NO308308B1 - Produksjon av biologisk aktive, rekombinante medlemmer av NGF/BDNF-familien til neurotrofiske proteiner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante medlemmer av den humane NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner i biologisk aktive former.

Neurotrofiske faktorer er naturlige proteiner, tilstede i nervesystemet eller i ikke-nervevev innervert av nervesystemet, der funksjonen er å fremme overlevelsen og å opprettholde den fenotypiske differensieringen av nerve og/eller glialceller (Varon og Bunge 1978 Ann. Rev. Neuroscience 1:327; Thoenen og Edgar 1985 Science 229:238). På grunn av denne fysiologiske rollen, kan neurotrofiske faktorer være nyttige for behandling av degenerasjon av nerveceller og tap av differensiert funksjon som oppstår i forskjellige neurodegenerative sykdommer, så som Alzheimers eller Parkinsons sykdommer, eller etter traumatiske skader, så som slag eller fysisk traume for ryggraden (Appel 1981 Ann. Neurology 10:499).

For at en bestemt neurotrofisk faktor er potensielt nyttig for behandling av nerveskade, må klassen eller klassene av skadete nerveceller reagere overfor faktoren. Forskjellige neurotrofiske faktorer påvirker vanligvis svært forskjellige klasser av nerveceller. Det er derfor tilrådelig å ha forskjellige neurotrofikse faktorer for å behandle hver av klassene av skadete neuroner som kan oppstå ved forskjellige former av sykdom eller skade.

En gitt neurotrofisk faktor må i tillegg til å ha riktig neuronal spesifisitet, være tilgjengelig i tilstrekkelig mengde for å bli anvendt som en farmasøytisk behandling. Også, på grunn av at neurotrofiske faktorer er proteiner, vil det være ønskelig å administrere til humane pasienter bare den humane formen av proteinet, for å unngå en immunologisk respons overfor et fremmed protein.

På grunn av at neurotrofiske faktorer vanligvis er tilstede i meget små mengder i vev (for eksempel Hover og Barde 1988 Nature 331:261; Lin et al., 1989 Science 246:1023), og på grunn av at humant vev ikke er lett tilgjengelig for ekstraksjon, vil det være uhensiktsmessig å fremstille farmasøytiske mengder av humane neurotrofiske faktorer direkte fra humane vev. Som et alternativ vil det være ønskelig å isolere det humane genet for en neurotrofisk faktor, og anvende det genet som grunnlaget for etablering av et rekombinant ekspresjonssystem for å fremstille potensielt ubregrensede mengder av det humane proteinet.

To neurotrofiske faktorer er blitt beskrevet som er nært beslektede i aminosyresekvens, men som påvirker forskjeller, til tross for at de er delvis overlappende, sett av responderende neuroner (Leibrock et al. 1989 Nature 341:149). Disse to neurotrofiske faktorene er: (1) Nerve-vekstfaktor (NGF) og (2) hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF). Både NGF og BDNF blir tilsynelatende syntetisert som større forlø-performer, som deretter blir prosessert, ved proteolytiske spaltninger, for å danne den modne neurotrofiske faktoren (Edwards et al, 1986 Nature 319:784; Leibrock et al. 1989 ibid.). De eneste genene for medlemmer av den foreslåtte NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner som er blitt rapportert opptil nå, er de humane og forskjellige dyregener NGF (Scott et al., 1983 Nature 302:538; Ullrich et al. 1983 Nature 303:821; Meier et al. 1986 EMBO J. 5:1489) og grisegenet for BDNF (Leibrock et al., 1989 ibid.). Det er en betraktelig likhet i aminosyresekvenser mellom modne NGF og modne BDNF, inkludert den relative posisjonen til alle seks cysteinaminosyreresidiene, som er identiske i modne NGF og BDNF fra alle undersøkte arter (Leibrock et al. 1989 ibid.) Se fig. 7, for sammenligning og fremheving av likhetene til de humane formene av NGF og BNDF. Dette foreslår at den tredimensjonale strukturen til disse to proteinene, som bestemt ved beliggenheten av disulfidbindingene, er like. Begge de modne proteinene har også et felles basisk isoelektrisk punkt. (pl).

NGF er en neurotrofisk faktor i det minste for cholinergiske neuroner i basalforhjernen (Hefti og Will 1987 J. Neural Transm. [Suppl] (AUSTRALIA) 24:309). Den funksjonelle inaktiveringen og degenerasjonen av basal-forhjerne-cholinergiske neuroner, responderende overfor NGF i løpet av Alzheimers sykdom, antas å være den direkte årsaken til kognitive og hukommelsesmangler assosiert med sykdommen (Hefti og Will 1987 ibid.). NGF er blitt vist å forhindre degenerasjon og gjenopprette funksjonen til basal-forhjerne-cholinergiske neuroner i dyremodeller, relatert til Alzheimers sykdom, og er på dette grunnlaget blitt foreslått som behandling for å forhindre degenerasjon og gjenopprette funksjonen til disse neuronene i Alzheimers sykdom (Williams et al., 1986 Proe. nati. Acad. Sei. USA 83:9231; Hefti 1986 J. Neuroscience 6:2155; Kromer 1987 Science 235:214; Fischer et al., 1987 Nature 329:65).

BDNF er en neurotrofisk faktor for sensoriske neuroner i det perifere neuronsystemet (Barde 1989 Neruon 2:1525). På dette grunnlaget kan BDNF vise seg å være nyttig for behandling av tap av følelse knyttet til skade av sensoriske nerveceller som oppstår i forskjellige perifere neuropatier (Schaumberg et al., 1983 "Disorders of Peripheral Nerves" F.A. Davis Co., Philadelphia, PA).

Rekombinante ekspresjonssystemer som kan produsere store mengder fullstendig biologisk aktiv og strukturelt umodifisert moden NGF, nødvendig for farmasøytisk utvikling, er meget ønskelig. Se Europeisk patentsøknad EP 89113709, som beskriver den rekombinante ekspresjonen av NGF i insektceller. Moden, biologisk-aktiv NGF kan bli fremstilt når humane- eller dyre-NGF-gener blir uttrykt i eukaryote celle-ekspresjonssystemer (f.eks. Edwards et al. 1988 Molec. Cell. Biol. 8:2456). I slike systemer blir full-lengde NGF-forløper først syntetisert og deretter proteolytisk uttrykt for å fremstille moden NGF som blir riktig foldet 3-dimensjonalt og som er fullstendig biologisk aktiv. Eukaryote celle-ekspresjonssystemer produserer ofte relativt lave utbytter av protein pr. gram celler, og er relativt dyre for bruk ved fremstilling.

Ekspresjonssystemer som anvender prokaryote celler, så som bakterier, tilveiebringer derimot ofte relativt store mengder av uttrykt protein pr. gram celler, og er relativt billige å anvende ved fremstilling. Et adekvat bakterielt ekspresjonssystem som kan fremstille fullstendig biologisk aktiv og strukturelt umodifisert moden NGF, er derimot ikke blitt beskrevet. Et bakterielt ekspresjonssystem er beskrevet i et Kanadisk patent nr. 1.220.736. Ingen fremgangsmåter for refolding av det uttrykte proteinet er derimot presentert. Denne svikten kan sannsynligvis bli sporet tilbake til problemer assosiert med bakterielle ekspresjonssystemer generelt, og problemer assosiert med de spesifikke teknikkene anvendt for å fremstille NGF i bakteriene.

Bakterier kan ikke prosessere forløperproteinene riktig, så som forløperproteinet for NGF, ved å danne hensiktsmessige proteolytiske spaltninger for å fremstille det riktige mindre modne proteinet.

For dermed å fremstille moden NGF i bakterier, er det nødvendig å bare uttrykke den delen av NGF DNA-sekvensen kodende for det modne proteinet, og ikke den for den større forløperformen. Da dette ble utført i bakterien Escherichia coli, ble relativt store mengder moden humant NGF-protein fremstilt (se f.eks. Iwai et al. 1986 Chem. Pharm. Bull. 34:4724; Dicou et al. 1989 J. Neurosci, REs. 22:13; EP-søknad 121.338). Det bakterielt uttrykte proteinet hadde derimot liten eller ingen biologisk aktivitet.

En protokoll for refolding bakterielt uttrykt NGF er blitt beskrevet i europeisk patentsøknad 336.324, som har beholdt en viss biologisk aktivitet i forhold til moden NGF produsert i bakterier. Denne protokollen har derimot alvorlige mangler.

Moden human NGF har generelt vært utilgjengelig i tilstrekkelige mengder for farmasøytisk bruk på grunn av at mange eukaryote ekspresjonssystemer er dyre og produserer ofte ikke tilstrekkelige mengder moden NGF. Bakterielle ekspresjonssystemer som er beskrevet inntil nå, har ikke produsert biologisk-aktiv og kjemisk-umodifisert moden NGF i tilstrekkelige mengder for farmasøytisk bruk. På grunn av at human moden NGF sannsynligvis er nyttig for behandling av Alzheimers sykdom, har utilgjengeligheten av dette materialet vært et problem for videnskapsfolk og medisinere. Utilgjengeligheten av biologisk-aktiv human moden NGF ble oppdaget av et panel av videnskapsfolk som var tilstede ved National Institute on Aging, som krtikere til videre utvikling av NGF som en behandling av Alzheimers sykdom (Phelps et al. 1989 Science 243:11).

Det antas at lignende vanskeligheter ved fremstilling vil gjelde for hvert medlem av NGF/BDNF-familien av neorotrofiske proteiner, på grunn av at medlemmer av denne familien som inntil nå er blitt beskrevet har identiske beliggende systeinaminosyreresidier og danner dermed sannsynligvis et mønster av intremolekylære disulfidbindinger som er identiske med de til NGF (Angeletti et al,. 1973 Biochemistry 12:100).

I lys av verdien av slike neurotrofiske proteiner og begrensninger på produksjon av store mengder biologiske aktive proteiner som angitt ovenfor, vil det være ønskelig å tilveiebringe følgende: (1) Identifikasjon, isolasjon og karakterisering av alle medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner; dvs. proteiner som er strukturelt beslektede med NGF og BDNF på en måte som ligner måten disse to proteinene er beslektet med hverandre på; (2) identifika sjon, isolasjon og karakterisering av alle naturlig fore-kommende humane medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner, inkludert spesifikt human BDN; (3) isolering og krakterisering av gener kodende for hvilke som helst av alle medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner, inkludert spesifikt humane gener kodende for alle slike familiemedlemmer; (4) fremgangsmåter for anvendelse av humane gener for å etablere rekombinante ekspresjonssystemer i mikroorganismer så som E. coli som vil produsere betraktelige mengder moden (prosessert) form av disse humane proteinene; (5) fremgangsmåter for refolding av medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner for å muliggjøre at de oppnår en biologisk spesifikk aktivitet og (6) farmasøytiske sammensetninger for behandling av neurologiske sykdommer innbefattende hvilke som helst og hvilke som helst kombinasjon av medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for refolding og renaturering av hydrofobe proteiner som blir rekombinant uttrykt i prokaryote celler, hvori proteinene oppnår full biologisk aktivitet, og hvori nevnte protein blir valgt fra gruppen bestående av human moden nervevekstfaktor (NGF), human moden hjerneavledet neurotrofisk faktor (BDNF) og human moden nervevekstfaktor 3(NGF-3); kjennetegnet ved at den omfatter: (a) oppløse alle intramolekylære og intermolekylære disulfidbindinger i en oppløsning inneholdende nevnte neurotrofiske protein for å danne frie tioler ved tilsetning av et denatureringsmiddel og et redu-seringsmiddel til nevnte oppløsning; (b) oksidering av nevnte frie tioler med en disulfid inneholdende forbindelse for å danne blandede disulfidbindinger; (c) fortynne nevnte oppløsning i nærvær av en tiolinneholdende forbindelse; og (d) isolere nevnte neurotrofiske protein fra nevnte oppløsning.

Vedlagte tegnigner som var inkorporert i beskrivelsen illustrerer forskjellige utførelsesformer av oppfinnelsen og forklarer prinsippene ifølge oppfinnelsen sammen med beskrivelsen.

Kort beskrivelse av tegningene:

Figur 1 angir nukleinsyren og gjeldende aminosyresekvenser til human BDNF. Gjeldende aminosyresekvens til moden (prosessert) form av BDNF er uthevet. Figur 2 angir ekspresjon av human moden (prosessert) NGF i E. coli i vector pT5T. Detaljene er angitt i teksten til eksempel 2. Figur 3: angir tapet og gjenoppnåelse av biologisk aktivitet ved denturering og refolding av moden human NGF, produsert i eukaryote celler. Figur 4: angir visse trekk ved bakteriell ekspresjonsvektor pT3XI-2. Trekkene er bare representative og er ikke oppsatt i riktig skala. NGF-innskuddet skal representere et hvilket som helst medlem av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner. Figur 5 angir visse trekk ved bakteriell ekspresjonsvektor pT3XI-2. Trekkene er bare representative og er ikke tegnet i nøyaktig skala. NGF-innskuddet skal representere et hvilket som helst medlem av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner. Figur 6 sammenligner nukleinsyresekvensen til NGF-3 med sekvensen til NGF og BDNF. Gap, angitt ved stiplede linjer, korresponderer med beliggenheten av gapene anvendt for å oppstille aminosyresekvensene (se fig. 7). Delvis nuklein-syresekvens til NGF-3 oppnådd ved PCR er understreket. Figur 7 sammenligner aminosyresekvensen til NGF-3 med sekvensen til NGF og BDNF. Gjeldende sekvenser til modne proteiner er fremhevet. Hver aminosyre understreket i den modne sekvensen til BDNF eller NGF, er identisk med den korresponderende aminosyren i NGF-3. Hver aminosyre understreket i den modne sekvensen til NGF-3, er identisk med tilsvarende aminosyrer i både NGFog BDNF. Gap, angitt ved stiplede linjer, ble plassert i sekenser for å øke oppstillingen. De seks cysteinene i BDNF, NGF og NGF-3 er funnet i samme beliggenheter i alle tre proteiner, og er angitt i parenteser. Figur 8 angir bioanalysen ved anvendele av E10 kylling-dorsalrotganglion-neuoroner av ekstrakter av C0S-7-celler, transfektert med plasmid pSG5 med og uten et humant BDNF-innskudd. Figur 9 angir en dose-responskurve for insekt-cellepro-duserende humant rekombinant NGF ved anvendelse av bioanalysen på Ell kylling-embryo-sympatetiske ganglion-neuroner. Figur 10 angir bioaktiviteten til flere fortynninger av den endelige refoldingblandingen av E. coli-produsert humant rekombinant NGF. ved anvendelse av bioanalysen på Ell kyllingembryo-sympatetiske ganglionneuroner. Figur 11 angir analysen på reversert-fase høy ytelse væskekromatografi av (A) 50 ul av den endelige refoldingblandingen analysert i figur 10, hvor 100 ng nativt, insekt-celle-produserende NGF er blitt tilsatt, og (B) 50 ul av den endelige refoldingsblandingen hvor det ikke er blitt tilsatt nativt, insekt-celle-produserende NGF. Posisjonen hvor nativ, insekt-celle-produserende NGF normalt løper på denne kolonnen, er blitt indikert med markør NGF etterfulgt av en pil. Figur 12 viser elueringsprofilen til proteiner (Optisk tetthet ved 214 nm) når den endelige refoldingsblandingen for ytterligere rensing er kromatografert på en C4-kolonne ved reversert-fase-HPLC. Riktig refoldet NGF er den største proteintoppen som eluerer ved omtrent 37$ acetonitril. Figur 13 viser elueringsprofilen til proteiner (optisk tetthet ved 214 nm) når den endelige refoldingsblandingen etter dialyse og konsentrasjon, men før S-Sepharose er kromatografert på en C4-kolonne ved reversert fase HPLC. Riktig refoldet NGF er den største proteintoppen som eluerer ved omtrent 37$ acetonitril. Figur 14 angir elueringsprofilen til proteiner (optisk tetthet ved 214 nm) når den endelige refoldingsblandingen etter rensing over S-Sepharose er kromatografert på en C4-kolonne ved reversert-fase-HPLC. Riktig refoldet NGF er den største proteintoppen som eluerer ved omtrent 38'7$ acetonitril. Den lille proteintoppen som eluerer rett etter hovedtoppen, er den monomeriske formen av riktig refoldet NGF, som blir dannet i løpet av kromatografi på reversert-fase-HPLC.

Foreliggende oppfinnelse beskriver en fremgangsmåte for å refolde og renaturere hydrofobe proteiner rekombinant uttrykt i prokaryote celler, hvor nevnte protein blir valgt fra gruppen bestående av NGF, BDNF og NGF-3. NGF og BDNF definerer en familie strukturelt beslektede neurotrofiske proteiner som sannsynligvis har forskjellig fysiologisk rolle i organismen, idet hvert medlem påvirker et annet sett responderende neuroner. Det vil være meget ønskelig å isolere genene for hvilke som helst og alle ytterligere medlemmer av denne NGF/BDNF-familien, for å ha et batteri neurotrofiske proteiner tilgjengelige for å behandle de forskjellige nervecelletypene hvor funksjonene er ofret i forskjellige former av skade på nervesystemet.

Det er ønskelig å anvende humane proteiner for behandling av mennesker. I henhold til dette prinsippet vil det være ønskelig å oppnå det humane genet for BDNF for å fremstille det humane proteinet. I henhold til dette prinsippet, og med prinsippet uttrykt ovenfor, at det vil være ønskelig å ha et batteri neurotrofiske proteiner med forskjellige neuronale spesifisiteter for å behandle forskjellige neurologiske betingelser, vil det være ønskelig å oppnå de humane genene for hvilke som helst og alle ytterliger medlemmer av NGF/BDNF-familie neurotrofiske proteiner.

Den manglende evnen til å oppnå biologisk aktiv bakterielt uttrykt NGF, har vært et hovedhinder i dette området. Den sannsynlige grunnen for denne mangelen for denne biologiske aktivitet er at modent NGF-protein ikke kunne oppnå spontant riktig 3-dimensjonal struktur og danne riktige intramolekylære disulfidbindinger, som begge er essensielle for biologisk aktivitet. Det ser derfor ut til å være nødvendig å utvikle en protokoll for refolding som kan gjenopprette moden NGF produsert i bakterier den 3-dimensjonale strukturen og intramolekylære disulfidbindingsmønstre, nødvendig for fullstendig biologisk aktivitet.

Protokollen for refolding av NGF beskrevet i europeisk patentsøknad 336.324, løser ikke problemet tilstrekkelig. Protokollen anvender utsetting for høy pH (pH 13 er anbefalt)

- antagelig for å bryte disulfidbindingene som kan ha blitt dannet feilaktig i bakterielt produsert NGF, etterfulgt av redusering av pH for å muliggjøre at riktige intramolekylære disulfidbindinger dannes. Utsetting for høy pH, som anvendt i denne protokollen, er kjent for å forårsaket omfattende modifikasjon av proteiner, inkludert eliminering av aminside-kjeder i glutamin og asparagin (som det er 7 av i moden human NGF) og omfattende kjemisk endring av asparagin-glycin, asparagin-serin og asparagin-treonin ved siden av liggende par (som det er to av i moden human NGF). I tillegg til disse kjemiske modifikasjoner, så refoldingsprosedyren ut til å bare gjenopprette omtrent en tiendedel av den biologiske aktiviteten til NGF. Protokollen beskrevet i europeisk patentsøknad 336.324, ser dermed ut til å være utilstrekkelig for å produsere fullstendig biologisk aktiv og kjemisk umodifisert moden human NGF. Til tross for at mange pro-tokoller for refolding og renaturering av proteiner som ikke involverer grove betingelser eksisterer, er ingen slike

fremgangsmåter blitt påført NGF på en vellykket måte. For en generell oversikt av refoldingsfremgangsmåter, se H. Kohno, Methods Enzymol., vol. 185, s. 187 (1990).

Basert på disse betraktningene vil et fremstillingssystem som kan produsere fullstendig biologisk aktiv og kjemisk umodifisert human moden NGF i store mengder i bakterier, være nyttig for fremstilling av likeledes store mengder av et hvilket som helst medlem av NGF/BDNF-familien i en biologisk aktiv og umodifisert form egnet for farmasøytisk anvendelse.

1. Isolering av human BDNF

Fremgangsmåter for oppnåelse av det humane genet kodende for forløper og modne former av BDNF, som innbefatter modne og forløperformer av humant BDNF og genene som koder for slike proteiner, er beskrevet. Det refereres til den modne formen til et neurotrofisk protein til den biologiske aktive formen av proteinet som den eksisterer i naturen etter protolytisk spaltning. Forløperformen av et neurotrofisk protein, refererer til proteinet kodet for av det humane genet før protolytisk spaltning. I en versjon som er beskrevet i eksempel 1 nedenfor, ble syntetiske oligonukleotider BDNF-1, BDNF-2, BDNF-2B, BDNF-4 og BDNF-5, omtrent 15-30 basers lengde, fremstilt basert på forskjellige regioner av nukleinsyresekvensen kodende for grise-BDNF. Disse grise-BDNF-oligonukleotidene blir anvendt i forskjellige kombinasjoner som primere i polymerasekjedereaksjonen (PCR) med humant genomisk DNA som templat for å amplifisere mellomliggende sekvenser av det humane genet for BDNF. Amplifiserte fragmenter blir subklonet og subklonene screenet for de som hybridiserer til en ytterligere oligonukleotidprobe som representerer sekvenser beliggende mellom de til de to primerne anvendt i PCR.

Positive subkloner isolert i denne screeningen kan bli sekvensert for å bekrefte deres identitet som deler av BDNF-gener. En eller flere av disse amplifiserte fragmentene kan bli anvendt for å screene et humant genomisk DNA-bibliotek, for å oppnå det human genet for BDNF. Subklonede restriksjonsfragmenter til humane genomiske kloner, kan bli sekvensert for å tilveiebringe nukleotinsyren og gjeldende aminosyresekvenser kodende for forløperen og modne former av humant BDNF. Nukleinsyren og gjeldende aminosyresekvenser til humant BDNF er angitt i figur 1.

2.Identifikasjon av tidligere ubeskrevne medlemmer

av NGF/ BDNF- familien av neurotrofiske proteiner

Fremgangsmåter er beskrevet for oppnåelse av humane gener kodende for forløperen og modne former av tidligere urapporterte, nye medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner. Uønskede humane DNA-sekvenser er hvilke som helst og alle tidligere urapporterte sekvenser som koder for proteiner som ikke er identiske med human NGF eller BDNF, men som er klart relatert til NGF eller BDNF med hensyn på mulige definerende karaktertrekk til familien. Slike karaktertrekk kan innbefatte en eller flere av følgende: neurotrofisk aktivitet i en hensiktsmessig bioanalyse; signifikant homologi i aminosyresekvens inkludert både aminosyreidentite-ter og konservative substitusjoner; konservert beliggenhet av cysteinresidier i aminosyresekvensen; hydrofobiske signalsekvenser for sekresjon av proteinet; signalsekvenser for proteolytisk prosessering til en moden form; og/eller basisk isoelektrisk punkt til det prosesserte proteinet.

A. I en versjon kan flere syntetiske oligonukleotider, omtrentlig 15-40 base i lengde, bli preparert basert på et antall av både konserverte og variable regioner av nuklein-syresekvensene kodende for NGFog BDNF fra mennesker og dyr. Disse NGF/BDNF-olignonukleotidene kan bli anvendt i forskjellige kombinasjoner som primere i PCR med human genomisk DNA, eller humant CDNA-bibliotek, preparert fra forskjellige diskrete regioner av nervesystemet som templater for templater for å amplifisere mellomliggende segmenter av de humane genene for medlemmer av NGF/BNDF-familien.

Anvendelse av CDN fra diskrete regioner av nervesystemet, kan være fordelaktig på grunn av at (1) regioner som ikke inneholdet betraktelige mengder (messages) for NGF og BDNF, kan redusere bakgrunnen til fragmentene amplifisert ved PCR fra NGF opg BDNF i seg selv; og (2) neurotrof iske faktorer som påvirker ønskede neuronalpopulasjoner er beliggende i forutsigbare regioner av nervesystemet.

Amplifiserte fragmenter kan bli subklonet og individuelle subkloner valgt for sekvensering enten (a) ved positiv hybridisering til et degenerert oligonukleotid som representerer DNA-sekvenser beliggende mellom de til oligonukleotid-primerne, eller (b) ved restriksjonskartlegging for å detektere subkloner inneholdende et innskudd på omtrent den størrelsen man vil vente å bli amplifisert fra NGF eller

BDNF.

Slike selekterte subkloner kan bli sekvensert for å bestemme om de representerer deler av genet for NGF, BDNF eller nye medlemmer av NGF/BDNF-familien. Dersom det subklonete, amplifiserte fragmentet ser ut til å representere et nytt medlem av NGF/BDNF-familien, kan dette fragmentet bli radiomerket og anvendt for å screene et humant genomisk DNA-bibliotek for å oppnå det humane genet for det antatte nye neurotrofiske proteinet. Det humane genet kan bli sekvensert for å tilveiebringe nukleinsyren og gjeldende aminosyresekvenser kodende for forløperen og modne former av det nye neurotrofiske proteinet.

B. I en annen versjon kan subkloner av fragmentene amplifisert ved PCR som beskrevet ovenfor bli screenet med hver av flere ikke-degenererte DNA-fragmenter som er spesifikke for NGF eller BDNF-genene. Hensikten med denne screeningen er å lette isolering av fragmenter amplifisert fra gener for nye medlemmer av NGF/BDNF-familien, ved eliminering av fragmenter amplifisert fra allerede karakteri- serte medlemmer av NGF og BDNF. Amplifiserte fragmenter som er blitt identifisert på denne måte å være forskjellig fra NGF og BDNF, kan bli sekvensert for å bekrefte deres identitet og, dersom hensiktsmessig, anvendt for å oppnå det humane genet som beskrevet ovenfor. C. Et humant genomisk bibliotek og humane cDNA-bibliotek fremstilt fra forskjellige diskrete regioner av nervesystemet, kan bli screenet for å lokalisere kloner inneholdende mulige nye medlemmer av NGF/BDNF-familien. Slike bibliotek kan bli screenet enten med en del av de humane DNA-sekvensene kodende for NGF eller BDNF eller med en av flere syntetiske oligonukleotider, omtrentlig 15-40 baser i lengde, dannet basert på forskjellige konserverte og variable regioner av nukleinsyresekvenser kodende for dyre- eller humane NGF og BDNF. Redusering av stringentheten ved hybridisering i løpet av screening av disse bibliotekene, muliggjør at probene hybridiserer ikke bare til kloner inneholdende NGF og BDNF-sekvenser, men også til kloner inneholdende lignende, og muligens beslektede sekvenser. Screening cDNA-bibliotek fra regioner av nervesystemet som ikke inneholder betraktelige mengder av "messages" for NGF og BDNF, kan være anbefalelses-verdige for å reduserer bakgrunnen av NGF og BDNF-klonene. Kloner identifisert i disse screeningene kan enten bli sekvensert for å bestemme om de representerer gener for nye medlemmer av NGF/DBDNF-familien eller de kan bli ytterligere screenet, som beskrevet i foregående avsnitt, for å eliminere de som sannsynligvis representerer gener for allerede kjente medlemmer, NGF og BDNF.

Hver av de tre versjonene kan bli anvendt for å tilveiebringe nukleinsyren og gjeldende aminosyresekvenser kodende for forløperen og modne former av nye humane medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner.

Et nytt medlem av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner er blitt identifisert ved anvendelse av fremgangs måtene angitt ovenfor. Som beskrevet i eksempel 4 nedenfor, og som det fremgår i figur 6, er den fullstendige nukleinsyresekvensen blitt identifisert som koder for det tidligere urapporterte proteinet NGF-3. Basert på nukleinsyresekvensen anvendt i figur 6 er den fullstendige aminosyresekvensen til moden og forløper NGF-3 blitt oppnådd. Aminosyresekvensen til NGF-3, angitt ved referanse til sekvensert NGF-3-genet, er angitt i figur 7.

I tillegg omfattes neurotrofiske proteiner av en hvilken som helst opprinnelse som er biologisk ekvivalent med de neurotrofiske proteinene beskrevet heri. Omfattet er modne neurotrofiske proteiner. I beskrivelsen skal en hvilken som helst referanse til et neurotrofisk protein bli konstruert for å referere til proteiner identifisert og beskrevet heri som medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner .

Med "biologisk ekvivalente" som anvendt i beskrivelsen og kravene, menes sammensetninger som kan fremme overlevelsen og opprettholde den fenotypiske differensieringen av nerve eller glialceller, men ikke nødvendigvis i samme grad som de native neurotrofiske proteinene beskrevet heri. Med "vesentlig homolog" som anvendt i beskrivelsen og kravene, nevnes en grad av homologi med de native neurotrofiske proteinene i overskudd av det som fremkommer av hvilke som helst tidligere rapporterte neurotrofiske proteiner. Homologigraden kan være i overskudd av 70$ eller i overskudd av 80$ eller i overskudd av 90$, 95% eller 99%. En gruppe neurotrofiske proteiner er i overskudd av 95% homologe med de native proteinene. Prosentandel homologi som beskrevet heri, er beregnet som prosentandel aminosyreresidier som finnes i den mindre av de to sekvensene som oppstilles med identiske aminosyreresidier i sekvensen som blir sammenlignet når fire gap i en lengde på 100 aminosyrer kan bli introdusert for å være behjelpelig med den oppstillingen som angitt av Dayhoff, i Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, s. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., spesifikt inkorporert heri som referanse. Også innbefattet som vesentlig homolog, er de neurotrofiske proteinene som kan bli isolert i kraft av kryssreaktivitet med antistoffer til det beskrevne proteinet eller hvor genene kan bli isolert gjennom hybridisering med genet eller med segmentene av det beskrevne proteinet.

3. Genekspresj on

Hver av de humane genene for medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner, inkludert de humane genene for NGF, BDNF og NGF-3, kan bli anvendt for å oppnå rekombinante ekspresjonssystemer for fremstilling av det modne neurotrof iske proteinet kodet av hvert gen. Ekspresjonen kan oppstå i en organisme, spesielt i Escherchia coli.

Genet for hvert neurotrofisk protein kan bli modifisert for å lette effektiv ekspresjon i E. coli. Slike modifikasjoner, beskrevet i mer detalj nedenfor, kan innbefatte følgende: (i) fremstilling av en DNA-sekvens som bare koder for den utledete modne (prosesserte) formen av proteinet, ved fjerning av ytterligere kodende og ikke-kodende sekvenser som kan være tilstede i genet; (ii) endring av humane kodoner med de som fortrinnsvis blir anvendt av E. coli; (iii) tilsetning av en translasjonen kobler for å fremme effektiv translasjon i E. coli; (iv) innskudd av nye restriksjonsseter for hensiktsmessighet av påfølgende legering og kloning; og (v) innskudd av DNA inn i en eller flere ekspresjonsvektorer konstruert for å fremme effektiv ekspresjon av DNA i E. coli. De endelige ekspresjonskonstruksjonene kan bli transformert inn i en egnet stamme av E. coli og transf ormanter som produserer moden neurotrofisk protein selektert for opp-skallering og fremstilling. Ekspresjon av NGF i E. coli. er beskrevet i eksempel 2 nedenfor.

A. Generelt

En naturlig eller syntetisk DNA-sekvens kan bli anvendt for å lede produksjonen av slike neurotrofiske proteiner. Endrede former av de neurotrofiske faktorene kan bli produsert, hvori det aktive setet virker på en måte som er biologisk ekvivalent med det til de neurotrofiske proteinene beskrevet heri. Den generelle fremgangsmåten for ekspresjon omfatter: 1. Preparering av en DNA-sekvens som kan lede en vertscelle til å produsere et protein med neurotrofisk aktivitet eller en forløper derav: 2. kloning av DNA-sekvensen inn i en vektor som kan bli overført inn i og replikert i en vertscelle, idet en slik vektor inneholder operasjonelle elementer nødvendig for å uttrykke DNA-sekvensen eller en forløper derav: 3. overføring av vektoren inneholdende den syntetiske DNA-sekvensen og operasjonelle elementer inn i en vertscelle som kan uttrykke DNA kodende for det neurotrofikse proteinet eller en forløper derav; 4. dyrking av vertscellene under betingelser for amplifikasjon av vektoren og ekspresjon av proteinet eller en forløper derav;

5. høsting av proteinet eller en forløper derav; og

6. muliggjøre at proteinet innehar en aktiv tertiær struktur hvorved den prosesserer, eller kan bli prosessert, til et protein med biologisk aktivitet.

B. DNA- sekvenser

DNA-sekvenser for anvendelse i denne fremgangsmåten, er diskutert delvis i eksemplene 1, 2 og 4. Figur 6 angir fullstendige nukleinsyresekvenser kodende for human NGF, BDNF og NGF-3. Det er betraktet at disse sekvensene innbefatter syntetiske og naturlige DNA-sekvenser og kombinasjoner derav. Naturlige sekvenser innbefatter videre cDNA eller genomiske DNA-segmenter.

Fremgangsmåte for syntetisk dannelse av polynukletotid-sekvenser kodende for et protein identisk med det som blir kodet av cDNA eller genomiske polynukleotidsekvenser er generelt kjent for fagfolk innenfor dette området, spesielt i lys av det som er beskrevet heri. Som et eksempel på teknikkens stand vedrørende polynukleotidsyntese, kan Matteucci , M.D. , og Caruhers, M.H., i J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981) og Beaucage, S.L. og Varuthers, M.H. i Tetrahedron Lett. 22:1859 (1981), og instruksjoner fra en AB I oligonukleotidsyntetisator, som hver spesifikt er inkorporert heri som referanse.

Disse syntetiske sekvensene kan være identiske med de naturlige sekvensene beskrevet i større detalj nedenfor eller de kan inneholde forskjellige nukleotider. Dersom de syntetiske sekvensene inneholder nukleotider forskjellig fra de som finnes i naturlige DNA-sekvenser, er det betraktet at disse forskjellige sekvensene vil enda kode for et polypeptid som har samme primærstruktur som de neurotrofiske proteinene beskrevet heri. I et alternativ vil den syntetiske sekvensen inneholdende forskjellige nukleotider kode for et polypeptid som har samme biologiske aktivitet som de neurotrofiske proteinene beskrevet heri.

I tillegg kan DNA-sekvensen være et fragment av en naturlig sekvens, dvs. et fragment av et polypeptid som oppstod i naturen og som er blitt isolert og renset. DNA-sekvensen kan være et restriksjonsfragment isolert fra et cDNA-bibliotek.

DNA-sekvensen kan også isoleres fra et humant genomisk bibliotek. Eksempel på et slikt bibliotek som er nyttig i denne utførelsesformen, er angitt av Wyman, et al., (1985) Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 82, 2880-2884.

DNA-sekvenser kodende for ønskede neurotrofiske proteiner kan bli oppnådd på flere forskjellige måter. Humane cDNA-bibliotek og humane genomiske bibliotek kan bli probet med minst en probe med evne for binding til det neurotrof iske proteingenet eller genproduktet derav. Etter identifikasjon av gener kodende for proteinet i kraft av dets evne til å binde til proben, kan genet bli isolert og koblet til operasjonelle elementer nødvendig for å opprettholde og uttrykke genet i en vertscelle.

En annen fremgangsmåte for identifisering og isolering av gensekvenser er ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen. Som beskrevet i eksempel 1, ble den naturlige DNA-sekvensen kodende for humant BDNF identifisert og isolert ved å preparere flere syntetiske oligonukleotider konstruert ved granskning av. nukleinsyresekvensen for grise-BDNF og anvendelse av par av disse primerne i polymerasekjedereaksjon for å identifisere amplifiserte fragmenter av den humane BDNF-sekvense. De amplifiserte fragmentene oppnådd ved PCR ble deretter anvendt for å klone den fullstendige nukleinsyresekvensen til human BDNF.

Som beskrevet i eksempel 4 ble den naturlige DNA-sekvensen kodende for human NGF-3 identifisert og isolert ved å preparere syntetiske oligonukleotider konstruert ved å granske nukleinsyresekvensen til human og dyre-NGF og BDNF og ved anvendelse av disse primerne i polymerasekjedereaksjon for å identifisere et amplifisert fragment av det tidligere urapporterte humane NGF-3-sekvens. Det amplifiserte fragmentet oppnådd ved PCR ble anvendt for å klone hele nukleinsyresekvensen til human NGF-3.

En DNA-sekvens, isolert ifølge disse fremgangsmåtene fra et humant genomisk DNA-bibliotek og kodende i det minste for en del av det humane BDNF-proteinet beksrevet heri, er blitt skutt inn i plasmid pSYN23. Dette plasmidet er blitt deponert til American Type Culture Collection, Rockville, M.D., under Accession nr. 40992, 20. mars 1991, i henhold til Budapestav-talen. Denne DNA-sekvensen er angitt i figur 1 nedenfor, med unntagelse av at kodonet som tilsvarer aminosyreposisjon 223 er AAA i steden for AGA.

En DNA-sekvens, isolert ifølge disse fremgangsmåtene fra et humant genomisk DNA-bibliotek og kodende for minste en del av DGF-3-proteinet beskrevet heri, er blitt skutt inn i plasmid pSYN 30. Dette plasmidet er blitt deponert til the American Type Culture Collection, Rockville, MD., under Accession nr. 40991, 20. mars 1991, i henhold til Budapest-avtalen. Denne DNA-sekvensen er videre beskrevet i eksempel 4.

C. Vektorer

(i) Mikroorganismer, spesielt E. coli

Vektorer for anvendelse innbefatter hvilke som helst vektorer hvori en DNA-sekvens som diskutert ovenfor kan bli skutt inn i, sammen med hvilke som helst foretrukne eller nødvendige operasjonelle elementer, og vektoren kan deretter bli overført inn i en vertscelle og replikert i en slik celle. Det er ønskelig at alle disse vektorene har noen eller alle av følgende karaktertrekk: (1) har et minimalt antall verts-organismesekvenser; (2) blir stabilt opprettholdt og propagert i den ønskede verten; (3) kan være tilstede i et høyt kopiantall i ønsket vert; (4) har en regulerbar promoter beliggende slik at den fremmer transkripsjon av genet som er av interesse; (5) har minst en markør DNA-sekvens kodende for et selekterbart trekk tilstede på en del av plasmidet separert fra der hvor DNA-sekvensen vil bli skutt inn; og (6) en DNA-sekvens som kan terminere transkripsjonen.

Kloningsvektorene inneholder forskjellige operasjonelle elementer. Disse "operasjonelle elementene" innbefatter følgende: Regulatorer, promonere, transkripsjonsterminator, ikke-translatert sekvens, tibosombindingsseter, ledersekven-ser og translasjonene koblere, translasjonsterminator, selekterbar markør. I praksis er det mulig å konstruere disse vektorene på en måte som muliggjør at de lett blir isolert, oppstilt og byttet innbyrdes.

De operasjonelle elementene diskutert heri, blir rutinemessig selektert av fagfolk i lys av tidligere litteratur og beskrivelser deri. Generelle eksempler på disse operasjonelle elementene er angitt i B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983), som er spesifikt inkorporert heri som referanse. Forskjellige eksempler på egnede operasjonelle elementer kan finnes på vektorene diskutert ovenfor og kan bli vurdert gjennom granskning av publikasjoner som diskuterer hoved-karaktertrekkene til ovennevnte vektorer.

Ved syntese og isolering av alle nødvendige og ønskede komponentdeler av ovennevnte vektor, blir vektoren oppstilt ved fremgangsmåter som er generelt kjente for fagfolk. Oppstilling av slike vektorer antas å være innenfor hva som kan bli utført av fagfolk innenfor området, og som dermed kan bli utført uten unødig eksperimentering. For eksempel har lignende DNA-sekvenser blitt ligert inn i hensiktsmessige kloningsvektorer, som angitt av Maniatis et al. i Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984), som er spesifikt inkorporert heri som referanse.

I eksempel 2 nedenfor er fremstilling av to vektorer inneholdende nukleinsyresekvensen kodende for moden human NGF beskrevet. Vektorene som hensiktsmessige nukleinsyresekvenser var skutt inn i, er E. coli ekspresjonsvektorene referert til som pT5T og pT3XI-2. Detaljene til vektoren pT5T:NGF er vist i figur 4 og detaljene til vektor pT3XI-2:NGF er vist i figur 5.

Ved konstruksjon av kloningsvektorer bør det i tillegg bli bemerket at multiple kopier av DNA-sekvensen og gjeldende operasjonelle elementer kan bli skutt inn i hver vektor. I en slik utførelsesform vil vertsorganismen produsere store mengder pr. vektor av ønsket neurotrofisk protein. Antall multiple kopier av DNA-sekvensen som kan bli skutt inn i vektoren er bare begrenset av evnen som den resulterende vektoren, på grunn av dets størrelse, har til å bli overført inn i og replikert og transkribert inn i en hensiktsmessig vertscelle.

(i i) Andre mikroorganismer

Vektorer egnede for anvendelse i mikroorganismer forskjellig fra E. coli. er også bekreftet. Slike vektorer er beskrevet i tabell 1. I tillegg er visse vektorer beskrevet nedenfor. Disse mikroorganismevektorene som beskrevet heri, blir rutinemessig anvendt av fagfolk innenfor området i lys av tidligere litteratur og beskrivelser innbefattet heri. Oppstilling av slike vektorer antas å være innenfor fagom-rådet til fagfolk innenfor dette området, og kan bli utført uten unødig eksperimentering.

1. Backman, K., Ptashne, M. and Gilbert, W. Proe.Nati. Acad. Sei. USA 71, 4174-4178 (1976).2. de Boer, H.A., Comstock, L.J., and Vasser, M. Proe. Nati. Acad. Sei. USA fiO/ 21-25 (1983).3. Shimatake, H. and Rosenberg, M. Nature 292. 128-132

(1981) .

4. Derom, C., Gheysen, D. and Fiers, W. Gene 17, 45-54

(1982) . 5. Hallewell, R.A. and Emtage, S. Gene 9, 27-47 (1980).6. Brosius, J., Dull, T.J., Sleeter, D.D. and Noller, H.F. J. Mol. Biol. 2AS. 107-127 (1981). 7. Normanly, J., Ogden, R.C., Horvath, S.J. and Abelson, J. Nature 321. 213-219 (1986). 8. Belasco, J.G., Nilsson, G., von Gabain, A. and Cohen, S.N. Cell 16#245-251 (1986). 9. Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg M. and Court, D. J. Mol. Biol. 176, 39-53 (1984).10. Mott, J.E., Galloway, J.L. and Platt, T. EMBO J. 4, 1887-1891 (1985). 11. Koshland, D. And Botstein, D. Cell 2£,/749-760

(1980). 12. Mowa, N.R., Kakamura, K. and Inouye, M. J. Mol. Biol. 143, 317-328 (1980). 13. Surin, B.P., Jans, D.A., Fimmel, A.L., Shaw, D.C., Cox, G.B. and Rosenberg, H. J. Bacteriol. 157. 772-778

(1984) . 14. Sutcliffe, J.G. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 25, 3737-3741 (1978). 15. Peden, K.W.C. Gene 22., 277-280 (1983). 16. Alton, N.K. and Vapnek, D. Nature 282. 864-869

(1979) . 17. Yang, M., Galizzi, A., and Henner, D. Nuc. Acids Res. lim . 237-248 (1983).18. Wong, S.-L., Price C.W., Goldfarb, D.S., and Doi, /R.H. Proe. Nati. Acad. Sei. USA fli, 1184-1188 (1984). 19. Wang, P.-Z. and Doi, R.H. J. Biol. Chem. 251, 8619-8625, (1984). 20. Lin, C-K., Quinn, L.A., Rodriguez, R.L. J. Cell Biochem. Suppl. ( 9B). p. 198 (1985). 21. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, c., Banner, c, Nagle, J., and Filpula, D. J. Bact. 159 ( 3 ) . 811-819

(1984). 22. Plava, I., Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibazkov, M., and Kaariainen, L. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 5582-5586 (1982). 23. Wong. S.-L., Pricee, C.W., Goldfarb, D.S., and/Doi, R.H. Proe. Nati. Acad. Sei. USA fil., 1184-1188 (1984). 24. Sullivan, M.A., Yasbin, R.E., Young, F.E. Gene 29, 21-46 (1984). 25. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C. Nagle, J., and Filula, D.J. Bact. 159 ( 3 ) . 811-819 (1984). 26. Yansura, D.G. and Henner, D. J. PNAS fli, 439-443

(1984). 27. Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H. and Heyneker, H.L. Biotechnology, 161-165 (1984).

28. Lory, S., and Tai, P.C. Gene 22, 95-101 (1983).

29. Liu, P.V. J. Infect. Dis. 130 (suppl)/, 594-599

(1974). 30. Wood, D.G., Hollinger, M.F., and Tindol, M.B. J. Bact. 145, 1448-1451 (1981). 31. St. John, T.P. and Davis, R.W. J. Mol. Biol. 152, 285-315 (1981). 32. Hopper, J.E., and Rowe, L.B. J. Biol. Chem. 253. 7566-7569 (1978). 33. Denis, C.L., Ferguson, J. and Young, E.T. J. Biol. Chem. 25_&#1165-1171 (1983). 34. Lutsdorf, L. and Megnet, R. Archs. Biochem. Biophys. 126. 933-944 (1968). 35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, H. and Hinnen, A. EMBO. J. 6, 675-680 (1982).36. Watson, M.E. Nucleic Ac id Research 12., 5145-5164

(1984) .

37. Gerband, C. and Guerineau, M. Curr. Genet, l, 219-228

(1980).38. Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75., 1929-1933 (1978).39. Jabbar, M.A., Sivasubramanian, N. and Nayak, D.P. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82., 2019-2023 (1985).

(a) Pseudomonas- vektorer

Flere vektor-plasmider som autonomt replikerer i et stort antall Gram-negative bakterier, kan anvendes som klonings-bærere i verter av slekten Pseudomonoas. Endel av disse er beskrevet av Tait, R.C, Close, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya, M. , Rodriguez, R.L., og Kado, CI. i Biotechnology, mai 1983, s. 269-275; Paopoulos,N.J. i Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, s. 163-185 (1981): og Sakagucki, K. i Current Topics i Microbiology and Immunology 96:31-45 (1982), hver er spesifikt inkorporert heri som referanse.

En konstruksjon som kan anvendes, er plasmid RSF1010 og derivater derav som beskrevet av Bagdasarian, M., Bagda-satian, M.M., Coleman, S. , og Timmis, K.N. i Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. og Puhler, A. eds. Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), spesifikt inkorporert heri som referanse. Fordelene ved RSF1010 er at det er et relativt lite, høyt kopi antall plasmid som lett blir transformert inn i og stabilt opprettholdt i både E. coli og Pseudomonas-artene. I dette systemet vil det være en fordel å anvende Tac-eks-presjonssystemet som beskrevet for Escherchia, siden det ser ut som om E. coli trp promoteren lett blir gjenkjent av Pseudomonas RNA polymerase som angitt av Sakagucki, K. i Current Topics in Microbiology and Immunology 96:31-45 (1982) og Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones A.J.S., Seeburg, P.H., og Heyneker, H.L. i Biotechnology, februar 1984, s. 161-165, begge er spesifikt inkorporert heri som referanse. Transkripsjonen aktivitet kan bli videre maksimalisert ved å kreve utveksling av promoteren med f.eks. en E. coli eller P. aeruginosa trp promoter. I tillegg vil lacl-genet til E. coli også bli innbefattet i plasmidet for å oppnå regulering.

Translasjon kan bli koblet til translasjonsinitiering for hvilke som helst av Pseudomonas-proteinene, samt initierings-seter for hvilke som helst av de høyt uttrykte proteinene av den typen valgt for å forårsake intracellulær ekspresjon av det neruotrofiske proteinet.

I de tilfellene hvor restriksjons-minus-stammene til en vert Pseudomonas-art ikke er tilgjengelig, er transformasjonsef-fektiviteten med plasmidkonstruksjoner isolert fra E. coli. dårlig. Passasje av Pseudomonas kloningsvektoren gjennom en r- m+-stamme fra en annen art før transformasjon av ønsket vert som angitt i Bagdasarian, M. , et al., Plasmids of Medivcal, Environmental and Commercial Importance, s. 411-422, Timmis og Puhler eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), er spesifikt inkorporert heri som referanse om ønskelig.

(b) Baeillus- vektorer

Et ekspresjonssystem i verter av slekten Bacillus involverer anvendelse av plasmid pUBllO som kloningsbeholder. Som i andre vertsvektorsystemer er det i Bacillus mulig å uttrykke de neurotrofiske proteinene som enten et intracellulært eller et uskilt protein. Dette innbefatter begge systemene. Skyttelvektorer som replikerer i både Bacillus og E. coli er tilgjengelige for konstruering og testing av forskjellige gener som beskrevet av Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., og Shivakumar, A.G. i Genetic Engineering, Vol 2, Setlow og Hollander eds., Plenum Press, New York, New York, s. 115-131

(1980), spesifikt inkorporert heri som referanse. For ekspresjon og utskillelse av neurotrofiske proteiner fra B. subtilis, er signalsekvensen til alfa-amylase fortrinnsvis koblet til den kodende regionen for proteinet. For syntese av intracellulært protein, vil den transportable DNA-sekvensen bli translasjonelt koblet til ribosombindingssetet til alfa-amylase-ledersekvensen.

Transkripsjon av hvilke som helst av disse konstruksjonene blir fortrinnsvis ledet av alfa-amylasepromoteren eller et derivat derav. Dette derivatet inneholder RNA polymerasegjen-kj enningssekvensen til det native alfa-amylasepromoteren, men inkorporerer også lac-operatorregionen. Lignende hybridpro-motere konstruert fra penicillinase-genpromoteren og lac-operatoren har blitt vist å virke i Bacillus verter på en regulerbar måte som angitt av Yansura, D.G. og Henner i Genentics and Biotechnology of Bacilii, Ganesan, A.T. og Hoch, J.A., eds. Academic Press, s. 249-263 (1984), og er spesifikt inkorporert som referanse, lacl-genet til E. coli kan også bli innbefattet i plasmidet for å oppnå regulering.

(c) Colstridium- vektorer

En konstruksjon for ekspresjon i Clostridium er i plasmid pJU12, beskrevet av Squires, C.H. et al., i J. Bacteriol. 159:465-471 (1984) og spesifikt inkorporert heri ved referanse, transformert inn i C. perfringens ved fremgangsmåten til Heefner, D.L. et al., som beksrevet i J. Bacteriol. 159:460-464 (1984), spesifikt inkorporert heri som referanse. Transkripsjonen er ledet av promoteren til tetracyklin-resistensgenet. Translasjonen er koblet til Shine-Dalgarno-sekvenser til dette samme tet<r->genet på en måte som er analogt med fremgangsmåtene beskrevet ovenfor for vektorer egnede for anvendelse i andre verter.

(d) Gjær- vektorer

Opprettholdelse av fremmed DNA ført inn i gjær, kan bli oppnådd på flere måter som beskrevet av Botstein.D. og Davis, R.W., i The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones og Broach, eds. s. 607-636 (1982), spesifikt inkorporert heri som referanse. Et ekspresjonssystem for anvendelse med vertsorga-nismer fra slekten Saccharomyces inneholder det neurotrofiske proteingenet på 2 um plasmidet. Fordelene ved 2 um sirkelen innbefatter relativt høyt kopiantall og stabilitet når ført inn i eir'-stammer. disse vektorene inkorporerer fortrinnsvis replikasjonsorigo og minst en antibiotikaresistensmarkør fra pBR322 for å muliggjøre replikasjon og seleksjon i E. coli. I tillegg har plasmidet fortrinnsvis to pm sekvensen og gjær LEU2-genet for å ha samme hensikter i LEU2 defekte gjærmutan-ter.

Dersom det gjelder at de remombinante neurotrofiske proteinene vil bli uttrykt i gjær, er det en fordel at kloningsvektoren først blir overført i Escherchia coli, hvor vektoren kan replikere og som vektoren blir oppnådd fra og renset etter ampiifikasjon. Vektoren blir deretter overført til gjær for ekspresjon av proteinet.

(iii) Pattedyr- celler

cDNA for det neurotrofiske proteinet vil virke som genet for ekspresjon av proteinet i psattedyrceller. Det bør ha en sekvens som effektivt vil binde ribosomer som beskrevet av Kozak, i Nucleic Acids Research 15:8125-8132 (1987), spesifikt inkorporert heri som referanse, og bør ha kodende kapasitet for en ledersekvens (se seksjon 3 (a) (vi) for å lede modent protein ut av cellen i en prosessert form. DNArestriksjonsfragmentet inneholdende den fullstendige cDNA-sekvensen kan bli skutt inn i en ekspresjonsvektor som har en transkripsjonen promoter og en transkripsjonen enhancer som beskrevet av Guarente, L. i Cell 52:303-305 (1988) og Kadonaga, J.T. et al., i Cell 51:1079-1090 (1987), og begge er spesifikt inkorporert heri som referanse. Promoteren kan være regulerbar som i plasmid pMSG (Pharmacia Cat. nr. 27450601) dersom konstitutiv ekspresjon av proteinet er skadelig for celleveksten. Vektoren bør ha et fullstendig polyadenyleringssignal som beskrevet av Ausubel, F.M. et al. i Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987), spesifikt inkorporert heri som referanse, slik at mRNA transkribert fra denne vektoren blir riktig prosessert. Til slutt bør vektoren ha replikasjonsorigo og minst en anti-biotikaresistensmarkør fra pBR322 for å muliggjøre replikasjon og seleksjon i E. coli.

For å selektere en stabil cellelinje som produserer de neurotrofiske proteinene, kan ekspresjonsvektoren inneholde genet for en selekterbar markør så som en medikament-resistent markør eller inneholde et komplementært gen for en manglende cellelinje, så som et dihydrofolat reduktase (dhfr) gen for transformering av en dhfr- cellelinje som beskrevet av Ausubel et al., supra. Alternativt kan et separat plasmid, inneholdende den selekterbare markøren, bli kotransformert sammen med ekspresjonsvektoren.

D. Vertceller/ transformasjon

Vektoren oppnådd på denne måten blir overført til en hensiktsmessig vertscelle. Disse vertscellene kan være mikroorganismer, insektceller eller pattedyrceller. Vertscellene som blir anvendt kan være mikroorganismer, og mer spesifikt E. coli-celler.

(i) Mikroorganismer

Det antas at eventuelle mikroorganismer som har evnen til å ta opp eksogent DNA og uttrykke de genene og vedhørende operasjonelle elementer kan bli valgt. Etter at en verts-organisme er blitt valgt, blir vektoren overført til vertsorganismen ved anvendelse av fremgangsmåter som generelt er kjente for fagfolk innenfor området. Eksemplet på slike fremgangsmåter finnes i Advanced Bacterial Genetics av R.W. Davis et al., Cold Spring Harbor press, Cold Spring harbor, New York, (1980), som spesifikt er inkorporert heri som referanse. Transformasjonen kan oppstå ved lave temperaturer, idet temperaturregulering er betraktet som et middel for regulering av genekspresjonen gjennom anvendelse av operasjonelle elementer som angitt ovenfor. Dersom osmolære regulatorer er blitt innskutt i vektoren, reguleringen av saltkonsentrasjonene i løpet av transformasjonen være nødvendig for å forsikre hensiktsmessig kontroll av de fremmede genene.

Vertsmikro-organismen kan være en fakultativ anaerob eller en aerob. Bestemte verter for anvendelse i denne fremgangsmåten, kan innbefatte gjær og bakterier. Spesifikke gjær omfatter de fra slekten Saccharomyces, og spesielt Saccharomyces cervisiae. Spesifikke bakterier innbefatter de fra slekten Bacillus, Escherchia og Pseudomonas, spesielt Bacillus subtilis og Escherchia coli. Ytterligere vertsceller er oppført i tabell I, ovenfor. (1) Eventuelle intramolekylære eller intramolekylære disulfidbindinger og/eller eventuelle ikke-kovalente interaksjoner som har oppstått innbefattende det modne neurotrofiske proteinet produsert i en mikroorganisme, blir først ødelagt. For å oppnå dette, blir proteinet eksponert for tilstrekkelige denatureringsmiddel, for eksempel guanidin, hydroklorid eller urea) og tilstrekkelig reduksjonsmiddel f.eks. beta-merkaptoetanol, ditiotreitol eller cystein) for å denaturere proteinet, ødelegge ikke-kovalente interaksjoner og redusere disulfidbindinger. (2) Etter at det modne neurotrofiske proteiner er blitt denaturert og redusert, blir de frie tiolene tilstede i det redusert proteinet oksydert ved tilsetning av et stort overskudd disulfidinneholdende reagens (f.eks. glutation eller cystin). Denne reaksjonen danner blandede disulfidbindinger der hver cysteinrest i det modne neurotrofiske proteinet danner en disulfidbinding med den monomeriske formen av oksydasjonsmidlet. Dette trinnet hjelper med å forhindre dannelsen av ukorrekte intramolekylære disulfidbindinger i det neurotrofiske proteinet i løpet av påfølgende prosessering. (3) Denatureringsmidlet og oksyderingsmidlet blir deretter fortynnet til en definert konsentrasjon og et tiolinneholdende reagens (for eksempel cystein) blir tilsatt for å katalysere disulfidendringene. Hensikten er å produsere et miljø der konsentrasjonen av denatureringsmidlet er tilstrekkelig redusert for å muliggjøre at det neurotrofiske proteinet opptar forskjellige 3-dimensjonale konfigurasjoner og der .oksydasjons/reduksjonspotensialet blir justert for å muliggjøre dannelsen og brudd av disulfidbindinger. Det antas at riktig 3-dimensjonal struktur og disulfidbindingsmønstre til det modne neurotrofiske proteinet er energetisk mere stabilt enn andre mulige konformasjoner. Betingelser der det neurotrofiske proteinet får oppta forskjellige 3-dimensjonale konformasjoner og intramolekylære disulfidbindingsmønstre, vil derfor muliggjøre at en betraktelid del av det neurotrof iske proteinet gjenoppretter riktige intramolekylære disulfidbindingsmønstre, korrekt 3-dimensjonal struktur, og derfor blir biologisk aktivt.

I en foretrukket utførelsesform blir det rekombinante neurotrofiske proteinet oppløst til en konsentrasjon på mellom .1-2 mg/ml i en bufferoppløsning inneholdende urea. Om nødvendig blir pH til slik oppløsning gjort alkalisk ved tilsetning av en høyere pH bufferoppløsning, også inneholdende urea, for å fremme disulfidutveksling. Reduksjonsmidlet blir tilsatt til en final konsentrasjon på omtrent 1-15 mM. Oksyderingsmidlet blir deretter tilsatt til en final konsentrasjon på omtrent 15-50 mM. Fortynning av de neurotrofiske proteinet inneholdende oppløsningen er til omtrent 5-20 ganger, og tiolinneholdende reagens blir tilsatt til en konsentrasjon slik at oppløsningen inneholde romtrent 2-3 ganger mere tiolinneholdende reagens enn disulfidinnholdende reagens.

I de mest foretrukne utførelsesformene for refolding av rekombinante neurotrofiske proteiner, blir den endelige refoldingsblandingen utluftet, og refolding blir latt oppstå i anaerobisk tilstand. I tillegg, i den mest foretrukne utførelsesformen ifølge foreliggende oppfinnelse, blir en NGF-oppløsningen vesentlig renset fra andre proteiner før refolding. Med vesentlig renset, menes i denne sammenhengen at oppløsningen er vesentlig fri for vertcelleproteiner som interferer med raten eller effektiviteten til NGF-refoldingen . I foretrukken utførelsesformer ifølge oppfinnelsen, blir glykol inneholdende reagenser også innbefattet i refoldingsblandingen.

Disse fremgangsmåtene er milde og bør ikke resultere i kjemisk modifikasjon av det neurotrofiske proteinet. Dersom urea blir anvendt som et denatureringsmiddel i protokollen, er det viktig å fjerne cyanat som kan bli dannet ved å sende ureaoppløsnignen voer en ionebyttekolonne, så som DOWEX 1-X8(BioRad). Dersom cyanat ikke blir fjernet, kan det modifisere aminogruppene i proteinet (Stark 1967 Methods in Enzymology 11.125).

Den optimale konsentrasjonen og valg av denatureringsmiddel, oksyderende reagens, tiolreagenser og deres konsentrasjoner i den endelige refoldingsoppløsningen, blir bestemt eks-perimentelt ved å registrere proporsjonen av neurotrofisk protein som blir riktig refoldet og biologisk aktiv. Hensikten med den endelige refoldingsoppløsningen er å tilveiebringe et kontroller miljø der disulfidutvekslingen og konformasjonelle forandringer kan oppstå i det neurotrofikse proteinet, helt til ønsket konformasjon og disulfid-bindingsmønstret blir ooppnådd. Foretrukne betingelser for optimal refolding som angitt ovenfor, er ventet å være vesentlig de samme for alle medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofiske proteiner på grunn av at de er nært beslektede i aminosyresekvens, inkludert den relative beliggenheten til alle seks cysteinresidiene i det modne proteinet, og derfor opptar samme disulfidbindingsmønstre.

(i i) Patted<y>rceller

Vektoren kan bli ført inn i pattedyrceller i kultur ved flere teknikker så som kalsiumfosfat: DNA kopresipitasjon, elektroproasjon eller protoplastfusjon. En fremgangsmåte er kopresipitasjon med kalsiumfosfat som beskrevet av Ausubel et al., supra.

Mange stabile celletyper eksisterer som er transformerbare og som kan transkribere og translatere cDNA-sekvensen, prosessere forløper-neurotrofiske proteiner og utskille det modne proteinet. Celletypene kan derimot være variable med hensyn på glykosylering av utskilte proteiner og post-translasjonell modifikasjon av aminosyreresidiene. Ideelle celletyper er de som produserer et rekombinant neurotrofisk protein identisk med det naturlige molekylet.

E. Dyrkning av omkonstruerte celler

Vertcellene blir dyrket under betingelser som er hensiktsmessig for ekspresjon av neurotrofiske proteiner. Disse betingelsene er generelt spesifikke for vertcellen, og kan lett bestemmes av fagfolk i lys av publisert litteratur vedrørende vekstbetingelser for slike celler og beskrivelsene deri. For eksempel inneholder Bergey's Manual og Determina-tive Bacteriology, 8th Ed., Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, som er spesifikt inkorporert heri som referanse, informasjon på betingelser for dyrkning av bakterier. Lignende informasjon på dyrking av gjær og pattedyrceller kan oppnås fra Pollack, R. Mammalian Cell Culture, Cold Spring harbor Laboratories (1975), spesifikt inkorporert heri som referanse.

Hvilke som helst betingelser nødvendige for regulering av ekspresjonen av DNA-sekvensen, avhengig av operasjonelle elementer skutt inn i eller tilstede i vektoren, vil virke ved transformasjons- og dyrkingsstadiene. Cellene kan dyrkes til høy tetthet i nærvær av hensiktsmessige regulatoriske betingelser som inhiberer ekspresjonen av DNA-sekvensen. Når optimal celletetthet oppnås, blir omgivende betingelser endret til de som er hensiktsmessig for ekspresjon av DNA-sekvensen. Dét blir dermed betraktet at produksjon av de neurotrofiske proteinene vil oppstå i det tidsområde etter veksten av vertscellene til nesten optimal tetthet, og det resulterende protein vil bli høstet etter at de regulatoriske betingelsene nødvendig for dets ekspresjon ble indusert.

4. Renaturering av uttrykte rekombiannte proteiner.

I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse, blir de rekombinante modne neurotrofiske proteinene renset etter høsting og før oppnåelse av deres aktive struktur. Denne utførelsesformen er foretrukket på grunn av at oppfinnerne mener at isolering av et høyt utbytte refoldet protein blir lettere, dersom proteinet først blir renset. Det neurotrofiske proteinet kan bli refoldet for å oppnå dets aktive sturktur før rensing. Ifølge foreliggende oppfinnelse er proteinet tilstede i dets refoldete aktive tilstand ved isolering fra kulturmediet.

I visse tilfeller vil det modne neurotrofiske proteinet innta riktig aktiv struktur ved ekspresjon i verts-mikroorganismen og transport av proteinet gjennom celleveggen eller membranet eller inn i periplasmaområdet. Dette vil generelt oppstå dersom DNA kodende for en hensiktsmessig ledersekvens er blitt koblet til DNA kodende for det rekombinante proteinet.

I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse kan proteinet produsert i mikroorganismer mangle vesentlig biologisk aktivitet og må bli refoldet og renaturert for å tilveiebringe et neurotrofisk protein med en biologisk spesifikk aktivitet som er ventet av medlemmene av NGF/BDNF-familien. Den ventede spesifikke aktiviteten er enten den som er observert for proteinet uttrykt i eukaryote celler eller den som er observert for samme eller et beslektet protein renset fra naturlige kilder (f.eks. muse-submaksilliærkjertel NGF og grisehjerne BDNF).

Ofte er mangelen på biologisk aktivitet i proteiner uttrykt i mikroorganismer relatert til uriktig dannelse av intramolekylære disulfidbindinger. Rekombinant neurotrofisk protein produsert i E. coli kan bli refoldet og renaturert for å oppnå riktig konfigurasjon av intramolekylære disulfidbindinger og ventet biologisk spesifikk aktivitet.

I en versjon kan det rekombinante proteinet bli refoldet og renaturert ved anvendelse av følgende trinn: (1) Eventuelle intramolekylære eller intermolekylære disulfidbindinger og/eller eventuelle ikke-kovalente interaksjoner som har oppstått, innbefattende det modne neurotrofiske proteinet produsert i en mikroorganisme blir først ødelagt. For å oppnå dette, bli proteinet eksponert for tilstrekkelige denatureringsmiddel (f.eks. guanidin, hydroklorid eller urea) og tilstrekkelig reduksjonsmiddel (f.eks. beta-merkaptoetanol, ditiotreitol eller cystein) for å denaturere proteinet, ødelegge ikke-kovalente interaksjoner og redusere disulfidbindinger. (2) Etter at det modne neurotrofiske proteinet er blitt denaturert og redusert, blir de frie tiolene tilstede i det reduserte proteinet oksydert ved tilsetning av et stort overskudd disulfidinneholdende reagens (f.eks. flutation eller cystin). Denne reaksjonen danner blandede disulfidbindinger der hver cysteinrest i det modne neurotrofiske proteinet danner en disulfidbinding med den monomeriske formen av oksydasjonsmidlet. Dette trinnet hjelper med å forhindre dannelsen av ukorrekte intramolekylære disulfidbindinger i det neurotrofiske proteinet i løpet av påfølgende prosessering. (3) Denatureringsmidlet og oksyderingsmidlet blir deretter fortynnet til en definert konsentrasjon og et tiolinneholdende reagens (f.eks. cystein) blir tilsatt for å katalysere disulfidendringene. Hensikten er å produsere et miljø der konsentrasjonen denatureringsmidlet er tilstrekkelig redusert for å muliggjøre at det neurotrofiske proteinet opptar forskjellige tre-dimensjonale konfigurasjoner, og der oksydasjons/reduksjonspotensialet blir juster for å mulig- gjøre dannelsen og brudd av disulfidbindinger. Det antas at riktig 3-dimensjonal struktur og disulfidbindingsmønstre til det modne neurotrofiske proteinet er energetisk mer stabilt enn andre mulige konformasjoner. Betingelser der det neurotrofiske proteinet får oppta forskjellige tredimensjonale konformasjoner og intramolekylære disulfidbind-ingsmønstre vil derfor muliggjøre at en betraktelig del av det neurotrofiske proteinet gjenoppretter riktige intramolekylære disulfidbindingsmønstre, den korrekte 3-dimensjonale struktur, og derfor blir biologisk aktivt.

I en foretrukket utførelsesform blir det rekombinante neurotrofiske proteinet oppløst til en konsentrasjon på mellom .1-2 mg/ml i en bufferoppløsning inneholdende urea. Om nødvendig blir pH til slik oppløsning gjort alkalisk ved tilsetning av en høyere pH-bufferoppløsning, også inneholdende urea, for å fremme disulfidutveksling. Eeduksjonsmidlet blir tilsatt til en final konsentrasjon på omtrent 5-15 mM. Oksyderingsmidlet blir deretter tilsatt til en final konsentrasjon på omtrent 15-50 mM. Fortynning av det neurotrofiske proteinet inneholdende oppløsningen, er til omtrent 5-20 ganger, og tiolinneholdende reagens blir tilsatt til en konsentrasjon, slik at oppløsningen inneholder omtrent 2-3 ganger mer tiolinneholdende reagens enn disulfidinneholdende reagens.

For refolding av rekombinante neurotrofiske proteiner, kan den endelige refoldingsblandingen bli utluftet, og refolding oppstår i anaerobisk tilstand. I tillegg blir NGF-oppløs-ningen vesentlig renset fra andre proteiner før refolding. Med vesentlig renset, menes i denne sammenheng at oppløs-ningen er vesentlig fri for vertcelleproteiner som interferer med raten eller effektiviteten til NGF-refolding. Glykolin-neholdende reagenser kan også innbefattes i refoldingsblandingen .

Disse fremgangsmåtene er milde og bør ikke resultere i kjemisk modifikasjon av det neurotrofiske proteinet. Dersom urea blir anvendt som et denatureringsmiddel i protokollen, er det viktig å fjerne cyanat som kan bli dannet ved å sende ureaoppløsningen over i en ionebyttekolonne, så som DOWEX 1-X8(BioRad). Dersom cyanat ikke blir fjernet, kan det modifisere aminogruppene i proteinet (Stark 1967 Methods in Enzymology 11:125).

Den optimale konsentrasjonen og valg av denatureringsmiddel, oksyderende reagens, tiolreagenser og deres konsentrasjoner i den endelige refoldingsoppløsningen, blir bestemt eks-perimentelt ved å registrere proporsjonen av neurotrofisk protein som blir riktig refoldet og biologisk aktiv. Hensikten med den endelige refoldingsoppløsningen er å tilveiebringe et kontrollert miljø der disulfidutvekslingen og konformasjonelle forandringer kan oppstå i det neurotrofiske proteinet, helt til ønsket konformasjon og disulfidbind-ingsmønstre blir oppnådd. Foretrukne betingelse for optimal refolding som angitt ovenfor, er ventet å være vesentlig de samme for medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofi ske proteiner, på grunn av at de er nært beslektede i aminosyresekvens, inkludert relative beliggenheten til alle seks cysteinresidiene i det modne proteinet, og derfor opptar samme disulfidbindingsmønstre.

Utførelsesformer for refolding ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør ekspresjon av neurotrofiske proteiner i et ønsket ekspresjonssystem som er blitt vist ikke å tilveiebringe biologisk aktive neurotrofiske proteiner. Ifølge fremgangsmåtene vil det bakterielt uttrykte rekombinante neurotrofiske proteinet oppnå minst 10% biologisk aktivitet, eller det neurotrofikse proteinet vil innta minst 30% biologisk aktivitet. Proteinet vil kunne være minst 50% biologisk aktivt.

Eksempel 3 nedenfor beskriver et eksperiment som viser at denne refoldingsprotokollen er vellykket for refolding av moden NGF produsert i bakterier som følger: (1) Riktig foldet og fullstendig-biologisk aktiv moden NGF, enten produsert i et eukaryotisk celle-ekspresjonssystem eller renset fra naturlige kilder, blir denaturert og disulfidbindinger redusert som beskrevet ovenfor, som forårsaker et tap av biologisk aktivitet. På grunn av at NGF var biologisk aktivt før denaturering og reduksjon, er det mulig å demonstrere at denaturering og refolding har oppstått ved tap av biologisk aktivitet; (2) Denaturert og redusert NGF blir renaturert ifølge protokollen beskrevet heri, for å bestemme at biologisk aktivitet er blitt gjenopprettet. Det antas at gjenopprettelse av biologisk aktivitet er avhengig av rikt refolding og renaturering av denaturert og redusert protein. Det er forsikret at moden NGF fra en hvilken som helst kilde angitt ovenfor, inkludert et bakterielt celle-ekspresjonssystem vil være strukturelt uskjeldbart etter denaturering og reduksjon. Vellykket refolding av denaturert og redusert moden NGF fra enten et eukaryotisk celle-ekspresjonssystem eller fra naturlige kilder indikerer derfor at moden NGF produsert i bakterielle celler kan bli vellykket refoldet (se eksempel 3 og fig. 3).

Eksempel 3B beskriver den vellykkede refoldingen av moden NGF produsert i et bakterielt ekspresjonssystem ved anvendelse av E. coli, ved anvendelse av fremgangsmåter som ligner de som er beskrevet ovenfor. Refoldet NGF er fullstendig biologisk aktivt og migrerer i posisjonen til nativ insektcelleprodusert NGF på reversert fase høy-ydelseskromatografi. 5. Rensing av rekombinant neurotrofisk protein Protokollen beskrevet ovenfor for å refolde og renaturere modent neurotrofisk protein, kan bli anvendt ved et stadium i løpet av rensningen av det rekombinante proteinet som er mest hensiktsmessig og som er blitt bestemt ved eksperimenter å produsere et høyt utbytte biologisk aktivt protein.

De rekombinante medlemmer av NGF/BDNF-familien kan bli renset fra ekstrakter av ekspresjonsvertcellen ved standard-teknikker innen proteinkjemi, helt til det rekombinante proteinet er tilstrekkelig rent for å bli anvendt i farma-søytiske prepareringer. En slik renhet er definert som minst 90% av alle proteinene i preparatet er det neurotrofiske proteinet, og fortrinnsvis minst 90% av alle proteinene er neurotrofisk protein. Fremgangsmåtene som blir anvendt for rensing av det rekombinante proteinet kan innbefatte følgende: Ionebyttekromatografi (f.eks. Q-, S- og DEAE-Sepharose-ionebyttekolonner), gel-permeasjonskromatografi (f.eks. Superose-størrelseskolonner), kromatofokusering (f.eks. mono-P-kolonner), hydrofobisk interaksjonskroamto-grafi (f.eks. oktyl- og fenyl-Sepharose HIC-kolonne), affinitetskromatografi (f.eks. zink, kobber og kvikksølv-metall-affinitetskolonner). 6. Formulering av farmasøytiske produkter Som angitt tidligere er neurotrofiske proteiner betraktet for anvendelse som terapeutiske midler, og skal dermed bli formulert i farmasøytisk akseptable bærere. De neurotrofiske proteinene kan bli modifisert kjemisk for å forbedre de farmakokinetiske egenskapene til molekylene. Et eksempel vil være kobling av polymeriske materialer med høyere molekylvekt, så som polyetylenglykol, til det neurotrofiske proteinet. Neurotrofiske proteiner kan bli administrert separat, i kombinasjon med andre medlemmer av NGF/BDNF-familien av neurotrofikse proteiner, eller i kombinasjon med andre neurotrofikse proteiner eller andre terapeutiske midler, avhengig av type nervecelleforstyrrelse som blir behandlet.

Den terapeutiske sammensetningen kan fortrinnsvis bli administrert parenteralt ved injeksjon eller intratekalt ved kontinuerlig infusjon fra en implantert pumpe. Andre effektive administrasjonsformer, så som parenteral sakte frigjørende formuleringer, inhaleringsstøv, oralt aktive formuleringer eller suppositorier, kommer i betraktning. En bærer kan være fysiologisk saltvannsoppløsning, men det er betraktet at andre farmasøytisk akseptable bærere også kan bli anvendt. Bæreren og det neurotrofiske proteinet kan utgjøre en fysiologisk-kompatibel sakte frigjørende formulering. Det primære oppløsningsmidlet i en slik bærer kan være av enten vandig eller ikke-vandig natur. Bæreren kan i tillegg inneholde andre farmakologisk akseptable eksipienter for modifisering eller opprettholdelse eller opprettholdelse av pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farve, sterilitet, stabilitet, oppløsningshastighet eller lukt på formuleringen. Bæreren kan likeledes inneholde ytterligere andre farmakologisk akseptable eksipienter for modifisering eller opprettholdelse av stabiliteten, oppløsningshastigheten, frigjør-ingen eller absorpsjonen av det neurotrofiske proteinet. Slike eksipienter er de forbindelsene som er vanlige, og som blir anvendt for å formulere doseringer for parenteral administrasjon i enten enhetsdose eller multi-doseform eller for intratekal levering ved kontinuerlig eller periodisk infusjon fra en implantert pumpe eller intratekalt ved periodisk injeksjon.

Når den terapeutiske sammensetningen er blitt formulert, kan den bli lagret i sterile beholdere, så som en oppløsning, suspensjon, gel, emulsjon, faststoff eller dehydrert eller lyofilisert pulver. Slike formuleringer kan bli lagret enten i en klar til bruk form eller som krever rekonstitusjon rett før administrasjon. Foretrukket lagring av slike formuleringer er ved temperaturer som minst er så lave som 4°C og fortrinnsvis ved -70° C. Det er også foretrukket at slike formuleringer inneholdende neurotrofisk protein blir lagret og administrert ved, eller nære ved, fysiologisk pH. Det antas at lagring og administrasjon i en formulering ved Ph under omtrent pH 5,5 og over omtrent pH 8,9 er uønsket. Fremgangsmåte for parenteral administrering av formuleringene inneholdende neurotrofisk proteine er fortrinnsvis via en suhkutan eller intramuskulær vei. For å oppnå ønsket dose av neurotrofisk protein, kan gjentatte daglige, eller mindre hyppige suhkutane eller intramuskulære injeksjoner bli administrert. Det antas at administrasjonen av neurotrofisk protein i daglig dose under omtrent 0,01 mg/kg ikke behøver å være effektive, mens administrasjon av daglige doser som er større enn 1 mg/kg har uønskede bivirkninger. Det er også betraktet av visse formuleringer inneholdende neurotrofisk protein skal bli administrert oralt. Neurotrofisk protein som blir administrert på denne måten, er fortrinnsvis innkapslet. Innkapslet neurotrofisk protein kan bli formulert med eller uten bærere som vanligvis blir anvendt ved dannelse av faste doseringsformer. Kapslen blir fortrinnsvis konstruert slik at den aktive delen av formuleringen blir frigjort ved det punktet i mave-tarmkanalen når biotilgjengeligheten er maksimalisert og presystemisk degradering er minimalisert, ytterligere eksipienter kan bli innbefattet for å lette absorpsjonen av neurotrofisk protein. Fortynningsmidler, smakstoffer lavt smeltepunkt voks, vegetabilske oljer, smøremidler, suspenderingsmidler, tablettdesintegrerende midler og bindemidlet kan også bli anvendt.

Uansett administrasjonsmåte blir den spesifikke dosen beregnet ifølge omtrentlig kroppsvekt til pasienten. Ytterligere endringer på beregningene nødvendig for å bestemme hensiktsmessig dosering for behandling som involverer hver av ovennevnte formuleringer, blir rutinemessig utført av fagfolk, og kan bestemmes uten eksperimentering. I biologiske tester blir ingen toksiske virkninger observert ved anvendelse av de neurotrofiske proteinene.

EKSEMPEL 1

ISOLASJON, SEKVENSERING OG EKSPRESJON AV DET

HUMANE GENET FOR BDNF

A. Anvendelse av polymerasekjedereaks. iori for å amplifisere deler av det humane BDNF- genet.

Følgende oligonukleotider ble syntetisert basert på det rapporterte nukleinsyresekvensen for grise-BDNF (Leibrock et al. 1989 ibid.): BNDF-1 [ikke-degenerert, senstråd oligo beliggende rett oppstrøms for den femte kodende basen i grise-BDNF, også inneholdende et 5' BamHI-sete] BDNF-2 [delvis degenerert "guessmer", senstrådoligo nedstrøms fra initieringskodonet for grise-BDNF; denne oligo ble syntetisert i to forskjellige pooler for å redusere degenerasjon; en "guessmer" er et oligonukleotid der degenerasjonen er blitt redusert ved anvendelse av preferanser for kodonbruk fra pattedyr] BDNF-3 [ikke-degenert, anti-senstråd oligo liggende rett nedstrøms for termineringskodonet for grise-BDNF, også inneholdende et 5' Spel sete]

BDNF-4 [delvis deggenerert "guessmer", anti-senstråd oligo oppstrøms fra termineringskodonet for grise-BDNF] BNDF-5 [degenert, sen???strådoligo beliggende i den kodende regionen for det modne (prosesserte) BDNF-proteinet]

PCR-reaksjonene ble utført ved anvendelse av humant genomisk DNA som templat og følgende kombinasjoner av syntetsike oligonukleotider som primere: BDNF-1 og BDNF-3; BDNF-2A og BDNF-3; BDNF-3; BDNF-2A og BDNF-4; BDNF-2B og BDNF-4; og BDNF-1 og BDNF-4. Reaksjonsproduktene ble elektroforert og DNA (Southern) blots ble probet med radioaktivt merket BDNF-5, for å identifisere amplifiserte fragmenter som sannsynligvis korresponderer med human BDNF. Se eksperimentell appendix i dette eksemplet for detaljer.

Det var bånd ved omtrentlig ventet størrelse som hybridiserte til BDNF-5 i reaksjonene ved anvendelse av BNDF-1/BNDF-3, BNDF-2A/BNDF--3 og BNDF-2B/BNDF-3 som primere. DNA ved posisjonen til det hybridiserende Southern-båndet fra elektroforert BNDF-l/BNDF-3 reaksjonsblanding ble kuttet ut av gelen og en aliquot ble sekvensert direkte ved anvendelse av BNDF-1 og BNDF-3 som sekvenseringspr imere for å tilveiebringe en delsekvens av det humane genet i den kodende region for BNDF (fig. 1). Gjenværende av dette amplifiserte DNA ble subklonet inn i Smal-spaltet phage M13mpl0 og positive subkloner selektert, basert på hybridisering til radioaktivt merket BNDF-5. To uavhengige positive subkloner i motsatte orienteringer, BNDF-PCR1 & 2, ble sekvensert for å tilveiebringe sekvensen til det humane genet i den kodende regionen for BNDF (fig. 1).

B. Anvendelse av DNA amplifiserte med PCR for å klone

det humane genet for BNDF.

DNA ved posisjonen til amplifisert hybridiserende Southern-bånd ble radioaktivt merket og anvendt for å screene et humant genomisk DNA-bibliotek i phage lambda EMBL3 og 6 positive kloner ble plaque-renset. DNA fra klon #3 ble spaltet separat med følgende restriksjonsenzuymer: HinfI; Alul; Rsal; og NcoI/Sau3AI. Disse enzymene ble valgt på grunn av at de bryter den BNDF-kodende sekvensen i flere fragmenter regnede i størrelse for kloning inn i M13. Restriksjonsfragmenter inneholdende BNDF-kodende sekvens, ble subklonet inn i phage M13mpl0 og sekvensert for å bekrefte sekvensen til det humane genet i den kodende regionen for BNDF (fig. 1). Figur 1 viser også hele den aminosyresekvens til forløper og moden (prosessert) humant BNDF protein. Spaltningssete i figur 1 er basert på likheter i spaltnings-setene i de kjente sekvensene til NGF og grise-BNDF og de kjente aminosyresekvensene til NGF og grise-BDNF.

BDNF-sekvensen oppnådd fra PCR-amplifiserte fragmenter (figur 1) og fra to humane genomiske DNA-kloner, var forskjellig i nukleinsyreposisjon 196. Den humane genomiske klonen hadde en A i steden for G i posisjon 196, som forandret aminosyre 66 fra valin til metionin. Denne forskjellen oppstår i forlø-peren, ikke i den modne biologiske aktive formen av BDNF. Denne forandringen av et enkelt basepar og en enkelt aminosyre, kan representere en allelisk forskjell i BDNF-sekvensen innenfor det humane genomet.

Sekvensering av en ytterligere klon, ga en sekvens identisk med den som er vist i figur 1, med unntagelse av at aminosyren i posisjon223 var lysin (K) i steden for arginin (R) og kodenet var AAA i steden for AGA. Denne forskjellen oppstår i den modne biologisk aktive formen av humant BNDF. Dette kan representere et alternativt humant allel i denne posisjonen.

C. Ekspresjon av biologisk aktivt BDNF i

COS- 7 celler

For å bekrefte at det humane BNDF-genet som ble oppnådd virkelig kodet for biologisk aktivt BDNF, ble genet uttrykt transient til COS-7 celler, og det uttrykte materialet ble analysert for evnen til å fremme overlevelsen av embryonisk dag 10 kylling-dorsal-rot-ganglion-neuroner i kultur, en kjent egenskap ved BDNF renset fra grisehjerner (Barde et al. 1982 The EMBO Journal 1:549).

1. Fremstilling av en DNA konstruksjon for

ekspresjon av human BDNF

Gelrenset DNA inneholdende den humane BDNF-kodende sekvensen som fremstilt i del B ovenfor, amplifisert fra humant genomisk DNA ved PCR med oligonukleotidene BNDF-1 og BNDF-3 ble ligert inn i COS celle-ekspresjonsvektor pSG5 (Green et al. 1988 Nuc. Acids Res. 16:369). Plasmid pSG5 ble spaltet med restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI og de kohesive endene ble gjort butte ved behandling med Klenow-fragmentet til DNA polymerase I i nærvær av alle fire deoksyribonukleo-tidene. Gel-renset DNA inneholdende hele den BNDF-kodende sekvensen, ble deretter ligert inn i butt-endet pSG5. Orienteringen til innskutt DNA der BDNF-forløperproteinet kan bli uttrykt fra SV40 øyeblikkelig tidlig promoter ved transfeksjon inn i COS-vceller, ble identifisert ved restriksjonskartlegging. I den ønskede orienteringen kan BNDF-innskuddet bli separert fra vektoren etter spaltning med BamHI og Bglll.

2. Transfeksjon av COS- celler

DNA fra pSG5 med og uten BDNF-kodende innskudd ble preparert ved fremgangsmåten for alkalisk lysering, etterfulgt av CsCl tetthets-sentrifugering (Maniatis et al., ibid.). Plasmidet DNA ble transfektert inn i COS-7 celler ved anvendelse av lipofektin ifølge protokoll C til forhandlerens instruksjoner (BRL). COS-celle kulturer transfektert med plasmid DNA uten et BDNF-kodende innskudd, virker som en negativ kontroll.

3. Bioanalvse av uttrykte materialer

24 timer etter transfeksjon, ble cellene skrapet av skålen og høstet ved kort sentrifugering. Celle-pelletene ble ekstrahert ved kort sonikering på is i 20 mM natriumfosfat, pH 6,7 inneholdende 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF og 0,1 um pepstatin. Serie-fortynninger av celle-ekstraktet fra hver kultur ble analysert for Moaktivitet ved anvendelse av kylling-embryo dag KO dorsal-rot-ganglion-neuroner (se eksperimentell appendix til eksempel 3). Det var betraktelig biologisk aktivitet detektert i ekstraktet av celler transfektert med pSG5 inneholdende BDNF-innskudd, men ikke i ekstraktet til celler transfektert med pSG5 uten et innskudd (figur 8). Disse resultatene tyder på at genet som er blitt klonet, kan uttrykke biologisk aktive BDNF.

D. Ekspresjon av moden humant BDNF i E. coli

Humant modent BDNF-gen, som beskrevet i figur 1, blir skutt inn i E. coli-ekspresjonsvektorer, og slike vektorer blir introdusert inn i E. coli-vertsceller og ekspresjon av genet for å produsere humant modent BDNF blir oppnådd ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 2 nedenfor ved å erstatte BDNF-genet for NGF-genet.

EKSPERIMENTELL APPENDIX TIL EKSEMPEL 1

1. Molekylære biologiske fremgangsmåter

Polymerasekjedereaksjonen (PCR) ble utført vesentlig som beskrevet i Saiki et al., 1988 Science 239:487. PCR-reaksjonsproduktene ble elektroforert gjennom 2% agarosegeler, og overført til Zeta-Bind membraner (BioRad) for DNA (Southern) blotting. Hensiktsmessige amplifiserte bånd ble spaltet fra de opprinnelige gelene og preparert for subkloning ved å reparere endene med Klenow-fragmentet til DNA-polymerase (New England Biolabs) og deretter enten klonet butt-endet eller, dersom restriksjonssetene ble plassert i primere, klonet etter spaltning med hensiktsmessige enzymer. Slike fragmenter ble subklonet inn i hensiktsmessig spaltet og fosfatasebehandlet M13ml0 vektor (Amersham). Oligonukleotider ble radioaktivt merket ved kinasebehandling (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. SDambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982)). Oligonukleotid-hybridiseringsbetingelsene var 6X SSCP, 2X Denhardfs, 2mM EDTA, 0,05% natr iumpyrof osf at, 0,1% SDS, 100 mcg/ml gjær-tRNA som uspesifikk kompetitor, pH 8,0. Hybridiseringstemperaturen og betingelsene for stringenthet ved vasking av hybridiserte blots og filtere, ble justert individuelt for hver oligonukleotidprobe basert på dets relative GC-innhold. Lange, radioaktivt merkede DNA-prober ble dannet ved tilfeldig priming [A. P. Feinberg og B. Vogelstein, Anal. Biochem. 132, 6 (1983)]. Hybridiseringsbetingelsene ved anvendelse av slike prober var: 5X SSCP, 2X Denhardfs, 2 mM EDTA, 0,05% natr iumpyrof osf at, 0,1% SDS, 250 ug/ml laksesperm DNA, pH 8,0 ved 65° C; vasking ved 65° C i 0,1X SSCP og 0,1% SDS. Sekvensering ble utført ved dideoksy kjedetermineringsmetoden [F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463 (1977)] ved anvendelse som templat enkelttrådet DNA, preparert fra subkloner i begge orienteringer i M13 vektorer.

EKSEMPEL 2

Produksjon av rekombinant NGF i E. coli

Et syntetisk gen kodende for den modne (prosesserte) formen av human NGF ble kjøpt fra British Biotech. Dette genet er identisk med den humane nukleinsyresekvensen rapportert for NGF (Ullrich et al. 1983 ibid.), med unntagelse av forandringer i den humane nukelinsyresekvensen utført for å innskyte forskjellige restriksjonsseter og tilført i plasmid BBG26.

Plasmidet ble transformert inn i E. coli-stamme DH5alfa for å produsere plasmidet i tilstrekkelig mengde for påfølgende operasjoner. For å modifisere dette syntetiske genet for innskudd inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor, ble følgende to oligonukleotider syntetisert:

NGF-A

Translasjonen

NGF-B

EcoRI

5'- AAT TC GCC GCG GTG AAA GAT CGG GTG GGA GGA GGA CAT TTAATCA TCCTCCAAGATCG-3'

Disse oligonukleotidene inneholder et BamHI sete ved 5'-enden og et EcoRI sete ved 3'-enden. Det er et unikt EcoRI-sete beliggende nær 5' enden av det syntetiske NGF-genet. Etter utsetting av BBG26 for restriksjonsenzym EcoRI, kan det syntetiske oligonukleotidet bli ligert til det spaltede plasmidet like 5' for EcoRI-setet, for derved å erstatte 5'-delen av den NGF-kodende sekvensen. Denne erstatning av 5'-enden av den kodende sekvensen muliggjør innskudd av en translasjonen kobler oppstrøms (se ovenfor oligonukleotid-sekvensene) og substitusjon av kodoner foretrukket av E. coli.

(ifølge deBoer og Kastelein i From Gene to Protein: Steps Dictating the Maximal Level of Gene Expression (1986) Davis and Reznikoff, eds. s. 225-283, Butterworths, NY). Disse forandringene er konstruert for å fremme effektiv ekspresjon av NGF-sekvensene.

Oligonukleotid NGF-A og NGF-B ble kinasebehandlet og sammensmeltet og deretter ligert til EcoRI-spaltet og fosfatasebehandlet plasmid BBG26 og blandingen fosfatasebehandlet. Blandingen ble behandlet med restriksjonsenzymet BamHI og det omtrentlige 390 'bp BamHI-fragmentet inneholdende modifisert NGF-kodende sekvens, ble gelrenset. Dette fragmentet ble ligert til hver av forskjellige gelrensede, BamHI-spaltede og fosfatasebehandlede E.coli ekspresjonsvektorer: (1) en vektor basert på et T7 phage promotersystem betegnet pT5T; eller (2) en vektor basert på en hybrid 'Tac' promoter avledet fra både tryptofan og laktose, betegnet pT3XI-2 (se eksperimentell appendix til dette eksemplet og figurene 4 & 5 for detaljer). Dette resulterte til dannelsen av enten pT5T:NGF eller pT3XI-2:NGF.

pT5T:NGF ble transformert inn i E.coli-stamme BL21(DE3). Denne stammen (beskrevet i Studier og Moffat J. Mol. Biol.

(1986) 189:113-130) inneholder T7 RNA polymerasegenet under kontroll av IPTG induserbar lac promoter på en ikke-ut-spaltbar lysogenisk lambda bacteriophage. På grunn av at innskuddet i pT5T vektoren er under kontroll av T7 phage-promoteren, plasserer dette ekspresjonen av de innskutte sekvensene under kontroll av lac promoteren, på grunn av at ekspresjonen er induserbar ved isopropyl p<->D-tiogalaktopyra-nosid (IPTG). Transformanter ble plukket, dyrket og hybridisert med<SP>^er^et 390-bp BamHI-fragmentet for å bestemme hvilke transformanter inneholdt NGF-innskuddet. Åtte positiver ble selektert, dyrket, og vektor DNA ble isolert og sekvensert. Hver av de åtte inneholde det riktige innskuddet i riktig orientering i vektoren. To ble dyrket separat i Luria-kraft inneholdende 15 mcg/ml tetracyklin til en optisk tetthet (O.D.) på ca. 0,6, deretter ble kulturene indusert ved tilsetning av ImM final konsentrasjon i IPTG. Prøver av hver kultur ble tatt i intervaller på fra 2 til 21 timer etter induksjon og lysert i SDS-PAGE-prøvebuffer (0,025% bromfenol blå, 10% glyserol, 1% p<->merkaptoetanol, 2% SDS, 0.0625M Tris-HCl, pH 6,8). Hver prøve ble elektroforert i reduserende SDS-PAGE og produksjon av NGF ble registrert både ved tilstedeværelse av et Coomassie-brilliant-blue-farvet bånd ved riktig molekylvekt og ved Western blot analyse ved anvendelse av antistoff mot musesubmaxillær kjertel NGF (Sigma).

Som negative kontroller ble prøver tatt fra identiske kulturer som ikke ble indusert, og fra kulturer av bakterier transformert med pT5T vektor som ikke inneholdt NGF-innskudd. Resultatene vist i fig. 2 tyder på at transformant pT5T:NGF-18 produserer et proteinbånd ved molekylvekten som er ventet for prosessert NGF som også er gjenkjent av anti-NGF antiserum (kolonnene merket: pT5T:NGF-18 2,4,6,8,10 og 21 timer induksjon med IPTG). Som ventet er dette båndet ikke detekterbart i bakterier transformert med pT5T uten NGF-innskudd [kolonnene merket: pTGT u (uindusert) og i (indusert] eller i pT5T:NGF-18 ikke indusert ved tilstedeværelse av IPTG (kolonne merket: pT5gT:NGF-18 0 timer etter induksjon med IPTG).

pT3XI-2:NGF ble transformert inn i phage-resistent E. coli K-stamme, JM107. 13 transformanter ble dyrket som for pT5T:NGF transformanter og 3 ble funnet å uttrykke det human modne NGF-proteinet ved SDS-PAGE av celle-ekstrakter etter både farving med Coomassie Brilliant Blue og immunofarving med anti-muse NGF antiserum som ovenfor for pT5T:NGF transformanter.

Aminoterminal aminosyresekvens av rekombinant NGF, produsert ved pT3XI-2:NGF i E. coli JM107, indikerte at aminoterminal metionin var blitt fjernet i løpet av ekspresjon i minst 85% av det NGF produserte. Dette tyder på at NGF som blir produsert har riktig aminoterminus for prosessert moden human NGF.

NGF produsert som beskrevet heri ble funnet å ikke ha noen detekterbar biologisk aktivitet som bestemt ved fremgangsmåtene angitt i eksempel 3 nedenfor.

Proteinet produsert av enten vektor pT5T:NGF eller vektor pT3XI-2-NGF ble testet for nervevekststimulerende aktivitet og rekombinant h<p>NGF produsert i insektceller ved anvendelse av en baculovirus-vektor, ble anvendt som en kontroll. Den positive kontrollen ga halv-maksimal neuronal overlevelse ved en konsentrasjon på 1,1 mg/ml. I kontrast til dette, demonstrerte polypeptidene produsert i E. coli fra de to vektorene, demonstrerte begge ingen signifikant biologisk aktivitet, selv ved en konsentrasjon på omtrent 3.600 mg/ml.

EKSPERIMENTELL APPENDIX TIL EKSEMPEL 2

1. Beskrivelse av pT5T.en ekspresjonsvektor basert på " T7 promoter"- systemet (referer til fig. 4 for

trekkene til vektoren)

T7-promoterbasert ekspresjonsvektor pT5T er vesentlig samme som pJU1003 [Squires, et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:16297-16302], med unntagelse av at det er et kort område av DNA mellom det unike Bgllll-sete 5' for T7-promoteren og Clal-setet i tetracyklinresiostensgenet. Sekvensen til dette DNA er:

Clal

2. Beskrivelse av PT3XI- 2: en modifikasjon av PKK223- 3 ved anvendelse av et hybrid ' Tac' promotersystem

(Referer til fig 5 for trekkene til vektoren)

Utgangsplasmidet for denne konstruksjonen var plasmid pKK223-3 fra Pharmacia. Plasmid pKK223-3 inneholder et delvis gen for tetracyklinresistens. Dette ikke-funksjonelle genet ble erstattet med et fullstendig tetracyklinresistent gen båret på plasmid pBR322. Plasmid pK223-3 ble fullstendig spaltet med SphI og delvis med BamHI. Et 4,4 kilobaseparfragment ble gelrenset og kombinert med en syntetisk adaptor med sekvensen :

og et 539 baseparf ragment av DNA fra en Cia I, Sph I spaltning av tetracyklinresistensgenet til pBR322 (PL Biochemicals, katalog nr. 27-4891-01=. Det resulterende plasmidet ble betegnet pCJl.

Deretter ble en Xhol linker kjøpt fra New England Biolabs, skutt inn i plasmid pCJl<*>s PvuII sete for å danne plasmid pCJX-1. Dette innskuddet ødelegger rop-genet som kontrollerer plasmidkopitallet. Et EcoRI-fragment inneholdende lac 1-genet ble renset fra plasmid pMC9 [Calos, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1983), 80:3015-3019] og deretter skutt inn i Xhol-setet med Xhol til EcoRI adaptere med sekvensen:

Polylinkersekvensen mellom EcoRI og Pstl-setene i plasmid pCJX-1, ble deretter erstattet med en polylinkersekvens vist her:

Plasmidvektoren oppnådd på denne måten ble betegnet pCJXI-1.

Til slutt ble tetracyklin resistensgenet erstattet med et lignende gen som hadde gjenkjennings-seter for restrik-sjonsenzymene Hind III, Bam HI og Sal I ødelagt ved bi-sulfittmutagenese. Følgende prosedyre ble anvendt for å mutere tetracyklinresistensgenet til pBR322. Plasmid pBR322 ble spaltet med Hind III. deretter mutagenisert med natrium-bisulfitt [Shortle og Nathans, Proe. Nati. Acad. Sei. USA

(1978) 5:2170-2174]. Mutagenisert DNA ble ligert for å danne sirkulært DNA, og deretter spaltet med Hind III for å lineærisere eventuelt plasmid som hadde unngått mutagenesen. E. coli JM109 [Yanisch-Perron, et al., Gene (1985) 33:103-119] ble transformert med plasmidet, og deretter utsatt på selektivt medium. Plasmidene ble isolert fra tetracyklin-resistenskoliniene og undersøkt for tap av Hind III setet i tetracyklin-resistensgenet. Vellykket mutert plasmid ble betegnet pTl. En lignende prosedyre ble fulgt for å mutageni-sere Bam HI setet i pTl, for tilveiebringing plasmid pT2. Plasmid pT2 ble igjen mutagenisert for å fjerne Sal I setet for dannelsen av plasmid pT3. Et Clal/Bsml-fragment av pT3 inneholdende mutert tetracyklinresistensgen ble isolert og anvendt for å erstatte det homogene fragmentet til pCJXI-1 for dannelsen av pT3XI-2. Det muterte tetracyklin-resistensgenet koder enda for et funksjonelt protein.

3. Dannelse av pTsXI- 2- ølOTC3FGFsvn ( dannelse

av tac promotervektor for NGF)

Opprinnelig ble et "gen" for basisk fibroblast-vekst-faktor (bFGF) syntetisert. Dette "gene" koder for samme sekvens som det som er rapportert for bFGF av Sommer et al. (1987 Biochem. Biophys. Res. Commu. 141:67) men anvender kodoner som finnes fortrinnsvis i høyt uttrykte gener i E. coli. Strukturen til dette genet er slik at den kodende delen er etter en translasjonen koblersekvens (se Swuires, et al., 1988, ibid.) for å forsikre effektiv initiering av translasjonen .

Det bFGF syntetiske genet ble først skutt inn i vektor M13mpl8 mellom EcoRI og Hind III setene og sekvensert. Strukturen til dette genet er:

Noen trekk av genet er fremhevet.

Det ble deretter isolert ved spaltning med Bam HI og Hind III og skutt inn i Bam Hl/Hind III-spaltet pJU1003 (Squires, et al., 1988, ibid.) for tilveievringing av pJU1003-synFGF. Dette plasmidet ble spaltet med Xba I/Hind III, og Xba I/Hind III fragmentet inneholdende bFGF-genet ble isolert. Dette fragmentet ble ligert inn i pT3XI-2 spaltet med EcoRI og Hind III ved anvendelse av en EcoRI-Xbal-linker:

Det nye plasmidet er betegnet pT3XI-2-ølOTC3FGFsyn.

4. Innskudd av NGF- eksprese. ionskonstruks. jon inn i Tac promotervektoren

pT3XI-2-ølOTC3FGFsyn ble spaltet med BamHI, som resulterte i 1ineæriseringen av 7,4-kb par ekspresjonsvektoren og frigjorde det ca. 0,5-kb paret pFGF DNA-fragmentet. 390-bp BamHI fragmentet inneholdende modifiserte NGF-kodende sekvenser, ble ligert inn i gelrenset Bam HI-spaltet vektor DNA-fragment, som resulterte i plasmid pT3XI-2:NGF.

EKSEMPEL 3

Refolding og renaturering av medlemmer av NGF/ BDNF- familien av neurotrofiske proteiner

A. Refolding av moden NGF produsert i

eukarvotiske celler eller renset fra naturlige kilder En utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter evnen til å refolde og gjenopprette den bologiske aktiviteten

til den inaktive, modne formen av rekombinat NGF produsert i prokaryotiske celler. For å demonstrere at dette er mulig, ble det først bestemt at fulsltendig biologisk, aktiv, moden NGF, produsert i et eukaryotisk celle-ekspresjonssystem eller renset vann fra naturlige kilder, kan på en vellykket måte bli refoldet etter at dets bilogiske aktivitet er blitt ødelagt ved denauturering og reduksjon av disulfidbindingene. Denne demonstrasjonen er signifikant av to grunner: 1) Det er sannsynlig å hevde at etter å bli fullstendig denaturert og redusert, vil moden NGF produsert i bakterier (opprinnelig inaktiv), eller renset fra naturlige kilder (opprinnelig aktiv), bli inaktiv og strukturelt ikke skjeldnbar. På grunn av at de ikke er skjeldnbare strukturelt, indikerer vellykket refolding av denaturert og redusert moden NGF fra eukaryotiske celler eller naturlig kilder, at moden NGF uttrykt fra bakterier kan etter å bli denaturert og redusert, også være refoldet på en vellykket måte. 2) Full-lengde NGF-forløperen kan ikke bli prosessert proteolytisk i bakterier for å produsere riktig moden NGF, som den er i eukaryot celle-ekspresjonssystem. Det er derfor i bakterier nødvendig å uttrykke den kodende sekvensen for moden NGF direkte, og ikke den for full-lengdeforløperen. Det er teoretisk mulig at riktig folding og oppnåelse av biologisk aktivitet til moden NGF bare vil oppstå dersom det først blir syntetisert som full-lengdeforløper, som i eukaryote celler og i naturlige kilder. Dette vil eliminere enhver sannsynlighet på vellykket refolding av modent protein produsert i bakterier. Vellykket refolding av denaturert og redusert moden NGF, som demonstrert heri, viser at riktig refolding avhenger ikke av full-lengdeforløperen.

To former for opprinnelig bilogisk aktiv, moden NGF, ble refoldet på en vellykket måte etter å ha blitt denaturert og redusert: (1) moden (beta) NGF renset fra hannmus-sub-maksillærkjertel (SIGMA), og (2) rekombinant human moden NGF produsert i eukaryotiske celler ifølge fremgangsmåtene beskrevet i europeisk patentpublikasjon EP 89113709. Figur 3 demonstrerer at rekombinant human moden NGF produsert som ovenfor, fremmer overlevelsen av kylling embryo sympatetiske ganglion-neuroner ved konsentrasjonene ventet for NGF (Greene 1977 Develop. Biol. 58:113). Figur 3 demonstrerer også at denne biologiske aktiviteten blir tapt etter denaturering og reduksjon av disulfidbinddingene. Figur 3 demonstrerer videre at full biologisk aktivitet blir gjenopprettet til det denaturerte og reduserte proteinet etter at det er refoldet ifølge fremgangsmåtene beskrevet heri. Vesentlig lignende resultater blir oppnådd ved anvendelse av moden beta-NGF renset fra musesubmaksilliærkjertel. Disse vellykkede refoldingene indikerer sterkt mulighetene for refolding av moden NGF produsert i bakterier.

1. Protokoll for refolding av NGF

NGF ble løst opp i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml i PBS (0.15M NaCl , 0.04M K2HP04, 0,02M KH2P04, pH7,2) og denaturert ved tilsetning av guanidinhydroklorid til en final konsentrasjon på 3M. Etter 30 minutter ved 25°C, ble ditiotreitol (DTT) tilsatt til en final konsentrasjon på 5,6 mM, og inkubasjonen ble fortsatt ved 25 0 C i ytterligere 2 timer (50 mM DTT har også blitt anvendt med like stort hell). Oksydert glutation ble deretter tilsatt til en final konsentrasjon på 50 mM og inkubert ved 25 °C i 10 minutter. Denne oppløsningen ble fortynnet 7-ganger i 0,6% Tris (Boehringer/Mannheim 604-205), ikke pH justert, inneholdende 0,2% humant serumalbumin. L-cystein ble tilsatt til en final konsentrasjon på 20 eller 30 mM med omtrent like stort hell. Denne refoldingsblandingen ble inkubert ved 25°C i 16-20 timer, og deretter ble materialet konsentrert med en Centricon-10 konsentrator (Amicon) og bufferet skiftet til PBS.

2. Analyse for NGF biologisk aktivitet etter

refolding

Ubehandlet utgangs-NGF, NGF gjenværende i denaturerings-bufferen inneholdende 3M guanidin og 5,6 mM DTT, og dena turert deretter refoldet NGF, ble analysert for deres evne til å fremme overlevelsen av nuroner fra dissoslerte Ell kyllingembryo-lumbarsympatetisk kjede-ganglia, som beskrevet i den eksperimentelle appendixen til dette eksempel. Figur 3 viser resultatene av denne bioanalysen. Denaturert og redusert NGF utviste halvmaksimal biologisk aktivitet ved 450 ng/ml, mens utgangs-NGF og refoldet NGF utviste halv-maksimal biologisk aktivitet ved 0,5 og 1,0 ng/ml. Disse resultatene viser at denaturering og kjemisk reduksjon reduserte den biologiske aktiviteten til rekombinant human moden NGF med en faktor på rundt 1.000, og refoldingsprosedyren gjenopprettet den biologiske aktiviteten til materialet funnet i utgangs-NGF innenfor omtrent to ganger eksperimentelle feilen til bioanalysen.

B. Refolding av moden human NGF produsert i

E. coli- celler

Moden NGF uttrykt i E. coli celler som beskrevet i eksempel 2 ovenfor, er biologisk inaktiv. Slike NGF er refoldet for å danne biologisk aktiv NGF ifølge fremgangsmåtene beskrevet nedenfor. 1. Preparering av utgangsmaterialet for refolding 10 gram E. coli celle-pasta fra pT3Xl-2:NGF i JM107 som beskrevet i eksempel 2, ble resuspendert i 50 ml 10 mM EDTA, pH 7,0 og kjørt gjennom en French-presscelle to ganger ved 11032 kPa. Celle-ekstraktet ble spunnet ned ved 16.000 xg i 20 minutter og supernatanten ble fjernet. Pelleten ble homogenisert i 100 ml 10 mM EDTA, pH 7,0. Resuspendert pellet ble sentrifugert som ovenfor, og supernatanten fjernet. Pelleten ble påny homogenisert i 100 ml 10 mM EDTA, pH 7,0. Resuspendert pellet ble sentrifugert som ovenfor og supernatanten fjernes. Pelleten ble homogenisert med 30 ml 4 M urea i 50 mM Tris, pH 8,0 og 0,2% g<->merkaptoetanol. Resuspendert pellet ble spunnet ned og supernatanten fjernet som ovenfor. Pelleten ble homogenisert med 30 ml 20 mM natriumsitrat, pH

3,0, inneholdende 8 M urea. Resuspendert pellet ble spunnet ned som ovenfor, og supernatanten plassert på is. Pelleten ble homogenisert i 30 ml 20 mM natriumcltrat, pH 3,0, inneholdende 8 M urea, sentrifugert som ovenfor, og supernatanten plassert på is. Supernatantene kan bli lagret ved-80°C.

2. Refolding av E. coli- ekstraktet

Til det endelige supernatantekstraktet beskrevet ovenfor blir en fjerdedel av volumet av 1 M Tris, pH 8,5, inneholdende 8 M urea, til,satt. Ditiotreitol blir tilsatt til en final konsentrasjon på 5-15 mM og oppløsningen plassert ved 25°C i 1 time. Deretter blir cystin (eller oksidert glutation) tilsatt til en final konsentrasjon på 15-50 mM og oppløs-ningen plassert ved 25° C i 10-15 minutter. Ni volum 100 mM NagHP04, pH 8,3, inneholdende 3,2-4,2 M urea blir tilsatt etterfulgt av cystein 2-3 ganger den finale konsentrasjonen til cystin (eller glutation). Oppløsningen blir holdt ved 4°C overnatt. Disse betingelsene reduserer ikke eller denaturerer aktiv NGF.

Ovennevnte betingelser tilveiebringer konsentrasjonsområder og alternative reagenser som er blitt funnet akseptable. I det følgende tilveiebringes et eksempel av et representativt refoldings-eksperiment: 40 ml E. coli-ekstrakt beskrevet ovenfor (inneholdende omtrent 650 jjgm/ml NGF vurdert ved laser-densitometri av coomassie brilliant blå-farvede SDS-polyakrylamidgeler) mottok 10 ml IM Tris, pH 8,5, inneholdende 8 M urea. 2 ml 200 mM ditiotreitol ble tilsatt, og oppløsningen plassert ved 25°C i 1 time. 4 ml 600 mM oksydert glutation ble tilsatt og oppløsningen plassert ved 25° C i 15 minutter, hvorpå 450 ml 100 mM Na2HP04, pH 8,3, inneholdende 3,2 M urea ble tilsatt, etterfulgt av 6 ml 1 M cystein. Oppløsningen ble plassert ved 4°C i 16 timer. Denne oppløsningen er referert nedenfor som den endelige refoldingsblandingen.

2a. Alternative fremgangsmåter for ekstrahering og

refolding av moden human NGF produsert i E. coli

Følgende fremgangsmåter er foretrukket i forhold til de som allerede er presentert, på grunn av at de resulterer i en betraktelig høyere effektivitet og refoldingsrate, og tilveiebringer høyere utbytter av riktig refoldet og biologisk aktiv moden human NGF.

NGF- ekstrahering

E. coli-cellene som produserer NGF (beskrevet i eksempel 2) ble åpnet av en French press eller Gaulin mølle i 10 volum/v (f.eks. 1 liter/100 g cellepasta) 10 mM EDTA, pH 7,0. Lysatet ble sentrifugert ved 16.000 xg i 20 minutter for å separere supernatanten fra pelleten. Pelleten ble påny ekstrahert to ganger ved homogenisering i 10 volum 10 mM EDTA, pH 7,0 og sentrifugert som ovenfor. Pelleten ble ekstrahert en gang til, som ovenfor. Den vaskede pelleten ble ekstrahert med 5 volu,/v 20 mM Tris, pH 8,0 inneholdende 2 M urea og sentrifugert som ovenfor. Supernatanten ble fjernet.

NGF ble ekstrahert fra pelleten med 10 volum/v 20 mM citrat, pH 3,0 inneholdende 8 M urea og sentrifugert som ovenfor. Supernatanten ble beholdt på is mens pelleten påny ble ekstrahert for siste gang med 4 volum/v 20 mM sitrat, pH 3,0 inneholdende 8 M urea som ovenfor. NGF var omtrent 50% av det totale proteinet i CU (citrat urea) ekstraktet.

En typisk refolding ble utført som følger: 20 ml IM Tris, pH 8,5 inneholdende 8 M urea, ble tilsatt til 80 ml CU ekstrakt inneholdende omtrent 2 mg/ml NGF. Ditiotreitol eller 23-merkaptoetanol ble tislatt til 5 mM final konsentrasjon og blandingen ble holdt ved 25<6>C i 30-60 minutter. Deretter ble oksydert glutation eller cystin tilsatt til 20 mM final konsentrasjon og reaksjonsblandingen ble holdt ved 25°C i 10-15 minutter. Deretter ble 19 volum fortynningsbuffer (100 mM Na2HP04, 10 mM etanolamin, pH 8,3, 4,6 M urea og 15,8% polyetylenglykol 300) tilsatt. Cystein eller 2-merkaptoetylamin ble tilsatt til 3 mM final konsentrasjon. Den endelige refoldingsblandingen ble utluftet under vakuum og spylt med renset argon gjennom 3-5 sykluser utluftning og argonspyling. Blandingen ble forseglet mot gasinnførsel, og holdt under argon ved 9°C i 1-7 dager.

Det er tilrådelig å optimalisere forholdet mellom cystein (eller 2-merkaptoetylamin) og oksidert glutatuion (eller cystamin) I den endelige refoldingsblandingen. Det optimale forholdet (vanligvis mellom 2-10) kan variere avhengig av flere faktorer, inkludert temperaturen som den endelige reaksjonsblandingen blir holdt på. Temperaturer på 0-25°C gir refoldet NGF; men foretrukket temperatur er mellom 4-9°C. Fortynningstrinnet tilveiebringer refoldet NGF ved finale fortynninger på 3x til 80x; men fortynninger på 20x eller større, gir større høyest prosentandel total NGF som blir refoldet. Polyetylenglykolene 200, 300 og 1000 gir refoldet NGF, når anvendt opptil 25% final konsentrasjon; men utbyttet er større med polyetylenglykol 200 eller 300 ved 15% final konsentrasjon. Etylenglykol, glyserol, propylenglykol kan bli anvendt i steden for polyetylenglykol; men effektiviteten til refoldingen blir redusert omtrent totredjedeler sammenlignet med polyetylenglykol 300. Konsentrasjonen av urea i den endelige ref oldingsblandingen kan være mellom 4 til 6 M, til tross for at 4,5-6,0 M gir høyeste utbytter av refoldet NGF. Refolding oppstår over et pH område fra 8 til 10 i den endelige ref oldingsblandingen, til tross for at pH 10 ga den hurtigste refoldingsraten. Fosfatbufferkonsentrasjonen i den endelige refoldingsblandingen blir best opprettholdt mellom 100 til 300 mM, mens forholdet mellom fosfatbuffer og etanolamin holdes ved 10:1.

Refolding utført som ovenfor, resulterer vanligvis i mer enn omtrent 30% av den opprinnelige mengden NGF som opprettholder riktig refoldet biologisk aktiv form. Dersom NGF-ekstraktet fra E. coli er denaturert og redusert i urea og merkaptoetanol som ovenfor, og deretter renset over RP-HPLC (fremkommer som en enkelt topp ved omtrent 43% acetonitril), øker refold-ingsef f ektivi teten til mer enn 60% av utgangs-NGF. Dette tyder på at kontaminanter i E. coli-ekstraktet interfererer delvis med refoldingseffektiviteten. Rensning av NGF før refolding på andre måter enn RP-HPLC, så som ionebyttekromatografi, kan også øke refoldingseffektiviteten.

3. Bestemmelse av refoldingseffektiviteten

Den totale mengden NGF i en endelig refoldingsblanding ble bestemt som følger: Laser-densitometri-scanner ble utført etter coomassie brilliant blå-farving av SDS-polyakrylamidgeler kjørt under reduserende betingelser der noen kolonner inneholdt forskjellige konsentrasjoner av en NGF kali-breringsstandard (baculovirus, insektcelleprodusert materiale beskrevet i eksempel 3) mens noen kolonner inneholdt aliquoter av den endelige refoldingsblandingen. Ved å etablere det kvantitative forholdet mellom den laserdensito-metrioptiske mengden av NGF standardprotein, kan man bestemme mengden av NGF i en ukjent prøve.

Mengden av riktig refoldet NGF i en endelig refoldingsblanding ble bestemt som følger: Seriefortynninger av den endelige refoldingsblandingen ble testet for deres evne til å fremme overlevelsen av kyllingembryosympatetiske kjedeneuro-ner in vitro i analysen beskrevet i eksperimentell appendiks til eksempel 3. I det samme området ble en rekke konsentrasjoner av standard insektcelleprodusert NGF også testet for deres evne til å fremme neuronal overlevelse. Fortynning av endelig refoldingsblanding som ga halvmaksimal overlevelse i bioanalysen, ble betraktet å inneholde samme konsentrasjon av riktig refoldet NGF som konsentrasjonen av standard NGF nødvendig for å tilveiebringe halvmaksimal overlevelse.

Disse fremgangsmåtene ble anvendt for å bestemme mengden av riktig refoldet NGF i den eksperimentelle refoldingen beskrevet ovenfor. I bioanalysen var 3,7 ng/ml insekt celleprodusert NGF nødvendig for å tilveiebringe halvmaksimal overlevelse. På grunn av at en fortynnelse på 1:1500 av den endelige refoldingsblandingen ga halvmaksimal overlevelse, ble det konkludert at den endelige refoldingsblandingen inneholdt (1500 x 3,7 =) 5550 ng/mL aktiv NGF. Den totale mengden NGF i den endelige refoldingsblandingen, ble vurdert ved laserdensitometri å være 522000 ng/ml, som angir en refoldingseffektivitet på omtrent 11%.

Figur 9 illustrerer bioanalyseresultatene for standard insektcelleprodusert NGF, som ga halv-maksimal overlevelse ved 3,7 ng/ml. Figur 10 illustrerer bioanalyseresultatene for den endelige refoldingsblandingen som ga halv-maksimal overlevelse ved en fortynning på 1:1500.

4. Rensing og karakterisering av refoldet

NGF produsert i E. coli

Revers-fase høy-ydelseskromatografi (RP-HPLC) ble anvendt for å rense og karakterisere biologisk aktiv, refoldet NGF i den endelige refoldingsblandingen. RP-HPLC-betingelsene var som følger: Oppløsningsmiddel A = 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i vann; oppløsningsmiddel B = 0,1% TFA i acetonitril (alle HPLC kvalitetreagenser); kolonne = VyDec C4 #214TP54; strømnings-hastighet = 1 ml pr. minutt. Prøven blir injisert ved tid 0 og gradienten utviklet med følgende program:

Posisjonene der nativ NGF og redusert NGF ble bestemt for å kalibrere kolonnen for påfølgende analyse av refoldede prøver. %B er mengden oppløsningsmiddel B i kolonne-eluatet. En prøve av insektcelleprodusert, nativt NGF, eluert ved omtrent 34% B. En prøve av denaturert og redusert insekt celleprodusert NGF, eluerte ved omtrent 43% B. NGF ble denaturert og redusert ved utsetting ved 6 M guanidin hydroklorid og 50 mM ditiotreitol i 200 mM Tris, pH 8,5. Individuell RP-HPLC-kolonner krevde separate beregninger med disse standardene for å bestemme nøyaktig % B hvorpå disse to prøvene eluerte.

I 50 pl final refoldingsblanding fra den eksperimentelle refoldingen beskrevet ovenfor, fremkom en proteintopp ved posisjonen til nativ NGF (figur 11B). Ikke noe protein kom frem ved denne posisjonen før refolding. Da 100 ng nativt insektcelleprodusert NGF ble tilsatt til en annen 50 pl prøve, ble størrelsen på toppen ved posisjonen til NGF omtrent doblet (figur 11A). Dette bekreftet at proteinet som fremkom etter refolding kjørte ved samme posisjon som nativt NGF og viser også at det var omtrentlig 100 ng av dette materialet i 50 pl av den endelige refoldingsblandingen. Det var bare denne toppen som utviste detekterbar bioaktivitet når fraksjonene samlet fra RP-HPLC-gradienten ble analysert for bioaktivitet i sympatetisk neuronoverlevelsesanalysen. Dette bekrefter videre identiteten til dette proteinet i den endelige refoldingsblandingen som NGF. Den spesifikke aktiviteten til denne toppen var innenfor området av det som ble observert for nativ insektcelleprodusert NGF (halv-maksimal overlevelse ved 0,5-5 ng/ml i separate analyser på forskjellige dager). Refodlet NGF fra E. coli utgør ved posisjonen til nativ insektcelleprodusert NGF og er fullstendig biologisk aktiv.

Når refoldingen blir utført som i eksempel 3.B.2a. ovenfor, kan rensning av refoldet NGF bli oppnådd som følger. Den endelige refoldingsblandingen blir konsentrert omtrent 20 ganger ved anvendelse av en konsentreringsanordning så som en hul fiber filter/konsentrator. Konsentratet blir deretter dialysert mot 10-20 volum ureainneholdende buffer. Bufferen som anvendes er 50 mM nat r iumacetat, pH 5,0, på grunn av at refoldet NGF er oppløselige og stabile i denne bufferen og pH er hensiktsmessig for påfølgende kationbyttekromatografi. Dialysebufferen innbefatter tilstrekkelig urea slik at den endelige ureakonsentrasjonen etter dialyse er 1,5-2 M. Dette muliggjør at E. coli proteiner og uriktig refoldet NGF presipiterer, som vurdert ved reversfase HPLC.

Den dialyserte prøven ble sentrifugert for å pelletere presipitatet og deretter applisert på S-Sepharose i 50 mM Na acetat, pH 5,0. Kolonnen ble vasket og eluert med en lineær saltgradient på 0,05-1,5 M NaCl. NGF blir renset til homogenisitet ved reversfase HPLC.

Figur 12 illustrerer revers-fase-HPLC (RP-HPLC) proteinprofilen til den endelige refoldingsblandingen. Riktig refoldet NGF er hovedprotein topp, som eluerer ved omtrent 37% acetonitril. Figur 13 illustrerer RP-HPLC-proteinprofilen til den endelige refoldingsblandidngen etter konsentrering og dialyse, men før kromatografi over S-Sepharose. Kontaminasjon med andre proteiner synlige i figur 12, inkludert ikke-refoldet NGF eluerende ved omtrent 47% acetonitril (figur 12), er blitt betraktelig redusert og riktig refoldet NGF er vesentlig ren. Figur 14 illustrerer RP-HPLC-proteinprofilen til materialet etter kromatografi over S-Sepharose. Nesten alle de kontaminerende proteinene er blitt fjernet. Den lille toppen som eluerer like etter hovedtoppen av refoldet NGF, er den monomeriske formen av refoldet NGF. Hovedtoppen som eluerer ved omtrent 37% acetonitril, er den dimeriske formen av refoldet NGF.

Den spesifikke aktiviteten til reversert faserenset NGF i kylling-embryo-sympatetiske nervecelle-overlevelses-bioanalyse var E.D.50= 0,17 ± 0,01 ng/ml. For sammenligning var den spesifikke aktiviteten til human rekombinant NGF produsert i insektceller (som beskrevet i eksempel 3) E.D.50= 0,26 ± 0,02 ng/ml. Dette demonstrerer at refoldet NGF, produsert i E. coli og refoldet og renset ved fremgangsmåter som nettopp er blitt beskrevet er fullstendig biologisk aktiv.

C. Refolding av moden human BDNF

Moden human BDNF produsert rekombinant i E. coli. som beskrevet i eksempel ID ovenfor, blir gjort biologisk aktiv ved refolding ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 3B ovenfor.

D. Refolding av moden NGF- 3

Moden human NGF-3, som beskrevet i eksempel 4 nedenfor blir gjort biologisk aktiv ved refolding ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 3B ovenfor.

EKSPERIMENTELL APPENDIX TIL EKSEMPEL 3

1. Bioanalvse av NGF og BDNF

Kulturer av kyllingembryo sympatetisk kjede og dorsalrot-ganglia ble dannet som tidligere beskrevet (Collins og Lile 1989 Brain Research 502:99). Sympatetisk eller dorsal rot-ganglia ble fjernet fra fertile, patogenfrie kyllingegg som var blitt inkubert i 8-11 dager ved 38"C i en fuktig atmosfære. Ganglia ble kjemisk dissosiert ved utsetting først for Hank's balanserte saltoppløsning uten divalente kationer, inneholdende 10 mM HEPES-buffer pH 7,2 i 10 min ved 37" C, deretter ved utsetting for en oppløsning av 0,125% bac-totrypsin 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) i Hank's balanserte saltoppløsning modifisert som ovenfor i 12 min ved 37° C. Trypsineringen ble stoffet ved tilsetning av fetalt kalveserum til en final konsentrasjon på 10%. Etter denne behandlingen ble ganglia overført til en oppløsning bestående av Dulbecco's høyglukose-modifiserte Eagle-medium uten bikarbonat inneholdende 10% fetalt kalveserum og 10 mM HEPES, pH 7,2 og mekanisk disossiert ved triturering omtrentlig 10 ganger gjennom en glass-Pasteur-pipette, der åpningen var blitt polert i idi, og innsnevret til en diameter slik at det tok 2 sekunder å fylle pipetten. Dissosierte ganglia ble deretter plassert i kulturmedium (Dulbecco's modifiserte Eagle Medium supplementert med 10% fetalt kalveserum, 4 mM glutamin, 60 mg/L penicillin-G, 25 mM HEPES, pH 7,2) i 100 mm diameter vevskulturskåler (40 dissosierte ganglia pr. skål) i tre timer. Denne forutsåingen ble utført for å separere ikke-neuronalceller, som adhererer til skålen fra nerveceller som ikke adhererer. Etter tre timer ble ikke-adherente nerveceller samlet ved sentrifugering, resuspendert i kulturmedium og sådd ut i 50 pl pr. brønn på halve området av 96 brønn mikrotiter-vevskulturplater i en tetthet på 1500 nerveceller pr. brønn. Mikrotiterbrønnene var tidlgiere blitt eksponert for en 1 mg/ml oppløsning av poly-L-ornitin i 10 mM natrium-borat, pH 8,4 overnatt ved 4°C, vasket i destillert vann og lufttørket.

10 pl av en seriefortynning av prøven som skal bli analysert for neurotrofisk aktivitet, ble tilsatt til hver brønn og skålene ble inkubert i 20 timer ved 37 °C i en fuktig atmosfære inneholdende 7,5% COg- Etter 18 timer ble 15 pl pr. brønn av en 1,5 mg/ml oppløsning av tetrazoliumfarve MTT i Dulbecco's høy-glukosemodifiserte Eagle-medium uten bikarbonat inneholdende 10 mM HEPES, pH 7,2 tilsatt, og kulturene ble plassert tilbake i 37°Cinkubatoren i 4 timer. Deretter ble 75 pl av en oppløsning av 6,7 ml 12 M HC1 pr. liter idopropanol tilsatt, og inneholdet av hver brønn ble triturert 30 ganger for å åpne cellene og suspendere farvestoffet. Absorbansen ved 570 nm ble bestemt relativt til en 690 nm referanse for hver brønn ved anvendelse av en automatisk mikrotiterplateavleser (Dynatech, Chantilly, Virginia). Absorbansen til brønnene som ikke4 mottok neurotrofisk middel (negative kontroller) ble subtrahert fra absorbansen til prøveinnholdende brønner. Den resulterende absorbansen er proporsjonal med antallet levende celler i hver brønn, definert som de nervecellene som kan redusere farvestoffene. Konsentrasjonen av trofisk aktivitet i trofiske enheter (TU) pr. ml. ble definert som den for- tynningen som ga 50% av maksimal overlevelse til nervecellene. For eksempel, dersom prøven ga 50% maksimal overlevelse når fortynnet 1:100.000, ble titere definert som 100.000 TU/ml. Spesifikk aktivitet ble bestemt ved å dele antallet trofiske deler pr. ml med konsentrasjonen av protein pr. ml i ufortynnet prøve.

EKSEMPEL 4: KLONING AV NGF-3, ET NYTT MEDLEM AV NGF/BDNF-FAMILIEN AV NEUR 0 TR 0 FISKE PROTEINER

A. Anvendelse av polymerase- kjedereaksjon ( PCR) for å

amplifisere et DNA- fragment fra NGF- 3

To delvis degenererte oligonukleotider, NNF-1 og NNF-3, ble syntetisert basert på høyt konserverte regioner av nukleinsyresekvenser kodende for moden (prosessert) NGF fra forskjellige arter og grise- og human BDNF. Serkvensene til disse oligonukleotidene og 5'-restriksjonssetene innskutt for å lette subkloning av amplifiserte fragmenter, er presentert nedenfor. (I = inosin)

NNF-1 og NNF-3 ble anvendt som primere i PCR (se eksperimentell appendix til eksempel 1) med human genomisk DNA som templat. PCR-produktene ble elektroforert i en 3% agarosegel og en fluorescent DNA-bånd rundt den ventede størrelsen på 150-200 bp ble spaltet ut fra gelen og klonet ved butt-endet ligering inn i Smal-spaltet phage M13mpl0. Den resulterende ligeringsreaksjonen ble sådd ut på E. coli-stamme TG1 og duplikatløft ble tatt. Det første løftet ble hybridisert ved høy stringenthet til tilfeldig merket human BDNF-kodende sekvens oppnådd ved PCR (se eksempel 1). Det andre løftet ble hybridisert ved høy stringenthet til tilfeldig merket human NGF moden proteinkodende sekvens oppnådd fra Britsh Biotech (se eksempel 1). En hvilken som helst plaque som hybridiserte til en av probene, ble ikke ført videre. Alle gjenværende paque som inneholder et innskudd som angitt ved mangel på å produsere beta-galaktosidase, ble sekvensert. Phagen i en slik plaque, NNF-18, inneholdt et 136-bp amplifisert DNA-fragment mellom oligonukleotidene NNF-1 og NNF-3 som kodet for et proteinfragment som er 53% identisk med human NGF og 44% identisk med human BDNF (figur 7). Noen aminosyrehomolo-gier er for både NGF og BDNF og noen er unike for NGF eller BDNF (figur 7). NGF-3-fragmentet har omtrent samme homologi med NGF eller BDNF idet sistnevnte to proteiner er overfor hverandre (figur 7). DNS-sekvensen til dette fragmentet er understreket i figur 6, mens den er sammenlignet med NGF og BDNF. Basert på disse homologier ble det konkludert at dette fragmentet var blitt amplifisert fra et gen for et nytt medlem av NGF/BDNF-familien av nerotrofiske proteiner. Det nye genet og proteinet ble betegnet NGF-3.

B. Anvendelse av DNA amplifisert med PCR for å klone det

humane genet for NGF- 3

DNA-fragmentet til NGF-3, amplifisert ved PCR som ovenfor, ble radioaktivt merket ved å utføre PCR-amplifikasjon i nærvær av<32>P-dCTP og anvendt for å screene et humant genomisk bibliotek i lambda FIX II (Stratagene kat. nr. 946203). Seks positiver fra 1,2 x IO<6>plaque ble renset ved gjentatt kloning. Delvise spaltninger av DNA fra en positiv ved anvendelse av restriksjonsenzym HinCII, ble subklonet inn i vektor M13. Flere M13 subkloner som hybridiserte til det radioaktivt merkede PCR-fragmentet, ble sekvensert i begge orienteringer ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksempel IB ovenfor, for å oppnå fullstendig nukleinsyre (figur 6) og gjeldende aminosyre (figur 7) sekvenser for human NGF-3. C. Ekspresjon av moden human NGF- 3 i E. coli Human moden NGF-3-genet oppnådd som beskrevet i Eksempel 4B ovenfor, ble skutt inn i E. coli-ekspresjonsvektorene. slike vektorer blir innført inn i E. coli-vertsceller. og ekspresjon av genet for å produsere moden BDNF ble oppnådd ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 2 ovenfor ved å erstatte NGF-3-genet med NGF-genet. Proteinet uttrykt rekombinant ble deretter gjort biologisk aktivt ved refolding ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 3B ovenfor.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for refolding og renaturering av hydrofobe proteiner som blir rekombinant uttrykt i prokaryote celler, hvori proteinene oppnår full biologisk aktivitet, og hvori nevnte protein blir valgt fra gruppen bestående av human moden nervevekstfaktor (NGF), human moden hjerneavledet neurotrofisk faktor (BDNF) og human moden nervevekstfaktor 3(NGF-3);karakterisert veda t den omfatter: (a) oppløse alle intramolekylære og intermolekylære disulfidbindinger i en oppløsning inneholdende nevnte neurotrofiske protein for å danne frie tioler ved tilsetning av et denatureringsmiddel og et redu-seringsmiddel til nevnte oppløsning; (b) oksidering av nevnte frie tioler med en disulfid inneholdende forbindelse for å danne blandede disulf idbindinger; (c) fortynne nevnte oppløsning i nærvær av en tiolinneholdende forbindelse; og (d) isolere nevnte neurotrofiske protein fra nevnte oppløsning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte disulfidinneholdende forbindelse er oksidert glutation eller cystin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte denatureringsmiddel er guanidin hydroklorid eller urea.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte tiolinneholdende forbindelse er cystein eller ditiotreitol.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte oppløsning omfatter følgende trinn: (a) oppløse nevnte uttrykte neurotrofiske protein til en konsentrasjon på omtrent 0,6 mg/ml i 20 mM natrium-citrat, pH 3,0, inneholdende 8 molar urea; (b) øke pH til nevnte oppløsning ved tilsetning av 1 M tris oppløsning, pH på 8,5, inneholdende 8 molar urea; og (c) redusere nevnte NGF ved tilsetning av ditiotreitol til en konsentrasjon på omtrent 5-15 mM.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte oksidering oppstår uten fjerning av reduksjonsmiddelet.