, glass, celluloseresiner, kiselgelbaserte resiner, polystyren, kryssbundet polyakrylamid eller lignende materialer som er stabile under anvendelsesbetingelsene.Fremgangsmåter for kobling av polypeptider til faste støttemidler er kjent innen faget og omfatter aminkjemi, cyanogenbromidaktivering, N-hydroksysuksinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydryl-aktivering og hydrazidaktivering. Det resulterende medium vil generelt utformes til en kolonne, og ligandholdige væsker får passere gjennom kolonnen én eller flere ganger, slik at liganden får bindes til reseptorpolypeptidet. Liganden elueres så ved å anvende endringer i saltkonsentrasjonen, kaotrope midler (guanidin-HCl) eller pH for å bryte ligandreseptorbindingen.

Et analysesystem som anvender en ligandbindende reseptor (eller et antistoff, et medlem av et komplement-/antikomplementpar) eller et bindende fragment av disse og et kommersielt tilgjengelig biosensorinstrument (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) kan med fordel anvendes. Slike reseptorer, antistoffer, medlemmer av et komplement-/antikomplementpar eller fragmenter immobiliseres til overflaten av en mottakerbrikke. Anvendelse av dette instrumentet beskrives av Karlsson, J. Immunol.Methods, 145:229-240, 1991, og Cunningham og Wells, J. Mol. Biol., 234:554-63, 1993. En reseptor, et antistoff, et medlem eller et fragment tilkobles kovalent ved anvendelse av amin- eller sulfhydrylkjemi til dekstranfibrer som er koblet til et gullbelegg i gjennomstrømningscellen. En analyseprøve får passere gjennom cellen. Dersom en ligand, en epitop eller det tilsvarende medlem av komplement-/antikomplementparet foreligger i prøven, vil dette bindes til den immobiliserte reseptor, antistoffet eller medlemmet, slik at mediets refraksjonsindeks endres, noe som påvises som en endring i overflateplasmon-resonansen i gullbelegget. Dette systemet muliggjør bestemmelse av på- og av-hastigheter, hvorfra bindingsaffiniteten kan beregnes, og bestemmelse av bindingsstøkiometrien. Alternativt kan ligand-/reseptorbinding analyseres ved anvendelse av "SELDI"-teknologi (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).

Ligandbindende reseptorpolypeptider kan også anvendes i andre analysesysterner som er kjent innen faget. Slike systemer

omfatter Scatchard-analyse for bestemmelse av bindingsaffinitet (se Scatchard, Ann. NY Acad. Sei., 51:660-672, 1949) og kalori-metriske analyser (Cunningham et al., Science, 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science, 245:821-25, 1991).

Zalphall-ligandpolypeptider kan også anvendes for fremstilling av antistoffer som bindes til zalphall-ligandepitoper, -peptider eller -polypeptider. Zalphall-ligandpolypeptidet eller et fragment av dette fungerer som et antigen (immunogen) som inokuleres i et dyr og utløser en immunrespons. En fagperson vil innse at antigene, epitopbærende polypeptider inneholder en sekvens på minst 6, fortrinnsvis minst 9, og mer fortrukket minst 15-30, på hverandre følgende aminosyrerester fra et zalphall-ligandpolypeptid (f.eks. SEQ ID NO: 2). Polypeptider som omfatter en større del av et zalphall-ligandpolypeptid, det vil si 3 0-100 aminosyrerester opp til hele lengden av aminosyresekvensen, omfattes. Antigener eller immunogene epitoper kan også omfatte tilkoblede merkelapper, adjuvanser og bærere, som beskrevet heri. Egnede antigener omfatter zalphall-ligandpolypeptidet som kodes av SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 32 til aminosyre nr. 162, eller et kontinuerlig fragment på 9-31 aminosyrer av dette. Andre egnede antigener omfatter moden zalphall-ligand av fullengde, heliksene A-D og enkeltvise helikser A, B, C og D fra fireheliksbunt-strukturen til zalphall-ligand eller kombinasjoner av disse, som beskrevet heri. Foretrukne peptider for anvendelse som antigener er hydrofile peptider som dem identifisert av en fagperson ut fra et hydrofobisitetsplott, som beskrevet heri, f.eks. aminosyrerestene 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 og 158-162 i SEQ ID NO: 2.

Antistoffer fra en immunrespons frembrakt ved inokulering av et dyr med disse antigenene kan isoleres og renses som beskrevet heri. Fremgangsmåter for fremstilling og isolering av polyklonale og monoklonale antistoffer er vel kjent innen faget. Se f.eks. Current Protocols in Immunology, Cooligan et al.

(red.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboraory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor, NY, 1989; og Hurrell, J.G.R., red., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.

Det vil være åpenbart for en gjennomsnittsfagperson at polyklonale antistoffer kan frembringes ved å inokulere en rekke varmblodige dyr, f.eks. hester, kuer, geiter, sauer, hunder, kyllinger, kaniner, mus og rotter, med et zalphall-ligandpolypeptid eller et fragment av dette. Immunogenisiteten til et zalphall-ligandpolypeptid kan forsterkes ved anvendelse av et adjuvans, f.eks. alun (aluminiumhydroksid), eller Freunds komplette eller ukomplette adjuvans. Polypeptider som er anvendbare for immunisering, kan også omfatte fusjonspolypeptider, f.eks. fusjoner mellom zalphall-ligand eller en del av dette og et immunglobulinpolypeptid eller maltosebindende protein. Poly-peptidimmunogenet kan være et fullengdemolekyl eller en del av et slikt. Dersom polypeptiddelen er "haptenlignende", kan en slik del med fordel kobles eller bindes til en makromolekylær bærer (f.eks. "keyhold limpet"-hemocyanin (KLH), bovint serum-albumin (BSA) eller tetanustoksoid) for immunisering.

Som anvendt heri, omfatter begrepet "antistoffer" polyklonale antistoffer, affinitetsrensede polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer og antigenbindende fragmenter, f.eks. de proteolytiske fragmentene F(ab')2og Fab. Genetisk fremstilte, intakte antistoffer eller fragmenter, f.eks. kimære antistoffer, Fv-fragmenter, enkeltkjedeantistoffer og lignende, så vel som syntetiske antigenbindende peptider og polypeptider, omfattes også. Ikke-humane antistoffer kan humaniseres ved å innføre ikke-humane CDR-er i humanrammeverksområder og konstante områder, eller ved å innføre hele ikke-humane variable domener (eventuelt "kledd" med en humanlignende overflate ved å erstatte eksponerte aminosyrerester, hvor resultatet er et "finer"-antistoff ) . I noen tilfeller kan humaniserte antistoffer fortsatt inneholde ikke-humane aminosyrerester i de humane rammeverks-domenene i det variable området for å fremme korrekte bindings-egenskaper. Ved å humanisere antistoffer kan den biologiske halveringstid økes, og faren for uheldige immunreaksjoner ved tilførsel til mennesker reduseres. Videre kan humane antistoffer fremstilles i transgene, ikke-humane dyr som er blitt modifisert slik at de inneholder humane immunglobulingener, som beskrevet i WIPO-publikasjon WO 98/24893. Det foretrekkes at de endogene immunglobulingenene i slike dyr aktiveres eller fjernes, f.eks. ved homolog rekombinasjon.

Antistoffer anses å være spesifikt bindende dersom:

1} de viser et terskelnivå for bindingsaktiviteten, og 2} de ikke i vesentlig grad kryssreagerer med beslektede polypeptidmolekyler. Et terskelnviå for bindingen påvises dersom anti-zalphall-ligandantistof f er som beskrevet heri bindes til et zalphall-ligandpolypeptid, -peptid eller en -epitop med en affinitet som er minst ti ganger større enn bindingsaffiniteten til kontrollpolypeptid (ikke-zalphall-ligandpolypeptid). Det foretrekkes at antistoffene viser en bindingsaffinitet (Ka) påIO6M"<1>eller høyere, fortrinnsvis IO<7>M"<1>eller høyere, mer foretrukket IO<8>M"<1>eller høyere, og mest foretrukket IO<9>M"<1>eller høyere. Bindingsaffiniteten til et antistoff kan lett bestemmes av en gjennomsnittsfagperson, f.eks. ved Scatchard-analyse (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sei., 51:660-672, 1949).

Hvorvidt zalphall-ligandantistoffer ikke i vesentlig grad kryssreagerer med beslektede polypeptidmolekyler, vises f.eks. ved at antistoffet påviser zalphall-ligandpolypeptid, men ikke kjente, beslektede polypeptider, ved anvendelse av en standard Western blot-analyse (Ausubel et al., ibid.). Eksempler på kjente, beslektede polypeptider er polypeptider som er beskrevet innen teknikkens stand, f.eks. kjente ortologer og paraloger, og lignende kjente medlemmer av en proteinfamilie. Analysen kan også gjøres ved anvendelse av ikke-humane og mutante zalphall-ligandpolypeptider. Videre kan antistoffer "screenes mot" kjente, beslektede polypeptider for isolering av en populasjon som spesifikt bindes til zalphall-ligandpolypeptidene. For eksempel adsorberes antistoffer frembrakt mot zalphall-ligand til beslektede polypeptider som er koblet til et uløselig støttemiddel; antistoffer som er spesifikke for zalphall-ligand, vil strømme gjennom bærestoffet under egnede buffer-betingelser. Screening muliggjør isolering av polyklonale og monoklonale antistoffer som ikke kryssreagerer med kjente, nært beslektede polypeptider (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al. (red.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Screening og isolering av spesifikke antistoffer er vel kjent innen faget. Se Fundamental Immunology, Paul (red.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol., 43:1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W.

(red.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol., 2:67-101, 1984. Spesifikt bindende anti-zalphall-ligandantistof f er kan påvises ved en rekke fremgangsmåter som anvendes innen faget og beskrives nedenfor.

En rekke analysefremgangsmåter som er kjent blant fagfolk, kan anvendes for påvisning av antistoffer som bindes til zalphall-lilgandproteiner eller -polypeptider. Eksempler på slike analyser beskrives i detalj i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Representative eksempler på slike analyser omfatter: samtidig immunelektroforese, radioimmunanalyse, radio- immunutfelling, enzymkoblet immunadsorpsjonsanalyse (ELISA), "dot blot"- eller Western blot-analyse, inhiberings- eller konkurranseanalyse og "sandwich"-analyse. I tillegg kan antistoffer analyseres for binding til villtype sammenlignet med mutant zalphall-ligandprotein eller -polypeptid.

Antistoffer mot zalphall-ligand kan anvendes for merking av celler som uttrykker zalphall-ligand; for isolering av zalphall-ligand ved affinitetsrensing; for diagnostiske analyser for bestemmelse av nivået i sirkulasjonen av zalphall-ligandpolypeptider; for påvisning eller kvantifisering av løse-lig zalphall-ligand som en markør for underliggende patologiske tilstander eller sykdommer; i analytiske fremgangsmåter som anvender FACS; for gjennomsøking av ekspresjonsbiblioteker; for frembringelse av antiidiotypiske antistoffer; og som nøytrali-serende antistoffer eller som antagonister for blokkering av zalphall-ligandaktivitet in vi tro og in vivo. Egnede grupper for direkte merking omfatter radioaktive isotoper, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescerende markører, kjemiluminescerende markører, magnetiske partikler og lignende; indirekte merking kan omfatte bruk av biotin-avidin eller andre komplement-/antikomplementpar som intermediater. Antistoffene heri kan også konjugeres direkte eller indirekte til medikamenter, toksiner, radioaktive isotoper og lignende, og disse konju-gatene anvendes for diagnostiske eller terapeutiske formål in vivo. Videre kan antistoffer mot zalphall-ligand eller fragmenter derav anvendes in vitro for påvisning av denaturert zalphall-ligand eller fragmenter derav i analyser, f.eks. Western blot eller andre analyser som er kjent innen faget.

Egnede påvisbare molekyler kan være direkte eller indirekte festet til polypeptidet eller antistoffet og omfatter radioaktive isotoper, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescerende markører, kjemiluminescerende markører, magnetiske partikler og lignende. Egnede cytotoksiske molekyler kan være direkte eller indirekte festet til polypeptidet eller antistoffet, og omfatter bakterietoksiner eller plantetoksiner (f.eks. difteritoksin, saporin, Pseudomonas-eksotoksin, ricin, abrin og lignende), så vel som terapeutiske radioaktive isotoper, slik som jod-131, rhenium-188 eller yttrium-90 (enten direkte koblet til polypeptidet eller antistoffet, eller festet indirekte ved hjelp av f.eks. en chelaterende gruppe). Polypeptider eller antistoffer kan også konjugeres til cytotoksiske medikamenter, f.eks. adriamycin. For indirekte tilkobling av et påvisbart eller cytotoksisk molekyl kan det påvisbare eller cytotoksiske molekyl konjugeres til et medlem av et komplement- /antikomplementpar , hvor det andre medlemmet er bundet til polypeptid- eller antistoffdelen. For disse formål er biotin/- streptavidin et eksemplarisk komplement-/antikomplementpar.

Bindende polypeptider kan også fungere som zalphall-ligand- "antagonister " for blokkering av zalphall-ligandbinding og signaloverføring in vitro og in vivo. Disse anti-zalphall-ligandbindende polypeptidene vil være anvendbare for inhibering av zalphall-ligandaktivitet eller -proteinbinding.

Polypeptid-toksinfusjonsproteiner eller antistoff-toksin-fusjonsproteiner kan anvendes for målstyrt inhibering eller fjerning av celler eller vev (f.eks. for behandling av cancerceller eller -vev). Dersom polypeptidet har flere funksjonelle domener (det vil si et aktiveringsdomene eller et reseptorbindende domene, pluss et målstyringsdomene), kan alternativt et fusjonsprotein som omfatter bare målstyringsdomenet være egnet for å styre et påvisbart molekyl, et cytotoksisk molekyl eller et komplementært molekyl til en celle- eller vevstype av interesse. I de tilfeller hvor fusjonsproteinet omfatter et komplementært molekyl, kan det antikomplementære molekyl konjugeres til et påvisbart eller cytotoksisk molekyl. Slike domene-komplementære molekylfusjonsproteiner representerer således en generisk målstyrende bærer for celle-/vevsspesifikk tilførsel av generiske antikomplement-påvisbart/cytotoksisk molekylkonju-gater.

Zalphall-ligandcytokinfusjonsproteiner eller antistoff cytokinf us jonsproteiner kan anvendes for å fremme dreping in vivo av målvev (f.eks. cancere i blod og benmarg) dersom

zalphall-ligandpolypeptidet eller anti-zalphall-ligandantistof-fet styres til den hyperproliferative blodcelle eller benmargs-celle (se genereltHornick et al., Blood, 85:4437-47, 1997). De beskrevne fusjonsproteiner muliggjør målstyring av et cytokin til et ønsket virkningssete, hvorved det erholdes en forhøyet lokal konsentrasjon av cytokin. Egnede zalphall-ligandpolypeptider eller anti-zalphall-ligandantistoffer styres til en

uønsket celle eller et uønsket vev (f.eks. en tumor eller en leukemi), og det tilkoblede cytokin formidler forbedret mål-cellelysis ved effektorceller. Egnede cytokiner for dette formål omfatter f.eks. interleukin 2 og granulocyttmakrofag-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF).

Differensiering er en progressiv og dynamisk prosess som begynner med pluripotente stamceller og slutter med terminalt differensierte celler. Pluripotente stamceller som kan regenereres uten at de forpliktes til en gitt cellelinje, uttrykker et sett med differensieringsmarkører som går tapt når en forpliktelse til en gitt cellelinje opptrer. Forløperceller uttrykker et sett med differensieringsmarkører hvor noen fort-setter å uttrykkes etter hvert som cellene utvikler seg langs cellelinjereaksjonsveien mot modning, mens andre ikke gjør det. Differensieringsmarkører som uttrykkes utelukkende av modne celler, er vanligvis funksjonelle egenskaper som celleprodukter, enzymer for fremstilling av celleprodukter og reseptorer. Et cellepopulasjonsdifferensieringsstadium måles ved å identifisere markørene som foreligger i cellepopulasjonen.

Det foreligger bevismateriale som tyder på at faktorer som stimulerer spesifikke celletyper langs en reaksjonsvei mot terminal differensiering eller dedifferensiering, påvirker hele cellepopulasjonen som har opphav i en felles forløpercelle eller stamcelle. Således omfatter foreliggende oppfinnelse stimulering eller inhibering av proliferasjon av lymfoide celler, hematopoietiske celler og epitelceller.

Zalphall-ligand ble isolert fra vev som vites å ha en viktig immunologisk funksjon og som inneholder celler som spiller en rolle i immunsystemet. Zalphall-ligand uttrykkes i CD3<+->selekterte aktiverte celler fra perifert blod, og det er blitt vist at ekspresjonen av zalphall-ligand øker etter T-celleaktivering. Videre viser resultatene fra eksperimenter som beskrives i eksempelseksjonen heri at polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse har en virkning på vekst/ekspansjon av og/eller differensieringsstadiet til NK-celler eller NK-for-løperceller. Ytterligere bevismateriale viser at zalphall-ligand påvirker proliferasjon og/eller differensiering av T-celler og B-celler in vivo. Faktorer som både stimulerer proliferasjon av hematopoietiske forløperceller og aktiverer modne celler, er generelt kjent. NK-celler responderer på IL-2 alene, men proliferasjon og aktivering krever generelt ytterligere vekstfaktorer. Det er f.eks. blitt vist at IL-7 og Steel-faktor (c-sett-ligand) var nødvendig for dannelse av kolonier av NK-for-løperceller. IL-15 + IL-2 i kombinasjon med IL-7 og Steel-faktor var mer effektive (Mrozek et al., Blood, 87:2632-2640, 1996). Imidlertid kan ikke identifiserte cytokiner være nødvendige for proliferasjon av spesifikke undergrupper av NK-celler og/eller NK-forløpere (Robertson et al., Blood, 76:2451-2438, 1990). Et preparat som omfatter zalphall-ligand og IL-15 stimulerer NK-forløpere og NK-celler, med holdepunkter for at dette preparat har høyere aktivitet enn tidligere beskrevne faktorer og faktor-kombinas j oner.

Analyser som måler differensiering, omfatter f.eks. måling av cellemarkører forbundet med stadiumspesifikk ekspresjon i et vev, enzymatisk aktivitet, funksjonell aktivitet eller morfologiske endringer (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation, 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989). Alternativt kan zalphall-ligandpolypeptidet selv fungere som ytterligere en celleover-flatemarkør eller utskilt markør forbundet med stadiumspesifikk ekspresjon i et vev. Slik kan direkte måling av zalphall-ligandpolypeptid eller tap av ekspresjon av dette i et vev under differensieringen fungere som en markør for differensiering av vev.

På tilsvarende måte kan direkte måling av zalphall-ligandpolypeptid eller tap av ekspresjon av dette i et vev bestemmes i et vev eller i celler etter hvert som de gjennomgår en tumorutvikiing. Økt invasivitet og motilitet av celler, eller økt eller redusert ekspresjon av zalphall-ligand i en førcancer-tilstand eller cancertilstand, sammenlignet med normalt vev, kan fungere som et diagnostisk middel for transformasjon, invasjon og metastase i tumorutvikiingen. Slik kjennskap til en tumors utviklingsstadium eller metastase vil hjelpe den behandlende lege ved valg av den mest egnede behandling, eller behandlingens aggressivitet, for en gitt cancerpasient. Fremgangsmåter for å måle økt eller redusert ekspresjon (av enten mRNA eller protein) er vel kjent innen faget og beskrives heri, og kan anvendes på zalphall-ligandekspresjon. For eksempel kan nærvær eller fravær av polypeptider som regulerer cellemotiliteten anvendes som et diagnostisk og prognostisk hjelpemiddel ved prostatacancer (Banyard, J. og Zetter, B.R., Cancer and Metast. Rev., 17:449-458, 1999). Som en effektor på cellemotiliteten kan økt eller redusert ekspresjon av zalphalll-ligand fungere som et diagnostisk middel for lymfoid cancer, B-cellecancer, epitelcancer, hematopoietisk cancer og andre cancere.

Videre kan aktiviteten og virkningen av zalphall-ligand på tumorutvikiing og metastase måles in vivo. Flere syngeneiske musemodeller er blitt utviklet for å undersøke påvirkningen av polypeptider, forbindelser eller andre typer behandling på tumorutviklingen. I disse modellene implanterer tumorceller som er blitt passert i kultur i mus fra samme stamme som tumor-donoren. Cellene vil utvikles til tumorer med lignende egenskaper i mottakermusene, og metastaser vil også opptre i noen av modellene. Egnede tumormodeller for våre undersøkelser omfatter blant annet Lewis-lungekarsinom (ATCC nr. CRL-1642) og B-16-melanom (ATCC nr. CRL6323). Begge disse er hyppig anvendte tumorlinjer som er syngeneiske til C57BL6/J-musen, som lett kan dyrkes og manipuleres in vi tro. Tumorer som følger av implanta-sjon av en av disse cellelinjene kan metastasere til lungene hos C57BL6/J-mus. Lewis-lungekarsinommodellen er nylig blitt anvendt i mus for identifisering av en angiogeneseinhibitor (0'Reilly, M.S. et al., Cell, 75:315-328, 1994). C57BL6/J-mus behandles med et eksperimentelt middel, enten ved daglige injeksjoner av rekombinant protein, agonist eller antagonist, eller injeksjon én gang av rekombinant adenovirus. Tre dager etter denne behandlingen implanteres 10<5->10<6>celler under rygghuden. Alternativt kan cellene selv infiseres med rekombinant adenovirus, f.eks. adenovirus som uttrykker zalphall-ligand, før implantasjonen, slik at proteinene syntetiseres i tumorsetet eller intracellulært, snarere enn systemisk. Musene utvikler normalt synlige tumorer i løpet av 5 dager. Tumorene får vokse over et tidsrom på opptil 3 uker, og i løpet av dette tidsrommet kan de nå en størrelse på 1500-1800 mm<3>i den behandlede kontrollgruppe. Tumorens størrelse og kroppsvekten måles nøye gjennom hele eksperimentet. På avlivningstidspunktet fjernes tumoren og veies sammen med lunger og lever. Lungevekten er blitt vist å korre-lere godt med den metastatiske tumorbyrde. Som ytterligere et mål telles antall metastaser på lungeoverflaten. Den fjernede tumor, lunge og lever forberedes for histopatologisk under-søkelse, immunhistokjemisk undersøkelse og in situ-hybridisering ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget og som beskrives heri. Virkningen av det uttrykte polypeptid det gjelder, f.eks. zalphall-ligand, på tumorens evne til å rekrut-tere vaskulatur og gjennomgå metastaser kan således anslås. Videre kan de implanterte cellene i stedet for anvendelse av adenovirus transfekteres transient med zalphall-ligand. Anvendelse av stabile zalphall-ligandtransfektanter, så vel som anvendelse av induserbare promoterer for aktivering av zalphall-ligandekspresjonen in vivo, er kjent innen faget og kan anvendes i dette systemet for å anslå virkningen av zalphall-ligand på induksjon av metastaser. Videre kan renset zalphall-ligand eller kondisjonert zalphall-ligandmedium injiseres direkte i muse-modellen, og således anvendes i dette systemet. For en generell referanse, se 0'Reilly, M.S. et al., Cell, 7S:315-328, 1994; og Rusciano, D. et al., Murine Models of Liver Metastasis, Invasion Metastasis, 24:349-361, 1995.

Zalphall-ligand vil være anvendbar ved behandling av tumorogenese, og vil derfor være anvendbar ved behandling av cancer. Zalphall-ligand inhiberer IL-4-stimulert proliferasjon av anti-IgM-stimulerte normale B-celler, og en tilsvarende virkning observeres i B-celletumorlinjer, noe som tyder på at det kan være terapeutiske fordeler ved å behandle pasienter med zalphall-ligand for å indusere B-celletumorcellene til en mindre proliferativ tilstand. Liganden kan tilføres i kombinasjon med andre midler som allerede er i bruk, innbefattet konvensjonelle kjemoterapeutiske midler så vel som immunmodulatorer som interferon-a. a-/P~interferoner er blitt vist å være effektive ved behandling av noen leukemier og sykdomsmodeller i dyr, og den vekstinhiberende virkning av interferon-a og zalphall-ligand er additive for minst én B-celletumoravledet cellelinje.

Et zalphall-ligand-såporinfusjonstoksin kan anvendes mot et tilsvarende sett av leukemier og lymfomer, noe som ut-vider omfanget av leukemier som kan behandles med zalphall-ligand. Fusjonstoksinformidlet aktivering av zalphall-reseptoren tilveiebringer to uavhengige midler for inhibering av mål-cellenes vekst, hvor den første er identisk med virkningene som observeres med liganden alene og den andre skyldes tilførsel av toksinet via reseptorinternalisering. Det lymfoidbegrensede ekspresjonsmønster for zalphall-reseptoren tyder på at ligand-saporinkonjugatet kan tolereres av pasienter.

Dersom behandling av ondartede tilstander omfatter allogeneisk benmargstransplantasjon eller stamcelletransplanta-sjon, kan zalphall-ligand være av verdi for å styrke "graft-vs-tumor"-virkningen. Zalphall-ligand stimulerer dannelsen av lytiske NK-celler fra forløperceller i benmargen og stimulerer proliferasjon av T-celler etter aktivering av antigenresep-torene. Når pasienter gis allogene benmargstransplantater, vil derfor zalphall-ligand styrke dannelsen av antitumorresponser, med eller uten infusjon av donorlymfocytter.

Vevsfordelingen av en reseptor for et gitt cytokin gir sterke signaler om de mulige virkningsseter for cytokinet.

Northern-analyse av zalphall-reseptor viste transkripter i human milt, brissel, lymfeknute, benmarg og i leukocytter fra perifert blod. Spesifikke celletyper ble identifisert som zalphall-reseptoruttrykkende, og kraftige signaler ble observert i en blandet lymfocyttreaksjon (MLR) og i Burkitts lymfomceller Raji. De to monocyttiske cellelinjene THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cancer, 26:171-176, 1980) og U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cancer, 17:565-577, 1976) var negative.

Zalphall-reseptor uttrykkes i relativt høyt nivå i MLR, hvor mononukleære celler fra perifert blod (PBMNC) fra to individer sammenblandes, noe som fører til gjensidig aktivering. Påvisning av høyt transkriptnivå i MLR, men ikke i hvilende T-eller B-cellepopulasjoner, tyder på at zalphall-reseptorekspresjonen kan induseres i én eller flere celletyper under aktiver-ingen. Aktivering av isolerte populasjoner av T- og B-celler kan oppnås på kunstig vis ved å stimulere cellene med PMA og "Ionomycin" . Når sorterte celler ble behandlet under disse aktiver-ingsbetingelsene, økte nivået av zalphall-reseptortranskript i begge celletyper, noe som understøtter en rolle for denne reseptoren og zalphall-ligand i immunresponser, særlig i autokrine og parakrine T- og B-celleekspansjoner under aktivering. Zalphall-ligand kan også spille en rolle i ekspansjonen av mer primitive forløperceller som inngår i lymfopoesen.

Zalphall-reseptor ble funnet å foreligge i lavt nivå i hvilende T- og B-celler og ble oppregulert under aktivering i begge celletypene. Det er av interesse at B-cellene også ned-regulerer transkriptet hurtigere enn T-cellene gjør, noe som tyder på at signalamplituden og tidspunktet for demping av signalet er viktig for korrekt regulering av B-celleresponsene.

I tillegg viser en stor andel av lamina propria-cellene i tarm positive hybridiseringssignaler med zalphall-reseptor. Dette vevet består av en blandet populasjon av lymfoide celler, innbefattet aktiverte CD4<+->T-celler og aktiverte B-celler. Immun-dysfunksjon, særlig kronisk aktivering av immunresponsen i slim-hinner, spiller en viktig rolle i sykdomsutviklingen ved Crohns sykdom; unormal respons på og/eller produksjon av proinflamma-toriske cytokiner er også en faktor under mistanke (Braegger et al., Annals Allergy, 72:135-141, 1994; Sartor, R.B., Am. J. Gastroenterol., S2:5S-11S, 1997. Zalphall-ligand sammen med IL-15 ekspanderer NK-celler fra forløpere i benmarg og forsterker NK-celleeffektorfunksjonen. Zalphall-ligand kostimulerer også modne B-celler som stimuleres med anti-CD40- antistoffer, men inhiberer B-celleproliferasjon indusert ved signaler via IgM. Zalphall-ligand forsterker T-celleproliferasjonen sammen med et signal via T-cellereseptoren, og overekspresjon i transgene mus fører til lymfopeni og ekspansjon av monocytter og granulocyt-ter. Disse pleiotrope virkningene av zalphall-ligand tyder på at den kan tilveiebringe terapeutisk nytteverdi for et bredt utvalg av sykdommer som oppstår grunnet defekter i immunsystemet, innbefattet (men ikke begrenset til) systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artritt (RA), multippel sklerose (MS), myasthenia gravis og diabetes. Det er viktig å merke seg at disse sykdommene er resultater av et komplisert nettverk av immundysfunksjoner (SLE er f.eks. manifestasjonen av defekter både i T- og B-celler), og at immunceller avhenger av interaksjoner med hverandre for å utløse en kraftig immunrespons. Zalphall-ligand (eller en antagonist av liganden), som kan anvendes for manipulering av flere enn én type immunceller, er derfor en attraktiv terapeutisk kandidat for anvendelse i flere stadier av sykdommen.

Polypeptidene og proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes ex vivo, f.eks. i en autolog benmargs- kultur. Kort beskrevet fjernes benmarg fra en pasient før kjemoterapeutisk behandling eller organtransplantasjon og behandles med zalphall-ligand, eventuelt i kombinasjon med ett eller flere andre cytokiner. Den behandlede benmarg returneres så til pasienten etter kjemoterapeutisk behandling for å fremme gjenvinning av benmargen eller, etter transplantasjon, for undertrykkelse av "graft vs. host"-sykdom. I tillegg kan proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse også anvendes for ex vivo-ekspansjon av forløperceller fra benmarg eller perifert blod (PBPC). Før behandlingen kan benmargen stimuleres med stamcellefaktor (SCF) for å frigi tidlige forløperceller til den perifere sirkulasjon. Disse forløpercellene kan oppsamles og konsentreres fra perifert blod, og så behandles i kultur med zalphall-ligand, eventuelt i kombinasjon med ett eller flere andre cytokiner, innbefattet, men ikke begrenset til, SCF, IL-2, IL-4, IL-7 eller IL-15, for differensiering og proliferasjon til lymfoide kulturer med høy tetthet, som så kan returneres til pasienten etter kjemoterapeutisk behandling eller transplantasjon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for ekspansjon av hematopoietiske celler og hematopoietiske forløperceller som omfatter dyrkning av benmarg eller celler fra perifert blod med et preparat som omfatter en mengde av polypeptid ifølge hvilket som helst av patentkravene 1-9 som er tilstrekkelig til å gi et økt antall lymfoidceller i cellene fra benmarg eller perifert blod, sammenlignet med celler fra benmarg eller perifert blod dyrket i fravær av polypeptid ifølge hvilket som helst av patentkravene 1-9. I andre utførelser er de hematopoietiske cellene og de hematopoietiske forløpercellene lymfoide celler. I en annen utførelse er de lymfoide cellene NK-celler eller cytotoksiske T-celler. Videre kan preparatet også omfatte minst ett annet cytokin utvalgt fra gruppen bestående av IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3-ligand og stamcellefaktor.

Alternativt kan zalphall-ligand aktivere immunsystemet, noe som vil være viktig for å forsterke immuniteten mot infeksiøse sykdommer, behandling av immunkompromitterte pasienter, f.eks. HIV-pasienter, eller for forbedring av vaksiner. Nærmere bestemt kan zalphall-ligandstimulering eller ekspansjon av NK-celler eller disses forløpere ha terapeutisk verdi ved behandling av virusinfeksjon og som en antineoplastisk faktor. NK-celler antas å spille en hovedrolle for fjerning av metastatiske tumorceller, og pasienter med både metastaser og faste tumorer har redusert NK-celleaktivitetsnivå (Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 230:221-244, 1998). På tilsvarende måte kan zalphall-ligandstimulering av immunresponsen mot virale og ikke-virale, patogene midler (innbefattet bakterier, protozoer og sopp) ha terapeutisk verdi ved behandling av slike infeksjoner ved inhibering av veksten av slike infeksiøse midler. Direkte eller indirekte bestemmelse av nivået av en patogen organisme eller et antigen, f.eks. en tumorcelle, som foreligger i kroppen, kan oppnås ved en rekke fremgangsmåter som er kjent innen faget og som beskrives heri.

Polynukleotider som koder for zalphall-ligandpolypeptider, er anvendbare i genterapeutiske anvendelser hvor det er ønsket å forhøye eller inhibere zalphall-ligandaktiviteten. Dersom et pattedyr har et mutert eller fraværende zalphall-ligandgen, kan zalphall-ligandgenet innføres i cellene til pattedyret. Et gen som koder for et zalphall-ligandpolypeptid kan innføres in vivo i en viral vektor. Slike vektorer omfatter et svekket eller defekt DNA-virus, f.eks., men ikke begrenset til, herpes simplex-virus (HSV), papillomavirus, Epstein Barr-virus (EBV), adenovirus, adenoassosiert virus (AAV) og lignende. Defekte virus som fullstendig eller nesten fullstendig mangler virale gener, foretrekkes. Et defekt virus er ikke infektivt etter innføring i en celle. Anvendelse av defekte virusvektorer muliggjør tilførsel til celler i et spesifikt, lokalisert område uten fare for at vektoren kan infisere andre celler. Eksempler på spesielle vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, en defekt herpes simplex-virus 1(HSVl)-vektor (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-30, 1991); en svekket adenovirus-vektor, f.eks. vektoren som beskrives av Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 50:626-30, 1992; og en defekt adenoassosiert virusvektor (Samulski et al., J. Virol., 61:3096-101, 1987; Samulski et al., J. Virol., 63:3822-8, 1989).

Et zalphall-ligandgen kan innføres i en retroviral vektor, f.eks. som beskrevet av Anderson et al., US patentskrift nr. 5 399 346; Mann et al., Cell, 33:153, 1983; Temin et al.,

US patentskrift nr. 4 650 764; Temin et al., US patentskrift nr. 4 980 289;Markowitz et al., J. Virol., 62:1120, 1988; Temin et al., US patentskrift nr. 5 124 263; internasjonal patentpublikasjon WO 95/07358, publisert 16. mars 1995 av Dougherty et al.; og Kuo et al., Blood, 82:845, 1993. Alternativt kan vektoren innføres ved lipofeksjon in vivo ved anvendelse av liposomer. Syntetiske kationiske lipider kan anvende for fremstilling av liposomer for transfeksjon in vivo av et gen som koder for en markør (Felgner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:7413-7, 1987; Mackey et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:8027-31, 1988). Anvendelse av lipofeksjon for innføring av eksogene gener i spesifikke organer in vivo har visse praktiske fordeler. Molekylær målstyring av liposomer til spesifikke celler representerer én fordel. Nærmere bestemt representerer styring av transfeksjonen til gitte celler én fordel. For eksempel vil styring av transfeksjonen til spesielle celletyper være spesielt fordelaktig i et vev med cellulær heterogenitet, f.eks. immunsystemet, bukspyttkjertelen, leveren, nyrene og hjernen. Lipider kan kobles kjemisk til andre molekyler for målstyring. Målstyrende peptider (f.eks. hormoner eller neurotrans-mittere), proteiner, slik som antistoffer, eller ikke-peptid-molekyler kan kobles kjemisk til liposomer.

Det er mulig å fjerne målcellene fra kroppen og innføre vektoren som et nakent DNA-plasmid, og så reimplantere de transformerte cellene i kroppen. Nakne DNA-vektorer for genterapi kan innføres i de ønskede vertsceller ved fremgangsmåter som er kjent innen faget, f.eks. transfeksjon, elektroporering, mikroinjeksjon, transduksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsium-fosfatutfelling, anvendelse av en genpistol eller anvendelse av en DNA-vektortransportør. Se f.eks. Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem., 263:14621-4, 1988.

"Antisense"-metodologi kan anvendes for inhibering av zalphall-ligandgentranskripsjon, slik at celleproliferasjonen inhiberes in vivo. Polynukleotider som er komplementære til et segment i et zalphall-ligandkodende polynukleotid (f.eks. et polynukleotid som beskrevet i SEQ ID NO: 1), utformes slik at de bindes til zalphall-ligandkodende mRNA og inhiberer translasjonen av dette mRNA. Slike "antisense"-polynukleotider anvendes for å inhibere ekspresjonen av zalphall-ligandpolypeptidkodende gener i cellekultur eller i et individ.

Mus som er modifisert slik at de uttrykket zalphall-ligandgenet, betegnet "transgene mus", og mus som viser fullstendig fravær av zalphall-ligandgenfunksjonen, betegnet "knock-out-mus", kan også frembringes (Snouwaert et al., Science, 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature, 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science, 244:1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al., Annu Rev Genet., 20:465-499, 1986). For eksempel kan transgene mus som overuttrykker zalphall-ligand, enten i hele kroppen eller under kontroll av en vevsspesifikk eller vevsbegrenset promoter, anvendes for å fastslå hvorvidt overekspresjon gir en fenotype. Overekspresjon av et villtype-zalphall-ligandpolypeptid, -polypeptidfragment eller en mutant av dette kan f.eks. endre normale cellulære prosesser, noe som fører til en fenotype som identifiserer et vev i hvilket zalphall-ligandekspresjon er funksjonelt relevant, og kan peke på et terapeutisk mål for zalphall-liganden og dens agonister eller antagonister. For eksempel er en foretrukket transgen mus å fremstille en mus som overuttrykker zalphall-liganden (aminosyrerestene 32-162 i SEQ ID NO: 2). Videre kan slik overekspresjon føre til en fenotype som viser likhet med humane sykdommer. På tilsvarende måte kan en zalphall-ligand-"knockout"-mus anvendes for å fastslå hvorvidt zalphall-ligand er absolutt nødvendig in vivo. Fenotypen til "knockout"-mus gjør det mulig å forutsi hvilke in vivo-virkninger en zalphall-lilgandantagonist, f.eks. dem beskrevet heri, kan ha. Zalphall-ligand-cDNA fra menneske eller mus kan anvendes for "knockout"-mus. Disse musene kan anvendes for å studere zalphall-ligandgenet og proteinet som kodes av dette i et in vivo-system, og kan anvendes som in vivo-modeller for tilsvarende humane sykdommer. Videre kan transgene mus som uttrykker zalphall-ligand-"antisense"-polynukleotider eller -ribozymer rettet mot zalphall-ligand, som beskrives heri, anvendes på tilsvarende måte som de transgene musene beskrevet ovenfor. Undersøkelser kan også utføres ved tilførsel av renset zalphall-ligandprotein.

For farmasøytisk anvendelse utformes proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse for parenteral, fortrinnsvis intravenøs eller subkutan, tilførsel ifølge konvensjonelle fremgangsmåter. Det bioaktive polypeptid eller antistoffkonjugatene som beskrives heri, kan tilføres intravenøst, intraarterielt eller intraduktalt, eller det kan innføres lokalt på det påtenkte virkested. Intravenøs tilførsel vil skje ved bolusinjeksjon eller infusjon over et tidsrom som typisk er fra 1 til flere timer. Generelt vil farmasøytiske preparater omfatte et zalpha-11-ligandprotein i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff, f.eks. saltvann, bufret saltvann, 5 % dekstrose i vann eller lignende. Preparatene kan videre omfatte én eller flere eksipienser, konserveringsmidler, solubiliseringsmidler, buffermidler, albumin for å forhindre proteintap på beholderens overflater osv. Fremgangsmåter for utformingen er vel kjent inn faget og beskrives f.eks. i Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, red., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19. utgave, 1995. De terapeutiske doser vil generelt ligge i området 0,1-100 (lg/kg kroppsvekt pr. dag, fortrinnsvis 0,5-20 |ig/kg pr. dag, hvor den nøyaktige dose bestemmes av den behandlende lege ifølge aksepterte standarder, idet naturen og omfanget av tilstanden som skal behandles, egenskapene til pasienten osv. tas i betraktning. Bestemmelse av doser ligger innenfor gjennom-snitts fagpersonens kunnskapsområde. Proteinene kan tilføres for akutt behandling over et tidsrom på 1 uke eller mindre, ofte over et tidsrom på 1-3 dager, eller de kan anvendes i kronisk behandling over flere måneder eller år. Generelt er en terapeutisk effektiv mengde av zalphall-ligand en mengde som er tilstrekkelig til å gi en klinisk signifikant endring i den hematopoietiske funksjon eller immunfunksjonen.

Oppfinnelsen illustreres videre ved de påfølgende eksempler.

Eksempler

Eksempel 1

Konstruksjon av MPL- zalphall- polypeptidkimære: det ekstracellulære domenet og transmembrandomenet fra MPL fusjonert til det intracellulære signaldomenet fra zalphall

Det ekstracellulære domenet og transmembrandomenet fra MPL-reseptoren fra mus ble isolert fra et plasmid som inneholdt MPL-reseptoren fra mus (plasmid PHZl/MPL) ved anvendelse av PCR med primerne ZC 17 212 (SEQ ID NO: 5) og ZC 19 914 (SEQ ID

NO: 6). Reaksjonsbetingelsene var som følger: 95 °C i 1 minutt;

35 sykluser ved 95 °C i 1 minutt, 45 °C i 1 minutt og 72 °C i

2 minutter; etterfulgt av 72 °C i 10 minutter; og lagring ved

10 °C. PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), og MPL-reseptorfragmentet på ca. 1,5 kb ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "Qiaquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksj oner.

Det intracellulære domenet fra human zalphall ble isolert fra et plasmid som inneholdt zalphall-reseptor-cDNA ved anvendelse av PCR med primerne ZC 19 913 (SEQ ID NO: 8) og ZC 20 097 (SEQ ID NO: 9). Polynukleotidsekvensen som tilsvarer den kodende sekvens for zalphall-reseptoren er vist i SEQ ID

NO: 7, og den tilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 115. Reaksjonsbetingelsene var som ovenfor. PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt

(BoehringerMannheim), og zalphall- fragmentet på ca. 900 bp ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "Qiaquick" ifølge produsentens instruksjoner.

De to isolerte fragmentene beskrevet ovenfor ble sammenblandet i et 1:1 volumetrisk forhold og anvendt i en PCR-reaksjon ved anvendelse av ZC 17 212 (SEQ ID NO: 5) og ZC 20 097 (SEQ ID NO: 9) for dannelse av MPL-zalphall-kimæren. Reaksjonsbetingelsene var som følger: 95 °C i 1 minutt; 35 sykluser ved 95 °C i 1 minutt, 55 °C i 1 minutt, 72 °C i 2 minutter; etterfulgt av 72 °C i 10 minutter; og lagring ved 10 °C. Hele PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt (Boehringer Mannheim), og det kimære MPL-zalphall-fragment på ca. 2,4 kb ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjons settet "Qiaquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Det kimære MPL-zalphall-fragment ble kuttet med EcoRI (BRL) og Xbal (Boehringer Mannheim) ifølge produsentens instruksjoner. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert i en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt (Boehringer Mannheim), og den kuttede MPL-zalphall-kimære ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "Qiaquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Den resulterende kuttede MPL-zalphall-kimære ble innsatt i en ekspresjonsvektor som beskrevet nedenfor.

Mottakerekspresjonsvektoren pZP-5N ble kuttet med EcoRI (BRL) og Hindlll (BRL) ifølge produsentens instruksjoner og gelrenset, som beskrevet ovenfor. Dette vektorfragmentet ble kombinert med EcoRI- og Xbal-kuttet MPL-zalphall-kimæren isolert ovenfor og et XbaI/-HindIII-linkerfragment i en ligeringsreaksjon. Ligeringsreaksjonen ble utført ved anvendelse av T4-ligase (BRL) ved 15 °C over natten. En prøve av ligeringsblandingen ble elektroporert inn i elektrokompetente DH10B-"ElectroMAX"- E. coli-celler (25U.F, 200 Q, 2,3 V). Transformanter ble utsådd på LB+-ampicillinskåler og enkeltkolonier analysert ved PCR for å påvise MPL-zalphall-kimæren ved anvendelse av ZC 17 212 (SEQ ID NO: 5) og ZC 20 097 (SEQ ID NO: 9) ved anvendelse av PCR-betingelsene som er beskrevet ovenfor.

Bekreftelse av sekvensen til MPL-zalphall-kimæren ble oppnådd ved sekvensanalyse med følgende primere: ZC 12 700 (SEQ ID NO: 10), ZC 5 020 (SEQ ID NO: 11), ZC 6 675 (SEQ ID NO: 12), ZC 7 727 (SEQ ID NO: 13), ZC 8 290 (SEQ ID NO: 14), ZC 19 572 (SEQ ID NO: 15), ZC 6 622 (SEQ ID NO: 16), ZC 7 736 (SEQ ID

NO: 17) og ZC 9 273 (SEQ ID NO: 18).Innskuddet var ca. 2,4 bp og hadde full lengde.

Eksempel 2

MPL- zalphall- kimærebasert proliferasjon i BaF3- analyse ved anvendelse av Alamar Blue

A. Konstruksjon av BaF3- celler som uttrykker MPL- zalphall-kimære

BaF3, en interleukin-3-avhengig (IL-3) prelymfoidcelle-linje avledet fra benmarg fra mus (Palacios og Steinmetz, Cell, 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol., 6:4133-4135, 1986), ble oppbevart i komplett medium (RPMI-medium (JRH Biosciences Inc., Lenexa, KS) supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt kalveserum, 2 ng/ml muse-IL-3 (mIL-3) (R&D, Minneapolis, MN), 2 mM L-"glutaMax-1" (Gibco BRL), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL) og PSN-antibiotika (Gibco BRL)). Før elektroporeringen ble pZP-5N/MPL-zalphall-plasmid-DNA (eksempel 1) fremstilt og renset ved anvendelse av et Qiagen Maxi Prep-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. BaF3-celler for elektroporering ble vasket én gang i RPMI-medium og så resuspendert i RPMI-medium ved en celletetthet på 10<7>celler/ml. 1 ml resuspenderte BaF3-celler ble blandet med 3 0 |ig pZP-5N/MPL-zalphall-plasmid-DNA og overført til separate elektroporerings-kamre for engangsbruk (Gibco BRL). Etter 15 minutters inkubering ved romtemperatur ble cellene gitt to på hverandre følgende sjokk (800 lFad/300 V; 1180 lFad/300 V) tilført med et elektro-poreringsapparat ("CELL-PORATOR", Gibco BRL). Etter 5 minutters gjenvinningstid ble de elektroporerte cellene overført til 50 ml komplett medium og plassert i en inkubator i 15-24 timer (37 °C, 5 % CO2) . Cellene ble så nedsentrifugert og resuspendert i 50 ml komplett medium inneholdende "Geneticin" (Gibco) (500 |ig/ml G418) i en T-162-flaske for isolering av den G418-resistente fraksjon. Porsjoner av de transfekterte BaF3-celler, i det på-følgende betegnet BaF3/MPL-zalphall-celler, ble analysert for signaliseringsevne, som beskrevet nedenfor.

B. Analyse av signaliseringsevnen til BaF3/ MPL- zalphall-cellene ved anvendelse av en Alamar Blue- proliferasjonsanalyse

BaF3/MPL-zalphall-celler ble nedsentrifugert og vasket i det komplette medium som er beskrevet ovenfor, men uten mIL-3 (i det påfølgende betegnet "mIL-3-fritt medium"). Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerning av mIL-3. Cellene ble så talt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i en 96-brønners plate med 5000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn med mIL-3-fritt medium.

Proliferasjon av BaF3/MPL-zalphall-cellene ble anslått ved anvendelse av trombopoietin fra mus (mTPO) fortynnet med mIL-3-fritt medium til konsentrasjoner på 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml, 7,5 ng/ml, 3,75 ng/ml, 1,8 ng/ml, 0,9 ng/ml, 0,5 ng/ml og 0,25 ng/ml. 100 ul fortynnet mTPO ble tilsatt til BaF3/MPL-zalphall-cellene. Det totale analysevolum er 200 ul. Negative kontroller ble analysert parallelt ved anvendelse av mIL-3-fritt medium alene, uten tilsetning av mTPO. Analyseplatene ble inkubert ved 37 °C, 5 % CO2i 3 dager, hvoretter Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) ble tilsatt i en mengde på 20 ul/brønn. Alamar Blue gir en fluoro-metrisk avlesning basert på cellenes metabolske aktivitet, og gir således en direkte måling av celleproliferasjon sammenlignet med en negativ kontroll. Platene ble igjen inkubert ved 37 °C, 5 % CO2i 24 timer. Platene ble avlest i en "Fmax"-plateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved anvendelse av programvaren "SoftMax" Pro ved bølgelengdene 544 nm (eksitasjon) og 590 nm (emisjon).

Resultatene bekreftet signaliseringsevnen til den intracellulære del av zalphall-reseptoren, siden trombopoietin induserte en proliferasjon som lå ca. ti ganger over bakgrunnsnivået ved mTPO-konsentrasjoner på 62 ng/ml og høyere.

Eksempel 3

Konstruksjon av ekspresjonsvektor som uttrykker fullengde-zalphall

Hele zalphall-reseptoren ble isolert fra et plasmid som inneholdt zalphall-reseptor-cDNA (SEQ ID NO: 7) ved anvendelse av PCR med primerne ZC 19 905 (SEQ ID NO: 19) og ZC 19 906 (SEQ ID NO: 20). Reaksjonsbetingelsene var som følger: 95 °C i

1 minutt; 35 sykluser ved 95 °C i 1 minutt, 55 °C i 1 minutt,

72 °C i 2 minutter; etterfulgt av 72 °C i 10 minutter; og lagring ved 10 °C. PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt (Boehringer Mannheim), og zalphall-cDNA på ca. 1,5 kb ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "Qiaquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.

Renset zalphall-cDNA ble kuttet med BamHI (Boehringer Mannheim) og EcoRI (BRL) ifølge produsentens instruksjoner. Kutteproduktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt (Boehringer Mannheim), og det kuttede zalphall-fragment ble renset ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "Qiaquick" ifølge produsentens instruksjoner. Det resulterende kuttede zalphall-fragment ble innsatt i en ekspresjonsvektor, som beskrevet nedenfor.

Mottakerekspresjonsvektoren pZP-5N ble kuttet med BamHI (Boehringer Mannheim) og EcoRI (BRL) ifølge produsentens instruksjoner og gelrenset, som beskrevet ovenfor. Dette vektorfragmentet ble kombinert med BamHI- og EcoRI-kuttet zalphall-fragment isolert ovenfor i en ligeringsreaksjon ved anvendelse av T4-ligase (BRL). Ligeringsblandingen ble inkubert ved 15 °C over natten. En prøve av ligeringsblandingen ble elektroporert inn i elektrokompetente DH10B-"ElectroMAX"- E. coli-celler (25 UF, 200 £2, 2,3 V). Transformanter ble utsådd på LB+-ampicillinskåler og enkeltkolonier analysert ved PCR for påvisning av zalphall-sekvensen med ZC 19 905 (SEQ ID NO: 19) og ZC 19 906 (SEQ ID NO: 20) ved anvendelse av PCR-betingelsene som er beskrevet ovenfor.

En bekreftelse av zalphall-sekvensen ble gjort ved sekvensanalyse med følgende primere: ZC 12 700 (SEQ ID NO: 10), ZC 5 020 (SEQ ID NO: 11), ZC 20 114 (SEQ ID NO: 21), ZC 19 459 (SEQ ID NO: 22), ZC 19 954 (SEQ ID NO: 23) og ZC 20 116 (SEQ ID NO: 24). Innskuddet var ca. 1,6 kb og hadde full lengde.

Eksempel 4

Zalphall- basert proliferasjon i BaF3- analyse ved anvendelse av Alamar Blue

A. Konstruksjon av BaF3- celler som uttrykker zalphall-reseptor

BaF3-celler som uttrykker fullengde-zalphall-reseptoren, ble konstruert som i eksempel 2A ovenfor ved anvendelse av 30 ug av zalphall-ekspresjonsvektoren som beskrives i eksempel 3 ovenfor. BaF3-cellene som uttrykte zalphall-reseptor-mRNA, ble betegnetBaF3/zalphall. Disse cellene ble anvendt for søk etter zalphall-ligand, som beskrevet nedenfor i eksemplene 5 og 6.

Eksempel 5

Søk etter zalphall- ligand anvendelse av BaF3/ zalphall- celler ved anvendelse av enAlamar Blue- proliferasjonsanalyse

A. Aktivering av primære apesplenocytter for analyse av nærvær av zalphall- ligand

Apesplenocytter ble stimulert in vitro for fremstilling av kondisjonert medium for analyse av nærvær av zalphall-ligandaktivitet, som beskrevet nedenfor. Apemilt ble erholdt fra 8 år gamle M. nesestrian-hunnaper. Milten ble fragmentert for dannelse av en enkeltcellesuspensjon. De mononukleære cellene ble isolert ved "Ficoll-Paque" PLUS-tetthetsgradientsentrifugering (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige). De mononukleære cellene ble utsådd ved 2 x IO<6>celler/ml i RPMI-1640-medium tilsatt 10 % FBS og aktivert med 5 ng/ml forbol-12-myristat-13-acetat (PMA)

(Calbiochem, San Diego, CA) og 0,5 mg/ml "Ionomycin" (Calbiochem) i 48 timer. Supernatanten fra de stimulerte apemiltcellene ble anvendt for analyse av proliferasjonen av BaF3/zalphall-cellene, som beskrevet nedenfor.

B. Søk etter zalphall- ligand ved anvendelse av BaF3/ zalphall- celler ved anvendelse av en Alamar Blue-prolif eras jonsanalyse

BaF3/zalphall-celler ble nedsentrifugert og vasket i mIL-3-fritt medium. Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerningen av mIL-3. Cellene ble så talt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i en 96-brønners plate med 5000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn med mIL-3-fritt medium.

Proliferasjonen av BaF3/zalphall-cellene ble anslått ved anvendelse av kondisjonert medium fra aktivert apemilt (se eksempel 5A). Kondisjonert medium ble fortynnet med mIL-3-fritt medium til konsentrasjoner på 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %,

3,125 %, 1,5 %, 0,75 % og 0,375 %. 100 ul fortynnet kondisjonert medium ble tilsatt til BaF3/zalphall-cellene. Det totale analysevolum er 200 ul. Analyseplatene ble inkubert ved 37 °C,

5 % CO2i 3 dager, hvoretter Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) ble tilsatt i et volum på 20 ul/brønn. Platene ble igjen inkubert ved 37 °C, 5 % C02i 24 timer. Platene ble avlest i en "Fmax"-plateleser (Molecular Devices), som beskrevet ovenfor (eksempel 2).

Resultatene bekreftet den proliferative respons av BaF3/zalphall-cellene på en faktor som forelå i kondisjonert medium fra aktivert apemilt. Den målte respons var ca. fire ganger høyere enn bakgrunnsnivået ved 50 %-konsentrasjonen. Ikke-transfekterteBaF3-celler prolifererte ikke som respons på denne faktoren, noe som viser at faktoren er spesifikk for zalphall-reseptoren. C. Human primærkilde anvendt for isolering av zalphall-ligand

100 ml blod ble tappet fra seks donorer. Blodet ble tappet ved anvendelse av 10 x 10 ml "vacutainer"-rør inneholdende heparin. Blod fra seks donorer ble slått sammen (600 ml),

fortynnet 1:1 i PBS og separert ved anvendelse av "Ficoll-Paque" PLUS (Pharmacia Biotech). Utbyttet av de isolerte humane primærceller etter separasjon i Ficoll-gradienten var 1,2 x IO<9>celler.

Cellene ble suspendert i 9,6 ml MACS-buffer (PBS, 0,5 % EDTA, 2 mM EDTA). 1,6 ml cellesuspensjon ble tatt ut, og 0,4 ml

CD3-mikrokuler (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) ble tilsatt. Blandingen ble inkubert i 15 minutter ved 4 °C. Cellene merket med CD3-kuler ble vasket med 30 ml MACS-buffer og så resuspendert i 2 ml MACS-buffer.

En VS+-kolonne (Miltenyi) ble fremstilt ifølge produsentens instruksjoner. VS+-kolonnen ble så plassert i et "Vario-MACS"-magnetfelt (Miltenyi). Kolonnen ble ekvilibrert med 5 ml MACS-buffer. De isolerte primære humancellene ble så påsatt kolonnen. De CD3-negative cellene fikk passere gjennom kolonnen. Kolonnen ble vasket med 9 ml (3 x 3 ml) MACS-buffer. Kolonnen ble så fjernet fra magneten og plassert over et 15 ml falconrør. CD3<+->celler ble eluert ved tilsetning av 5 ml MACS-buffer til kolonnen, og bundne celler ble skylt ut ved anvendelse av stempelet levert av produsenten. Inkubasjonen av cellene med CD3-magnetkuler, vask og VS+-kolonnetrinnene (fra inkubering til eluering) ovenfor ble gjentatt ytterligere fem ganger. De resulterende CD3<+->fraksjonene fra de seks ko1onneseparasjonene ble slått sammen. Utbyttet av de selekterte humane CD3<+->cellene var 3 x IO<8>celler totalt.

En prøve av de selekterte sammenslåtte humane CD3<+->celler ble tatt ut for farging og sortering basert på et fluorescerende antistoff i en cellesorterer (FACS) for måling av renheten. De humane CD3<+->selekterte cellene var 91 % CD3<+->celler.

De humane CD3<+->selekterte cellene ble aktivert ved inkubering i RPMI + 5 % FBS + PMA, 10 ng/ml, og "Ionomycin"

0,5 ug/ml (Calbiochem) i 13 timer ved 37 °C. Supernatanten fra disse aktiverte CD3<+->selekterte humane cellene ble analysert for zalphall-ligandaktivitet, som beskrevet nedenfor. Videre ble de aktiverte CD3<+->selekterte humane cellene anvendt for fremstilling av et cDNA-bibliotek, som beskrevet i eksempel 6 nedenfor.

D. Analyse av supernatant fra aktiverte CD3+- selekterte humane celler for zalphall- ligand ved anvendelse av BaF3/ zalphall- celler og en Alamar Blue- proliferasjonsanalyse

Proliferasjon av BaF3/zalphall-cellene ble målt ved anvendelse av kondisjonert medium fra aktiverte CD3<+->selekterte humane celler (se eksempel 5C), fortynnet med mIL-3-fritt medium til konsentrasjoner på 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %,

1,5 %, 0,75 % og 0,375 %. 100 ul av det fortynnede kondisjonerte medium ble tilsatt til BaF3/zalphall-cellene. Totalt analysevolum er 200 ul. Analyseplatene ble inkubert og analysert som beskrevet i eksempel 5B.

Resultatene bekreftet den proliferative respons av BaF3/zalphall-cellene på en faktor som forelå i det kondisjonerte medium fra de aktiverte CD3<+->selekterte humane cellene. Den målte respons var ca. ti ganger over bakgrunnsnivået ved 50 %-konsentrasjonen. Ikke-transfekterte BaF3-celler prolifererte ikke som respons på denne faktoren, noe som viser at faktoren er spesifikk for zalphall-reseptoren. Videre blokkerte løselig zalphall-reseptor denne proliferative aktivitet i BaF3/zalphall-cellene (se eksempel 11).

Eksempel 6

Kloning av human zalphall- ligand fra et bibliotek fra humane CD3+- selekterte celler

Gjennomsøking av et cDNA-bibliotek fra primære humane aktiverte CD3<+->selekterte celler gav et isolert cDNA som er et nytt medlem av fireheliksbunt-cytokinfamilien. Dette cDNA kodet for zalphall-liganden. cDNA ble isolert ved analyse av zalphall-ligandaktivitet ved anvendelse av zalphall-reseptoren.

A. Vektoren for konstruksjon av et CD3+- selektert bibliotek

Vektoren for konstruksjon av det CD3<+->selekterte bibliotek var pZP7NX. pZP7NX-vektoren ble konstruert som følger. Det kodende området for seleksjonsmarkøren DHFR i vektoren pZP7 ble fjernet ved kutting av DNA med restriksjonsenzymene Ncol og Psti (Boehringer Mannheim). Det kuttede DNA ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, kuttet ut av gelen og gelrenset ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "Qiagen" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Et DNA-fragment som representerte det kodende området i seleksjonsmarkøren zeocin, ble amplifisert ved PCR-fremgangsmåten med primerne ZC 13 946 (SEQ ID NO: 25) og ZC 13 945 (SEQ ID NO: 26) og pZeoSV2(+) som templat. Det foreligger i tillegg restriksjonsseter for Psti og Bell i primer ZC 13 946 (SEQ ID NO: 25), og Ncol- og Sful-seter i primer

ZC 13 945 (SEQ ID NO: 26). PCR-fragmentet ble kuttet med restriksjonsenzymene Pstl og Ncol og klonet inn i vektoren pZP7, forberedt ved kutting med de samme to enzymene og påfølgende gelrensing. Denne vektoren ble betegnet pZP7Z. Deretter ble det zeocinkodende området fjernet ved kutting av vektoren pZP7Z med restriksjonsenzymene Bell og Sful. Det kuttede DNA ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, kuttet ut og gelrenset, og så ligert til et DNA fragment med det neomycinkodende området kuttet ut fra vektoren pZem228 (deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA; ATCC-deponeringsnummer 69446) med de samme restriksjonsenzymene Bell og Sful).

Denne nye vektoren, i hvilken det kodende området for seleksjonsmarkøren DHFR var erstattet med det kodende området for en neomycinseleksjonsmarkør fra vektor pZem228, ble betegnet pZP7N. Et fyllfragment som omfattet et Xhol-sete, ble addert til pZP7N for å gi en vektor som var egnet for retningsstyrt kloning med høy effektivitet av cDNA; denne nye vektoren ble betegnet pZP7NX. For å forberede vektoren for cDNA ble 20 ug pZP7NX kuttet med 20 enheter EcoRI (Life Technologies Gaithersburg, MD) og 20 enheter Xhol (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i 5 timer ved 37 °C, og så inkubert ved 68 °C i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble så fraksjonert i en 0,8 % 1 x TAE-agarosegel med lavt smeltepunkt for å separere fyllfragmentet fra vektoren. Vektorbåndet ble kuttet ut og behandlet med "beta-Agarase" (New England Biolabs, Beverly, MA) ifølge produsentens anbefalinger. Etter etanolutfelling ble den kuttede vektor resuspendert i vann til en konsentrasjon på 45 ng/ml som en for-beredelse for ligering til CD3<+->selektert cDNA-bibliotek, som beskrevet nedenfor.

B. Fremstilling av cDNA- bibliotek fra primære humane aktiverte CD3+- selekterte celler

Cirka 1,5 x IO<8>primære humane CD3<+->selekterte celler stimulert med "Ionomycin"/PMA ble isolert ved sentrifugering etter dyrkning ved 37 °C i 13 timer (eksempel 5C). Total-RNA ble isolert fra de nedsentrifugerte cellene ved anvendelse av settet "RNeasy Midi" fra Qiagen, Inc. (Valencia, CA). mRNA ble isolert fra 225 ug total-RNA ved anvendelse av "MPG-mRNA"-rensesett fra CPG Inc. (Lincoln Park, NJ) . 3,4 fig mRNA ble isolert og overført til dobbelttrådet cDNA ved anvendelse av følgende fremgangsmåte

Førstetråds-cDNA fra stimulerte humane CD3<+->selekterte celler ble syntetisert som følger. 9 ul oligo d(T)-selektert poly(A)-CD3<+->RNA i en konsentrasjon på 0,34 ug/ul og 1,0 Ul med 1 ug/ul av førstetrådsprimeren ZC 18 698 (SEQ ID NO:27), som inneholder et Xhol-restriksjonssete, ble sammenblandet og oppvarmet til 65 °C i 4 minutter og avkjølt på is. Førstetråds-cDNA-syntese ble innledet ved tilsetning av 9 ul førstetrådsbuffer

(5 x "SUPERSCRIPT"-buffer, Life Technologies), 4 ul 100 mM ditiotreitol og 2 ul av en deoksynukleotidtrifosfatløsning som inneholdt 10 mM av hver av dATP, dGTP, dTTP og 5-metyl-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.) til RNA-primerblandingen. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 45 °C i 4 minutter, etterfulgt av tilsetning av 8 ul 200 U/ul "Superscriptll", RNase H-reverstranskriptase (Life Technologies). Reaksjonsblandingen ble

inkubert ved 45 °C i 45 minutter, etterfulgt av økning av temperaturen med 1 °C for hvert 2. minutt til 50 °C, hvor reaksjonsblandingen ble holdt i 10 minutter. For denaturering av even-tuell sekundærstruktur og ytterligere forlengelse av cDNA ble reaksjonsblåndingen så oppvarmet til 70 °C i 2 minutter og temperaturen redusert til 55 °C i 4 minutter, hvoretter 2 fil "Superscriptll" RT ble tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 15 minutter, etterfulgt av en temperaturøkning til 70 °C med 1 minutt/l °C. Ikke-inkorporerte nukleotider ble fjernet fra cDNA ved to gangers utfelling i nærvær av 2 ug glykogen som bærer, 2,0 M ammoniumacetat og 2,5 volumer etanol, etterfulgt av vask med 100 ul 70 % etanol. cDNA ble resuspendert i 98 ul vann for anvendelse i andretrådssyntesen. Andretrådssyntesen ble utført på førstetråds-cDNA under betingelser som fremmet førstetrådspriming av andretrådssyntesen, noe som fører til dannelse av en DNA-hårnål. Andre-trådsreaksjonen inneholdt 98 ul førstetråds-cDNA, 3 0 ul 5 x polymerase I-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KC1, 25 mM MgCl2, 50 mM (NH4)2S04), 2 ul 100 mM ditiotreitol, 6 ul av en løsning som inneholdt 10 mM av hvert deoksynukleotidtrifosfat, 5 ul 5 mM b-NAD, 1 ul med 3 U/ul E. coli-DNA-ligase (New England Biolabs Inc.) og 4 ul med 10 U/ul E. coli-DNA-polymerase I (New England Biolabs Inc.). Reaksjonsblandingen ble satt sammen ved romtemperatur og inkubert ved romtemperatur i 2 minutter, etterfulgt av tilsetning av 4 ul med 3,8 U/ulRNase H (Life Technologies) . Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 15 °C i 2 timer, etterfulgt av inkubering i 15 minutter ved romtemperatur. 10 ul 1 M Tris, pH 7,4, ble tilsatt til reaksjonsblandingen, som så ble ekstrahert to ganger med fenol/kloroform og én gang med kloroform, hvoretter de organiske faser ble tilbakeekstrahert med 50 ul TE (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA). Vannfasene ble slått sammen og DNA utfelt med etanol i nærvær av 0,3 M natriumacetat. Nedsentrifugert materiale ble vasket med 100 ul 70 % etanol, lufttørket og resuspendert i 40 ul vann.

Enkelttrådet DNA i hårnålsstrukturen ble kuttet ved anvendelse av nuklease fra bønner. Reaksjonsblandingen inneholdt 40 ul andretråds-cDNA, 5 ul 10 x bønnenukleasebuffer (Life Technologies) og 5 ul bønnenuklease (Pharmacia Biotech Corp.) fortynnet til 1 U/ul i 1 x bønnenukleasebuffer. Reaksjonsbland ingen ble inkubert ved 37 °C i 45 minutter. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 10 ul 1 M Tris-HCl, pH 7,4, etterfulgt av ekstråksjoner med fenol/kloroform og kloroform, som beskrevet ovenfor. Etter ekstraksjonene ble cDNA utfelt med etanol i nærvær av 0,3 M natriumacetat. Nedsentrifugert materiale ble vasket med 100 ul 7 0 % etanol, lufttørket og resuspendert i 38 ul vann.

Resuspendert cDNA ble gjort buttendet med T4-DNA-polymerase. cDNA resuspendert i 38 ul vann ble blandet med 12 ul 5 x T4-DNA-polymerasebuffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM KCl, 25 mM MgCl2) , 2 ul 0,1 M ditiotreitol, 6 ul av en løsning som inneholdt 10 mM av hvert deoksynukleotidtrifosfat og 2 ul med 1 U/ul T4-DNA-polymerase (Boehringer Mannheim Corp.). Etter inkubering i 45 minutter ved 15 °C ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 30 Ul TE, etterfulgt av ekstraksjoner med fenol/kloroform og kloroform og tilbakeekstråksjon med 20 ul TE, som beskrevet ovenfor. DNA ble utfelt med etanol i nærvær av 2 ul "Pellet Paint" (Novagen) som bærer og 0,3 M natriumacetat, og ble resuspendert i 11 ul vann.

EcoRI-adaptorer ble ligert til 5'-endene i cDNA beskrevet ovenfor for å muliggjøre kloning i en ekspresjonsvektor. 11 ul cDNA og 4 ul med 65 pmol/ul av hemifosforylert EcoRI-adaptor (Pharmacia Biotech Corp.) ble blandet med 5 ul 5 x ligasebuffer (Life Technologies), 2 ul 10 mM ATP og 3 ul med 1 U/ul T4-DNA-ligase (Life Technologies), 1 Ul 10 x ligerings-buffer (Promega Corp.) og 9 ul vann. Den ekstra fortynningen med 1 x buffer var for å forhindre utfelling av "Pellet Paint". Reaksjonsblandingen ble inkubert i 9 timer i et vannbad hvor temperaturen ble økt fra 10 °C til 22 °C over et tidsrom på 9 timer, etterfulgt av 45 minutter ved 25 °C. Reaksjonen ble stanset ved inkubering ved 68 °C i 15 minutter.

For å lette retningsstyrt kloning av cDNA inn i en ekspresjonsvektor ble cDNA kuttet med Xhol, noe som fører til et cDNA med en klebrig 5'EcoRl-ende og en klebrig 3' Xhol-ende. Xhol-restriksjonssetet i 3'-enden av cDNA var blitt innført tidligere ved anvendelse av primeren ZC 18 698 (SEQ ID NO: 27). Restriksjonsenzymkuttingen ble utført i en reaksjonsblanding som inneholdt 35 ul av ligeringsblandingen beskrevet ovenfor, 6 ul 10 x H-buffer (Boehringer Mannheim Corp.), 1 ul med 2 mg/ml BSA (Biolabs Corp.), 17 ul vann og 1,0 ul 40 U/ul Xhol (Boehringer Mannheim). Kuttingen ble utført ved 37 °C i 1 time. Reaksjonen ble stanset ved inkubering ved 68 °C i 15 minutter, etterfulgt av etanolutfelling, vask og tørking som beskrevet ovenfor og re-suspensjon i 30 ul vann.

Det resuspenderte cDNA ble oppvarmet til 65 °C i

5 minutter og avkjølt på is, 4 [il 5 x farget gelpåsettings-løsning (Research Genetics Corp.) ble tilsatt, cDNA ble applisert på en 0,8 % 1 x TAE-agarosegel med lavt smeltepunkt ("SEA PLAQUE GTG"-agarose med lavt smeltepunkt; FMC Corp.) og fraksjonert ved elektroforese. Kontaminerende adaptorer og cDNA med størrelse under 0,6 kb ble kuttet ut fra gelen. Elektrodene ble reversert, smeltet agarose tilsatt for igjenfylling av brønnene, bufferen ble endret og elektroforesen fortsatt inntil cDNA var

konsentrert nær utgangsposisjonen. Området i gelen som inneholdt det konsentrerte cDNA, ble kuttet ut og plassert i et mikrofuge-sentrifugerør, og agarosen ble smeltet ved oppvarming til 65 °C i 15 minutter. Etter ekvilibrering av prøven til 45 °C ble 2 ul med 1 U/ul beta-agarose I (Biolabs, Inc.) tilsatt, og blandingen ble inkubert i 90 minutter ved 45 °C for nedbrytning av agarosen. Etter inkuberingen ble 1/10 volum 3 M Na-acetat tilsatt til prøven, og blandingen ble inkubert på is i 15 minutter. Prøven ble sentrifugert ved 14 000 x g i 15 minutter ved romtemperatur for fjerning av ikke nedbrutt agarose, og cDNA ble utfelt med etanol, vasket med 70 % etanol, lufttørket og resuspendert i 40 ul vann.

For å bestemme det optimale forhold mellom cDNA og

vektor ble flere ligeringsblandinger satt opp og fraksjonert ved elektroforese. Kort beskrevet ble 2 ul 5 x T4-ligasebuffer (Life Technologies), 1 ul 10 mM ATP, 1 ul pZP7NX kuttet med EcoRI-XhoI, 1 ul T4-DNA-ligase, fortynnet til 0,25 ug/ul (Life Technologies), vann til et volum på 10 ul og 0,5, 1,2 eller 3 ul cDNA sammenblandet i fire separate ligeringsblandinger, inkubert ved 22 °C i 4 timer og 68 °C i 20 minutter, utfelt med etanol i nærvær av natriumacetat, vasket, tørket og resuspendert i 10 ul. 1 ul av hver ligeringsblanding ble elektroporert inn i 40 ul "DHlOb ElectroMax"-elektrokompetente bakterier (Life Technologies) ved anvendelse av en 0,1 cm kyvette (Biorad) og en "Genepulser pulse controller" (Biorad) justert til 2,5 kV, 251 F, 200 ohm. Cellene ble umiddelbart resuspendert i 1 ml SOC-medium (Manniatis et

al., supra) , etterfulgt av 500 (il 50 % glyserol-SOC som konser-veringsmiddel. Disse "glyserollagerløsningene" ble nedfrosset i flere porsjoner ved -70 °C. Et uttak fra hver ble opptint og utsådd etter seriefortynning på LB-agarskåler tilsatt 100 ug/ml ampicillin. Koloniantallet tydet på at det optimale forhold mellom CD3<+->cDNA og pZP7NX-vektor var 1 ul til 45 ng; en slik ligering gav 4,5 millioner primærkloner.

For gjennomsøking av dette biblioteket ved anvendelse av en BaF3-zalphall-basert proliferasjonsanalyse (eksempel 5) ble glyserollagerløsningene fremstilt ovenfor fortynnet til flytende kulturer med 100 eller 250 kloner pr. porsjon i mikro-titerplater med dype brønner og dyrket i 24 timer ved 37 °C under omristing, og plasmid ble isolert ved anvendelse av et Qiagen-sett ifølge produsentens instruksjoner. Dette DNA ble så transfektert inn i BHK-celler, og mediet ble kondisjonert i 72 timer, høstet og plassert på 5 K BaF3-zalphall-celler i 72 timer, hvoretter proliferasjonen ble målt ved anvendelse av en "Alamar blue"-fluorescensanalyse (eksempel 5B og eksempel 2B).

For gjennomsøking av biblioteket ved sekresjonsfelle-kloning var det nødvendig med en kompleks, amplifisert form av biblioteket for transfeksjon av COS-7-celler. Omtrent 4,8 millioner kloner ble utsådd på 110 15 cm LB-agarskåler tilsatt 100 ug/ml ampicillin og 10 ug/ml meticillin. Etter inkubering av skålene over natten ved 37 °C ble bakteriene høstet ved avskraping og nedsentrifugert. Plasmid-DNA ble ekstrahert fra de nedsentrifugerte bakteriene ved anvendelse av et "Nucleobond-giga"-sett (Clonetech) ifølge produsentens instruksjoner. Dette plasmid ble så anvendt for transfeksjon av COS-7-celler (ATCC nr. CRL 1651) på objektglass og gjennomsøkt ved anvendelse av sekresjonsfelleteknikken beskrevet nedenfor (eksempel 12).

Eksempel 7

Ekspresjonskloning av human zalphall- ligand

Glyserollagerløsningene fra det aktiverte humane CD3<+->selekterte cellebibliotek (eksempel 6) ble tilsatt til "SuperBroth II" (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) +0,1 mg/ml ampicillin (amp) i en konsentrasjon på 250 celler pr. 800 ul.

E. Coli fikk ekvilibrere i 24 timer ved romtemperatur. På inokulasjonstidspunktet ble 400 ul utsådd påLB+amp-skåler for å bestemme den faktiske inokuleringstiter. Etter 24 timer ble koloniene på skålene talt, og den endelige konsentrasjon av "SuperBroth II" + E. coli ble justert til 250 celler pr. 1,2 ml. Tre ganger 2 1 ble inokulert, i alt 6 1. Kulturen ble så utsådd i 96-brønners blokker med dype brønner (Qiagen). Utsåingen ble utført med en 8-kanalers "Q-Fill2"-dispenser (Genetix, Christ-church, Dorset, UK). E. coli ble dyrket over natten ved 37 °C og omristing ved 250 rotasjoner/minutt i en New Brunswick Scientific Innova 4900-multiraders ristemaskin. E. coli ble nedsentrifugert ved 3000 rpm i en Beckman GS-6KR-sentrifuge. Nedsentrifugert E. coli ble nedfrosset ved -20 °C eller anvendt uten nedfrysning for fremstilling av minipreparater av plasmid-DNA. Hver porsjon med nedsentrifugerte celler inneholdt ca. 250 cDNA-kloner fra det humane CD3<+->selekterte cellebibliotek.

Fra disse blandingene av 250 cDNA-kloner ble det så fremstilt minipreparater av plasmid ved anvendelse av "QIAprep"-96 Turbo Miniprep-sett (Qiagen). Plasmid-DNA ble eluert ved anvendelse av 125 ul TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Dette plasmid-DNA ble så anvendt for transfeksjon av BHK-celler.

BHK- trans feks j on

BHK-celler ble utsådd i 96-brønners vevsdyrkningsplater 1 en tetthet på 12 000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn. Dyrkningsmediet var DMEM (Gibco BRL), 5 % varmeinaktivert, føtalt, bovint serum, 2 mM L-glutamin (Gibco BRL), 1 x PSN (Gibco BRL), 1 mM Na-pyruvat (Gibco BRL).

Neste dag ble BHK-cellene vasket én gang med 100 ul SFA. SFA er serumfritt medium bestående av DMEM/F12 (Gibco BRL), 2 mM L-"GlutaMax" (Gibco BRL), 1 mM Na-pyruvat, 10 ug/ml transferrin, 5 ug/ml insulin, 10 ug/ml fetuin, 2 ug/ml selen, 25 mM HEPES (Gibco BRL), 100 UM ikke-essensielle aminosyrer (Gibco

BRL) .

En DNA-/"Lipofectamin"-blanding fremstilles som følger: 2,2 ul "Lipofectamin"-reagens (Gibco BRL) blandes med 102,8 ul SFA ved romtemperatur, og ca. 5 Ul plasmid-DNA tilsetts så til "Lipofectamin"/SFA, slik at det dannes en DNA-/"Lipofectamin"-blanding som inkuberes ved romtemperatur i 3 0 minutter. SFA ble fjernet fra BHK-cellene, og cellene ble inkubert med 50 ul av DNA-/"Lipofectamin"-blandingen i 5 timer ved 37 °C med 5 % CO2. 50 ul av DNA-/"Lipofectamin"-blandingen ble tilsatt til hver av to brønner med BHK-celler, slik at transfeksjonene ble utført i duplikat.

Etter inkubering av BHK-cellene med DNA-/"Lipofectamin" -blandingen i 5 timer ble DNA-/"Lipofectamin"-blandingen fjernet, og 100 ul dyrkningsmedium ble tilsatt. Cellene ble inkubert over natten, og mediet ble fjernet og erstattet med 100 ul dyrkningsmedium. Etter dyrkning av cellene i 72 timer ble kondisjonert medium fjernet, nedfrosset ved -80 °C i minimum 20 minutter og opptint, hvoretter 50 ul ble analysert i zalpha-ll/BaF3-proliferasjonsanalysen som beskrives i eksemplene 2B og 5, for identifisering av blandinger av 250 kloner med ligandaktivitet.

Trettifem 96-brønners plater ble analysert i en enkelt analyse. Dette representerte ca. 250 cDNA-er/brønn eller i alt 840 000 cDNA-er. Av disse ga kondisjonert medium fra 54 brønner (som representerer 250 cDNA-er pr. brønn) positiv analyse i proliferasjonsanalysen. Kondisjonert medium fra disse positive blandingene ble analysert på ny i en annen analyse (sekresjons-felle) med og uten løselig reseptor (se eksempel 12). Den løse-lige zalphall-CEE-reseptor (eksempel 10A) ble anvendt i en sluttkonsentrasjon på ca. 1 ug/ml. For alle de 54 positive blandingene ble i det vesentlige all aktivitet nøytralisert ved tilsetning av den løselige zalphall-reseptoren, noe som viser at disse blandingene inneholdt et cDNA for zalphall-ligand. Fire av disse positive blandingene ble utvalgt for fraksjonering og isolering av ett enkelt cDNA som koder for zalphall-ligand. Disse var 45C5, 46611, 40H12 og 60A1.

For hver av disse fire blandingene ble 1 ul DNA anvendt for transformasjon av "ElectroMax"-DHlOB-celler (Gibco BRL) ved elektroporering. Transformantene ble utsådd på skåler med LB + amp (100 ug/ml) + meticillin (10 ug/ml) for erholdelse av enkeltkolonier. For hver elektroporerte blanding ble 960 enkeltkolonier plukket med tannpirkere og overført til ti 96-brønners plater som inneholdt 1,2 ml "SuperBroth II" pr. brønn. Disse platene ble nummerert fra 1 til 10 for hver av de fraksjonerte porsjonene (45C5, 46G11, 40H12 og 60A1). Platene ble inkubert over natten, og minipreparater av plasmid-DNA ble fremstilt som ovenfor. For 46G11, 40Hl2-og 60A1 ble plasmid-DNA fra fraksjo-neringsplatene transfektert inn i BHK-celler som ovenfor.

For 45C5 ble en "hurtig"-fremgangsmåte anvendt for å oppnå hurtigere identifisering av zalphall-ligand-cDNA. BHK-celler ble transfektert med plasmid-DNA fra fraksjonerings-platene som ovenfor, DNA-/"Lipofectamin"-blandingen ble fjernet etter 5 timers inkubering, og dyrkningsmedium ble tilsatt. Siden transfeksjonene ble utført i duplikat, ble dyrkningsmediet høstet neste dag etter 24 timer fra en av de transfekterte BHK-platene og høstet neste dag etter 48 timer fra den gjenværende transfekterte plate. Medium kondisjonert i 24 timer ble analysert som ovenfor for zalphall-ligandaktivitet ved anvendelse av proliferasjonsanalysen beskrevet heri.

Plasmid-DNA ble slått sammen fra 45C5-fraksjonerings-platene nr. 1-4 og analysert for binding av løselig zalphall-reseptor til liganden ved "sekresjonsfelle"-fremgangsmåten (se eksempel 12 nedenfor). Åtte positive kloner ble identifisert fra i alt 384 sekvenser. Resultatene fra proliferasjonsanalysen bekreftet zalphall-ligandaktiviteten og korrelerte med resultater fra sekresjonsfelleanalysen (se eksempel 12). Deretter ble plasmid-DNA-minipreparater fra platene nr. 1-4 fra 45C5-blandingsfraksjoneringen sekvensert for å bestemme DNA-sekvensen til hver av de 3 84 klonene.

Flere kloner som ble identifisert som positive i proliferasjonsanalysen og sekresjonsfelleanalysen, ble også sekvensert ved anvendelse av følgende primere: ZC 14 063 (SEQ ID

NO: 28), ZC 7 764a (SEQ ID NO: 38), ZC 7 764b (SEQ ID NO: 39), ZC 22 034 (SEQ ID NO: 40) og ZC 22 035 (SEQ ID NO: 41). Polynukleotidsekvensen til zalphall-ligand var fullengde (SEQ ID NO: 1), og den tilsvarende aminosyresekvens er vist (SEQ ID

NO: 2).

Eksempel 8

Konstruksjon av pattedyrekspresjonsvektorer som uttrykker løselige zalphall- reseptorer: zalphall- CEE, zalphall- CFLG, zalphall- CHIS og zalphall- Fc4

A. Konstruksjon av pattedyrekspresjonsvektor for zalphall som inneholder zalphall- CEE, zalphall- CFLG og zalphall-CHIS

En ekspresjonsvektor ble fremstilt for ekspresjonen av det løselige, ekstracellulære domenet fra zalphall-polypeptidet, pC4-zalphll-CEE, hvori konstruksjonen er utformet slik at den uttrykker et zalphall-polypeptid bestående av det utledede initierende metionin og som er avkortet i nabostilling til det utledede transmembrandomenet, og med en C-terminal Glu-Glu-merkelapp (SEQ ID NO: 29) .

Et zalphall-DNA-fragment på 700 bp, dannet ved PCR, ble fremstilt ved anvendelse av ZC 19 931 (SEQ ID NO: 30) og ZC 19 932 (SEQ ID NO: 31) som PCR-primere for innføring av Asp718- og BamHI-restriksjonsseter. Et plasmid som inneholdt zalphall-reseptor-cDNA-et (SEQ ID NO: 7) ble anvendt som templat. PCR-amplifisering av zalphall-fragmentet ble utført som følger: 25 sykluser ved 94 °C i 0,5 minutt; 5 sykluser ved 94 °C i 10 sekunder, 50 °C i 30 sekunder, 68 °C i 45 sekunder, etterfulgt av oppbevaring ved 4 °C. Reaksjonsblandingen ble renset ved ekstraksjon med kloroform/fenol og utfelling med isopropanol, og DNA ble kuttet med Asp718 og BamHI (Gibco BRL) ifølge produsentens fremgangsmåter. Et bånd av forventet størrelse, 7 00 bp, ble synliggjort ved 1 % agarosegelelektroforese og kuttet ut, og DNA-et ble renset ved anvendelse av et "QiaexII"-rensesystem (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.

Det utkuttede DNA ble subklonet i plasmid pC4EE, som var blitt kuttet med BamHI og Asp718. Ekspresjonsvektoren pC4-zalphall-CEE anvender det native zalphall-signalpeptid og kobler Glu-Glu-merkelappen (SEQ ID NO: 29) til C-enden av den ekstracellulære del av den zalphall-polypeptidkodende polynukleotidsekvens. Plasmid pC4EE er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett med metallotionein-l-promoteren fra mus, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser, et stoppkodon og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et E. coli-replikasjonsorigo, en ekspresjonsenhet for en seleksjonsmarkør for pattedyr med en SV40-promoter, en SV40-enhancer og SV40-replikasjonsorigo, et DHFR-gen og SV40-terminatoren.

Cirka 3 0 ng av det restriksjonskuttete zalphall-innskudd og ca. 12 ng av den kuttete vektor ble ligert over natten ved 16 °C. 1 ul av hver ligeringsreaksjon ble uavhengig av hverandre elektroporert inn i kompetente DH10B-celler (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) ifølge produsentens retningslinjer og utsådd på LB-plater tilsatt 50 mg/ml ampicillin og inkubert over natten. Koloniene ble analysert ved restriksjonsanalyse av DNA fremstilt fra 2 ml væskekulturer av enkeltkolonier. Innskuddssekvensen til positive kloner ble bekreftet ved sekvensanalyse. Plasmidfremstilling i større skala ble utført ved anvendelse av et "QIAGEN" Maxi Prep-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner .

Den samme prosess ble anvendt for fremstilling av de løselige zalphall-reseptorene med en C-terminal His-merkelapp, som består av seks His-rester i en rekke; og en C-terminal flag-merkelapp (SEQ ID NO: 37), zalphall-CFLAG. For fremstilling av disse konstruksjonene har den ovenfor nevnte vektor enten HIS-merkelappen eller "FLAG"-merkelappen i stedet for Glu-Glu-merkelapp (SEQ ID NO: 29).

B. Konstruksjon for pattedyrekspresjon av den løselige zalphall- reseptor zalphall- Fc4

Et ekspresjonsplasmid som inneholdt hele eller en del av et polynukleotid som kodet for zalphall, ble fremstilt ved homolog rekombinasjon. Det ekstracellulære domenet fra zalphall-reseptoren ble fusjonert til Fc-området avledet fra humant IgG, som betegnes "Fc4" (SEQ ID NO: 33), som inneholder en mutasjon slik at det ikke lenger bindes til Fc-reseptoren. Et fragment av zalphall-cDNA som omfatter polynukleotidsekvensen for det ekstracellulære domenet i zalphall-reseptoren, ble isolert ved anvendelse av PCR. De to primerne som ble anvendt for fremstilling av zalphall-fragmentet, var: (1) PCR-primerne omfattet begge fra 5'- til 3'-ende: 40 bp av den flankerende vektorsekvens (5'for innskuddet) og 17 bp, som tilsvarte 5'-enden av det ekstracellulære zalphall-domenet (SEQ ID NO: 32); og (2)

40 bp fra 5'-enden av Fc4-polynukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 33) og 17 bp, som tilsvarte 3'-enden av det ekstracellulære zalpha-11-domenet (SEQ ID NO: 34). Fc4-fragmentet som skulle fusjoneres til zalphall ble dannet ved PCR på en tilsvarende måte. De to primerne som ble anvendt for fremstilling av Fc4-fragmentet, var: (1) en 5'-primer bestående av 40 bp med sekvens fra 3'-enden av det ekstracellulære zalphall-domenet og 17 bp fra 5'-enden av Fc4 (SEQ ID NO: 35); og (2) en 3'-primer bestående av 40 bp vektorsekvens (3' for innskuddet) og 17 bp fra 3'-enden av Fc4 (SEQ ID NO: 36). PCR-amplifisering av de to reaksjonene beskrevet ovenfor ble utført som følger: 1 syklus ved 94 °C i 2 minutter; 25 sykluser ved 94 °C i 30 sekunder, 60 °C i 30 sekunder, 72 °C i 1 minutt; 1 syklus ved 72 °C i 5 minutter; etterfulgt av lagring ved 4 °C. 10 ul av PCR-reaksjonen på 100 ul ble fraksjonert i en 0,8 % LMP-agarosegel (Seaplaque GTG) med 1 x TBE-buffer for analyse. De gjenværende 90 ml av PCR-reaksjonen utfelles ved tilsetning av 5 ul 1 M NaCl og 250 ul absolutt etanol. Den anvendte ekspresjonsvektor var avledet fra plasmidet pCZRl99, som igjen er avledet fra pZP9 (ATCC-deponeringsnummer 98668), og var kuttet med Smal (BRL). Ekspresjonsvektoren var avledet fra plasmidet pCZRl99 og er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett med den umiddelbart tidlige promoter fra CMV, et konsensusintron fra det variable området i immunglobulintungkjedested hos mus, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser, et stoppkodon og en terminator fra humant veksthormon. Ekspresjonsvektoren har også et E. coli-replikasjonsorigo, en ekspresjonsvektor for en seleksjonsmarkør for pattedyr med en SV40-promoter, en SV40-enhancer og et SV40-replikasjonsorigo, et DHFR-gen og SV40-terminatoren. Den anvendte ekspresjonsvektor ble konstruert fra pCZRl99 ved å erstatte metallotioneinpromoteren med den umiddelbart tidlige promoter fra CMV.

100 ul kompetente gjærceller ( S. cerevisiae) ble kombinert med 10 ul inneholdende ca. 1 ug av zalphall-innskuddet og av Fc4-innskuddet og 100 ng Smal(BRL)-kuttet ekspresjonsvektor, og overført til en 0,2 cm elektroporeringskyvette. Blandingene av gjær og DNA ble elektropulset ved 0,75 kV (5 kV/cm), "uendelig" ohm, 25UF. Til hver kyvette tilsettes 600 ul 1,2 M sorbitol, og

gjærcellene ble utsådd i to 300 ul porsjoner på to URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C.

Etter ca. 48 timer ble Ura+-gj ær transf ormantene fra en enkeltskål resuspendert i 1 ml H20 og sentrifugert i kort tid for nedsentrifugering av gjærcellene. De nedsentrifugerte cellene ble resuspendert i 1 ml lyseringsbuffer (2 % Triton-X, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 Ul lyserings-blanding ble overført til et Eppendorf-rør inneholdende 3 00 ul syrevaskede glasskuler og 200 ul fenol-kloroform og vorteksbehandlet to eller tre ganger med 1 minutts mellomrom, etterfulgt av 5 minutters sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge ved maksimal hastighet. 3 00 ul av vannfasen ble overført til et nytt rør, og DNA-et ble utfelt med 600 ul etanol (EtOH), etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble resuspendert i 100 ul H20.

Transformasjon av elektrokompetente E. coli-celler (DH10B, Gibco BRL) utføres med 0,5-2 ml gjær-DNA-preparat og 40 ul DHlOB-celler. Cellene ble elektropulset ved 2,0 kV, 25UF og 400 ohm. Etter elektroporeringen ble 1 ml SOC (2 % "Bacto"-trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5 % gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04, 20 mM glukose) utsådd i porsjoner på 250 Ul på fire LB-AMP-skåler (LB-medium (Lennox), 1,8 % "Bacto"-agar (Difco), 100 mg/l ampicillin).

Enkeltkloner inneholdende den korrekte ekspresjons-konstruksjon for zalphall-Fc4 ble identifisert ved restriksjonskutting for å bekrefte nærvær av zalphall-Fc4-innskuddet og for å bekrefte at de forskjellige DNA-sekvensene var blitt korrekt sammenkoblet. Innskuddet i de positive klonene ble sekvensert. Plasmid-DNA i større skala isoleres ved anvendelse av "Qiagen Maxi"-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.

Eksempel 9

Transfeksjon og ekspresjon av løselige zalphall- reseptorpolypeptider

A. Pattedyrekspresjon av løselig zalphall- reseptor zalphall- CEE, zalphall- CFLG og zalphall- CHIS

BHK-570-celler (ATCC nr. CRL-10314), passasje 27, ble utsådd med 1,2 x IO<6>celler/brønn (6-brønners plate) i 800 ul serumfritt (SF) DMEM-medium (DMEM, Gibco BRL, High Glucose)

(Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Cellene ble transfektert med ekspresjonsplasmider som inneholdt zalphall-CEE, zalphall-CFLG eller zalphall-CHIS, beskrevet ovenfor (se eksempel 8), ved anvendelse av "Lipofectin" (Gibco BRL) i serumfritt (SF) DMEM. 3 ug zalphall-CEE, zalphall-CFLG eller zalphall-CHIS ble fortynnet i 1,5 ml rør inntil et totalt sluttvolum på 100 ul SF-DMEM. I separate rør ble 15 ul "Lipofectin" (Gibco BRL) blandet med 100 ul SF-DMEM. "Lipofectin"-blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 30-45 minutter, hvoretter DNA-blandingen ble tilsatt og inkubert i ca. 10-15 minutter ved romtemperatur.

Hele blandingen av DNA og "Lipofectin" ble tilsatt til de utsådde cellene og fordelt jevnt over dem. Cellene ble inkubert ved 37 °C i ca. 5 timer, og så overført til separate 150 mm MAXI-skåler i et totalvolum på 30 ml DMEM/5 % føtalt, bovint serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT). Skålene ble inkubert ved 37 °C, 5 % CO2, over natten, og blandingen av DNA og "Lipofectin" ble erstattet med seleksjonsmedium (5 % FBS/DMEM med 1 UM metotreksat (MTX)) neste dag.

Omtrent 10-12 dager etter transfeksjon ble skålene vasket med 10 ml SF-DMEM. Vaskemediene ble avsugd og erstattet med 7,25 ml serumfritt DMEM. Sterile teflonnett (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) som på forhånd var fuktet med SF-DMEM ble så plassert over de klonale cellekoloniene. Et sterilt nitrocellulosefilter som på forhånd var fuktet med SF-DMEM ble så plassert over nettet. Orienteringsmerker på nitro-cellulosen ble overført til dyrkningsskålen. Skålene ble så inkubert i 5-6 timer i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2.

Etter inkubasjonen ble filtre og nett fjernet, og mediene ble avsugd og erstattet med 5 % FBS/DMEM med 1 uM MTX. Filtrene ble så blokkert med 10 % fettfri tørrmelk/Western A-buffer (Western A: 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05 % NP-40,

150 mM NaCl og 0,25 % gelatin) i 15 minutter ved romtemperatur i en roterende ristemaskin. Filtrene ble så inkubert med henholdsvis et anti-Glu-Glu-, anti-"FLAG"- eller anti-HIS-antistoff-HRP-konjugat i 2,5 % fettfri tørrmelk/Western A-buffer i 1 time ved romtemperatur i en roterende ristemaskin. Filtrene ble så vasket tre ganger ved romtemperatur med Western A i 5-10 minutter pr. vask. Filtrene ble fremkalt med ultra-ECL-reagens (Amersham

Corp., Arlington Heights, IL) ifølge produsentens instruksjoner og visualisert i en Lumi-Imager (Roche Corp.).

Klonale kolonier med positiv ekspresjon ble mekanisk

overført til 12-brønners plater i 1 ml 5 % FCS/DMEM med 5 UM MTX og så dyrket til konfluens. Prøver av kondisjonert medium ble så analysert for ekspresjonsnivåer ved SDS-PAGE og Western-analyse. De tre klonene med den høyeste ekspresjon for hver konstruksjon ble plukket ut; to av de tre ble nedfryst som reserver, mens én ble ekspandert for analyse av mykoplasma og dyrkning i stor skala.

B. Pattedyrekspresjon av løselig zalphall- reseptor zalpha-Il- Fc4

BHK-570-celler (ATCC nr. CRL-10314) ble utsådd i 10 cm vevsdyrkningsskåler og dyrket til ca. 50-70 % konfluens over natten ved 37 °C, 5 % C02, i DMEM/FBS-medium (DMEM, Gibco BRL High Glucose (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5 % føtalt, bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL)). Cellene ble så transfektert med plasmidet som inneholdt zalphall-Fc4 (se eksempel 8), ved anvendelse av "Lipofectamin" (Gibco BRL) i et serumfritt (SF) mediumpreparat (DMEM, 10 mg/ml transferrin,

5 mg/ml insulin, 2 mg/ml fetuin, 1 % L-glutamin og 1 % natriumpyruvat) . Plasmidet som inneholdt zalphall-Fc4, ble fortynnet i 15 ml rør inntil et endelig sluttvolum på 640 ml med SF-medium. 35 ml "Lipofectamin" (Gibco BRL) ble blandet med 605 ml SF-medium. "Lipofectamin"-blandingen ble tilsatt til DNA-blandingen, og dette ble inkubert i ca. 3 0 minutter ved romtemperatur. 5 ml SF-medium ble tilsatt til blandingen av DNA og "Lipofectamin" . Cellene ble vasket én gang med 5 ml SF-medium, som så ble avsugd, og blandingen av DNA og "Lipofectamin" ble tilsatt. Cellene ble inkubert ved 37 °C i 5 timer, hvoretter 6,4 ml DMEM/10 % FBS, 1 % PSN-medium ble tilsatt til hver skål. Skålene ble inkubert ved 37 °C over natten, og blandingen av DNA og "Lipofectamin" ble erstattet med friskt 5 % FBS/DMEM-medium neste dag. På dag 2 etter transfeksjonen ble cellene splittet i seleksjonsmediet (DMEM/FBS-medium som ovenfor, tilsatt 1 uM metotreksat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) i 150 mm skåler ved fortynninger på 1:10, 1:20 og 1:50. Mediet på cellene ble erstattet med friskt seleksjonsmedium på dag 5 etter transfeksjonen. Omtrent 10 dager etter transfeksjonen ble to 150 mm dyrkningsskåler med metotreksatresistente kolonier fra hver transfeksjon behandlet med trypsin, og cellene ble slått sammen og utsådd i en T-162-flaske og overført til dyrkning i stor skala.

Eksempel 10

Rensing av løselige zalphall- reseptorer fra BHK- 570- celler

A. Rensing av zalphall- CEE- polypeptid fra BHK- 57 0

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av zalphall-polypeptid med C-terminal GluGlu(EE)-merkelapp. 30 1 kondisjonert medium fra en cellefabrikk ble konsentrert til 1,6 1 med en Amicon S10Y3-spiralpatron i en ProFlux A30. En proteaseinhibitorløsning ble tilsatt til de konsentrerte 1,6 1 med kondisjonert medium fra transfekterte BHK-57 0-celler dyrket i cellefabrikk (se eksempel 9) inntil sluttkonsentrasjoner på 2,5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,003 mM leupeptin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM pepstatin (Boehringer Mannheim) og 0,4 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim). Prøver ble uttatt for analyse, og resten ble nedfryst ved -80 °C inntil rensingen ble påbegynt. Den totale konsentrasjon av målproteiner i det konsentrerte kondisjonerte medium fra cellefabrikken ble bestemt ved SDS-PAGE og Western blot-analyse med HRP-konjugerte anti-EE-stoff.

En 100 ml kolonne med anti-EE-G-Sepharose (fremstilt som beskrevet nedenfor) ble uthelt i en 5 cm x 10 cm Waters AP-5-glasskolonne. Kolonnen ble strømningspakket og ekvilibrert i en BioCad Sprint-enhet (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) med fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4. Det konsentrerte kondisjonerte medium fra cellefabrikken ble opptint og sterilfiltrert gjennom et 0,2 mikrometer filter, pH ble justert til 7,4, og løsningen ble satt på kolonnen over natten ved en gjennom-strømningshastighet på 1 ml/minutt. Kolonnen ble vasket med

10 kolonnevolumer (CV-er) fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) og så direkte eluert med 200 ml PBS (pH 6,0) inneholdende 0,5 mg/ml EE-peptid (Anaspec, San Jose, CA) ved 5 ml/minutt. Det anvendte EE-peptid har sekvensen EYMPME (SEQ ID NO: 29) . Kolonnen ble vasket med 10 CV-er PBS og så eluert med 5 CV-er 0,2 M glysin, pH 3,0. pH i den glysineluerte kolonnen ble justert til 7,0 med 2 CV-er 5 x PBS, og kolonnen ble så ekvilibrert med PBS

(pH 7,4). 5 ml fraksjoner ble oppsamlet gjennom hele elueringskromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt; ubundet materiale og materiale eluert under vask ble også spart og analysert. Fraksjoner som inneholdt eluert EE-polypeptid, ble så analysert for målproteinet ved SDS-PAGE, sølvfarging og Western-blotting med HRP-konjugert anti-EE-antistoff. Polypeptidelueringsfraksjonene av interesse ble slått sammen og konsentrert fra 60 ml til 5,0 ml ved anvendelse av en membran-basert sentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 10 000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) ifølge produsentens ins truks j oner.

For å separere zalphall-CEE fra andre proteiner som ble opprenset sammen med dette, ble de sammenslåtte, konsentrerte polypeptidelueringsfraksjonene behandlet med POROS HQ-50 (et kraftig anionbytterresin fra PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) ved pH 8,0. En 1,0 x 6,0 cm kolonne ble fylt og strømnings-pakket i en BioCad Sprint. Kolonnen ble ladet med motion og så ekvilibrert med 20 mM Tris, pH 8,0 (Tris(hydroksymetylamino-metan)). Prøven ble fortynnet 1:13 (for å redusere ionestyrken til PBS) og så påsatt Poros HQ-kolonnen ved 5 ml/minutt. Kolonnen ble vasket med 10 CV-er 20 mM Tris, pH 8,0, og så eluert med en 40 CV-gradient av 20 mM Tris/l M natriumklorid (NaCl) ved 10 ml/minutt. 1,5 ml fraksjoner ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt. Elueringstoppfraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE og sølv-farging. Fraksjoner av interesse ble slått sammen og konsentrert til 1,5-2 ml ved anvendelse av en membransentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 10 000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) ifølge produsentens instruksjoner.

For å separere zalphall-CEE-polypeptid fra fritt EE-peptid og eventuelle kontaminerende proteiner som ble renset sammen med dette, ble de sammenslåtte, konsentrerte fraksjoner behandlet med kromatografi på en 1,5 x 90 cm Sephadex S200-kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ) ekvilibrert og ladet i PBS ved en gjennomstrømningshastighet på 1,0 ml/minutt ved anven- deise av en BioCad Sprint. 1,5 ml fraksjoner ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt. Toppfraksjonene blekarakterisert vedSDS-PAGE og sølvfarging, og bare de reneste fraksjonene ble slått sammen. Dette materialet representerte renset zalphall-CEE-polypeptid.

Dette rensede materialet ble til slutt behandlet på en 4 ml ActiClean Etox-kolonne (Sterogene) for fjerning av eventuelle gjenværende endotoksiner. Prøven fikk passere gjennom den PBS-ekvilibrerte gravitetskolonnen fire ganger, hvoretter kolonnen ble vasket med 3 ml PBS, som ble slått sammen med den "rensede" prøve. Materialet ble så sterilfiltrert gjennom en 0,2 um membran og lagret ved -80 °C inntil det ble fordelt i porsjoner.

På Western-blottede, Coomassie Blue- og sølvfargede SDS-PAGE-geler gav zalphall-CEE-polypeptidet ett hovedbånd med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 50 000 Dalton. Mobiliteten til dette båndet var den samme i reduserende og ikke-reduserende geler.

Proteinkonsentrasjonen av det rensede materialet ble målt ved BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL), og proteinet ble fordelt i porsjoner og lagret ved -80 °C ifølge våre standardfremgangsmåter. På IEF-geler (isoelektrisk fokusering) vandrer proteinet med en PI lavere enn 4,5. Konsentrasjonen av zalphall-CEE-polypeptid var 1,0 mg/ml.

For fremstilling av anti-EE-Sepharose ble et 100 ml lagvolum av protein G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) vasket tre ganger med 100 ml PBS inneholdende 0,02 % natriumazid ved anvendelse av en 500 ml Nalgene 0,45 mikrometer filtrerings-enhet. Gelen ble vasket med 6,0 volumer 200 mM trietanolamin, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO), og et likt volum EE-anti-stoffløsning inneholdende 900 mg antistoff ble tilsatt. Etter inkubering over natten ved 4 °C ble ubundet antistoff fjernet ved å vaske resinet med 5 volumer 200 mM TEA, som beskrevet ovenfor. Resinet ble resuspendert i 2 volumer TEA og overført til en egnet beholder, og dimetylpimilimidat-2 HCl (Pierce, Rockford, IL) oppløst i TEA ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 3 6 mg/ml protein G-Sepharose-gel. Gelen ble vippet på et vippebrett ved romtemperatur i 45 minutter, og væsken ble fjernet ved anvendelse av filtreringsenheten som beskrevet ovenfor. Ikke-spesifikke seter på gelen ble så blokkert ved inkubering i 10 minutter ved romtemperatur med 5 volumer 20 mM etanolamin i 200 mM TEA. Gelen ble så vasket med 5 volumer PBS inneholdende 0,02 % natriumazid og lagret i denne løsningen ved

B. Rensing av zalphall- CFLAG- polypeptid fra BHK- 57 0

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av zalphall-polypeptid inneholdende C-terminale "FLAG"-merkelapper (FLG) (Sigma-Aldrich Co.). 30 1 kondisjonert medium fra en cellefabrikk ble konsentrert til 1,7 1 med en Amicon S10Y3-spiralpatron i en ProFlux A30. En proteaseinhibitorløsning ble tilsatt til de 1,7 1 med konsentrert kondisjonert medium fra transfekterte BHK-570-celler dyrket i en cellefabrikk (se eksempel 9) inntil sluttkonsentrasjoner på 2,5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),

0,003 mM leupeptin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM pepstatin (Boehringer Mannheim) og 0,4 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim). Prøver ble uttatt for analyse, og hovedmengden ble nedfryst ved -80 °C inntil rensingen ble startet. Totalekonsentrasjonen av målprotein i det kondisjonerte medium fra cellefabrikken ble bestemt ved SDS-PAGE og Western blot-analyse med HRP-konjugert anti-"FLAG"-antistoff (Kodak). En 125 ml kolonne med anti-"FLAG"-M2-agaroseaffinitetsgel (Sigma-Aldrich Co.) ble uthelt i en Waters AP-5-glasskolonne, 5 cm x 10 cm. Kolonnen ble strømningspakket og ekvilibrert i en BioCad Sprint (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) med fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4. Det konsentrerte kondisjonerte medium fra cellefabrikken ble opptint og sterilfiltrert gjennom et 0,2 mikrometer filter, pH ble justert til 7,4, og løsningen ble satt på kolonnen over natten ved en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/minutt. Kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolumer (CV-er) fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) og så eluert med 250 ml PBS (pH 6,0) inneholdende 0,5 mg/ml"FLAG"-peptid (Sigma-Aldrich Co.) ved 5 ml/minutt. Det anvendte "FLAG"-peptid har sekvensen DYKDDDDK (SEQ ID NO: 37). Kolonnen ble vasket med 10 CV-er PBS og så eluert med 5 CV-er 0,2 M glysin, pH 3,0. pH i den glysineluerte kolonnen ble justert til 7,0 med 2 CV-er 5 x PBS, og kolonnen ble så ekvilibrert med PBS (pH 7,4). 5 ml fraksjoner

ble oppsamlet under hele elueringskromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nM ble målt; ubundet materiale og utvasket materiale ble også spart og analysert. Fraksjoner fra eluerings-toppen med "FLAG"-polypeptid ble analysert for målproteinet ved SDS-PAGE, sølvfarging og Western-blotting med HRP-konjugert anti-"FLAG"-antistoff. De polypeptidholdige fraksjoner av interesse ble slått sammen og konsentrert fra 80 ml til 12 ml ved anvendelse av en membransentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 10 000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) ifølge produsentens instruksjoner.

For å separere zalphall-CFLG fra andre proteiner som renses sammen med det ble de sammenslåtte polypeptideluerings-fraksjoner behandlet med POROS HQ-50 (et kraftig anionbytterresin fra PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) ved pH 8,0. En 1,0 x 6,0 cm kolonne ble fylt og strømningspakket i en BioCad Sprint. Kolonnen ble ladet med motion og så ekvilibrert med

20 mM Tris, pH 8,0 (Tris(hydroksymetylaminometan)). Prøven ble fortynnet 1:13 (for å redusere ionestyrken til PBS) og så påsatt Poros HQ-kolonnen ved 5 ml/minutt. Kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolumer (CV-er) 20 mM Tris, pH 8,0, og så eluert med en 40 CV-gradient av 20 mM Tris/l M natriumklorid (NaCl) ved 10 ml/minutt. 1,5 ml fraksjoner ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt. Elueringstoppfraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE og sølv-farging. Fraksjoner av interesse ble slått sammen og konsentrert til 1,5-2 ml ved anvendelse av en membransentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 10 000Dalton (Millipore, Bedford, MA) ifølge produsentens instruksjoner.

For å skille zalphall-CFLG-polypeptid fra fritt "FLAG"-peptid og eventuelle kontaminerende proteiner som ble renset sammen med dette, ble de sammenslåtte, konsentrerte fraksjoner behandlet med kromatografi på en 1,5 x 90 cm Sephacryl S200-kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ) ekvilibrert og ladet med PBS ved en gjennomstrømningshastighet på 1,0 ml/minutt ved anvendelse av en BioCad Sprint. 1,5 ml fraksjoner ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt. Toppfraksjonene blekarakterisert vedSDS-PAGE og sølvfarging, og bare de reneste fraksjonene ble slått sammen. Dette materialet representerte renset zalphall-CFLG-polypeptid.

Dette rensede materialet ble til slutt behandlet på en 4 ml ActiClean Etox-kolonne (Sterogene) for fjerning av eventuelle gjenværende endotoksiner. Prøven fikk passere gjennom den PBS-ekvilibrerte gravitetskolonnen fire ganger, hvoretter kolonnen ble vasket med 3 ml PBS, som ble slått sammen med den "rensede" prøve. Materialet ble så sterilfiltrert gjennom et 0,2 mikrometer filter og lagret ved -80 °C inntil det ble fordelt i porsjoner.

På Western-blottede, Coomassie Blue- og sølvfargede SDS-PAGE-geler gav zalphall-CFLG-polypeptidet ett hovedbånd med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 50 000 Dalton. Mobiliteten til dette båndet var den samme i reduserende og ikke-reduserende geler.

Proteinkonsentrasjonen av det rensede materialet ble målt ved BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL), og proteinet ble fordelt i porsjoner og lagret ved -80 °C ifølge våre standardfremgangsmåter. På IEF-geler (isoelektrisk fokusering) vandrer proteinet med en PI lavere enn 4,5. Konsentrasjonen av zalphall-CFLG-polypeptid var 1,0 mg/ml.

C. Rensing av zalphall- Fc4- polypeptid fra transfekterte BHK- 570- celler

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av zalphall-polypeptid som omfattet C-terminal fusjon, til human-IgG/Fc (zalphall-Fc4, eksemplene 8 og 9). 12 000 ml kondisjonert medium fra BHK-570-celler transfektert med zalphall-Fc4 (eksempel 9) ble filtrert gjennom et 0,2 um steriliserende filter og så supplert med en oppløsning av proteaseinhibitorer inntil sluttkonsentrasjoner på 0,001 mM leupeptin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM pepstatin (Boehringer Mannheim) og 0,4 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim). Protein G-Sepharose (6 ml lagvolum, Pharmacia Biotech) ble pakket og vasket med 500 ml PBS (Gibco BRL). Det supplerte kondisjonerte medium fikk passere gjennom kolonnen med en gjennornstrømnings-hastighet på 10 ml/minutt, etterfulgt av vasking med 1000 ml PBS (BRL/Gibco). Zalphall-Fc4 ble eluert fra kolonnen med 0,1 M glysin, pH 3,5, og 2 ml fraksjoner ble oppsamlet direkte i 0,2 ml 2 M Tris, pH 8,0, for justering av den endelige pH til 7,0 i fraksjonene.

De eluerte fraksjoner blekarakterisert vedSDS-PAGE og Western-blotting med antihumane Fc-antistoffer (Amersham). Western blot-analyse av reduserende SDS-PAGE-geler viser et immunreaktivt protein på ca. 80 000 kDa i fraksjonene 2-10. Sølvfargede SDS-PAGE-geler viste også et zalphall:Fc-polypeptid på 80 000 kDa i fraksjonene 2-10. Fraksjonene 2-10 ble slått sammen.

Proteinkonsentrasjonen av de sammenslåtte fraksjoner ble målt ved BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL), og materialet ble fordelt i porsjoner og lagret ved -80 °C ifølge våre standardfremgangsmåter. Konsentrasjonen av de sammenslåtte fraksjoner var 0,26 mg/ml.

Eksempel 11

Anvendelse av de løselig zalphall- reseptorene zalphall- CEE, zalphall- CFLG og zalphall- Fc4 ( mutant) i konkurranse-inhiberingsanalyse

BaF3/zalphall-celler ble nedsentrifugert og vasket i mIL-3-fritt medium. Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerning av mIL-3. Cellene ble så talt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i en 96-brønners plate med 5000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn med mIL-3-fritt medium.

Både kondisjonert medium fra apemiltcelleaktiveringen og de humane CD3<+->selekterte cellene beskrevet i eksempel 5 ble tilsatt i separate eksperimenter ved konsentrasjoner på 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 % og 0,375 %, med eller uten løselige zalphall-reseptorer (CEE-, C-flag- og Fc4-konstruksjoner, se eksemplene 9 og 10) ved 10 ug/ml. Total-analysevolumet var 200 ul.

Analyseskålene ble inkubert ved 37 °C, 5 % C02, i

3 dager, hvoretter Alamar Blue (Accumed) ble tilsatt med

20 ul/brønn. Platene ble igjen inkubert ved 37 °C, 5 % C02, i 24 timer. Platene ble avlest i en "Fmax"-plateleser (Molecular Devices), som beskrevet i eksempel 2. Resultatene viste fullstendig inhibering av celleveksten for alle de forskjellige løselige zalphall-reseptorkonstruksjonene ved 10 ug/ml, noe som bekrefter at faktoren i hver prøve var spesifikk for zalphall-reseptoren.

Titreringskurver hvor de løselige reseptorer ble fortynnet, ble også bestemt ved anvendelse av analysen beskrevet ovenfor. De løselige zalphall-reseptorene zalphall-CEE og zalphall-CFLG var begge i stand til fullstendig å inhibere veksten i konsentrasjoner ned til 20 ng/ml. Den løselige zalphall-reseptoren mutant zalphall-Fc4 var like effektiv bare ved 1,5 ug/ml.

Eksempel 12

Sekresjonsfelleanalyse

En sekresjonsfelleanalyse ble anvendt for identifisering av cDNA for zalphall-liganden. De positive DNA-blandingene erholdt fra ekspresjonskloningsforsøket beskrevet i eksempel 7 ble benyttet.

DNA-blandingene av 250 kloner ble transfektert inn i BHK-celler i 96-brønners plater, og det kondisjonerte medium ble anvendt i proliferasjonsanalysen med BaF3/zalphall-celler, som beskrives i eksemplene 4 og 5. Flere DNA-blandinger gav positiv aktivitet som var reproduserbar og kunne nøytraliseres med løse-lige zalphall-reseptorer (se eksempel 11).

Én av de positive DNA-blandingene, 45C5, ble transfektert inn i COS-celler i 12-brønners plater ved anvendelse av "Lipofectamin"-fremgangsmåten beskrevet nedenfor. En sekresjonsfelleanalyse ble så utført ved anvendelse av løselige zalphall-reseptorer (C-terminalt Glu-Glu-merket, enten med eller uten biotinylering, C-terminalt Flag-merket eller Fc4-merket)

(eksempel 9) for analyse av direkte binding mellom den mulige ligand for zalphall-reseptoren i blanding 45C5 og løselig zalphall-reseptor (se nedenfor). Resultatet var positivt. DNA fra blanding 45C5 ble derfor elektroporert inn i E. coli, og enkeltkolonier ble overført til ti 96-brønners plater. Platene ble ristet ved 37 °C i 24 timer, hvoretter minipreparater av DNA ("QiaPrep"-96 Turbo Miniprep-sett, Qiagen) ble fremstilt i 96-brønners format ved anvendelse av en TomTech Quadra 9600. Plasmid-DNA ble så blandet fra rader og kolonner og transfektert inn i COS-celler, hvoretter de positive blandingene ble bestemt ved sekresjonsfeller, som beskrevet nedenfor.

COS- celletransfeksjoner

COS-celletransfeksjonen ble utført som følger: bland

3 ul DNA-blanding og 5 ul "Lipofectamin" i 92 ul serumfritt DMEM-medium (55 mg natriumpyruvat, 146 mg L-glutamin, 5 mg transferrin, 2,5 mg insulin, 1 ug selen og 5 mg fetuin i 500 ml DMEM), inkuber ved romtemperatur i 30 minutter og tilsett så

400 ul serumfritt DMEM-medium. Tilsett denne blandingen på 500 ul til 1,5 x 10<5>COS-celler/brønn utsådd i 12-brønners vevsdyrkningsplater og inkuber i 5 timer ved 37 °C. Tilsett 500 Ul DMEM-medium med 2 0 % FBS (100 ml FBS, 55 mg natriumpyruvat og 146 mg L-glutamin i 500 ml DMEM) og inkuber over natten.

Sekresjonsfelleanalyse

Sekresjonsfellen ble utført som følger: Medium ble vasket av cellene med PBS, og cellene ble så fiksert i 15 minutter med 1,8 % formaldehyd i PBS. Cellene ble så vasket med TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl og 0,05 % Tween-20 i H20) og gjort permeable med 0,1 % Triton-X i PBS i 15 minutter, og igjen vasket med TNT. Cellene ble blokkert i 1 time med TNB (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl og 0,5 % blokkeringsreagens (NEN Renaissance TSA-Direct-sett) i H20), og igjen vasket med TNT. Dersom det biotinylerte protein ble anvendt, ble cellene blokkert ved inkubering i 15 minutter med avidin, etterfulgt av biotin (Vector Labs) med vask mellom disse med TNT. Avhengig av hvilken løselig reseptor som ble anvendt, ble cellene inkubert i 1 time med: (A) 1-3 ug/ml av den løselige zalphall-reseptor zalphall-Fc4-fusjonsprotein (eksempel 10); (B) 3 ug/ml av den løselige, C-terminalt FLAG-merkede zalphall-reseptor zalphall-CFLG (eksempel 10); (C) 3 ug/ml av den løselige, C-terminalt GluGlu-merkede zalphall-reseptor zalphall-CEE (eksempel 10); eller (D) 3 ug/ml av den biotinylerte, løselige, zalphall-reseptor zalphall-CEE i TNB. Cellene ble så vasket med TNT. Avhengig av hvilken løselig reseptor som ble anvendt, ble cellene inkubert i ytterligere 1 time med: (A) 1:200 fortynnet HRP-konjugert antihumant lg (Fc-spesifikt) fra geit; (B) 1:1000 fortynnet M2-HRP; (C) 1:1000 fortynnet HRP-konjugert anti-Glu-Glu-antistoff; eller (D) 1:300 fortynnet streptavidin-HRP (NEN-sett) i TNB. Igjen ble cellene vasket med TNT.

Positiv binding ble påvist med fluoresceintyramidreagens fortynnet 1:50 i fortynningsbuffer (NEN-sett) og inkubert i 4-6 minutter, og så vasket med TNT. Cellene ble preservert med monteringsmediet Vectashield (Vector Labs Burlingame, CA) fortynnet 1:5 i TNT. Cellene ble synliggjort ved anvendelse av et FITC-filter i et fluorescensmikroskop.

Eksempel 13

Kromosomtilhørighet og plassering av genet for zalphall- ligand

Genet for Zalphall-ligand ble kartlagt til kromosom 4 ved anvendelse av den kommersielt tilgjengelige versjonen av "Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). "Stanford G3 RH Panel" inneholder DNA-er fra 83 forskjellige strålingshybridkloner som dekker hele det humane genom, pluss to kontroll-DNA-er (RM-donoren og A3-mot-takeren) . En offentlig tilgjengelig WWW-server (http://shgc-www.stanford.edu) muliggjør kromosomal lokalisering av markører.

For kartlegging av zalphall-lilgandgenet med "Stanford G3 RH Panel" ble reaksjoner på 20 ul satt opp i en 96-brønners mikrotiterplate (Stratagene, La Jolla, CA) og anvendt i en "RoboCycler Gradient 96" programmerbar varmeblokk (Stratagene). De 85 PCR-reaksjonsblandingene bestod av 2 ul 10 x KlenTaq-PCR-reaksjonsbuffer (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 ul dNTP-blandinger (2,5 mM av hvert, Perkin-Elmer, Foster City,CA), 1 ul"sense"-primer, ZC 22 0050, (SEQID NO: 42), 1 ul "antisense"-primer, ZC 22 051 (SEQ ID NO: 43), 2 ul "RediLoad"

(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,4 ul 50 x Advantage KlenTaq Polymerase-blanding (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA fra en enkelt hybridklon eller kontroll-DNA, og dobbelt-destillert H20 til et totalvolum på 20 ul. Et likt volum mineral-olje ble lagt over reaksjonsblandingene, og platen ble forseglet. PCR-syklusbetingelsene var som følger: en innledende syklus på 5 minutters denaturering ved 94 °C, 35 sykluser av en 45 sekunders denaturering ved 94 °C, 45 sekunders hybridisering ved 60 °C og 1 minutt 15 sekunders forlengelse ved 72 °C; etterfulgt av en avsluttende forlengelse på 7 minutter ved 72 °C. Reaksjonsblandingene ble separert ved elektroforese på en 2 % agarosegel (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

Resultatene viste kobling av zalphall-ligandgenet til IL2-rammeverksmarkøren SHGC-12342 med LOD-poeng > 12 og en avstand på 6 cR_10000 (ca. 180 kb) fra markøren. Anvendelse av omliggende markører plasserer zalphall-ligandgenet i 4q27-området i det integrerte LDB-kromosom 4-kart (The Genetic Location Database, University of Southampton, WWW-server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/).

Eksempel 14

Identifisering og kloning av zalphall- ligand fra mus. Anvendelse av en EST- sekvens for erholdelse av fullengde- zalphall- ligand fra mus

A. EST- sekvens for zalphall- ligand fra mus

Ved gjennomsøking av databasen med human zalphall-1igand-cDNA-sekvens (SEQ ID NO: 1) som spørresekvens ble en muse-EST (EST1483966) identifisert som en mulig delsekvens for zalphall-ligand fra mus. EST1483966 representerer et musegenom-fragment i hvilket en peptidsekvens avledet fra to mulige eksoner viser høy sekvensidentitet med et peptidsegment fra den humane zalphall-ligand (aminosyre 13 (Ile) til aminosyre 80 (Gin) i SEQ ID NO: 2).

B. PCR- gjennomsøking av et maraton- cDNA- panel fra mus

Elleve maraton-cDNA-paneler fra mus (Clontech) ble gjennomsøkt ved PCR som beskrevet nedenfor. "Marahton"-cDNA-prøvene fra mus var fremstilt fra vev fra hjerne, bukspyttkjertel, nyrer, placenta, spyttkjertel, hud, testis, uterus, embryo og milt. Disse ble fremstilt i laboratoriet ved anvendelse av et "Marahton"-cDNA-amplifiseringssett (Clontech) ifølge produsentens instruksjoner. Basert på EST-sekvensen ble to PCR-primere, ZC 22 056 (SEQ ID NO: 44) og ZC 22 057 (SEQ ID NO: 45), anvendt for identifisering av en kilde for muse-zalphall-ligand ved PCR. PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 94 °C i 2 minutter, 35 sykluser ved 94 °C i 30 sekunder, 68 °C i 2 minutter, etterfulgt av 68 °C i 4 minutter og oppbevaring ved 10 °C. PCR-produktene ble fraksjonert i en 1 % agarosegel. Et kraftig bånd på 150 bp som representerte et amplifisert cDNA-fragment, kunne observeres. Dette viste at maraton-cDNA fra musemilt er en kilde for kloning av zalphall-ligand-cDNA fra mus. Musemilt-maraton-cDNA inneholdt et positivt cDNA som senere ble identifisert ved sekvensanalyse som et partielt cDNA for zalphall-ligand fra mus.

C. En sammensatt sekvens for fullengde- cDNA fra mus ble dannet ved 5'- og 3'- RACE

De 5'- og 3'-flankerende sekvenser til den partielle cDNA-sekvens for zalphall-ligand fra mus ble erholdt ved 5'- og 3'-RACE-amplifisering. To runder med nestet PCR-amplifisering ble utført med flere genspesifikke oligoprimere, ZC 22 205 (SEQ ID NO: 46) og ZC 22 206 (SEQ ID NO: 47), ZC 22 056 (SEQ ID

NO: 44) og ZC 22 057 (SEQ ID NO: 45), og to adaptoroligoprimere, ZC 9 739 (SEQ ID NO: 48) og ZC 9 719 (SEQ ID NO: 49). PCR-reaksjonene ble utført som følger: 94 °C i 2 minutter, 35 sykluser ved 94 °C i 30 sekunder, 68 °C i 2 minutter, etterfulgt av 68 °C i 4 minutter og oppbevaring ved 10 °C. PCR-produktene ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, og et 5'-RACE-produkt på ca. 300 bp og et 3<1->RACE-produkt på ca. 800 bp ble påvist. Disse fragmentene ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet"Qiaquick"(Qiagen).

De rensede PCR-produktene ble sekvensert ved anvendelse av følgende primere: ZC 9 719 (SEQ ID NO: 49), ZC 22 205 (SEQ ID NO: 46) og ZC 22 206 (SEQ ID NO: 47). En foreløpig, sammensatt fullengdesekvens for zalphall-ligand fra mus ble erholdt ved å kombinere 5'- og 3'-RACE-fragmentene. Museklonen med full lengde ble isolert som beskrevet i eksempel 15 nedenfor.

Eksempel 15

Isolering av zalphall- cDNA- klon fra mus fra et aktivert muse-miltbibliotek

A. Primærkilde fra mus anvendt for isolering av zalphall-ligand fra mus

Milter fra Balb/c-mus ble oppsamlet og knut mellom objektglass med mattslipte ender for dannelse av en cellesuspensjon. Utbyttet av isolerte primærceller fra mus var 6,4 x IO8 celler før seleksjonen som beskrives nedenfor.

Miltcellene ble suspendert i 9,6 ml MACS-buffer (PBS, 0,5 %EDTA, 2 mM EDTA). 1,6 ml cellesuspensjon ble tatt ut, og 0,4 ml CD90-mikrokuler (Thyl.2) (Miltenyi Biotec) ble tilsatt. Blandingen ble inkubert i 15 minutter ved 4 °C. Cellene merket med CD90-kuler ble vasket med 30 ml MACS-buffer og resuspendert i 2 ml MACS-buffer.

En VS+-kolonne (Miltenyi) ble fremstilt ifølge produsentens instruksjoner. VS+-kolonnen ble så plassert i et "Vario-MACS"-magnetfelt (Miltenyi). Kolonnen ble ekvilibrert med 5 ml MACS-buffer. De isolerte primærcellene fra mus ble så påsatt kolonnen. De CD3-negative cellene fikk passere gjennom kolonnen. Kolonnen ble vasket med 9 ml (3 x 3 ml) MACS-buffer. Kolonnen ble så fjernet fra magneten og plassert over et 15 ml falconrør. CD90<+->celler ble eluert ved tilsetning av 5 ml MACS-buffer til kolonnen, og bundne celler ble skylt ut ved anvendelse av stempelet levert av produsenten. Inkubasjonen av cellene med CD90-magnetkuler, vask og VS+-kolonnetrinnene (fra inkubering til eluering) ovenfor ble gjentatt ytterligere én gang. De resulterende CD90<+->fraksjonene fra de to ko1onneseparasjonene ble slått sammen. Utbyttet av CD90<+->selekterte musemiltceller var 1 x IO<8>celler totalt.

En prøve av de sammenslåtte CD90<+->selekterte musecellene ble farget og sortert i en fluorescerende antistoff-cellesorterer (FACS) for måling av renheten. Et PE-konjugert antimuse-CD3e-antistoff fra hamster (PharMingen) ble anvendt for farging og sortering av de CD90<+->selekterte cellene. De CD90<+->selekterte musecellene bestod av 93 % CD3<+->celler, noe som tyder på at 93 % av cellene var T-celler.

De CD90<+->selekterte musecellene ble aktivert ved inkubering av 3 x IO<6>celler/ml i RPMI + 5 % FBS + PMA, 10 ng/ml, og "Ionomycin" 0,5 ug/ml (Calbiochem) over natten ved 37 °C. Supernatanten fra disse aktiverte CD90<+->selekterte musecellene ble analysert for zalphall-ligandaktivitet, som beskrevet nedenfor. Videre ble de aktiverte CD90<+->selekterte musecellene anvendt for fremstilling av et cDNA-bibliotek, som beskrevet i eksempel 16 nedenfor.

Eksempel 16

Kloning av zalphall- ligand fra mus fra et CD90+- selektert muse-cellebibliotek

Gjennomsøking av et cDNA-bibliotek fra aktiverte CD90<+->selekterte primærmuseceller gav et isolert cDNA, som er et nytt medlem av fireheliksbunt-cytokinfamilien. Dette cDNA kodet for museortologen til den humane zalphall-ligand. Dette cDNA ble identifisert ved hybridiseringssøk.

A. Vektoren for konstruksjon av CD90+- selektert bibliotek

Vektoren pZP7N ble anvendt for konstruksjon av det CD90<+->selekterte bibliotek (se eksempel 6A).

B. Fremstilling av cDNA- bibliotek fra aktiverte CD90<*->

selekterte primærmuseceller

Omtrent 1,5 x IO<8>CD90<+->selekterte primærmuseceller stimulert i "Ionomycin"/PMA (eksempel 15) ble isolert ved sentrifugering. Total-RNA ble isolert fra de nedsentrifugerte cellene og overført til dobbelttrådet cDNA, som beskrevet i eksempel 6B. Dette DNA ble deretter transfektert inn i BHK-celler, som beskrevet i eksempel 6B, og proliferasjonen ble målt ved anvendelse av en "Alamar blue"-fluorescensanalyse (eksempel 2B) .

For gjennomsøking av biblioteket ved sekresjonsfelle-kloning var det nødvendig med en kompleks, amplifisert form av biblioteket for transfeksjon av C0S-7-celler. 4,8 millioner kloner ble utsådd på 110 15 cm LB-agarskåler tilsatt 100 ug/ml ampicillin og 10 ug/ml meticillin. Etter inkubering av skålene over natten ved 37 °C ble bakteriene høstet ved avskraping og nedsentrifugert. Plasmid-DNA ble ekstrahert fra de nedsentrifugerte bakteriene ved anvendelse av et "Nucleobond-giga"-sett (Clonetech) ifølge produsentens instruksjoner. Dette plasmid ble så anvendt for transfeksjon av COS-7-celler på objektglass og gjennomsøkt ved anvendelse av sekresjonsfelleteknikken beskrevet nedenfor (eksempel 17).

C. Gjennomsøking av det aktiverte muse- cDNA- bibliotek

Omtrent 5 x IO<5>kloner ble utsådd på 10 LB/Amp-Maxi-skåler. Koloniene ble overført til filteret, denaturert, nøytralisert og kryssbundet ved anvendelse av standardfremgangs-måten (Sambrook, J. et al., supra). 50 ng av 5'-RACE-PCR-fragmentet på 300 bp (eksempel 14) ble merket med<32>P ved anvendelse av innmerkingssettet "Prime-It" (Stratagene), som er basert på tilfeldige primere. De ti fltrene ble hybridisert med denne merkede proben ved 65 °C over natten ved anvendelse av hybridiseringsløsningen "Expresshyb" (Clontech). Filtrene ble så vasket ved 60 °C i 3 x 1 time med 0,2 x SSC (3 0 mM NaCl, 3 mM natriumsitrat, pH 7,0), 0,1 % SDS; og så ved 65 °C i 1 time. Filtrene ble pålagt røntgenfilm ved -80 °C over natten, og røntgenfilmen ble fremkalt.Agaroseblokker som inneholdt de positive klonene ble tatt ut, og klonene ble utsådd på 10 cm LB/Amp-skåler. Koloniene ble så overført til filter og hybridisert igjen ved anvendelse av samme fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor.

Én DNA-klon, betegnet MllL/pZP7, ble isolert og sekvensert ved anvendelse av følgende primere: ZC 14 063 (SEQ ID

NO: 50), ZC 5 020 (SEQ ID NO: 51), ZC 22 421 (SEQ ID NO: 52),

ZC 22 604 (SEQ ID NO: 53) og ZC 22 641 (SEQ ID NO: 54). Polynukleotidsekvensen til denne klon er fullengde-zalphall-ligand fra mus (SEQ ID NO: 55), og er i samsvar med den sammensatte sekvens som ble erholdt fra 5'- og 3'-RACE-produktene. Den tilsvarende aminosyresekvens for zalphall-ligand fra mus er vist i SEQ ID NO: 56.

Eksempel 17

Zalphall- ligand fra mus bindes til løselig human zalphall- reseptor i en sekresjonsfelleanalyse

DNA fra museklonen MllL/pZP7 ble transfektert inn i COS-celler, og binding til den løselige, humane zalphall-reseptor zalphall-Fc4 (eksempel 10C) til de transfekterte COS-cellene ble analysert ved en sekresjonsfelleanalyse (eksempel 12). Analysen bekreftet at muse-zalphall-ligand bindes til løselig human zalphall-reseptor.

COS-celletransfeksjonen ble utført som i eksempel 12 ved anvendelse av 0,7 ug MllL/pZP7-DNA (eksempel 16) i 3 ul.

Sekresjonsfelleanalysen ble utført som i eksempel 12 ved anvendelse av 1 ug/ml løselig zalphall-reseptor-Fc4-fusjonsprotein (eksempel 10C) i TNB, og med 1:200 fortynnet antihumant Ig-HRP (Fc-spesifikt) fra geit i TNB som det påvisbare antistoff. Positiv binding av den løselige humane zalphall-reseptor til de fikserte cellene ble påvist med fluoresceintyramidreagens som i eksempel 12. Cellene ble preservert og synliggjort som i eksempel 12.

Det positive resultat viste at lyse-zalphall-ligand bindes til løselig human zalphall-reseptor.

Eksempel 18

Ekspresjon av zalphall- ligand fra mus i pattedyrceller

A. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren MllL/ pZP9

En ekspresjonsvektor ble fremstilt for ekspresjon av muse-zalphall-ligand i pattedyrceller. Et PCR-dannet zalphall-ligand- DNA- fragment på 500 bp ble dannet ved anvendelse av ZC 22 283 (SEQ ID NO: 57) og ZC 22 284 (SEQ ID NO: 58) som PCR-primere for amplifisering av det kodende området for muse-zalphall-ligand og innføring av restriksjonsseter for Xhol og Xbal. Muse-zalphall-ligandklonen MllL/pZP7 (eksempel 16) ble anvendt som templat. PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 94 °C i 2 minutter, 25 sykluser ved 94 °C i 30 sekunder og 68 °C

i 2 minutter, etterfulgt av 68 °C i 4 minutter og oppbevaring ved 10 °C. Et bånd med forventet størrelse, ca. 500 bp, ble observert etter 1 % agarosegelelektroforese og kuttet ut, og DNA ble renset ved anvendelse av rensesystemet"QiaexII" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Det rensede DNA ble kuttet med Xhol og Xbal (Boehringer Mannheim) ved 37 °C i 2 timer. DNA ble så isolert fra en gel og renset ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet ovenfor.

Det utkuttede DNA ble subklonet i plasmid pZP9 kuttet med Xhol og Xbal (Boehringer Mannheim). Plasmid pZP9 er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett med metallotionein-1(MT-1)-promoteren fra mus, flere restriksjonsseter for innføring av kodende sekvenser og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et E. coli-replikasjonsorigo, en ekspresjonsenhet for en seleksjonsmarkør for pattedyr med en SV40-promoter, en SV40-enhancer og et SV40-replikasjonsorigo, et DHFR-gen og SV40-terminatoren.

Cirka 30 ng av det restriksjonskuttete muse-zalphall-ligandfragment og ca. 10 ng av den kuttete pZP9-vektor ble ligert ved romtemperatur i 2 timer. 2 ug ligeringsreaksjon ble transformert inn i kompetente INVaF'-celler (Invitrogen) ifølge produsentens fremgangsmåte, og cellene ble utsådd på LB-skåler tilsatt 50 ug/ml ampicillin og inkubert ved 37 °C over natten. Koloniene ble analysert ved restriksjonsanalyse med Xhol og Xbal (Boehringer Mannheim) av DNA fremstilt fra væskekulturer av enkeltkolonier. Innskuddssekvensen i de positive kloner ble bekreftet ved sekvensanalyse å være sekvensen til zalphall-ligand fra mus. Et plasmidpreparat i stor skala ble fremstilt ved anvendelse av et "Qiagen" Maxi Prep-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Ekspresjonsvektoren som inneholder muse-zalphall-ligand, ble betegnet MllL/pZP9.

B. Pattedyrekspresjon av muse- zalphall- ligand

BHK-570-celler (ATCC nr. CRL-10314) ble utsådd i 10 cm vevsdyrkningsskåler og dyrket til ca. 20 % konfluens over natten ved 37 °C, 5 % C02, i DMEM/FBS-medium (DMEM, Gibco BRL, High Glucose-medium; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5 % føtalt, bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL). Cellene ble transfektert med plasmid MllL/pZP9 (eksempel 18A) ved anvendelse av et sett for stabil CaP04-transf eks jon av pattedyrceller (Stratagene) ifølge produsentens instruksjoner.

Én dag etter transfeksjonen ble cellene splittet 1:10 og 1:20 i seleksjonsmedium (DMEM/FBS-medium tilsatt 1 UM metotreksat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) i 150 mm skåler. Mediet på cellene ble erstattet med friskt seleksjonsmedium på dag 5 etter transfeksjonen. Omtrent 10 dager etter transfeksjonen ble metotreksatresistente kolonier behandlet med trypsin, og cellene ble slått sammen og utsådd i dyrkningsflasker for dyrkning i stor skala. Etter dyrkning av cellene til ca. 90 % konfluens ble de vasket tre ganger med PBS og dyrket med serumfritt ESTEP-medium (DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/l Na-pyruvat,

3,7 g/l NaHC03, 2,5 mg/l insulin, 5 mg/l transferrin, pH 7,0). Kondisjonert medium ble oppsamlet 3 dager senere og anvendt i en BaF3-proliferasjonsanalyse ved anvendelse av Alamar Blue, beskrevet i eksempel 19 nedenfor.

Eksempel 19

Muse- zalphall- ligand aktiverer human zalphall- reseptor i en BaF3- analyse med Alamar Blue

Proliferasjon av BaF3/zalphall-celler (eksemplene 4 og 5B) ble analysert ved anvendelse av serumfritt, kondisjonert medium fra BHK-celler som uttrykker zalphall-ligand fra mus (eksempel 18).

BaF3/zalphall-celler ble nedsentrifugert, vasket og utsådd i mIL-3-fritt medium som beskrevet i eksempel 5B.

Proliferasjon av BaF3/zalphall-cellene ble analysert ved anvendelse av serumfritt, kondisjonert medium fra aktivert apemilt (se eksempel 5A). Kondisjonert medium fra BHK-celler som uttrykker zalphall-ligand fra mus (eksempel 18). Det kondisjonerte medium ble fortynnet med mIL-3-fritt medium til konsentrasjoner på 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 % og 0,375 %. Proliferasjonsanalysen ble utført som i eksempel 5B.

Resultatene bekreftet den proliferative respons av BaF3/zalphall-cellene på zalphall-ligand fra mus. Den målte respons var omtrent fem ganger høyere enn bakgrunnsnivået ved 50 %-konsentrasjonen.

Eksempel 2 0

Zalphall- ligand aktiverer human zalphall- reseptor i en luciferaseanalyse

A. Konstruksjon av BaF3/ KZl34/ zalphall- cellelinje

Plasmid KZ134 ble konstruert med komplementære oligonukleotider ZC 12 749 (SEQ ID NO: 59) og ZC 12 748 (SEQ ID

NO: 60), som inneholdt STAT-transkripsjonsfaktorbindende elementer fra fire gener. Et modifisert c-fos-Sis-induserbart element (m67SlE eller hSIE) (Sadowski, H. et al., Science, 261:1739-1744, 1993), p21-SIEl fra p21-WAFI-genet (Chin, Y. et al., Science,, 272:719-722, 1996), brystkjertelresponselementet fra P-kaseingenet (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol., 11:3745-3755, 1991) og et STAT-induserbart element fra Fcg-RI-genet (Seidel, H. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 52:3041-3045, 1995) . Disse oligonukleotidene inneholder Asp718-Xhol-kompatible ender og ble ligert ved anvendelse av standardfremgangsmåter inn i en ildflueluciferaserapportørvektor med en c-fos-promoter

(Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem., 273:6229-6232, 1998), kuttet med de samme enzymer og inneholdende en neomycinselek-sjonsmarkør. Plasmid KZ134 ble anvendt for stabil transfeksjon av BaF3-celler ved anvendelse av standardfremgangsmåter for transfeksjon og seleksjon, for dannelse av BaF3/KZl34-cellelinjen.

En stabil BaF3/KZl34-indikatorcellelinje som uttrykte fullengde zalphall-reseptoren, ble konstruert som i eksempel 2A ved anvendelse av ca. 30 ug av zalphall-ekspresjonsvektoren beskrevet i eksempel 3.Klonene ble fortynnet, utsådd og selektert ved anvendelse av standardteknikker. Klonene ble gjennom-søkt ved en luciferaseanalyse (se eksempel 20B nedenfor) ved anvendelse av humant zalphall-ligandkondisjonert medium som induser. Klonene med den høyeste luciferaserespons (via STAT-luciferase) og den laveste bakgrunn ble utvalgt. En stabil transfektantcellelinje ble utvalgt. Cellelinjen ble betegnet BaF3/KZl34/zalphalll.

B. Zalphall- ligand fra menneske og mus aktiverer human zalphall- reseptor ved BaF3/ KZl34/ zalphall- luciferaseanalyse

BaF3/KZl34/zalphalll-celler ble nedsentrifugert og vasket med mIL-3-fritt medium. Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerning av mIL-3. Cellene ble så telt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i 96-brønners plater med ca. 30 000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn med mIL-3-fritt medium. Den samme fremgangsmåten ble anvendt for ikke-transfekterte BaF3/KZl34-celler for anvendelse som kontroll i den påfølgende analyse.

STAT-aktivering av BaF3/KZ134/zalphall-cellene ble analysert ved anvendelse av kondisjonert medium from (1) BHK-57 0-celler transfektert med human zalphall-ligand (eksempel 7) eller (2)BHK-570-celler transfektert med zalphall-ligand fra mus (eksempel 18), eller (4) mIL-3-fritt medium for måling av kontrollresponsen oppnådd med medium alene. Kondisjonert medium ble fortynnet med mIL-3-fritt RPMI-medium til konsentrasjoner på 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 % og 0,375 %. 100 ul av det fortynnede kondisjonerte medium ble tilsatt til BaF3/KZl34/zalphall-cellene. Analyse med det kondisjonerte medium ble utført i parallell på ikke-transfekterte BaF3/KZl34-celler som kontroll. Det totale analysevolum var 200 ul. Analyseplatene ble inkubert ved 37 °C, 5 % CO2, i 24 timer, hvoretter cellene ble nedsentrifugert ved 2000 rpm i 10 minutter, mediet avsugd og 25 ul lyseringsbuffer (Promega) tilsatt. Etter 10 minutter ved romtemperatur ble platene målt for aktivering av STAT-rapportørkonstruksjonen ved avlesning i et luminometer (Labsystems Luminoskan, modell RS), som tilsatte 40 ul luciferaseanalysesubstrat (Promega) ved en integrasjonstid på 5 sekunder.

Resultatene bekreftet STAT-rapportørresponsen av BaF3/KZl34/zalphall-cellene på human zalphall-ligand. Den målte respons lå ca. 50 ganger høyere enn kontrollen med medium alene ved 50 %-konsentrasjonen. STAT-aktivering som respons på human zalphall-ligand var fraværende i de ikke-transfekterte BaF3/KZl34-kontrollcellene, noe som viser at responsen formidles via zalphall-reseptoren.

Resultatene bekreftet også STAT-rapportørresponsen av BaF3/KZl34/zalphall-cellene på zalphall-ligand fra mus. Den målte respons lå ca. 40 ganger høyere enn kontrollen med medium alene ved 50 %-konsentrasjonen. Videre var STAT-aktivering som respons på zalphall-ligand fra mus åpenbar (ca. fem ganger) i de ikke-transfekterte BaF3/KZl34-kontrollcellene, noe som tyder på atBaF3-musecellene kan ha en endogen musereseptor.

Eksempel 21

Zalphall- ligand er aktiv i en musebenmargsanalyse

A. Isolering av ikke- adherente benmargsceller med lav tetthet

Friskt musefemuraspirat (benmarg) ble erholdt fra 6-10 uker gamle Balb/c- eller C57BL/6-hannmus. Benmargen ble vasket med RPMI + 10 % FBS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan, UT) og suspendert i RPMI + 10 % FBS som en cellesuspensjon fra hel benmarg. Cellesuspensjonen ble så fraksjonert i en tetthetsgradient (Nycoprep, 1.077, Animal; Gibco BRL) for anrikning av celler med lav tetthet, hovedsakelig mononukleære celler, som følger: Benmargscellesuspensjonen (ca. 8 ml) ble forsiktig pipettert over en Nycoprep-gradientløsning på ca. 15 ml i et 15 ml konisk rør, og så sentrifugert ved 600 x g i 20 minutter. Grenseflatesjiktet, som inneholder mononukleære celler med lav tetthet, ble så tatt ut, vasket med overskudd av RPMI + 10 % FBS og nedsentrifugert ved 400 x g i 5-10 minutter. De nedsentrifugerte cellene ble resuspendert i RPMI + 10 % FBS og utsådd i en T-75-f laske med ca. IO<6>celler/ml, og inkubert ved 37 °C, 5 % CO2, i ca. 2 timer. De resulterende suspensjonscellene var ikke-adherente benmargsceller med lav tetthet (NA-LD-celler).

B. 96- brønners analyse

NA-LD-musebenmargsceller ble utsådd med 25 000 til

45 000 celler/brønn i 96-brønners vevsdyrkningsskåler i RPMI + 10 % FBS + 1 ng/ml musestamcellefaktor (mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN), pluss 5 % kondisjonert medium fra en av følgende: (1) BHK-57 0-celler som uttrykker muse-zalphall-ligand (eksempel 18), (2)BHK-570-celler som uttrykker human zalphall-ligand (eksempel 7), eller (3) kontroll-BHK-570-celler som inneholder vektor og ikke uttrykker noen av ligandene. Disse cellene ble så behandlet med en rekke forskjellige cytokiner for analyse av ekspansjon eller differensiering av hematopoietiske celler

fra benmargen. For analysen ble de utsådde NA-LD-musebenmargs-cellene behandlet med humant interleukin-15 (hIL-15) (R&D Systems) eller et annet cytokin fra et sett (R&D Systems). Seriefortynninger av hIL-15 eller de andre cytokinene ble analysert med to gangers seriefortynning fra ca. 50 ng/ml ned til ca. 6025 ng/ml. Etter 8-12 dager ble 96-brønners analyser analysert for celleproliferasjon ved Alamar Blue-analysen, som beskrevet i eksempel 5B.

C. Resultater fra 96- brønners NA- LD- musebenmargsanalyse

Kondisjonert medium fra BHK-cellene som uttrykte human zalphall-ligand fra mus eller menneske, virket synergisk med hIL-15 til å fremme ekspansjon av en populasjon av hematopoietiske celler i NA-LD-musebenmarg. Denne ekspansjonen av hematopoietiske celler ble ikke observert med kondisjonert medium fra kontroll-BHK-celler tilsatt IL-15. Populasjonen av hematopoietiske celler som ble ekspandert med muse-zalphall-ligand med hIL-15 og de hematopoietiske cellene som ble ekspandert med human zalphall-ligand med hIL-15, ble dyrket videre i kultur. De hematopoietiske cellene ble farget med et fykoery-trinmerket anti-Pan-NK-celleantistoff (PharMingen) og analysert ved flowcytometri, som viste at de ekspanderte cellene ble positivt farget for denne naturlige drepercelle(NK-celle)-markøren.

Den samme 96-brønners analyse ble kjørt ved anvendelse av friske humane benmargsceller erholdt fra Poeitic Technologies, Gaithersburg, MD. Igjen gav zalphall-ligand fra mus og menneske sammen med IL-15 en ekspansjon av en hematopoietisk cellepopulasjon som ble positivt farget for NK-cellemarkøren ved anvendelse av antistoffet som er beskrevet ovenfor.

Eksempel 22

Konstruksjon for dannelse av mus transgene for human zalphall-ligand

A. Konstruksjon for ekspresjon av human zalphall- ligand fra den leverspesifikke MT- l- promoter

Oligonukleotider ble utformet for dannelse av et PCR-fragment som inneholdt en konsensus-Kozak-sekvens og det kodende området for human zalphall-ligand. Oligonukleotidene ble utformet med et Fsel-sete i 5'-enden og et Ascl-sete i 3'-enden for å lette kloning i (a) pMTl2-8, vår standard transgene vektor, eller (b) pKF051, en lymfoidspesifikk transgen vektor (eksempel 22B).

PCR-reaksjoner ble utført med 200 ng human zalphall-ligandtemplat (eksempel 7) og oligonukleotidene ZC 22 143 (SEQ ID NO: 61) og ZC 22 144 (SEQ ID NO: 62). PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 95 °C i 5 minutter, under hvilke "Advantage"-cDNA-polymerase ble tilsatt; 15 sykluser ved 95 °C i 60 sekunder, 60 °C i 60 sekunder og 72 °C i 90 sekunder; og 72 °C i 7 minutter. PCR-produktene ble fraksjonert ved agarosegelelektroforese og renset ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "Qiaquick" (Qiagen). Det isolerte DNA-fragment på 488 bp ble kuttet med Fsel og Ascl (Boehringer Mannheim), utfelt med etanol og ligert inn i pMTl2-8 som på forhånd var kuttet med Fsel og Ascl. Plasmid pMTl2-8, utformet for ekspresjon av et gen av interesse i lever og andre vev i transgene mus, inneholder en ekspresjonskassett som er flankert av 10 kb MT-1 5'-DNA og 7 kb MT-1 3'-DNA. Ekspresjonskassetten omfatter MT-1-promoteren, intron II fra rotteinsulin, en polylinker for innsetting av den ønskede klon, og poly-A-sekvensen fra humant veksthormon (hGH).

Cirka 1 ul av hver ligeringsreaksjon ble elektroporert inn i kompetente DH10B-"ElectroMax"-celler (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) ifølge produsentens instruksjoner, og cellene ble utsådd på LB-skåler tilsatt 100 ug/ml ampicillin og inkubert over natten. Kolonier ble plukket og dyrket i LB-medium tilsatt 100 ug/ml ampicillin. Minipreparater av DNA ble fremstilt fra de valgte kloner og analysert for humant zalphall-ligandinnskudd ved restriksjonskutting med EcoRI alene eller en kombinasjon av Fsel og Ascl, og påfølgende agarosegelelektroforese. Maksiprepa-rater av den korrekte pMT-humane zalphall-ligand ble fremstilt. Et Sall-fragment som inneholdt sammen med 5'- og 3'-flankerende sekvenser MT-1-promoteren, intron II fra rotteinsulin, humant zalphall-ligand-cDNA og poly-A-sekvensen fra hGH ble fremstilt for mikroinjeksjon i befruktede museoocytter. Mikroinjeksjonen og fremstilling av transgene mus ble utført som beskrevet av Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory press, NY, 1994.

B. Konstruksjon for ekspresjon av human zalphall- ligand fra den lymfoidspesifikke promoter EuLCK

Oligonukleotider ble utformet for dannelse av et PCR-fragment som inneholdt en konsensus-Kozak-sekvens og det kodende området for human zalphall-ligand. Disse oligonukleotidene ble utformet med et Fsel-sete i 5'-enden og et Ascl-sete i 3'-enden for å lette kloning i pKF051, en lymfoidspesifikk transgen vektor.

PCR-reaksjoner ble utført med 200 ng human zalphall-ligandtemplat (eksempel 7) og oligonukleotidene ZC 22 143 (SEQ ID NO: 61) og ZC 22 144 (SEQ ID NO: 62). En PCR-reaksjon ble utført ved anvendelse av "Advantage"-cDNA-polymerase (Clontech) under følgende betingelser: 95 °C i 5 minutter, 15 sykluser ved 95 °C i 60 sekunder, 60 °C i 60 sekunder og 72 °C i 90 sekunder; og 72 °C i 7 minutter. PCR-produktene ble renset som beskrevet ovenfor. Det isolerte DNA-fragment på 488 bp ble kuttet med Fsel og Ascl (Boehringer Mannheim), utfelt med etanol og ligert inn i pKF051 som på forhånd var kuttet med Fsel og Ascl. Den transgene vektor pKF051 er avledet fra pl026X (Iritani, B.M. et al., EMBO J., 26:7019-31, 1997) og inneholder den T-cellespesifikke proksimale lck-promoter, den B/T-cellespesifikke enhancer for immunglobulin |i-tungkjede, en polylinker for innsetting av den ønskede klon og et hGH-gen som koder for et inaktivt vekst-hormonprotein (som tilveiebringer 3'-introner og et polyadenyl-eringssignal).

Cirka 1 (il av hver ligeringsreaksjon ble elektroporert, bakteriene utsådd, kloner plukket og analysert for humant zalphall-ligandinnskudd ved restriksjonskutting, som beskrevet ovenfor. En korrekt klon med pKF051-zalphall-ligand ble bekreftet ved sekvensering, og et maksipreparat av denne klon ble fremstilt. Et Notl-fragment som inneholdt den proksimale lck-promoter, immunglobulin (i-enhanceren (EuLCK) , zalphall-cDNA og det muterte hGH-gen, ble fremstilt for mikroinjeksjon i befruktede museoocytter.

Eksempel 23

Vevsfordeling av zalphall- ligand i mus

Northern blot fra flere musevev (mus, museembryo, Clontech; MB1010, MB1012 Origene) ble analysert for å bestemme vevsfordelingen av ekspresjonen av zalphall-ligand i mus. En PCR-fremstilt probe på ca. 484 bp ble amplifisert ved anvendelse av plasmid MllL/pZP7 (eksempel 16) som templat og oligonukleotidene ZC 22 283 (SEQ ID NO: 57) og ZC 22 284 (SEQ ID NO: 58) som primere. PCR-amplifiseringen ble utført som følger: 1 syklus ved 94 °C i 1,0 minutt, 35 sykluser ved 94 °C i 30 sekunder,

50 °C i 30 sekunder og 72 °C i 3 0 sekunder, etterfulgt av

1 syklus ved 72 °C i 10 minutter. PCR-produktene ble synliggjort ved agarosegelelektroforese, og PCR-produktet på ca. 488 bp ble renset ved anvendelse av et gelekstraksjonssett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Proben ble radioaktivt merket ved anvendelse av innmerkingssettet "REDIPRIME" (Amersham) ifølge produsentens instruksjoner. Proben ble renset ved anvendelse av en "NUCTRAP"-gjennompressingskolonne (Stratagene). "EXPRESSHYB"-løsning (Clontech) ble anvendt for prehybridisering og som hybridiseringsløsning for Northern-blottene. Hybridiseringen fant sted over natten ved 65 °C med IO<6>cpm/ml merket probe. Blottene ble så vasket tre ganger med 2 x SSC og 0,1 % SDS ved romtemperatur, etterfulgt av to gangers vask med 0,1 x SSC og 0,1 % SDS ved 55 °C. To transkripter på ca. 1,2 og 3,5 kb ble observert i testis. Bare det største transkriptet ble observert i brissel.

Et RNA-Master Dot Blot fra mus (Clontech) som inneholdt RNA fra forskjellige vev som var normalisert for åtte hushold-ningsgener, ble også analysert og hybridisert som beskrevet ovenfor. Ekspresjon ble observert i testis.

Eksempel 24

Rensing av umerket zalphall- ligand fra menneske og mus fra BHK-570

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av zalphall-ligand fra menneske og mus fra kondisjonert medium fra BHK-57 0-celler transfektert med en konstruksjon som enten uttrykte human zalphall-ligand (eksempel 25) eller muse-zalphall-ligand MllL/pZP7 (eksempel 18). Det kondisjonerte medium ble konsentrert ved standardteknikker. Konsentrert kondisjonert medium (CM) ble sterilfiltrert gjennom 0,45 og 0,22 |im filtre. Mediet ble så fortynnet til en lav ionestyrke (< 2 mS) i 0,01 M HEPES (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ved pH 7,0. Fortynnet CM med lav ionestyrke ble så påsatt en 10 x 66 mm (6 ml) Poros HS50-kolonne (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) over natten ved 4 ml/minutt ved anvendelse av en BioCad SPRINT (PerSeptive Biosystems) . Kolonnen ble vasket med 10-20 kolonnevolumer (CV)

0,01 M HEPES, pH 7,0. Bundne proteiner ble så eluert med 1 M NaCl (Mallinckrodt, Paris, KY) i 0,01 M HEPES, pH 7,0, ved 5 ml/minutt; fraksjoner på 2 ml ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt. Fraksjonene med høyest absorbans ble analysert ved bioanalyse og farging av SDS-PAGE-geler med sølv (Geno Technology, St. Louis, MO) og Coomassie (Sigma, St. Louis, MO). Toppfraksjonene ble slått sammen, sterilfiltrert og fortynnet til < 19 mS med fosfatbufret saltvann (PBS, Gibco BRL) ved pH 7,2.

Den fortynnede prøve ble så påfylt ved 2 ml/minutt og ved anvendelse av en BioCad SPRINT påsatt enten en 0,8 ml Poros AL-kolonne med den løselige reseptor zalphall-CFLAG (eksempel 10B) eller den løselige reseptor zalphall-Fc4-fusjon (eksempel 10C) immobilisert til resinet (se nedenfor). Kolonnen ble så vasket med minst 20 CV PBS ved 10 ml/minutt. Kolonnen ble så hurtig eluert med en injeksjon av 600 ul 0,1 M glysin (aminoeddiksyre; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA), pH 2,5, ved en gjennomstrømningshastighet på 10 ml/minutt med PBS i en BioCad 700E. Fraksjoner på 1 ml ble oppsamlet, hver over et tidsrom på 6 sekunder, og umiddelbart nøytralisert med 55 ul 2 M Tris (Tris(hydroksymetyl)aminometan, EM Science, Gibbstown, NJ),

pH 8,8. Absorbansen ved 280 og 215 nM ble målt gjennom hele kromatografien.

Toppfraksjonene ble analysert ved bioanalyse og farging av SDS-PAGE-geler med sølv (Geno Technology) og Coomassie (Sigma). To bånd på ca. 24 kDog 18 kD ble sett på både sølv-fargede og Coomassie-fargede geler for muse-zalphall-ligand. Ett enkelt bånd på ca. 18 kD ble observert i både sølvfargede og Coomassie-fargede geler for human zalphall-ligand.

Immobilisering av løselige humane zalphall- reseptorpolypeptider til Poros AL- medium

Poros AL-kolonner med immobilisert løselig reseptor-zalphall-CFLAG (eksempel 10B) eller den løselige reseptor zalphall-Fc4-fusjon (eksempel 10C) ble fremstilt. Cirka 3 mg av den løselige reseptor zalphall-CFLAG og ca. 10 mg av den løse-lige reseptor zalphall-Fc4-fusjon ble anvendt. Alle operasjoner ble utført ved romtemperatur i en BioCad 700E. En 4,5 x 50 mm kolonne med Poros AL-medium ble pakket i 2 M NaCl ifølge produsentens instruksjoner. Kolonnen ble så ekvilibrert med 1,1 M Na2SO4/50 mM Na-fosfat, pH 7,2. Reseptoren ble konsentrert til

4 mg/ml ved anvendelse av en sentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 30 kD fra Millipore og så fortynnet 1:1 med 1,1 M Na2SO4/50 mM Na-fosfat, pH 7,2. Kolonnen ble vasket med en gjennomstrømningshastighet på 2 ml/minutt med 1,1 M Na2S04/ 50 mM Na-fosfat, pH 7,2, og injeksjoner med 100 ul fortynnet ligand ble utført for hvert niende CV inntil en stabil konsentrasjon av ligand i det ubundne materialet ble nådd. En 62 CV-gradient ble så kjørt fra 1,1 M Na2SO4/50 mM Na-fosfat, pH 7,2, til 550 nM Na2SO4/50 mM Na-fosfat, pH 7,2/5 mg/ml natriumcyanborhydrid. Kolonnen fikk så stå i ro i ca. 2 timer for full-føring av den kjemiske immobilisering.Kolonnen ble så ekvili brert med 0,2 M Tris, pH 7,2/ 5 mg/ml natriumcyanborhydrid og fikk stå rolig i ca. 1 time for blokkering. Endelig ble kolonnen ekvilibrert med PBS/0,02 % natriumazid og lagret ved 4 °C inntil den skulle brukes. Før anvendelsen ble kolonnen vasket med 0,1 M glysin for å sikre at uspesifikke proteiner ble fjernet, og at det ikke var lekkasje av immobilisert løselig human zalphall-reseptor fra kolonnen.

Eksempel 25

Ekspresjon av human zalphall- ligand i pattedyrceller

A. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren PSMPll/ zalphall- Lig

Et ekspresjonsplasmid som inneholdt hele eller deler av et polynukleotid som koder for human zalphall-ligand, ble konstruert ved homolog rekombinasjon. Et fragment av humant zalphall-ligand-cDNA (SEQ ID NO: 63) ble isolert ved anvendelse av PCR. To primere ble anvendt for fremstilling av det humane zalphall-ligandfragment i en PCR-reaksjon: (1) primer ZC 22 052 (SEQ ID NO: 64), som inneholder 40 bp av den flankerende vektorsekvens og 17 bp som tilsvarer aminoenden av den humane zalphall-ligand, og (2) primer ZC 22 053 (SEQ ID NO: 65), som inneholder 40 bp av 3'-enden som tilsvarer den flankerende vektorsekvens og 17 bp som tilsvarer karboksylenden av den humane zalphall-ligand. PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger:

1 syklus ved 94 °C i 2,0 minutter; 25 sykluser ved 94 °C i

30 sekunder, 60 °C i 30 sekunder, 72 °C i 30 sekunder; etterfulgt av 1 syklus ved 72 °C i 5 minutter og lagring ved 4 °C. 10 ul av PCR-reaksjonen på 100 ul ble fraksjonert i en 0,8 % LMP-agarosegel (Seaplaque GTG) med 1 x TBE-buffer for analyse, og det forventede fragment på ca. 560 bp ble observert. De gjenværende 90 ml av PCR-reaksjonen ble utfelt ved tilsetning av 5 ul 1 M NaCl og 250 Ul absolutt etanol for rekombinasjon inn i mottakervektoren pZMPll, som beskrevet nedenfor. Mottakerplasmidet pZMPll var på forhånd kuttet med Smal.

Plasmid pZMPll er avledet fra plasmid pCZRl99 (beskrevet heri, se f.eks. eksempel 8). Plasmid pCZRl99 er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett som omfatter den umiddelbart tidlige CMV-promoter, et konsensusintron fra det variable området fra immunglobulintungkjedested hos mus, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser, et stoppkodon og en terminator fra humant veksthormon.Plasmidet har også et E. coli-replikasjonsorigo, en ekspresjonsenhet for en pattedyrseleksjonsmarkør med en SV40-promoter, en SV40-enhancer og et SV40-replikasjonsorigo, et DHFR-gen og SV40-terminatoren. Vektoren pZMPll ble konstruert fra pCZRl99 og omfatter innføring av metallotioneinpromoteren i stedet for den umiddelbart tidlige CMV-promoter og innføring avKozak-sekvenser i 5'-enden av den åpne leseramme.

100 ul kompetente gjærceller { S. cerevisiae) ble kombinert med 10 ul av en blanding som inneholdt ca. 1 ug av det humane zalphall-ligandinnskuddet og 100 ng Smal-kuttet pZMPll-vektor og overført til en 0,2 cm elektroporeringskyvette. Blandingene av gjær og DNA ble elektropulset ved 0,75 kV

(5 kV/cm), "uendelig" ohm, 25UF. Til hver kyvette tilsettes

600 ul 1,2 M sorbitol, og gjærcellene ble så utsådd i to 300 ul porsjoner på to URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C.

Etter ca. 48 timer ble Ura<+->gjærtransformantene fra en enkeltskål resuspendert i 1 ml H2O og sentrifugert i kort tid for nedsentrifugering av gjærcellene. De nedsentrifugerte cellene ble resuspendert i 1 ml lyseringsbuffer (2 % Triton-X, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 ul lyserings-blanding ble overført til et Eppendorf-rør inneholdende 300 ul syrevaskede glasskuler og 200 ul fenol-kloroform og vorteksbehandlet to eller tre ganger med 1 minutts mellomrom, etterfulgt av 5 minutters sentrifugering i enEppendorf-sentrifuge ved maksimal hastighet. 3 00 ul av vannfasen ble overført til et nytt rør, og DNA-et ble utfelt med 600 ul etanol (EtOH), etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble resuspendert i 100 ul H20.

Transformasjon av elektrokompetente E. coli-celler (DH10B, Gibco BRL) utføres med 0,5-2 ml gjær-DNA-preparat og 40 ulDHlOB-celler. Cellene ble elektropulset ved 2,0 kV, 25UF og 400 ohm. Etter elektroporeringen ble 1 ml SOC (2 % "Bacto"-trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5 % gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04, 20 mM glukose) utsådd i porsjoner på 250 ul på fire LB-AMP-skåler (LB-medium (Lennox), 1,8 %"Bacto"-agar (Difco), 100 mg/l ampicillin).

Enkeltkloner inneholdende den korrekte ekspresjons-konstruksjon for human zalphall-ligand ble identifisert ved restriksjonskutting for å bekrefte nærvær av innskuddet og for å bekrefte at de forskjellige DNA-sekvensene var blitt korrekt sammenkoblet. Innskuddet i de positive klonene ble sekvensert.Plasmid-DNA i større skala isoleres ved anvendelse av "Qiagen Maxi"-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.

B. Pattedyrekspresjon av human zalphall- ligand

BHK-570-celler (ATCC nr. CRL-10314), ble utsådd i 10 cm vevsdyrkningsskåler og dyrket til ca. 50-70 % konfluens over natten ved 37 °C, 5 % C02, i DMEM/FBS-medium (DMEM, Gibco BRL High Glucose (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5 % føtalt, bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL)). Cellene ble så transfektert med plasmid PZMPll/zalphall-Lig (se eksempel 25A), ved anvendelse av "Lipofectamin" (Gibco BRL) i serumfritt (SF) medium (DMEM, 10 mg/ml transferrin, 5 mg/ml insulin, 2 mg/ml fetuin, 1 % L-glutamin og 1 % natriumpyruvat). Zalphall-Fc4/pZMP6 (eksempel 8B) ble fortynnet i 15 ml rør inntil et endelig sluttvolum på 640 ul med SF-medium. 35 ul "Lipofectamin"

(Gibco BRL) ble blandet med 605 ul SF-medium. "Lipofectamin"-blandingen ble tilsatt til DNA-blandingen, og dette ble inkubert i ca. 3 0 minutter ved romtemperatur. 5 ml SF-medium ble tilsatt til blandingen av DNA og "Lipofectamin". Cellene ble vasket én gang med 5 ml SF-medium, som så ble avsugd, og blandingen av DNA og"Lipofectamin" ble tilsatt. Cellene ble inkubert ved 37 °C i 5 timer, hvoretter 6,4 ml DMEM/10 % FBS, 1 % PSN-medium ble tilsatt til hver skål. Skålene ble inkubert ved 37 °C over natten, og blandingen av DNA og "Lipofectamin" ble erstattet med friskt 5 % FBS/DMEM-medium neste dag. På dag 5 etter transfeksjonen ble cellene splittet i T-162-flasker i seleksjonsmediet (DMEM/5 %

FBS, 1 % L-GLU, 1 % NaPyr). Cirka 10 dager etter transfeksjonen ble to 150 mm dyrkningsskåler med metotreksatresistente kolonier fra hver transfeksjon behandlet med trypsin, og cellene ble slått sammen og utsådd i en T-162-flaske og overført til dyrkning i stor skala. Kondisjonert medium fra kulturer i stor skala ble anvendt for rensing av humant zalphall-ligandpolypeptid, som beskrevet i eksempel 24.

Eksempel 26

Konstruksjon for dannelse av mus transgene for muse- zalphall-ligand

A. Konstruksjon for ekspresjon av muse- zalphall- ligand fra den lymfoidspesifikke EuLCK- promoter

Oligonukleotider ble utformet for dannelse av et PCR-fragment som inneholdt en konsensus-Kozak-sekvens og det kodende området for zalphall-ligand fra mus. Disse oligonukleotidene ble utformet med et Fsel-sete i 5<1->enden og et Ascl-sete i 3'-enden for å lette kloning i (a) pKF051, en lymfoidspesifikk transgen vektor, eller (b) pTGl2-8, vår standard transgene vektor.

PCR-reaksjoner ble utført med 200 ng muse-zalphall-ligandtemplat (SEQ ID NO: 55, eksempel 16) og oligonukleotidene ZC 23 115 (SEQ ID NO: 66) og ZC 23 116 (SEQ ID NO: 67). En PCR-reaks jon ble utført under anvendelse av "Advantage"-cDNA-polymerase (Clontech) under PCR-betingelsene beskrevet i eksempel 22B. PCR-produktet ble isolert som beskrevet i eksempel 22B. Det isolerte DNA-fragment på 440 bp ble kuttet og ligert inn i pKF051 som på forhånd var kuttet med Fsel og Ascl, som beskrevet i eksempel 22B.

Cirka 1 ul av hver ligeringsreaksjon ble elektroporert, og bakterier ble utsådd og kloner plukket og analysert for humant zalphall-ligandinnskudd ved restriksjonskutting, som beskrevet i eksempel 22. En korrekt pKF051-zalphall-ligandklon ble bekreftet ved sekvensering, og et maksipreparat av denne klon ble fremstilt. Et Notl-fragment som inneholdt den proksimale lck-promoter, immunglobulin u-enhanceren, zalphall-ligand-cDNA og det muterte hGH-gen, ble fremstilt for mikroinjeksjon i befruktede museoocytter.

B. Konstruksjon for ekspresjon av muse- zalphall- ligand fra den leverspesifikke MT- l- promoter

Det samme muse-zalphall-ligandinnskudd som i eksempel 26A ble subklonet i vektoren pTGl2-8, som beskrevet i eksempel 22A. For denne konstruksjonen ble ca. 10 mg av maksipreparatet av pKF051-zalphall-ligand-DNA kuttet med Fsel og Ascl sammen og utfelt med etanol, og muse-zalphall-ligandfragmentet ble renset som beskrevet i eksempel 22. Dette fragment ble så ligert inn iPTG12-8, som på forhånd var kuttet med Fsel og Ascl, som beskrevet i eksempel 22A. Elektroporering, analyse av kloner og maksipreparering av DNA ble utført som beskrevet i eksempel 22. Et Sall-fragment som omfattet 5'- og 3'-flankerende sekvenser, MT-l-promoteren, intron II fra rotteinsulin, muse-zalphall-ligand-cDNA og poly-A-sekvensen fra hGH ble fremstilt for mikroinjeksjon i befruktede museoocytter.

Eksempel 27

Polyklonale antistoffer mot muse- zalphall- ligand

Polyklonale antistoffer ble fremstilt ved immunisering av to hvite New Zealand-kaniner av hunnkjønn med det rensede rekombinante protein mu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32). Kaninene ble gitt en innledende intraperitoneal (ip) injeksjon med 200 mg renset protein i komplett Freunds adjuvans, etterfulgt av for-sterknings injeksjoner intraperitonealt av 100 mg peptid i ukomplett Freunds adjuvans hver 3. uke. 7-10 dager etter til-førsel av den andre forsterkningsinjeksjonen (i alt tre injeksjoner) ble blod tappet og serum oppsamlet. Dyrene ble så gitt forsterkningsinjeksjoner og tappet for blod hver 3. uke.

Det mu-zalphallL/MBP-6H-spesifikke kaninserum ble pre-adsorbert til anti-MBP-antistoffer ved anvendelse av en CNBr-SEPHAROSE-4B-proteinkolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg renset rekombinant, maltosebindende protein (MBP) pr. gram CNBr-SEPHAROSE. Rekombinant MBP ble fremstilt og renset på en amylosekolonne i laboratoriet ved anvendelse av fremgangsmåter som er vel kjent innen faget. De mu-zalphall-ligandspesifikke polyklonale antistoffene ble affinitetsrenset fra kaninserumet ved anvendelse av en CNBr-SEPHAROSE- 4B-proteinkolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg av det spesifikke antigen, renset rekombinant mu-zalphallL/MBP-6H-protein (eksempel 32), etterfulgt av 20 x dialyse mot PBS over natten. Mu-zalphall-ligandspesif ikke antistoffer blekarakterisert vedELISA med 1 ug/ml av de rensede rekombinante proteinene mu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32) eller hu-zalphallL-MBP/6H (eksempel 32) som mål for antistoffet. Den nedre deteksjonsgrense (LLD) for affinitetsrenset anti-mu-zalphallL/MBP-6H-antistoff fra kanin var

100 pg/ml for det spesifikke, rensede rekombinante antigen mu-

zalphallL/MBP-6H og 500 pg/ml for renset rekombinant hu-zalpha-11L/MBP-6H.

Eksempel 28

Konstruksjon av pattedyrekspresjonsvektor og ekspresjon i stor skala av humant zalphall- ligand i CHO- DG44- celler

En pattedyrekspresjonsvektor for human zalphall-ligand (SEQ ID NO: 1), utformet for innføring av et Sall-sette i 5'-enden og et Pmel-sete i 3'-enden av cDNA, ble konstruert ved amplifisering med PCR fra et plasmid som inneholdt human zalphall-ligand (eksempel 7) med oligonukleotidprimerne ZC 22 054 (SEQ ID NO: 70) og ZC 22 055 (SEQ ID NO: 71). PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 94 °C i 4 minutter, 25 sykluser ved 94 °C i 45 sekunder, 50 °C i 45 sekunder og 72 °C i 3 minutter, og 72 °C i 10 minutter. PCR-produktet ble isolert som beskrevet heri og kuttet med Sali og Pmel, og så ligert til plasmid pDC312, som på forhånd var kuttet i egnede restriksjonsseter i polylinkeren, ved anvendelse av standardfremgangsmåter som beskrives heri. Plasmid pDC312 beskrives av Morris, A. et al., "Expression Augmenting Sequence Element (EASE) isolated from Chinese Hamster Ovary Cells", i Animal Cell Technology, Carrondo, M.J.T. et al.

(red.) (1997), Kluwer Academic Publishers, Nederland, s. 529-534.

Den ligerte vektor ble transfektert inn i suspensjons-veksttilpassede CHO-DG44-celler (fremstilt i laboratoriet hos Novo Nordisk, Danmark) ved lipofeksjon med "LipofectaminPlus"-reagens (Gibco BRL) ifølge produsentens instruksjoner. Trans-fektantene ble selektert med PFCHO-medium (JRH, Lenexa, Kansas) fritt for tymidin og hypoksantin, etterfulgt av seleksjon med 200 nM metotreksat (Sigma, St. Louis, MO). De metotreksatresistente cellene ble klonet ved fortynning og analysert for produksjon av zalphall-ligand ved en BaF3-aktivitetsanalyse (eksempel 5B).

En produktiv klon ble oppskalert og dyrket i en 7-20 1 bioreaktor (Applikon Bioreactors, Schiedam, Nederland) i PFCHO-medium for fremstilling av materiale for rensing (eksempel 29).

Eksempel 29

Rensing i stor skala av umerket zalphall- ligand fra menneske og mus fra pattedyrekspresjonscellelinjene BHK og CHO

A. CHO- uttrykt human zalphall- ligand

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av human zalphall-ligand fra minst 30 1 kondisjonert CHO-medium (se eksempel 28). Konsentrert eller ikke-konsentrert kondisjonert medium (CM) ble sterilfiltrert gjennom 0,45 og 0,22 um filtre. Det kondisjonerte medium ble så bufret med 0,01 M MES (Fluka BioChemika, Sveits), og pH ble justert til 6,0, og så satt på en 50 x 100 mm (196 ml) Poros 50HS-kolonne (en kraftig kationbytter fra PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) over natten ved

4 ml/minutt ved anvendelse av en BioCad SPRINT (PerSeptive Biosystems) . Kolonnen ble vasket med 10-20 kolonnevolurner (CV)

0,01 MMES/0,130 M NaCl (Mallinckrodt, Paris, KY), pH 6,0. Bundne proteiner ble så eluert med en 10 CV-gradient fra 0,130 M NaCl til 1 M NaCl i 0,01 M MES, pH 6,0, ved 30 ml/minutt; fraksjoner på 25 ml ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt. Fraksjonene med topp-absorbans ble analysert ved SDS-PAGE og sølvfarging (Geno Technology, St. Louis, MO), Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) og immunologisk Western-blotting ved anvendelse av antistoffer mot human zalphall-ligand (eksemplene 33 og 34).

Toppfraksjonene ble slått sammen og så konsentrert i en konsentrator med beholder ved omrøring med en YMlO-membran (Millipore/Amicon, Bedford, MA) til et nominelt volum (1-10 ml). Prøven ble så satt på en egnet Sephacryl S200-høyresolusjons-størrelseseksklusjonskolonne (Pharmacia, Uppsala, Sverige) (52-600 ml) ekvilibrert i PBS (Gibco BRL) ved gjennomstrømnings-hastigheter på 1-2 ml/minutt; fraksjoner på 1-2 ml ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt. Toppfraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE og farging med sølv (Geno Technology, St. Louis, MO) og Coomassie (Sigma, St. Louis, MO).

Fraksjonene av interesse ble slått sammen og konsentrert med en sentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 5 kD fra Millipore til et minimalt volum. Sluttproduktet ble så analysert ved SDS-PAGE og Coomassie-farging (Sigma, St. Louis, MO), immunologisk Western-blotting, N-terminal sekvensering, aminosyreanalyse og BCA-analyse (Pierce, Rockford, Illinois) for måling av proteinets renhet og konsentrasjon.

B. BHK- 570- uttrykt muse- zalphall- ligand

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av muse-zalphall-ligand fra kondisjonert BHK-medium (eksempel 18). Konsentrert eller ikke-konsentrert kondisjonert medium (CM) ble sterilf iltrert gjennom 0,45 og 0,22 |im filtre. Mediet ble så bufret med 0,01 M MES (Fluka BioChemika, Sveits), og pH ble justert til 6,0. CM ble analysert, påsatt og eluert fra en AS-kolonne som beskrevet i eksempel 29A.

Fraksjoner av interesse ble slått sammen og så konsentrert i en konsentrator med beholder med omrøring som i eksempel 29A til et volum på 20-3 0 ml. pH ble justert til 7,0, og prøven ble så påsatt en 0,8 ml Poros AL-kolonne som enten hadde ca. 3 mg av den merkede løselige reseptor zalphall-CFLAG (eksempel 10B) eller ca. 10 mg av fusjonsreseptoren zalphall-Fc4 (eksempel 10C), immobilisert til resinet (se fremgangsmåte nedenfor) ved 1 ml/minutt i en BioCad SPRINT. Kolonnen ble så vasket med minst 20 CV 0,3 M NaCl/PBS (Gibco BRL)/0,01 M MES ved 10 ml/minutt. Kolonnen ble så hurtig eluert med en injeksjon av 600 ul 0,1 M glysin (aminoeddiksyre; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA), pH

2,5, ved en gjennomstrømningshastighet på 10 ml/minutt med PBS i en BioCad SPRINT. Fraksjoner på 1 ml ble oppsamlet, hver over et tidsrom på 6 sekunder, og umiddelbart nøytralisert med 55 ul 2 M Tris (Tris(hydroksymetyl)aminometan, EM Science, Gibbstown, NJ), pH 8,8. Absorbansen ved 280 og 215 nM ble målt gjennom hele

kromatografien. Toppfraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE og farging med sølv (Geno Technology, St. Louis, MO), Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) og immunologisk Western-blotting som ovenfor.

Toppfraksjonene ble slått sammen og så konsentrert i en konsentrator med beholder ved omrøring som i eksempel 29A til et minimalt volum (1-10 ml). Prøven ble så påsatt en passende Sephacryl S200-høyresolusjonsstørrelseseksklusjonskolonne (Pharmacia), ekvilibrert og analysert som i eksempel 29A. Toppfraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE og farging med sølv (Geno Technology, St. Louis, MO) og Coomassie (Sigma, St. Louis, MO). Fraksjonene av interesse ble slått sammen, konsentrert og analysert som i eksempel 29A.

C. Proteinimmobilisering til Poros AL- medium

Alle operasjoner ble utført ved romtemperatur i enBioCad 70OE. En 4,5 x 50 mm kolonne ble pakket med Poros AL-medium i 2 M NaCl ifølge produsentens spesifikasjoner. Kolonnen ble så ekvilibrert med 1,1 M Na2S04og 50 mM Na-fosfat, pH 7,2. Reseptoren ble konsentrert til 4 mg/ml ved anvendelse av en sentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 3 0 kD fra Millipore og så fortynnet 1:1 med 1,1 M Na2S04og 50 mM Na-fosfat, pH 7,2. Kolonnen ble vasket med en gjennomstrømnings-hastighet på 2 ml/minutt med 1,1 M Na2S04og 50 mM Na-fosfat,

pH 7,2, og injeksjoner med 100 ul fortynnet ligand ble utført for hvert niende CV inntil en stabil konsentrasjon i eluatet, som viser at kolonnen er mettet, ble oppnådd. En 62 CV-gradient ble så kjørt fra 1,1 M Na2S04og 50 mM Na-fosfat, pH 7,2, til 550 nM Na2S04og 50 mM Na-fosfat, pH 7,2 med 5 mg/ml natriumcyanborhydrid. Kolonnen fikk så stå i ro i ca. 2 timer for full-føring av den kjemiske immobilisering.Kolonnen ble så ekvilibrert med 0,2 M Tris, pH 7,2 med 5 mg/ml natriumcyanborhydrid og fikk stå rolig i ca. 1 time. Endelig ble kolonnen ekvilibrert med PBS med 0,02 % natriumazid og lagret ved 4 °C inntil den skulle brukes. Før anvendelsen ble kolonnen preeluert med 0,1 M glysin for å sikre at uspesifikke proteiner ble fjernet, og at det ikke var lekkasje av den immobiliserte reseptor fra kolonnen.

Eksempel 3 0

Ekspresjonsvektorkonstruksjon, ekspresjon og rensing av umerket menneske- og muse- zalphall- ligand fra baculovirus

A. Konstruksjon for ekspresjon av human zalphall- ligand i baculovirus

En ekspresjonsvektor, p-zalphallL, ble fremstilt for ekspresjon av humane zalphall-ligandpolypeptider i insektceller. Et fragment på 517 bp som inneholdt sekvensen for human zalpha- 11-ligand og kodet for BamHI- og Xhol-restriksjonsseter i 5'-henholdsvis 3'-ende ble dannet ved PCR-amplifisering fra et plasmid som inneholdt humant zalphall-ligand-cDNA (eksempel 7) med primerne ZC 23 444 (SEQ ID NO: 74) og ZC 23 445 (SEQ ID NO: 75). PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 1 syklus ved 94 °C i 4 minutter; etterfulgt av 25 sykluser ved 94 °C i 45 sekunder, 50 °C i 45 sekunder og 72 °C i 2 minutter; 1 syklus ved 72 °C i 10 minutter; etterfulgt av lagring ved 4 °C. Fragmentet ble synliggjort ved gelelektroforese (1 % Seaplaque/1 % NuSieve). Båndet ble kuttet ut, fortynnet til 0,5 % agarose med 2 mM MgCl2, smeltet ved 95 °C, kuttet med BamHI og Xhol (Boehringer Mannheim) og ligert inn i en BamHI/Xhol-kuttet baculovirusekspresjonsvektor, pZBV3L. pZBV3L-vektoren er en modifikasjon av ekspresjonsvektoren "pFastBacl" (Life Technologies), hvor polyhedronpromoteren er fjernet og erstattet med den sent aktiverte promoter fra basisk protein. Cirka 14 ng av det restriksjonskuttede zalphall-ligandinnskudd og ca. 40 ng av den tilsvarende vektor ble ligert over natten ved 16 °C.

Ligeringsblandingen ble fortynnet tre ganger med TE

(10 mMTris-HCl, pH 7,5, og 1 mM EDTA), og ca. 4 fmol av den fortynnede ligeringsblanding ble transformert inn i DH5ct "LibraryEfficiency" kompetente celler (Life Technologies) ifølge produsentens instruksjoner, ved varmesjokk i 45 sekunder i et 42 °C vannbad. Det transformerte DNA og cellene ble fortynnet med 450 ul SOC-medium (2 % "Bacto"-trypton, 0,5 % "Bacto"-gjærekstrakt, 10 ml 1 M NaCl, 1,5 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04og 20 mM glukose) og utsådd på LB-skåler inneholdende 100 ug/ml ampicillin. Kloner ble analysert ved restriksjonskutting, og 1 ul av den positive klon ble transformert inn i 20 ul DHl0-"Bac Max Efficiency"-kompetente celler (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) ifølge produsentens instruksjoner, ved varmesjokk som beskrevet ovenfor. De transformerte cellene ble så fortynnet med 980 ul SOC-medium (2 % "Bacto"-trypton, 0,5 % "Bacto"-gjærekstrakt, 10 ml 1 M NaCl, 1,5 mM KC1, 10 mM MgCl2,

10 mM MgS04og 20 mM glukose), dyrket i en risteinkubator ved

37 °C i 4 timer og utsådd på Luria-agarskåler inneholdende

50 ug/ml kanamycin, 7 ug/ml gentamicin (Life Technologies),

10 ug/ml tetrasyklin, IPTG (Pharmacia Biotech) og Bluo-Gal (Life Technologies). De utsådde cellene ble inkubert i 48 timer ved 37 °C. Fargeseleksjon ble anvendt for identifisering av celler som hadde et humant zalphall-ligandkodende donorinnskudd som var blitt inkorporert i plasmidet (betegnet et "bakmid"). Disse koloniene, som hadde hvit farge, ble valgt for analyse. Humant zalphall-ligandbakmid-DNA ble isolert fra positive kolonier ved anvendelse av QiaVac Miniprep8-systemet (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Klonene ble analysert for korrekt innskudd ved amplifisering av DNA med primere komplementære til det transposable element i bakmidet ved PCR med primerne ZC 447 (SEQ ID NO: 76) og ZC 97 6 (SEQ ID NO: 77). PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 35 sykluser ved 94 °C i 45 sekunder, 50 °C i 45 sekunder og 72 °C i 5 minutter; 1 syklus ved 72 °C i 10 minutter; etterfulgt av lagring ved 4 °C. PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel for kontroll av størrelsen på innskuddet. Kloner med korrekt innskudd ble anvendt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda(Sf9)-celler.

B. Ekspresjon og dannelse av materiale for rensing av human zalphall- ligand fra baculovirus

Sf9-celler ble utsådd med 5 x IO<6>celler pr. 35 mm skål og fikk feste seg til skålen i 1 time ved 27 °C. 5 ul humant zalphall-ligandbakmid-DNA (se ovenfor) ble fortynnet med 100 ul Sf-900 II SFM (Life Technologies). 6 ul "CellFECTIN"-reagens (Life Technologies) ble fortynnet med 100 ul Sf-900 II SFM. Bakmid-DNA-løsningen og lipidløsningen ble forsiktig sammenblandet og inkubert i 3 0-45 minutter ved romtemperatur. Mediet fra én skål med celler ble avsugd, og cellene ble vasket 1 x med 2 ml friskt Sf-900 II SFM-medium. 800 ul Sf-900 II SFM ble tilsatt til lipid-DNA-blandingen. Vaskemediet ble avsugd, og DNA-lipidblandingen ble tilsatt til cellene. Cellene ble inkubert ved 27 °C i 4-5 timer. DNA-lipidblandingen ble avsugd, og 2 ml Sf-900 II-medium ble tilsatt til hver skål. Skålene ble inkubert ved 27 °C, 90 % luftfuktighet i 96 timer, hvoretter viruset ble høstet.

For primær amplifisering ble Sf9-celler dyrket i 50 ml Sf-900 II SFM i en 125 ml ristekolbe til en tilnærmet tetthet på 0,41-0,52 x IO<5>celler/ml. De ble så infisert med 150 ul av virussuspensjonen fremstilt ovenfor og inkubert ved 27 °C i 3 dager, hvoretter viruset ble høstet ifølge standardfremgangs måter kjent innen faget. En prøve på 500 ul ble analysert i en BaF3-analyse (eksempel 5) for å vise at den var biologisk aktiv.

For den sekundære amplifisering ble Sf9-celler dyrket i 1 1 Sf-900 II SFM i en 2800 ml ristekolbe til en tilnærmet tetthet på 0,5 x IO5 celler/ml. Kulturen ble infisert med 500 ul av

den primære virussuspensjonen fremstilt ovenfor og inkubert ved 27 °C i 4 dager, hvoretter viruset ble høstet ifølge standardfremgangsmåter kjent innen faget. Viruset ble titrert og dyrket opp i stor skala for rensing av baculovirusfremstilt human zalphall-ligand (hu-zalphallL-Bv), som beskrevet i eksempel 30C og eksempel 3OD nedenfor.

C. Rensing i stor skala av baculovirusuttrykt zalphall-ligand fra menneske/ mus

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av human zalphall-ligand (hu-zalphallL-Bv) fra BV-kondisjonert medium (eksempel 3OB). Kondisjonert medium (CM) ble sterilfiltrert gjennom 0,45 og 0,22 um filtre og så bufret med 0,01 M MES (Fluka BioChemika, Sveits), og pH ble justert til 6,0. CM ble så applisert på en Poros 50HS-kolonne og fraksjonert, og fraksjonene ble oppsamlet og analysert som beskrevet i eksempel 29A.

Toppfraksjonene ble slått sammen, konsentrert, fraksjonert med en høyresolusjonsstørrelseseksklusjonskolonne og analysert som beskrevet i eksempel 29A.

Fraksjonene av interesse fra størrelseseksklusjons-kolonnen ble slått sammen og konsentrert med en sentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 5 kD fra Millipore til et minimalt volum. Sluttproduktet ble så analysert ved SDS-PAGE og farging med Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), immunologisk Western-blotting, N-terminal sekvensering, aminosyreanalyse og CB (Pierce, Rockford, Illinois) for måling av proteinets renhet og konsentrasjon, som beskrevet i eksempel 29A. Proteinproduktet ble lagret ved -80 °C.

D. Rensing i liten skala ( < 2 mg) av baculovirusuttrykt zalphall- ligand fra menneske/ mus

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av < 2 mg zalphall-ligand fra menneske eller mus fra BV-kondisjonert medium. CM ble filtrert og bufret, og pH ble justert som i eksempel 3 0C. CM ble så applisert på en Poros 50HS-kolonne, og kolonnen ble eluert og eluatet analysert som i eksempel 30C.

Fraksjonene ble slått sammen og konsentrert ved diafiltrering i en konsentrator med beholder ved omrøring med en YMlO-membran (10 kD molekylvektgrense) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) til et nominelt volum (20-30 ml). pH ble justert til 7,0, og prøven ble applisert på en 0,8 ml Poros AL-kolonne som enten hadde ca. 3 mg av den løselige reseptor zalphall-CFLAG (eksempel 10B) eller ca. 10 mg av den løselige reseptor zalphall-Fc4-fusjon (eksempel 10C) immobilisert til resinet (se fremgangsmåte i eksempel 29C) ved 1 ml/minutt i en BioCad SPRINT. Kolonnen ble så vasket med minst 20 CV 0,3 M NaCl/PBS (Gibco BRL)/0,01 M MES ved 10 ml/minutt. Kolonnen ble så hurtig eluert med en injeksjon av 600 Ul 0,1 M glysin (aminoeddiksyre; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA), pH 2,5, ved en gjennom-strømningshastighet på 10 ml/minutt med PBS i en BioCad SPRINT. Fraksjoner på 1 ml ble oppsamlet, hver over et tidsrom på 6 sekunder, og pH ble umiddelbart nøytralisert med 55 ul 2 M Tris (Tris(hydroksymetyl)aminometan, EM Science, Gibbstown, NJ), pH 8,8. Absorbansen ved 280 og 215 nM ble målt gjennom hele kromatografien. Fraksjonene ble analysert som ovenfor.

Toppfraksjonene ble slått sammen og konsentrert ved diafiltrering i en konsentrator med beholder ved omrøring med en YMlO-membran (10 kD molekylvektgrense) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) til 1-2 ml. Prøven ble så påsatt en egnet Sephacryl S200-høyresolusjonsstørrelseseksklusjonskolonne (Pharmacia, Uppsala, Sverige) ekvilibrert i PBS (Gibco BRL) ved en optimal gjennomstrømningshastighet; fraksjoner ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt. Fraksjonene ble analysert som ovenfor.

Fraksjonene av interesse ble slått sammen og konsentrert med en sentrifugeringskonsentrator med molekylvektgrenseverdi 5 kD fra Millipore til et nominelt volum. Sluttproduktet ble så analysert ved SDS-PAGE og farging med Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), immunologisk Western-blotting, N-terminal sekvensering, aminosyreanalyse og BCA-analyse (Pierce, Rockford, Illinois) for måling av proteinets renhet og konsentrasjon. Proteinproduktet ble lagret som beskrevet ovenfor.

E. Konstruksjon for ekspresjon av muse- zalphall- ligand i baculovirus:p- zalphall- lig. M

En ekspresjonsvektor, p-zalphallLM, ble fremstilt for ekspresjon av zalphall-ligandpolypeptider fra mus i insektceller. Et fragment på 413 bp som inneholdt sekvensen for zalphall-ligand fra mus og som inneholdt BspEI- og Xbal-restriksjonsseter i 5'- henholdsvis 3'-enden, ble dannet ved PCR-amplifisering fra et plasmid som inneholdt zalphall-ligand-cDNA fra mus (eksempel 16) ved anvendelse av primerne ZC 25 970 (SEQ ID NO: 109) og ZC 25 971 (SEQ ID NO: 110) og settet Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) ifølge produsentens instruksjoner. PCR-betingelsene var som følger: 1 syklus ved 94 °C i 2 minutter; etterfulgt av 35 sykluser ved 94 °C i

15 sekunder, 50 °C i 30 sekunder, 72 °C i 2 minutter; 1 syklus

ved 72 °C i 10 minutter, etterfulgt av lagring ved 4 °C. Et lite uttak av PCR-produktet ble synliggjort ved gelelektroforese (1 % NuSieve-agarose). Resten av fragmentet ble renset ved anvendelse av Qiagen-PCR-rensesettet ifølge produsentens instruksjoner og eluert med 3 0 ul H20. Fragmentet ble så kuttet med restriksjonsenzymene Bspel og Xbal (Boehringer Mannheim) ved 37 °C i ca.

2 timer, og så fraksjonert i en agarosegel som beskrevet ovenfor. Båndet ble kuttet ut, renset og eluert ved anvendelse av Qiagen-gelekstraksjonssettet ifølge produsentens instruksjoner. Det rensede fragment ble ligert inn i en Bspel/Xbal-kuttet baculovirusekspresjonsvektor, pZBV37L. pZBV37L-vektoren er en modifikasjon av ekspresjonsvektoren "pFastBacl" (Life Technologies), hvor polyhedronpromoteren er fjernet og erstattet med den sent aktiverte promoter fra basisk protein, etterfulgt av den sekretoriske signalsekvens fra Ecdysteroid glukosyltransferase (EGT). Cirka 5 ul av det restriksjonskuttede muse-zalpha-11-ligandinnskudd og ca. 100 ng av den kuttede vektor ble ligert over natten ved 16 °C i ca. 20 fil. 5 ul av ligeringsblandingen ble elektroporert inn i 50 ul elektrokompetente DHl2S-bakterie-celler fra Life Technologies ved anvendelse av en 2 mM kyvette og innstillingene 2 kV, 25UF og 400 ohm. De elektroporerte cellene ble tilsatt 1 ml SOC-medium (2 % "Bacto"-trypton, 0,5 % "Bacto"-gjærekstrakt, 10 ml 1 mM NaCl, 1,5 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04og 20 mM glukose (Gibco BRL)}, dyrket ved 37 °C i ca. 1 time og utsådd på LB-skåler inneholdende 100 ug/ml ampicillin. DNA fra kloner ble isolert og analysert ved restriksjonskutting for identifisering av positive kloner. Cirka 5 ng DNA fra en positiv klon ble transformert inn i 20 ul DHl0-"Bac Max Effi-ciency" (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) ifølge produsentens instruksjoner, ved varmesjokk i 45 sekunder i et 42 °C vannbad. De transformerte cellene ble så fortynnet og dyrket som beskrevet i eksempel 3OA. Bakmider som inneholdt muse-zalphall-ligandinnskuddet ble identifisert og isolert som beskrevet i eksempel 3OA. Kloner ble analysert for korrekt innskudd ved amplifisering av DNA med primere komplementære til det transposable element i bakmidet, ved PCR med primerne ZC 447 (SEQ ID NO: 76) og ZC 976 (SEQ ID NO: 77). PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 35 sykluser ved 94 °C i 45 sekunder, 50 °C i 45 sekunder og 72 °C i 5 minutter; 1 syklus ved 72 °C i 10 minutter; etterfulgt av lagring ved 4 °C. PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel for kontroll av størrelsen på innskuddet. Bakmider med korrekt innskudd ble anvendt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda(Sf9)-celler.

F. Ekspresjon og dannelse av materiale for rensing av muse- zalphall fra baculovirus

Sf9-celler ble utsådd med 1 million celler pr. 35 mm skål og fikk feste seg i 1 time ved 27 °C. Muse-zalphall-ligandbakmid-DNA ble transfektert som beskrevet i eksempel 3OB, og viruset ble høstet.

For primær amplifisering ble Sf9-celler utsådd som ovenfor, og 500 ul supernatant høstet 72 timer etter transfeksjonen ble tilsatt, og kulturene ble dyrket videre i 96 timer, hvoretter viruset ble høstet ifølge standardfremgangsmåter.

For den sekundære amplifisering ble Sf9-celler utsådd som ovenfor, og 200 ul av den primære virussuspensjon ble tilsatt. Kulturene ble inkubert ved 27 °C i 72 timer, hvoretter viruset ble høstet ifølge standardfremgangsmåter.

For den tertiære amplifisering ble 10 ul virussuspensjon fra den sekundære amplifisering plassert på Sf9-celler med 500 000 celler pr. brønn i 50 ml SF900lI-medium i en 250 ml ristekolbe i 6 dager, og virus ble høstet som ovenfor. Viruset ble titrert og oppdyrket i stor skala for rensing av baculovirusfremstilt muse-zalphall-ligand (mu-zalphallL-Bv), som beskrevet i eksempel 3 0C og eksempel 3OD.

Nærvær av protein med den forventede molekylvekt i supernatanten ble vist ved Western-analyse med et polyklonalt anti-mu-zalphallL/MBP-6H-antistoff (eksempel 27). BaF3-basert proliferasjonsanalyse (eksempel 5) viste også at den utskilte ligand var aktiv.

Eksempel 31

Ekspresjon av zalphall- ligand fra menneske og mus i E . coli

A. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren pTAP98/ zalphall-ligand for human zalphall- ligand- MBP- fusjon

Et ekspresjonsplasmid som inneholdt et polynukleotid som kodet for en del av den humane zalphall-ligand fusjonert N-terminalt til maltosebindende protein (MBP), ble konstruert ved homolog rekombinasjon. Et fragment av humant zalphall-ligand-cDNA ble isolert ved PCR. To primere ble anvendt ved fremstilling av det humane zalphall-ligandfragmentet i en PCR-reaksjon: (1) primer ZC 22 128 (SEQ ID NO: 78), inneholdende 40 bp av den flankerende vektorsekvens og 26 bp tilsvarende aminoenden av den humane zalphall-ligand, og (2) primer ZC 22 127 (SEQ ID NO: 79), inneholdende 40 bp av 3'-enden tilsvarende den flankerende vektorsekvens og 2 8 bp tilsvarende karboksylenden av human zalphall-ligand. PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 25 sykluser ved 94 °C i 30 sekunder, 50 °C i 30 sekunder og 72 °C 1 1 minutt; etterfulgt av lagring ved 4 °C, og kjørt i duplikat. 2 ul av PCR-reaksjonen på 100 ul ble fraksjonert i en 1,0 % agarosegel med 1 x TBE-buffer for analyse, noe som viste det forventede bånd på ca. 472 bp. De gjenværende 90 ul av PCR-reaks jonen ble kombinert med det andre PCR-røret og utfelt med 400 ul absolutt etanol for anvendelse for rekombinasjon i den Smal-kuttede mottakervektoren pTAP98 for fremstilling av konstruksjonen som koder for MBP-zalphall-ligandfusjonen, som beskrevet nedenfor.

Plasmid pTAP98 ble avledet fra plasmidene pRS316 og pMAL-c2. Plasmidet pRS316 er en Saccharomyces cerevisiae- skyttelvektor (Hieter P. og Sikorski, R., Genetics, 122:19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) er et E. coli-ekspresjonsplasmid. Det inneholder tac-promoteren som styrer MalE (genet som koder for MBP), etterfulgt av en His-merkelapp, et trombinkløyvingssete, et kloningssete og rrnB-terminatoren. Vektoren pTAP98 ble konstruert ved anvendelse av homolog rekombinasjon i gjær.

100 ng EcoRI-kuttet pMAL-c2 ble rekombinert med 1 ug Pvul-kuttet pRS316, 1 ug linker og 1 ug Scal/EcoRI-kuttet pRS316. Linkeren bestod av oligoene ZC 19 372 (SEQ ID NO: 80) (100 pmol),

ZC 19 351 (SEQ ID NO: 81) (1 pmol), ZC 19 352 (SEQ ID NO: 82)

(1 pmol) og ZC 19 371 (SEQ ID NO: 83) (100 pmol) sammenblandet i en PCR-reaksjon. Betingelsene var som følger: 10 sykluser ved 94 °C i 30 sekunder, 50 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder; etterfulgt av lagring ved 4 °C. PCR-produktene ble konsentrert ved utfelling med 100 % etanol.

100 ul kompetente gjærceller (S. cerevisiae) ble blandet med 10 ml av en blanding som inneholdt ca. 1 ug av det humane zalphall-ligand-PCR-produktet og 100 ng Smal-kuttet pTAP98-vektor, og overført til en 0,2 cm elektroporeringskyvette. Blandingen av gjær og DNA ble elektropulset ved 0,75 kV (5 kV/cm), uendelig ohm, 25UF. Til hver kyvette ble det tilsatt 600 ul 1,2 M sorbitol. Gjærcellene ble så utsådd i to porsjoner på 3 00 ul på to URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C.

Etter ca. 48 timer ble Ura<+->gjærtransformantene fra en enkeltskål resuspendert i 1 ml H20 og kortvarig sentrifugert for nedsentrifugering av gjærcellene. De nedsentrifugerte cellene ble resuspendert i 1 ml lyseringsbuffer (2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 Ul av lyseringsblandingen ble overført til et Eppendorf-rør inneholdende 3 00 ul syrevaskede glasskuler og 200 ul fenol-kloroform, vorteksbehandlet i 1 minutts intervaller to eller tre ganger, etterfulgt av 5 minutters sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge ved maksimal hastighet. 300 ul av vannfasen ble overført til et nytt rør, og DNA-et ble utfelt med 600 ul etanol (EtOH), etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble resuspendert i 100 ml H20.

Transformasjon av elektrokompetente E. coli-celler (MC1061, Casadaban et al., J. Mol. Biol., 138, 179-207) ble gjort med 1 ml gjær-DNA-preparat og 40 ul MC1061-celler. Cellene ble elektropulset ved 2,0 kV, 25UF og 400 ohm. Etter elektroporeringen ble 0,6 ml SOC (2 % "Bacto"-trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5 % gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04, 20 mM glukose) tilsatt, og cellene ble utsådd i én porsjon på LB-AMP-skåler (LB-medium (Lennox), 1,8 % "Bacto"-agar (Difco), 100 mg/ml ampicillin).

Enkeltkloner som inneholdt den korrekte ekspresjons-konstruksjon for human-zalphall-ligand, ble bekreftet ved ekspresjon. Cellene ble dyrket i Superbroth II (Becton Dickinson med 100 ug/ml ampicillin over natten. 50 ul av over natt-kulturen ble anvendt for inokulering av 2 ml friskt Superbroth II +

100 ug/ml ampicillin. Kulturene ble dyrket ved 37 °C under omristing i 2 timer. 1 ml av kulturen ble indusert med 1 mM IPTG. 2-4 timer senere ble 250 ul fra hver kultur blandet med 250 (il syrevaskede glasskuler og 250 ul Thorner-buffer med 5 % pME og fargestoff (8 M urea, 100 mM Tris, pH 7,0, 10 % glyserol, 2 mM EDTA, 5 % SDS). Prøver ble vorteksbehandlet i 1 minutt og varmet opp til 65 °C i 10 minutter. 20 ul pr. spor ble satt på en 4 %-12 % PAGE-gel (NOVEX). Gelene ble kjørt i 1 x MES-buffer. De positive klonene ble betegnet pTAPl26 og sekvensert. Polynukleotidsekvensen til MBP-human-zalphall-ligandfusjon i pTAPl2 6 er vist i SEQ ID NO: 84, og det tilsvarende polypeptid i SEQ ID

NO: 85.

B. Bakterieekspresjon av human hu- zalphall- ligand

1 ul av det sekvenserte DNA ble anvendt for transformasjon av stamme W3110 (ATCC). Cellene ble elektropulset ved 2,0 kV, 25 UF og 400 ohm. Etter elektroporeringen ble 0,6 ml SOC (2 % "Bacto"-trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5 % gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04, 20 mM glukose) tilsatt, og cellene ble utsådd i én porsjon på LB-AMP-skåler (LB-medium (Lennox), 1,8 % "Bacto"-agar

(Difco), 100 mg/l ampicillin).

Protein ble uttrykt fra enkeltkolonier. Cellene ble dyrket i Superbroth II (Becton Dickinson med 100 ug/ml ampicillin over natten. 50 ul av over natt-kulturen ble anvendt for inokulering av 2 ml friskt Superbroth II + 100 ug/ml ampicillin. Kulturene ble dyrket ved 37 °C under omristing i 2 timer. 1 ml av kulturen ble indusert med 1 mM IPTG. 2-4 timer senere ble 250 ul fra hver kultur blandet med 250 ul syrevaskede glasskuler og 250 ul Thorner-buffer med 5 % pME og fargestoff (8 M urea, 100 mM Tris, pH 7,0, 10 % glyserol, 2 mM EDTA, 5 % SDS). Prøver ble vorteksbehandlet i 1 minutt og varmet opp til 65 °C i 10 minutter. 20 ul pr. spor ble satt på en 4 %-12 % PAGE-gel (NOVEX). Gelene ble kjørt i 1 x MES-buffer. De positive klonene ble dyrket opp for rensing av hu-zalphallL/MBP-6H-fusjonsproteinet (eksempel 32 nedenfor). C. Konstruksjon av muse- zalphall- ligand- MBP- fusjons-ekspres jonsvektoren pTAP98/ muse- zalphall- ligand

Et ekspresjonsplasmid som inneholdt et polynukleotid som kodet for en del av muse-zalphall-liganden fusjonert N-terminalt til maltosebindende protein (MBP), ble konstruert ved homolog rekombinasjon, som beskrevet i eksempel 31A. Et fragment av muse-zalphall-ligand-cDNA (SEQ ID NO: 55) ble isolert ved anvendelse av PCR. To primere ble anvendt ved fremstilling av muse-zalphall-ligandfragmentet i en PCR-reaksjon: (1) primer ZC 22 849 (SEQ ID NO: 86), inneholdende 40 bp av den flankerende vektorsekvens og 24 bp tilsvarende aminoenden av muse-zalphall-liganden, og (2) primer ZC 22 850 (SEQ ID NO: 87), inneholdende 40 bp av 3'-enden tilsvarende den flankerende vektorsekvens og

21 bp tilsvarende karboksylenden av muse-zalphall-ligand. PCR-reaks jonsbetingelsene var som ovenfor. Fragmentet på ca. 450 bp ble klonet i pTAP98, som beskrevet ovenfor. Kloner ble transformert, identifisert og dyrket som beskrevet ovenfor. De positive klonene ble betegnet pTAPl34 og sekvensert. Polynukleotidsekvensen til MBP-muse-zalphall-ligandfusjonen i pTAPl34 er vist i SEQ ID NO: 88, og den tilsvarende polypeptidsekvens er vist i SEQ ID NO: 89. De positive klonene ble anvendt for dyrkning i

E. coli, som beskrevet ovenfor, for rensing av mu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32).

Eksempel 32

Rensing av zalphall- MBP- ligand eller zalphall- MBP- reseptor

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av zalphall-MBP-ligandfusjoner for human zalphall-MBP-ligand (hu-zalphallL/MBP-6H) eller muse-zalphall-MBP-ligand (mu-zalpha- 11L/MBP-6H) fra E. coli. Fusjon mellom zalphall-reseptor fra menneske eller mus og MBP ble utført ved anvendelse av samme fremgangsmåte. Nedsentrifugert, nedfrosset E. coli-masse ble tint og fortynnet med 2 1 buffer B (0,02 M Tris (EM Science); 0,2 M NaCl (Mallinckrodt); 0,01 M 2-merkaptoetanol (EM Science); pH 8,0; med 5 mg/l pepstatin A (Boehringer Mannheim); 5 mg/l aprotinin (Boehringer Mannheim); og 1 mg/l PMSF (Fluka)) pluss 1-2 ml av et antiskumreagens AF289 (Sigma). Blandingen ble behandlet i en avkjølt French-presse ved et trykk på 138 000-207 000 kPa.

Lysatet ble så sentrifugert ved 18 000 x g i 45 minutter ved 4 °C, og supernatanten ble bevart. En 200 ml suspensjon av amyloseresin (New England Biolabs), preekvilibrert i buffer A (0,02 M Tris (EM Science); 0,2 M NaCl (Mallinckrodt); 0,01 M 2-merkaptoetanol (EM Science); pH 8,0) ble tilsatt til lysatsuper-natanten og inkubert over natten i 2 1 rulleflasker for maksimal absorpsjon av MBP-fusjonsproteinet. Resinet ble vasket i kolonneformat med > 5 kolonnevolumer buffer A og så eluert med buffer C (buffer A med 0,02 M maltose (Sigma)). Urene fraksjoner ble oppsamlet, og absorbansen ved 280 nm ble målt.

Det eluerte protein ble analysert ved SDS-nuPAGE (NOVEX) og farging med Coomassie (Sigma). Prøve og protein ble lagret ved -80 °C.

Eksempel 33

Polyklonale antistoffer mot human zalphall- ligand

Polyklonale antistoffer mot human zalphall-ligand ble fremstilt ved immunisering av to hvite New Zealand-kaniner av hunnkjønn med det rensede rekombinante protein hu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32) eller det rensede, CHO-fremstilte rekombinante protein hu-zalphallL/CHO (eksempel 29). Kaninene ble gitt en innledende intraperitoneal (ip) injeksjon med 200 mg renset protein i komplett Freunds adjuvans, etterfulgt av forsterkningsinjeksjoner intraperitonealt av 100 mg renset protein i ukomplett Freunds adjuvans hver 3. uke. 7-10 dager etter til-førsel av den andre forsterkningsinjeksjonen (i alt tre injeksjoner) ble blod tappet og serum oppsamlet. Dyrene ble så gitt forsterkningsinjeksjoner og tappet for blod hver 3. uke.

Kaninserumet dannet mot hu-zalphallL/MBP-6H ble pre-adsorbert til anti-MBP-antistoffer ved anvendelse av en CNBr-SEPHAROSE- 4B-proteinkolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg renset rekombinant MBP pr. gram CNBr-SEPHAROSE (Pharmacia). Rekombinant MBP ble fremstilt og renset på en amylosekolonne i laboratoriet ved anvendelse av fremgangsmåter som er vel kjent innen faget. De hu-zalphall-ligandspesifikke polyklonale antistoffene ble affinitetsrenset fra kaninserumet ved anvendelse av en CNBr-SEPHAR0SE-4B-protein-kolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg av det spesifikke antigen, renset rekombinant hu-zalphallL/MBP-6H-protein eller 10 mg av det rensede, CHO-fremstilte rekombinante protein hu-zalphallL-CHO pr. gram CNBr-SEPHAROSE, etterfulgt av 20 x dialyse mot PBS over natten. Hu-zalphall-ligandspesifikke antistoffer blekarakterisert vedELISA med 1 ug/ml av de rensede rekombinante proteinene hu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32), human zalphall-ligand (hu-zalphallL-CHO) (eksempel 29) eller mu-zalphallL-MBP/6H (eksempel 32) som mål for antistoffet.

Den nedre deteksjonsgrense (LLD) for affinitetsrenset anti-hu-zalphallL/MBP-6H-antistoff fra kanin var 100 ng/ml for det spesifikke, rensede rekombinante antigen hu-zalphallL/MBP-6H, 500 pg/ml for renset, rekombinant hu-zalphallL-CHO og 100 pg/ml for renset, rekombinant hu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32). LLD for det affinitetsrensede anti-hu-zalphallL-CHO-antistoff fra kanin var 20 pg/ml for det spesifikke, rensede rekombinante antigen hu-zalphallL-CHO, 500 pg/ml for renset, rekombinant hu-zalphallL/MBP-6H og 50 ng/ml for renset, rekombinant mu-zalphallL/MBP-6H.

Eksempel 34

Antistoffer mot peptider fra human zalphall- ligand

Polyklonale antistoffer mot peptid fra human zalphall-ligand ble fremstilt ved immunisering av to hvite New Zealand-kaniner av hunnkjønn med humant zalphall-ligandpeptid, hu-zalphallL-1 (SEQ ID NO: 72) eller hu-zalphallL-3 (SEQ ID

NO: 73). Peptidene ble syntetisert ved anvendelse av et peptid-synteseinstrument fraApplied Biosystems, modell 43IA, ifølge produsentens instruksjoner. Peptidene ble så konjugert til bærerproteinet "keyhold limpet"-hemocyanin (KLH) ved maleimid-aktivering. Hver kanin ble gitt en innledende intraperitoneal (ip) injeksjon med 200 mg peptid i komplett Freunds adjuvans, etterfulgt av forsterkningsinjeksjoner intraperitonealt av 100 mg peptid i ukomplett Freunds adjuvans hver 3. uke. 7-10 dager etter tilførsel av den andre forsterkningsinjeksjonen (i alt tre injeksjoner) ble blod tappet og serum oppsamlet. Dyrene ble så gitt forsterkningsinjeksjoner og tappet for blod hver 3. uke.

Kaninserumet dannet mot det humane zalphall-ligand-peptider blekarakterisert veden ELISA-titerkontroll med 1 |ig/ml av peptidet som ble anvendt for fremstilling av antistoffet (SEQ ID NO: 72 eller SEQ ID NO: 73) som antistoffmål. De to kaninsera mot hu-zalphallL-l-peptid hadde en titer for det spesifikke peptid i en fortynning på 1:5 000 000 (1:5E6). De to kaninsera mot hu-zalphallL-3-peptid hadde en titer for det spesifikke peptid i en fortynning på 1:5E6.

Polyklonale antistoffer spesifikke for humant zalphall-ligandpeptid ble affinitetsrenset fra kaninserumet ved anvendelse av CNBr-SEPHAROSE-4B-proteinkolonner (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg av det spesifikke peptid (SEQ ID NO: 72 eller SEQ ID NO: 73) pr. gram CNBr-SEPHAROSE, etterfulgt av 20 x dialyse mot PBS over natten. Hu-zalphall-ligandspesifikke antistoffer blekarakterisert veden ELISA-titeranalyse med 1 ug/ml av det rensede pepetidantigen eller rensede rekombinante fullengdeproteiner som mål for antistoffet.

Den nedre deteksjonsgrense (LLD) for affinitetsrenset anti-hu-zalphallL-l-antistoff fra kanin var 500 pg/ml for det spesifikke, peptidantigen (hu-zalphallL-1, SEQ ID NO: 72);

500 pg/ml for renset, rekombinant hu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32) og 500 pg/ml for renset, CHO-rekombinant hu-zalphallL-CHO (eksempel 29). Ingen kryssreaktivitet ble observert med renset rekombinant mu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32). LLD for det affinitetsrensede anti-hu-zalphallL-3-antistoff fra kanin var 50 pg/ml for det spesifikke peptidantigen (hu-zalphallL-1, SEQ ID NO: 73); 50 pg/ml for renset, rekombinant hu-zalphallL/MBP-6H; 500 pg/ml for renset, CHO-rekombinant hu-zalphallL-CHO (eksempel 29) og 100 pg/ml for renset, baculovirus-rekombinant hu-zalphallL-Bv (eksempel 30). Kryssreaktivitet ble observert

med renset rekombinant mu-zalphallL/MBP-6H (eksempel 32) med en LLD på 5 ng/ml.

Eksempel 35

Monoklonale antistoffer mot human zalphall- reseptor

Monoklonale antistoffer mot zalphall-reseptor ble fremstilt ved immunisering av 5 Balb/c-hannmus (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) med det rensede rekombinante, løselige reseptorprotein zalphall-CEE (hu-zalphall-CEE-BHK) (eksempel 10A). Hver mus ble gitt en innledende intraperitoneal (ip) injeksjon med 20 mg renset protein i komplett Freunds adjuvans (Pierce, Rockford, IL), etterfulgt av forsterkningsinjeksjoner intraperitonealt av 10 mg i ukomplett Freunds adjuvans annenhver uke. 7-10 dager etter tilførsel av den tredje forsterkningsinjeksjonen ble blod tappet og serum oppsamlet.

Museserumprøvene dannet mot hu-zalphall-CEE-BHK blekarakterisert veden ELISA-titerkontroll med renset rekombinant CHO-hu-zalphall-Fc-protein (eksempel 10C) som antistoffmål. Én museserumprøve hadde en titer for det spesifikke antistoffmål i en fortynning på 1:1 000 000 (1:1E6). Fire museserumprøver hadde en titer for det spesifikke antistoffmål i en fortynning på 1:100 000 (1:1E5).

Splenocytter ble høstet fra de fire musene med den høyeste titer og fusjonert til SP2/0-musemyelomceller ved anvendelse av PEG 1500 (Boehringer Mannheim, UK) i to separate fusjonseksperimenter som benyttet et forhold mellom splenocytter og myelomceller på 4:1 under fusjonen (Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow og D. Lane, Cold Spring Harbor Press). Etter 10 dagers vekst etter fusjonen ble hybridomer som produserte spesifikt antistoff, identifisert ved ELISA med renset rekombinant BHK-fremstilt zalphall-Fc4-protein (eksempel 10C) som antistoffmål, og ved FACS med BaF3-celler som uttrykte hu-zalphall-sekvensen (eksempel 4 og eksempel 2) som antistoffmål. De resulterende fire hybridomer som var positive ved begge fremgangsmåter, ble klonet tre ganger ved grensefortynning. Antistoffene ble betegnet 249.28.2.1.2.2; 247.10.2.15.4.6; 249.19.2.2.3.5; og 249.15.2.4.2.7.

Eksempel 3 6

Transgene mus for zalphall- ligand

A. Frembringelse av transgene mus som uttrykker zalphall-ligand fra menneske og mus

DNA-fragmenter fra transgene vektorer (eksempel 22 og eksempel 26) som inneholdt 5'- og 3<1->flankerende sekvenser for den angjeldende promoter (den leverspesifikke MT-1-promoteren)

(muse-zalphall-ligand, eksempel 26B) eller den lymfoidspesifikke LCK-promoteren (muse- og human-zalphall-ligand, eksemplene 26A og 22B), intron II fra rotteinsulingenet, zalphall-ligand-cDNA og poly-A-sekvensen fra humant veksthormon, ble fremstilt og anvendt for mikroinjeksjon i befruktede B6C3f1-museoocytter (Taconic, Germantown, NY) ved anvendelse av en standardmikro-injeksjonsfremgangsmåte. Se Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1994.

Åtte transgene mus som uttrykte human zalphall-ligand fra den lymfoidspesifikke EULCK-promoter, ble påvist blant 44 museunger. Fire av disse var unger som døde, og fire overlevde til voksen alder. Ekspresjonsnivået var temmelig lavt i disse dyrene. 2 0 transgene dyr som uttrykte muse-zalphall-ligand fra den lymfoidspesifikke EULCK-promoter, ble påvist blant 77 museunger. Alle 2 0 mus overlevde til voksen alder. Ekspresjonsnivået var temmelig lavt i disse dyrene. Tre transgene mus som uttrykte muse-zalphall-ligand fra den leverspesifikke MT-1-promoteren, ble påvist blant 60 museunger. To av disse ungene døde, og én overlevde til voksen alder. Ekspresjonsnivået var temmelig lavt i disse dyrene. Vev ble fremstilt og undersøkt histologisk som beskrevet nedenfor.

B. Mikroskopisk analyse av vev fra transgene mus

Milt, brissel og mesenteriske lymfeknuter ble oppsamlet og forberedt for histologisk undersøkelse fra transgene dyr som uttrykte zalphall-ligand fra menneske og mus (eksempel 36A). Andre vev som rutinemessig ble oppsamlet, omfattet: lever, hjerte, lunge, nyre, hud, brystkjertel, bukspyttkjertel, mage, tynntarm, tykktarm, hjerne, spyttkjertel, luftrør, spiserør, binyre, hypofyse, forplantningssystemet, hannlige tilleggs- kjønnskjertler, skjelettmuskel, inklusive perifere nerver, og femur med benmarg. Vevene ble høstet fra en nyfødt museunge som døde uventet og flere voksne transgene mus, som beskrevet nedenfor. Prøvene ble fiksert med 10 % bufret formalin, viderebehand-let på rutinemessig måte, innstøpt i parafin, kuttet i snitt på 5 |im og farget med hematoksylin og eosin. Objektglassene ble undersøkt og evaluert når det gjaldt omfanget av vevsendringer (0 = ingen, 1 = milde, 2 = moderate, 3 = alvorlige) av en god-kjent veterinærmedisinsk patolog som ikke var informert om behandlingen.

Museungen og to voksne hunnmus som uttrykte human zalphall-ligand og tre av de seks voksne hannmusene som uttrykte muse-zalphall-ligand, viste inflammatoriske infiltrater i mange av de undersøkte vev. Organene som var påvirket, varierte noe fra mus til mus. Det inflammatoriske infiltrat bestod i det vesentlige av nøytrofile celler og makrofager i varierende antall og forhold, og hadde generelt et mildt til moderat omfang. Videre viste disse dyrene endringer i de lymfoide organer, innbefattet moderat til alvorlig lymfopeni i milt og brissel (transgene dyr for zalphall-ligand fra menneske og mus), og alvorlig lymfopeni (transgene dyr for human zalphall-ligand), eller mild til alvorlig suppurativ til pyogranulomatøs lymf-adenitt (transgene for muse-zalphall-ligand) i lymfeknutene. I tillegg var forhøyet ekstramedullær hematopoese påtakelig i milt. Disse endringene ble ikke observert i alderstilpassede kontrollmus. C. Flowcytometrisk analyse av vev fra transgene mus som overuttrykker zalphall- ligand

Transgene dyr som overuttrykte zalphall-ligand fra mus eller menneske (eksempel 3 6A), ble avlivet for flowcytometrisk analyse av perifert blod, brissel, lymfeknute, benmarg og milt.

Cellesuspensjoner ble fremstilt fra milt, brissel og lymfeknuter ved å trekke organet i biter med pinsetter i iskaldt dyrkningsmedium (500 ml RPMI 1640-medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS); 5 ml 100 x L-glutamin (Gibco BRL, Grand Island, NY); 5 ml 100 x Na-pyruvat (Gibco BRL); 5 ml 100 x penicillin, streptomycin, neomycin (PSN) (Gibco BRL), og så forsiktig presse cellene gjennom en cellesil (Falcon, VWR Seattle, WA). Perifert blod (200 ml) ble oppsamlet i heparinbehandlede rør og fortynnet til 10 ml med HBSS tilsatt 10 U heparin/ml. Erytrocytter ble fjernet fra miltpreparater og preparater fra perifert blod ved hypoton lysering. Cellesuspensjoner fra benmarg ble fremstilt ved å vaske margen ut fra femur med iskaldt dyrkningsmedium. Cellene ble talt og analysert for levedyktighet ved anvendelse av trypanblått (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Cellene ble resuspendert i iskaldt innfargingsmedium (HBSS, 1 % føtalt, bovint serum, 0,1 % natriumazid) ved en konsentrasjon på 10 millioner celler pr. ml. Blokkering av Fc-reseptoren og uspesifikk binding av antistoffer til cellene ble oppnådd ved å tilsette 10 % normalt geiteserum og Fc-blokker (PharMingen, La Jolla, CA) til cellesuspensj onen.

Cellesuspensjoner ble blandet med like volumer fluoro-krommerkede, monoklonale antistoffer (PharMingen), inkubert på is i 60 minutter og så vasket to ganger med iskald vaskebuffer (PBS, 1 % føtalt, bovint serum, 0,1 % natriumazid) før cellene ble resuspendert i 400 ml vaskebuffer inneholdende 1 mg/ml 7-AAD (Molecular Probes, Eugene, OR) som viabilitetsmarkør i noen prøver. Flowanalyseverdier ble oppsamlet i et FACSCalibur flowcytometer (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Både oppsamling og analyse ble utført ved anvendelse av programvaren CellQuest (BD Immunocytometry Systems).

De transgene dyrene som uttrykte zalphall-ligand, enten fra mus eller menneske, i det høyeste nivå, hadde dramatisk endrede cellepopulasjoner i alle analyserte lymfoide organer. De observerte endringene omfattet fullstendig tap av celler i brisselen, totalt fravær av CD45R-positive B-celler og økt størrelse av og antall celler i milten. Både milt og benmarg hadde forhøyet antall celler av myeloid størrelse, noe som skyldtes økt antall av både monocytter og nøytrofile celler. Pan-NK-cellemarkøren (DX5) var forhøyet i mange populasjoner. Transgene dyr med moderat ekspresjon hadde mindre dramatiske men fortsatt signifikante endringer som var i samsvar med fenotypen observert for dyrene med høy ekspresjon. Musene med det laveste ekspresjonsnivå hadde verken signifikant økning av antall myeloide celler eller redusert antall B-celler. De viste signifikante endringer i tymocyttpopulasjonene, med redusert antall CD4<+>CD8<+->dobbeltpositive celler og økt antall celler som enten var CD4-positive eller CD8-positive.

Eksempel 37

Renset rekombinant, humant zalphall- ligandprotein Doseresponsundersøkelser i normale mus

A. Oppsummering

Normale 6 uker gamle C57Bl/6-hunnmus (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) ble behandlet med intraperitoneal injeksjon én gang daglig i enten 4 eller 8 dager med ett av fire forskjellige dosenivåer av renset rekombinant, human zalphall-ligand (eksempel 24) i mengder på 0,1, 0,5, 5 eller 50 ug/mus/dag, eller med løsemiddel som kontroll. Kroppsvekt og kroppstemperatur ble målt daglig. På enten dag 4 eller dag 9 ble fire av de åtte musene i hver proteinbehandlingsgruppe og fem av de ti musene i løsemiddelkontrollgruppen avlivet. Blod, benmarg og vev ble tatt ut og analysert. Mulige forstyrrelser i lymfoide vev ble undersøkt, likeså generelle fysiologiske og toksiko-logiske parametere.

Det var ingen tegn på toksisitet av humant zalphall-ligandprotein i de analyserte doser. Kroppsvekt og temperatur var uendret. Det var ingen åpenbare endringer i klinisk-kjemiske parametere. Det forelå imidlertid konsistente funn når det gjaldt forhøyet antall celler fra den myeloide linje i benmarg, milt og perifert blod hos mus behandlet med den høyeste dose av zalphall-ligand, sammenlignet med løsemiddelkontrollen. Det var en statistisk signifikant økning av celler med myeloidlinje-størrelse, identifisert ved flowcytometrisk analyse av milthomo-genat i høydosegruppen. Milten fra de to høyeste doserings-gruppene var statistisk signifikant større enn i de andre gruppene. Ved histopatologisk undersøkelse kunne imidlertid bare en marginal økning av den ekstramedullære hematopoese observeres i gruppen som ble gitt den høyeste dosen. Det var en statistisk signifikant økning av forholdet mellom myeloide celler og erytroide celler i benmargen i gruppen som ble gitt den høyeste dosen, sammenlignet med de andre gruppene. Endelig ble det observert økninger i perifert blod, både når det gjaldt det totale antall hvite blodceller og prosentandelen av monocytter i denne gruppen.

B. Fremstilling av doseløsning

Renset rekombinant, human zalphall-ligand (eksempel 24) ble fortynnet med sterilt, fosfatbufret saltvann (Gibco BRL, Grand Island, NY) i konsentrasjoner som gav 50, 5, 0,5 eller 0,1 ug protein i 0,1 ml PBS-bærerstoff. Dosene for de fire første dagene ble fremstilt på dag 0 og nedfrosset i en rim-dekket -20 °C fryser før anvendelsen. Dosene for dagene 5-8 ble fremstilt på dag 5 og nedfrosset som ovenfor. Uttak av samme PBS-løsning ble nedfrosset samtidig for den løsemiddelbehandlede kontrollgruppen. På tilførselsdagen ble de egnede uttak opptint, og 0,1 ml løsning ble injisert intraperitonealt i musen hver dag i enten 4 eller 8 dager.

C . Utforming av undersøkelsen

Musene var 6 uker gamle da undersøkelsen startet. Hver behandlingsgruppe bestod av åtte mus, bortsett fra løsemiddel-kontrollgruppen, som omfattet ti mus. Halvparten av musene i hver behandlingsgruppe ble avlivet etter 4 dagers behandling, og den andre halvpart ble avlivet etter 8 dager.

Før behandlingen hver dag ble hver mus veid og kropps-temperaturen målt ved anvendelse av Portable Programmable Note-book System (BMDS, Inc., Maywood, NJ) ved å skanne musen for identifiseringsnummer og kroppstemperatur fra transpondere som var implantert subkutant (IPTT-100, BMDS, Maywood, NJ).

Ved avlivningen omfattet vev som ble høstet for å anslå populasjoner av hvite blodceller ved flowcytometrisk analyse, benmarg, brissel og milt. FACS-analyse av de lymfoide organer og benmarg ble utført med instrumentet FACSCalibur (Becton Dickinson, Mansfield, MA). Vevene som ble uttatt for histologisk undersøkelse for tegn på toksisitet av proteinet, omfattet milt, brissel, lever, nyre, binyre, hjerte og lunger. Alle vev som ble fiksert for histologisk undersøkelse, ble inkubert over natten ved 4 °C i 10 % normalt bufret saltvann (NBF) (Surgipath, Richmond, IL). Neste dag ble NBF erstattet med 70 % etanol, og vevene ble oppbevart ved 4 °C til de skulle prosessere for histologisk undersøkelse.

Vevene ble prosessert og farget for hematoksylin og eosin i laboratoriet, og så sendt til en kontraktansatt patolog for histopatologisk analyse. Blod ble oppsamlet for måling av komplett antall blodceller (CBC), og den kjemiske profil av serum. CBC ble analysert i laboratoriet med analysatoren Cell Dyn 3500 Hematology Analyzer (Abbott Diagnostics Division, Abbott Park, IL), og manuelle differensielle tellinger av hvite blodceller ble analysert ved Phoenix Central Laboratory (Everett, WA). Serum ble holdt nedfrosset ved -20 °C inntil det ble sendt til Phoenix Central Laboratory for fullstendig kjemisk analyse av serum. For måling av forholdet mellom myeloide celler og erytroide celler ble benmargen fra én femur overført til CytoSpin-objektglass (CYTOSPIN 3 CYTOCENTRIFUGE og CYTO SLIDES, Shandon, Pittsburgh, PA) og sendt til Phoenix Central Laboratories for analyse.

D.Resultater fra undersøkelsene

Det forelå ingen åpenbare kliniske tegn på fysiologiske virkninger eller toksisitet av human zalphall-ligand i doser på 50 ug/dag eller lavere. Kroppsvekt og -temperatur forble normal gjennom hele behandlingen. Kjemiske parametere i serum lå i normalområdet. Antall røde blodceller og blodplater var normalt. I musene som ble gitt 50 ug/dag i 8 dager, viste manuelle differensielle tellinger av hvite blodceller at prosent monocytter var forhøyet i perifert blod, og en tilsynelatende økning av det totale antall hvite blodceller. I benmarg utvasket fra femur var forholdet mellom myeloide og erytroide celler forhøyet i 50 ug-dosegruppen, og i mindre grad i 5 ug-dosegruppen, fra gruppene som ble dosert i 8 dager. I en ikke-parametrisk flerkolonne-sammenligning ved anvendelse av programvaren InStat (InStat MAC; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) var denne forskjellen statistisk signifikant (p = 0,0049). Forskjellen mellom gruppen som ble gitt den høyeste dosen og gruppen som ble gitt bærerstoff var også signifikant (p = 0,0286). Det forhøyede antall hvite blodceller i perifert blod og den signifikante økning av myeloide forløperceller i benmarg kan således være forbundet med hverandre.

Histologisk evaluering av følgende vev viste ingen åpenbare tegn på cytologiske eller strukturelle endringer, mitotiske begivenheter eller nekrose: brissel, lever, nyre, binyre, tolvfingertarm, bukspyttkjertel, jejunum, coecum, colon, mesenteriske lymfeknuter, uterus, ovarier, spyttkjertel, hjerte, luftrør, lunge og hjerne. Det var ingen åpenbare forskjeller mellom behandlingsgruppene når det gjaldt vekt av brissel,

nyre, lever eller hjerne. Av alle de undersøkte vev var bare vekten av milt signifikant påvirket.

Vekten av hver musemilt ble normalisert relativt til hjernevekten. I 50 ug/dag-behandlingsgruppen sammenlignet med gruppen gitt løsemiddel og gruppene behandlet med 0,1 og 0,5 ug/dag var den gjennomsnittlige miltvekt nesten 50 % høyere etter 4 dagers behandling og nesten 100 % høyere etter 8 dagers behandling enn den gjennomsnittlige miltvekt i de andre tre gruppene. I gruppene behandlet i 4 dager hadde gruppen behandlet med 5 ug/dag også en tendens til å ha større milt enn kontrollgruppen og gruppene gitt de lavere doser. Forskjellen i milt-/hjernevekten med verdier fra gruppene behandlet i 4 dager og i 8 dager, kombinert ut fra behandlingsgruppe, var statistisk signifikant (p = 0,0072) ved Kruskall-Wallace ikke-parametrisk ANOVA, multippelkolonnesammenligningsanalyse utført ved anvendelse av programvaren InStat (GraphPad Software).

En marginal økning av den ekstramedullære hematopoese, særlig i den røde masse, kunne observeres i milt fra mus fra den høyeste doseringsgruppe, selv hos musene som kun var behandlet i 4 dager. Flowcytometrisk analyse av milten viste en signifikant økning av andelen celler med myeloid størrelse for den høyeste doseringsgruppen (p = 0,01, Student's t-test), som representerer økt antall av både monocytter og nøytrofile celler. Denne virkningen kan være forbundet med den økte prosentandel mononukleære celler i perifert blod, så vel som med den tilsynelatende økning av myeloide forløperceller i benmarg beskrevet ovenfor. Videre hadde de transgene mus som var dannet ved innsetting av det humane zalphall-gen, forhøyet ekstramedullær hematopoese i milten, sammenlignet med ikke-transgene kull-kamerater .

Flere endringer ble observert ved sammenligning av gruppen behandlet med 50 (lg pr. dag, sammenlignet med kontrollgruppen, som tyder på at zalphall-ligand deltar i dannelse eller utvikling av celler i den myeloide linje. Sett under ett tyder de observerte endringer på at zalphall kan være anvendbart som et terapeutisk protein innen medisinske områder som cancer og immunologiske forstyrrelser som beskrevet heri.

Eksempel 38

Foreløpig undersøkelse av eliminering og vevsfordelng av renset rekombinant, humant zalphall- ligandprotein

A. Oppsummering

For å utlede vevsfordelingsmønsteret og eliminerings-mønsteret for renset rh-zalphall-ligand ble en foreløpig farmakokinetisk undersøkelse utført. C57Bl/6-hannmus, 9 uker gamle, ble gitt renset rekombinant, humant zalphall-ligandprotein merket med<ni>indium, (<in>In) (NEN, Boston, MA) via én av tre tilførselsveier. En enkelt bolusinjeksjon ble gitt til hver mus, enten intravenøst (iv), intraperitonealt (ip) eller subkutant (sc). Musene som ble injisert enten subkutant eller intraperitonealt, ble avlivet enten 1 eller 3 timer etter injeksjon. Musene som ble injisert intravenøst, ble avlivet enten etter 10 minutter eller 1 time etter injeksjon. Blod, plasma og utvalgte vev ble tatt ut på forskjellige tidspunkter og analysert i en gammateller for måling av den tilnærmede halveringstid for og vevsfordelingen av det eksogene merkede protein. Vevene som ble tatt ut for måling og avlivningstidspunktet ble valgt basert på rapporter vedrørende fordelingen av andre cytokiner merket med radioaktive isotoper.

På avlivningstidspunktet omfattet vevene som ble tatt ut for måling av radioaktivitet, brissel, milt, nyre, en lever-lapp, en lungelapp og urinblæren. I gruppen som ble gitt den intraperitoneale injeksjon, ble tarmen også analysert for å oppdage forekomst av injeksjon i tarmen, og i musene som ble dosert subkutant, ble huden med underliggende strukturer i injeksjonsområdet analysert. Cpm for hel lever og lunge ble beregnet fra radioaktiviteten i det analyserte området og den prosentandel av vekten av hele organet som denne delen utgjorde.

Etter avsluttet undersøkelse av de oppsamlede vev ble helblod og plasma analysert i en COBRA II AUTO-GAMMA-gammateller (Packard Instrument Company, Meriden, CT). Et uttak av den opp-rinnelige merkede doseringsløsning ble også analysert etter avsluttet undersøkelse av vevene. Dette tillot beregning av prosentandelen av den totale injiserte radioaktivitet for hver mus og samtidig korrigering av alle målinger for radioaktiv nedbrytning.Tilnærmede verdier for gjenværende volum av blod og organvekt tydet på at hovedmengden av den tilførte mengde tellinger kunne redegjøres for, og at prosentandelen av tellinger pr. vev var et rimelig anslag for fordelingen av tellingene etter tilførsel av merket zalphall-ligand ved forskjellige tilførselsveier.

B. 111indium- merking av zalphall- ligand

Renset rekombinant, human zalphall-ligand (eksempel 29) ble konjugert med et 10 gangers molart overskudd av DTPA (Pierce, Rockford, IL) ved inkubering i 30 minutter ved romtemperatur i PBS. Ikke-reagert DTPA og hydrolysert materiale ble fjernet ved bufferutbytting i en "Biomax-5k NMWL" (Ultrafree-15, Millipore, Bedford, MA). Proteintoppen i void-volumet ble konsentrert til 5 mg/ml, og et uttak ble gjort for bioanalyse (anti-CD40-stimulering av B-celler fra mus (eksempel 44)). Etter at det var bekreftet at DTPA-konjugatet hadde full bioaktivitet, ble konjugatet fortynnet til 0,5 mg/ml med 1 M Na-acetat, pH 6,0. To mCi1:L<1>indium ble løst i 0,5 ml 1 M Na-acetat, pH 6,0, og blandet med DTPA-human-zalphall-ligand i 30 minutter ved romtemperatur. Ikke-inkorporert<1:L1>indium ble fjernet under utbytting av bufferen til PBS i en PD-10-kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ). Radioaktivt merket materiale ble fortynnet med umerket human zalphall-ligand til en spesifikk aktivitet på 100 mCi/mg, sterilfiltrert og lagret ved 4 °C over natten. 100 % av det

merkede protein ble holdt tilbake av en "Biomax-5k NMWL"-membran (Millipore). Den<lu>In-merkede humane zalphall-ligand ble tilført til mus i undersøkelsen av eliminering og farmakokinetikk. 50 ug humant zalphall-ligandprotein merket med 5 uCi merket human

zalphall-ligand i 0,1 ml PBS ble tilført til hvert dyr.

C. Resultater fra den foreløpige fordelingsanalysen

1 og 3 timer etter tilførsel ble for alle tre til-førselsveier den høyeste konsentrasjon av<ni>In-human zalphall-ligand funnet i nyre, og den nest høyeste i urin og urinblære, som vist ved at disse vevene hadde den høyeste mengde cpm.

Gjennomsnittlig antall tellinger gjenvunnet fra nyrene var 3-

8 ganger høyere enn tellingene i hel lever, avhengig av til-førselsveien og avlivningstidspunktet. For eksempel var gjennomsnittlig antall cpm i nyre 60 minutter etter intravenøs injeksjon 4,5 ganger høyere enn gjennomsnittlig antall tellinger for hel lever i samme gruppe. I gruppen som ble avlivet 10 minutter etter intravenøs tilførsel var igjen det høyeste antall cpm i nyren, og den nest høyeste akkumulering var i lever, urinblære og urin.

D. Foreløpig farmakokinetisk undersøkelse

Oppsamling av blod og plasma ble utført 10, 3 0 og

60 minutter etter injeksjonen for alle tre tilførselsveier. Etter intravenøs injeksjon ble en separat gruppe mus tappet for blod og plasmaprøver tatt etter 2, 5 og 10 minutter. En annen gruppe som ble gitt injeksjonene enten intraperitonealt eller subkutant, ble tappet for blod etter 1, 2 og 3 timer. For behandlingsgruppene, se tabell 6. De korte oppsamlingstidene omfatter den rapporterte halveringstid for IL-2 etter intravenøs injeksjon. Den rapporterte Ti/2var i området mellom 2,5 og 5,1 minutter. For en referanse vedrørende in vivo-tilførsel av IL-2, se Donahue, J.H. og Rosenberg, S.A., J. Immunol., 130:2203, 1983. De lengre tidsrommene ble valgt for å omfatte den forventede elimineringsfase.

Umerket IL-2 er blitt vist å fjernes fra serum med en halveringstid på ca. 3 minutter i mus etter intravenøs injeksjon. For referanse, se Donahue, J.H. og Rosenberg, S.A., supra. Etter injeksjon ip og sc av tilsvarende mengder IL-2 forlenges vedvarende IL-2-aktivitet i serum fra 2 enheter/ml i mindre enn 3 0 minutter etter intravenøs injeksjon til mer enn 2 enheter/ml i 2 timer etter intraperitoneal injeksjon og 6 timer etter subkutan injeksjon. Den viktigste utskillelsesvei for IL-2 ser ut til å være nyrene, zalphall-ligand er blitt vist å ligne IL-2 strukturelt, som diskutert heri. En foreløpig evaluering av utskillelse av zalphall-ligand ser ut til å være i samsvar med tilsynelatende fjerning av IL-2 via nyrene, basert på en hovedsakelig akkumulering av cpm i nyrene, fulgt av urinblære og urin, i den foreliggende undersøkelse.

Anslag ble utført vedrørende farmakokinetiske parametere, basert på ikke-kompartmentalisert analyse av cpm-resultatene erholdt fra plasma ved anvendelse av PK-analyseprogrammet WinNonLin, versjon 1.1 (Scientific Consulting, Inc., Cary, NC). Halveringstiden i plasma for zalphall-ligand ble estimert ved anvendelse av den utledede terminale elimineringshastighets-konstant for intravenøs, subkutan og intraperitoneal tilførsel av en dose på 50 ug. De farmakokinetiske resultatene var estimater, grunnet begrenset antall datapunkter i det avsluttende elimineringsområdet av plasmakonsentrasjonsprofilen mot tid. Videre krevde tilpasning av den terminale elimineringsfase for subkutan og intraperitoneal dosering anvendelse av måle-verdier fra tidspunkter ved hvilke absorpsjonen av<111>In-human-zalphall-ligand tilsynelatende fortsatt foregikk. Imidlertid var anslagene av halveringstiden etter intravenøs, subkutan og intraperitoneal dosering 13,6 minutter, 18,8 minutter henholdsvis 34,3 minutter. Siden et doseringsområde ikke ble evaluert, er det ikke åpenbart hvorvidt det var en mettbar eller en aktiv eliminering (med Michaelis Menten-kinetikk) som foregikk. Disse beregningene av halveringstiden er følgelig estimater.

Estimater vedrørende biotilgjengeligheten av det merkede protein ble utført, basert på området under kurven (AUC) etter subkutan eller intraperitoneal tilførsel, sammenlignet med arealet for intravenøs dosering. Den beregnede biotilgjengelig-het etter subkutan og intraperitoneal injeksjon var 35,8 % henholdsvis 63,9 %. Siden bare én proteindose ble undersøkt, ble biotilgjengeligheten ikke evaluert som en funksjon av dosen. Den beregnede fjerning og fordelingsvolumet (basert på resultater fra den intravenøse injeksjon) var 0,48 ml/minutt henholdsvis 6,1 ml.

Selv om resultatene er foreløpige, var skjebnen til zalphall-ligand tilført intravenøst tilsvarende den rapportert for IL-2, et annet fireheliksbunt-cytokin (Donahue, J.H. og Rosenberg, S.A., supra). I likhet med IL-2 hadde intravenøst tilført zalphall-ligand en halveringstid i plasma på få minutter, med hovedmengden fjernet via nyrene. 3 timer etter injeksjonen var hovedandelen av det merkede materialet som ble ekstrahert fra nyren fortsatt holdt tilbake av en "Biomax-5k NMLW"-membran (Millipore). Siden det tidligere er blitt rapportert at indium forblir assosiert med protein selv under lyso-somal degradering (Staud, F. et al., J. Pharm. Sciences, 88:511-585, 1999), akkumuleres zalphall-ligand i nyrene og kan ned-brytes der. Den foreliggende undersøkelse viste også, som for mange andre proteiner, innbefattet IL-2 (Donahue, J.H. og Rosenberg, S.A., supra), at intraperitoneal og subkutan til-førsel gav et plasmanivå av zalphall-ligand med vesentlig lengre levetid.

Eksempel 39

Isolering og ekspansjon av MNC- CD34+- fraksjonen fra frisk human benmarg ved anvendelse av zalphall- ligand for måling av NK-aktivitet

A. Seleksjon og isolering av CD34+- celler fra human benmarg

Mononukleære celler (MNC) fra frisk human benmarg ble fremstilt for anrikning av celler med NK-celleaktivitet. Friske humane MNC ble erholdt fra Poeitic Technologies (Gaithersburg, MD). 10 ml alfa-MEM (JRH, Lenexa, KS) inneholdende 10 % HIA-FBS (Hyclone, Logan, UT) og antibiotikumet 1 % PSN (Gibco BRL, Grand Island, NY) ble tilsatt til cellesuspensjonen, og cellene fikk passere gjennom en 100 um sikt. Cellene ble så talt, nedsentrifugert, vasket med 10 ml PBS inneholdende 2 % FBS og nedsentrifugert igjen, og så resuspendert i 1 ml PBS inneholdende 2 % FBS. Celler med en CD34-celleoverflatemarkør (CD34<+->celler) ble magnetisk separert ved anvendelse av et Detachabead-sett med Dynabeads M-450-CD34 (Dynal, Oslo, Norge) ifølge produsentens instruksjoner. Både CD34<+->cellefraksjonen og CD34 -celle-fraksjonen ble analysert videre nedenfor.

B. Ekspansjon av CD34+- celler ved anvendelse av zalphall-ligand

En CD34<+->cellefraksjon ble plassert i fire brønner i en 24-brønners plate. 50 000 positivt selekterte celler suspendert i 1 ml alfa-MEM (JRH) inneholdende 10 % HIA-FBS (Hyclone) og 1 % PSN (Gibco BRL), samt de forskjellige cytokinene beskrevet ovenfor, ble utsådd i hver av de fire brønnene (1-4). Forskjellige reagenser ble anvendt for å analysere for zalphall-ligand-indusert ekspansjon av de CD34<+->selekterte MNC fra benmarg: Reagensene omfattet human flt3 (R&D, Minneapolis, MN); renset human zalphall-ligand (eksempel 3 0C og eksempel 3OD); humant IL-15 (R&D). Reagensene ble kombinert som følger på dag 0: I brønn nr. 1 ble 2 ng/ml human flt3 tilsatt. I brønn nr. 2 ble 2 ng/ml human flt3 og 15 ng/ml renset human zalphall-ligand tilsatt. I brønn nr. 3 ble 2 ng/ml human flt3 og 20 ng/ml humant IL-15 tilsatt. I brønn nr. 4 ble 2 ng/ml human flt3, 15 ng/ml renset human zalphall-ligand og 20 ng/ml humant IL-15 tilsatt. Etter inkubering i 18 dager ble suspensjonscellene fra hver brønn nedsentrifugert, resuspendert i 0,5 ml alfa-MEM (JRH) inneholdende 10 % HIA-FBS (Hyclone) og 1 % PSN (Gibco BRL) og talt for å anslå proliferasjon av CD34<+->cellefraksjonen. Et lavt proliferasjonsnivå ble observert i nærvær av flt3 alene (kontrollbrønn nr. 1), men nærvær av IL-15 eller zalphall i tillegg til flt3 hadde ingen signifikant virkning på ekspansjonen (brønnene nr. 2 og 3). Ekspansjon ut over ekspansjonen i flt3-kontrollen var imidlertid åpenbar i brønn nr. 4, som inneholdt IL-15 og zalphall-ligand i tillegg til flt3. Disse resultatene tyder på at zalphall og IL-15 virker synergistisk for ekspansjon av den humane CD34<+->cellepopulasjon. Videre under-støtter resultatene fra dette eksperiment resultatene observert med zalphall-ligand fra mus i muse-BM-analysen (eksempel 21).

Alle cellepopulasjonene ble så analysert for NK-aktivitet og undersøkt ved flowcytometrisk analyse, som vist nedenfor (eksempel 41).

C. Ekspansjon av CD34<+->eller CD34"- celler ved anvendelse av zalphall- ligand med forsinket tilsetning av IL- 15

Både den CD34-positive og den negative (CD34~) fraksjon ble utsådd hver for seg i seks 12-brønners plater (1-6). Hver av de seks brønnene inneholdt 100 000 positivt eller negativt selekterte celler i 2 ml alfa-MEM inneholdende 10 % HIA-FBS og PSN, beskrevet ovenfor. De anvendte reagenser var som beskrevet ovenfor. I brønn nr. 1 ble 2 ng/ml human flt3 tilsatt på dag 0. I brønn nr. 2 ble 2 ng/ml human flt3 tilsatt på dag 0, og etter 5 dagers inkubering ble 2 0 ng/ml humant IL-15 tilsatt. I brønn nr. 3 ble 2 ng/ml human flt3 og 15 ng/ml human zalphall-ligand tilsatt på dag 0. I brønn nr. 4 ble 2 ng/ml human flt3 og 15 ng/ml human zalphall-ligand tilsatt på dag 0, og etter 5 dagers inkubering ble 20 ng/ml humant IL-15 tilsatt. I brønn nr. 5 ble 2 ng/ml human flt3 og 20 ng/ml humant IL-15 tilsatt på dag 0. I brønn nr. 6 ble 2 ng/ml human flt3, 15 ng/ml human zalphall-ligand og 20 ng/ml humant IL-15 tilsatt på dag 0. Etter inkubering i totalt 15 dager etter eksperimentets begynnelse ble cellene i hver brønn høstet og talt.

I CD34<+->populasjonen kunne et lavt proliferasjonsnivå observeres i nærvær av flt3 alene (kontrollbrønn nr. 1), men nærvær av IL-15 eller zalphall, tilsatt på dag 0 i tillegg til flt3, hadde ingen signifikant virkning på ekspansjonen (brønnene nr. 3 og 5. Tilsetning av IL-15 etter 5 dager hadde en viss proliferativ virkning sammenlignet med flt3-kontrollen (brønn nr. 2 sammenlignet med brønn nr. 1) og en proliferativ virkning i nærvær av zalphall (brønn nr. 4 sammenlignet med brønn nr. 3). Den høyeste grad av ekspansjon var imidlertid åpenbar i brønn nr. 6, som inneholdt IL-15 og zalphall-ligand i tillegg til flt3 fra dag 0.

I CD34"-populasjonen kunne ingen proliferasjon observeres i nærvær av flt3 alene (kontrollbrønn nr. 1), og faktisk var en reduksjon i cellepopulasjonen åpenbar, Nærvær av zalphall, tilsatt på dag 0 sammen med flt3 (brønn nr. 3), hadde tilsvarende virkning som flt3-kontrollen. Nærvær av IL-15 tilsatt på dag 5 gav en forhøyet proliferasjonsvirkning på cellene i nærvær (brønn nr. 4) eller fravær (brønn nr. 2) av zalphall-ligand. Igjen var den største ekspansjonen åpenbar i brønn nr. 6, som inneholdt IL-15 og zalphall-ligand i tillegg til flt3 fra dag 0.

Alle cellepopulasjonene ble så analysert for NK-aktivitet og undersøkt ved FACS-analyse, som vist nedenfor (eksempel 41) .

Eksempel 40

Isolering og ekspansjon av nyuttatte museceller ved anvendelse av zalphall- ligand fra menneske og mus for måling av NK- aktivitet og NK- cellemarkører

A. Isolering og ekspansjon av celler med lav tetthet fra fersk musebenmarg ved anvendelse av zalphall- ligand fra menneske og mus

Celler fra fersk musebenmarg ble isolert ved å kutte begge endene av musefemurer og skylle 2-3 ml dyrkningsmedium (se nedenfor) gjennom benets innside ned i et oppsamlingsrør. Dyrkningsmediet var 500 ml RPMI 1640-medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS); 5 ml 100 x L-glutamin (Gibco BRL, Grand Island, NY); 5 ml 100 x Na-pyruvat (Gibco BRL); 5 ml 100 x penicillin, streptomycin, neomycin (PSN) (Gibco BRL), og 50 ml varmeinaktivert føtalt, bovint serum (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT). Benmargscellene ble så oppbrutt ved å pipettere mediet opp og ned flere ganger. Cellene ble så nedsentrifugert, vasket én gang med dyrkningsmedium og sendt gjennom en 7 0 um sikt. Mononukleære celler med lav tetthet ble så isolert ved å behandle benmargscellene med en tetthetsgradient. Benmargsceller i 5-8 ml dyrkningsmedium ble forsiktig pipettert på toppen av 5-8 ml Nycoprep, 1.077, Animal (Nycomed, Oslo, Norge) i et sentrifuge-rør. Denne gradienten ble så sentrifugert ved 600 x g i 20 minutter. Mononukleære celler med lav tetthet ble høstet fra grensesjiktet mellom Nycoprep og medium. Disse cellene ble så fortynnet til ca. 20 ml med dyrkningsmedium, nedsentrifugert og vasket. Cellene ble så utsådd ved en tetthet på ca. 0,5-1,5 x IO<6>celler pr. ml i dyrkningsmedium i en standard vevsdyrknings-flaske og inkubert ved 37 °C, 5 % C02, i 2 timer.

Ikke-adherente benmargsceller (NA-LD) ble så høstet og utsådd ved 0,5-2,0 x 10<5>celler pr. ml i dyrkningsmedium pluss 2,5 ng pr. ml muse-flt3 (R and D Systems, Minneapolis, MN) pluss 25-50 ng pr. ml humant interleukin 15 (IL-15) (R and D Systems) med eller uten 50-150 ng pr. ml human zalphall-ligand, eller med eller uten 0,12-10 ng pr. ml muse-zalphall-ligand.

Det var ingen signifikant ekspansjon uten tilsetning av zalphall-ligand fra menneske eller mus. Ikke-adherente celler ble ekspandert i kulturene som inneholdt muse-zalphall-ligand ned til 0,12 ng/ml og i kulturene som inneholdt human zalphall-ligand ned til 22 ng/ml. I kulturer som inneholdt zalphall-ligand både fra menneske og mus, økte ekspansjonen av ikke-adherente celler med økende dose av zalphall-ligand, hvor muse-liganden nådde en mettende respons ved ca. 5-10 ng/ml og den humane ligand ikke ga metning selv i den høyeste dose på

200 ng/ml. Human zalphall-ligand så ut til å være ca. 20-

100 ganger mindre aktiv på museceller enn muse-zalphall-ligand. Etter ca. 5-10 dager ble de zalphall-ligandekspanderte musecellene høstet og analysert ved flowcytometri (FACSCalibur (Becton Dickinson, Mansfield, MA) for å bestemme prosentandelen av cellene som var positive for NK-celleantigener, hvor 46 % var positive for Pan-NK-cellemarkøren DX5 (PharMingen).

B. Isolering og ekspansjon av nyisolerte musebenmargsceller befridd for lin- celler

Nyfremstilte musebenmargsceller befridd for lin-celler ble isolert fra friske musebenmargsceller ved først å inkubere cellene med følgende antistoffer:TER119, Gr-1, B220, MAC-1, CD3e og I-Ab (PharMingen, San Diego, CA) . Lin<+->cellene ble så fjernet med Dynabeads M-450 tilkoblet antirotte-IgG fra sau (Dynal, Lake Success, NY) ifølge produsentens instruksjoner.

De negativt selekterte lin"-benmargscellene ble så utsådd som ovenfor i dyrkningsmedium tilsatt enten 2,5 ng/ml flt3 (R&D Systems) og 25 ng/ml IL-15 (R&D Systems); eller flt3, IL-15 og muse-zalphall-ligand, 2-5 % muse-zalphall-ligandkondisjonert BHK-medium. Etter 6 dagers dyrkning ble kulturene høstet, talt og undersøkt med en NK-celleaktivitetsanalyse (eksempel 41). Cellene som ble dyrket med muse-zalphall-ligand, var omtrent to til tre ganger mer effektive når det gjaldt lysering av NK-cellemålceller (YAC-l-celler) enn cellene dyrket uten zalphall-ligand.

C. Isolering og ekspansjon av CD4~ CD8~- tymocytter ( dobbelt negative eller DN)

Nyisolerte musetymocytter ble isolert ved å kutte opp og sikte brissel fra 3-8 uker gamle mus. CD4~CD8~ (DN)-celler ble så negativt selektert ved å inkubere tymocyttene med anti-CD4-og anti-CD8-antistoffer (PharMingen), og så fjerne CD4<+>CD8<+->cellene med Dynabeads M-450 tilkoblet antirotte-IgG fra sau (Dynal) ifølge produsentens instruksjoner.

DN-musetymocyttene ble så dyrket i dyrkningsmedium tilsatt 2,5 ng/ml flt3 (R&D Systems), 25 ng/ml IL-15 (R&D Systems) og 10 ng/ml IL-7 (R&D Systems), med eller uten muse-zalphall-ligand som ovenfor. Seks dager senere ble cellene høstet, talt og analysert ved flowcytometri, som beskrevet ovenfor, og også undersøkt i en NK-celleaktivitetsanalyse (eksempel 41).

Kulturen dyrket med muse-zalphall-ligand gav ca.

480 000 celler, mens kulturen uten zalphall-ligand kun gav ca. 160 000 celler. Kulturen dyrket med muse-zalphall-ligand ble funnet å omfatte ca. 16,2 % celler som var positive for NK-celleantigener Pan-NK, DX5 (PharMingen). Kulturen dyrket uten zalphall-ligand inneholdt 14,6 % celler som var positive for DX5. Cellene dyrket med zalphall-ligand lyserte NK-celle-målcellene YAC-1 omtrent to ganger bedre enn cellene dyrket uten zalphall-ligand. De ekspanderte cellene lyserte ikke i signifikant grad en negativ kontrollmålcellelinje, EL4. Disse resultatene tydet på at zalphall-ligand gir selektiv ekspansjon av lytiske NK-celler.

Eksempel 41

Aktivitet av celler ekspandert med zalphall- ligand fra menneske og mus og modne muse- NK- celler i NK- cellecytotoksisitetsanalyser

A. NK- celleanalyse

NK-celleformidlet cytolyse av målceller ble undersøkt ved en standard<51>Cr-frigivningsanalyse. Målcellene (K562-celler (ATCC nr. CCL-443) i humane analyser og YAC-l-celler (ATCC nr. TIB-160) i museanalyser) manglet ekspresjon av vevstypekompleks-(MHC)-molekyler, noe som gjør dem utsatt for NK-celleformidlet lysering. En negativ kontrollmålcellelinje i museanalysene er MHC<+->tymomcellelinjen EL4 (ATCC nr. TIB-39). Vi dyrket K562-, EL4- og YAC-1-celler i RP10-medium (standard RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY) supplert med 10 % FBS (Hyclone, Logan, UT), samt 4 mM glutamin (Gibco BRL), 100 I.U./ml penicillin + 100 MCG/ml streptomycin (Gibco BRL) , 50 UM P-merkaptoetanol (Gibco BRL) og 10 mM HEPES-buffer (Gibco BRL). På analysedagen ble 1-2 x IO<6>målceller høstet og resuspendert i en konsentrasjon på 2,5-5 x IO<6>celler/ml i RPlO-medium. Vi tilsatte 50-100 ul 5 mCi/ml<51>Cr-natriumkromat (NEN, Boston, MA) direkte til cellene og inkuber te dem i 1 time ved 37 °C, og vasket dem så to ganger med 12 ml PBS og resuspenderte dem i 2 ml RP10-medium. Etter telling av cellene i et hematocytometer ble målcellene fortynnet til 0,5-1 x IO<5>celler/ml, og 100 ul (0,5-1 x IO<4>celler) ble blandet med effektorcellene, som beskrevet nedenfor.

I humane analyser ble effektorceller fremstilt fra selekterte og ekspanderte humane CD34<+->BM-celler (eksempel 39B), som ble høstet, vasket, talt, blandet med forskjellige konsentrasjoner med<51>Cr-merkede målceller i 96-brønners plater med rund bunn og inkubert i 4 timer ved 37 °C. Etter saminkubering av effektorcellene og de merkede målcellene ble halvparten av supernatanten fra hver brønn oppsamlet og analysert i en gammateller i 1 minutt/prøve. Prosent spesifikk<51>Cr-frigjøring ble beregnet med formelen 100 x (X-Y)/(Z-Y), hvor X er frigjøring av<51>Cr i nærvær av effektorceller, Y er den spontane frigjøring i fravær av effektorceller, og Z er den totale frigivelse av<51>Cr fra målceller inkubert med 0,5 % Triton X-100. Resultatene ble fremstilt grafisk som prosent spesifikk lysis mot forholdet mellom effektorceller og målceller i hver brønn.

B. Aktivitet av celler ekspandert med human zalphall-ligand

Isolerte humane CD34<+->HPC-er dyrket med flt3 +/zalphall-ligand og flt3 + IL-15 +/- zalphall-ligand (eksempel 39) ble høstet på dag 15 for å analysere cellenes evne til å lysere MHC~-K562-celler i en standard<51>Cr-frigjøringsanalyse, som beskrevet ovenfor, og for å analysere overflatefenotypen ved flowcytometri. Som forventet fra tidligere rapporter (Mrozek, E. et al., Blood, 87:2632-2640, 1996; og Yu, H. et al., Blood, 52:3647-3657, 1998) induserte samtidig tilsetning av IL-15 og flt3L utvekst av en liten populasjon av CD56~-celler. Det er av interesse at selv om det ikke var noen signifikant ekspansjon av BM-celler dyrket med zalphall-ligand og flt3L sammen, var det en signifikant økning av det totale celleantall i kulturer som inneholdt en kombinasjon av flt3L, zalphall-ligand og IL-15 (se eksempel 39).

For måling av overflatefenotypen av disse humane BM-kulturene farget vi små uttak av cellene for 3-fargers flowcytometrisk analyse med monoklonale anti-CD3-FITC-, anti-CD56-PE- og anti-CDl6-CyChrome-antistoffer (alle fra PharMingen, San Diego, CA) og analyserte dem i et FACSCalibur ved anvendelse av programvaren CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Denne flowcytonretriske analysen bekreftet at cellene som vokste ut av disse kulturene, var differensierte NK-celler, siden de var store og granulære og uttrykte både CD56 og CD16, og var CD3"

(Lanier, L.L., Annu. Rev. Immunol., 16:359-393, 1998). Videre viste disse cellene signifikant høyere effektorfunksjon enn cellene dyrket med IL-15 og flt3. Nærmere bestemt lyserte celler som var dyrket i alle tre cytokiner mer enn 40 % av K562-målcellene ved et forhold mellom effektorceller og målceller (E:T) på 1,5, mens cellene som ble dyrket i IL-15 + flt3L lyserte færre enn 5 % av målcellene ved et E:T på 2. Disse resultatene viser at zalphall-ligand i kombinasjon med IL-15 stimulerer differensiering av NK-celler fra CD34<+->BM-celler.

C. Aktivitet av muse- zalphall- ligandekspanderte celler

For å analysere virkningene av zalphall-ligand på hematopoietiske forløperceller fra mus ble rensede linjenegative (lin") benmargsceller fra C57Bl/6-mus ekspandert i flt3 + IL-15 +/- zalpall-ligand, som beskrevet i eksempel 40B. På dag 6 av dyrkningen ble cellene ("effektorcellene") høstet og talt, og så resuspendert i 0,4 ml RPlO-medium (eksempel 41A). To uttak (hvert på 0,15 ml) av hver prøve ekspandert med eller uten zalphall-ligand (eksempel 41A) ble seriefortynnet tre ganger i duplikat i 96-brønners plater med rund bunn, med i alt 6 brønner med 100 ul i hver. De gjenværende 100 ul celler ble farget for NK-celleoverflatemarkører med monoklonale FITC-anti-2B4- og PE-anti-DX5-antistoffer (PharMingen) og analysert ved flowcytometri. Alle cellegrupper som var behandlet med flt3 + IL-15, med eller uten nærvær av zalphall-ligand, hadde andeler av 2B4+DX5+-celler i samme område, med 65-75 % av cellene positive for begge NK-markørene.

For NK-lyseringsanalysen ble målceller (YAC-1 og EL4) merket med<51>Cr, som beskrevet ovenfor. Etter telling av målcellene i et hemacytometer ble de fortynnet til 0,5-1 x IO<5>celler/ml, og 100 ulYAC-1 ellerEL4 (0,5-1 x 10<4>celler) ble blandet med 100 ul effektorceller og inkubert i 4 timer ved 37 °C. Spesifikk lysering ble bestemt for hver brønn, som beskrevet ovenfor.

Vi fant at celler dyrket i nærvær av flt3 + IL-15 + zalphall-ligand viste forhøyet lytisk aktivitet (grovt sett to ganger) mot YAC-l-målcellene (men drepte ikke MHC<+->kontroll-cellelinjen EL4). Ved et forhold mellom effektorceller og målceller (E:T) på 5 lyserte NK-celler dannet i nærvær av alle tre cytokiner (zalphall-ligand + flt3 + IL-15) 12 % av YAC-1-cellene, mens NK-cellene som var ekspandert med flt3 + IL-15 lyserte 6 % avYAC-l-målcellene. Påfølgende eksperimenter bekreftet denne tendensen.

I en annen tilnærming for å bestemme den biologiske aktivitet av zalphall-ligand på muse-NK-celler isolerte vi umodne CD4~CD8" ("dobbelt negative", DN)-musetymocytter, som beskrevet i eksempel 40C, og dyrket dem med IL-15 + flt3 + IL-7 eller IL-15 + flt3 + IL-2, med eller uten zalphall-ligand. Etter 6 dagers dyrkning ble cellene høstet og analysert for NK-lytisk aktivitet på YAC-l-celler og EL4-celler, som beskrevet ovenfor. Vi fant at celler dyrket i nærvær av zalphall-ligand hadde den høyeste lytiske aktivitet i denne analysen, med forhøyet aktivitet sammenlignet med celler dyrket i nærvær av de andre cytokinene. Nærmere bestemt drepte tymocytter dyrket med IL-15 + flt3 + IL-7 18 % av YAC-l-cellene ved E:T på 24, mens celler dyrket i nærvær av IL-15 + flt3 + IL-7 pluss zalphall-ligand drepte 48 % av målcellene ved samme E:T. DN-tymocytter dyrket i IL-15 + flt3 + IL-2 drepte 15 % av YAC-l-målcellene ved E:T på 6, mens celler dyrket med disse tre cytokinene og zalphall-ligand drepte 35 % av YAC-l-cellene ved E:T på 9. Flowcytometri ble utført på de dyrkede cellene én dag før NK-lyseringsanalysen. Som for benmargskulturene og trass i den proliferative virkning av zalphall-ligand (celletallene øker omtrent to ganger dersom zalphall-ligand tilsettes) gav liganden ingen signifikant økning av fraksjonen av DX5<+->celler (17-20 % av det totale antall celler i kulturene med IL-7, og 35-46 % av totalen i kulturer med IL-2). Disse resultatene tyder på at zalphall-ligand i kombinasjon med IL-15 og flt3 forsterker den lytiske aktivitet av NK-celler dannet fra benmarg eller brissel fra mus.

D. Aktivitet av muse- zalphall- ligand på modne muse- NK-celler

For å analysere virkningene av muse-zalphall-ligand på modne NK-celler isolerte vi milten fra fire 5 uker gamle C57Bl/6-mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) og knuste disse med rundslipte objektglass for dannelse av en cellesuspensjon. Røde blodceller ble fjernet ved hypoton lysering som følger: Cellene ble nedsentrifugert og supernatanten fjernet ved avsugning. Vi brøt opp massen med nedsentrifugerte celler ved forsiktig omristing og tilsatte så 900 |il sterilt vann under omristing, hurtig (mindre enn 5 sekunder senere), etterfulgt av 100 ul 10 x HBSS (Gibco BRL). Cellene ble så resuspendert i 10 ml 1 x HBSS, og cellerestene ble fjernet ved å la cellene passere gjennom en cellesikt utstyrt med et nylonnett (Falcon). Disse RBC-befridde miltcellene ble så nedsentrifugert og resuspendert i MACS-buffer (PBS + 1 % BSA + 2 mM EDTA) og talt. Vi farget 3 00 x IO<6>av cellene med anti-DX5-belagte magnetiske kuler (Miltenyi Biotec) og selekterte positivt DX5<+->NK-celler over en MACS VS+-separasjonskolonne ifølge produsentens instruksjoner, noe som førte til gjenvinning av 8,4 x IO<6>DX5<+->celler og 251 x IO<6>DX5"-celler. Begge disse cellegruppene ble dyrket i 24-brønners plater (0,67 x IO<6>celler/brønn, to brønner pr. behand-lingsbetingelse) i RPlO-medium (eksempel 41A), alene eller med 1) 30 ng/ml muse-zalphall-ligand, 2) 30 ng/ml rekombinant muse-IL-2 (R&D Systems, Inc., Minneapolis,MN), 3) 30 ng/ml rekombinant, humant IL-15 (R&D), 4) 3 0 ng/ml av hver av muse-zalphall-ligand og hIL-15, eller 5) 30 ng/ml av hver av mIL-2 og hIL-15. Disse cellene ble høstet etter 21 timer, vasket og resuspendert i RPlO-medium og talt. Cellene ble så analysert for evne til å lysere<51>Cr-merkede YAC-1- eller EL4-målceller som beskrevet i eksempel 41A.

Generelt var det lite NK-aktivitet fra DX5~ (ikke-NK-celle)-gruppene, men DX5~-celler dyrket med zalphall-ligand og hIL-15 lyserte 25 % av YAC-l-målcellene ved E:T på 82. Til sammenligning lyserte DX5"-celler dyrket med hIL-15 alene 14 % av YAC-l-cellene ved E:T på 110. Dette tyder på at zalphall-ligand og IL-15 virker sammen på de gjenværende NKl. l+-NK-cellene i dette cellepreparatet. Når det gjelder DX5"-cellepreparatet gav behandling med msue-zalphall-ligand alene ingen signifikant økning av effektorfunksjonen (disse cellenes lysering av YAC-1-celler tilsvarte aktiviteten i den ubehandlede gruppe). Som forventet, gav både IL-2 og IL-15 signifikant forbedret NK-aktivitet. Den høyeste lyseringsgrad ble imidlertid påvist i gruppen behandlet med zalphall-ligand og hIL-15 (65 % lysering av YAC-l-celler ved E:T på 3,3, sammenlignet med 45 % lysering ved E:T på 4 for hIL-15-behandlingsgruppen). Sett under ett tyder disse resultatene på at selv om zalphall-ligand alene ikke kan gi økt NK-cellelyseringsaktivitet, forsterker liganden NK-lyseringsaktivitet i modne NK-celler ved tilførsel sammen med IL-15.

Eksempel 42

Zalphall- ligandproliferasjon av T- celler fra menneske og mus i en T- celleproliferasjonsanalyse

A. Muse- zalphall- ligandproliferasjon av muse- T- celler

T-celler fra C57Bl/6-mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ble isolert fra blandede splenocytter og lymfocytter fra lymfeknuter (LN) fra aksille, forben, inguinalkanal, nakke og mesenterium. Milten ble knust med objektglass med rundslipte ender for dannelse av en cellesuspensjon. LN ble oppdelt i biter med pinsetter og fikk passere gjennom en cellesikt for fjerning av rester. Sammenslåtte splenocytter og LN-celler ble separert i CD8<+->og CD4<+->undergrupper ved anvendelse av to på hverandre følgende MACS magnetiske separasjonskolonner ifølge produsentens instruksjoner (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Hele tymocytter ble oppsamlet fra de samme musene.

Cellene ble dyrket ved 3 x 10<5>celler/brønn (tymocytter) eller 10<5>celler/brønn (modne T-celler) med økende konsentrasjoner av renset muse-zalphall-ligand (0-3 0 ng/ml) (eksempel 24 og eksempel 29) i 96-brønners plater med flat bunn, på forhånd belagt over natten ved 4 °C med forskjellige konsentrasjoner av monoklonalt anti-CD3-antistoff 2C11 (PharMingen), i 3 dager ved 37 °C. Anti-CD3-antistoffet bidro til å aktivere muse-T-cellene via T-cellereseptoren. Hver brønn ble pulsmerket med 1 uCi<3>H-tymidin på dag 2, og platene ble høstet og radioaktiviteten målt 16 timer senere for å måle proliferasjonen.

Ved analyse av zalphall-ligand i T-celleproliferasjons-analyser fant vi at liganden kostimulerte anti-CD3-aktiverte musetymocytter, noe som førte til akselerert utvekst av CD8<+>CD4~-celler (hovedandelen av tymocyttene dyrket med anti-CD3 + zalphall-ligand var CD8<+>CD4" etter 3 dagers dyrkning, mens celler dyrket med anti-CD3 alene ikke viste signifikant forfordeling av denne fenotypen før dag 5. Vi observerte ikke signifikant proliferasjonsnivå av tymocytter med zalphall-ligand i fravær av anti-CD3.

Det er av interesse at når vi analyserte modne perifere muse-T-celler for evne til å respondere på zalphall-ligand + anti-CD3, fant vi at bare CD8<+->cellene, men ikke CD4<+->under-gruppen, responderte på en doseavhengig måte på zalphall-ligand. Vi observerte også svak, men reproduserbar, proliferasjon av CD8<+->celler (men ikke CD4"-celler) som respons på zalphall-ligand alene. Det er av interesse at dette ikke ble observert for humane T-celler (se eksempel 42B nedenfor).

B. Human zalphall- ligandproliferasjon av humane T- celler

Humane CD4<+->og CD8<+->T-celler ble isolert fra PBMC-er, som beskrevet i eksempel 43 (nedenfor). Cellene ble dyrket ved ca. IO<5>celler/brønn med økende konsentrasjoner av renset human zalphall-ligand (0-50 ng/ml) (eksempel 24) i 96-brønners plater med flat bunn, på forhånd belagt over natten ved 4 °C med forskjellige konsentrasjoner av monoklonalt antihuman-CD3-antistoff UCHTI (PharMingen), i 3 dager ved 37 °C. Hver brønn ble pulsmerket med 1 uCi<3>H-tymidin på dag 2, og platene ble høstet og radioaktiviteten målt 16 timer senere. I motsetning til våre resultater med muse-T-celler tyder våre foreløpige resultater på at human zalphall-ligand kostimulerer humane CD4<+->T-celler, men ikke CD8<+->T-celler, på en doseavhengig måte.

Eksempel 43

Sanntids- PCR viser zalphall- ligandekspresjon i humane CD4+- celler

A. Rensede humane T- celler som primærkilde anvendt for måling av ekspresjon av human zalphall- ligand

Helblod (150 ml) ble oppsamlet fra en frisk human donor og blandet 1:1 med PBS i 50 ml koniske rør. Under 3 0 ml fortynnet blod ble det så plassert 15 ml Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige). Gradientene ble sentrifugert i 3 0 minutter ved 500 g, og sentrifugen fikk stanse uten oppbremsing. RBC-befridde celler i grenseflaten (PBMC) ble oppsamlet og vasket tre ganger med PBS. Utbyttet av isolerte humane PBMC var 200 x IO<6>før seleksjonen beskrevet nedenfor.

PBMC-ene ble suspendert i MACS-buffer (PBS, 0,5 % EDTA, 2 mM EDTA) , og 3 x IO<6>celler ble satt til side for kontroll-RNA og for flowcytometrisk analyse. Vi tilsatte så 0,25 ml antihumane CD8-mikrokuler (Miltenyi Biotec), og blandingen ble inkubert i 15 minutter ved 4 °C. Disse cellene merket med CD8-kuler ble vasket med 3 0 ml MACS-buffer og så resuspendert i 2 ml MACS-buffer.

En VS+-kolonne (Miltenyi) ble fremstilt ifølge produsentens instruksjoner. VS+-kolonnen ble så plassert i et Vario-MACS-magnetfelt (Miltenyi).Kolonnen ble ekvilibrert med 5 ml MACS-buffer. De isolerte primære musecellene ble så påsatt kolonnen. De CD8-negative cellene fikk passere gjennom kolonnen. Kolonnen ble vasket med 9 ml (3 x 3 ml) MACS-buffer. Kolonnen ble så fjernet fra magneten og plassert over et 15 ml falconrør. CD8<+->celler ble eluert ved tilsetning av 5 ml MACS-buffer til kolonnen, og bundne celler ble skylt ut ved anvendelse av stempelet levert av produsenten. Utbyttet av CD8<+->selekterte humane perifere T-celler var ca. 51 x 10<6>celler totalt. De CD8-negative, ubundne cellene ble oppsamlet, talt og farget med antihumane CD4-belagte kuler, og så inkubert og sendt gjennom en ny VS+-kolonne ved samme konsentrasjoner som beskrevet ovenfor. Utbyttet av CD4<+->selekterte humane perifere T-celler var 42 x IO<6>celler totalt.

Et uttak av de CD8<+->og de CD4<+->selekterte humane T-cellene ble tatt ut for farging og sortering i en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) for måling av renheten. Et PE- konjugert antihuman-CD4-antistoff, et FITC-konjugert antihuman-CD8-antistoff og et CyChrome-konjugert antihuman-CDl9-antistoff (alle fra PharMingen) ble anvendt for farging av de CD8<+->og CD4<+->selekterte cellene. De CD8-selekterte cellene i dette første eksperiment var 80 % CD8<+>, og de CD4-selekterte cellene var 85 % CD4<+>. I to påfølgende eksperimenter (eksempel 43B) var de CD8<+->rensede cellene 84 % henholdsvis 81 % rene, mens CD4<+->cellene var 85 % henholdsvis 97 % rene. I ett eksperiment farget vi cellene som ikke bandt seg til antihuman-CDl9-belagte kuler (Miltenyi) og sendte dem gjennom en tredje kolonne med magnetiske kuler for isolering av CDl9<+->B-celler (disse var 92 % rene).

De humane CD8<+->, CD4<+->og CDl9<+->selekterte cellene ble aktivert ved å inkubere 0,5 x IO<6>celler/ml i RPMI + 5 % humant ultraserum (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) + PMA, 10 ng/ml, og "Ionomycin" 0,5 ug/ml (Calbiochem) i ca. 4, 16 eller 24 timer ved 37 °C. T-cellene (2,5 x 10<6>/brønn) ble alternativt stimulert i 24-brønners plater som på forhånd var belagt over natten med 0,5 ug/ml monoklonalt platebundet anti-CD3-antistoff, UCHTI (PharMingen), med eller uten løselig monoklonalt anti-CD28-antistoff (PharMingen), ved 5 (lg/ml. For hvert tidspunkt ble cellene høstet, nedsentrifugert, vasket én gang med PBS og nedsentrifugert igjen. Supernatanten ble fjernet, og de nedsentrifugerte cellene ble hurtig nedfrosset i et tørris-/etanolbad, og så lagret ved -80 °C for senere fremstilling av RNA.

Sanntids-PCR ble utført på disse humane CD8<+->, CD4<+->og CDl9<+->selekterte cellene, som beskrevet i eksemplene 43B og 43C nedenfor, for å anslå ekspresjonen av human zalphall-ligand og zalphall-ligandreseptor.

A. Primere og prober for kvantitativ RT- PCR for måling av ekspresjonen av human zalphall- ligand

Sanntidskvantitativ RT-PCR ved anvendelse av ABI PRISM 7700-sekvensdeteksjonssystemet (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) er tidligere blitt beskrevet (se Heid, CA. et al., Genome Research, 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research, 6:995-1001, 1996; og Sundaresan, S. et al., Endocrinology, 135:4756-4764, 1998. Denne fremgangsmåten omfatter anvendelse av en genspesifikk probe som inneholder både rapportørfargestoffer og emisjonshemmende fargestoffer. Dersom proben er intakt, hindres rapportørfargestoffemisjonen på grunn av nærheten til det emisjonshemmende fargestoff. Under PCR-for-lengelsen ved anvendelse av ytterligere genspesifikke fremover-og reversprimere kuttes proben av Taq-polymerasens 5'-nuklease-aktivitet, noe som frigjør rapportørfargestoffet og fører til økt fluorescensemisjon.

Primerne og probene som ble anvendt til sanntids-kvantitative RT-PCR-analyser ble utformet ved anvendelse av primerutformingsprogramvaren "Primer Express" (PE Applied Biosystems) . Primere for human zalphall-ligand ble utformet slik at de spenner over en intron-eksongrense for å hindre amplifisering av genomisk DNA. Fremoverprimeren ZC 22 281 (SEQ ID NO: 90) og reversprimeren ZC 22 279 (SEQ ID NO: 91) ble begge anvendt i en konsentrasjon på 300 nM for å syntetisere et produkt på 80 bp. Den tilsvarende TaqMan-probe for zalphall-ligand, ZG31 (SEQ ID NO: 92), ble syntetisert av PE Applied Biosystems. Proben var merket med et fluorescerende rapportørfargestoff (6-karboksy-fluorescein) (FAM) (PE Applied Biosystems) i 5'-enden og et emisjonsblokkerende fargestoff (6-karboksytetrametylrhodamin)

(TAMRA) (PE Applied Biosystems) i 3'-enden. For å analysere RNA-prøvenes integritet og kvalitet ble de analysert for rRNA ved anvendelse av et primer- og probesett bestilt fra PE Applied Biosystems (kat.nr. 4304483). Det fluorescerende rapportør-fargestoff for denne proben er VIC (PE Applied Biosystems). rRNA-resultatene vil tillate normalisering av resultatene for zalphall-li gand.

RNA ble fremstilt fra nedsentrifugerte celler erholdt i eksempel 43A ved anvendelse av"RNeasy Midiprep"-settet (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Kontroll-RNA ble fremstilt fra ca. 10 millioner BHK-celler som uttrykker human zalphall-ligand. C. Primere og prober for kvantitativ RT- PCR for måling av ekspresjonen av human zalphall- reseptor

Sanntids-PCR ble utført for å måle ekspresjonen av zalphall-reseptor som i eksempel 43B og eksempel 43D, ved anvendelse av cellene fremstilt under betingelsene beskrevet i detalj i 43A og prober som var spesifikke for zalphall-reseptoren. Fremoverprimeren ZC 22 276 (SEQ ID NO: 94) ble anvendt i en PCR- reaksjon (ovenfor) i en konsentrasjon på ca. 300 nM for syntese av et produkt på 143 bp. Den tilsvarende zalphall-TaqMan-probe, betegnet ZG31 (SEQ ID NO: 95), ble syntetisert og merket av PE Applied Biosystems. RNA fra BaF3-celler som uttrykker human zalphall-reseptor, ble anvendt for fremstilling av egnede kontroller for standardkurver for sanntids-PCR-reaksjonen beskrevet i eksempel 43D nedenfor.

D. Sanntidskvantitativ RT- PCR

Det relative nivå av zalphall-ligand-mRNA ble bestemt ved å analysere total-RNA-prøver ved å anvende ettrinns-RT-PCR-fremgangsmåten (PE Applied Biosystems). RNA fra BHK-celler som uttrykte human-zalphall-ligand, ble anvendt for dannelse av en standardkurve. Kurven bestod av seriefortynninger i området fra 2,5-2,5 x IO<4>ng for rRNA-analysen og 25-0,0025 ng for zalphall-ligandanalysen, hvor hvert punkt ble analysert i triplikat. Total-RNA-prøvene ble også analysert i triplikat for måling av nivået av humant zalphall-ligandtranskript og for måling av rRNA-nivået som en endogen kontroll. Hver ettrinns-RT-PCR-reaksjon bestod av 25 ng total-RNA i buffer A (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl), og det interne standardfargestoff (ROX) (PE Applied Biosystems), egnede primere (50 nM for rRNA-prøver, 3 00 nM for zalphall-ligandprøver og probe (50 nM for rRNA, 100 nM for zalphall-ligand), 5,5 mM MgCl2, 300 UM hver av d-CTP, d-ATP og d-GTP og 600 UM d-UTP, reverstranskriptase (0,25 U/ul), AmpliTaq-DNA-polymerase (0,025 U/ul) og RNase-inhibitor (0,4 U/ul) i et totalvolum på 25 ul. Temperaturbetingelsene bestod av et innledende RT-trinn ved 48 °C i 3 0 minutter, et AmpliTaq Gold-aktiveringstrinn på 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med amplifisering ved 95 °C i 15 sekunder og 60 °C i

1 minutt. Det relative nivå av zalphall-ligand-RNA ble bestemt ved standardkurvefremgangsmåten, som beskrevet i brukerbulletin nr. 2 (PE Biosystems; User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Seguence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11. desember 1997), ved anvendelse av rRNA-målingene for normalisering av nivået av zalphall-ligand. Prøvene ble sammenlignet med kalibratoren i hvert eksperiment. Kalibratoren ble valgt tilfeldig, basert på RNA av god kvalitet og et ekspresjonsnivå som de andre prøvene kunne sammenlignes signifikant med. Resultatene fra eksperimentene som analyserte ekspresjonen av zalphall-ligand og zalphall-reseptor i stimulerte og ikke-stimulerte celler (eksempel 43A) er beskrevet i eksempel 43E nedenfor.

E. Ekspresjon av human zalphall- reseptor og - ligand i CD4<+->, CD8<+->og CDl9+- celler

Det første eksperimentet benyttet RT-PCR, som beskrevet ovenfor, for måling av zalphall-reseptorekspresjonen i ikke-stimulerte og anti-CD3-stimulerte CD4<+->og CD8<+->prøver ved tids-punktene 0 timer (ikke-stimulerte ("hvilende") celler) og 4 timer, 15,5 timer og 24 timer etter stimulering. Den hvilende CD4<+->prøven ble tilfeldig valgt som kalibratorprøve og gitt en verdi på 1,00. Det var en tilnærmet fire gangers økning i reseptor ekspres jonen i ikke-stimulerte CD4<+->celler mellom 4 timers og 24 timers dyrkning, og ca. åtte gangers økning over det samme tidsrom i anti-CD3-stimulerte CD4<+->celler. CD8<+->cellene viste sju gangers økning i zalphall-reseptorekspresjonen, som nådde en topp etter 4 timer og så avtok med tiden. Ved anti-CD3-stimulering hadde CD8<+->cellene en konstant åtte gangers økning av reseptor ekspres j onen.

Dette første eksperimentet benyttet også RT-PCR for å måle zalphall-ligandekspresjonen i de samme anti-CD3-stimulerte og ikke-stimulerte CD4<+->og CD8<+->prøvene. CD8<+->prøven uttatt 4 timer etter stimulering med anti-CD3 ble tilfeldig valgt som kalibratorprøve og gitt en verdi på 1,00. Resultatene viste at ikke-stimulerte CD4<+->og CD8<+->celler ikke uttrykker zalphall-ligand. Vi observerte en signifikant økning av ekspresjonen i de anti-CD3-stimulerte CD4<+->cellene etter 4 timer, med ca.

300 gangers økning i signalet observert etter 15,5 timer. CD8<+->cellene uttrykte en liten mengde ligand ved anti-CD3-stimulering, dette skyldes imidlertid sannsynligvis kontaminering av CD8<+->populasjonen med et lite antall CD4<+->celler.

Det andre eksperimentet benyttet RT-PCR for analyse av zalphall-reseptorekspresjonen i anti-CD3-stimulerte, PMA- + "Ionomycin"-stimulerte og ikke-stimulerte CD4<+->og CD8<+->prøver

0 timer, 3,5 timer, 16 timer og 24 timer etter aktivering. Den hvilende CD8<+->prøven ble tilfeldig valgt som kalibratorprøve og gitt en verdi på 1,00. De hvilende CD4<+->og CD8<+->cellene hadde

ikke signifikante mengder av reseptorekspresjon. Ekspresjonen var tilnærmet tre ganger høyere i de PMA- + "Ionomycin"-stimulerte CD4<+->prøvene 3,5 timer, 16 timer og 24 timer etter stimulering. Ekspresjonen i anti-CD3-aktiverte CD4<+->celler nådde en topp som lå tilnærmet ti ganger over bakgrunnsnivået 3,5 timer etter stimuleringen, men var så redusert til et nivå fire ganger over bakgrunnsnivået 16 timer etter stimuleringen. CD8<+->cellene viste en fire gangers økning av ekspresjonen 3,5 timer etter stimulering med PMA + "Ionomycin", med avtakende ekspresjon ved påfølgende tidspunkter. Som i det første eksperimentet viste de anti-CD3-stimulerte CD8<+->cellene igjen åtte gangers økning av reseptorekspresjonen over bakgrunnsnivået.

Disse prøvene fra det andre eksperimentet ble også anvendt for å måle zalphall-ligandekspresjonen. CD4<+->prøven uttatt 24 timer etter stimulering med PMA + "Ionomycin" ble tilfeldig valgt som kalibratorprøve og gitt en verdi på 1,00. Resultatene viste igjen at ingen av de ikke-stimulerte cellene uttrykte zalphall-ligand. Det var tilnærmet 30 gangers induksjon av ligandekspresjonen i CD4<+->cellene stimulert med anti-CD3 etter 3,5 timer, som observert i det foregående eksperiment (etter 4 timer). Det var imidlertid bare fem gangers induksjon ved stimulering med PMA + "Ionomycin" etter 3,5 timer, og denne induksjonen gikk ned ved de påfølgende tidspunkter. Igjen uttrykte CD8<+->cellene en svært liten mengde ligand, noe som sannsynligvis skyldes kontaminerende CD4<+->celler.

Det avsluttende eksperiment benyttet RT-PCR for måling av zalphall-reseptorekspresjonen i anti-CD3- og anti-CD3/anti-CD28-stimulerte og ikke-stimulerte CD4<+->og CD8<+->prøver 0 timer,

2 timer, 4 timer og 16 timer etter stimuleringen. CDl9<+->celler aktivert med PMA + "Ionomycin" ble også analysert for reseptor-ekspres jon ved de samme tidspunkter. Den hvilende CD4<+->prøve ble tilfeldig valgt som kalibratorprøve og gitt en verdi på 1,00. De anti-CD3-stimulerte CD4<+->cellene hadde etter 2 timer bare fire gangers induksjon av reseptoren, sammenlignet med ti gangers induksjon observert etter 3,5 timer i det foregående eksperiment. Kombinasjonen av anti-CD3 og anti-CD28 gav økt ekspresjon av zalphall-reseptor til åtte ganger over bakgrunnsnivået. Anti-CD3/anti-CD28-stimulerte CD8<+->celler etter 16 timer hadde svært lavt ekspresjonsnivå for zalphall-reseptor, som observert i CD8<+->cellene i de foregående eksperimenter (ovenfor). CDl9<+->cellene stimulert med PMA + "Ionomycin" hadde den mest signifikante ekspresjon av zalphall-reseptoren med 19 gangers økning etter 2 timer, men ekspresjonsnivået var som for hvilende celler etter

16 timer.

Disse prøvene fra det avsluttende eksperiment ble også anvendt for måling av zalphall-ligand ved RT-PCR. Anti-CD3/anti-CD28-stimulert CD8<+->prøve etter 16 timer ble tilfeldig valgt som kalibratorprøve og gitt en verdi på 1,00. Resultatene viste at CD4<+->cellene etter 2 timer hadde tilnærmet to gangers induksjon av zalphall-ligandekspresjon ved stimulering med anti-CD3 og fem gangers induksjon ved stimulering med anti-CD3 pluss anti-CD28. Disse stimuleringsbetingelsene induserte ligandekspresjonen over tid, hvor de stimulerte CD4<+->cellene etter 16 timer viste et ligandekspresjonsnivå som lå 7 0 ganger høyere enn bakgrunnsnivået. CD8<+->og CDl9<+->celler viste ingen ekspresjon av zalphall-ligand.

En viss mengde variasjon var forventet mellom de forskjellige blodprøvene (det vil si flere prøver uttatt på forskjellige tidspunkter fra samme pasient og prøver fra flere pasienter). Tendensene i resultatene ble derfor analysert innen hver undersøkelse eller fra en enkelt blodprøve, og de tre eksperimentene ovenfor ble sammenlignet for en total konklusjon. Tendensen fra sanntids-PCR-eksperimentene beskrevet ovenfor er at av alle de analyserte celletypene uttrykte CDl9<+->B-celler aktivert med PMA + "Ionomycin" det høyeste nivå av zalphall-reseptor-RNA. CD4<+->og CD8<+->celler kan også stimuleres til ekspresjon av reseptoren, men i lavere nivå enn i B-celler. Zalphall-ligand ble uttrykt nesten utelukkende i stimulerte CD4<+->T-celler (og ikke av CD8<+->T-celler eller CDl9<+->B-celler). Selv om stimulering med PMA + "Ionomycin" induserte et godt zalphall-ligandsignal i denne analysen, ble et signifikant høyere signal erholdt fra CD4<+->T-celler stimulert med monoklonalt anti-CD3-antistoff eller en kombinasjon av monoklonale anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer, betingelser som bedre etterligner et møte med et antigen in vivo.

Eksempel 44

Zalphall- ligandavhengig proliferasjon av B- celler stimulert med anti- CD40 eller anti- IgM

A. Rensing av humane B- celler

En ampulle som inneholdt 1 x IO<8>nedfrosne humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC-er), isolert ved aferese, ble hurtig opptint i et 37 °C vannbad og resuspendert i 25 ml B-cellemedium (RPMI 1640-medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 10 % varmeinaktivert føtalt, bovint serum, 5 % L-glutamin, 5 % Pen/Strep) (Gibco BRL)) i et 50 ml rør (Falcon, VWR Seattle, WA). Cellene ble analysert for levedyktighet ved anvendelse av trypanblått (Gibco BRL). 10 mlFicoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ) ble lagt under celle-suspens jonen, og prøven ble sentrifugert i 30 minutter ved 1800 rpm, og sentrifugen ble stanset uten bruk av brems. Grensesjiktet ble så tatt ut og overført til et nytt 50 ml falconrør, justert til et sluttvolum på 40 ml med PBS og sentrifugert i 10 minutter ved 1200 rpm med bremsen på. De isolerte cellenes levedyktighet ble igjen analysert ved anvendelse av trypanblått. Alternativt ble nytappet humant blod fortynnet 1:1 med PBS (Gibco BRL) og lagt over Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia), sentrifugert og vasket som ovenfor. Celler isolert fra friskt blod og nedsentrifugerte celler gav ekvivalente resultater.

B-celler ble isolert fra Ficoll-floterte celler fra perifert blod fra normale humane donorer (ovenfor) med magnetiske anti-CDl9-kuler (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), ifølge produsentens instruksjoner. Renheten av de resulterende preparatene ble undersøkt ved flowcytometrisk analyse med FITC-konjugert anti-CD22-antistoff (PharMingen, San Diego, CA). B-cellepreparatene var typisk > 90 % rene.

B. Rensing av muse- B- celler

En suspensjon av musesplenocytter ble fremstilt ved å rive milten fra voksne C57Bl/6-mus (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fra hverandre med bøyde nåler i B-cellemedium. RBC-er ble fjernet ved hypoton lysering. CD43-positive celler ble fjernet med magnetiske CD43-kuler (Miltenyi Biotec) ifølge produsentens instruksjoner. Renheten av de resulterende prepa rater ble målt ved flowcytometrisk analyse med FITC-konjugert anti-CD45R-antistoff (PharMingen). B-cellepreparatene var typisk

> 90 % rene.

C. Proliferasjon av anti- CD40- stimulerte B- celler i nærvær av zalphall- ligand fra menneske eller mus

B-cellene fra enten menneske eller mus ble resuspendert i en sluttkonsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml i B-cellemedium og utsådd med 100 ul/brønn i en 96-brønners plate med U-bunn (Falcon, VWR) inneholdende forskjellige stimulanter, slik at sluttvolumet ble 200 ul/brønn. For anti-CD40-stimulering ble humane kulturer tilsatt 1 ug/ml antihumant CD40 (Genzyme, Cambridge, MA), mens musekulturene ble tilsatt 1 ug/ml antimuse-CD40 (Serotec, UK). Zalphall-ligand fra menneske eller mus ble tilsatt i fortynninger i området fra 1 pg/ml til 100 ng/ml. Spesifisiteten av virkningen av zalphall-ligand ble bekreftet ved inhibering av zalphall-ligand med 25 mg/ml løselig human zalphall-CEE (eksempel 10A). Alle behandlinger ble utført i triplikat. Cellene ble så inkubert ved 37 °C i en fuktgjort inkubator i 120 timer (humane celler) eller 72 timer (museceller). 16 timer før høsting ble 1 uCi<3>H-tymidin (Amersham, Piscataway, NJ) tilsatt til alle brønner for måling av B-celleproliferasjonen. Cellene ble høstet på en 96-brønners filter-plate (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) ved anvendelse av en cellehøster (Packard) og oppsamlet ifølge produsentens instruksjoner. Platene ble tørket ved 55 °C i 20-30 minutter, og bunnen av brønnene ble forseglet med en ugjennomsiktig plate-forsegler. Hver brønn ble tilsatt 0,25 ml scintillasjonsvæske (Microscint-O, Packard), og platen ble analysert i en TopCount mikroplatescintillasjonsteller (Packard).

Inkubasjon med zalphall-ligand i konsentrasjoner på

3 ng/ml eller mer forsterket proliferasjonen indusert med løse-lig anti-CD40 på en doseavhengig måte opp til 30 ganger, både for muse-B-celler og humane B-celler. B-cellene fra mus og menneske responderte like godt på den tilsvarende zalphall-ligand. For begge arter var stimuleringen spesifikk for zalphall-ligand, siden den kunne reverseres ved nærvær av løselig zalphall-reseptor i kulturen.

D. Proliferasjon av anti- IgM- stimulerte B- celler i nærvær av zalphall- ligand fra menneske eller mus

B-cellene fra enten menneske eller mus, beskrevet ovenfor (eksempel 44A og eksempel 44B) ble utsådd som beskrevet ovenfor (eksempel 44C). For anti-IgM-stimulering av humane celler ble platene på forhånd belagt over natten med 10 mg/ml F (ab1)2-humant IgM-antistoff (Southern Biotech Associates, Birmingham, Alabama) og vasket med sterilt medium like før bruk. Kulturene ble tilsatt 0-10 ng/ml hu-rIL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN). For en anti-IgM-stimulering av museceller ble løse-lig anti-IgM (Biosource, Camarillo, CA) tilsatt til kulturene i en konsentrasjon på 10 mg/ml. For hver av de ovenfor beskrevne anti-IgM/IL-4-betingelsene ble zalphall-ligand fra menneske eller mus tilsatt i konsentrasjoner fra 1 pg/ml til 100 ng/ml, som beskrevet ovenfor. Spesifisiteten av virkningen av zalphall-ligand ble bekreftet ved inhibering med løselig human zalphall-reseptor, som beskrevet ovenfor (eksempel 44C). Alle behandlinger ble utført i triplikat. Cellene ble inkubert, merket med<3>H-tymidin, høstet og analysert som beskrevet i eksempel 44C.

Inkubering med zalphall-ligand i konsentrasjoner på 0,3 ng/ml eller mer inhiberte proliferasjonen som ble indusert med uløselig anti-IgM (mus) eller anti-IgM og IL-4 (humant) på en doseavhengig måte. Inhiberingen var spesifikk for zalphall-ligand, siden den kunne reverseres ved nærvær av løselig zalphall-reseptor i kulturen.

Eksempel 45

Ekspresjon av løselig human zalphall- reseptor i E . coli

A. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren pCZR225, som uttrykker hu- zalphal1/ MBP- 6H- fusj onspolypeptid

Et ekspresjonsplasmid som inneholdt et polynukleotid som kodet for en løselig human zalphall-reseptor fusjonert C-terminalt til maltosebindende protein (MBP), ble fremstilt med homolog rekombinasjon. Et fragment av humant zalphall-cDNA (SEQ ID NO: 7) ble isolert ved anvendelse av PCR. Polynukleotidsekvensen til det løselige MBP-zalphall-reseptorfusjonspoly-peptidet er vist i SEQ ID NO: 96. To primere ble anvendt for fremstilling av det humane zalphall-fragmentet i en PCR- reaksjon: (1) primer ZC 20 187 (SEQ ID NO: 98), inneholdende 40 bp av den flankerende vektorsekvens, og 25 bp tilsvarende aminoenden av human zalphall, og (2) primer ZC 20 185 (SEQ ID NO: 99), inneholdende 40 bp av 3'-enden tilsvarende den flankerende vektorsekvens, og 25 bp tilsvarende karboksylenden av human zalphall. PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 25 sykluser ved 94 °C i 3 0 sekunder, 50 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt; etterfulgt av oppbevaring ved 4 °C, kjørt i duplikat. 2 ul av PCR-reaksjonen på 100 ul ble kjørt på en 1,0 % agarosegel med 1 x TBE-buffer for analyse, og det forventede fragment på omtrent 660 bp kunne observeres. De gjenværende 90 ul av PCR-reaks jonen ble kombinert med det andre PCR-røret og utfelt med 400 ul absolutt etanol. Utfelt DNA ble anvendt for rekombinasjon i den Smal-kuttede mottakervektor pTAP98 (eksempel 31) for fremstilling av konstruksjonen som kodet for MBP-zalphall-fusjonen. Klonene ble transformert, identifisert og dyrket som beskrevet i eksempel 31. De positive klonene ble betegnet pCZR225 og sekvensert. Polynukleotidsekvensen til det løselige reseptorfusjons-polypeptid MBP-zalphall er vist i SEQ ID NO: 96, og den tilsvarende polypeptidsekvens er vist i SEQ ID NO: 97. De positive klonene ble dyrket i E. coli, som beskrevet i eksempel 34, for rensing av hu-zalphall/MBP-6H-fusjonsproteinet (eksempel 46 nedenfor).

Eksempel 46

Rensing av den løselige reseptor hu- zalphall/ MBP- 6H ved fermen-tering i E . coli

Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner ut-ført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av løselig hu-zalphall/MBP-6H-reseptorpolypeptid. E. coli-celler som inneholdt konstruksjonen pCZR225 og som uttrykte den løse-lige reseptor hu-zalphall/MBP-6H (eksempel 45), ble dyrket i "SuperBroth II" (12 g/l kasein, 24 g/l gjærekstrakt, 11,4 g/l kaliumfosfat, 1,7 g/l monokaliumfosfat; Becton Dickinson, Cockeysville, MD) og nedfrosset i 0,5 % glyserol. 20 g av de nedfrosne cellene i "SuperBroth II" + glyserol ble anvendt for rensing av proteinet. De nedfrosne cellene ble opptint og fortynnet 1:10 i en proteaseinhibitorløsning (ekstraksjonsbuffer) før lysering av cellene og frigjøring av det løselige hu-zalpha- ll/MBP-6H-reseptorprotein. De fortynnede cellene inneholdt sluttkonsentrasjoner på 20 mM Tris (JT Baker, Philipsburg, NJ), 100 mM natriumklorid (NaCl, Mallinckrodt, Paris, KY), 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 2 ug/ml leupeptin (Fluka, Sveits) og 2 ug/ml aprotinin (Sigma). Et French Press-celleoppbrytningssystem (Constant Systems Ltd. , Warwick, UK) med temperatur mellom -7 °C og -10 °C og et trykk på 207 000 kPa ble anvendt for lysering av cellene. De fortynnede cellene ble kontrollert for oppbrytning ved avlesning av A6oofør og etter behandlingen i French Press-instrumentet. De lyserte cellene ble sentrifugert ved 18 000 G i 45 minutter for fjerning av cellerester, og supernatanten ble anvendt for rensing av proteinet. Den totale målproteinkonsen-trasjon i supernatanten ble bestemt ved BCA-proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL) ifølge produsentens instruksjoner. En 25 ml kolonne med Talon-metallaffinitetsresin (Clontech, Palo Alto, CA) (fremstilt som beskrevet nedenfor) ble uthelt i en Bio-Rad-glasskolonne, 2,5 cm D x 10 cm H. Kolonnen ble pakket og ekvilibrert ved gravitet med 10 kolonnevolurner (CV) Talon-ekvilibreringsbuffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0). Supernatanten ble påsatt i én porsjon til Talon-metall-af f initetsresinet og ble vippet på et vippebrett over natten. Resinet ble helt tilbake i kolonnen og vasket med 10 CV Talon-ekvilibreringsbuf f er ved gravitetseluering, og så gravitets-eluert med 140 ml elueringsbuffer (Talon-ekvilibreringsbuffer + 2 00 mM imidazol, Fluka Chemical). Talon-kolonnen ble vasket med 5 CV 20 mM 2-(N-morfolino)etansulfonsyre, pH 5,0 (MES, Sigma) og 5 CV destillert H20, og så lagret i 20 % etanol/0,1 % natriumazid. Fraksjoner på 14 ml ble oppsamlet gjennom hele kromatografien, og fraksjonene ble analysert ved avlesning av absorbansen ved 280 og 320 nm og ved BCA-proteinanalyse. Ubundet materiale og vaskefraksjoner ble også oppsamlet og analysert. Proteinelueringsfraksjonene av interesse ble slått sammen og direkte påsatt en amyloseresin (New England Biolabs, Beverly,

MA) .

For erholdelse av renere hu-zalphall/MBP-6H-polypeptid ble de sammenslåtte Talon-affinitetsfraksjonene behandlet med amyloseresin (22 ml) ved pH 7,4. En 2,5 cm D x 10 cm H Bio-Rad-kolonne ble fylt, pakket og ekvilibrert i 10 CV med amylose ekvilibreringsbuffer - 20 mM Tris (JT Baker), 100 mM NaCl (Mallinckrodt), 1 mM PMSF (Sigma), 10 mM p-merkaptoetanol (BME, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH), pH 7,4. Prøven ble påsatt ved en gravitetsgjennomstrømningshastighet på 0,5 ml/minutt.Kolonnen ble vasket med 10 CV amyloseekvilibreringsbuffer og så eluert med ca. 2 CV amyloseekvilibreringsbuffer + 10 mM maltose (Fluka Biochemical, Sveis) ved gravitetseluering. Fraksjoner på 5 ml ble oppsamlet over hele kromatografien, og absorbansen ved 280 og 320 nm ble avlest. Amylosekolonnen ble regenerert med 1 CV destillert H20, 5 CV 0,1% (vekt/volum) SDS (Sigma), 5 CV destillert H20 og så 5 CV amyloseekvilibreringsbuffer.

Fraksjoner av interesse ble slått sammen og dialysert i en Slide-A-Lyzer (Pierce) med 4x41 PBS, pH 7,4 (Sigma) for fjerning av kontaminanter med lav molekylvekt, utbytting av bufferen og avsalting. Etter utbytting til PBS representerte det erholdte materialet det rensede hu-zalphall/MBP-6H-polypeptid. Det rensede hu-zalphall/MBP-6H-polypeptid ble analysert ved SDS-PAGE, Coomassie-farging og Western blot-analyse med HRP-konjugert kaninantistoff (Rockland, Gilbertsville, PA). Konsentrasjonen av hu-zalphall/MBP-6H-polypeptid var 1,92 mg/ml, bestemt ved BCA-analyse.

Renset hu-zalphall/MBP-6H-polypeptid ble forberedt for injeksjon i kaniner og sendt til R&R Research and Development (Stanwood, WA) for fremstilling av antistoff. Kaniner ble injisert til å produsere anti-anti-hu-zalphall/MBP-6H-serum (eksempel 47 nedenfor).

Eksempel 47

Polyklonale antistoffer mot zalphall- reseptor

Polyklonale antistoffer ble fremstilt ved å immunisere to New Zealand hvite hunnkaniner med renset hu-zalphall/MBP-6H-polypeptid (eksempel 46) eller den rensede rekombinante, løse-lige reseptor zalphall-CEE (eksempel 10A). De tilsvarende polyklonale antistoffene ble betegnet kaninanti-hu-zalphall/MBP-6H henholdsvis kaninanti-hu-zalphall-CEE-BHK. Kaninene ble hver gitt en innledende intraperitoneal (ip) injeksjon med 200 mg renset protein i komplett Freunds adjuvans (Pierce, Rockford, IL), etterfulgt av ip forsterkningsinjeksjoner med 100 mg renset protein i ukomplett Freunds adjuvans hver 3. uke. 7-10 dager etter tilførsel av den tredje forsterkningsinjeksjonen ble blod tappet og serum oppsamlet. Kaninene ble så gitt forsterkningsinjeksjoner og tappet for blod hver 3. uke.

De polyklonale zalphall-spesifikke antistoffene ble affinitetsrenset fra kaninserumet ved anvendelse av en CNBr-SEPHAROSE- 4B-proteinkolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg av det rensede hu-zalphall/MBP-6H-polypeptid (eksempel 32) pr. gram CNBr-SEPHAROSE, etterfulgt av 20 x dialyse mot PBS over natten. Zalphall-spesifikke antistoffer blekarakterisert veden ELISA-titeranalyse med 1 ug/ml av det tilhørende proteinantigen som antistoffmål. Den nedre deteksjonsgrense (LLD) for affinitetsrenset anti-hu-zalphall/MBP-6H-antistoff fra kanin er en fortynning på 500 pg/ml. LLD for affinitetsrenset anti-hu-zalphall-CEE-BHK-antistoff fra kanin er en fortynning på 50 pg/ml.

Eksempel 48

Fordelingen av zalphall- reseptor

For å analysere fordelingen av zalphall-reseptor i forskjellige celletyper frembrakte vi både polyklonale antistoffer fra kanin og monoklonale antistoffer (mAb-er) fra mus rettet mot den humane reseptor (eksempel 35 og eksempel 47) og konjugerte disse antistoffene til biotin for anvendelse i flowcytometri. Vi anvendte i utgangspunktet de polyklonale antistoffene, som hadde relativt lav affinitet for farging av et sett av cellelinjer: den IL-3-avhengige muse-pre-B-cellelinjen villtype-BaF3-celler (Palacios og Steinmetz, ibid. ; Mathey-Prevot et al., ibid.) ; BaF3-celler transfektert med human zalphall (eksempel 4); de humane Burkitts lymfom-cellelinjene Raji (ATCC nr. CCL-86); Ramos (ATCC nr. CRL-1596), RPMI 8226 (ATCC nr. CCL-155); og Daudi (ATCC nr. CCL-213); den humane T-celleleukemilinjen Jurkat (ATCC nr. TIB-152); de humane myelomonocyttiske leukemicelle-linjene Thp-1 (ATCC nr. TIB-202) og UT937 (ATCC nr. CRL-1593.2); de humane promyelomonocyttiske cellene HLT60 (ATCC nr. CCL-240); muse-B-cellelymfomlinjen A20 (ATCC nr. TIB-208); og tymomcelle-1injen EL4 (ATCC nr. TIB-39).

Cellene ble høstet og vasket én gang med FACS-vaskebuffer tilsatt serum (WBS). WBS består av Hanks balanserte salt-løsning (Gibco BRL) + 10 mM HEPES (Gibco BRL) + 1 % BSA (Sigma) + 10 % normalt geiteserum (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) + 10 % normalt kaninserum (Sigma). Vaskebufferen (WB) var identisk med WBS, bortsett fra at den var serumfri. Etter vask ble cellene resuspendert i 100 Ul WB tilsatt 10 ug/ml polyklonalt zalphall-antistoff fra kanin (eksempel 47). Cellene ble inkubert på is med antistoff i 20 minutter og så vasket med WB og resuspendert i WB tilsatt antikanin-FITC fra geit (Biosource, International), inkubert i ytterligere 20 minutter på is og så vasket og resuspendert i 400 ul WB for analyse i et FACSCalibur-flowcytometer (Becton Dickinson). Kontrollprøvene ble farget med det sekundære antikanin-FITC-antistoff fra geit alene. Positiv farging ble definert som en farging ut over fargingen oppnådd med sekundært antistoff alene. Selv om de polyklonale antistoffene hadde lav affinitet, påviste vi en sikker zalphall-ekspresjon på BaF3/zalphall-transfektanten, på alle de fire humane Burkitts lymfom-cellelinjene Raji, Ramos, Daudi og RPMI 822 6) og på Jurkat T-cellene. Hvilende (ikke-differensierte) HL-60-celler bandt ikke anti-zalphall-antistoffene, men vi påviste et positivt signal på HL-60-celler aktivert i 24 timer med PMA (Calbiochem, La Jolla, CA), som induserer differensiering av HL-60-cellene til en monocytt-lignende celle. Vi observerte også et positivt signal på UT937-og Thp-l-celler, selv om dette signalet kan skyldes uspesifikk binding. De polyklonale antistoffene kryssreagerte svakt på muse-B-cellelinjen A20, men vi observerte ingen farging av muse-tymomcellelinjen EL4.

De fire monoklonale zalphall-antistoffene (eksempel 35) ble konjugert til biotin, og en undergruppe av cellene beskrevet ovenfor ble analysert for ekspresjon av zalphall-reseptor (BaF3, BaF3/zalphall, Raji, Jurkat og hvilende HL-60). Cellene ble høstet og vasket og så resuspendert i 100 ul WB tilsatt 15 ug/ml av ett av de fire biotinylerte mAb-er. Cellene ble inkubert med mAb i 20 minutter på is, vasket med 1,5 ml WB og nedsentrifugert i en sentrifuge. Supernatanten ble fjernet ved avsugning, og de nedsentrifugerte celler ble resuspendert i 100 ul CyChrome-konjugert streptavidin (CyC-SA; PharMingen) og så inkubert på is i ytterligere 2 0 minutter og vasket og nedsentrifugert som tidligere. Kontrollrørene inneholdt celler som kun ble farget med CyC-SA. De nedsentrifugerte cellene ble resuspendert i

400 ul WP, og flowcytometrisk analyse ble utført som ovenfor. Positiv farging ble definert som et signal som var høyere enn bakgrunnsfargenivået oppnådd med CyC-SA alene. Ved anvendelse av BaF3/zalphall-transfektanten som kontroll kunne vi rangere de fire mAb-er ut fra deres respektive gjennomsnittlige fluor-escensintensitet (MFI), som kan reflektere antistoffets affinitet og/eller omfanget av biotinylering av mAb-ene. De fire mAb-ene ble rangert som følger, fra høyest til lavest MFI: 249.28.2.1.2.2; 247.10.2.15.4.6; 249.19.2.2.3.5; og 249.15.2.4.2.7. Raji-cellene gav positiv farge med de monoklonale zalphall-antistoffene. Jurkat-cellene ble farget positivt med de monoklonale zalphall-antistoffene, men ikke like kraftig som B-cellene (Raji). Zalphall-reseptoren ble således uttrykt på disse B- og T-cellelinjene. Fargingsmønsteret på ikke-aktiverte HL-60-celler var identisk for alle mAb-er, og signalet var svært svakt. Vi antar at dette signalet ikke representerer faktisk ekspresjon av zalphall ved HL-60-celler, men at det snarere skyldes uspesifikk binding av muse-mAb til de humane cellene, trolig via Fc-reseptorer.

Eksempel 49

Virkning av human zalphall- ligand på B- celler og fusjon mellom toksisk saporin og zalphall- ligand

Virkningene av human zalphall-ligand ble analysert på følgende humane B-cellelinjer, og de humane Burkitts lymfom-cellelinjene Raji (ATCC nr. CCL-86); og Ramos (ATCC nr. CRL-1596); den humane EBV-B-cellelymfomcellelinjen RPMI 1788 (ATCC nr. CRL-156); den humane myelom-/plasmacytomcellelinjen IM-9 (ATCC nr. CRL-159); og den humane EBV-transformerte B-cellelinjen DAKIKl (ATCC nr. TIB-206); og HS-Sultan-celler (ATCC nr. CRL-1484). Etter ca. 2-5 dagers behandling med zalphall-ligand ble endringer i overflatemarkørekspresjonen funnet for cellelinjene IM-9, Raji, Ramos og RPMI 1788, noe som viser at disse cellene kan respondere på zalphall-ligand. Humane B-cellelinjer behandlet med zalphall-ligand vokste mye langsommere enn ubehandlede celler ved gjenutsåing i vevsdyrkningsskåler. Disse cellene hadde også en forhøyet ekspresjon av FAS-ligand, målt ved flowcytometri (eksempel 49D og eksempel 49E), og moderat forhøyet sensitivitet overfor et aktiverende FAS-antistoff

(eksempel 49A). Disse resultatene tyder på at zalphall-ligand kan kontrollere noen typer av B-celleneoplasmer ved å indusere dem til differensiering til en mindre proliferativ og/eller mer FAS-ligandsensitiv tilstand. Videre uttrykkes zalphall-reseptor på overflaten av flere av disse cellelinjene (se eksempel 48). Således kan zalphall-ligand og det humane zalphall-ligand-saporin-immuntoksinkonjugat (eksempel 49B nedenfor) eller andre fusjoner mellom zalphall-ligand og toksiner anvendes terapeutisk ved B-celleleukemier og -lymfomer.

A. Virkningen av human zalphall- ligand på B- cellelinjer

IM-9-celler ble utsådd med ca. 50 000 celler pr. ml +/-50 ug/ml renset human zalphall-ligand (eksempel 29). Etter 3 dagers dyrkning ble cellene høstet, vasket og talt, og så utsådd på nytt ved ca. 2500 celler/ml i 96-brønners plater i brønner tilsatt 0, 0,033, 0,1 eller 0,33 ug/ml anti-FAS-antistoff (R&D Systems, Minneapolis). Etter 2 dager ble en Alamar Blue-fluorescensanalyse utført (eksempel 2B) for analyse av celleproliferasjonen.

Zalphall-ligandbehandlede IM-9-celler vokste til bare 27 % av tettheten av de ubehandlede cellene i fravær av anti-FAS-antistoff. I nærvær av 0,33 ug/ml anti-FAS-antistoff ble de zalphall-ligandbehandlede cellene inhibert med ytterligere 52 %, mens de ubehandlede cellene kun ble inhibert med 3 0 %. Den totale inhibering av celleveksten ved behandling med både zalphall-ligand og 0,33 ug/ml anti-FAS-antistoff var 86 %.

Dersom lM-9-cellene ble forbehandlet i 3 dager med eller uten zalphall-ligand og så utsådd med 100 celler pr. brønn og dyrket med eller uten anti-FAS-antistoff i 6 dager, ble veksten av de ubehandlede cellene, analysert ved Alamar Blue-analyse (eksempel 2B), inhibert med bare 25 % anti-FAS-anti-stof f, mens veksten av zalphall-ligandbehandlede celler ble inhibert med 95 % relativt til veksten av ubehandlede celler uten tilsetning av anti-FAS-antistoff.

B. Virkningen av human zalphall- ligand- saporin- immuntoksin på B- cellelinjer

Konstruksjon og rensing av human zalphall-ligand-saporin-immuntoksinkonjugat (zalphallL-sap) er beskrevet i eksempel 50. Det humane zalphallL-sap var mye mer aktivt enn saporin alene når det gjelder inhibering av cellevekst. Ved utsåing av de behandlede cellene etter 3-4 dagers behandling vokste de humane zalphallL-sap-behandlede cellene svært dårlig. IM-9-, Ramos- og K562-celler (ATCC nr. CCL-243) ble utsådd med ca. 2500 celler/brønn i 96-brønners skåler fra 0 til 250 ng/ml humant zalphallL-sap-konjugat eller 0-250 ng/ml saporin (Stirpe et al., Biotechnology, 10:405-412, 1992) alene som kontroll. Platene ble inkubert i 4 dager, hvoretter en Alamar Blue-proliferasjonsanalyse ble utført (eksempel 5B). Ved maksimal konsentrasjon av human zalphall-sap-konjugat ble veksten av IM-9-celler og Ramos-celler inhibert med 79 % henholdsvis 65 %. K562-celler som viser lav eller ingen ekspresjon av zalphall-reseptor ved flowcytometrisk analyse, ble ikke påvirket av zalphall-sap, noe som viser spesifisiteten av konju-gatets virkning. IM-9-celler ble utsådd med 50 000 celler/ml i 6-brønners plater med 0 eller 50 ng/ml human zalphallL-sap-konjugat. Etter 3 dager ble cellene høstet og talt, og så utsådd med fra 100 til 0,8 celler pr. brønn i to gangers seriefortynninger, og med 12 brønner pr. cellefortynning uten human zalphall-ligand- såpor in- immunt oks in. Etter 6 dager ble antall brønner med vekst for hver cellefortynning målt ved en Alamar Blue-proliferasjonsanalyse (eksempel 2B).

Ved analyse av celletallet ved Alamar Blue-analyse (eksempel 2B) etter 6 dagers vekst hadde kontrollcellene utsådd med ca. 12,5 og 6,25 celler pr. brønn ekvivalent vekst som zalphall-sap-behandlede celler utsådd med 100 henholdsvis 50 celler/brønn. Veksten av de overlevende behandlede IM-9-cellene var således markant svekket, selv etter fjerning av zalphall-sap-immuntoksinet ved ny utsåing.

Den begrensede vevsfordeling av den humane zalphall-reseptoren (eksempel 48) og spesifisiteten av virkningen av zalphall-sap for reseptoruttrykkende cellelinjer antyder at dette konjugatet kan tolereres in vivo.

C. Virkningen av human zalphall- ligand- saporin- immuntoksin på levedyktigheten til B- cellelinjer

HS-Sultan-celler (ATCC nr. CRL-1484) ble utsådd ved ca. 40 000 celler pr. ml i 12-brønners plater og dyrket i 5 dager, enten uten tilsatte cytokiner eller med 4,0 ng/ml renset human zalphall-ligand (eksempel 29) eller 25 ng/ml human zalphall-sap-konjugat (eksempel 50 nedenfor), eller med 20 ng/ml IFN-a (RDI) eller zalphall-ligand og IFN-a. Zalphall-ligand inhiberte opp-veksten av HS-Sultan-cellene med 63 %. IFN-a inhiberte veksten med 38 %. Zalphall-ligand pluss IFN-a inhiberte veksten med 78 %, noe som tyder på at den vekstinhiberende virkning av human zalphall-ligand og virkningen av IFN-a kan være additiv. Human zalphallL-sap inhiberte veksten av HS-Sultan-cellene med 92 %.

Resultatene ovenfor understøtter mulig anvendelse av zalphall-ligand eller human zalphallL-sap ved behandling av ondartede tilstander eller andre sykdommer i celler som uttrykker zalphall-reseptor, særlig sykdommer med opphav i B-celler. Kombinasjonen av zalphall-ligand og IFN-a antydes spesifikt av den additive virkning av disse to stoffer på inhibering av HS-Sultan-celler. Noen andre typer av lymfoide ondartede tilstander og sykdommer kan også føre til ekspresjon av zalphall-reseptoren, siden aktiverte T-celler også uttrykker reseptor-mRNA (eksempel 48), og noen av disse sykdommene kan også tenkes å respondere på zalphall-ligand eller behandling med fusjonsproteiner mellom zalphall-ligand og toksiske proteiner. D. FAS( CD95)- ekspresjon på humane B- cellelinjer forsterkes ved stimulering med human zalphall- ligand De humane B-cellelinjene HS-Sultan (ATCC nr. CRL-1484); IM-9 (ATCC nr. CRL-159); RPMI 8226 (ATCC nr. CCL-155); Ramos (ATCC nr. CRL-1596); DAKIKI (ATCC nr. TIB-206); og RPMI 1788 (ATCC nr. CRL-156) ble alle behandlet med eller uten renset 10-50 ng/ml renset human zalphall-ligand (eksempel 29) i 2-8 dager. Cellene ble så farget med PE-konjugert anti-CD95-antistoff (PharMingen, San Diego, CA) ifølge produsentens anbefalinger og analysert i et FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). For alle cellelinjene ble anti-CD95(FAS eller APO-1)-fargingen forsterket, i noen tilfeller mer enn to ganger, ved behandling med human zalphall-ligand.

E. FAS( CD95)- ekspresjon på primære musemilt- B- celler forsterkes ved stimulering med human zalphall- ligand

Primære musesplenocytter ble erholdt ved å kutte opp milten fra 8-12 uker gamle C57/BL6-mus. Erytrocyttene ble lysert ved behandling av preparatet i 5 sekunder med vann, etterfulgt av filtrering gjennom en 70 um sikt. De gjenværende splenocyt-tene ble vasket og utsådd i RPMI (JRH Bioscience) pluss 10 % HIA-FBS (Hyclone, Logan, UT). Interleukin 2 (IL-2) (R and D Systems) med eller uten human zalphall-ligand, som beskrevet ovenfor. De ble så inkubert ved 37 °C, 5 % CO2i 5 dager. Spleno-cyttene ble høstet og farget med PE-konjugert anti-CD95-antistoff (PharMingen) og FITC-konjugert anti-CDl9-antistoff (PharMingen) ifølge produsentens instruksjoner. Cellene ble analysert ved flowcytometri i et FACSCalibur (Becton Dickinson). Ved sortering av CDl9<+->muse-B-cellene ble det funnet at fargingen med anti-CD95 var forhøyet på B-celler behandlet med IL-2 pluss human zalphall-ligand, sammenlignet med cellene behandlet med IL-2 alene. Anti-CD95-fargingen var 37 relative fluorescens-enheter (RFU) på B-cellene behandlet med IL-2 alene og 55 RFU på B-cellene dyrket i IL-2 og human zalphall-ligand.

Eksempel 50

Konstruksjon og rensing av en toksisk zalphall- ligandfusjon

Under en leveransekontrakt ble 10 mg human zalphall-ligand (eksempel 29) sendt til Advanced Targeting Systems (ATS, San Diego, CA) for konjugering til plantetoksinet saporin (Stirpe et al., Biotechnology, 10:405-412, 1992). Zymogenetics mottok fra ATS 1,3 mg av et proteinkonjugat som bestod av 1,1 molekyler saporin pr. molekyl human zalphall-ligand, utformet ved en konsentrasjon på 1,14 mg/ml i 20 nM natriumfosfat, 3 00 nM natriumklorid, pH 7,2.

Eksempel 51

Toksisk zalphall- ligandfusjon in vivo

A. Analyse av zalphall- saporinkonjugat i mus

Zalphall-såporinkonjugat (eksempel 49) ble tilført til C57BL6-mus (hunner, 12 uker gamle, erholdt fra Taconic) i to forskjellige doser: 0,5 og 0,05 mg/kg. Injeksjonene ble gitt intravenøst i et bærerstoff bestående av 0,1 % BSA (ICN, Costa Mesa, CA). Tre injeksjoner ble gitt over et tidsrom på 1 uke (dagene 0, 2 og 7). Blodprøver ble tatt fra musene på dag 0 (før injeksjonen) og på dagene 2 og 8 (etter injeksjonen). Blodet ble oppsamlet i heparinbehandlede rør (Bectin Dickenson, Franklin Lakes, NJ), og celletallet ble bestemt ved anvendelse av en automatisk hematologianalysator (Abbot Cell-Dyn, modell nr. CD-3500CS, Abbot Park, IL). Dyrene ble avlivet og obdusert på dag 8 etter oppsamlingen av blod. Milt, brissel, lever, nyre og benmarg ble oppsamlet for histopatologisk analyse. Milt og brissel ble veid, og ytterligere en blodprøve ble oppsamlet i serum-separatorrør. Serum ble sendt til Pheonix Central Labs.,Everett, WA) for standard kjemisk analyse. Prøver ble også oppsamlet for flowcytometrisk analyse, som beskrevet heri.

Celletallet i sirkulerende blod og kjemisk analyse av serum gav ikke signifikante forskjeller mellom zalphall-konju-gatbehandlede mus og mus behandlet med en ekvivalent dose ikke-konjugert toksin (saporin). Histologisk analyse av vev i zalphall -saporinbehandlede mus viste ingen signifikante endringer, sammenlignet med mus behandlet med en ekvivalent dose ikke-konjugert toksin. Disse resultatene viste at såporinkonjugatet ikke var toksisk in vivo.

B. Analyse av toksisk zalphall- ligand- saporinfusjon på B-celleavledede tumorer in vivo

Virkningen av human zalphall-ligand og den toksiske fusjon mellom human zalphall-ligand og saporin (eksempel 50) på humane tumorceller er analysert in vivo ved anvendelse av en tumorxenotransplantatmodell i mus, beskrevet heri. Xenotransplantatmodellene analyseres i utgangspunktet ved anvendelse av cellelinjer utvalgt basert på eksperimenter in vi tro, f.eks. eksperimentene beskrevet i eksempel 49. Disse cellelinjene omfatter, men er ikke begrenset til, de humane Burkitts lymfom-cellelinjene Raji (ATCC nr. CCL-86) og Ramos (ATCC nr. CRL-1596); den humane cellelinjen RPMI 1788 (ATCC nr. CRL-156); den humane myelom-/plasmacytomcellelinjen IM-9 (ATCC nr. CRL-159); og den humane cellelinjen DAKIKl (ATCC nr. TIB-206); og HS-Sultan-celler (ATCC nr. CRL-1484). Celler avledet direkte fra humane tumorer kan også anvendes i denne modelltypen. På denne måten kan analyse av pasientprøver for sensitivitet overfor behandling med zalphall-ligand eller med en toksisk fusjon mellom zalphall-ligand og saporin anvendes for å utvelge optimale betingelser for anvendelse av zalphall i antitumorbehand-ling.

Etter valg av en egnet in vivo-xenotransplantatmodell, som beskrevet ovenfor, analyseres den zalphall-ligandinduserte aktivitet av naturlige dreperceller og/eller virkningen av zalphall-ligand på B-celleavledede tumorer in vivo. Human zalphall-ligand analyseres for evne til å frembringe cytotoksiske effektorceller (f.eks. NK-celler) med aktivitet mot B-celleavledede tumorer ved anvendelse av tumorxenotransplantat-modeller i mus, som beskrevet heri. Videre kan direkte virkninger av human zalphall-ligand på tumorer analyseres. Xenotransplantatmodellene som må fremstilles, utvelges som beskrevet ovenfor. En fremgangsmåte som anvender zalphall-11-ligandstimulerte humane celler, utvikles og analyseres for virkning når det gjelder fjerning av tumorceller og økt overlevelse av mus som inokuleres med cellelinjer eller primære tumorer.

Eksempel 52

Identifisering av kunstige Pl- kromosomkloner som inneholder genomisk human zalphall- ligand- DNA

Det humane zalphall-ligand-cDNA-innskudd ble amplifisert ved PCR med vektorbaserte primere. PCR-produktet ble32P-merket og hybridisert til filtre med høy tetthet, som representerte et PAC(P1 kunstig kromosom)-bibliotek. Filtre og nedfrosne bibliotekceller ble erholdt fra Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York; biblioteksegmentet var RPCI6 med fire gangers dekning. Filtrene ble hybridisert over natten ved 65 °C i Expresshyb (Clontech) og vasket ifølge produsentens anbefalinger. Avkoding av de positive signalene førte til identifisering av fire PAC-kloner betegnet 23H17, 34A9, 105G9 og 23 6H14. PCR-analyse ved anvendelse av primere spesifikke for 5'-enden (ZC 22 452 (SEQ ID NO: 100) og ZC 22 451 (SEQ ID NO: 101)) og 3'-enden (ZC 22 450 (SEQ ID NO: 102) ogZC 22 449 (SEQ ID

NO: 103)) av det kodende området viste at PAC 34A9, 105G9 inneholdt begge ender, mens PAC 23H17 og 236H14 kun inneholdt 5'- enden. PAC 23H17 ble kuttet med EcoRI og Noti, og et fragment på 9 kb som hybridiserte til zalphall-ligand-cDNA-proben, ble identifisert. Dette fragmentet ble isolert og subklonet ved anvendelse av fremgangsmåter beskrevet heri i pBluescript II SK(+)

(Stratagene), som på forhånd var kuttet med EcoRI og Noti. Sekvensering viste at dette fragmentet inneholdt ca. 380 basepar fra promoterområdet, eksonene 1, 2 og 3 samt intronene 1 og 2, og stoppet i intron 3.

3'-enden av det humane zalphall-ligandgen ble erholdt ved PCR med DNA fra PAC 34A9 som templat, med primerne ZC 23 771 (SEQ ID NO: 104) og ZC 22 449 (SEQ ID NO: 103). Taq-DNA-polymerase ble anvendt med bufferen levert med enzymet og tilsetning av 4 % DMSO. Reaksjonsbetingelsene var som følger: 94 °C i 5 minutter; etterfulgt av 35 sykluser ved 94 °C i 3 0 sekunder,

52 °C i 1 minutt og 72 °C i 3 minutter; etterfulgt av 72 °C i

7 minutter. Dette gav et fragment på 2,9 kb som inneholdt en del av ekson 3, hele intron 3 og intron 4, hele ekson 4 og den kodende del av ekson 5.

Den genomiske struktur av det humane zalphall-ligandgen er som følger fra 5'- til 3'-ende: SEQ ID NO: 105, inneholdende ca. 240 bp av promoteren, ekson 1 (nukleotid nr. 240-455 i SEQ ID NO: 105), intron 1 (nukleotid nr. 456-562 i SEQ ID NO: 105), ekson 2 (nukleotid nr. 563-598 i SEQ ID NO: 105), og en del av intron 2 som omfatter 748 basepar fra 5'-enden (nukleotid nr. 599-1347 i SEQ ID NO:105); et gap på ca. 3 kb, SEQ ID NO: 106, inneholdende 718 bp fra 3'-enden av intron 2, ekson 3 (nukleotid nr. 719-874 i SEQ ID NO: 106) og en del av 5'-enden av intron 3 (nukleotid nr. 875-1656 i SEQ ID NO:106); et gap på mindre enn ca. 800 bp, SEQ ID NO: 107, inneholdende 644 bp av intron 3; et gap på mindre enn 800 bp, og SEQ ID NO: 108, inneholdende 435 bp fra 3'-enden av intron 3, ekson 4 (nukleotid nr. 436-513 i SEQ ID NO: 108), intron 4 (nukleotid nr. 514-603 i SEQ ID NO: 108), og en del av 5'-enden av ekson 5 (nukleotid nr. 604-645 i SEQ ID NO: 108).

Eksempel 53

Bindingsanalyse av 125I- merket human zalphall- ligand i cellelinjer 25 ug renset human zalphall-ligand (eksempel 29) ble merket med 2 mCi<125>I ved anvendelse av Iodobeads (Pierce, Rockford, Illinois) ifølge produsentens instruksjoner. Dette merkede protein ble anvendt for analyse av binding av human zalphall-ligand til humane Raji-celler (ATCC nr. CCL-86), med binding til villtypemuse-BaF3-celler og BaF3-celler transfektert med zalphall-reseptor (BaF3/h-zalphall-celler) som kontroll-celler. Zalphall-ligandbinding til BaF3/h-zalphall-celler var forventet (positiv kontroll), mens ingen binding til villtype-BaF3-celler var forventet (negativ kontroll), basert på proli-ferasjonsanalyseresultater (eksempel 5). Ca. 5 x IO<5>Raji-celler/brønn, 1 x IO<6>BaF3/h-zalphall-celler og 1 x IO<6>BaF3-celler/brønn ble utsådd i 96-brønners plater. 10 ng/ml med merket human zalphall-ligand ble tilsatt i duplikat til brønnene, med en fortynningsserie av umerket human zalphall-ligand som konkurrent tilsatt fra 250 gangers molart overskudd i fortynninger på 1:4 ned til 0,061 gangers molart overskudd. Hvert punkt ble analysert i duplikat. Etter tilsetning av merket human zalphall-ligand til brønnene ble platene inkubert ved 4 °C i 2 timer for binding av ligand til cellene. Cellene ble så vasket 3 x bindingsbuffer (RPMI-1710 (JRH Bioscience) med 1 % BSA (Sigma) og analysert i analysert i gammatelleren COBRA II AUTO-GAMMA (Packard Instrument Company, Meriden, CT).

Binding av merket zalphall-ligand til cellene var åpenbar for Raji-cellene og BaF3/h-zalphall-cellene. For Raji-cellene reduserte i tillegg et 250 gangers molart overskudd av umerket zalphall-ligand bindingen tre ganger i nærvær av uspesifikk, umerket konkurrent (interferon-y fraR&DSystems, Minneapolis,MN) og 3,7 ganger relativt til bindingen uten konkurrent. Konkurranse ble observert på en doseavhengig måte for den spesifikke umerkede konkurrent, human zalphall-ligand. Binding av zalphall-ligand til Raji-cellene var således spesifikk. For den positive kontroll, BaF3/zalphall-cellene, reduserte på tilsvarende vis 250 gangers molart overskudd av umerket zalphall-ligand bindingen to ganger relativt til den uspesifikke konkurrent og 3,06 ganger relativt til binding uten konkurrent. Bindingen av zalphall-ligand til BaF3/zalphall-cellene var således også spesifikk. Ingen utkonkurrerbar binding ble observert med villtype-BaF3-celler. Zalphall-ligand ble således vist å bindes spesifikt til Raji-celler og til BaF3/h-zalphall-celler, men ikke til den negative kontroll, BaF3-celler.

Eksempel 54

Zalphall- reseptorekspresjon på humane blodceller

A. Fremstilling og dyrkning av humane celler fra perifert blod

Nytappet humant blod ble fortynnet 1:1 med PBS (Gibco BRL), lagt over Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ) og sentrifugert i 30 minutter ved 1800 rpm, og sentrifugen ble stanset uten bruk av brems. Grensesjiktet ble tatt ut og overført til et nytt 50 ml falconrør (Falcon, VWR Seattle, WA), justert til et sluttvolum på 40 ml med PBS og sentrifugert i 10 minutter ved 1200 rpm med bremsen på. De isolerte cellenes levedyktighet ble analysert ved anvendelse av trypanblått (Gibco BRL), og cellene ble resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 1 x 10<6>/ml i cellemedium (RPMI 1640-medium, 10 % varmeinaktivert føtalt, bovint serum, 5 % L-glutamin, 5 % Pen/Strep) (Gibco BRL).

Cellene ble dyrket i 6-brønners plater (Falcon, VWR) i 0, 4 eller 24 timer med en rekke forskjellige stimuli, som beskrevet nedenfor. Anti-IgM-, anti-CD40- og anti-CD3-stimuleringen ble utført som i eksempel 44 og eksempel 42. Forbolmyri-statacetat (PMA) og "Ionomycin" (Sigma, St. Louis, MO) (eksempel 5C) ble tilsatt til egnede brønner i en konsentrasjon på 10 ng/ml henholdsvis 0,5 mg/ml. Cellene ble inkubert ved 37 °C i en fuktgjort inkubator i forskjellige tidsrom.

B. Antistoffarging og analyse

Cellene ble oppsamlet fra platene, vasket og resuspendert i iskaldt fargemedium (HBSS, 1 % føtalt, bovint serum,

0,1 % natriumazid) i en konsentrasjon på ca. 10 millioner celler pr. ml. Blokkering av Fc-reseptoren og uspesifikk binding av antistoffer til cellene ble oppnådd ved å tilsette 10 % normalt geiteserum (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) og 10 % normalt

humant serum (ultraserum, Gemini) til cellesuspensjonen. Uttak av cellesuspensjonene ble blandet med et FITC-merket, monoklonalt antistoff mot en av cellelinjemarkørene CD3, CD19 eller CD14 (PharMingen, La Jolla, CA) og et biotinylert, monoklonalt antistoff mot human zalphall-reseptor (hu-zalphall) (eksempel 35).Fargingsspesifisiteten ble bestemt ved konkurranse, ved anvendelse av den løselige reseptor zalphall-CEE (eksempel 10A) i ti gangers masseoverskudd. Etter inkubering på is i 60 minutter ble cellene vasket to ganger med iskaldt fargemedium og resuspendert i 50 ml fargemedium tilsatt streptavidin-PE (Caltag, Burlingame, CA). Etter 30 minutters inkubering på is ble cellene vasket to ganger med iskald vaskebuffer (PBS, 1 % føtalt, bovint serum, 0,1 % natriumazid) og resuspendert i vaskebuffer tilsatt 1 mg/ml 7-AAD (MolecularProbes, Eugene, OR) som markør for levende celler. Flowcytometriresultater ble erholdt for levende celler ved anvendelse av et FACSCalibur flowcytometer (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Både oppsamling og analyse ble utført ved anvendelse av programvaren CellQuest (BD Immunocytometry Systems).

Resultatene av fargingen med anti-zalphall-antistoff viste at den humane zalphall-reseptor uttrykkes på celler fra humant perifert blod som uttrykker enten CD3, CD19 eller CD14. Fargingen på CD3- og CDl9-celler var spesifikk, som vist ved absolutt konkurranse med løselig zalphall-reseptor. Fargingen på CDl4-cellene viste en viss spesifisitet for liganden, vist ved delvis utkonkurrering med den løselige reseptor. Aktivering av T-cellene med anti-CD3 eller B-cellene med anti-CD40 førte til forhøyet nivå av zalphall på celleoverflaten etter 24 timer. Ingen økning i nivået av ekspresjonen av zalphall kunne observeres etter 4 timer for noen av cellepopulasjonene, uavhengig av stimuli. Cellene med zalphall-ligand førte til redusert zalpha-11-farging på CD3-positive og CDl9-positive celler, men ikke for CDl4-positive celler, både etter 4 og 24 timer.

Eksempel 55

Foreløpig evaluering av stabiliteten i vann av human zalphall-ligand

Foreløpige undersøkelser ble utført for å evaluere stabilitetsegenskapene i vann av human zalphall-ligand som en hjelp for bioprosessering, utforming og tilførsel in vivo. For-målene var: 1) å bekrefte stabilitet og gjenvinning fra Alzet-minipumper samt generell lagring og håndtering; 2) å bestemme stabiliteten ved anvendelse av flere analytiske fremgangsmåter, innbefattet kationbytter-HPLC (CX-HPLC), reversfase-HPLC (RP-HPLC), størrelseseksklusjons-HPLC (SEC-HPLC) samt bioanalyse (BaF3/zalphallR-proliferasjon) (se f.eks. eksempel 2 og eksempel 4); og 3) å bestemme de stabilitetsbegrensende degraderings-reaksjonsveiene og disses kinetiske parametere.

Uttak av renset human zalphall-ligand (eksempel 29) ble klargjort ved fortynning til 2 mg/ml i PBS (pH 7,4) og lagring i fryseampuller av polyetylen med lav tetthet (LDPE) (Nalgene,

1,8 ml) ved -80 °C (kontroll), 5 °C, 30 °C og 37 °C. Prøvene ble analysert med jevne mellomrom over et tidsrom på 29 dager ved CX-, RP- og SEC-HPLC og bioanalyse. Uttak ble også lagret ved

-80 °C og behandlet ved gjentatte fryse-tine(f/t)-sykluser

(-80 °C/RT; 5 x f/t, 10 x f/t). Gjenvinning av human zalphall-ligand ble bestemt relativt til -80 °C-kontrollen (1 f/t) for alle analyser.

Gjenværende løsning av human zalphall-ligand fra

-80 °C-kontrollprøvene ble nedfrosset på nytt (-80 °C) etter analyse. Dette uttak (2 f/t) ble anvendt for evaluering av varmestabilitet og konformasjonsstabilitet av human zalphall-ligand som funksjon av pH ved anvendelse av sirkulær dikroisme (CD). Løsningen med 2 mg/ml ble fortynnet til 100 ug/ml i PBS-buffere i området fra pH 3,3-8,8. CD-spekteret i det fjerne UV-området ble tatt opp over et temperaturområde fra 5 til 90 °C med 5 °C mellomrom (n =3/pH). CD-spektropolarimeteret som ble anvendt, var et Jasco 715 (Jasco, Easton, MD). Varmeindusert oppfolding ble fulgt ved å følge endringer i elliptisiteten ved 222 nm som funksjon av temperaturen. Estimater av Tm ble erholdt ved å anta en tostadiers utfoldingsmodell. Resultatene ble tilpasset (sigmoid) ved anvendelse av SlideWrite Plus for Windows v4.1 (Advanced Graphics Software; Encinitas, CA).

Gjenvinning og stabilitet fra Alzet-minipumper (modell nr. 1007D; ALZA Corporation, Mountain View, CA) ble analysert ved å fylle pumpene med 100 ul av 2 mg/ml løsning av human zalphall-ligand, plassering av pumpene i 1,8 ml LDPE tilsatt 1 ml PBS (pH 74) og lagring av dem ved 37 °C. Frigjør ing/g jen- vinning av human zalphall-ligand fra minipumpene ble analysert ved CX-, RP- og SEC-HPLC på dagene 2, 4 og 7. Aktiviteten ble målt ved bioanalyse på dag 7. Undersøkelsen var utformet for evaluering av frigjøring fra tre pumper pr. analysetidspunkt.

Kromatografiresultatene tydet på at CX- og SEC-HPLC-fremgangsmåtene var stabilitetsindikerende, mens RP-HPLC-fremgangsmåten ikke var det. Minst tre tilleggstopper som tydet på tilsynelatende degraderingsprodukter, ble observert ved CX-HPLC. SEC-HPLC-fremgangsmåten gav resolusjon av et tilsynelatende aggregat av human zalphall-ligand, som ble eluert før human zalphall-ligand. Imidlertid ble ingen signifikante topper som ble eluert etter human zalphall-ligandtoppen, observert. Dette tyder på at degraderingsproduktene observert ved CX-HPLC sannsynligvis er resultater av aminosyremodifiseringer som de-amidering, snarere enn hydrolyse-/proteolyseprosesser som fører til avkortede varianter. En liten grad av front-/haleeluering ble observert ved RP-HPLC (relativt til kontrollen) i prøver som ble vist å ha gjennomgått signifikant degradering ved SEC-&CX-HPLC. Tilsynelatende degraderingsprodukter ble imidlertid ikke resolvert ved RP-HPLC. Degraderingen observert ved CX-HPLC økte som funksjon av tid og temperatur og fulgte tilsynelatende førsteordens kinetikk. Prosentandelen av human zalphall-ligand gjenvunnet ved CX-HPLC etter 29 dager ved 37 °C, 3 0 °C og 5 °C var 39 %, 63 % henholdsvis 98 %. Aggregeringen økte også på en tid-temperaturavhengig måte. Prosentandelen av aggregat som ble funnet i preparater lagret i 29 dager ved 37 °C, 3 0 °C og 5 °C var 7,4, 3,4 henholdsvis under påvisningsgrensen (BDL). Ingen signifikante forskjeller ble observert ved bioanalyse i noen prøver, noe som tyder på at degraderingsproduktene har tilsvarende aktivitet som intakt human zalphall-ligand. Ingen degradering ble påvist ved noen av analysene for prøver behandlet med opptil 10 f/t-sykluser.

Frigjøring av human zalphall-ligand fra Alzet-minipumpene var i samsvar med det teoretisk forventede frigjorte volum. Dette tyder på at signifikant overflateadsorpsjon ikke vil svekke tilførsel av human zalphall-ligand ved anvendelse avAlzet-minipumpene fylt med en løsning med konsentrasjon på 2 mg/ml. En degradering som var i samsvar med den allerede angitte, ble observert. Prosent renhet bestemt ved CX-HPLC av

human zalphall-ligand frigjort etter 2, 4 og 7 dager var 96 %,

90 % henholdsvis 79 %. Det bør innses at degradering også skjer etter frigjøring av human zalphall-ligand til frigjøringsmediet eller fortynning med dette. Prosent renhet i minipumpen kan således være noe forskjellig fra prosent renhet bestemt i frigjør-ingsmediet. Bioaktiviteten til prøvene var i samsvar med den forventede mengde human zalphall-ligand frigjort fra minipumpene. CD-spekteret i det fjerne UV-området av human zalphall-ligand var som forventet i samsvar med interleukinspekteret, f.eks. spekteret for IL-3 (J. Biochem., 23:352-360, 1991), IL-4 (Biochemistry, 30:1259-1264, 1991) og IL-6-mutanter (Biochemistry, 35:11503-11511, 1996). Store endringer i CD-spekteret i det fjerne UV-området som funksjon av pH ble ikke observert. Resultatene viste at pH for maksimal varmestabilitet/konformasjonsstabilitet var ca. pH 7,4. Analyse av oppfoldingskurvene var basert på en tostadiers oppfoldingsmekanisme som tillot sammenligning av varmestabilitet/konformasjonsstabilitet som funksjon av pH/preparat. Det kan imidlertid foreligge ett eller flere intermediater under oppfoldingsprosessen, siden koopera-tiviteten var relativt lav basert på oppfoldingskurvens flathet. Selv om undersøkelsene ikke var spesifikt utformet for å fastslå hvorvidt human zalphall-ligand gjenfoldes etter varmeoppfolding ved 90 °C, tyder foreløpige resultater på at en i det minste delvis gjenfolding foregår etter at temperaturen i prøven er redusert til 20 °C.

Disse undersøkelsene tillater identifisering av et analytisk paradigme for evaluering av renheten og bekreftelse av stabiliteten av human zalphall-ligand. For eksempel kan SEC-HPLC anvendes for å karakterisere omfang av og dannelseshastighet av aggregater i vandig løsning. Likeså kan CX-HPLC anvendes for å karakterisere omfang og hastighet for degradering av human zalphall-ligand ved andre mekanismer enn aggregering. Bio-analysen kan anvendes for å bekrefte aktiviteten av human zalphall-ligand og de vandige degraderingsproduktene. For eksempel kan varianter av human zalphall-ligand som dannes i vandig løsning og resolveres ved CX-HPLC, i seg selv være anvendbare som terapeutiske midler, siden de har en tilsvarende bioaktivitet. Det faktum at human zalphall-ligand degraderes ved forskjellige prosesser (aggregering, aminosyremodifisering), tyder også på at det kan være nødvendig med et foretrukket eller unikt preparat som minimaliserer hastigheten for degraderings-prosessene for stabilitet over lang tid av et produkt i løsning. Identifisering av de vandige degraderingsproduktenes natur og bestemmelse av deres kinetiske parametere (pH, konsentrasjon, eksipienser) foregår nå. Stabiliteten av human zalphall-ligand i serum/plasma bestemmes for å understøtte utforming og tolking av undersøkelser in vivo.

Claims

1. Fusjonsprotein, karakterisert ved at det omfatter et første polypeptid og et andre polypeptid, hvori nevnte første polypeptid omfatter aminosyrerestene 32 til 162 ifølge SEQ ID NO: 2 .

2. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte andre polypeptid er valgt fra gruppen bestående av et immunglobulin og et toksin.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein ifølge kravene 1 eller 2, karakterisert ved at den omfatter å forbinde polypeptidkomponentene av fusjonsproteinet ved kjemisk konjugasjon.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein ifølge kravene 1 eller 2, karakterisert ved at den omfatter å uttrykke en enkelt polynukleotidkonstruksjon som koder for polypeptidkomponentene av fusjonsproteinet i riktig leseramme.

5. Definert cellekulturmedium, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid omfattende aminosyrerestene 32-162 ifølge SEQ ID NO:2.

6. Transgen mus, karakterisert ved at den er konstruert til å overutrykke et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 32-162 ifølge SEQ ID NO: 2.

7. Knock-out-mus, karakterisert ved at den er konstruert til å mangle et funksjonelt zalphall-ligandpolypeptid omfattende aminosyrerestene 18-146 ifølge SEQ ID NO: 55.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff mot et inokulert zalphall-polypeptid, karakterisert ved at den omfatter å isolere et antistoff fremkalt av det inokulerte polypeptidet, hvori polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av; a) et polypeptid bestående av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 72; b) et polypeptid bestående av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 73.

9. Antistoff, karakterisert ved at det binder spesifikt til et zalphall-ligandpolypeptid, hvori polypeptidet er valgt fra; a) et polypeptid bestående av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 72; b) et polypeptid bestående av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 73.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff mot et inokulert zalphall-polypeptid, karakterisert ved at den omfatter å isolere et antistoff fremkalt av det inokulerte polypeptidet, hvori polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av; a) isolert polypeptid minst 90% identisk med aminosyrerestene fra 41 (Gin) til 148 (Ile) som vist i SEQ ID NO: 2, hvori aminosyreresten ved posisjon 44 er Asp, aminosyreresten ved posisjon 47 er Asp og aminosyreresten ved posisjon 135 er Glu, hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115; b) isolert polypeptid minst 90% identisk med aminosyrerestene fra 32 (Gin) til 162 (Ser) som vist i SEQ ID NO: 2, hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115; c) isolert polypeptid minst 90% identisk med aminosyrerestene fra 41 (Gin) til 148 (Ile) som vist i SEQ ID NO: 2, hvori aminosyreresten ved posisjon 44 er Asp, aminosyreresten ved posisjon 47 er Asp og aminosyreresten ved posisjon 135 er Glu, hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115, og hvori aminosyrerestene 71, 78, 122 og 125 er cystein; d) isolert polypeptid minst 95% identisk med aminosyrerestene fra 41 (Gin) til 148 (Ile) som vist i SEQ ID NO: 2, hvori aminosyreresten ved posisjon 44 er Asp, aminosyreresten ved posisjon 47 er Asp og aminosyreresten ved posisjon 135 er Glu, hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115; e) isolert polypeptid hvori sekvensen av aminosyrerester er 100% identisk med SEQ ID NO: 2 fra aminosyrerestene 41 (Gin) til 148 (Ile); f) isolert polypeptid minst 95% identisk med aminosyrerestene fra 32 (Gin) til 162 (Ser) som vist i SEQ ID NO: 2, hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115; g) isolert polypeptid hvori sekvensen av aminosyrerester er som vist i SEQ ID NO: 2 fra aminosyrerest 32 (Gin) til aminosyrerest 162 (Ser), hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115; h) isolert polypeptid hvori sekvensen av aminosyrerester er som vist i SEQ ID NO: 2 fra aminosyrerest 1 (Met) til aminosyrerest 162 (Ser), hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115; i) isolert polypeptid hvori sekvensen av aminosyrerester er som vist i SEQ ID NO: 56 fra aminosyrerest 23 (Gin) til aminosyrerest 146 (Ser), hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115; j) isolert polypeptid hvori sekvensen av aminosyrerester er som vist i SEQ ID NO: 56 fra aminosyrerest 1 (Met) til aminosyrerest 146 (Ser), hvori polypeptidet binder en zalphall-reseptor som vist i SEQ ID NO: 115.

11. Antistoff, karakterisert ved at det spesifikt binder til et zalphall-ligandpolypeptid, hvori polypeptidet er valgt fra; a) polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 114 til aminosyre nr. 119; b) polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 114 til aminosyre nr. 119; c) polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 101 til aminosyre nr. 105; d) polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 113 til aminosyre nr. 118; e) polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 158 til aminosyre nr. 162.

12. In vitro-metode for å detektere en genetisk abnormitet hos en pasient, karakterisert ved at den omfatter; a) inkubere en genetisk prøve fra nevnte pasient med en zalphall-ligand-polynukleotidprobe eller primer omfattende en del av SEQ ID NO: 1, den komplementære tråden til SEQ ID NO: 1 eller RNA ekvivalent derav, hvori nevnte probe eller primer hybridiserer til komplementær polynukleotidsekvens, for å fremstille et første rekasjonsprodukt; og b) visualisere nevnte første reaksjonsprodukt; og c) sammenligne det visualiserte første reaksjonsproduktet med et andre kontroll-reaksjonsprodukt fra en genetisk kontrollprøve, hvori forskjell mellom det første reaksjonsproduktet og det andre kontrollproduktet er indikativ for genetisk abnormitet eller avvik hos nevnte pasient.

13. In vitro-metode for å detektere kreft hos en pasient, karakterisert ved at den omfatter; a) måle ekspresjon av zalphall-ligandpolypeptid i en celle-eller vevsprøve fra pasienten; og b) sammenligne ekspresjon av zalphall-ligandpolypeptid i pasientprøven med ekspresjon av zalphall-ligandpolypeptid i en celle- eller vevs-kontrollprøve, hvori redusert eller økt ekspresjon av zalphall-ligandpolypeptid i pasientprøven sammenlignet med kontrollprøven er indikativ for kreft hos pasienten.