NO309199B1

NO309199B1 - Ren bakteriekultur av halogenalkalifile mikroorganismer og anvendelse derav for fremstilling av alkali- og salt-tolerante enzymer

Info

Publication number: NO309199B1
Application number: NO932381A
Authority: NO
Inventors: Brian Edward Jones; William Duncan Grant
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1993-06-29
Publication date: 2000-12-27
Also published as: NO932381L; NZ244949A; EP0540127A1; AU661873B2; ATE188246T1; DE69230490T2; FI932903L; NO932381D0; FI932903A7; CA2097431A1; JPH06504207A; WO1993009219A1; EP0540127B1; ES2141718T3; DK0540127T3; AU2957592A; DE69230490D1; FI932903A0; KR930703431A

Abstract

Haloalkalifile bakterier er blitt isolert fra prover av jord, vann, sediment, trona (NaHC0-NaC0-2H0) og en rekke andre kilder oppnådd fra i og omkring hypersaline sodasjøer. Disse bakterier er blitt analysert ifolge den numeriske taksonomiens prinsipper med hensyn til hverandre, foruten i forhold til andre kjente haloalkalifile bakterier. Videre er disse bakteriene ytterligerechemotakso-nomisk analyse. Bakteriene fremstiller forskjellige alkali-og salt-tolerante enzymer som kan brukes i forskjellige industrielle prosesser og fremgangsmåter som krever slik enzymatisk aktivitet i et salt miljo med hoy pH.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår ren bakteriekultur av halofile, alkalifile for fremstilling av alkali- og salt-tolerante enzymer samt anvendelse derav.

Alkalifile mikroorganismer er definert som organismer som har en optimal vekst ved alkalisk pH-miljø, spesielt over pH 8, og vanligvis i området mellom pH 9 og 10. Alkalifile mikroorganismer kan leve i miljøer som har en pH så høy som 12. Obligate alkalifiler er ute av stand til å vokse ved nøytral pH.

Alkalifiler kan finnes i dagligdagse miljøer såsom vanlig jordsmonn, hvor det kan oppstå midlertidige alkaliske betingelser som skyldes biologisk aktivitet, såsom produksjon av ammoniakk, sulfatreduksjon eller fotosyntese. En langt rikere kilde for større variasjon med hensyn til alkalifile organismer kan finnes i naturlige forekommende, stabile alkaliske miljøer, såsom sodasjøer.

Halofile bakterier er definert som mikroorganismer som vokser optimalt i nærvær av salt (natriumklorid). Ettersom mikroorganismer ofte er i stand til å vokse innenfor et stort variasjonsområde med hensyn til saltkonsentrasjoner, så er begrepet halofil vanligvis begrenset eller reservert for mikroorganismer som har et minimumskrav som ligger over den konsentrasjonen man finner i sjøvann (ca. 0,5 M eller 3%) .

Ekstreme halofile bakterier er definert som bakterier som vokser optimalt over 20% NaCl (3-4 molar). Ekstreme halofiler finnes i såkalte hypersaline miljøer. De mest grundige studerte ekstreme halofile bakterier hører til ordnen Halo-bacteriales. Unntatt slektene Natronobacterium og Natrono-coccus er alle kjente halobakterier obligate halofiler som krever minst 12-15% salt for å kunne vokse og en pH omkring nøytralitet. Disse bakteriene hører til riket Euryarchaeota i klassen Archaea (dvs. archaeo-bakteriene) (Woese, C.R., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87, (1990), 4576-4579).

Begrepet "haloalkalifil" ble først brukt av Soliman og Triiper for å beskrive bakterier som er både halofile og alkalifile. (Soliman, G.S.H. & Triiper, H.G., (1982), Zbl. Bakt. Hyg., 1. Abt. Orig. C3, pp. 318-329). De eneste kjente eksempler på slike bakterier har hittil hørt til riket Euryarchaeota (Tindall, B.J. & Triiper, H.G. , (1986), System. Appl. Microbiol., 7, 202-212).

De mest ekstreme hypersaline miljøer er mikrobiologisk de minst diverse, men har ikke desto mindre en distinkt, rik og kompleks flora av ekstreme halofile bakterier. Det har vært antydet at disse miljøer er dominert av Euryarchaeota og at bare få eubakterier er tilstede (Rodriguez-Valera, F., i Halophilic Bacteria, vol. 1, (Rodriguez-Valera, F., ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, (1988), pp. 3-30).

Sodasjøer som er eksempler på naturlig forekommende alkaliske_.miljøer som også kan være hypersaline, er kjent fra forskjellige steder omkring i verden. De oppstår vanligvis ved en kombinasjon av geologiske, geografiske og klimatiske betingelser. De er karakterisert ved et nærvær av store mengder av natriumkarbonat (eller komplekser av dette saltet) dannet ved en fordampningskonsentrasjon, så vel som en til-svarende mangel på Ca<2+> og Mg<2+> som ville fjerne karbonationer som uoppløselige salter.

I situasjoner eller steder hvor konsentrasjonene av Ca<2+>

og Mg<2+> er høyere enn for karbonat, eller hvor konsentrasjonene er like, så vil saltsjøen vanligvis ha en pH mellom 6 og 8, og ionesammensetningen vil være avhengig av den lokale geologien. Dødehavet i Israel er et typisk eksempel på en svakt sur (pH

6-7) saltsjø som er anriket med divalente kationer, da spesielt Mg<2+>. På den annen side er den store saltsjøen i Utah i USA et eksempel på en salt lakes jø som er fattig på Mg<2+> og som er svakt alkalisk (pH 7-8) .

Den kommersielle produksjonen av vanlig salt fra sjøvann ved solfordampning i dammer (saltdammer) utvikler kunstige hypersaline miljøer. Saltdammer er utmerkede modellsystemer innenfor en rekke forskjellige saltkonsentrasjoner (fra sjø-vann til supermetning), og deres kjemi og mikrobiologi har vært meget intenst undersøkt (Javor, B., i Hypersaline Environments, Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg, 1989) .

Den afrikanske Rift Valley er usedvanlig ved å ha en rekke større saltsjøer. Den del av Rift Valley som ligger innenfor Kenya og Tanzania har en rekke alkaliske sodasjøer • hvor de totale saliniteter varierer fra ca. 5% (w/v) i de mer fortynnede sjøene (f.eks. Elmenteita, Bogoria, Nakuru, etc), til meting (30% eller mer) i deler av sjøene Magadi, Little Magadi (Nasikie Engida) og Natron. Disse sjøene mangler betydelige mengder Ca<2+> og Mg<2+> (i de fleste tilfeller under påvisningsnivået) og har pH-verdier fra 9 til 11,5 i de mest konsentrerte sjøene.

Til tross for dette tilsynelatende meget ugjestmilde miljøet, så har sodasjøene ikke desto mindre en stor popula-sjon av prokaryoter, og vanligvis vil et par typer av disse dominere -enten permanent eller ved sesongmessige opp-blomstringer. De nevnte organismene varierer fra alkalifile cyanobakterier til haloalkalifile archaeo-bakterier. Ved høyere saliniteter (karakterisert ved høyere ledningsevne), vil haloalkalifile archaeo-bakterier dominere. Det er videre ikke uvanlig å finne de samme arter av alkalifile organismer i sodasjøer på en rekke forskjellige steder i verden, f.eks. i den østafrikanske Rift Valley, i det vestlige USA, Tibet, Kina og Ungarn. Natronbakterier har f.eks. blitt isolert og identifisert fra sodasjøer og jord i Kina (Wang, D. og Tang, Q., " Natronobacterium from Soda Lakes of China" i Recent Advances in Microbial Ecology (Proceedings of the 5th Inter-national Symposium on Microbial Ecology, eds. T. Hattori et al., Japan Scientific Societies Press, Tokyo, (1989), pp. 68-72), Sovjetunionen (Zvyagintseva, I.S. og Tarasor. A.L. (1988) Microbiologiya, 57, 664-669) og i det vestlige USA (Morth, S. og Tindall, B.J. (1985) System. Appl. Microbiol., 6, 247-250). Natronbakterier er også blitt funnet i sodasjøer i Tibet (W.D. Gran, upubliserte observasjoner) og India (Upasani, V. og Desai, S. (1990) Arch. Microbiol., 154. pp. 589-593).

En mer detaljert undersøkelse av sodasjøer og alkalifile organismer er beskrevet i Grant, W.D., Mwatha, W.E. og Jones, B.E. (1990) FEMS Microbiology Reviews, 75<_>, 255-270, og denne teksten inngår her som en referanse. Lister over alkaliske sodasjøer kan finnes i publikasjoner av Grant, W.D. og Tindall, B.J. i Microbes in Extreme Environments, (redaktører R.A. Herbert og G.A. Codd); Academic Press, London (1986), pp. 22-54); og Tindall, B.J. i Halophilic Bacteria, vol. 1, (ed. F. Rodriguez-Valera); CRC Press Inc., Boca Raton, FL, (1988), pp. 31-70, og begge disse tekster inngår her som referanser. En detaljert undersøkelse over hypersaline miljøer er beskrevet i Javor, B., i H<yp>ersaline Environments. supra).

Alkalifiler isolert fra ikke-saltholdige miljøer er også beskrevet av Horikoshi, K. og Akiba, T. i Alkalophilic Micro-organisms (Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg/N.Y., 1982). I denne boken er det imidlertid ikke beskrevet eller diskutert noen alkalifile organismer fra alkaliske hypersaline miljøer. Strengt anaerobe bakterier fra alkaliske, hypersaline miljøer er nylig beskrevet av Shiba, H., i Superbu<g>s (eds. K. Horikoshi og W.D. Grant) ,- Japan Scientific Societies Press, Tokyo, og Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, N.Y., (1991), pp. 191-211; og av Nakatsugawa, N. ibid, pp. 212-220.

Alkalifile mikroorganismer er allerede blitt utnyttet innenfor bioteknologien for fremstilling av forbruker-produkter. Alkalifile enzymer fremstilt ved hjelp av alkalifile mikro-organismer har funnet anvendelse i industrielle prosesser og har et betydelig økonomisk potensiale. Disse enzymer blir f.eks. brukt i vaske- og rensemiddelsammen-setninger og -produkter og ved garving av lær, og man kan lett se at enzymene kan finne anvendelser i matvare- og tekstilindustrien og ved behandling av avfallsstoffer. Videre vil alkalifiler og deres enzymer kunne brukes for biotrans-formasjoner, da spesielt ved syntesen av rene enantiomerer. Mange av de mikroorganismer som beskrives i foreliggende søknad er sterkt pigmentert, og ville kunne brukes for fremstilling av naturlige fargestoffer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer renkulturer av nye haloalkalifile bakterier.

Nærmere bestemt omhandler oppfinnelsen ren bakteriekultur for fremstilling av alkali- og salt-tolerante enzymer, kjenne-tegnet ved at bakteriene er aerobe, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper:

a) en positiv reaksjon i de følgende prøver:

1) katalase

2) vekst i 15% til 25% NaCl

3) esterase

4) esteraselipase

5) leucinarylamidase

6) novobiocin

7) bacitracin;

b) en negativ reaksjon i de følgende prøver:

1) oksydase

2) vekst i 4% NaCl

_.3) alkalisk fosfatase

4) sur fosfatase

5) ampicillin

6) penicillin G

7) kloramfenikol

8) oleandomycin

9) vankomycin.

a) gir en positiv reaksjon i de følgende prøver:

1) KOH-prøve

2) vekst i 12% til 30% NaCl

3) esterase

4) esteraselipase

5) leucinarylamidase;

b) gir en negativ reaksjon i de følgende prøver:

1) vekst i 0% NaCl

2) ampicillin

3) penicillin G

4) kloramfenikol

5) oleandomycin

6) vancomycin.

a) gir en positiv reaksjon i de følgende prøver:

1) sirkulære, konvekse og hele kolonier

2) KOH-prøve

3) katalase

4) vekst i 15% til 30% NaCl

5) vekst ved 20°C eller lavere

..6) stivelseshydrolyse

7) esterase

8) esteraselipase

9) leucinarylamidase

10) ampicillin

11) penicillin G

12) kloramfenikol

13) oleandomycin

14) vankomycin

15) bacitracin;

b) gir en negativ reaksjon i de følgende prøver:

1) oksydase

2) vekst ved 0% NaCl

3) alkalisk fosfatase

4) sur fosfatase.

a) gir en positiv reaksjon i de følgende prøver:

1) sirkulære, konvekse og hele kolonier

2) katalase

3) gelatinhydrolyse

4) vokser ved 12% til 30% NaCl

5) esterase

6) esteraselipase

7) penicillin G

8) kloramfenikol

9) novobiocin

10) oleandomycin

11) bacitracin; b) gir en negativ reaksjon i de følgende prøver:

1) kolonier er rosa eller røde

2) stivelseshydrolyse

alkalisk fosfatase.

Nærmere bestemt omhandler oppfinnelsen ren bakteriekultur for fremstilLing av alkali- og salt-tolerante enzymer, kjenne-tegnet ved at bakteriene er aerobe, gram-positive, stavformede, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) gir på en alkalisk, saltholdig næringsagar opake, oransje, sirkulære kolonier, 2-3 mm i diameter, med

en konveks overflate og hel kant

b) vokser ved 20°C

c) ingen vekst ved 45°C

d) KOH-prøve er positiv

e) aminopeptidaseprøve er negativ

f) oksydaseprøve er negativ

g) katalaseprøve er positiv

h) gror i nærvær av 0% til 30% NaCl

i) hydrolyse av gelatin er positiv

j) hydrolyse av stivelse er positiv k) veksten hemmes av følgende antibiotika:

1) gentamicin

2) kloramfenikol

3) fusidinsyre

4) eryt romyc in

5) meticillin

6) oleandomycin

7) rifampicin

8) vankomycin

9) bacitracin

1) veksten hemmes ikke av følgende antibiotika:

1) nitrofurantoin

2) ampicillin

3) nalidiksinsyre

4) sulfametoksazol

5) trimetoprim

6) penicillin G

7) novobiocin

8) streptomycin

9) tetracyklin

10) polymiksin

11) neomycin

J.2) kanamycin

m) vokser på enkle sukkere

n) vokser på aminosyrer

0) vokser på organiske syrer

p) vokser på gjærekstrakt og peptoner q) inneholder membranlipider basert på fettsyreestere.

Nærmere bestemt omhandler oppfinnelsen ren bakteriekultur for fremstilling av alkali- og salt-tolerante enzymer, kjenne-tegnet ved at bakteriene er aerobe,gram-positive, stavformede haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) danner på en alkalisk, saltholdig næringsagar krem-fargede, sirkulære kolonier med en diameter på ca. 1

mm med en konveks overflate og hel kant;

b) vokser ved 20°C

c) vokser ved 45°C

d) KOH-prøve er negativ

e) aminopeptidaseprøve er negativ

f) oksydaseprøve er negativ

g) katalaseprøve er negativ

h) obligat halofil

1) vokser i nærvær av 15% til 30% NaCl j) hydrolyse av stivelse er positiv k) veksten hemmes ikke av følgende antibiotika:

1) gentamicin

2) nitrofurantoin

3) ampicillin

4) nalidiksinsyre

5) penicillin G

6) klormafenikol

7) erytromycin

8) fusidinsyre

9) meticillin

10) novobiocin

11) streptomycin

12) tetracyklin

13) oleandomycin

1) ..veksten hemmes av følgende antibiotika:

1) sulfametoksazol

2) trimetoprim

3) polymiksin

4) rifampicin

5) bacitracin

m) vokser på gjærekstrakt og peptoner n) inneholder membranlipider sammensatt av glyceroldietergrupper.

Nærmere bestemt omhandler oppfinnelsen ren bakteriekultur for fremstilling av alkali- og salt-tolerante enzymer, kjenne-tegnet ved at bakteriene er aerobe,gram-variable, kokkeformede haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) danner på en alkalisk, saltholdig næringsagar rosafargede, uregelmessige kolonier med en diameter på

1-2 mm, med hevet overflate og hel kant;

b) KOH-prøve er positiv

c) oksydaseprøve er negativ

d) vokser i nærævr av 0% til 30% NaCl

e) hydrolyse av stivelse er positiv

f) vekst hemmes av følgende antibiotika:

1) nitrofurantoin

2) trimetoprim

g) veksten hemmes ikke av følgende antibiotika:

1) gentamicin

2) ampicillin

3) nalidiksinsyre

4) penicillin G

5) klormafenikol

6) erytromycin

7) fusidinsyre

8) meticillin

9) novobiocin

10) streptomycin

11) tetracyklin

h) vokser på gjærekstrakt og peptoner

i) inneholder membranlipider sammensatt av glyceroldietergrupper.

Disse bakterier er blitt isolert fra jordprøver, vann, sedimenter og trona (NaHC03-Na2C03 • 2H20) og en rekke andre forskjellige kilder, og hvor alle kommer fra eller omkring alkaliske, hypersaline sjøer. Disse haloalkalifiler er blitt analysert ved hjelp av numerisk taksonomi med hensyn til hverandre og også i forhold til andre kjente haloalkalifilie bakterier for å bekrefte at de er nye og ubeskrevne bakterier. Videre er disse bakterieartene blitt definert ved hjelp av kjemotaksonomiske analyser.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også data med hensyn til sammensetningen på de miljøer hvor man tok prøvene som inneholdt de nye mikroorganismene, så vel som sammensetningen på de medier som er nødvendige for å få en effektiv isolering og vekst, slik at en velutdannet mikrobiolog lett kan lokalisere slike miljøer og vil være i stand til å isolere de foreliggende mikroorganismer ved hjelp av de fremgangsmåter som er beskrevet her.

Det er også en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe mikroorganismer som kan fremstille anvendbare alkali- og salt-tolerante enzymer, så vel som anvendelser derav for å kunne fremstille i alt vesentlig rene preparater av disse enzymene. Disse enzymene er i stand til å utføre sine funksjoner ved høy pH og i miljøer med høy saltkonsen-trasjon, som gjør enzymene meget godt egnet for anvendelser • hvor man har slike ekstreme betingelser. F.eks. vil enzymer med alkali- og salt-toleranse kunne anvendes i vaskemidler, ved garving av lær og i matvarer, ved behandling av avfallsstoffer og i tekstilindustrien, foruten for en biotrans-formasjon for fremstilling av rene enantiomerer.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 Dendrogram som viser de grupper (fenoner) som ble oppnådd med SSM-koef f isientmetoden og den uveide

—midlere forbindelsesmetoden.

Fig. 2 Dendrogram som viser grupper (fenoner) som ble oppnådd med Sj-koeffisientmetoden og den uveide midlere forbindelsesmetoden.

Detaljert beskrivelse av fremgangsmåten for innsamling av prøver ifølge foreliggende oppfinnelse

Flere hundre stammer av bakterier er blitt isolert fra prøver av jordsmonn, vann, sediment, trona (NaHC03 • Na2C03 • 2H20) og en rekke andre kilder i og omkring alkaliske, hypersaline sjøer. Prøvene ble oppnådd som en del av en undersøkelse som strakk seg over 3 år. De isolerte bakterier er ikke-foto-trofiske eubakterier og archaeo-bakterier. Inntil nå er det bare blitt karakterisert noen få haloalkalifile archaeo-bakterier (se tabell 4) .

Prøvene ble samlet i sterile plastposer. Prøvetakingen ble utført ved sjøene Magadi, Little Magadi (Nasikie Engida) og Natron, som alle er plassert i Rift Valley i østre afrika i Kenya og Tanzania. Alkaliske sodasjøer med lignende miljøer er også funnet i Tibet, Kina, Egypt og vestlige USA. Ved hver prøvelokalitet målte man også fysiske paramtere såsom pH, ledningsevne og temperatur, foruten de fysiske karakterer på selve innsamlingsstedet og på prøven. Noen av prøvene ble behandlet lokalt i løpet av 36 timer etter innsamlingen, men hovedtyngden ble undersøkt flere uker etter innsamling.

Tabell 1 angir forskjellige stammer som ble isolert. Stammene er listet opp ifølge den lokalitet hvor prøven ble tatt og utseende på selve prøven. Tabell 2 gir eksempler på kjemiske analyser av innsjøvannet på de steder hvor samlingen ble foretatt på det tidspunkt da prøvene ble tatt. Disse data er i overensstemmelse med tidligere analyser (Gran, W.D. og Tindall B.J., i Microbes in Extreme Environments. (eds. R.A. Herbert og G.A. Godd); Academic Press, London, 1986).

Tabell 3 gir en liste av de isolerte stammer plassert etter resultatene av den numeriske taksonomiske analyse (fig. 1) . Videjre gir tabell 3 fysiske egenskaper for prøvene, da spesielt temepratur, ledningsevne og alaklisk pH, så vel som de tallrike isolasjonsmedia som ble anvendt for å oppnå renkulturer av de nye bakterier. Disse media har en bokstavkode med henvisning til appendiks A.

Tabellene 1, 2 og 3 gir data som gjør at man kan karak-terisere de miljøer hvor prøvene ble innsamlet. De kjemiske og fysiske analyser av prøvene bekrefter nærværet av en alkalisk pH, så vel som et nærvær av usedvanlig høye nivåer av Na2C03 koblet med lavt innholdt eller nivå av Ca<2+> og Mg<2+>. Det er velkjent at det basiske miljøet i sodasjøer er stabilt med hensyn til pH og ionesammensetning. Det er videre kjent at det mikrobielle miljøet som finnes i nevnte sjøer er relativt stabilt. Man kan således forvente at det miljø fra hvilke bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse er oppnådd, kan bestemmes ut fra de data som er angitt i tabellene 1-3.

Behandling av prøvene: Anrikning og isolasjon av haloalkalifile bakterier

En rekke anriknings- og isolasjonsmetoder ble anvendt. Enkelte av metodene er spesifikt utformet for anriking og isolasjon av haloalkalifile bakterier som har visse typer enzymaktivitet ved en alkalisk pH. Andre teknikker av mer generell type ble anvendt for isolasjon av forskjellige typer haloalkalifile bakterier. I visse tilfeller tok man hensyn til de spesielle betingelser som hersker i de angitte prøve-sjøer (tabell 2) når man utførte eksperimenter for å isolere bakteriene.

De forskjellige næringsmedier som ble anvendt for isolasjon av de nye haloalkalifile bakterier er angitt Medium A - Medium F. Sammensetningen på de forskjellige media som ble anvendt, _er vist i appendiks A.

For isoleringen av ikke-spesifikke haloalkalifile organo-trofe bakterier, ble prøver av vann fra sodasjøer eller for-tynninger av disse streket ut på en alkalisk saltholdig næringsagar, pH 10 til pH 10,5 (medium A). Prøver av mer fast konsistens, f. eks. mudder, sediment, etc, ble først suspendert i et alkalisk, saltholdig næringsmedium (medium A) før det ble spredd ut på en alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A). Bakteriene ble dyrket i en oppvarmet inkubator, fortrinnsvis ved 37°C. I visse tilfeller ble prøvene suspendert i et alkalisk, saltholdig næringsmedium (medium A), og bakteriene dyrket ved risting, fortrinnsvis ved 37°C i 2 til 7 døgn før man spredde mediet ut på en alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) for isolering av bakteriekolonier.

For isoleringen av haloalkalifile bakterier som viste spesifikke typer av enzymaktivitet, så ble prøvene spredd ut på en alkalisk, saltholdig næringsagar som inneholdt spesifikke substrater såsom laktalbumin eller kasein. I visse tilfeller ble bakterien i prøven anriket i 1 døgn til flere uker i et ikke-spesifikt alkalisk, saltholdig næringsmedium såsom medium A, før dette ble spredd ut på en alkalisk, saltholdig næringsagar som var spesifikk for påvisning av bakterier som viste enzymaktivitet, f.eks. proteolytisk aktivitet .

Taksonomisk analyse

25 stammer av bakterier isolert i eller fra omkring alkaliske, hypersaline sjøer ble angitt i kategorien haloalkalifile på basis av deres evne til å vokse i en NaCl-konsentrasjon på 15% eller mer og ved en pH på over 10.

De 25 stammene ble prøvet for 107 karakterer. Av praktiske hensyn ble karakterene oppdelt i 123 karaktertilstander. Resultatene ble analysert ved hjelp av numeriske taksonomiprinsipper (Sneath, P.H.A. og Sokal, R.R., i Numerical Taxonomv, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1973). De karakterer som ble undersøkt og selve prøvemetoden er angitt i .appendiks B. I tillegg viser appendiks C hvordan hver karaktertilstand ble kodet for den taksonomiske analysen.

Som kontroll ble 5 kjente haloalkalifile arkaeobakterier underkastet samme analyse under samme betingelser. Disse referansebakteriene er de eneste tilgjengelige som er kjente som haloalkalifile bakterier. Disse 5 kjente referansebakteriene er angitt i tabell 4, og man kan se fra denne tabellen at "typestammen" av de kjente artene er blitt brukt når denne var tilgjengelig.

Analyse av prøvedata for bedømmelse av taksonomisk slektskap

De fenetiske data som besto av 107 karakterer ble skåret for 123 to-trinnskarakterer (nærvær-fravær-karakterer) ved å bruke det binære system som er angitt i appendiks C. Additiv oppskalering ble brukt når dette var passende (f.eks. vekst på NaCl), og når det var nødvendig ble kvalitative flertrinns-karakterer (f.eks. kolonifarge) oppdelt i flere gjensidige utelukkende karaktertilstander. Dataene ble satt ut i form av en "n x t"-matrise, hvor t-kolonnene representerer t-bakterie-stammer som skulle grupperes på basis av slektskap, og hvor n-radene er enhetskarakterene. Taksonomisk slektskap innenfor bakteriestammene ble bedømt ved hjelp av en likhetskoeffisient (Sneath, P.H.A og Sokal, R.R., Numerical Taxonomy. supra, pp. 114-187). Skjønt mange forskjellige koeffisienter er blitt brukt for_.biologisk klassifikasjon, så er det bare noen få som er regelmessig brukt i bakteriologi. Man har her valgt å anvende to assosiasjonskoeffisienter (Sneath, P.H.A. og Sokal, R.R., ibid, p. 129 og etterfølgende), nemlig Simple Matching og Jaccard-koeffisientene. Disse er ofte blitt brukt for analyse av bakteriologiske data og har vid anvendelse blant bakteriologer, ettersom de har vist seg å gi en robust klassifikasjon .

De kodede data ble analysert ved hjelp av TAXPAK-programpakken (Sackin, M.J., "Programmes for classification and identification" i Methods in Microbiolocry. vol. 19. (eds. R.R. Colwell og R. Grigorova, pp. 459-4 94, Academic Press, London, 1987) og kjørt i et DEC VAX-computersystem ved universitetet i Leicester i England. I tillegg ble nevnte data analysert ved hjelp av NTSYS-pc- (versjon 1.50) programpakken som ble kjørt på en IMB PS/2 desk topp datamaskin (Rolf, F.J., Numerical taxonomy and multivariate analysis system, Applied Biostatistics Inc. and Exeter Publishing Ltd., Setauket, New York, 1988) .

En lignende matrise ble konstruert for alle stammepar ved å bruke the Simple Matching Coefficient (SSM) , (Sneath, P.H.A. og Sokal, R.R., Numerical Taxonomy. p. 132; W.H. Freeman & Company, San Francisco, 1973) ved å bruke RTBNSIM-programmet i TAXPAK. Gruppeanalysen av likhetsmatrisen ble oppnådd ved hjelp av en uveiet pargruppemetode med aritmetisk middel (UPGMA) algoritme, også kjent som den uveide midlere forbindelsesmetoden som ble kjørt ved hjelp av en SMATCLST sub-rutine

i TAXPAK.

Resultatet av gruppeanalysen (cluster-analyse) er et dendrogram som er vist på fig. 1. Dette dendrogrammet viser likhetsnivåer mellom bakterierasene, Dendrogrammet ble oppnådd ved å bruke DENDGR-programmet i TAXPAK.

De fenetiske data ble analysert omigjen ved hjelp av Jaccard-koeffisienten (Sj) (Sneath, P.H.A. og Sokal, R.R., Numerical Taxonomy. p. 131; W.H. Freeman & Company, San Francisco, 1973) ved å kjøre RTBNSIM-programmet i TAXPAK. Et annet dendrogram ble oppnådd ved å bruke SMATCLST med UPGMA-valg og DENDGR sub-rutiner i TAXPAK, og dette dendrogrammet er vist på fig. 2.

Resultater av gruppeanalyse

SSM/UPGMA-metode

Fig. 1 viser resultatene av gruppeanalysen basert på den enkle tilpasningskoeffisienten og UPGMA-algoritmen for de 25 nye haloalkalifile bakterier som ble isolert i og fra alkaliske sjøer sammen med 5 kjente haloalkalifile bakterier.

Fire naturlige grupper eller fenoner av haloalkalifile bakterier ble påvist med et 78,5% likhetsnivå. Disse fire gruppene innbefatter 22 av de 25 nye haloalkalifile bakterier som ble isolert fra alkaliske sjøer. Skjønt valget av 78,5% for avgrensningsnivået kan synes vilkårlig, så er dette i overensstemmelse med vanlig praksis i numerisk taksonomi (Austin, B. og Priest, F. i Modem Bacterial Taxonomy, p. 37; Van Nostrand Reinhold; Wokingham, U.K., 1986). Hvis man hadde plassert avgrensningen på et lavere prosentnivå, så ville dette kombinert grupper av klart ubeslektede organismer hvis definisjon ikke er understøttet av de nevnte data, mens en høyere prosent ville gi en rekke mindre definerte grupper. Videre viste en undersøkelse av de opprinnelige data, da spesielt kolonikarakteristika og følsomhet overfor antibiotika, at gruppe 1 og gruppe 2 inneholder utelukkende archaeo-bakterier, mens gruppe 3 og gruppe 4 inneholder bare eubakterier. Denne konklusjonen understøttes av chemotaksono-misk data (se diskusjon nedenfor). Gruppetilhørigheten i gruppene ble ytterligere bekreftet ved det gruppemønster man oppnådde ved hjelp av Jaccard-koeffisienten (se nedenfor og fig. 2) .

På 78,5% nivået så vil to av gruppene (gruppe 3 og gruppe 4) utelukkende inneholde nye haloalkalifile eubakterier som representerer 9 av de nylig isolerte stammer, og disse kan representere nye taksa eller arter. Tre av de nye haloalkalifile stammene faller utenfor hovedklyngene. Disse ikke-klyngetilhørende stammene er l03Nt.4, 31M.4 og 931LM.4, og deres indre slektskap er mer vanskelig å definere, men de representerer sannsynligvis nye fenoner som hittil ikke har blitt beskrevet.

Fordelingen av positive karakterer i gruppene er gitt i appendiks E.

Sj/UPGMA-metode

Jaccard-koeffisienten er verdifull i tillegg til den enkle tilpasningskoeffisienten, ettersom den kan brukes for å påvise fenoner eller taksonomiske grupper i sistnevnte på grunn av at man har gitt negative data for sterk vekt. Følge-lig vil Jaccard-koeffisienten kunne brukes for å bekrefte holdbarheten på de grupper som opprinnelig ble definert ved hjelp av den enkle tilpasningskoeffisienten. Jaccard-koeffisienten er spesielt fordelaktig når man sammenligner bio-kjemisk ureaktive eller langsomtvoksende organismer (Austin, B. og Priest, F., supra, p. 37) .

De fire grupper som ble utviklet ved hjelp av SSM/UPGMA-metoden fremgår også av det dendrogrammet som ble fremstilt ved hjelp av Sj/UPGMA-metoden (fig. 2) . Skjønt det er en viss omarrangering av mønsteret i gruppene, så vil gruppetilhørig-heten forbli den samme i begge dendrogrammer. I dette tilfellet er imidlertid gruppene definert ved et nivå på 59% (Sj)

(det minimumsnivået som er nødvendig for å definere gruppe 1 (SSM)) , og i dette tilfellet vil de eubakterielle gruppene 3 .og 4 bli slått sammen. Skjønt dette kan indikere at disse to gruppene er i alt vesentlig differensiert på basis av negative karakterer, så vil en undersøkelse av begge de opprinnelige dendrogrammene antyde at en mer sannsynlig forklaring er gruppe l's heterogenitet. Stammene 30M.4 og 87M.4 synes å danne en undergruppe innenfor gruppe 1.

Når fenetiske data ble undersøkt ved hjelp av NTSYS-programmene, så fikk man nøyaktig de samme resultatene med hensyn til gruppering av stammene.

Bestemmelse av representative stammer

Sentroiden eller den hypotetiske opprinnelige organisme for hver individuelle gruppe utviklet ved hjelp av SSM/UPGMA-metoden, ble beregnet ved å bruke RGROUPS-programmet i TAXPAK. Sentroiden i en punktgruppe representerer virkelige organismer som er projesert i et hyperrom og representerer en hypotetisk midlere organisme. Sentroiden er meget sjelden, hvis noen sinne, en virkelig organisme. Man beregnet derfor den euklidiske avstand for hvert medlem av gruppen fra sentroiden for å mulig kunne fastslå hvilken organisme som var nærmest den hypotetiske midlere organisme. Den organisme som er nærmest sentroiden ble betegnet som "sentrotypeorganismen"

(angitt med indikasjonen "CT").

Sentrotypeorganismen kan ansees å være "typestammen" som nærest mulig representerer vesentlige og diskriminerende trekk for hver spesiell gruppe. Sentrotypestammene er angitt i tabell 5.

Beskrivelse av sentrotypestammer

Stamme 86M.4

En aerob, kokkoid bakterie. Ingen sporer ble observert.

Haloalkalifil. Vokser ved pH 10 på et medium som inneholder 20% NaCl. Vokser i nærvær av 12-30% NaCl.

På alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) dannes det rosafargede, sirkulære kolonier, ca. 2 mm i diameter, som har en konveks overflate og hel kant.

Temperatur: vokser optimalt ved 30-40°C. Vokser ved 20°C, men ikke ved 45°C.

Veksten ble hemmet av følgende antibiotika: gentamicin, ampicillin, penicillin G, kloramfenikol, streptomycin, tetracyklin, oleandomycin, polymiksin, rifampicin, neomycin, vankomycin og kanamycin. Veksten ble ikke hemmet av følgende antibiotika: erytromycin, novobiocin og bacitracin.

Chemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakter, peptoner og kasaminosyrer.

Membranlipidene inneholder glyceroldietergrupper, noe som indikerer at stamme 86M.4 er av archaeo-bakterietypen.

Stamme 98Nt.4

En aerob, kokkoid bakterie. Ingen sporer ble observert. Haloalkalifil. Vokser ved pH 10 på et medium som inneholder 20% NaCl. Vokser i nærvær av 12-30% NaCl.

På alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) dannes ugjennomskinnelige, sprø, rosa og sirkulære kolonier 1-2 mm i diameter, med en konveks overflate og hel kant.

Temperatur: gror optimalt ved 3 0-40°C. Gror ved 20°C, men ikke ved 45°C.

Veksten hemmes av følgende antibiotika: gentamicin, ampicillin, penicillin G, kloramfenikol, streptomycin, tetracyklin, oleandomycin, polymiksin, neomycin, vankomycin og kanamycin. Veksten hemmes ikke av disse antibiotika: erytromycin, novobiocin, rifampicin og bacitracin.

Kjemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjaerekstrakter, peptoner og kasaminosyrer.

Stamme 93dLM.4

En aerob, gram-negativ, stavformet bakterie. Ingen sporer ble observert.

Haloalkalifil. Vokser ved pH 10 på et medium som inneholder 20% NaCl. Vokser i nærvær av 15-30% NaCl.

På alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) dannes ugjennomskinnelige, fuktige, røde, sirkulære kolonier, ca. 1 mm i diameter, med en konveks overflate og hel kant.

Temperatur: vokser optimalt ved 30-40°C. Vokser ved 20°C, men ikke ved 45°C.

Veksten hemmes av følgende antibiotika: streptomycin, tetracyklin, polymiksin, neomycin og kanamycin. Veksten hemmes ikke av følgende antibiotika: gentamicin, ampicillin, penicillin G, erytromycin, novobiocin, oleandomycin, rifampicin, vankomycin og bacitracin.

Kjemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakter, peptoner og kasaminosyrer.

Stamme 95LM.4

En aerob, gram-negativ, stavformet bakterie. Ingen sporer ble observert.

Haloalkalifil. Vokser ved pH 10 på et medium som inneholder 20% NaCl. Vokser i nærvær av 8-30% NaCl.

På alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) dannes ugjennomskinnelige, gule, sirkulære kolonier, ca. 2 mm i diameter, med en konveks overflate og hel kant.

Temperatur: vokser optimalt ved 30-40°C. Vokser ved 2 0°C, men ikke ved 4 5°C.

Veksten hemmes av følgende antibiotika: gentamicin, streptomycin, tetracyklin, polymiksin, neomycin og kanamycin. Veksten hemmes ikke av følgende antibiotika: ampicillin, penicillin G, kloramfenikol, erytromycin, novobiocin, oleandomycin, rifampicin, vankomycin og bacitracin.

Kjemoorganotrof. Vokser på.komplekse substrater såsom gjærekstrakter, peptoner og kasaminosyrer.

Ikke-klyngedannende stammer

Stammene som ikke faller innenfor de fire grupper som er definert her, er også nye bakterier som hittil ikke har vært kjent eller vært beskrevet. Disse stammene med kodene l03Nt.4, 31M.4 og 931LM.4 kan representere sjeldnere variete-ter av haloalkalifile bakterier. Det er nedenfor gitt en beskrivelse av disse "ikke-klyngedannende" stammene slik at det er mulig å skille disse organismene fra alle tidligere kjente og beskrevne bakterier.

Stamme 103Nt.4

En aerob, gram-negativ, stavformet bakterie. Ingen sporer ble observert.

Haloalkalifil, vokser ved pH 10 på et medium som inneholder 20% NaCl. Vokser i nærvær av 0-30% NaCl.

På alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) dannes ugjennomskinnelige, oransje, sirkulære kolonier 2-3 mm i diameter, med konveks overflate og hel kant.

Temperatur: vokser optimalt ved 30-40°C. Vokser ved 20°C, men ikke ved 45°C.

Veksten hemmes av følgende antibiotika: gentamicin, kloramfenikol, fusidinsyre, erytromycin, meticillin, oleandomycin, rifampicin, vankomycin og bacitracin. Veksten hemmes ikke av følgende antibiotika: nitrofurantoin, ampicillin, nalidiksinsyre, sulfametoksazol, trimetoprim, penicillin G, novobiocin, streptomycin, tetracyklin, polymiksin, neomycin og kanamycin.

Kjemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakt, peptoner og kasaminosyrer. Veksten stimuleres av en rekke enkle sukkere, aminosyrer og organiske syrer.

Membranlipidene basert på fettsyreestere indikerer at stamme l03Nt.4 er av en eubakteriell type.

Stamme 31M.4

En aerob, gram-positiv, stavformet bakterie. Ingen sporer ble observert.

Obligat haloalkalifil, vokser ved pH 10 på et medium som inneholder 20% NaCl. Vokser i nærvær av 15-30% NaCl. Ingen vekst ved 12% NaCl.

På alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) dannes lysegule, sirkulære kolonier, ca. 1 mm i diameter, med konveks overflate..og hel kant.

Temperatur: vokser optimalt ved 3 0-40°C. Vokser ved 20°C og 45°C, men ikke ved 50°C.

Veksten hemmes av følgende antibiotika: sulfametoksazol, trimetoprim, polymiksin, rifampicin og bacitracin. Veksten hemmes ikke av følgende antibiotika: gentamicin, nitrofurantoin, ampicillin, nalidiksinsyre, penicillin G, kloramfenikol, erytromycin, fusidinsyre, meticillin, novobiocin, streptomycin, tetracyklin og oleandomycin.

Kjemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakt, peptoner og kasaminosyrer.

Membranlipidene inneholder glyceroldietergrupper, noe som indikerer at stamme 31M.4 er av archaeo-bakteriell type.

Stamme 93ILM.4

En aerob, gram-variabel, kokkoid bakterie. Ingen sporer ble observert.

Haloalkalifil, vokser ved pH 10 på et medium som inne- . holder 20% NaCl. Vokser i nærvær av 0-30% NaCl.

På alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) dannes rosa, uregelmessige kolonier, 1-2 mm i diameter, med hevet overflate og hel kant.

Veksten hemmes av følgende antibiotika: nitrofurantoin og trimetoprim.

Veksten hemmes ikke av følgende antibiotika: gentamicin, ampicillin, nalidiksinsyre, penicillin G, kloramfenikol, erytromycin, fusidinsyre, meticillin, novobiocin, streptomycin og tetracyklin.

Kjemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakt, peptoner og kasaminosyrer. Membranlipidene inneholder glyceroldietergrupper, noe som indikerer at stamme 93ILM.4 er av archaeo-bakteriell type.

Kjemotaksonomisk definisjon av gruppene

Kjemotaksonomi er studiene av kjemiske variasjoner i celler i forhold til deres systematiske stilling. Analyser av kromosomalt DNA, ribosomalt RNA, proteiner, cellevegger og membraner kan f.eks. gi verdifull innsikt i de taksonomiske slektsskapsforholdene og kan være et ytterligere redskap for å klassifisere eller å verifisere den taksonomiske eller systematiske stillingen for mikroorganismer (Goodfellow, M. og Minnikin, D.E. i Chemical Methods in Bacterial Systematics.

(eds. Goodfellow, M. og Minnikin, D.E.), Academic Press, London og Orlando, FL, (1985), pp. 1-5).

Analyse av kjernelipider

Alle membranlipider fra hittil kjente archaeo-bakterier er blitt karakterisert ved usedvanlig strukturelle trekk, noe som kan ansees å være spesifikke taksonomiske markører for denne gruppe av mikroorganismer. Mens alle levende organismer som hittil har vært undersøkt, har vist seg å ha membranlipider basert på esterbindinger, så har archaeo-bakterier lipider basert på eterbindinger. (De Rosa, M. et al., (1986), Microbiological Reviews, 50, 70-80).

Membranlipidene ble ekstrahert fra bakteriene og analysert ved hjelp av tynnsjiktkromatografi ved hjelp av de fremgangsmåter som er beskrevet av Ross, H.N.M. et al.,

(1981), Journal of General Microbiology, 123, 75-80) .

Resultatene av denne analysen for representative stammer og arter _av haloalkalifile bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse, er angitt i tabell 6. Nevnte data viser klart at stammer fra gruppene 1 og 2 mangler fettsyremetylestere, men inneholder de glyceroldietylgrupper som er karakteristiske for archaeo-bakteriene. Stammene fra gruppene 3 og 4 inneholder fettsyremetylestere, men ingen glyceroldietylgrupper, noe som bekrefter deres identitet som eubakterier. Disse resultater understreker den fundamentale forskjell som det er mellom bakteriene i gruppene 1 og 2 på den ene side og gruppene 3 og 4 på den annen side.

Fremstilling og anvendelse av alkali- og salt-tolerante enzymer

De haloalkalifile mikroorganismer ifølge foreliggende oppfinnelse fremstiller en rekke enzymer (se f.eks. appendiks D og E). Disse enzymene er i stand til å utføre sine funksjoner ved ekstremt høye pH-verdier og meget høye saltkonsentrasjoner, noe som gjør dem enestående godt egnet for anvendelse i en rekke prosesser som krever enzymatisk aktivitet i slike miljøer eller ved slike reaksjonsbetingelser.

Eksempler på forskjellige anvendelser av enzymer med alkali- og salt-toleranse er i vaskemiddelsammensetninger, lærgarving, behandling av matvarer, behandling av avfallsstoffer og i tekstilindustrien. De foreliggende enzymer kan også brukes for biotransformeringer, spesielt ved fremstil-lingen av., rene enantiomerer.

De haloalkalifile mikroorganismer kan lett undersøkes for fremstilling av alkali- og salt-tolerante enzymer med f.eks. lipolytisk, proteolytisk og stivelsesnedbrytende aktivitet eller andre aktiviteter ved å bruke de fremgangsmåter som er beskrevet i appendiks B.

Det medium i hvilket de haloalkalifile bakterier er dyrket, vil vanligvis inneholde en eller flere typer enzymatisk aktivitet. Det mediet som inneholder enzymet eller enzymene kan enten brukes direkte i den forønskede prosess etter at man har fjernet bakteriene ved hjelp av sentrifuge-ring eller filtrering.

Hvis det er ønskelig kan kulturfiltratet konsentreres ved frysetørking, før eller etter dialyse, eller ved ultrafiltrer-ing. Enzymene kan også utvinnes ved hjelp av utfelling og filtrering. Alternativt kan enzymet eller enzymene i mediet isoleres og renses ved hjelp av kromatografiske metoder eller ved gelelektroforese, f.eks. før de anvendes i den forønskede prosessen.

De gener som koder for disse alkali- og salt-tolerante enzymer kan isoleres, klones og bringes til ekspresjon i forenelige ekspresjonsverter, noe som gir en kilde for store volumer av enzymprodukter som, hvis det er ønskelig, lett kan renses å brukes for de forønskede industrielle formål, skulle villtypestammen ikke gi tilstrekkelige mengder av det for-ønskede enzym eller ikke lett lar seg fermentere.

I en utførelse kan det enzymatiske preparatet brukes i . vaskeprøver for å bestemme effekten av den enzymatiske akti-viteten.

Enzympreparater fra haloalkalifile bakterier kan under-søkes i spesielt utviklede minivaskeprøver hvor man bruker tøystykker av bomull som er forurenset med protein-, lipid-og/eller stivelsesholdige komponenter. Før vaskeprøven kan stykkene forbehandles med en oppløsning inneholdende et anionisk overflateaktivt middel, natriumperborat og en blekningsaktivator (TAED) . Etter denne behandlingen kan prøvestykkene skylles i rennende demineralisert vann og der-etter luf£tørkes. Denne behandlingen resulterer i en fikser-ing av jord og forurensninger og som gjør at de blir vanske-ligere å fjerne.

Vaskeprøvene kan utføres ved å bruke en definert vaske-middelsammensetning samt en spesifikk mengde av enzymatisk aktivitet i nærvær av prøvestykkene. Etter vaskingen skylles stykkene i rennende demineralisert vann og lufttørkes. Refleksjonen fra prøvestykkene måles ved hjelp av et foto-meter.

Appendiks A Media brukt i foreli<gg>ende oppfinnelse

MEDIUM A

MEDIUM B

MEDIUM C

MEDIUM D

MEDIUM E

MEDIUM F

Appendiks B

Metoder for enhetsprøver

1. Karakterene 1 til 12

Kolonifarge, størrelse, form, utseende og kant

En suspensjon av bakteriene ble spredd ut over en alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) og dyrket ved 37°C. Koloniene ble undersøkt etter 7 til 14 døgn.

2. Karakterene 13 til 15

Cellemorfologi, gramfargingsreaksj on

Bakteriecellene ble dyrket i et alkalisk, saltholdig næringsmedium (medium A uten agar) inntil man hadde oppnådd . tilstrekkelig vekst. Cellene ble så sentrifugert ned og igjen resuspendert i en mindre mengde friskt medium. En dråpe av bakteriesuspensjonen ble lufttørket på et mikroskopisk obj ekt-glass. Gramfargeprøven ble utført ved å bruke Dussault-modifikasjon (Journal of Bacteriology, 70., 484-485, 1955) med safranin som motfarge.

3. Karakter nummer 16

KOH-prøve

Denrje prøven ble utført ved å bruke 3% KOH i 20% NaCl + 1% Na2C03 på 7 til 14 døgns gamle bakteriekulturer som var dyrket på et alkalisk, saltholdig næringsmedium (medium A) som beskrevet av Halebian et al. i Journal of Clinical Microbiology, 13., 444-448, 1981 og sammenlignet med reaksjonen i oppløsningen som bare inneholdt 20% NaCl + 1% Na2C03.

4. Karakter nummer 17

Aminopeptidasereaksjon

Prøven ble utført ved å bruke diagnostiske prøvestriper Bactident" Aminopeptidase (E. Merck, Darmstadt, Tyskland). En gul farge i løpet av 3 0 minutter ble notert som en positiv reaksjon.

5. Karakter nummer 18

Oksydasereaksjon

Filtrerpapir fuktet med en 1% vandig oppløsning av N,N,N<1>,N<1->tetrametyl-p-fenylendiamin eller oksydaseidentifika-sjonsskiver (bioMérieux: Charboniéres-les-Bains, Frankrike) ble smurt med en ung bakteriekultur fra en alkalisk, saltholdig næringsagar. En purpurfarge i løpet av 1 minutt ble angitt som en positiv reaksjon. E. coli ble brukt som en negativ kontroll.

6. Karakter nummer 19

Katalasereaksj on

En bakteriekoloni fra en alkalisk, saltholdig næringsagar ble suspendert i en dråpe 3% hydrogenperoksydoppløsning eller "ID color catalase" reagens (bioMérieux). Bobler av utviklet oksygen ble angitt som en positiv reaksjon.

7. Karakter nummer 20

Gelatinhydrolyse

Trekull-gelatinskiver (bioMérieux) eller "chargels"

(Oxoid) ble inkubert ved 37°C i et alkalisk, saltholdig næringsmedium (medium A) sammen med bakteriene. Et svart sediment indikerte en positiv reaksjon.

8. Karakter nummer 21 og 3 9

Skummet melk og stivelseshydrolyseprøve

Bakteriene ble inokulert på et alkalisk, saltholdig

næringsmedium (medium A) tilsatt 5,0 g/liter av skummet melke-pulver eller 2,0 g/liter stivelse og inkubert ved 37°C. Klare områder omkring bakteriekoloniene i en ellers ugjennomskinne-lig agar, ble angitt som en positiv reaksjon. Soner med stivelseshydrolyse ble bekreftet med farging med jodoppløsning (lugol).

9. Karakterene nummer 22-29

NaCl-toleranse

Man anvendte to fremgangsmåter.

(a) Bakteriestammene ble dyrket ved 37°C på en alkalisk næringsagar (medium A) som inneholdt 0%, 4%, 8%, 12%, 15%, 20%, 25% eller 30% (w/v) NaCl. Agarplatene ble undersøkt for bakterievekst etter 7-14 døgn.

(b) Bakteriestammene ble dyrket ved 37°C i et alkalisk næringsmedium (medium A) som inneholdt 0%, 4%, 8%, 12%, 15%, 20%, 25% eller 30% (w/v) NaCl. Bakterieveksten ble undersøkt regelmessig opp til 14 døgn ved at man målte den optiske tettheten ved hjelp av et Klett-meter (grønnfilter).

10. Karakterene nummer 30 og 31

Veksttemperatur

Bakteriestammene ble inokulert på et alkalisk, saltholdig næringsmedium (medium A) og inkubert ved 10°C, 15°C, 20°C, 45°C eller 50°C. Bakterieveksten ble undersøkt regelmessig opp til 14 døgn etter inokulering ved at man målte den optiske tettheten—ved å bruke et Klett-meter (grønnfilter).

11. Karakterene 32-38

Karbohydratutnyttelse

Et minimumsmedium sammensatt av (g/liter destillert vann) av gjærekstrakt, 1,0; KN03, 1,0; KC1, 2,0; MgS04-7H20, 1,0; MnCl2-4H20, 0,00036; FeS04-7H20, 0,05; NaCl, 200,0; Na2C03, 18,5; agar, 20,0 ble tilsatt 2,0 g/liter av det karbohydrat som skulle prøves og hele mediet ble så helt over i firkantede Petri-skåler.

Skålene ble så inokulert med bakterier, idet man bruke en 25 punkts flerpunktsinokulator, hvor man avsatte 1,0 ml bakteriesuspensjon på det alkaliske, saltholdige næringsmediet (medium A). Agarplatene ble inkubert ved 37°C i opp til 14 døgn. Resultatene ble angitt ved å sammenligne veksten på det minimale næringsmedium inneholdende et supplerende karbohydrat med den vekst man fant på nevnte.minimumsmedium uten karbo-hydratet som skulle prøves.

12. Karakterene 40-51

Aminosyrer som karbon og nitrogenkilde

Man brukte samme teknikk som for prøvene 32-38.

13. Karakterene 52-72

Enzymatiske aktiviteter

Man brukte her den kommersielt tilgjengelige prøvestripen APIZYM (API-bioMérieux) som ble brukt som angitt i bruksanvisningen, bortsett fra at de haloalkalifile bakteriecellene ble suspendert i et alkalisk, saltholdig næringsmedium (medium A). Stripene ble inkubert ved 37°C i 4 timer.

14. Karakterene 71-91

Anti]?iotikaf ølsomhet

En lett suspensjon av bakteriene i et alkalisk, saltholdig næringsmedium ble spredd ut over overflaten på en alkalisk, saltholdig næringsagar (medium A) og hensatt for tørking. Kommersielt tilgjengelige antibiotikafølsomhets-prøveskiver (Oxoid eller Mast Laboratories: Merseyside, U.K.) ble så satt over på agaroverflaten. Bakteriene ble dyrket ved 37°C i opp til 14 døgn. Klare soner rundt antibiotikaskivene indikerte følsomhet og ble angitt som positive.

15. Karakterene 92-123

Vekst på karbonsubstrater

Man gjorde her bruk av kommersielt tilgjengelige prøve-striper ATB 32 GN (API-bioMérieux: La Balme les Grottes, Frankrike). Stripene ble brukt som angitt i bruksanvisningen, bortsett fra at man tilsatte 1,0 ml av en oppløsning inneholdende 20% NaCl og 1% Na2C03 til de ampullene hvor man hadde det basale mediet. Stripene ble inkubert ved 37°C i 48 timer.

Appendiks C

Enhetsprøver for analyse ved numerisk taksonomi

Appendiks C (forts.)

Enhetsprøver for analyse ved numerisk taksonomi

Appendiks C (fort s.)

Enhetsprøver for analyse ved numerisk taksonomi

Appendiks C (forts.)

Enhetsprøver for analyse ved numerisk taksonomi

Appendiks D

Undersøkelse for proteolytisk, amvlolvtisk og lipolvtisk aktivitet

Proteol<y>tisk aktivitet

A<p>pendiks D (forts.) Ikke- gruppedannende stammer

Amvlolvtisk og lipolvtisk aktivitet

Appendiks D (forts.) Ikke- gruppedannende stammer

n.t. = ikke testet

Proteolytisk aktivitet ble bestemt på media B-F (appendiks A)

og ifølge karakter 20 (appendiks B)

Stivelseshydrolyse ble bestemt som angitt under karakter 39

(appendiks B)

Esteraselipaseaktiviteten ble bestemt som angitt under

karakter 54 (appendiks B)

Lipaseaktiviteten ble bestemt som angitt under karakter 55

(appendiks B)

Appendiks E

Fordeling av positive karakterer på grupper av haloalkalifile bakterier definert på et 78. 5% likhetsnivå ( SSM)

Appendiks E (forts.)

Fordeling av positive karakterer på grupper av haloalkalifile bakterier definert på et 78. 5% likhetsnivå ( S?H)

Appendiks E (forts.)

Fordeling av positive karakterer på grupper av haloalkalifile bakterier definert på et 78. 5% likhetsnivå ( S?M)

Claims

1. Ren bakteriekultur for fremstilling av alkali-tolerante og salt-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene er aerobe, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) en positiv reaksjon i de følgende prøver: 1) katalase 2) vekst i 15% til 25% NaCl 3) esterase 4) esteraselipase 5) leucinarylamidase 6) novobiocin 7) bacitracin; b) en negativ reaksjon i de følgende prøver: 1) oksydase 2) vekst i 4% NaCl 3) alkalisk fosfatase 4) sur fosfatase 5) ampicillin 6) penicillin G 7) kloramfenikol 8) oleandomycin 9) vankomycin.

2. Ren bakteriekultur for fremstilling av alkali-tolerante og salt-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene er aerobe, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) gir en positiv reaksjon i de følgende prøver: 1) KOH-prøve 2) vekst i 12% til 3 0% NaCl 3) esterase4) esteraselipase 5) leucinarylamidase; b) gir en negativ reaksjon i de følgende prøver: 1) vekst i 0% NaCl 2) ampicillin 3) penicillin G 4) kloramfenikol 5) oleandomycin 6) vancomycin.

3. Ren bakteriekultur for fremstilling av alkali-tolerante og salt-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene er aerobe, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) gir en positiv reaksjon i de følgende prøver: 1) sirkulære, konvekse og hele kolonier 2) KOH-prøve 3) katalase 4) vekst i 15% til 30% NaCl 5) vekst ved 20°C eller lavere 6) stivelseshydrolyse 7) esterase 8) esteraselipase 9) leucinarylamidase 10) ampicillin 11) penicillin G 12) kloramfenikol 13) oleandomycin 14) vankomyc in 15) bacitracin; b) gir en negativ reaksjon i de følgende prøver: 1) oksydase 2) vekst ved 0% NaCl 3) alkalisk fosfatase 4) sur fosfatase.

4. Ren bakteriekultur for fremstilling av alkali-tolerante og salt-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene er aerobe, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) gir en positiv reaksjon i de følgende prøver: 1) sirkulære, konvekse og hele kolonier 2) katalase 3) gelatinhydrolyse 4) vokser ved 12% til 3 0% NaCl 5) esterase 6) esteraselipase 7) penicillin G 8) kloramfenikol 9) novobiocin 10) oleandomycin JL1) bacitracin; b) gir en negativ reaksjon i de følgende prøver: 1) kolonier er rosa eller røde 2) stivelseshydrolyse 3) alkalisk fosfatase.

5. Ren bakteriekultur for fremstilling av alkali-tolerante og salt-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene er aerobe, gram-negative, stavformede, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) gir på en alkalisk, saltholdig næringsagar opake, oransje, sirkulære kolonier, 2-3 mm i diameter, med en konveks overflate og hel kant b) vokser ved 20°C c) ingen vekst ved 45°C d) KOH-prøve er positiv e) aminopeptidaseprøve er negativ f) oksydaseprøve er negativ g) katalaseprøve er positiv h) gror i nærvær av 0% til 3 0% NaCl i) hydrolyse av gelatin er positiv j) hydrolyse av stivelse er positiv k) veksten hemmes av følgende antibiotika: 1) gentamicin 2) kloramfenikol 3) fusidinsyre 4) erytromycin 5) meticillin 6) oleandomycin 7) rifampicin 8) vankomycin 9) bacitracin 1) veksten hemmes ikke av følgende antibiotika: 1) nitrofurantoin 2) ampicillin 3) nalidiksinsyre _4) sulfametoksazol 5) trimetoprim 6) penicillin G 7) novobiocin 8) streptomycin 9) tetracyklin 10) polymiksin 11) neomycin 12) kanamycin m) vokser på enkle sukkere n) vokser på aminosyrer o) vokser på organiske syrer p) vokser på gjærekstrakt og peptoner q) inneholder membranlipider basert på fettsyreestere.

6. Ren bakteriekultur for fremstilling av alkali-tolerante og salt-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene er aerobe, gram-positive, stavformede, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) danner på en alkalisk, saltholdig næringsagar krem-fargede, sirkulære kolonier med en diameter på ca. 1 mm med en konveks overflate og hel kant; b) vokser ved 2 0°C c) vokser ved 45°C d) KOH-prøve er negativ e) aminopeptidaseprøve er negativ f) oksydaseprøve er negativ g) katalaseprøve er negativ h) obligat halofil i) vokser i nærvær av 15% til 30% NaCl j) hydrolyse av stivelse er positiv k) veksten hemmes ikke av følgende antibiotika: 1) gentamicin 2) nitrofurantoin _3) ampicillin 4) nalidiksinsyre 5) penicillin G 6) klormafenikol 7) erytromycin 8) fusidinsyre 9) meticillin 10) novobiocin 11) streptomycin 12) tetracyklin 13) oleandomycin 1) veksten hemmes av følgende antibiotika: 1) sulfametoksazol 2) trimetoprim 3) polymiksin 4) rifampicin 5) bacitracin m) vokser på gjærekstrakt og peptoner n) inneholder membranlipider sammensatt av glyceroldietergrupper.

7. Ren bakteriekultur for fremstilling av alkali-tolerante og salt-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene er aerobe, gram-variable, kokkeoidformede, haloalkalifile bakterier med følgende egenskaper: a) danner på en alkalisk, saltholdig næringsagar rosafargede, uregelmessige kolonier med en diameter på 1-2 mm, med hevet overflate og hel kant; b) KOH-prøve er positiv c) oksydaseprøve er negativ d) vokser i nærævr av 0% til 3 0% NaCl e) hydrolyse av stivelse er positiv f) vekst hemmes av følgende antibiotika: 1) nitrofurantoin 2) trimetoprim g) ..veksten hemmes ikke av følgende antibiotika: 1) gentamicin 2) ampicillin 3) nalidiksinsyre 4) penicillin G 5) klormafenikol 6) eryt romyc in 7) fusidinsyre 8) meticillin 9) novobiocin 10) streptomycin 11) tetracyklin h) vokser på gjærekstrakt og peptoner i) inneholder membranlipider sammensatt av glyceroldietergrupper.

8. Anvendelse av bakteriene ifølge kravene 1-7, for fremstilling av alkali- og salt-tolerante enzymer, hvori man: dyrker bakteriene ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7 i et dyrkningsmedium; skiller bakteriene fra dyrkningsmediet; og utvinner enzymaktiviteten fra dyrkningsmediet.