JPH09507643A

JPH09507643A - 抗原特異的細胞障害性ｔ細胞の養子移入の手段による免疫調節の方法

Info

Publication number: JPH09507643A
Application number: JP7529299A
Authority: JP
Inventors: ボルディニョン，クラウディオ; マビリオ，フルビオ
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1994-05-16
Filing date: 1994-05-16
Publication date: 1997-08-05
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: EP0804210A1; NO964896D0; DE69431808T2; AU6928194A; ATE228368T1; NO319331B1; JP3288708B2; DE69431808D1; EP0804210B1; KR100219258B1; PT804210E; WO1995031208A1; NO964896L; ES2186686T3; DK0804210T3; AU691501B2

Abstract

(57)【要約】Ｔ細胞含有細胞調製物を抗原と共にインキュベートし、該抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞(CTL)を単離することによる該抗原特異的 CTLの製造のための方法であって、ｉ）前記抗原とのインキュベーションにより前記細胞調製物において CTLの増殖を活性化するステップと、ii）標識遺伝子を含むベクターを前記増殖中のCTL内に選択的に転移させるステップであって、標識及び非標識の細胞が前記標識遺伝子の手段により分離され得るステップと、iii）前記標識遺伝子を基礎として前記移入された抗原特異的 CTLを分離するステップと、を特徴とする方法が免疫調節のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞の養子移入の手段による免疫調節の方法本発明は、抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞(CTL)の製造のための方法及び使用並びに前記Ｔ細胞を用いる治療剤の製造のための方法、並びに治療剤として用いるために適した CTLの組成物に関する。抗原特異的Ｔ細胞の養子移入は、動物モデルにおいて有効な免疫性を生じ、それゆえウイルス感染及び腫瘍の治療のための治療方法である。免疫抑制された患者において、例えばシトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルス又はヘパトウイルス(hepatovirus)群からのウイルスによる慢性的な感染の間の再活性化は、命を脅かす症候群を導く。これは、骨髄の移植もしくは固体器官の移植を行った患者、化学療法もしくは放射線療法を行った患者、並びに HIV感染患者に主に影響を与える。エプスタイン−バールウイルス(EBV)は口腔咽頭管の上皮細胞において通常複製し、試験管内でＢリンパ球を不死的にすることができるヒトヘルペスウイルスである。免疫適格の宿主において、EBVは感染的単球増加症の原因体である。しかしながら、それは、免疫不全患者：一次性免疫不全、HIV感染患者、器官移植物受容患者、及び自己免疫疾患のための免疫抑制剤で治療された患者におけるバーギトリンパ腫、鼻咽頭癌、及びＢ細胞リンパ腫のような生体内のいくつかのヒトの癌に関連している（Hanto et al.，1985（1）；Forman et al.，1987（2）；Zutter et al.，1988（3）；Kamel et al.，1993(4)）。これらの EBV誘導リンパ球増殖の発生は、多くの場合、免疫抑制の程度に関係している（Horowitz et al.，1990(23)）。通常の宿主において、EBV誘導リンパ球増殖は、EBV形質転換細胞に対する細胞毒性を有することができる EBV特異的及び MHC制限性Ｔリンパ球により（Roysto n et al.，1975（5）；Rickinson et al.，1980(6)）、MHC非制限性細胞障害性Ｔリンパ球により(Duncombe et al.，1992(7))及び特定のウイルス抗原に対する抗体により制御される。これに反して、免疫不全の患者において、これらのEBV 誘導細胞の増殖は制御なしに進行する。これらの条件はポリクローナル源のそれらの始まりにおいてであると考えられている。しかしながら、免疫抑制の持続と共に、クローンは、腫瘍性になり得、結果として本当のEBV誘導リンパ腫が発生する（Hanto et al.，1985(1)）。多くの研究が、固状器官受容者の場合のような薬剤誘導免疫抑制の除去がこの病状の自発的軽減に十分であり得ることを指摘している。しかしながら、免疫抑制が持続するなら、明白な腫瘍が進展する。骨髄移植の後のEBV誘導BLPD（Ｂ細胞リンパ球増殖症）の場合が開示されている（Zutter et al.，1988（3）；Shap iro et al.，1988(8)）。このような増殖が進行する可能性は、骨髄移植物の特徴に厳密に関連している。EBV誘導BLPDの散発的な報告が、Ｔ細胞が涸渇した骨髄移植物のセッティング又は抗胸腺細胞グロブリンの生体内での使用において開示されている（Zutter et al.，1988（3）；Shapiro et al.，1988(8)）。固状器官受容者の薬剤誘導免疫抑制と異なり、骨髄移植物受容者において、GVHDのために行われる薬理的免疫抑制の除去（Ferrara et al.，1991（31）；Jadus et a l．1992(32)）又は骨髄注入は、迅速な免疫学的認識が他感的に行われ得ない（Z utter et al.，1988（3），Shapiro et al.，1988( 8)）。この理由のため、BMTのセッティングにおけるEBV誘導BLPDの予後は、現在まで劇的に厳しいままである。通常の個体において、EBV形質転換Ｂリンパ球を制御するために限られた数の特異的細胞障害性Ｔリンパ球が必要とされるので、Ｔ細胞涸渇骨髄移植物の受容体におけるBLPDの発生のためのドナーリンパ球の投与は、EBVに対して患者ドナー免疫性を供することによりこの厳しい合併症を制御することができていた(Kem an et al.，1989(10)）。しかしながら、それ自体により、及びその治療のために用いられる免疫抑制剤によりEBV誘導病への逆戻りの原因となり得る厳しいGVH Dの進行により潜在的な危険性が示される。 CMVについて特異的なクローンされたＴ細胞の養子移入により免疫不全のヒトにおける抗ウイルス免疫性が回復され得ることがリッデルら（Riddell et al．（1992）(22)）により示されている。この研究において、CMV抗原に特異的であるCD３⁺，CD８⁺，CD４^- CTL クローンは、３つの CMV漿液陽性骨髄ドナーから作られ、養子移入前５〜12週間試験管内で増殖された。これらのクローンは、クラスＩMHC制限性免疫支配的保護的 CTL応答の代表であった。Ｔ細胞がこれらの CT Lと共に移る間、患者はシクロスポリン（Cyclosporine）Ａ及びプレドニソン（P rednisone）での移植片対宿主病免疫抑制療法のための予防として受容した。しかしながら、この方法は、特定の CTLを得るために、個々のクローンが選択されて少くとも５〜６週間にわたり増殖されなければならない欠点がある。更に、このように得られた CTLクローンは各々の場合ウイルス抗原の１つの特定のエピトープに対してのものであり、１つの MHCクラスのみに限定されない。治療的に用いることにおいて発生する他の欠点は、更なる免疫抑制療法を必要とすることである。AIDSを患っている患者又は化学療法又は放射線療法を以前に行っている患者の場合特に、これらの治療は決して奨められるべき治療ではない。本発明の目的は、これらの欠点を避けること、及び長期間の製造を必要とせず、深刻な副作用を含まない、使用に適しかつ治療剤として有効である抗原特異的 CTLの製造のための有効な方法を提供することである。本発明の目的とするものは、Ｔ細胞含有細胞標品を前記抗原でインキュベートし、前記抗原特異的 CTLを単離することにより、抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞(C TL)、好ましくはCD８⁺ CTLを製造するための方法であって、ｉ）前記抗原でインキュベートすることにより前記細胞標品中の CTLの増殖を活性化するステップと、 ii）前記増殖中の CTL内に標識遺伝子を含むベクターを移入するステップであって、標識された細胞と非標識の細胞が前記標識遺伝子の手段により分離され得るステップと、 iii）前記標識遺伝子を基礎として前記移入された抗原特異的 CTLを分離するステップと、を特徴とする方法である。この方法の本質的な利点は、時間を浪費する手順において個々のCTLクローンを選択する必要がないことにある；本明細書に記載される方法に従うと、CTLは、標識遺伝子の移入の後の遺伝的標識のための陽性選択により得られて分離され得る。更に、このように調製されたCTL標品は、MHC複合体において前記抗原の異なるエピトープを提示する少くとも２つ、好ましくは複数の CTLを含む。本明細書において、CD４⁺（MHCクラスII制限性）及びCD８⁺（MHCクラスＩ制限性)CTLが得られる。好ましい実施形態において、CD８⁺ CTLとCD４⁺ CTLの比は、予め決定された濃度におけるインターロイキン−２により、及び予め決定された期間にわたる添加により調節され得る。好ましくは、CTL標品は過剰なCD８⁺を含む。（例えばサイトカイン添加物を用いて） CD４^- CTL標品を、適切な測定を適用することにより調製することも好ましい。Ｔ細胞標品として自己由来及び同種の標品の両方を用いることができる。必要ではないが、本発明に従う方法を行う前にＴ細胞を豊富にするか又は他の細胞から分離することができ、この豊富な標品を本発明の方法のために用いることができる。Ｔ細胞として、（適切な HLAタイプの）同種のドナーからのＴ細胞を用いることが好ましい。好ましくは、いずれかの他の血液細胞ている血液標品が用いられる。このタイプの標品は、通常、“バフィーコート(b uffy coat)”と呼ばれる。ベクターとして、細胞の形質導入における遺伝子輸送システムとして作用することができるウイルスベクターが好ましい。ウイルスベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスが好ましい。レトロウイルスは、遺伝子転移のために最もキャラクタライズされているウイルスベクターであり、初期的遺伝子療法プロトコルにおいて用いられている(Mul ligan in Nobel Symposium 80：Etiology of human diseases at the DNA level (Lindsten and Petterson，eds．143〜189．Raven Press))。アデノウイルスベクターも、それらが構造的に安定であり、高タイターで調製され得るので魅力がある（Berker in Current Topics in Microbiology and Immunology 158(1992) ，Muzyczka，N.(ed.)36〜66，Springer Verlag)。非病原性ヒトアデノ随伴ウイルス(AAV)からのベクターもヒト遺伝子転移のための有望な道具である(Muzyczka ，前掲、97〜129)。レトロウイルスベクターはほとんど排他的に分裂中の細胞に感染するので、形質導入された細胞の陽性選択は抗原特異的リンパ球の重大な豊富化を許容する。それゆえレトロウイルスベクターが好ましい。本発明の好ましい実施形態において、抗原としてCMV，HBV，EBV，HIV，HSV及びHCVの抗原のようなウイルス抗原が用いられる。基礎的病気によって、種々のウイルス、バクテリア又は単細胞病原性生物に特異的な他の抗原も用いることができるであろう。完全に不活性化されたウイルス、ウイルスの一部、単離された抗原、又は好ましくは抗原としての抗原存在細胞を用いることも好ましい。例えば患者の腫瘍細胞、感染した細胞系統又は患者の感染した細胞が有用である。ウイルス又はその一部の使用は、１つのタイプの抗原特異的 CTLばかりでなくウイルスの異なる抗原及び／又はウイルスの異なるエピトープに対する多くの異なる CTLも作られる利点を供する。２以上のウイルス抗原又は抗原としてのウイルスの組合せを用いることも好ましい。ベクター遺伝子として、例えばレセプターのような細胞の表面に提示される分子をコードする遺伝子が好ましい。血液細胞の場合、LNGFRレセプターが好ましい(Bordignon et al.，1994(18))。免疫調節は、腫瘍細胞又は感染した細胞に対する患者の免疫応答の刺激のための抗原特異的Ｔ細胞の一過性の転移を意味する。これらの遺伝子改変された CTLは、好ましくは、成功した治療の後のこれらの細胞の生体内特異的除去のための（感染した細胞の死を直接又は媒介物により引きおこす物質を誘導後に発現する）自殺遺伝子を更に含む。この目的のために、 GVHDに潜在的に応答する細胞の生体内特異的除去のための薬剤ガンシクロビル(G anciclovir)への生体内感受性を、形質導入された CTLに与えるチミジンキナーゼ遺伝子を適用することが好ましい。例えば患者が増加性肝機能酵素及び陽性皮膚バイオプシーでの急性のGVHDの症状を進展させるなら、薬剤ガンシクロビルの約10mg／kgの静脈内２回投与が好ましい。これは、少しだけ標識リンパ球を減少させる。遺伝子改変 CTLの好ましいタイプを図１に示す。 WO 92／05262(36)に記載されるジフテリア毒遺伝子も自殺遺伝子として好ましい。GVHDの後の CTLの生体内特異的除去のために、細胞アポプトシスを誘導することも可能である。これにより、改変FASレセプターの使用及び関連するリガンドの投与が好ましい。本発明に従うストラテジーは、極めて大量のドナーリンパ球が、例えばアロー BMT(Kolb et al.，1990（25）；Riddel et al.，1992（26）；Cullis et al.，1 992（27）；Klingemann et al.，1991（28）：Helg et al.，1993（29）；Bar e t al.，1993(30))の後の白血病細胞の再発を制御するのに利用される養子免疫療法アプローチにおいて広い適用を見い出し得る。ベクター感染及びベクター遺伝子発現性細胞の陽性選別による抗原特異的細胞の陽性選択の更なる利点は、同時にGVHDを潜在的に引きおこすいくつかのアロリアクティブ細胞を減少させながらの腫瘍より高頻度特異的細胞を含むドナーリンパ球の産生である。この技術は、周知の腫瘍関連抗原を発現する腫瘍の養子免疫療法の他の形態における適用を見い出し得ることが顕著に考えられる(Traversar i et al.，1992(33)；van der Bruggen et al.，1991(34))。本発明の好ましい実施形態において、IL２は、10〜50ユニット／10⁵細胞、好ましくは約10〜25ユニット／約10⁵細胞の濃度で添加される。本発明の更なる実施形態において、約５ユニット／10⁵細胞の濃度のIL−４を更に加えることが好ましい。驚くことに、ベクター導入された抗原特異的 CTLの産生のために、２〜30日間の抗原での CTLの増殖の活性化の後、IL−２の存在下においてリンパ球を培養することが好ましい。前記ベクターの感染の後、細胞は、更に２〜４日間、IL−２の存在下においても培養されるであろう。その後、標識遺伝子を基礎とした選択が行われ、（好ましくはCD８⁺）CTLが単離される。ウイルスベクターでのＴ細胞の感染は、ベクターウイルス産生細胞からの上清で前記Ｔ細胞とのベクターウイルス産生細胞の同時培養により、又は精製されたウイルスでの感染により行われ得る。Ｔ細胞の活性化のために、腫瘍特異的抗原、該抗原を提示する腫瘍細胞又は細胞を用いることも好ましい。ここでの例は、悪性黒色腫の一部又は乳癌の一部に特異的であるMAGE抗原である（van der Bruggen et al.，1991(34)）。本発明は、以下の図面及び実施例により更に詳説される。実施例１ベクター導入抗原特異的 CTLの産生のための混合リンパ球腫瘍培養（MLTC）０日目：10％ヒト血清（HS）の存在下においてＬ−アルギニン（0.55mM）、Ｌ−アスパラギン（0.24mM）、Ｌ−グルタミン（1.5mM）が補足されたIscove's 培地中に自己由来 PBLを再懸濁した。HSを健康なドナーからのＡ，Ｂ及びＯ血清にプールし、デコンプリメント（56℃、30分）して滅菌した。 100万の応答 PBLを EBV抗原を発現する10⁵の刺激体自己由来腫瘍細胞とマルチ・ティッシュ24ウェル中で混合し、20ng／ml r-hu-IL4(5U)の存在下において最終容量２ml前述の培地中に照射（10,000ラドが現在まで用いられる腫瘍細胞系統のために十分である）した。より高い濃度は、IL−２産生を導き、外来性IL−２の活性をブロックし、これにより細胞毒性を阻害する。３日目：r-hu-IL-2を最終濃度10〜25ユニット／mlで添加して感染性ウイルスを加えた。７日目：応答体リンパ球を収集して遠心し、計数して新鮮な培地中に再懸濁した。リンパ球３〜５×10⁵を、10〜25ユニット／mlのIL−２及び20ng／m lのIL−４を含む同じ培地の２ml中における10⁵の照射された腫瘍細胞と24ウェルプレートにおいて再刺激した。14日目：応答体リンパ球を７日目のように再剌激し、又は限定的希釈によりクローンした。96ウェルマイクロタイタープレート（丸底ウェル）中の限定希釈により、MLTC応答体リンパ球をクローンした。10，３，１及び0.3応答体細胞を、50ユニット／mlのIL−２、3000の照射（10,000ラド）腫瘍細胞及び支持細胞としての５×10⁴の照射（6000ラド）同種PBLを含む100 μｌの培地中に接種した。21日目：クローンを50ユニット／mlのIL−２、3000の照射（10,000ラド）腫瘍細胞及び支持細胞としての５×10⁴の照射（6000ラド）自己由来PBLを含む100μｌの培地中に添加することにより再刺激した。照射 EBV感染自己由来Ｂ細胞にさらした後の EBV特異的ドナーリンパ球及びベクター導入リンパ球の陽性選別は100倍超増加した。この時間速度論は、最も効能の高い遺伝子導入された高細胞毒性の CTLの産生を与える。実施例２感染性ウイルスの調製トランスインフェクションプロトコルによりベクターDNAを対応するウイルスに転換させた。要するに、標準的なリン酸カルシウム共沈降により、ベクターDN Aをpsi2エコトロピックパッケージングライ（Mann et al.，Cell33(1983)153）内に移入した。移入後48時間に、psiZ上清を収集して、８μｇ／mlポリブレンの存在下において16時間、アンホトロピックパッケージング細胞系統PA317（Mille r et al.，Mol.Cell Blol．６（1986）2895）に感染させるのに用いた。感染した PA317細胞を10％FCS(Hyclone，Logan，UT)が補足され、0.8mg／ml G418（Gib co）を含むDMEM(Gibco，Grand Island，New York）中で選択し、その後、10⁴：1 0⁵CFU／mlの範囲のタイターでのヘルパ無含有ウイルス含有上清を作るのに用いた。全てのベクターは、ネオマイシンアナログG418に対する試験管内耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子neoR遺伝子を含んでいる。 psi2及び PA317のかわりに、より安全な標準のパッケージング細胞系統を用いることができる（例えばＥ86及びAM12（Markowitz etal.，1988（35）；Markowi tz et al.，1988（24）； WO 89／0715０(9))。抗原特異的 CTLの感染ポリブレン（８μｇ／ml）の存在下での６時間、無細胞ウイルス保存液への（実施例１に従って）刺激された CTLの露出によりウイルス感染を行った。感染後 48時間に、PBLを0.4mg／ml G418を含む２mmol／ｌＬ−グルタミン、１％非本質的アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、５％ヒト血清（HS）、及び100Ｕ／m l r-hu-IL2（完全培地）が補足されたRPMI1640中で選択した。G148選択の２週間の間、細胞濃度を一定（５×10⁵細胞／ml）に維持した。レトロウイルス導入ヒトＴ−リンパ球も支持細胞としての照射されたヒトCTLの存在下において0.4mg／ mlのG418を含む完全培地中で異なる細胞濃度（１×１０³細胞／ウェル）においてテラサキプレートにおいてクローンした。レトロウイルスの感染有効性を改良するために、ヒトCTLを完全培地中で48〜7 2時間、ウイルス産生性細胞と共に同時培養した。細胞間接触を防ぐためにトランスウェルプレート（Costar，Cambridge，MA）においても同時培養を行った。３×10⁵の産生体細胞を６ウェル皿のクラスタープレートウェル中に接種して37 ℃で一晩、インキュベートした。５×10⁵の刺激された CTLをトランスウェルに加えて８μｇ／mlポリブレンの存在下で48〜72時間、増殖させた。レトロウイルス導入細胞をレセプター発現についてフローサイトメトリーにより分析し、更なる分析のためにふくらませた。実施例３事例報告慣用的な化学療法での治療の１年後の第２の緩解期におけるグレードＧのリンパ腫を有する29歳の女性に彼女の HLAが同一で MLCが適合する兄弟からのＴ細胞涸渇骨髄移植を行った。プレトランスプラントコンディショニング条件を、Kerm an et al．(11)に従って改良を加えて行い、４日間のプレトランスプラントにわたり投与されたTBI(４日間にわたる11フラクションにおける1320cGy)、シクロフォスファミド (Cyclofosfamide)(連続２日の各々における 375mg／mq／die)、及びウサギ抗胸腺細胞グロブリン(連続４日間の各々の５mg／kg／die)。大豆レクチン凝集及びＥ−ロゼッティング（12）によりＴ細胞涸渇を行った。移植片拒絶（13）を防ぐために移植後最初の60日に患者にプレドニソン(prednisone)(１mg／kg／day)を投与した（12）。患者は、記録された植え付けと共に、良好な状態で移植後40日に病院から解放された。 55日目と60日目との間に、患者は高い熱、末梢血液数の激しい減少、並びに A ST，ALT，LDH及びアルカリホスファターゼの増加を伴って軽い外側頸部の塊を進展させた（結果参照）。首の塊の音響断層写真分析は、各々約２cmの多数の詰まったリンパ節を示した。胸部CTスキャンにおいて、多数のより小さな軽い双気管腺症が観察された。外側頸部のリンパ節バイオプシーを行って、壊死の領域に関連した散在性の大きな細胞リンパ腫の存在を確認した。EBVのためのインシトゥーハイブリダイゼーションは、腫瘍性の細胞の核における EBV RNAの存在を示した。ミエロアスピレート及び骨髄バイオプシーは、骨髄非形成パターン及び、リンパ系パラトラベカラー（paratrabecolar）節による骨髄の明白な浸潤を示した。これを基礎にして、EBVに誘導される第２のリンパ球増殖の診断を行った。EBV に対する患者ドナー免疫性を供することによりこの厳しい合併症を制御することができるであろうドナーリンパ球の投与による養子免疫療法の可能性が考えられた（10）。同種移植の戦いにおける遺伝子改変ドナーリンパ球の利用のための臨床的プロトコルを、National（Italian）Committee for Biosafety on May 15，1993のガイドラインに従うEthical Committee of Istituto Scientifico San Raffaeleにより改良した（14）。従って、このプロトコルにおいて、ドナーリンパ球を、次の２つの遺伝子の転移及び発現のためのレトロウイルスベクターにより導入した：１−導入された細胞の試験管内選択及び浸出されたドナーリンパ球の生体内追跡調査のための神経成長遺伝子のための低アフィニティーレセプターの改変（非機能）形態（ΔLNGFR）；２−ドナー抗腫瘍応答の生体内調節及びGVHDに潜在的に応答する細胞の生体内特異的除去のための薬剤ガンシクロビール（ganciclovir）（15）に生体内感受性のある形質導入された PBLを供するチミジンキナーゼ遺伝子。診断の後、患者の同意を得て、２つの後の注入において、ドナーの兄弟から得た２×10⁶／kg CD₃ ⁺リンパ球を投与した。ドナーリンパ球の注入の臨床的衝撃の詳しい記載が結果のセクションにおいて報告される。要約すると、ドナーリンパ球の最初の注入から２週間において、患者は EBVリンパ腫の臨床的症状がなくなった。グレードIIＧの進展のため、彼に末梢血液から標識 PBLの完全な除去を引きおこすガンシクロビール治療を行い、EBVリンパ球増殖、GVHDの症状もなく、進行中の病気もなく、BMTから 116日目に病院から解放された。彼女の血液における抗EBVリンパ球の頻度は１／3000程度であった。これは、１／1100の頻度を有する彼女の移植ドナーを含む通常の個体に相当する。ドナーリンパ球の注入の臨床的衝撃ベクター導入ドナー細胞の投与後２週間目において、EBV誘導Ｂ細胞増殖に関連した全ての臨床的症状が、十分な造血的回復と共にもとにもどった。この間、標識ドナー細胞は、LNGFR発現性細胞のFACS分析により検出されるように、全単球細胞の13.4％まで、患者の末梢血液中において進行的に増加した。図３に示すように、臨床的症状の回復と同時に、PBL数の激しい増加が観察された。循環している形質導入されたドナーリンパ球は、ほとんど排他的にCD３⁺／CD８⁺リンパ球であり（＋10日間〜＋15日間において全単核細胞の90％超）、高い増殖示数であった。１／10超の細胞が試験管内においてEBV感染した自己由来Ｂ細胞を認識した。ベクター導入されたリンパ球におけるドナー対宿主異質反応性（alloreactivi ty）の免疫調節遺伝子改変リンパ球の感染後約４週間目において、患者は、肝機能酵素の増加及び陽性皮膚バイオプシーと共に急性のGVHDの症状を進行的に発達させた。薬剤ガンシクロビールの10mg／kgの２回の間隔をあけた投与により、標的リンパ球の 3.1％への削減、皮膚GVHDの臨床的症状の消滅及び全ての変更された肝機能酵素の50％超の削減をおこした。この患者は、病気の症状がなくなり、治療後６週目に解放された。方法 EBVゲノムのインシトゥーハイブリダイゼーション：エプスタイン−バールウイルスによりコードされた２つの核のEBER RNAに相補的な30−merのデオキシリボ−オリゴヌクレオチドを用いて EBVの検出のためのインシトゥーハイブリダイゼーションを行った（Dako，Glostrup，DenmarK）（16）。患者BM，PBLS、及び EBVリンパ腫浸潤リンパ節におけるキメラ現象の分析を、 ApoB，ApoC、及び YNZ22の PCR多形性により行った（17）。末梢血液リンパ球への遺伝子転移を実施例１及び引用（18）に従って行う。抗原特異的リンパ球前駆体頻度の決定：EBV−特異的Ｔ細胞及び異質特異的Ｔ細胞の頻度を、小さな改良を加えた（19）に記載のような限定的希釈により行った。要約すると、補足されたRPMI1640(G ibco，５％自己由来血清含有)200μｌ中に２×10⁴の照射された（5000ラド）自己由来 EBV形質転換Ｂ細胞、もしくは刺激物としての４×10⁴の照射された（300 0ラド）同種間PBMC、並びに支持物としての10³の照射された（3000ラド）自己由来PBMCで、丸底マイクロタイタープレートにおいて限定された数において同時培養した。24の濃縮物を各々の応答体希釈についてセットアップした。20ユニットのhr-IL-2を６日目に加えた。クロム遊離アッセイを８及び12日目に標的として自己由来 EBV−Ｂ細胞又は同種PBMCを用いて行った。同一の培養条件の後、８日目に６時間の３Ｈ−チミジン（Amersham）の組込みにより行った。応答する細胞数と（20，21）に記載されるような非応答の培養物の百分率の対数との間のポアソン分布関係により前駆体頻度を計算した。細胞表面表現型：間接蛍光標識法（18）でのネズミ抗ヒト LNGFRモノクローナル抗体20.4（ATCC）を利用するフローサイトメトリーにより LNGFRの細胞表面発現を監視した。PE−接合抗ヒトCD4（T4），CD8（T8），CD5，B4，CD25R，Leu7， CD34モノクローナル抗体（MoAb）(Coulter Immunology，Hialeah，FL)を用いるフローサイトメトリーにより、Ｔリンパ球系統及びクローンの細胞表面表現型を決定した。要約すると、５×10⁵の細胞を４℃で30分間、100mlの希釈した抗体で染色し、FCSのない培地で２回洗浄してFACS分析のための0.5mlのPBS又は100mlの希釈されたFITC−接合第２抗体で希釈した。FITC−及びPE−接合抗体の連続的インキュベーションにより、二重染色分析を行った。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１月７日【補正内容】請求の範囲１．Ｔ細胞含有細胞調製物を抗原と共にインキュベートし、該抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞(CTL)を単離することによる該抗原特異的 CTLの製造のための方法であって、ｉ）前記抗原とのインキュベーションにより前記細胞調製物において CTLの増殖を活性化するステップと、 ii）標識遺伝子を含むベクターを前記増殖中の CTL内に選択的に転移させるステップであって、標識及び非標識の細胞が前記標識遺伝子の手段により分離され得るステップと、 iii）前記標識遺伝子を基礎として前記移入された抗原特異的 CTLを分離するステップと、を特徴とする方法。２．前記べクターとしてレトロウイルスを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記標識遺伝子として低アフィニティーNGFレセプターを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。４．前記ベクターが更に自殺遺伝子を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．自殺遺伝子として、HSVのTK遺伝子を用いることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．前記抗原として、不活性化ウイルスもしくはその一部、単離抗原又は抗原提示細胞を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．ウイルスとして、CMV，HBV，EBV，HIV，HSV及び HCVを用いることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．２〜30日間、IL−２の存在下において前記活性化 CTLを培養して、該細胞に前記ベクターを感染させ、更に２〜４日間IL-２の存在下において前記細胞を培養して、前記標識遺伝子を基礎として CTLを選択することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．CD８⁺ CTLが選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。 10．請求項１〜９のいずれかに記載の方法により得られるウイルス抗原の異なるエピトープに対する少くとも２つの CTLクローンを含む治療用組成物。

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｔ細胞含有細胞調製物を抗原と共にインキュベートし、該抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞(CTL)を単離することによる該抗原特異的 CTLの製造のための方法であって、ｉ）前記抗原とのインキュベーションにより前記細胞調製物において CTLの増殖を活性化するステップと、 ii）標識遺伝子を含むベクターを前記増殖中の CTL内に選択的に転移させるステップであって、標識及び非標識の細胞が前記標識遺伝子の手段により分離され得るステップと、 iii）前記標識遺伝子を基礎として前記移入された抗原特異的 CTLを分離するステップと、を特徴とする方法。２．前記ベクターとしてレトロウイルスを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記標識遺伝子として低アフィニティー NGFレセプターを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。４．前記ベクターが更に自殺遺伝子を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．自殺遺伝子として、HSVのTK遺伝子を用いることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．前記抗原として、不活性化ウイルスもしくはその一部、単離抗原又は抗原提示細胞を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．ウイルスとして、CMV，HBV，EBV，HIV，HSV及びHCVを用いることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．２〜30日間、IL−２の存在下において前記活性化 CTLを培養して、該細胞に前記ベクターを感染させ、更に２〜４日間IL−２の存在下において前記細胞を培養して、前記標識遺伝子を基礎としてCTLを選択することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．CD８⁺ CTLが選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。 10．請求項１〜９のいずれかに記載の方法により得られるウイルス抗原の異なるエピトープに対する少くとも２つの CTLクローンを含む治療用組成物。 11．免疫調節のための治療剤を調製するための請求項10に記載の組成物の使用。