NO319331B1 - Fremgangsmate for fremstilling av terapeutisk middel bestaende av antigenspesifikke, cytotoksiske T-celler. - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av terapeutisk middel bestaende av antigenspesifikke, cytotoksiske T-celler. Download PDFInfo
- Publication number
- NO319331B1 NO319331B1 NO19964896A NO964896A NO319331B1 NO 319331 B1 NO319331 B1 NO 319331B1 NO 19964896 A NO19964896 A NO 19964896A NO 964896 A NO964896 A NO 964896A NO 319331 B1 NO319331 B1 NO 319331B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cells
- antigen
- ctl
- vector
- cell
- Prior art date
Links
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 58
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 11
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 13
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108091008604 NGF receptors Proteins 0.000 claims 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 33
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 2
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000001494 anti-thymocyte effect Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 2
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000018616 Apolipoproteins B Human genes 0.000 description 1
- 108010027006 Apolipoproteins B Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000018240 Bone Marrow Failure disease Diseases 0.000 description 1
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108091034120 Epstein–Barr virus-encoded small RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000709715 Hepatovirus Species 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 208000031951 Primary immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000035286 Spontaneous Remission Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/46—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk middel som består av antigenspesifikke cytotoksiske T-celler (CTL) ved inkubasjon av et T-celleinneholdende cellepreparat med antigenet og isolering av de antigenspesifikke CTL.
Adoptiv overføring av antigenspesifikke T-celler bevirker i dyremodeller en effektiv immunitet og er derfor en terapeutisk metode for behandling av virus-infeksjoner og tumorer.
Hos immunundertrykte pasienter fører reaktivering under kroniske infeksjoner, f.eks. med cytomegalovirus, Epstein Barr-virus eller vimser fra hepato-virusgruppene, til livstruende syndromer. Dette innvirker hovedsakelig på pasienter som har gjennomgått transplantasjon av benmarg eller transplantasjon av faste organer, pasienter som utsettes for kjemoterapi eller radioterapi og HIV-infiserte pasienter.
Epstein Barr-virus (EBV) er et humant herpesvirus som vanligvis replikerer i epitelceller i svelget og er i stand til å immortaliserte B-lymfocytter in vitro. I den immunkompetente vert er EBV årsaken til infeksiøs mononukleose. Det er imidlertid forbundet med flere humane cancere in vivo, slik som Burkitts lymfom, nasofaryngealt karsinom og B-cellelymfomer hos irnmunsviktpasienter: primær immunsvikt, HIV-infiserte pasienter, organtransplantasjonsmottakere og pasienter behandlet med immunundertrykkende legemidler mot autoimmunsykdommer (Hanto et al., 1985 (1); Forman et al., 1987 (2); Zutter et al., 1988 (3); Kamel et al., 1993 (4)). Forekomsten av disse EBV-induserte lymfeproliferasjoner er i de fleste tilfeller forbundet med graden av immunundertrykkelse (Horowitz et al., 1990 (23)).
Hos den normale vert kontrolleres EBV-induserte lymfoidproliferasjoner av EBV-spesifikke og MHC-begrensede T-lymfocytter som er i stand til å være cytotoksiske overfor EBV-transformerte celler (Royston et al., 1975 (5); Rickinson et al., 1980 (6)), av MHC-ubegrensede cytotoksiske T-lymfocytter (Duncombe et al., 1992 (7)) og av antistoffer rettet mot spesifikke virusantigener. Hos irnmunsviktpasienter kan derimot proliferasjonen av disse EBV-induserte celler utvikle seg uten kontroll. Det antas at disse tilstander i sin begynnelse er av polyklonal opprinnelse. Ved vedvarende immunundertrykkelse kan imidlertid kloner bli neoplastiske og som følge av dette konfigurere forekomsten av ekte EBV-indusert lymfom (Hanto et al., 1985 (1)).
Mange arbeider har pekt på det faktum at fjerning av legemiddelindusert immunundertrykkelse, som i tilfelle med mottakere av faste organer, kan være tilstrekkelig for en spontan remisjon av denne tilstand. Dersom imidlertid immun-undertrykkelsen vedvarer utvikles en åpen neoplasme. Tilfeller med EBV-induserte BLDP (B-celle-lymfoproliferative forstyrrelser) etter benmargstransplantasjon er beskrevet (Zutter et al., 1988 (3); Shapiro et al., 1988 (8)). Sannsynligheten for utvikling av en slik proliferasjon er strengt forbundet med de karakteristiske trekk for den utførte benmargstransplantasjon. Sporadiske rapporter om EBV-induserte BLPD er beskrevet i omgivelsene av T-celle-manglende benmargstransplantasjon, eller ved anvendelse in vivo av antithymocyttglobulin (Zutter et al., 1983 (3); Shapiro et al., 1988 (8)). Til forskjell fra legemiddelindusert immunundertrykkelse hos mottaker av faste organer, kan hos mottakere av benmargstransplantasjoner fjerningen av farmakologisk immunundertrykkelse administrert for GVHD (Ferrara et al., 1991 (31); Jadus et al., 1992 (32)) eller benmargsavvisning, ikke utføres med det mål å oppnå en hurtig immunologisk rekonstitusjon (Zutter et al., 1988 (3); Shapiro et al., 1988 (8)). Av denne årsak har prognosen for EB V-indusert BLPD har inntil i dag vært dramatisk alvorlig.
Fordi et begrenset antall spesifikke cytotoksiske T-lymfocytter er påkrevet for å kontrollere EBV-transformerte B-lymfocytter i normale individer, kan administrering av donorlymfocytter for forekomsten av BLPD hos mottakere av T-celle-manglende benmargstransplantasjoner, kontrollere denne alvorlige komplikasjon ved å tilveiebringe til pasienten donorimmunitet mot EBV (Kernan et al., 1989 (10)). Potensielle risikoer er imidlertid representert ved utvikling av en alvorlig GVHD som i seg selv, og via de immunundetrrykkende legemidler anvendt for behandling av sykdommen, kan være ansvarlig for et tilbakefall av EBV-indusert sykdom.
Riddell et al. (1992) (22) og Heslop et al. (1994) (37) overførte cytotoksiske T-celler til individer som har gjennomgått transplantasjon av benmarg. Riddel benyttet klonede T-celler som var spesifikke for CMV, mens Heslop benyttet EBV-spesifikke CTLer.
Det ble vist av Riddell et al. (1992) (22) at ved den adoptive overføring av klonede T-celler spesifikke for CMV, så kunne antivirusimmunitet hos mennesker med immunsvikt gjenopprettes. I denne undersøkelse ble CD3<+->, CD8<+->, CD4<+->CTL-kloner som er spesifikke for et CMV-antigen, frembrakt fra CMV-serumpositive benmargsdonorer og formert in vitro i 5 til 12 uker før adoptiv overføring. Disse kloner var representative for den klasse I MHC-begrensede immundominante, beskyttende CTL-respons. Under T-celleoverføring med disse CTL mottok pasientene som profylakse mot transplantat-versus-vert-sykdom immunundertrykkende terapi med syklosporin A og prednison.
Denne metode lider imidlertid under den mangel at, for å oppnå spesifikke CTL, må individuelle kloner utvelges og formeres i en periode på minst 5 til 6 uker. De således erholdte CTL-kloner er dessuten i hvert tilfelle rettet mot en bestemt epitop av virusantigen og er begrenset for kun én MHC-klasse. En annen ulempe som forekommer ved terapeutisk anvendelse er nødvendigheten av en ytterligere immunundertrykkende terapi. Spesielt i tilfellet med pasienter som lider av AIDS, eller pasienter som tidligere har måttet gjennomgå kjemoterapi eller radioterapi, er en slik terapi imidlertid ikke den behandling som kan anbefales.
Målet for foreliggende oppfinnelse er å unngå disse ulemper og tilveiebringe en effektiv metode for fremstilling av antigen-spesifikke CTL som er egnede for anvendelse, og som er effektive, som terapeutiske midler uten å fordre en lang produksjonsperiode eller å involvere alvorlige bivirkninger.
Gjenstanden for foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk middel som består av antigenspesifikke cytotoksiske T-celler (CTL) ved inkubasjon av et T-celleinneholdende cellepreparat med antigenet og isolering av de antigenspesifikke CTL, kjennetegnet ved
i) aktivering av proliferasjon av CTL i cellepreparatet ved inkubasjon med antigenet;
ii) selektiv overføring av en retrovirusvektor i de prolifererende CTL, hvor vektoren inneholder et markørgen ved hjelp av hvilket merkede og umerkede celler kan separeres; og
iii) separering av de transfekterte antigenspesifikke CTL på basis av markørgen et.
En vesentlig fordel ved denne metode ligger i at behovet for å utvelge individuelle CTL-kloner i en tidkrevende prosedyre unngås; ifølge metoden beskrevet heri kan CTL erholdes og atskilles ved hjelp av markørgenoverføring etterfulgt av positiv utvelgelse av en genetisk markør. Det således fremstilte CTL-preparat inneholder dessuten minst to, men fortrinnsvis mange, CTL som oppviser forskjellige epitoper av antigenene i MHC-komplekset. Det oppnås her både CD4<+> (MHC klasse II-begrenset) og CD8<+> (MHC klasse I-begrenset) CTL. I en foretrukket utførelsesform kan forholdet mellom CD8<+> CTL og CD4<+> CTL kontrolleres ved hjelp av interleukin-2 i forutbestemte konsentrasjoner, og ved tilsetning i en forutbestemt tidsperiode. CTL-preparatet inneholder fortrinnsvis overskudd av CD8<+.> Det er også foretrukket å fremstille, ved å anvende egnede forholdsregler, et CD4" CTL-preparat (ved anvendelse av f.eks. et cytokinadditiv).
Som T-cellepreparat kan det både benyttes et autologt og et allogent preparat. Selv om det ikke er påkrevet kan T-cellene, før utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, anrikes eller separeres fra andre celler, og dette anrikede preparat kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Som T-celler anvendes fortrinnsvis T-celler fra en allogen donor (av den egnede HLA-type). Fortrinnsvis anvendes et blodpreparat som er blitt renset (f.eks. ved hjelp av en "Ficoll"-gradient) slik at det er fritt for alle andre blodceller. Et
preparat av denne type betegnes vanligvis som "buffy coat".
Som vektorer foretrekkes virusvektorer som kan virke som et genutleveringssystem ved transduksjonen av celler. Som virusvektorer foretrekkes retroviruser, adenoviruser, adeno-assosierte vimser og herpesviruser. Retrovimsvektorer er de mest karakteriserte virusvektorer for genoverføring og er blitt anvendt i innledende genterapiprotokoller (Se f.eks. WO 93/04167 (38), Mulligan i Nobel Symposium 80: Etiology of human diseases at the DNA level (Lindsen og Petterson, red. 143-189, Raven Press). Adenovimsvektorer kan også være attraktive fordi de er strukturelt stabile og kan fremstilles ved høyt titer (Berkner in Current Topics i Microbiology and hnmunology 158 (1992), Muzyczka, N. (ed.) 36-66, Springer Verlag). Vektorer avledet fra det ikke-patogene humane adenoassosierte virus (AAV) er også lovende verktøy for human genoverføring (Muzyczka, supra, 97-129).
Fordi retrovirusvektorer nesten utelukkende infiserer celler under deling, tillater positiv utvelgelse av transduserte celler en betydelig anrikning av antigen-spesifikke lymfocytter. Retrovimsvektorer er derfor foretrukket.
I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse anvendes det som antigen virusantigener, slik som antigener av CMV, HBV, EBV, HIV, HSV og HCV. Avhengig av den grunnleggende sykdom kan det også anvendes andre antigener som er spesifikke for forskjellige vimser, bakterier eller monocellulære patogene organismer. Det er også foretrukket å anvende fullstendig inaktiverte vimser, deler av vimser, isolerte antigener eller fortrinnsvis antigenpresenterende celler som antigener. Pasienttumorceller, infiserte cellelinjer eller infiserte celler fra pasientene er f.eks. anvendelige. Anvendelse av vimser eller deler derav har den fordel at det ikke kun dannes én type av antigenspesifikke CTL, men mange forskjellige CTL som er rettet mot forskjellige antigener i vimset og/eller forskjellige epitoper i vimsene. Det er også foretrukket å anvende en kombinasjon av to eller flere virusantigener eller vimser som antigener.
Som vektorgen er gener som koder for molekyler til stede på overflaten av celler, slik som f.eks. reseptorer, foretrukne. I tilfellet med blodceller er LNGFR-reseptoren foretrukket (Bordignon et al., 1994 (18)).
Immunmodulering betyr forbigående overføring av antigenspesifikke T-celle for stimulering av immunresponsen hos pasienten mot tumorceller eller infiserte celler.
Disse genmodifiserte CTL inneholder fortrinnsvis dessuten et selvmordsgen (som etter induksjon uttrykker et stoff som direkte, eller via formidlere, forårsaker død av de infiserte celler; f.eks. WO 92/08796) for in v/vo-spesifikk eliminering av disse celler etter vellykket behandling. For dette formål anvendes fortrinnsvis tymidinkinasegenet som gir de transduserte CTL in vivo-sensitivitet for legemidlet ganciclovir for spesifikk eliminering in vivo av celler som potensielt er ansvarlige for GVHD. Dersom pasientene f.eks. utvikler tegn på akutt GVHD med økende leverfunksjonsenzymer og en positiv hudbiopsi, er det foretrukket å administrere intravenøst to doser på ca. 10 mg/ml av legemidlet ganciclovir. Dette fører kun til en reduksjon av merkede lymfocytter i en mindre grad.
Foretrukne typer av genmodifiserte CTL er vist i figur 1. Difteritoksingenet er også foretrukket som et selvmordsgen og er beskrevet i WO 92/05262 (36). For den spesifikke eliminering in vivo av CTL etter en GVHD er det også mulig å induserer en celleapoptose. Det er således foretrukket å anvende modifisert FAS-reseptor og en dose av en beslektet ligand.
Strategien ifølge foreliggende oppfinnelse kan finne bred anvendelse ved adoptive immunterapimetoder hvor det anvendes et meget stort antall donorlymfocytter, f.eks. ved kontroll av tilbakefallende leukemiske celler etter allo-BMT (Kolb et al., 1990 (25); Riddel et al., 1992 (26); Cullis et al., 1992 (27); Klingemann et al., 1991 (28); Helg et al., 1993 (29); Bar et al., 1993 (30)).
En ytterligere fordel ved den positive utvelgelse av antigenspesifikke celler gjennom vektorinfeksjon, og positiv sortering av vektor-genekspresjonsceller, er produksjon av en populasjon av donorlymfocytter inneholder en høyere frekvens av tumorspesifikke celler, hvilket samtidig reduserer antall alloreaktive celler som potensielt forårsaker GVHD. Det er verd å legge merke til at denne teknikk kan anvendes ved andre former av adoptiv immunterapi av tumorer som uttrykker kjente tumorassosierte antigener (Traversari et al., 1992 (33); van der Bruggen et al., 1991 (34)).
I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse tilsettes IL-2 i en konsentrasjon fra 10 til 50 enheter/10<5> celler, fortrinnsvis ca. 10 til 25 enheter/ca. 10<5> celler.
I en ytterligere utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er det foretrukket å tilsette IL-4 i tillegg, i en konsentrasjon fra ca. 5 enheter/10<5> celler.
For produksjon av vektor-transduserte antigenspesifikke CTL ble det overraskende funnet at det er foretrukket å dyrke lymfocyttene i nærvær av IL-2 etter aktivering av proliferasjonen av CTL med antigenet i 2 til 30 dager, fortrinnsvis 2 til 10 dager, før infeksjon av de prolifererende CTL med vektoren. Etter infeksjon med vektoren vil celler også dyrkes i nærvær av IL-2 i ytterligere 2 til 4 dager. Utvelgelsen på basis av markørgenet utføres deretter og (fortrinnsvis CD8<4>) CTL isoleres.
Infeksjonen av T-celler med virusvektorer kan oppnås ved samtidig dyrking av vektorvirusproduserende celler med T-cellene med supernatant fra vektorvirusproduserende celler, eller ved infeksjon med rensede vimser.
Det er også foretrukket å anvende tumorcellespesifikke anticeller, tumorceller eller celler som fremviser slike antigener, ved aktivering av T-celler. Et eksempel på dette er mage-antigenet som er spesifikt overfor en del av de maligne melanomer eller en del av mastokarsinomene (van der Bruggen et al., 1991 (34)).
Foreliggende oppfinnelse illustreres ytterligere ved hjelp av figuren og eksemplene oppført i det etterfølgende.
Referanser
1 Hanto DW, Frizzera G, Gail Peczalska KJ, Simmons RL: Epstein Barr virus, immunodeficiency, and B cell lymphoproliferation.
Transplantation 1985; 39: 461-472.
2 Forman J.S., Sullivan J.L., Wright C, Ratech H., Racklin B., Blume K.G.: Epstein-Barr-Virus related malignant B cell lymphoplasmacytic lymphoma following allogeneic bone marrow transplantation for aplastic
anemia. Transplantation 1987; 44: 244-249
3 Zutter MM, Martin PJ, Sale GE, Shulman HM, Fischer L, Thomas ED, Dumam DM: Epstein-Barr Virus Lymphoproliferation after bone marrow
transplantation. Blood 1988;72:520-529.
4 Kamel O.W., Van de Rijn M., Weiss L.M., et al: Reversible lymphomas associated with Epstein Barr virus occurring during methotrexate therapy for rheumatoid arthritis and dermatomyositis. N. E.J.Med. 1993; 328: 1317-1321 5 Roysto I, et al: Cell mediated immunity to EBV transformed lymphoblastoid cells in acute infectious mononucleosis. N.EJ.Med. 1975; 293: 1159. 6 Rickinson AB, Wallace L.E., Epstein M.A: HLA restricted T cell recognition of EBV infected B cells. Nature 1980; 283: 865 7 Duncombe AS, Grundy IE, Oblakowsky P, Prentice HG, Gottlieb DJ, Roy DM et al: Bone marrow transplant recipients have defective MHC-unrestricted cytotoxic responses against cytomegalovirus in comparison with Epstein-Barr virus: the importance of target cell expression of lymphocyte function associated antigen 1 (LFA-1). Blood 1992; 79: 3059-3066.
8 Shapiro RS, McClain K, Frizzera G. et al: Epstein-Barr Virus Associated B cell lymphoproliferative disorders following bone marrow
transplantation. Blood 1988;71:1234-1243.
9 WO 89/07150 10 Kernan N. A., Bordignon C, Collins N.H., Castro-Malaspina H.,
Cunningham I., Brochstein J., Shank B.s Flomenberg N., Dupont B., & R. J 0'Reilly: Bone marrow failure in HLA-identical T-cell depleted allogeneic transplants for leukemia: I. Clinical aspects. Blood 74:2227-2236 (1989). 11 Papadopoulos E.B., Ladanyi M., Emanuel D., Mackinnon S., Rosenfield N.S., Boulad F., Carabasi M.H., Castro-Malaspina H., Childs B.H., Gillio A.P., Small T.N., Young J.W., Kernan N.A., 0'Reilly R.J.: Infusions of donor leukocytes as treatment of Epstein-Barr virus associated lymphoproliferative disorders complicating allogeneic marrow transplantation. NEJM 1994 in press. 12 Reisner Y, Reisner Y, Kapoor N, et al... 0'Reilly R: Tranplantation for acute leukemia with HLA-A and B non identical parental marrow cells fractionated with soybean agglutinin and sheep red blood cells. Lancet 1981 2: 327 13 Bordignon C, Kernan N.A., Keever C.A., Cartagena T., Benazzi E., Burns J., Flomenberg N., Dupont B., & R.J. 0'Reilly: Bone marrow failure in HLA-identical T-cell depleted allogeneic transplants for
leukemia: II. Experimental correlates. Blood 74:2237-2241 (1989).
14 Clinical Protocol
15 Moolten F.L, Wells J.M., Heyman R.A., Evans R.M. Lymphoma regression induced by gancyclovir in mice bearing a herpes thyrimidine-kinase transgene. Hum. Gene Ther. 1990,1:125-134. 16 Wu T.C., Mann R.B., Epstein J.I., Mac Mahon E., Lee W.A., Charache P., Hayward S.D., Curman R.J., Hayward G.S., Ambinder R.F. Abundant expression of EBER 1 small nuclear RNA in nasopharyngeal carcinoma.
Am. J. Pathol. 1991; 138:1461-1469. 17 McCann S.R. Lawler M. Mixed chimaerism; detection and significance following BMT. Bone Marrow Transpl. 1993; 11:91-94. 18 Mavilio F., Ferrari G., Rossini S., Bonini C, Casorati G., & C. Bordignon: Retroviral vector mediated gene transfer into human peripheral blood lymphocytes for human gene therapy. Blood 83 (1994)
1988-1997
19 Langhorne J., and Fischer-Lindahl K.: Limiting dilution analysis of precursors of cytotoxic T-lymphocytes. J. Immunol. Methods 11:221
(1981). 20 Bourgault I., Gomez A., Gomard E., Levi J.P.: Limiting dilution analysis of the HLA restriciton of anti-Epstein-Barr virus specific cytolytic T-lymphocytes. Clin. exp. Immunol. 1991, 84: 501-507. 21 Taswell C: Limiting dilution assay for the determnination of immunocompetent cell frequencies. I Data analysis. J. Immunol.
126:1614(1981).
22 Ridell et al., Science 1992,257:238-241
23 Horowitz M.M., Gale R.P., Sondel B.M., Goldman J.M., Kersey J., Kolbe H.J. Rimm A.A., Ringden O, Rozman C, Speck B., Truitt R.L., Zwaan F.E., Bortin M.M. Graft-versus-leukemia reactions after bone
marrow transplantation. Blood 1990,75:555-562
24 Markowitz D., et al., J. Virol. 1988, 62:1120-1124
25 Kolb HJ, Mittermuller J, Clemm Ch, Holler E, Ledderose G, Brehm G, Heim M, Wilmanns W: Donor leukocyte transfusions for treatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplant patients.
Blood 1990, 76: 2462-2465. 26 Riddel S.R., Watanabe K.S., Goodrich J.M., Li C.R., Agha M.E., Greenberg P.D. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T-cell clones. Science 1992,257:238-241. 27 Cullis JO, Jiang YZ, Schwarer AP, Hughes TP, Barrett AJ, Goldman JM: Dono leukocyte infusions for chronic myeloid leukemia in relapse after
allogeneic bone marrow transplantation Blood 1992, 79: 1379-1380
28 Klingemann HG, Phillips GL: Immunotherapy after bone marrow transplantation Bone Marrow Transplantation 1991, 8: 73-81. 29 Helg C, Roux E, Beris P, Cabrol C, Wacher P, Darbellay R, Wyss M, Jeannet M, Chapuis B, Roosnek E.: Adoptive immunotherapy for recurrent CML after BMT. Bone Marrow Transplantation 1993,12: 125-129. 30 Bar BMAM, Schattenberg A, Mensink EJBM, Geurt Van Kessel A, Smetsers TFCM, Knops GHJN, Linders EHP, De Witte T: Donor leukocyte infusions for chronic myeloid leukemia relapsed after allogeneic bone marrow transplantation Journal of Clinical Oncology 1993.3:513-519. 31 Ferrara J.L.M., Deeg H.J. Graft-versus-host disease N. Engl. J. Med. 1991,324:667-674. 32 Jadus MR, Wepsic HT: The role of cytokines in graft versus host reactions and disease Bone marrow transplantation 1992,10: 1-14.
33 TRAVERSARIC, VAN DER BRUGGEN P, VAN DEN EYNDE B,
HAINAUT P, LEMOINE C, OHOTA N, OLD L, BOON T: Transfection of the gene coding for the expression of a human melanoma antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes. Immunogenetics
1992,35:145-148.
34 VAN DER BRUGGEN P, TRAVERSARIC, CHOMEZ P, LURQUTN C, DE PLAEN E, VAN DEN EYNDE B, KNUTH A, BOON T: A gene
encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human
melanoma. Science 1991,254:1643-1647.
35 Markowitz D., et al., Virology 1988,167:400-406
36 WO 92/05262
37 Heslop, H. E. et al., Human Gene Therapy 5 (1994) 381-397
38 WO 93/04167
Eksempel 1
Blandet lymfocvttumorkultur ( MLTQ for fremstilling av vektortransduserte antigenspesifikke CTL
På dag 0: Autologe PBL ble resuspendert i Iscoves medium supplert med L-arginin (0,55 mM), L-asparagin (0,24 mM), L-glutamin (1,5 mM), i nærvær av 10 % humant serum (HS). HS var sammenslått A-, B- og O-serum fra friske donorer, dekomplementert (56 °C, 30 minutter) og sterilisert.
Én million responderende PBL ble blandet i 24-brønners plater med 10<5 >stimulatorautologe tumorceller som uttrykker EBV-antigener, bestrålet (10 000 rad er tilstrekkelig for de hittil anvendte tumorcellelinjer) i sluttvolum på 2 ml av det ovenfor beskrevne medium, i nærvær av 20 ng/ml r-hu-IL4 (5 U). Høyere konsentrasjoner induserer IL-2-produksjon og blokkerer aktiviteten av eksogent IL-2 og inhiberer således cytotoksisitet.
På dag 3: r-hu-IL2 ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10-25 enheter/ml og infeksiøse vimser ble tilsatt. På dag 7: responderende lymfocytter ble oppsamlet, sentrifugert, tellet og resuspendert i friskt medium. 3-5 x IO<5> lymfocytter ble restimulert i 24-brønners plater med IO<5> bestrålede tumorceller i 2 ml av det samme medium inneholdende 10-25 enheter/ml IL-2 og 20 ng/ml IL-4. På dag 14: responderende lymfocytter ble restimulert som på dag 7, eller klonet ved begrensningsfortynning. MLTC-responderende lymfocytter ble klonet ved begrensningsfortynning i 96-brønners mikrotiterplater (mndbunnete brønner). 10, 3,1 og 0,3 responderende celler ble tilsatt i 10011 medium inneholdende 50 enheter/ml IL-2, 3 000 bestrålede (10 000 rad) tumorceller og 5 x 10<4> bestrålede (6 000 rad) allogene PBL som tilførselsceller. På dag 21: kloner ble restimulert ved at det til 10011 medium inneholdende 50 enheter/ml IL-2 ble tilsatt 3 000 bestrålede (10 000 rad) tumorceller og 5 x IO<4> bestrålede (6 000 rad) allogene PBL som tilførselsceller. Frekvensen av EBV-spesifikke donorlymfocytter, etter utsettelse for bestrålede EBV-infiserte autologe B-celler, og positiv sortering av vektortransduserte lymfocytter, økte mer enn 100 ganger.
Denne tidskinetikk tilveiebringer den høyeste effektivitet for fremstilling av gentransduserte høycytotoksiske CTL.
Eksempel 2
Fremstilling av infeksiøse vimser
Vektor-DNA ble omdannet til tilsvarende vimser ved hjelp av en transinfeksjonsprotokoll. Kort beskrevet ble vektor-DNA transfektert inn i den psi2-ekotropiske innpakningslinje (Mann et al., Cell 33 (1983) 153) ved hjelp av standard kalsiumfosfat-kopresipitering. 48 timer etter transfeksjon ble psi2-supematanter oppsamlet og anvendt for å infisere den amfotrope innpakningscellelinje PA317 (Miller et al., Mol., Cell Biol. 6 (1986) 2895) i 16 timer i nærvær av 8 ig/ml polybren. Infiserte PA317-celler ble utvalgt i DMEM (Gibco, Grand Island, New York), supplert med 10 % FCS (Hyclone, Logan, UT) og inneholdende 0,8 mg/ml G418 (Gibco), og ble deretter anvendt for å danne hjelperne vimsinneholdende supernatanter med titere varierende fra 104: IO5 CFU/ml. Alle vektorer inneholdt et neoR-gen som koder for neomycinfosfotransferase som overfører in v/frø-resistens mot neomycinanalogen G418.
I stedet for psi2 og PA317 kan også innpakningscellelinjer med høyere sikkerhetsstandard anvendes (f.eks. E86 og AM12 (Markowitz et al., 1988 (35); Markowitz et al., 1988 (24); WO 89/07150 (9)).
Infeksjon av antigenspesifikke CTL
Vimsinfeksjon ble utført ved å utsette stimulerte CTL (i overensstemmelse med eksempel 1) for en cellefri vimsbestand i 6 timer i nærvær av polybren (8 ig/ml). 48 timer etter infeksjon ble PBL utvalgt i RPMI1640, supplert med 2 mmol/1 L-glutamin, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 % Na-pyruvat, 5 % humant semm (HS) og 100 U/ml r-hu-IL2 (komplett medium) inneholdende 0,4 mg/ml G418. Celletettheten ble holdt konstant (5 x IO<5> celler/ml) under 2 uker med G148-utvelgelse. Retrovims-transduserte humane T-lymfocytter ble også klonet i Terasaki-plater ved forskjellige cellekonsentrasjoner (1 x 10<3> celler/brønn) i komplett medium inneholdende 0,4 mg/ml G418 i nærvær av bestrålede humane CTL som til-førselsceller.
For å forbedre retrovimsinfeksjonseffektiviteten ble humane CTL dyrket sammen med vimsproduserende celler i 48 til 72 timer i komplett medium. Samtidig dyrkning ble også utført i transwell-plater (Costar, Cambridge, MA) for å forhindre celle-til-cellekontakt. 3 x IO<5> produsentceller ble utsådd i brønner på plater med grupper av 6 brønner pr. plate og inkubert ved 37 °C over natten. 5 x IO<5> stimulerte CTL ble tilsatt i overføringsbrønnene og dyrket i 48 til 72 timer i nærvær av 8 ig/ml polybren.
Retrovirus-transduseite celler ble analysert ved hjelp av strømnings-cytometri for reseptorekspresjon og ekspandert for ytterligere analyser.
Eksempel 3
Kasusrapport
En 29 år gammel kvinne med grad G-lymfom i andre remisjon etter ett års behandling med konvensjonell kjemoterapi, godtok en T-cellemanglende benmargstransplantasjon fra hennes HLA-identiske og MLC-forenlige bror. Tilpasningen før transplantasjon ble utført i overensstemmelse med Kernan et al. (11) med modifikasjoner, og inkluderte TBI (1320 cGY i 11 fraksjoner i løpet av 4 dager), syklofosfamid (60 mg/kg/dag på hver av to etterfølgende dager), VP16 (375 mg/mq/dag på hver av to etterfølgende dager), og kamn-antithymocyttglobulin (5 mg/kg/dag i hver av 4 etterfølgende dager) administrert i løpet av 4 dager før transplantasjon. T-celleuttynning ble utført ved hjelp av soyalektinagglutinering og E-rosettdannelse (12). For å forhindre transplantatawisning (13) mottok pasienten prednison (1 mg/kg/dag) i de første 60 dager etter transplantasjon (12). Pasienten ble utskrevet fra hospitalet 40 dager etter transplantasjon med et dokumentert transplantat i god tilstand.
Mellom dag 55 og 60 utviklet pasienten en høyere lateroservikalmasse medfulgt av høy feber, skarpt fall i perifere blodtellinger og økning av AST, ALT, LDH og alkalisk fosfatase (se resultater). En eccotomografisk analyse av halsområdet viste et stort antall overfylte lymfeknuter med størrelse ca. 2 cm. Ved en bryst-CT-skanning ble det observert et stort antall mindre høyre paratrakiale adenopatier. En lateroserivkal lymfeknutebiopsi ble utført og bekreftet tilstedeværelse av et diffust, stort cellelymfom forbundet med områder med nekrose. In ^//^-hybridiseringen for EBV viste tilstedeværelse av EBV-RNA i kjernene i de neoplastiske celler. Et myeloaspirat og en benmargsbiopsi viste et myelodysplastisk mønster og en åpenbar infiltrasjon i benmargen av lymfoide trabekulære knuter. Diagnosen EBV-indusert sekundær lymfeproliferasjon ble stilt på denne basis. Muligheten for en adoptiv immunterapi ved administrering av donorlymfocytter som kunne kontrollere denne alvorlige komplikasjon ved å tilveiebringe pasienten donorimmunitet mot EBV ble vurdert (10).
En klinisk protokoll for anvendelse av genmodifisert donorlymfocytter i sammenheng med allogenisk transplantasjon ble bifalt av den etiske komité ved Istituto Scientifico San Raffaele i overensstemmelse med retningslinjene fra the National (Italian) Committee for Biosafety den 15. mai 1993 (14). I overensstemmelse med denne protokoll transduseres donorlymfocytter in vitro ved hjelp av en retrovirusvektor for overføring og ekspresjon av to gener: l-en modifisert (ikke-funksjonell) form av lavaffinitetsreseptoren for nervevekstfaktorgenet (ÅLNGFR), for in vifrø-seleksjon av transduserte celler og for in v/vo-oppfølging av de infuserte donorlymfocytter; 2 - tymidinkinasegenet som overfører in vivo-sensitivitet overfor legemidlet ganciclovir til det transduserte PBL (15), for in vivomodulering av donor-antitumorrespons, og for in v/vo-spesifikk eliminering av celler som potensielt er ansvarlig for GVHD.
Etter diagnosen ble pasientens samtykke innhentet og hun mottok 2 x 10<6>/kg CD3<+->lymfocytter erholdt fra hennes bror som donor, i to etterfølgende infusjoner. Den detaljerte beskrivelse av den kliniske virkning av infusjonen av donorlymfocytter er rapportert nedenfor. Kort oppsummert forsvant de kliniske tegn på EBV-lymfom fra pasienten i løpet av to uker fra den første infusjon av donorlymfocytter. På grunn av utviklingen av grad IIG mottok pasienten ganciclovirbehandling som resulterte i fullstendig eliminering av tydelige PBL fra det perifere blod, pasienten ble utskrevet fra hospitalet på dag 116 etter BMT, uten noen tegn på EBV-lymfeproliferasjon, GvHD eller underliggende sykdom. Frekvensen av anti-EBVr lymfocytter i pasientens blod var i området 1/3 000. Dette tåler sammenligning med normale individer, inkludert transplantatdonoren, med en frekvens på 1/1 100.
Klinisk virkning av infusjon av donorlymfocytter
I de to uker etter administrering av vektortransduserte donorceller minsket alle kliniske symptomer forbundet med EBV-indusert B-celleproliferasjon med fullstendig hematopoetisk restitusjon. I løpet av denne tid økte merkede donorceller progressivt hos pasientens perifere blod opp til 13,4 % av det totale antall mononukleære celler, som påvist ved FACS-analyse av LNGFR-uttrykkende celler. Som vist i figur 3 ble det ved tidspunktet for regresjon av kliniske symptomer observert en skarp økning i PBL-tellinger. Sirkulerende, transduserte donorlymfocytter var nesten utelukkende CD3<+>/CD8<+->lymfocytter (> 90 % av totalt antall mononukleære celler fra dag +10 til dag +15), med høy proliferasjonsindeks. Mer enn 1/10 av cellene gjenkjente EBV-infiserte autologe B-celler in vitro.
Immunmodulering av donor vs vert- alloreaktivitet i vektortransduserte lymfocytter
Ca. 4 uker etter infusjon av genmodifiserte lymfocytter utviklet pasienten progressivt tegn på akutt GVHD med økt antall leverfunksjonsenzymer, og en positiv hudbiopsi. Intravenøs administrering av to doser på 10 mg/kg av legemidlet ganciclovir resulterte i reduksjon av markerte lymfocytter til 3,1 % med bortfall av kliniske tegn på hud-GVHD, og reduksjon på over 50 % av alle endrede leverfunksjonsenzymer. Denne pasient ble utskrevet 6 uker etter behandling uten noen synlige tegn på sykdom.
Metoder
In Jz/M-hybridisering for EBV-genom: In .si/H-hybirdisering for påvisning av EBV ble utført ved anvendelse av deoksyribooligonukleotider med 30 nukleotider komplementære med de to nukleære EBER RNA kodet for av Epstein-Barr-virus (Dako, Glostrup, Danmark) (16).
Analysen av den kimære karakter av pasientens BM, PBLS og de EBV-lymfominfiltrerte lymfeknuter, ble utført ved hjelp av PCR-polymorfisme av ApoB, ApoC ogYNZ22(17).
Genoverføring i perifere blodlymfocytter oppnås i overensstemmelse med eksempel 1 og referanse (18).
Bestemmelse av antigenspesifikke lymfocyttforløperfrekvenser: Frekvensen av EBV-spesifikke T-celler og allospesifikke T-celler ble utført ved begrensende fortynning som beskrevet i (19) med mindre modifikasjoner. Kort beskrevet ble PBMC dyrket i et begrenset antall i rundbunnet mikrotiterplater sammen med 2 x IO<4> bestrålede (5 000 rad) autologe EBV-transformerte B-celler, eller 4 x 10 bestrålede (3 000 rad) allogene PBMC som stimulatorer, og 10<3> bestrålede (3 000 rad) autologe PBMC som tilførselsceller i 200 il supplert RPMI 1640 (Gibco, inneholdende 5 % autologt serum). 24 konsentrasjoner ble tillaget for hver mottaker-fortynning. 20 enheter hr-IL-2 ble tilsatt på dag 6. En kromfrigivelseanalyse ble utført på dag 8 og 12 ved anvendelse av autologe EBV-B-celler eller allogene PBMC som mål. Proliferasjonsanalysen ble utført, etter dyrking under identiske betingelser, på dag 8 ved inkorporering av 3H-tymidin (Amersham) i 6 timer. Forløperfrekvens ble beregnet ved hjelp av Poisson-fordelingsforhold mellom antall responderende celler og log av prosenten av ikke-responderende kulturer, som beskrevet (20,21).
Celleoverflatefenocytebestemmelse: Celleoverflateekspresjon av LNGFR ble kontrollert ved strømningscytometri ved anvendelse av mus-anti-humant-LNGFR-monoklonalt antistoff 20.4 (ATCC) med en indirekte fluorescensmerkingsmetode (18). Celleoverflatefenotype for T-lymfocyttiske linjer og kloner ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av PE-konjugerte anti-humane-CS4 (T4), - CD8 (T), -CD5, -B4, -CD25R, -Leu7, -CD34-monoklonale antistoffer (MoAb)
(Coulter Immunology, Hialeah, FL). Kort beskrevet ble 5 x 10<5> celler farget med 100 ml fortynnede antistoffer ved 4 °C i 30 minutter, vasket to ganger i medium uten FCS
og resuspendert i 0,5 ml PBS for FACS-analyse, eller i 100 ml fortynnet FITC-konjugert sekundært antistoff. Dobbeltfargingsanalyse ble utført ved sekvensiell inkubasjon av FITC- og PE-konjugerte antistoffer.
Claims (9)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk middel som består av antigenspesifikke cytotoksiske T-celler (CTL) ved inkubasjon av et T-celleinneholdende cellepreparat med antigenet og isolering av de antigenspesifikke CTL, karakterisert vedi) aktivering av proliferasjon av CTL i cellepreparatet ved inkubasjon med antigenet; ii) selektiv overføring av en retrovirusvektor i de prolifererende CTL, hvor vektoren inneholder et markørgen ved hjelp av hvilket merkede og umerkede celler kan separeres; og iii) separering av de transfekterte antigenspesifikke CTL på basis av markørgenet.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at det som vektor anvendes et retrovirus.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,
karakterisert ved at det som markørgen anvendes lavaffinitets-NGF-reseptoren.
4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 3,
karakterisert ved at vektoren i tillegg inneholder et selvmordsgen.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,
karakterisert ved at det som selvmordsgen anvendes TK-genet fra HSV.
6. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 5,
karakterisert ved at det som antigen anvendes inaktiverte vimser eller deler derav, isolerte antigener eller antigenpresenterende celler.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,
karakterisert ved at det som vimser anvendes CMV, HBV, EBV, HIV, HSV og HCV.
8. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 7,
karakterisert ved at de aktiverte CTL dyrkes i nærvær av IL-2 i en tidsperiode på 2 til 30 dager, cellene infiseres med vektoren, cellene dyrkes i nærvær av IL-2 i ytterligere 2 til 4 dager, og CTL utvelges på basis av markørgenet.
9. Fremgangsmåte følge krav 8,
karakterisert ved at CD8+ CTL utvelges.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP1994/001573 WO1995031208A1 (en) | 1994-05-16 | 1994-05-16 | Method of immunomodulation by means of adoptive transfer of antigen-specific cytotoxic t-cells |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO964896D0 NO964896D0 (no) | 1996-11-18 |
| NO964896L NO964896L (no) | 1996-11-18 |
| NO319331B1 true NO319331B1 (no) | 2005-07-18 |
Family
ID=8165855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19964896A NO319331B1 (no) | 1994-05-16 | 1996-11-18 | Fremgangsmate for fremstilling av terapeutisk middel bestaende av antigenspesifikke, cytotoksiske T-celler. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0804210B1 (no) |
| JP (1) | JP3288708B2 (no) |
| KR (1) | KR100219258B1 (no) |
| AT (1) | ATE228368T1 (no) |
| AU (1) | AU691501B2 (no) |
| DE (1) | DE69431808T2 (no) |
| DK (1) | DK0804210T3 (no) |
| ES (1) | ES2186686T3 (no) |
| NO (1) | NO319331B1 (no) |
| PT (1) | PT804210E (no) |
| WO (1) | WO1995031208A1 (no) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6063375A (en) * | 1996-09-10 | 2000-05-16 | Medical University Of South Carolina | Semiallogeneic cell hybrids and related methods for treating cancer |
| GB0224442D0 (en) | 2002-10-21 | 2002-11-27 | Molmed Spa | A delivery system |
| KR100882445B1 (ko) | 2007-03-16 | 2009-02-09 | 울산대학교 산학협력단 | 항―４－１ｂｂ 항체를 이용한 항원 특이적 자가유래ｃｄ８＋ｔ 세포의 분리 및 증식 방법 |
| CA2772076A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-10 | Baylor College Of Medicine | Generation of ctl lines with specificity against multiple tumor antigens or multiple viruses |
| GB201121308D0 (en) | 2011-12-12 | 2012-01-25 | Cell Medica Ltd | Process |
| EP2812431B1 (en) | 2012-02-09 | 2019-07-17 | Baylor College Of Medicine | Pepmixes to generate multiviral ctls with broad specificity |
| US11167024B2 (en) | 2015-09-18 | 2021-11-09 | Baylor College Of Medicine | Immunogenic antigen identification from a pathogen and correlation to clinical efficacy |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69114299T3 (de) * | 1990-09-14 | 2005-09-15 | The Johns Hopkins University | Verfahren und zusammensetzungen für gentherapie und stärkung des immunsystems. |
| US5529774A (en) * | 1991-08-13 | 1996-06-25 | The Regents Of The University Of California | In vivo transfer of the HSV-TK gene implanted retroviral producer cells |
-
1994
- 1994-05-16 JP JP52929995A patent/JP3288708B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-16 DE DE69431808T patent/DE69431808T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-16 PT PT94917635T patent/PT804210E/pt unknown
- 1994-05-16 AT AT94917635T patent/ATE228368T1/de active
- 1994-05-16 EP EP94917635A patent/EP0804210B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-16 DK DK94917635T patent/DK0804210T3/da active
- 1994-05-16 ES ES94917635T patent/ES2186686T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-16 WO PCT/EP1994/001573 patent/WO1995031208A1/en not_active Ceased
- 1994-05-16 KR KR1019960706486A patent/KR100219258B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-16 AU AU69281/94A patent/AU691501B2/en not_active Expired
-
1996
- 1996-11-18 NO NO19964896A patent/NO319331B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0804210A1 (en) | 1997-11-05 |
| NO964896D0 (no) | 1996-11-18 |
| DE69431808T2 (de) | 2003-09-18 |
| AU6928194A (en) | 1995-12-05 |
| ATE228368T1 (de) | 2002-12-15 |
| JP3288708B2 (ja) | 2002-06-04 |
| DE69431808D1 (de) | 2003-01-09 |
| EP0804210B1 (en) | 2002-11-27 |
| KR100219258B1 (ko) | 1999-09-01 |
| PT804210E (pt) | 2003-04-30 |
| WO1995031208A1 (en) | 1995-11-23 |
| NO964896L (no) | 1996-11-18 |
| ES2186686T3 (es) | 2003-05-16 |
| DK0804210T3 (da) | 2003-03-10 |
| JPH09507643A (ja) | 1997-08-05 |
| AU691501B2 (en) | 1998-05-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Glienke et al. | GMP-compliant manufacturing of TRUCKs: CAR T cells targeting GD2 and releasing inducible IL-18 | |
| Sauce et al. | Retrovirus-mediated gene transfer in primary T lymphocytes impairs their anti–Epstein-Barr virus potential through both culture-dependent and selection process–dependent mechanisms | |
| Marktel et al. | Immunologic potential of donor lymphocytes expressing a suicide gene for early immune reconstitution after hematopoietic T-cell–depleted stem cell transplantation | |
| Amrolia et al. | Selective depletion of donor alloreactive T cells without loss of antiviral or antileukemic responses | |
| Heemskerk et al. | Reprogramming of virus-specific T cells into leukemia-reactive T cells using T cell receptor gene transfer | |
| US11471486B2 (en) | Selective and controlled expansion of educated NK cells | |
| Lucas et al. | Adoptive immunotherapy with allogeneic Epstein–Barr virus (EBV)‐specific cytotoxic T‐lymphocytes for recurrent, EBV‐positive Hodgkin disease | |
| US20250084145A1 (en) | Method for establishing pluripotent stem cells bearing genes encoding antigen specific t cell receptor | |
| Narita et al. | Leukemia blast-induced T-cell anergy demonstrated by leukemia-derived dendritic cells in acute myelogenous leukemia | |
| Alici et al. | Anti-myeloma activity of endogenous and adoptively transferred activated natural killer cells in experimental multiple myeloma model | |
| CN107002039A (zh) | 使用t细胞用于培养自然杀伤细胞的方法 | |
| Regn et al. | Ex vivo generation of cytotoxic T lymphocytes specific for one or two distinct viruses for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone marrow transplant | |
| Pullarkat et al. | Large-scale monocyte enrichment coupled with a closed culture system for the generation of human dendritic cells | |
| US20030219463A1 (en) | T cell receptor transfer into a candidate effector cell or a precursor thereof | |
| Garland et al. | The use of Teflon cell culture bags to expand functionally active CD8+ cytotoxic T lymphocytes | |
| Omer et al. | Chimeric antigen receptor signaling domains differentially regulate proliferation and native T cell receptor function in virus-specific T cells | |
| Smits et al. | Proinflammatory response of human leukemic cells to dsRNA transfection linked to activation of dendritic cells | |
| Bollard et al. | Immunotherapy targeting EBV-expressing lymphoproliferative diseases | |
| Kurihara et al. | Potential immunogenicity of adult T cell leukemia cells in vivo | |
| Zhou et al. | CD123 redirected multiple virus-specific T cells for acute myeloid leukemia | |
| EP0804210B1 (en) | Method of immunomodulation by means of adoptive transfer of antigen-specific cytotoxic t-cells | |
| Managlia et al. | Interleukin‐7 signalling is sufficient to phenotypically and functionally prime human CD4+ naïve T cells | |
| Mukherji et al. | Cell-mediated amplification and down regulation of cytotoxic immune response against autologous human cancer. | |
| Kubo et al. | A novel method for generating chimeric antigen receptor-transduced primary human natural killer cells by the use of multiple cytokines and anti-CD2 and anti-NKp46 stimulatory antibodies | |
| Dunnion et al. | Human antigen‐presenting cell/tumour cell hybrids stimulate strong allogeneic responses and present tumour‐associated antigens to cytotoxic T cells in vitro |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |