NO303657B1

NO303657B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av en luminiscent forbindelse samt anvendelse av den fremstilte forbindelsen i en luminiscens-immunoanalyse for bestemmelse av et antigenisk stoff i en vµskepr°ve

Info

Publication number: NO303657B1
Application number: NO923800A
Authority: NO
Inventors: Tonio Kinkel; Peter Molz; Erwin Schmidt; Gerd Schnorr; Heinz Juergen Skrzipczyk
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-02-20
Filing date: 1992-09-30
Publication date: 1998-08-10
Also published as: NO923800L; NO923800D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en luminiscent forbindelse samt anvendelse av den fremstilte forbindelsen i en luminiscens-immunoanalyse for bestemmelse av et antigenisk stoff i en væskeprøve.

Luminiscerende forbindelser har allerede mangfoldige anvendelser. De anvendes som indikatorer i bioanalyser, enzymimmunoanalyser og luminiscens-immunoanalyser (kfr. W.P. Collins "Alternative Immunoassays", John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), men anvendes også i nukleinsyre-hybridi-seringsanalyser (kfr. J.A. Matthews et al., "Analytical Biochemistry", 151, 205-209, 1985). Videre anvendes kjemiluminiscerende forbindelser ved "flow injection analysis", i etter-kolonne-detektorer innenfor væskekromato-grafi, innenfor strømningsforskning og kunstige lyskilder.

Ved kjemiluminiscens-immunoanalyser har spesielt to struktur-typer av kjemiluminiscerende merkestoffer fått stor betydning. Det dreier seg på den ene siden om luminol- hhv. isoluminolderivatene som er beskrevet hos H.R. Schroeder et al., "Methods in Enzymology", Academic Press Inc., New York, bind LVII, 1978, 424 ff, samt i de britiske patentene 2 008 247 og 2 041 920, de tyske patentskriftene 26 18 419 og 26 18 511, samt i den europeiske patentpublikasjonen 135 071. En oversikt over den praktiske anvendelsen av isoluminolforbind-elsene som luminiscens-indikatorer finner man hos W.G. Wood, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 1984, 905-918.

På den annen side har også akridiniumesterforbindelser funnet anvendelse som kjemiluminiscerende merkestoff. Slike akridiniumestere er kjente fra US-PS 3 352 791, de britiske patentene 1 316 363 og 1 461 877, samt fra den europeiske patentpublikasjonen 82 636. Anvendelsen av akridiniumesteren som merkestoff innenfor immunanalyser er beskrevet av Weeks et al., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1474-1479. Også anvendelsen av fenantridiniumestere som merkestoff i luminiscens- immunoanalyser er allerede kjent fra den europeiske patentpublikasjonen 170 415.

Kjemiluminiscensen av akridiniumestere kan startes ved tilsats av alkalisk I^C^-oppløsning. Vedrørende mekanismen for kjemiluminiscens har F. McCapra, Acc. Chem. Res. 9, 201, 1976, gitt en overbevisende forklaring. Derav er det åpenbart at typen av avspaltbar gruppe er av avgjørende betydning, både for lyskvanteutbyttet og også for den hydrolytiske stabiliteten.

De allerede kjente akridiniumesterene har sammenlignet med luminol- og isoluminolforbindelser den fordelen at de gir et høyere lyskvanteutbytte, som heller ikke påvirkes av proteiner bundet til indikatoren (kfr. Weeks et al., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1474-1479).

Selv om de fra det europeiske patent 82 636 kjente akridiniumfenylesterene utmerker seg ved en høy påvisningsfølsomhet ved fremkalling av kjemiluminiscensen ved hjelp av milde oksydasjonsmidler, oppviser de forstyrrende ulemper for den praktiske anvendelsen. Først og fremst er fenylesterbin-dingen meget labil i vandige systemer, allerede ved romtemperatur. Hertil kommer at akridiniumfenylesteren under de der angitte oksydasjonsbetingelsene oppviser en lysemmissjon som først i stor grad er opphørt etter ca. 10 sekunder, dvs. i et omfang på over 95$. Sammenlignet med dette har andre, ikke isotopiske analysefremgangsmåter, langt kortere måletider og muliggjør dermed en høyere prøvegjennomgang.

Det er allerede foreslått å anvende kjemiluminiscerende akridiniumderivater som ved høyere lyskvanteutbytte oppviser en raskere reaksjonskinetikk og dermed kortere måletider for en luminiscens-immunoanalyse (kfr. tysk patentpublikasjon P 36 28 573.0). Det dreier seg derved om akridiniumderivater av formelen hvori RA er hydrogen, en alkyl-, alkenyl- eller alkinylrest med 1 til 10 karbonatomer, en benzyl- eller arylgruppe, R^ og R<c>er hydrogen, en alkylgruppe med 1 til 4 karbonatomer, en substituert eller usubstituert aminogruppe, en karboksy-, alkoksy-, cyano-, nitrogruppe eller halogen, RD utgjør en rest hvori en sulfonamidgruppe er bundet direkte via nitrogenet til karbonylgruppen, eller er en tioalkyl- eller tioarylrest av formelen

hvori Y er en forgrenet eller uforgrenet alifatisk eller en aromatisk gruppe, som også kan inneholde heteroaromater, og rE er en reaktiv gruppe som under skånende betingelser selektivt kan inngå en binding med amino-, karboksy-, tiol-eller andre funksjonelle grupper i stoffer av biologisk interesse, og AØ er et anion som ikke påvirker kjemiluminiscensen .

Det har nå vist seg at spesielle akridiniumderivater, p.g.a. sin fremragende stabilitet og uventet høye påvisningsfølsom-het, egner seg spesielt for anvendelse som kjemiluminiscerende forbindelser.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av en luminiscent forbindelse, kjennetegnet ved at et akridiniumderivat med formel I

hvori R<*>er metyl, ;R<* ogR<3>er hydrogen,

R<4>er en rest av formelen II eller III

hvori R° er suksinimidoyloksykarbonyl,

r<6>er fenyl, mono- eller disubstituert med alkyl eller alkoksy med 1 til 4 C-atomer, eller fenyl som inneholder en etylendioksysubstituent, eller fenyl som er substituert med N-metyl-morfolino-N-2-etoksy,

X er p-fenylalkylen, hvorved alkylenkj eden inneholder 1-4 C-atomer, direkte eller via et bromolekyl, bindes til et protein, et polypeptid eller til et annet stoff av biologisk interesse under dannelse av et stabilt, immunologisk aktivt konjugat.

Under stoffer av biologisk interesse forstås fremfor alt antigener. Under dette begrepet faller f.eks. hormoner, steroider, legemidler, legemiddelmetabolitter, toksiner, alkaloider og også antistoffer.

Som aminokarboksylsyrer egner seg f.eks. glycin, alanin, serin, fenylalanin, histidin, a-aminosmørsyre, metionin, valin, norvalin, leucin, iso-leucin, norleucin, asparagin-syre , glutaminsyre, 4-aminobenzosyre, 4-aminofenyleddiksyre , 4-aminofenoksyeddiksyre og 3-(4-amino)fenylpropionsyre.

Anioner som ikke påvirker kjemiluminiscensen kan f.eks. være et tetrafluorborat-, perklorat-, halogenid-, alkylsulfat-, halogensulfat-, alkylsulfonat- eller arylsulfonat-anion. Også et hvert annet anion kan anvendes, så fremt det ikke slukker eller svekker kjemiluminiscensen.

Videre har akridiniumderivater av formel VI vist seg spesielt egnede. Formel VI er

hvori X er en gruppe av formelen VII

med n = 2 eller 4

og R12 ogR13 er uavhengig av hverandre hydrogen, en alkylgruppe. Disse forbindelsene utgjør lett vannoppløslige produkter.

Det er overraskende, at på amidnitrogen sulfonyl-substituerte akridinium-9-karboksylsyreamider oppviser en utmerket kjemiluminiscens, idet det er kjent at akridinium-9-karbok-sylsyreamider i motsetning til akridinium-9-karboksyl-syreesterene ikke oppviser noen kjemiluminiscens (kfr. F. McCapra i W. Carruthers og J.K. Sutherland: "Progress in Organic Chem.", bind 8, 231-277, 1973, Butterworth, London).

En betydelig fordel ved akridiniumforbindelsene ifølge oppfinnelsen sammenlignet med de fra den europeiske patent-søknaden 82 636 kjente akridiniumfenylesterene ligger i den vesentlig raskere reaksjonskinetikken for lysemissjonen (kfr. P 36 28 573.0).

Et lignende resultat får man ved det tilsvarende forsøket ved 4°C. Figur 2 viser signalintensiteten etter lagring ved 4°C. Igjen viser traceren fremstilt fra forbindelse a) seg som betydelig mer stabil enn den som er fremstilt fra forbindelse

c).

For fremstilling av akridinium-sulfonamidderivatene ifølge

oppfinnelsen kan man gå ut fra akridin-9-karboksylsyreklorid (IX). For å fremstille dette omsettes f.eks. akridin ved den av Lehmstedt og Hundertmark i Ber. 63, 1229 (1930) angitte fremgangsmåte i etanol/iseddik med kaliumcyanid til 9-cyanakridin. Herav utvinnes, fortrinnsvis etter omkrystalli-sasjon, ved omsetning med svovelsyre og natriumnitrit tilsvarende fremgangsmåten beskrevet av Lehmstedt og Wirth i Ber. 61, 2044 (1928) akridin-9-karboksylsyren. Ved omsetning av akridin-9-karboksylsyren, f.eks. med tionylklorid oppnås forbindelsen av formel IX

hvori Y har betydningen klor. Istedet for et halogen kan i forbindelsen IX for Y også innføres en oksykarbonylalkyl-, oksykarbonylaryl- eller imidazolidgruppe. Syrekloridet (IX) lar seg deretter omsette med en beskyttet sulfonamidkarboksylsyre av formel X eller av formel XI

hvori X og R<6>har de ovenfor angitte betydningene og Z står for en rest som beskytter karboksylgruppen som senere avspaltes. Eksempelvis kan man for denne reaksjonen anvende N - ( 4 -benz ok sy karbonyl fenyl )-N-4-toluen sulf on syre am idet. Fordelaktig er anvendelsen av t-butylester, hvis beskyt-telsesgruppe kan innføres og igjen avspaltes, under spesielt skånsomme betingelser. Syren som oppstår etter avspaltningen av beskyttelsesgruppen kan deretter, med en egnet forbindelse, eksempelvis med N-hydroksysuksinimid, overføres til resten R^. Herav oppnås den kjemiluminiscerende akridinfor-bindelsen ved alkylering på nitrogen i 10-stilling.

De oppnådde akridiniumforbindelsene lar seg deretter omsette med et stoff av biologisk interesse, f.eks. et antigen, et antistoff, et hormon, et legemiddel, en legemiddelmetabolit, et toksin eller et alkaloid til en luminiscerende forbindelse. Derved bindes akridiniumderivatet enten direkte eller via et bromolekyl som f.eks. aminosyrer, oligo- eller polyaminosyrer, peptider eller syntetiske polymerer, til det biologisk interessante stoffet under dannelse av et stabilt, immunologisk aktivt konjugat. Dette konjugatet betegnes også som tracer og anvendes i de nedenfor omtalte luminiscens-immunoanalysene.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av minst en luminiscent forbindelse oppnådd som beskrevet ovenfor sammen med minst en immunologisk aktiv komponent immobilisert på en fast fase i en kompetitiv— eller en sandwich-fremgangsmåte for bestemmelse av et antigenisk stoff i en væskeprøve ved luminiscens-immunoanalyse.

Etter avslutning av immunreaksjonen og eventuelt påkrevede vasketrinn, utløses lysemissjonen ved suksessiv eller samtidig tilsats av en eller flere reagenser, hvorved minst en reagens inneholder et oksydasjonsmiddel i bundet eller ubundet form. Luminiscens-immunoanalysen kan så gjennomføres på forskjellige måter.

En mulighet består i at man inkuberer det med antigenet spesifikt reagerende immobiliserte antistoffet med en prøve av væsken som skal undersøkes og et konjugat av antigenet og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat (antigen-tracer), adskiller prøven og den ikke bundne traceren, bringer den bundne traceren sammen med nødvendige reagenser for å fremkalle en lysemmisjon, og deretter bestemmer mengden av det tilstedeværende antigenet fra den målte styrken av lysemmisj onen.

En annen mulighet for gjennomføringen av luminiscens-immunoanalyser består I at man inkuberer et med antigenet spesifikt reagerende immobilisert antistoff med en prøve av væsken som skal undersøkes med et konjugat av et andre, spesifikt reagerende antistoff og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat, adskiller prøven og det ikke bundne, merkede konjugatet, bringer det bundne, merkede konjugatet sammen med de nødvendige reagensene for å fremkalle en lysemissjon, og bestemmer mengden av det tilstedeværende antigenet fra den målte styrken av lysemissjonen.

De ovenfor nevnte luminiscens-immunoanalysene kan også gjennomføres på en slik måte at man før tilsatsen av det merkede konjugatet fraskiller væsken som skal undersøkes fra immobilisert antistoff.

En annen luminiscens-immunoanalyse som kan gjennomføres ifølge oppfinnelsen er ikke antistoffet, men derimot antigenet, immobilisert. Følgelig kan et med antistoffet spesifikt reagerende immobilisert antigen inkuberes med en prøve av væsken som skal undersøkes og en oppløsning av et konjugat av antistoffet og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat, deretter adskilles prøven og det ikke bundne, merkede konjugatet og deretter bringes det bundne, merkede konjugatet sammen med de nødvendige reagensene. Derved opptrer en lysemmisjon fra hvis styrke gjenspeiler mengden av det tilstedeværende antigenet som bestemmes.

En ytterligere variant består i at man immobiliserer et med antistoffet spesifikt reagerende, immobilisert antigen med en oppløsning av et konjugat av antistoffet og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat, fraskiller det ikke omsatte, merkede konjugatet, tilsetter en prøve av væsken som skal undersøkes, deretter igjen fraskiller prøven, bringer det bundne, merkede konjugatet sammen med de nødvendige reagensene for å fremkalle en lysemmisjon og fra denne deretter bestemme mengden av det tilstedeværende antigenet.

Endelig kan luminiscens-immunoanalysen også gjennomføres ved at man inkuberer et med antistoffet spesifikt reagerende, immobilisert antigen med en oppløsning av et konjugat av antistoffet og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat, tilsetter en prøve av væsken som skal undersøkes, fraskiller prøven og konjugatet som ikke er bundet, bringer det bundne, merkede konjugatet sammen med de nødvendige reagensene, og deretter, fra den målte lysemmisjonen, bestemmer mengden av det tilstedeværende antigenet.

Oppfinnelsen belyses nærmere ved hjelp av de etterfølgende eksemplene.

Eksempel 1: N-(4-metoksyfenyl)-N-[4-(2-benzyloksykarbonyletyl)benzensulfonyl]akridin-9-karboksylsyreamid (3) 17 g 4'-[N-(4-metoksyfenyl)sulfamido]-3-fenylpropionsyre-benzylester (1) i 400 ml diklormetan blandes med 460 mg 4-(N,N-dimetylamino)pyridin og 22,1 ml trietylamin, etter 10 minutter tilsettes det 11,12 g akridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (2) og det oppvarmes i 6 timer til tilbakeløp. Den avkjølte oppløsningen sammenrøres i kort tid med 2 N NaOH, den fraskilte organiske fasen vaskes med HgO, tørkes over magnesiumsulfat og inndampes. Resten renses ved søylekromatografi.

Utbytte: 60$. Smeltepunkt: 130-132°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,7-3,0 ppm (d, br, 2H), S = 3,0-3,3 ppm (d, br, 2H), S = 3,5 ppm (s, br, 3H), S = 5,1 ppm (s, 2H), S = 6,5 ppm (d, br, 2H), S = 7,1 ppm (d, br, 2H), § = 7,35 ppm (s, 5H), S = 7,5-8,3 ppm (m, 12H).

N-(4-metoksyf enyl)-N-[4-(2-karboksyetyl)benzensul f onyl]-akridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid (4)

6,3 g (3) oppvarmes i 30 ml 33% HBr/iseddik i 2 timer til 60"C, etter avkjøling tilsettes 60 ml diisopropyleter, bunnfallet frasuges og det tørkes i vakuum:

Utbytte: 90%. Smeltepunkt: dekomponering 237°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): S =2,7ppm (d, br, 2H), S = 3,1 ppm (d, br, 2H), S = 3,5 ppm (s, br, 3H) , S = 6,5 ppm (d, br, 2H), S = 7,0-8,4 ppm (m, 15H).

N- ( 4 -me tok sy f enyl )-N - [4 - ( 2-suksinimidoyloksykarbonyletyl )-benzensulfonyl]akridin-9-karboksylsyreamid (5)

3.1 g (4) 1 50 ml tetrahydrofuran blandes med 1,41 ml trietylamin, avkjøles til -20°C og blandes med 0,474 ml klormaursyreetylester. Det omrøres i 20 minutter, tilsettes 575 mg N-hydroksysuksinimid, omrøres i 3 timer ved -20°C og får over natten, under omrøring, oppvarmes til romtemperatur. Bunnfallet frasuges, filtratet inndampes, resten opptas i diklormetan eller etylacetat, den resulterende oppløsningen vaskes med vann, NaHCOQ-oppløsning og vann og tørkes over MgS04. Den organiske fasen inndampes og resten omkrystalliseres fra toluen.

Utbytte: 50%.

NMR (DMSO, 100 MHz) S = 2,8 ppm (s, 4H), 5 = 3,2 ppm (s, br, 4H), S = 3,5 ppm (s, br, 3H), S = 6,5 ppm (d, br, 2H), S = 7.2 ppm (d, br, 2H), S = 7,6-8,4 (m, 12H)

IR: 3400 cm-<1>(br), 3060, 2930, 1815 (w), 1780 (w), 1740 (s), 1690 (m), 1600 (w), 1510 (m), 1370 (m), 1250 (m), 1203 (m), 1175 (m).

N-( 4-metoksyf enyl )-N-[4-( 2-suksinimidoyloksykarbonyletyl )-benzensulfonyl] -10 -me ty 1 akr i dinium-9-karboksyl syreamid-fluorsulfonat (6)

1,27 g (5) i 60 ml diklormetan blandes ved -20° C med 0,4 ml metylfluorsulfonat. Det omrøres i 2 timer ved -20°C og opptines over natten til romtemperatur. Etter tilsats av toluen utfelles et gult faststoff som frasuges og tørkes i vakuum.

Utbytte: 80%.

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,9 ppm (s, 4H), S = 3,2 ppm (s, br, 4H), S = 3,5 ppm (s, br, 3H), S = 4,8 ppm (s, br, 3H), S = 6,5 ppm (br, 2H), 5 = 7,2 ppm (br, 2H), å = 7,6-9,0 ppm (m, 12H)

IR = 3400 cm-<1>(br), 3160, 2970, 1810 (w), 1785 (w), 1740 (s), 1695 (m), 1600 (w), 1555 (w), 1510 (m), 1370 (m), 1290 (m), 1250 (m), 1210 (m), 1170 (m)

Massespektrum: m/Z: 652 M<+>(kation)

Eksempel 2:

Fremstillingen av N-(4-metoksyfenyl)-N-[4-(4-suksinimidoyloksykarbonylbutyl )benzensulfonyl] -10-metylakridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfat (11) med utgangspunkt fra 4'-[N - ( 4-metoksyfenyl)sulfamido]-5-fenylvaleriansyrebenzylester (7) og akridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (2) foregår analogt syntesen av (6). Utbyttene av de enkelte syntesetrinnene, samt den spektroskopiske karakteriseringen, er angitt nedenfor.

N-( 4-metoksyfenyl )-N-[4-(4-benzyloksykarbonylbutyl )-benzensulfonyl]-akridin-9-karboksylsyreamid (8)

Utbytte: 40% seig olje, størkner delvis.

NMR (CDC13, 100 MHz): å = 2,85 (m, 4H), S = 2,45 ppm (t, br, 2H), S = 2,8 ppm (t, br, 2H), S = 3,5 ppm (s, 3H), S = 5,15 ppm (s, 2H), S = 6,3 ppm (d, 2H), S = 6,9 ppm (d, 2H), S = 7,3-8,3 ppm (m, 17H).

N-(4-metoksyfenyl)-N-[4-(4-karboksybutyl)benzensulfonyl]-akridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid (9)

Utbytte: 95%. Smeltepunkt: dekomponering 153-5°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 1,7 ppm (s, br, 4H) , 5 = 2,3 ppm (t, br, 2H), S = 2,8 ppm (s, br, 2H), S = 3,5 ppm (s, br, 3H), S = 6,5 ppm (br, 2H), S = 7,05 ppm (br, 2H), S = 7,5-8,5 ppm (m, 12H).

N- ( 4-metoksyf enyl )-N- [4 - (4-suksinimidoyloksykarbonylbutyl )-benzensulfonyl]akridin-9-karboksylsyreamid (10)

Utbytte: 25%. Smeltepunkt: dekomponering 75-80°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): 5 = 1,8 ppm (br, 4H), S = 2,3 ppm (s, 2H), S = 2,85 ppm (s, br, 6H), 5 = 3,5 ppm (s, br, 3H), S = 6,5 ppm (d, br, 2H), S = 7,05 ppm (d, br, 2H), S = 7,5-8,3 ppm (m, 12H).

N- ( 4-metoksyf enyl )-N- [ 4 - (4-suksinimidoyloksykarbonylbutyl )-benzensulfonyl]-10-metylakridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat (11)

Utbytte: 90%.

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 1,8 ppm (br, 4H) , S = 2,3 ppm (s, br, 2H), S = 2,8 ppm (s, br, 6H), S = 3,5 ppm (s, br, 3H), å =4,8ppm (br, 3H), S = 6,5 ppm (br, 2H), S = 7,05 ppm (br, 2H), S = 7,5-9,0 ppm (m, 12H).

IR: 3340 cm-<1>(br), 3060 (w), 2930 (m), 2870 (w), 1810 (w), 1785 (w), 1740 (s), 1695 (m), 1600 (w), 1550 (w), 1510 (m), 1460 (w), 1370 (m), 1290 (s), 1250 (s), 1205 (s), 1170 (s). Massespektrum: m/z = 680 M<+>(kation).

Eksempel 3:

Fremstillingen av N-(2,4-dimetoksyfenyl)-N-[4-(2-suksinimi-doyl ok sykarb onyl etyl )benzensulf onyl] -10-metyl-akr idinium-9-karboksylsyreamld-fluorsulfonat (16a) med utgangspunkt 1 4'-[N- ( 2 , 4-dimetoksyf enyl )-sulfamido] -3-fenylpropionsyrebenzyl-ester (12a) og akridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (2) foregår analogt syntesen av (6). Utbyttene i de enkelte syntesetrinnene, samt den spektroskop!ske karakteriseringen av angitt nedenfor.

N-(2,4-dimetoksyfenyl)-N-[4-(2-benzyloksykarbonyletyl )-benzensulfonyl]akridin-9-karboksylsyreamid (13a)

Utbytte: 50% Smeltepunkt: 74"C

NMR (DMSO, 100 MHz): S =2,9ppm (d, br, 2H), S = 3,1 ppm (d, br, 2H), S = 3,3 ppm (s, 3H), S = 3,4 ppm (s, 3H), S = 5,1 ppm (s, 2H), S = 5,9-6,2 ppm (m, 2H) , S = 7,0 ppm (d, 1H), S = 7,35 ppm (s, 5H), S = 7,5-8,2 ppm (m, 12H).

N-(2,4-dimetoksyf enyl)-N-(2-karboksyetyl ) benzensulf onyl] - akridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid (14a)

Utbytte: 95%

NMR (DMSO, 100 MHz): 5 = 2,75 ppm (d, br, 2H), S - 3,05 ppm (d, br, 2H), S = 3,3 ppm (s, 3H), S = 3,5 ppm (s, 3H), 5 = 5,95-6,3 ppm (m, 2H), S = 7,05 ppm (d, 1H), S = 7,6-8,6 ppm (m, 12H), S = 9,2 ppm (s, br, 2H).

N-(2 , 4 - dimetoksyfenyl)-N-[4-(suksinimidoyloksykarbonyletyl)-benzensulfonyl]akridin-9-karboksylsyreamid (15a)

Utbytte: 45% Smeltepunkt:~105°C, dekomponering

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,9 ppm (s, 4H), S - 3 ppm (br, 2H), S = 3,2 ppm (s, 3H) , S = 3,4 ppm (s, 3H), S = 5,9-6,3 ppm (m, 2H), 5 = 7,0 ppm (d, 1H), S = 7,5-8,4 ppm (m, 12H)

IR (KBr-presset prøve): 3440 cm-<1>(br), 3060 (w), 2930 (w), 2850 (w), 1815 (w), 1785 (w), 1740 (s), 1695 (m), 1600 (w), 1510 (m), 1460 (w), 1440 (w), 1365 (m), 1320 (w), 1290 (w), 1240 (m), 1210 (s), 1165 (m), 1085 (m).

N-(2,4-dimetoksyfenyl)-N-[4-(2-suksinimidoyloksykarbonyletyl)-benzensulfonyl]-10-metylakridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat (16a)

Utbytte: 80% Smeltepunkt:~135 0 C, dekomponering

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,9 ppm (s, 4H), S = 2,95-4,2 ppm (m, 10H), S = 4,8-5,0 ppm (s, s, 3H), 5 = 6,05-6,25 ppm (m, 1H), S = 7,6-9,0 ppm (m, 14H).

IR (KBR-presset prøve). 3430 cm-l (m), 1950 (w), 2870 (w), 2825 (w), 1810 (w), 1780 (m), 1750 (s), 1695 (m), 1610 (m), 1555 (w), 1510 (m), 1465 (m), 1380 (m), 1285 (m), 1250 (m), 1210 (s), 1170 (m).

Eksempel 4:

Syntesen av N-(3,4-etylendioksyfenyl)-N-[4-(2-suksinimidoyloksykarbonyletyl)benzensulfonyl] -10-metylakridinium-9-karboksylsyreamid-f luorsulfonat (16b) med utgangspunkt fra 4'-[N-(3 , 4-etyl end loksyfenyl ) sul famldo]-3-fenylpropion-syrebenzylester (12b) og akridin-9-karboksylsyrekloridhydro-klorid (2) foregår analogt eksempel 1. Utbyttene i de enkelte trinnene, samt den spektroskopiske karakteriseringen er angitt nedenfor.

N-(3,4-etylendioksyf enyl ) -N - [ 4 - ( 2-benzyloksykarbonyletyl )-benzensulfonyl]akridin-9-karboksylsyreamid (13b)

Utbytte: 50% Smeltepunkt: 91,5°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S =2,9ppm (d, br, 2H), S = 3,1 ppm (d, br, 2H), S = 4,0 ppm (s, br, 4H), S = 5,1 ppm (s, 2H), S = 6,3-6,8 ppm (m, 3H), S = 7,3 ppm (s, 5H), S = 7,6-8,3 ppm (m, 12H).

N - ( 3 , 4-etylendioksyf enyl )-N-[4-(2-karbonyloksyetyl )-benzensulf onyl] akr i din-9-karboksyl sy reamid-hydrob romi d (14b )

Utbytte: 95% Smeltepunkt: > 200'C

NMR (DMSO, 100. MHz): S = 2,7 ppm (m, 2H), S - 3,05 ppm (m, 2H), S = 4,0 ppm (s, br, 4H), S = 6,3-6,8 ppm (m, 3H), å = 7,5-8,6 ppm (m, 12H), S = 9,6 ppm (s, br, 2H).

N- ( 3 , 4-etylendioksyf enyl )-N- [4 - ( suks inimidoyloksykarbonyl-etyl )benzensulfonyl]akridin-9-karboksylsyreamid (15b )

Utbytte: 45% Smeltepunkt: 140°C, dekomponering

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,7-2,9 ppm (d, s, overlagret, 6H), S = 3,0 ppm (d, 2H), § = 4,0 ppm (s, br, 4H), S = 6,3-6,8 ppm (m, 3H), S = 7,5-8,4 (m, 12H).

IR (KBr-presset prøve): 3420 cm-<1>(br), 3060 (m), 2980 (m), 1930 (m), 1810 (w), 1790 (w), 1740 (m), 1695 (s), 1590 (m), 1460 (w), 1430 (w), 1410 (w), 1370 (m), 1300 (m), 1225 (s), 1175 (s).

N - ( 3 , 4-etylendioksyf enyl ) -N- [4- ( suksinimidoyloksykarbonyletyl )benzensulfonyl]-10-metylakridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat (16b)

Utbytte: 80% Smeltepunkt:~110°C, dekomponering

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 1,85 ppm (s, 4H), S = 3,0-3,3 ppm (s, s, br, 4H), S = 3,8-4,5 ppm (m, br, 4H), S = 4,75-5,1 ppm (s, br med skuldre, 3H), S = 6,3-9,0 ppm (m, 15H).

Eksempel 5: N-(4-karboksyfenyl)-4-toluensulfonsyreamid

Til en blanding av 252 g (3 mol) natriumhydrogenkarbonat og 139,1 g (1 mol) 4-aminobenzosyre i 2,5 1 vann tilsettes det dråpevis ved 20-30°C en oppløsning av 190,5 (1 mol) 4-toluensulfoklorid i 300 ml i-propyleter. Det omrøres kraftig i 2-4 timer inntil sulfokloridet er forbrukt. Den fraskilte vandige oppløsningen innstilles med konsentrert saltsyre på pH 1 og det utfelte produktet opptas i propylacetat. Ekstraktet vaskes 2 ganger med 2 N-saltsyre, 1 gang med vann, det tørkes over natriumsulfat og inndampes. Det oppnås 240 g/82,5% av teoretisk) N-(4-karboksyfenyl)-4-toluensulfon-syreamid.

<1>H-NMR (DMSO d6): S = 2,3 (s, CH3); 7,1 (d, aromat., 2H), 7,3 (d, aromat., 2H); 7,6-7,9 (m, aromat., 4H); 10,75 (bred); 12,7 (bred).

N-(4-benzyloksykarbonylfenyl)-4-toluensulfonsyreamid

En oppløsning av 11,64 g (40 mMol) N-(4-karboksyfenyl)-4-toluensulfonsyreamid, 5,06 g (40 mMol) benzylklorid, 5,20 g (44 mMol) di-i-propyl-etylamin i. 100 ml dimetylformamid oppvarmes i 4 timer til 140°C. Etter avsluttet reaksjon inndampes i vakuum, det opptas i propylacetat, vaskes 2 ganger med 2 N saltsyre, 2 ganger med mettet NaHC03-oppløs-ning, det tørkes over natriumsulfat og inndampes. Det oppnås 11,8 g (78% av teoretisk) N-(4-benzyloksykarbonylfenyl )-4-toluensulfonsyreamid, som omkrystalliseres fra metanol.

^H-NMR (DMSO d6): S = 2,3 (s, CH3); 5,3 (s, CH2); 7,1-7,3 (dd, 4 aromat., H); 7,4 (s, C6H5); 7,7-7,9 (dd, 4 aromat., H); 10,8 (bred, NH).

N-(4-benzyloksykarbonylfenyl)-N-(4-toluensulfonyl)-akridin-9-karboksylsyreamid

Til oppløsningen av 1,5 g (4 mMol) N-(4-benzyloksykarbonyl-fenyl)-4-toluensulfonsyreamid, 1,23 g (4,4 mMol) akridin-syreklorid-hydroklorid og 0,02 g dimetylaminopyridin i 20 ml vannfri tetrahydrofuran tilsettes det ved 25°C dråpevis 2,1 ml (15 mMol) trietylamin i 10 ml tetrahydrofuran. Temperatu-ren økes til 60°C.

Det utkrystalliserte produktet utrøres etter avsluttet reaksjon med metanol og omkrystalliseres fra etylacetat. Utbytte: 1,57 g (67,0% av teoretisk)

<1>H-NMR (CDC13): S = 2,5 (s, CH3); 5,2 (s, CH2) ; 7,3 (s, C6H5); 7,0-8,2 (m, 16 aromat., H).

N-(4-karboksyfenyl )-N-(4-toluensulfonyl)-akridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid

I, 17 g (2 mMol) N-(4-benzyloksykarbonylfenyl)-N-(4-toluensul-fonyl)-akridin-9-karboksylsyreamid oppvarmes med 10 ml 33% bromhydrogenid-iseddikoppløsning under omrøring i 4 timer til 60° C. Etter avkjøling suges bunnfallet av og tørkes i vakuum. Utbytte: 1,00 g (87% av teoretisk).

1-H-NMR (TFA): S = 2,6 (s, CH3) , 7,3-8,6 (m, 16 aromat., H); II, 65 (s, NH); MS: 496 (M<+>).

N-( 4-suksinimidoyloksykarbonylfenyl )-N-( 4-toluensulf onyl )-akridin-9-karboksylsyreamid

Til en oppløsning av 0,57 g (1 mMol) N-(4-karboksyfenyl)-N-(4-toluensulfonyl)-akridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid og 0,21 g (2 mMol) trietylamin i 25 ml vannfri tetrahydrofuran tilsettes det under omrøring ved -15 °C 0,11 g (1 mMol) klormaursyreetylester. Det omrøres i 1 time ved samme temperatur og tilsettes deretter 0,12 g (1 mMol) N-hydroksysuksinimid. Etter ytterligere 1 time får blandingen stå ved romtemperatur i 15 timer. Det inndampes i vakuum, opptas i etylacetat, utvaskes med vann, natriumhydrogenkarbonatopp-løsning og vann og tørkes over natriumsulf at. Etter inndamping oppnår man 0,42 g (70,8% av teoretisk) av det ønskede produktet.

^H-NMR (TFA): 5 = 2,6 (s, CH3), 3,1 (s, CH2-CH2), 7,0-8,6 (m, 16 aromat., H).

N-4-suks inimidoyloksykarbonylfenyl)-N-(4-toluensulfonyl)-10-metylakridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat.

Til en oppløsning av 0,59 g (1 mMol) N-4-suksinimidoyloksykarbonylfenyl)-N-(4-toluensulfonyl)-akridin-9-karboksylsyreamid i 30 ml 1,2-dikloretan tilsettes det under omrøring ved 25 °C 0,85 g (7,5 mMol) f luorsulf onsyremetylester. Reaksjonsproduktet utfelles i løpet av 4 timer. Etter frasuging og tørking oppnår man 0,43 g (60,8% av teoretisk) av det ønskede produktet.

H-NMR (TFA): S = 2,6 (s, Ar-CH3), 3,1 (s, CH2-CH2), 4,9 (s, N-CH3), 7,3-8,8 (m, 16 arom., H).

Eksempel 6:

På samme måte som i eksempel 5 oppnår man fra N-(4-karboksymetylfenyl)-4-toluen-sulfonsyreamid, N- ( 4-suksinimidoyloksykarbonylmetylfenyl)-N-(4-toluensul-fonyl )-10-metylakridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat.

N-(4-karboksymetylfenyl )-4-toluensulfonsyreamid

H-NMR (DMSO): S = 2,3 (s, CH3) , 3,5 (s, CH2), 7,0 (AB, C5H4), 7,3-7,6 (AB,<C>6H4), 10,2 (s, NH).

N-(4-benzyloksykarbonyImetylfenyl)-4-toluensulfonsyreamid Utbytte: 35% av teoretisk.

<1>H-NMR (DMSO): S = 2,3 (s, CH3), 3,6 (s, C0CH2), 5,1 (s, 0CH2), 6,9-7,7 (m, 13 aromat., H), 10,2 (s, NH).

N- ( 4-benzyloksykarbonyImetylfenyl)-N-(4-toluensulfonyl)-akridin-9-karboksylsyreamid

Utbytte: 35% av teoretisk.

<1->H-NMR (CDCH3): S = 2,55 (s, CH3) , 3,3 (s, C0CH2) , 5,0 (s, 0- CH2), 6,7-8,2 (m, 21 aromat., H).

N - ( 4-karboksymetylfenyl)-N-(4-toluensulfonyl)-akridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid

Utbytte: 95% av teoretisk.

1- H-NMR (TFA): S = 2,65 (s, CH3) , 3,55 (s, CH2), 6,8-8,6 (m, 16 aromat., H).

N-( 4-suksinimidoyloksykarbonyImetylfenyl)-N-(4-toluensul-fonyl )-akridin-9-karboksylsyreamid

Utbytte: 71% av teoretisk.

^H-NMR (TFA): S = 2,65 (s, toluen-CH3), 3,0 (s, CH2-CH2), 3,6 (bred, C0CH2), 6,9-8,5 (m, aromat).

N - ( 4-suks inimidoyloksykarbonyImetyl f enyl ) -N-(4-toluensul-fonyl )-10-metylakridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat Utbytte: 80% av teoretisk.

1-H-NMR (TFA"): S = 2,6 (s, toluen-CH3), 2,9 (s, CH2-CH2 ) , 3,6 (bred, C0CH2), 4,9 (s, N-CH3), 6,8-8,9 (m, aromat).

Eksempel 7

På samme måte som 1 eksempel 5 får man fra

N-[4-(2-karboksyetyl)-fenyl]-4-toluensulfonsyreamid, N-[4-( 2-suksinimidoyloksykarbonyletyl)-fenyl] -N-(4-toluensul-fonyl)-10-metyl-akridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat.

N-[4-(2-karboksyetyl)-fenyl]-4-toluensulfonsyreamid

Utbytte: 44% av teoretisk.

1-H-NMR (DMSO): S = 2,3 (s, CH3) , 2,4-2,8 (m, CH2-CH2), 7,0 (AB, 4H), 7,2-7,8 (AB, 4H), 10,1 (s, NH).

N-[4-(2-benzyloksykarbonyletyl)-fenyl]-4-toluensulfonsyreamid Utbytte: 78% av teoretisk.

^H-NMR (CDC13): 5 = 2,35 (s, CH3), 2,4-3,0 (m, CH2-CH2), 5,1 (s, 0-CH2), 7,0-7,8 (13 aromat., H, NH).

N-[4-( 2-benzyloksykarbonyletyl)-fenyl]-N-(4-toluensulfonyl )-akridin-9-karboksylsyreamid

Utbytte: 77% av teoretisk.

1-H-NMR (CDC13): S = 2,2-2,8 (m, 7H); 5,0 (s, CH2), 6,65-7,0 (AB, 4 aromat., H), 7,3-8,3 (m, 17 aromat., H).

N-[4-(2-karboksyetyl)-fenyl]-N-(4-toluensulfonyl1)-akridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid

Utbytte: 65% av teoretisk.

<!>h-NMR (CD30D): S = 2,1-2,8 (m, CH2-CH2), 2,5 (s, CH3), 6,7-8,5 (16 aromat., H).

N-(4-(2-suksinimidoyloksykarbonyletyl)-fenyl)-N-(4-toluensul-fonyl)-akridin-9-karboksylsyreamid

Utbytte: 90% av teoretisk.

1-H-NMR (CDClg): S = 2,6 (s, CH3), 2,7 (bred, CH2-CH2), 2,8 (s, CH2-CH2), 6,6-8,3 (16 aromat., H).

N-[4-(2-sukslnimidoyloksykarbony1etyl)-fenyl]-N-(4-toluensul-fonyl )-10-metyl-akridlnlum-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat Utbytte: 84% av teoretisk.

<1->H-NMR (TFA): 5 = 2,6 (s, CH3), 2,3-3,3 (bred bakgrunn, 11H, s, 3, 1), 4,9 (s, N-CH3), 6,7-8,8 (16 aromat., H).

Eksempel 7a:

På tilsvarende måte som i de foregående eksemplene oppnår man N-[4 - (N-metylmorfolino-N-2-etoksy)-fenyl]-N-[4-(2-suksinimi-doyl-karboksyetyl ) -fenylsulfonyl]-10-metylakridin-9-karboksylsyreamid-diium-di-fluorsulfonat. Avvikende fremgangsmåte-trinn er angitt i de følgende reaksjonstrinnene.

(4-klorsulfonyl)-2-fenylpropionsyre-tert.butylester

25 g (0,1 mol) (4-klorsulfonyl)-2-fenylpropionsyre, 12 ml tert.butanol, 60 ml i-buten og 3 ml konsentrert svovelsyre blandes ved -15°C og omrøres intenst i en autoklav ved romtemperatur i 24 timer. Den på nytt til -15°C avkjølte reaksjonsblandingen innrøres i overskudd natriumhydrogenkar-bonatoppløsning, ekstraheres med metylenklorid og inndampes til sist under vakuum.

Utbytte: 20,4 g (67% av teoretisk). Produktet omkrystalliseres fra heksan. l-H-NMR (CDC13): S = 1,4 (s), 2,6 (m), 3,0 (t), 7,4 (m), 7,95

(m).

m

MS: - = 305 (M<+>H).

2

(4-klorsulfonyl)-2-fenylpropionsyre ble fremstilt på kjent måte fra 2-fenylpropionsyre og klorsulfonsyre.

4-(morfolino-N-2-etoksy)anilin

25 g (0,1 M) 4-(morfolino-N-2-etoksy)-nitrobenzen kokes med 75 g tinngranulat i 400 ml halvkonsentrert saltsyre i 4 timer under tilbakeløp. Etter avkjøling helles i 400 ml 33% saltsyre, ekstraheres med i-propyleter og den organiske fasen inndampes etter tørking. Det oppnås 20 g (90% av teoretisk) av det ønskede produktet.

H-NMR (CDC13): S = 2,5 (t), 2,7 (t), 3,5 (bred), 3,7 (t), 4,0 (t), 6,6 (m)

m

MS: - = 222 (M<+>)

2

Det samme produktet oppnår man ved hydrering av nitroforbindelsen i metanol over palladium-kull.

Nitroforbindelsen ble fremstilt ifølge Bull. Soc. chim. France 1955, 1353-62.

N- [4-(morfolino-N-2-etoksy)-fenyl]-N-[4-(2-t-butoksykar-bonyletyl )-fenylsulfonamid]

Den klare oppløsningen av 9,3 g (30 mMol) 4-klorsulfonyl-fenyl-propionsyre-t-butylester, 6,9 g 4-(morfolino-N-2-etoksy)-anilin og 0,3 g dimetylaminopyridin i 150 ml metylenklorid vaskes etter 10 timers henstand ved romtemperatur med mettet natriumhydrogenkarbonatoppløsning, inndampes til en tredjedel og kromatograferes over en giselgursøyle med en blanding av 90% metylenklorid og 10% metanol. Hovedfraksjonen av eluatet inndampes.

Utbytte: 9 g (61,2% av teoretisk)

H-NMR (CDCI3): S = 1,35 (s), 2,5 (m), 2,7-3,0 (m), 3,7 (m), 4,0 (t), 6,7-7,0 (m), 7,2-7,7 (m)

m

MS: - = 491 (M<+>H)

2

N- [ 4-(morfolino-N-2-etoksy)-fenyl]-N-[4-(2-t-butoksykar-bonyletyl)-fenylsulfonyl]-9-akridlnkarboksylsyreamid

En oppløsning av 2,0 g (4,1 mMol) N-[4-(morfolino-N-2-e tok sy)-f enyl]-N-[4-(2-t-butoksykarbonyletyl)-fenyl-sul-fonamid] i 50 ml metylenklorid blandes under kraftig omrøring trinnsvis med 50 ml 33% natronlut, 30 mg dimetylaminopyridin, 1.2 g tetrabutylammoniumklorid og 1,55 g (5,6 mMol) 9-akridinkarboksylsyrekloridhydroklorid. Etter 6 timer fraskilles den organiske fasen, utvaskes med vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes.

Utbytte: 2,8 g (98% av teoretisk)

<1->H-NMR (CDC13): S = 1,4 (s)=, 2,3-2,5 (m), 2,5-2,8 (m), 3,0-3.3 (t), 3,6-3,9 (m), 6,3 (d), 6,9 (d), 7,4-8,3 (m).

m

MS: 695 (M<+>)

2

N-[4-(morfolino-N-2-etoksy )-fenyl]-N-[4-(2-karboksyetyl )-fenylsulfonyl]-9-akridinkarboksylsyreamid

0,7 g (1 mMol) N-[4-morfolino-2-etoksy)-fenyl]-N-[4-(2-t-butoksykarbonyletyl )-fenyl sulf onyl] - 9-akridinkarboksyl-syreamid oppløses i 5 ml trifluoreddiksyre og får stå over natten ved romtemperatur. Det inndampes ved hjelp av vannstrålepumpe, oppløses i vann og den filtrerte oppløsnin-gen innstilles med natriumacetat på pH 4. Det dannede produktet ekstraheres med metylenklorid, tørkes over natriumsulfat og inndampes.

Utbytte: 0,6 g (94% av teoretisk).

H-NMR (DMSO): S = 2,6-3,0 (m), 3,0-3,3 (m), 3,6-4,0 (m), 4,0-4,4 (m), 5,8-6,6 (m), 6,8-7,0 (m), 7,3-8,4 (m).

m

MS: - = 639 (M<+>)

2

N-[4-(morfolino-N-2-etoksy )-fenyl]-N-[4-(2-suksinimidoylkar-boksyetyl)-fenylsulfonyl]-9-akridinkarboksylsyreamid Utbytte: 95% av teoretisk.

^H-NMR (CDCI3): S = 2,3-2,7 (m), 2,8 (s), 2,9-3,4 (m), 3,5-3,9 (m), 3,9-4,3 (m), 6,2-7,0 (m), 7,3-8,3 (m).

MS: 736 (M<+>).

N-[4-(N-metylmorfol i no-N-2-et ok sy )-f enyl] -N-[4-( 2-suksini-midoyl-karboksyetyl )-f enyl-sulf onyl] -10-metylakridin-9-karboksylsyreamidiium-di-fluorsulfonat

Utbytte: 84% av teoretisk.

Forbindelsen er med klar gul farge klart vannoppløslig.

1-H-NMR (DMSO): S - 2,85 (s), 3,1 (s), 3,2-4,4 (m), 4,75 (s), 6,4-8,3 (m).

Eksempel 8

Tracer-fremstilling for TSH-kjemiluminiscens-immunoanalysen.

91 ul antistoff (100 ug), 20 pl av det ifølge eksempel 1 fremstilte akridiniumderivatet (forbindelse (6)) (1 mg/ml i acetonitril og 600 ul konjugasjonsbuffer (0,01 M fosfat, pH 8,0) inkuberes i 15 minutter. Deretter tilsettes 200 ul-lysin (10 mg/ml i konjugasjonsbuffer) og det inkuberes i ytterligere 15 minutter. Denne blandingen anbringes på en PD 10-søyle ("Sephadex" G 25 Medium, (kuleformig tverrbundet dekstrangel, fa. Pharmacia, Sverige)), og elueres med 0,1 M fosfat, (pH 6,3 som elueringsmiddel). 10 dråper/fraksjon samles. De enkelte fraksjonene undersøkes etter egnet fortynning vedrørende kjemiluminiscensaktiviteten (350 yl oksydasjonsmiddel: 0,1% H202i 0,1 N NaOH). Tracerfraksjonen (1. aktivitetstopp) "samles" og lagres ved 4°C. Den bruksferdige traceren for h-TSH-kjemiluminiscens-immunoanalysen fremstilles ved egnet fortynning med en fosfatbuffer (0,1 M fosfat, pH 6,3, 1% "Tween 20" (polyetylensorbitanmonolau- rat, fa. f.eks. ICI American Inc., USA), 0,1% okseserumal-bumin, 0,1 M NaCl, 0,01% NaN3 ).

Eksempel 9

Gjennomføring av h-TSH-kjemiluminiscens-immunoanalysen.

50 ul standard/prøve og 200 pl tracer ble ristet i 2 timer ved romtemperatur i et rør belagt med monoklonalt anti-TSH-antistoff. Deretter vaskes det 3 ganger med 1 ml buffer, hhv. destillert vann. Lysemissjonen foregår ved tilsats av i et hvert tilfelle 300 pl aktiveringsreagens (pH 1-buffer, 0,5% H202og 300 pl startreagens, 0,2 N NaOH) over 2 dispensorer i luminometere inn i røret. Måletiden utgjør 1 sekund.

Figur 3 viser det typiske forløpet for en standardkurve for en immuno-kjemiluminometrisk analyse (ICMA) for det humane thyreoid-stimulerende hormonet (h-TSH).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en luminiscent forbindelse,karakterisert vedat et akridiniumderivat av formel I

hvori R<1>er metyl, R2 ogR<3>er hydrogen, R<4>er en rest av formelen II eller III

hvori r<5>er suksinimidoyloksykarbonyl, r<6>er fenyl, mono- eller disubstituert med alkyl eller alkoksy med 1 til 4 C-atomer, eller fenyl som inneholder en etylendioksysubstituent, eller fenyl som er substituert med N-metyl-morfolino-N-2-etoksy, X er p-fenylalkylen, hvorved alkylenkjeden inneholder 1-4 C-atomer, direkte eller via et bromolekyl, bindes til et protein, et polypeptid eller til et annet stoff av biologisk interesse under dannelse av et stabilt, immunologisk aktivt konjugat.

2. Anvendelse av minst en luminiscent forbindelse oppnådd ifølge krav 1 sammen med minst en immunologisk aktiv komponent immobilisert på en fast fase i en kompetitiv— eller en sandwich-fremgangsmåte for bestemmelse av et antigenisk stoff i en væskeprøve ved luminiscens-immunoanalyse.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvorved man a) inkuberer et med et antigen spesifikt reagerende, immobilisert antistoff med en prøve av væsken som skal undersøkes og et konjugat av antigenet og et kjemilumi-scerende akridiniumderivat; b) skiller prøven og det ikke-bundne, merkede konjugatet fra hverandre; c) det bundne, merkede konjugatet bringes suksessivt eller samtidig sammen med en eller flere reagenser som frem-kaller en lysemissjon og d) mengden av det tilstedeværende antigenet bestemmes fra den målte styrken av lysemissjonen.

4 . Anvendelse ifølge krav 3, hvorved væsken som skal undersøkes skilles fra immobilisert antistoff før tilsatsen av det merkede konjugatet.

5 . Anvendelse ifølge krav 2, hvorved man a) inkuberer et med antigenet spesifikt reagerende, immobilisert antistoff med en prøve av væsken som skal undersøkes og et konjugat av et andre, spesifikt reagerende antistoff og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat ; b) skiller prøven og det ikke-bundne, merkede konjugatet fra hverandre; c) bringer det bundne, merkede konjugatet, suksessivt eller samtidig, sammen med en eller flere reagenser for å fremkalle en lysemissjon og d) bestemmer mengden av det tilstedeværende antigenet fra den målte styrken av lysemissjonen.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvorved væsken som skal undersøkes skilles fra immobilisert antistoff før tilsatsen av det merkede konjugatet.

7. Anvendelse ifølge krav 2, hvorved man a) inkuberer et med antistoffet spesifikt reagerende, immobilisert antigen med en prøve av væsken som skal undersøkes og en oppløsning av et konjugat av antistoffet og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat; b) skiller prøven og det ikke-bundne, merkede konjugatet fra hverandre; c) bringer det bundne, merkede konjugatet, suksessivt eller samtidig, sammen med en eller flere reagenser for å fremkalle en lysemissjon og d) bestemmer mengden av det tilstedeværende antigenet fra den målte styrken av lysemissjonen.

8. Anvendelse ifølge krav 2, hvorved man a) inkuberer et med antistoffet spesifikt reagerende, immobilisert antigen med en oppløsning av et konjugat av antistoffet og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat; b) fraskiller det uomsatte, merkede konjugatet; c) tilsetter en prøve av væsken som skal undersøkes; d) fraskiller prøven igjen; e) bringer det bundne, merkede konjugatet, suksessivt eller samtidig, sammen med en eller flere reagenser for å fremkalle en lysemissjon og f) bestemmer mengden av det tilstedeværende antigenet fra den målte styrken av lysemissjonen.

9. Anvendelse ifølge krav 2, hvorved man a) inkuberer et med antistoffet spesifikt reagerende, immobilisert antigen med en oppløsning av et konjugat av antistoffet og et kjemiluminiscerende akridiniumderivat; b) tilsetter en prøve av væsken som skal undersøkes; c) fraskiller prøven og det ikke-bundne konjugatet; d) bringer det bundne, merkede konjugatet suksessivt eller samtidig, sammen med en eller flere reagenser for å fremkalle en lysemissjon og e) bestemmer mengden av det tilstedeværende antigenet fra styrken av lysemissjonen.