NO333876B1

NO333876B1 - Humanisert antistoff samt farmasøytisk preparat.

Info

Publication number: NO333876B1
Application number: NO20045323A
Authority: NO
Inventors: Jonathan Henry Ellis; Volker Germaschewski
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2002-08-06
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2013-10-07
Also published as: EP1526868B1; MXPA05001468A; US8071731B2; ES2440652T3; EP1526868A2; JP4528121B2; IS7576A; TWI323265B; AR040778A1; IL165478A; CY1114919T1; NZ537123A; CA2494008C; NO20045323L; DK1526868T3; MY148409A; BR0312456A; PL375405A1; JP2006512899A; SI1526868T1

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår endrede antistoffer mot myelin-assosiert glykoprotein (MAG), farmasøytiske formuleringer som inneholder dem og anvendelse av slike antistoffer for behandling og/eller profylakse av nevrologiske sykdommer/lidelser.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår endrede antistoffer som binder til myelin-assosiert glykoprotein (MAG) og nøytraliserer funksjonen derav, samt farmasøytiske formuleringer inneholdende nevnte antistoffer.

Polynukleotider som koder for slike antistoffer, og anvendelse av slike antistoffer ved behandling og/eller profylakse av nevrologiske sykdommer er også beskrevet.

Andre aspekter, formål og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå fra beskrivelsen nedenfor.

Slag er en hovedårsak til død og invaliditet i den vestlige verden. Det finnes ingen godkjent behandling for slag andre enn t-PA som må administreres innen 31 etter slag, etter et CT-scan for å utelukke hemoragi. Frem til i dag har de fleste agenser rettet mot behandling av akutt slag (dvs. neurobeskyttelse), hovedsakelig omfattet målretting av glutamatreseptorer og deres nedstrøms signalerings-overføringsbaner ("pathways") kjent for å være involvert i akutt celledød. Imidlertid har disse strategiene hittil vist seg å være mislykkede i kliniske forsøk, og er ofte forbundet med dose-begrensende bieffekter (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (suppl III) 10-14 (1998)). Derfor er det behov for nye tilnærminger for behandling rettet mot bedring av celledød etter opphør av blodstrømning.

Etter slag observeres noen grad av spontan funksjonsbedring hos mange pasienter, noe som antyder at hjernen har (om enn begrenset) evne til å reparere og/eller remodellere etter skade. Agenser som har potensiale til å forøke denne bedringen kan derfor tillate at inngripen utføres mye senere (potensielt dager) etter symptomstart for cerebral iskemi. Agenser som er i stand til å tilby både akutt neurobeskyttelse og fremme funksjonell bedring kan sørge for betydelige fordeler fremfor rådende potensielle neurobeskyttende strategier.

Mekanismene som ligger bak funksjonell bedring er for øyeblikket ukjente. Utvekst ("sprouting") av skadede eller ikke-skadede axoner har blitt foreslått som en mulig mekanisme. Selv om in wVo-studier har vist at behandling av skade i ryggmarg eller slag med neurotrofiske faktorer resulterer i forøkt funksjonell bedring og en grad av axonal utvekst ("sprouting"), beviser imidlertid ikke dette en direkte forbindelse mellom graden av axonal utvekst og omfang av funksjonsbedring (Jakeman, et al. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata et al. 1997, Proe Nati Acad. Sei. USA., 94: 8179-8184, Ribotta, et al. 2000, J Neurosci. 20: 5144- 5152). Enn videre krever axonal utvekst et viabelt neuron. Ved sykdommer slik som slag som er forbundet med omfattende celledød, kan forøkningen av funksjonsbedring som gis av et gitt agens etter slag derfor finne sted gjennom andre mekanismer enn axonal utvekst for eksempel differensiering av endogene stamceller, aktivering av redundante overføringsbaner ("pathways"), endringer i reseptordistribuering eller eksitabilitet av nevroner eller glia (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970).

Sentralnervesystemets (CNS) begrensede evne til å reparere etter skade er antatt delvis å skyldes molekyler innen CNS-omgivelsene som har en hemmende effekt på "axonal sprouting" (neuritt-utvekst). CNS myelin er antatt å inneholde inhibitormolekyler (Schwab ME og Caroni P (1988) J. NeurosciB, 2381-2193). To myelinproteiner, myelin-assosiert glykoprotein (MAG) og Nogo har blitt klonet og identifisert som antatte inhibitorer for neuritt-utvekst (Sato S. et al (1989) Biochem, Biophys Res. Comm. 163,1473-1480; McKerracher L et al (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G et al (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K og Lundborg G

(1997) Exp. NeurologyW, 254-262; Schafer et al (1996) Neuron 16, 1107-1113; W09522344; WO9701352; Prinjha R et al (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS et al (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T et al. (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; WO0031235).

Myelin-assosiert glykoprotein er et celleoverflate-transmembrant molekyl uttrykt på overflaten av myelin bestående av fem ekstracellulære immunglobulin-domener, et enkelt transmembran-domene og et intracellulært domene. MAG-ekspresjon er begrenset til myeliniserende glia i CNS og det perifere nervesystemet (PNS). MAG er antatt å interagere med neuronal(e) reseptor(er) som medierer effekter på det neuronale cytoskjelettet omfattende neurofilament-fosforylering og hemming av neuritt-utvekst in vitro. Selv om antagonister for MAG har blitt postulert som nyttige for å fremme axonal utvekst etter skade (W09522344, WO9701352 og WO9707810), understøttes ikke disse påstandene av in wVo-data. Enn videre er MAG's rolle som inhibitor for axonal utvekst fra CNS-neuroner in vivo ikke bevist (Li CM et al (1994) Nature 369, 747-750; Montag, D et al (1994) Neuron 13, 229-246; Lassmann H et al (1997) GLIA 19, 104-10; Li C et al (1998) J. Neuro. Res. 51, 210-217; Yin X et al (1998) J. Neurosci. 18, 1953-1962; Bartsch U et al (1995) Neuron 15 1375-1381; Li M et al (1996) 46, 404-414). Det vises også til WO 02062383, WO 9522344 og WO 0162907.

Antistoffer omfatter typisk to tunge kjeder bundet sammen med disulfidbindinger og to lette kjeder. Hver lett kjede er bundet til hver sin tunge kjede ved disulfidbindinger. Hver tunge kjede har et variabelt domene ved en ende etterfulgt av et antall konstante domener. Hver lett kjede har et variabelt domene ved en ende og et konstant domene ved den andre enden. Den lette kjedens variable domene står på linje med den tunge kjedens variable domene. Den lette kjedens konstante domene står på linje med den tunge kjedens første konstante domene. De konstante domenene i de lette og tunge kjedene er ikke direkte involvert i å binde antistoffet til antigen.

De variable domenene for hvert par av lette og tunge kjeder danner det antigenbindende setet. De variable domenene på de lette og tunge kjedene har samme generelle struktur og hvert domene omfatter en ramme av fire regioner, hvis sekvens er relativt konservert, forbundet med tre komplementær-bestemmende regioner ("complementarity determining regions") (CDR) ofte referert til som hypervariable regioner. De fire struktur-regionene inntar hovedsakelig en beta-flak konformasjon og CDR-ene danner løkker som forbinder, og i noen tilfeller danner del av, beta-flak strukturen. CDR-ene holdes i umiddelbar nærhet av struktur-regionene og bidrar, med CDR-ene fra det andre domenet, til dannelsen av det antigenbindende setet. Antistoffers komplementær-bestemmende regioner og ramme-regioner kan bestemmes ved henvisning til Kabat et al ("Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).

Det har nå blitt funnet at et anti-MAG monoklonalt antistoff, beskrevet (Poltorak et al (1987) Journal ofCell Biology 105, 1893-1899, DeBellard et al (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K og Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262) og kommersielt tilgjengelig (MAB1567 (Chemicon)) tilveiebringer neurobeskyttelse og forøker funksjonsbedring når det administreres enten direkte inn i hjernen eller intravenøst etter fokal cerebral iskemi i rotte (en modell for slag). Derfor tilveiebringer anti-MAG antistoffer potensielle terapeutiske agenser både for akutt neurobeskyttelse så vel som for å fremme funksjonsbedring etter slag. Dette antistoffet er et murint antistoff. Selv om murine antistoffer ofte anvendes som diagnostiske agenser har deres nytte som terapeutikum blitt påvist i bare noen få tilfeller. Deres begrensede anvendelse beror delvis på at gjentatt administrering av murine monoklonaler til mennesker vanligvis fremkaller humane immunresponser mot disse molekylene. For å overvinne disse reelle uønskede egenskapene ved murine monoklonaler har "endrede" antistoffer, utformet til å inkorporere regioner av humane antistoffer, blitt utviklet og er velkjente innen fagfeltet. For eksempel inneholder et humanisert antistoff komplementær-bestemmende regioner ("CDR") av ikke-human opprinnelse og majoriteten av resten av strukturen er avledet fra et humant antistoff.

Nevrodegenerasjon ligger til grunn for mange nevrologiske sykdommer/lidelser omfattende akutte sykdommer som slag, traumatisk hjerneskade og ryggmargskade så vel som kroniske sykdommer inkludert Alzheimers sykdom, fronto-temporal demens (tauopatier), perifer neuropati, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og multippel sklerose. Anti-MAG mabs kan derfor være nyttige ved behandling av disse sykdommene/lidelsene, ved både å forbedre celledød assosiert med disse sykdommene/lidelsene og fremme funksjonell bedring.

Oppfinnelsen tilveiebringer i et første aspekt et humanisert anti-MAG antistoff som binder til og nøytraliserer MAG, som er kjennetegnet ved at det omfatter et tung kjede variabelt domene valgt fra gruppen som består av: SEKV ID Nr. 13, SEKV ID Nr. 14 og SEKV ID Nr. 15, og et lett kjede variabelt domene valgt fra gruppen som består av: SEKV ID Nr. 16, SEKV ID Nr. 17, SEKV ID Nr. 18 og SEKV ID Nr. 19.

Et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som er kjennetegnet ved at det omfatter et humanisert anti-MAG antistoff ifølge det første aspekt av oppfinnelsen sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

I et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et humanisert anti-MAG antistoff ifølge det første aspekt av oppfinnelsen for behandling eller profylakse av slag og nevrologiske sykdommer/lidelser.

I et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et humanisert anti-MAG antistoff ifølge det første aspekt av oppfinnelsen for å hemme nevrodegenerasjon og/eller fremme funksjonell bedring hos et menneske som lider av eller med risiko for å utvikle slag eller nevrologisk sykdom/lidelse.

I en utførelsesform omfatter det humanisert anti-MAG antistoff videre en konstant del eller fragment derav av en human lett kjede og en konstant del eller fragment derav av en human tung kjede.

I en utførelsesform er tung kjede variabelt domenet SEKV ID Nr. 13.

I en utførelsesform er tung kjede variabelt domenet SEKV ID Nr. 14.

I en utførelsesform er tung kjede variabelt domenet SEKV ID Nr. 15.

I en utførelsesform er lett kjede variabelt domenet SEKV ID Nr. 16.

I en utførelsesform er lett kjede variabelt domenet SEKV ID Nr. 17.

I en utførelsesform er lett kjede variabelt domenet SEKV ID Nr. 18.

I en utførelsesform er lett kjede variabelt domenet SEKV ID Nr. 19.

I en utførelsesform er tung kjede variabelt domenet SEKV ID Nr. 13 og lett kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 16.

I en utførelsesform administeres antistoffet parenteralt.

I en utførelsesform administeres antistoffet intravenøst.

I en utførelsesform er den nevrologiske sykdommen/lidelsen valgt fra gruppen bestående av: traumatisk hjerneskade, ryggmarg, Alzheimers sykdom, fronto-temporal demens (tauopatier), perifer nevropati, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og multippel sklerose.

Beskrivelse av figurene

Figur 1: Sekvens for et mus/humant kimært anti-MAG antistoff tung kjede (SEKV ID NR. 27). Figur 2: Sekvens for et mus/humant kimært anti-MAG antistoff lett kjede (SEKV ID NR. 28). Figur 3: Sekvens for et mus/humant kimært anti-MAG antistoff tung kjede (SEKV ID NR. 29).

Figur 4: Kimært anti-MAG antistoff binder til rotte-MAG

Figur 5 Humaniserte anti-MAG antistoffsekvenser

Figur 6: Humaniserte anti-MAG antistoffer binder til rotte-MAG

Figur 7: Humaniserte anti-MAG antistoffer binder til rotte-MAG

Figur 8: Humaniserte anti-MAG antistoffer binder til humant MAG

Figur 9: Konkurrerende ELISA med mus og humaniserte anti-MAG antistoffer

MAG

Anti- MAG antistoff

Det endrede antistoffet er foretrukket et monoklonalt antistoff (mAb).

Det endrede antistoffet har foretrukket samme oppbygging som et naturlig antistoff eller fragment derav. Antistoffet kan derfor omfatte et komplett antistoff, et

(Fab<1>)2-fragment, et Fab-fragment, en lett kjede-dimer eller en tung kjede-dimer. Antistoffet kan være et IgGI, lgG2, lgG3 eller lgG4; eller IgM; IgA, IgE eller IgD eller en modifisert variant derav. Det konstante domenet av antistoffets tung kjede kan velges deretter. Det lett kjede konstante domenet kan være et kappa eller lambda konstant domene. Videre kan antistoffet omfatte modifikasjoner av alle klasser for eksempel IgG-dimerer, Fc-mutanter som ikke lenger binder Fc-reseptorer eller medierer Clq-binding (blokkerende antistoffer). Antistoffet kan også være et kimært antistoff av typen beskrevet i WO86/01533 som omfatter en antigenbindende region og en ikke-immunglobulin region. Den antigenbindende regionen er et antistoff lett kjede variabelt domene eller tung kjede variabelt domene. Det antigenbindende området omfatter typisk både lett og tung kjede variable domener. Ikke-immunglobulinområdet er fusjonert, ved dets C-terminal, til den antigenbindende regionen. Ikke-immunglobulinregionen er typisk et ikke-immunglobulinprotein og kan være et enzym, et toksin eller protein med kjent bindingsspesifisitet. De to regionene av denne type kimært antistoff kan være forbundet via en linkersekvens som er i stand til å kløyves. Immunoadhesin som har komplementær-bestemmende regioner (CDR) som tidligere beskrevet er også medregnet.

Den konstante regionen velges i henhold til nødvendig funksjonalitet. Vanligvis vil et lgG1 vise lytisk evne gjennom binding til komplement og/eller vil mediere ADCC (antistoffavhengig celle-cytotoksisitet). Et lgG4 vil foretrekkes dersom det behøves et ikke-cytotoksisk blokkerende antistoff. Imidlertid kan lgG4-antistoffer utvise ustabilitet ved fremstilling og derfor kan det være mer foretrukket å modifisere den generelt mer stabile lgG1. Foreslåtte modifikasjoner er beskrevet i EPO307434 foretrukne modifikasjoner omfatter ved posisjonene 235 og 237. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor en lytisk eller en ikke-lytisk form av et antistoff.

Det endrede antistoffet er foretrukket klasse IgG, mer foretrukket lgG1.

I foretrukne utforminger er derfor antistoffet et fullengde ikke-lytisk lgG1-antistoff med komplementær-bestemmende regioner (CDR) som beskrevet supra. I mest foretrukne utforminger tilveiebringes det et fullengde ikke-lytisk IgG-antistoff som har komplementær-bestemmende regioner (CDR) med SEKV ID NR: 13 og 16 og et fullengde ikke-lytisk lgG1 -antistoff med komplementær-bestemmende regioner (CDR) ifølge SEKV ID NR: 15 og 18.

Det tilveiebringes også polynukleotider som koder for CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 og CDRL3. Foretrukne polynukleotidsekvenser er Lett kjede komplementær- bestemmende regioner ( CDR)

Det tilveiebringes videre et polynukleotid som koder for en lett kjede variabel region av et endret anti-MAG antistoff omfattende minst én CDR valgt fra CDRL1, CDRL2 og CDRL3, mer foretrukket omfattende alle 3 CDR'ene i rekkefølge.

Det tilveiebringes ytterligere et polynukleotid som koder for en tung kjede variabel region av et endret anti-MAG antistoff omfattende minst én CDR valgt fra CDRH1, CDRH2 og CDRH3, mer foretrukket omfattende alle 3 CDR'ene i rekkefølge.

Anti-MAG antistoffet ifølge oppfinnelsen er et humanisert antistoff.

Det tilveiebringes et humanisert antistoff som binder til og nøytraliserer MAG som omfatter en tung kjede variabel region omfattende en av de følgende aminosyresekvensene:

Ved oppfinnelsen tilveiebringes et humanisert antistoff eller funksjonelt fragment derav som binder til MAG som omfatter tung kjede variabel regionen av Sekvens ID Nr. 13, 14 eller 15 sammen med en lett kjede variabel region omfattende aminosyresekvensene Sekvens ID Nr. 16, 17,18 eller 19:

Ved oppfinnelsen tilveiebringes i en utførelsesfrom et humanisert antistoff omfattende: et tung kjede variabelt fragment omfattende SEKV ID NR 13, 14 eller 15 og en konstant del eller fragment derav av en human tung kjede,

og et lett kjede variabelt fragment omfattende SEKV ID NR 16, 17, 18 eller 19 og en konstant del eller fragment derav av en human lett kjede.

Foretrukket er det humaniserte antistoffet klasse IgG, mer foretrukket lgG1.

Foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen omfatter:

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 13 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 16;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 13 og lett kjede variabel region SEKV ID NR 17;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 13 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 18;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 13 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 19.

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 14 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 16;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 14 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 17;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 14 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 18;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 14 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 19.

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 15 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 16;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 15 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 17;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 15 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 18;

Tung kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 15 og lett kjede variabel region omfattende Sekv ID Nr 19.

Ytterligere tilveiebringes polynukleotider som koder for tung kjede variabel regionen omfattende Sekvens ID Nr 13,14 og 15 og lett kjede variable regioner omfattende Sekvens ID Nr 16, 17, 18 og 19.

Foretrukket polynukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen SEKV ID NR 13 er

"Nøytralisering" henviser til hemming, enten total eller delvis, av MAG-funksjon inkludert dets binding til neuroner og hemming av neuritt-utvekst.

"Endret antistoff' refererer til et protein kodet for av en endret immunglobulinkodende region, som kan oppnås ved ekspresjon i en utvalgt vertscelle. Slike endrede antistoffer omfatter konstruerte ("engineered") antistoffer (foreksempel, kimære, omformede, humaniserte ellervektorbundne ("vectored") antistoffer) eller antistoff-fragmenter som mangler hele eller en del av en immunglobulin konstant region, for eksempel Fv, Fab, eller F(ab)2og lignende.

"Endret immunglobulinkodende region" refererer til en nukleinsyresekvens som koder for endret antistoff. Når det endrede antistoffet er et CDR-overført eller humanisert antistoff, er sekvensene som koder for de komplementær-bestemmende regioner (CDR'er) fra et ikke-humant immunglobulin insertert inn i en første immunglobulinpartner omfattende humane variable rammesekvenser. Eventuelt er den første immunglobulinpartneren operativt bundet til en andre immunglobulinpartner.

"Første immunglobulinpartner" henviser til en nukleinsyresekvens som koder for en human ramme eller human immunglobulin variabel region i hvilken de native (eller naturlig forekommende) CDR-kodende regionene erstattes av de CDR-kodende regionene fra et donor-antistoff. Den humane variable regionen kan være en immunglobulin tung kjede, en lett kjede (eller begge kjeder), en analog eller funksjonelle fragmenter derav. Slike CDR-regioner lokalisert innenfor den variable regionen av antistoffer (immunglobuliner) kan bestemmes ved metoder som er kjent innen fagfeltet. For eksempel fremlegger Kabat et al. ( Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) regler for lokalisering av komplementær-bestemmende regioner (CDR). I tillegg er det kjent datamaskinprogrammer som er nyttige for å identifisere CDR-regioner/strukturer.

"Andre immunglobulinpartner" viser til en annen nukleotidsekvens som koder for et protein eller peptid til hvilken den første immunglobulinpartneren fusjoneres i leseramme eller ved hjelp av en eventuell konvensjonell linkersekvens (dvs. operativt bundet). Foretrukket er det et immunglobulingen. Den andre immunglobulinpartneren kan omfatte en nukleinsyresekvens som koder for hele den konstante regionen for samme (dvs. homologe - de første og andre endrede antistoffene er avledet fra samme kilde) eller et ytterligere (dvs. heterologt) antistoff av interesse. Det kan være en immunglobulin tung kjede eller lett kjede (eller begge kjeder som del av et enkelt polypeptid). Den andre immunglobulinpartneren er ikke begrenset til en bestemt

immunglobulinklasse eller isotype. I tillegg kan den andre immunglobulinpartneren omfatte en del av en immunglobulin konstant region, for eksempel som funnet i en Fab, eller F(ab)2(dvs. en avgrenset del av en egnet human konstant region eller ramme region). En slik andre immunglobulinpartner kan også omfatte en sekvens som koder for et integrerende membranprotein eksponert på den ytre overflaten av en vertscelle, for eksempel som en del av et fagdisplay-bibliotek, eller en sekvens som koder for et protein for analytisk eller diagnostisk deteksjon, for eksempel pepperrot peroxidase, (3-galaktosidase, osv.

Betegnelsene Fv, Fc, Fd, Fab eller F(ab)2anvendes med deres standard betydninger (se, for eksempel, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

Som anvendt her beskriver et "konstruert antistoff' en type endret antistoff, dvs. et fullengde syntetisk antistoff (for eksempel et kimært, omformet eller humanisert antistoff i motsetning til et antistoff-fragment) i hvilket en andel av lett og/eller tung kjede variable domener av et valgt akseptor-antistoff er erstattet av analoge deler fra ett eller flere donor-antistoffer som har spesifisitet for den valgte epitopen. For eksempel kan slike molekyler omfatte antistofferkarakterisertav en humanisert tung kjede forbundet med en umodifisert lett kjede (eller kimær lett kjede), eller omvendt. Konstruerte antistoffer kan også karakteriseres ved endring av nukleinsyresekvensene som koder for akseptor-antistoff lett og/eller tung variabelt domene struktur-regionene for å bibeholde donor-antistoff bindingsspesifisitet. Disse antistoffene kan omfatte erstatning av en eller flere komplementær-bestemmende regioner (foretrukket alle) fra akseptor-antistoffet med komplementær-bestemmende regioner fra et donor-antistoff beskrevet her.

Et "kimært antistoff" viser til en type konstruert antistoff som inneholder en naturlig forekommende variabel region (lett kjede og tunge kjeder) avledet fra et donor-antistoff i forbindelse med lett og tung kjede konstante regioner avledet fra et akseptor-antistoff.

Et "humanisert antistoff" refererer til en type konstruert antistoff som har komplementær-bestemmende regioner (CDR) avledet fra et ikke-humant donor-immunglobulin, hvor resten av de immunglobulin-avledede delene av molekylet er avledet fra ett (eller flere) humane immunglobulin(er). I tillegg kan ramme-støttende rester endres for å bevare bindingsaffinitet (se, for eksempel, Queen et al., Proe. Nati Acad Sei USA. 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/ Technology. 9: 421

(1991)). Et egnet humant akseptor-antistoff kan være ett som er valgt fra en konvensjonell database, for eksempel KABAT®-databasen, Los Alamos database, og Swiss Protein database, ved homologi til nukleotidet og aminosyresekvensene for donor-antistoffet. Et humant antistoffkarakterisert vedhomologi til ramme-regionene for donor-antistoffet (på aminosyrebasis) kan være egnet til å tilveiebringe en tung kjede konstant region og/eller en tung kjede variabel struktur-region for insersjon av donor CDR'ene. Et egnet akseptor-antistoff i stand til å donere lett kjede konstant eller variable struktur-regioner kan velges på lignende måte. Det bør bemerkes at det ikke er nødvendig at akseptor-antistoffets tunge og lette kjeder stammer fra samme akseptor-antistoff. Tidligere kjent teknikk beskriver flere måter for fremstilling av slike humaniserte antistoffer - se for eksempel EP-A-0239400 og EP-A-054951 "Omformet humant antistoff" refererer til et endret antistoff i hvilket minst en CDR fra et første humant monoklonalt donor-antistoff anvendes i stedet for en CDR i et andre humant akseptor-antistoff. Foretrukket erstattes alle seks CDR'ene. Mer foretrukket erstatter en hel antigenkombinerende region (for eksempel, Fv, Fab eller F(ab')2) fra et første human donor monoklonalt antistoff den korresponderende regionen i et andre human akseptor monoklonalt antistoff. Mest foretrukket er Fab-regionen fra en første human donor operativt bundet til passende konstante regioner fra et andre human akseptor-antistoff for å danne et fullengde monoklonalt antistoff.

Et "vektorbundet antistoff" refererer til et antistoff til hvilket et agens er festet for å forbedre transport gjennom blod-hjernebarrieren (BBB). (Gjennomgåelse se Pardridge; Advanced Drug Delivery Review 36, 299-321, 1999). Festingen kan være kjemisk eller alternativt kan andelen være konstruert inn i antistoffet. Ett eksempel er å fremstille en kimær med et antistoff rettet mot en hjerne kapillær endotelcelle-reseptor for eksempel et anti-insulin reseptor antistoff eller anti-transferrin reseptor antistoff (Saito et al (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92 10227-31; Pardridge et al

(1995) Pharm. Res 12 807-816; Broadwell et al (1996) Exp. Neurol. 142 47-65; Bickel et al (1993) Proe Nati. Acad. Sei. USA 90, 2618-2622; Friden et al (1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278 1491-1498, US5182107, US5154924, US5833988, US5527527). Når de først er bundet til reseptoren passerer begge komponentene av det bispesifikke antistoffet over BBB ved transcytose. Alternativt kan agenset være en ligand som binder slike celleoverflatereseptorer, for eksempel insulin, transferrin eller low density lipoprotein (Descamps et al (1996) Am. J. Physiol. 270 H1149-H1158; Duffy et al (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck et al (1997) J. Cell Biol.

1997 877-889). Naturlig forekommende peptider slik som penetratin og SynB1 og Syn B3 som er kjent for å forbedre transport over BBB kan også anvendes (Rouselle et al (2000) Mol. Pharm. 57, 679-686 og Rouselle et al (2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124-131).

Betegnelsen "donor-antistoff' refererer til et antistoff (monoklonalt eller rekombinant) som bidrar med aminosyresekvensene fra dets variable regioner, komplementær-bestemmende regioner eller andre funksjonelle fragmenter eller analoger derav til en første immunglobulinpartner, for på den måten å tilveiebringe den endrede immunglobulinkodende regionen og resulterende uttrykt endret antistoff med antigenspesifisitet og nøytraliserende aktivitet karakteristisk for donor-antistoffet.

Betegnelsen "akseptor-antistoff' viser til et antistoff (monoklonalt eller rekombinant) heterologt til donor-antistoffet, som bidrar med alle (eller hvilken som helst andel, men foretrukket alle) aminosyresekvensene som koder for dets tung og/eller lett kjede rammeregioner og/eller dets tung og/eller lett kjede konstante regioner til den første immunglobulinpartneren. Foretrukket er et humant antistoff akseptor-antistoffet.

"CDR" er definert som aminosyresekvensene for komplementær-bestemmende regioner ("complementarity determining region") av et antistoff som er de hypervariable regionene av immunglobulin tunge og lette kjeder. Se, for eksempel, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Det er tre tung kjede og tre lett kjede komplementær-bestemmende regioner (eller CDR-regioner) i den variable delen av et immunglobulin. Følgelig refererer "CDR" som anvendt her til alle de tre tung kjede CDR'ene, eller alle de tre lett kjede CDR'ene (eller både alle tunge og alle lett kjede komplementær-bestemmende regioner, dersom hensiktsmessig). Strukturen og proteinfoldingen av antistoffet kan bety at andre rester anses som del av det antigenbindende området og ville av fagfolk være forstått å være det. Se for eksempel Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, s. 877-883. For letthets skyld er CDR'ene som definert av Kabat i SEKV ID NR 13-26 understreket.

Komplementær-bestemmende regioner (CDR) tilveiebringer majoriteten av

kontakt-rester for bindingen av antistoffet til antigenet eller epitopen. Komplementær-bestemmende regioner av interesse er avledet fra donor-antistoff variable tung og lett kjede-sekvenser, og omfatter analoger av de naturlig forekommende CDR'ene, hvilke

analoger også deler eller bibeholder den samme antigenbindingsspesifisitet og/eller nøytraliserende evne som donor-antistoffet fra hvilket de ble avledet.

Et "funksjonelt fragment" er en partiell tung eller lett kjede variabel sekvens (for eksempel mindre delesjoner ved amino- eller karboksyterminalen av det variable området av immunglobulinet) som bibeholder samme antigenbindings-spesifisitet og/eller nøytraliserende evne som antistoffet fra hvilket fragmentet ble avledet.

En "analog" er en aminosyresekvens modifisert ved minst én aminosyre, hvori nevnte modifikasjon kan være kjemisk eller en substitusjon eller en omordning av noen få aminosyrer (dvs. ikke mer enn 10), hvilken modifikasjon tillater aminosyresekvensen å bibeholde de biologiske egenskapene, for eksempel antigenspesifisitet og høy affinitet, fra den umodifiserte sekvensen. For eksempel kan (stille) mutasjoner konstrueres, via substitusjoner, når visse endonuklease-restriksjonsseter er opprettet innenfor eller rundt CDR-kodende regioner. Anvendelse av analoger av antistoffet er beskrevet. Det er velkjent at mindre endringer i aminosyre- eller nukleinsyresekvenser kan føre til for eksempel en allelisk form av det opprinnelige proteinet som hovedsakelig bibeholder samme egenskaper. Følgelig omfatter analoger av antistoffet dem hvor CDR'ene i det hypervariable området av de tunge og lette kjedene er minst 80% homologe, foretrukket minst 90 % homologe og mer foretrukket minst 95 % homologe med CDR'ene som definert ovenfor som CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 og CDRL3 og bibeholder MAG-nøytraliserende aktivitet. Aminosyresekvenser er minst 80% homologe dersom de har 80% identiske aminosyrerester i en lik posisjon når sekvensene er innregulert optimalt, hvor gaps eller insersjoner anses som ikke-identiske rester. Analoger av antistoffene hvori struktur-regionene er minst 80% er også beskrevet, foretrukket minst 90% og mer foretrukket minst 95% homologe med struktur-regionene vist i Sekv ID 1-5. Aminosyresekvenser er minst 80% homologe dersom de har 80% identiske aminosyrerester i en lik posisjon når sekvensene er innregulert optimalt, hvor gaps eller insersjoner anses som ikke-identiske rester.

Analoger kan også fremkomme som alleliske variasjoner. En "allelisk variasjon eller modifikasjon" er en endring i nukleinsyresekvensen. Slike variasjoner eller modifikasjoner kan skyldes at den genetiske koden er degenerert eller kan være konstruert bevisst for å tilveiebringe ønskede egenskaper. Disse variasjonene eller modifikasjonene kan, eller ikke, resultere i endringer i hvilken som helst kodet aminosyresekvens.

Betegnelsen "effektor-agenser" refererer til ikke-protein bærermolekyler til hvilke de endrede antistoffene, og/eller naturlige eller syntetiske lette eller tunge kjeder av donor-antistoffet eller andre fragmenter av donor-antistoffet kan forbindes ved konvensjonelle metoder. Slike ikke-protein bærere kan omfatte konvensjonelle bærere anvendt i det diagnostiske fagområde, for eksempel polystyren eller andre plastkuler, polysakkarider, for eksempel som anvendt i BIAcore [Pharmacia]-systemet, eller andre ikke-protein substanser nyttige i det medisinske fagområdet og sikre for administrering til mennesker og dyr. Andre effektor-agenser kan omfatte amacrocycle, for å chelatere et tungmetallatom, eller radioisotoper. Slike effektor-agenser kan også være nyttige for å forøke halveringstiden for de endrede antistoffene, for eksempel polyetylenglykol.

Et nøytraliserende antistoff spesifikt for MAG har blitt beskrevet (Poltorak et al

(1987) Journal of Cell B/o/ogy 105,1893-1899, DeBellard et al (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K og Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262) og er kommersielt tilgjengelig (MAB1567 (Chemicon)).

Alternativt kan en konstruere antistoffer, endrede antistoffer og fragmenter, ved å immunisere en ikke-human art (foreksempel kveg, sau, ape, kylling, gnager (for eksempel fra musefamilien og rotte), osv.) for å frembringe et ønskelig immunglobulin etter presentasjon med nativt MAG fra hvilken som helst art mot hvilket det kan frembringes antistoffer som er kryssreaktive med humant MAG, for eksempel menneske eller kylling. Konvensjonelle hybridomteknikker anvendes for å tilveiebringe en hybridomcellelinje som sekreterer en ikke-human mAb til MAG. Slike hybridomer screenes deretter for binding ved anvendelse av MAG overtrukket på 384- eller 96-brønners plater, med biotinylert MAG bundet til en streptavidinovertrukket plate, eller i en homogen europium-APC-bundet immunoassay ved anvendelse av biotinylert MAG.

Et nativt humant antistoff kan fremstilles i en human antistoff-mus slik som "Xenomusen" (Abgenix) hvor musens immunglobulingener har blitt fjernet og gener som koder for de humane immunglobulinene har blitt insertert inn i musekromosomet. Musene immuniseres som vanlig og utvikler en antistoffrepons som er utledet fra de humane genene. Følgelig produserer musen humane antistoffer noe som fjerner behovet for å humanisere etter seleksjon av positive hybridomer. (Se Green L.L., J Immunol Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2): 11-23)

Anvendelse av Fab-fragmenter eller F(ab')2-fragmenter avledet fra mAb rettet mot MAG er også beskrevet. Disse fragmentene er nyttige som agenser som er beskyttende in vivo. Et Fab-fragment inneholder hele den lette kjeden og aminoterminal del av den tunge kjeden; og et F(ab')2-fragment er fragmentet dannet av to Fab-fragmenter bundet av disulfidbindinger. Fab-fragmenter og F(ab')2-fragmenter kan oppnås ved bruk av konvensjonelle metoder, for eksempel kløyving av mAb med egnede proteolytiske enzymer, papain og/eller pepsin, eller ved hjelp av rekombinante metoder. Fab- og F(ab')2-fragmentene er nyttige i seg selv terapeutisk eller profylaktisk, og som donorer av sekvenser omfattende de variable regionene og CDR-sekvenser nyttige for dannelse av rekombinante eller humaniserte antistoffer som beskrevet her.

Fab- og F(ab')2-fragmentene kan også konstrueres via et kombinatorisk fag-bibliotek (se, for eksempel, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994)) eller via immunglobulin kjedestokking "chain shuffling" (se, for eksempel, Marks et al., Bio/ Technology, 10:779-783 (1992).

Følgelig kan humane antistoff-fragmenter (Fv, scFv, Fab) spesifikke for MAG isoleres ved anvendelse av humant antistoff-fragment fag-display bibliotek. Et bibliotek av bakteriofagpartikler, som fremviser ("display") de humane antistoff-fragment-proteinene, oppberedes mot MAG-proteinet. De fag-fremvisende antistoff-fragmentene som binder MAG beholdes fra biblioteket og amplifiseres klonalt. De humane antistoffgenene fjernes deretter fra den spesifikke bakteriofagen og inserteres inn i humane IgG-ekspresjonskonstruksjoner som inneholder de humane konstante regionene fra IgG for å danne intakt humant IgG-molekyl med de variable regionene fra den isolerte bakteriofagen spesifikk for MAG.

Donor-antistoffene kan bidra med sekvenser, for eksempel variabel tung og/eller lett kjede peptidsekvenser, rammesekvenser, CDR-sekvenser, funksjonelle fragmenter, og analoger derav, og nukleinsyresekvensene som koder for dem, nyttige for å utforme og oppnå forskjellige endrede antistoffer som kjennetegnes ved den antigenbindende spesifisiteten for donor-antistoffet.

Når en tar med i beregningen at den genetiske koden er degenerert, kan det konstrueres forskjellige kodende sekvenser som koder for de variable tung og lett kjede aminosyresekvensene, og CDR-sekvenser så vel som funksjonelle fragmenter og analoger derav som deler donor-antistoffets antigenspesifisitet. Isolerte nukleinsyresekvenser, eller fragmenter derav, som koder for variabel kjede peptidsekvenser eller komplementær-bestemmende regioner kan anvendes for å fremstille endrede antistoffer, for eksempel kimære eller humaniserte antistoffer, eller andre konstruerte antistoffer når de kombineres operativt med en andre immunglobulinpartner.

Endrede immunglobulinmolekyler kan kode for endrede antistoffer som omfatter konstruerte antistoffer slik som kimære antistoffer og humaniserte antistoffer. En ønsket endret immunglobulinkodende region inneholder CDR-kodende regioner som koder for peptider med antigenspesifisiteten for et anti-MAG antistoff, foretrukket et høyaffinitetsantistoff, insertert inn i en første immunglobulinpartner (en human struktur- eller human immunglobulin variabel region).

Foretrukket er den første immunglobulinpartneren operativt bundet til en andre immunglobulinpartner. Den andre immunglobulinpartneren er definert ovenfor, og kan omfatte en sekvens som koder for en andre antistoffregion av interesse, for eksempel en Fc-region. Andre immunglobulinpartnere kan også omfatte sekvenser som koder for et annet immunglobulin til hvilket den lette eller tunge kjede konstante regionen er fusjonert i leseramme eller ved hjelp av en linkersekvens. Konstruerte antistoffer rettet mot funksjonelle fragmenter eller analoger av MAG kan utformes til å frembringe forøkt binding.

Den andre immunglobulinpartneren kan også være forbundet med effektoragenser som definert ovenfor, inkludert ikke-protein bærermolekyler, til hvilke den andre immunglobulinpartneren kan bindes operativt ved konvensjonelle metoder.

Fusjon eller binding mellom de andre immunglobulinpartnerne, for eksempel antistoffsekvenser, og effektoragenset kan skje på hvilken som helst passende måte, for eksempel ved konvensjonell kovalent eller ionebindinger, proteinfusjoner eller hetero-bifunksjonelle kryssbindere, for eksempel karbodiimide, glutaraldehyd og lignende. Slike teknikker er kjent innen fagfeltet og er uten vansker beskrevet i konvensjonelle kjemi- og biokjemitekster.

I tillegg kan konvensjonelle linkersekvenser som ganske enkelt tillater en ønsket avstand mellom den andre immunglobulinpartneren og effektoragenset også konstrueres inn i den endrede immunglobulinkodende regionen. Utforming av slike linkere er velkjent for fagfolk innen området. Det tilveiebringes dimerer (bivalente eller bispesifikke), trimerer, tetramerer og andre multivalente scFV-proteinspesier som har én eller flere komplementær-bestemmende regioner som beskrevet supra som binder til og nøytraliserer MAG-funksjon.

Antistoffet kan ha et ytterligere agens festet til seg. For eksempel kan metoder innenfor rekombinant DNA-teknologi anvendes for å fremstille et konstruert antistoff i hvilket Fc-fragmentet eller CH2-CH3-domenet fra et komplett antistoffmolekyl er erstattet med et enzym eller annet detekterbart molekyl (dvs. et polypeptideffektor eller reportermolekyl).

Den andre immunglobulinpartneren kan også være operativt bundet til et ikke-immunglobulin peptid, protein eller fragment derav som er heterologt til den CDR-inneholdende sekvensen som har antigenspesifisiteten for anti-MAG antistoff. Det resulterende proteinet kan utvise både anti-MAG antigenspesifisitet og egenskaper for ikke-immunglobulinet ved ekspresjon. Denne fusjonspartneregenskapen kan, for eksempel, være en funksjonell egenskap slik som et annet bindings- eller reseptordomene, eller en terapeutisk egenskap dersom fusjonspartneren i seg selv er et terapeutisk protein, eller ytterligere antigene egenskaper.

Et annet ønskelig protein kan omfatte et komplett antistoffmolekyl, som har fullengde tunge og lette kjeder, eller hvilket som helst avgrenset fragment derav, for eksempel Fab eller F(ab')2-fragmentene, en tung kjede dimer, eller hvilke som helst minste rekombinante fragmenter derav slik som et Fv eller et enkelt-kjede antistoff (SCA) eller hvilket som helst annet molekyl med samme spesifisitet som den valgte donor-mAb. Et slikt protein kan anvendes i form av et endret antistoff, eller kan anvendes i sin ikke-fusjonerte form.

Når den andre immunglobulinpartneren er avledet fra et antistoff forskjellig fra donor-antistoffet, for eksempel hvilken som helst isotype eller klasse av immunglobulinstruktur eller konstante regioner, resulterer det i et konstruert antistoff. Konstruerte antistoffer kan omfatte immunglobulin (lg) konstante regioner og variable struktur-regioner fra én kilde, foreksempel akseptor-antistoffet, og én eller flere (foretrukket alle) komplementær-bestemmende regioner fra donorantistoffet. I tillegg kan endringer foretas, for eksempel delesjoner, substitusjoner eller addisjoner av akseptor mAb lett og/eller tung variabel domenestruktur-region på nukleinsyre- eller aminosyrenivå, eller donor-CDR-regionene for å bibeholde donor-antistoff antigenbindingsspesifisitet.

Slike konstruerte antistoffer er utformet for å anvende én (eller begge) av de variable tunge og/eller lette kjedene av anti-MAG mAb eller én eller flere av de tung eller lett kjede komplementær-bestemmende regionene. De konstruerte antistoffene kan være nøytraliserende, som definert ovenfor.

Slike konstruerte antistoffer kan omfatte et humanisert antistoff inneholdende struktur-regionene fra et valgt humant immunglobulin eller subtype, eller et kimært antistoff inneholdende de humane tung og lett kjede konstante regionene fusjonert til anti-MAG antistoff funksjonelle fragmenter. Et egnet humant (eller fra annet dyr) akseptor-antistoff kan være ett valgt fra en konvensjonell database, for eksempel KABAT®-databasen, Los Alamos database og Swiss Protein database, ved homologi til nukleotid- og aminosyresekvensene fra donor-antistoffet. Et humant antistoffkarakterisert vedhomologi til rammeregioner fra donor-antistoffet (på aminosyrebasis) kan være egnet for å tilveiebringe en tung kjede konstant region og/eller en tung kjede variabel rammeregion for insersjon av donor-CDR'ene. Et egnet akseptor-antistoff i stand til å donere lett kjede konstante eller variable ramme-regioner kan velges på lignende måte. Det bør nevnes at det ikke er nødvendig at akseptor-antistoffets tunge og lette kjeder har sin opprinnelse fra det samme akseptor-antistoffet. Ønskelig velges de heterologe ramme- og konstante regionene fra humane immunglobulinklasserog isotyper, foreksempel IgG (underklassene 1 til4), IgM, IgA og IgE. Imidlertid trenger ikke akseptor-antistoffet å inneholde kun humane immunglobulinproteinsekvenser. For eksempel kan det konstrueres et gen i hvilket en DNA-sekvenskodende del av en human immunglobulinkjede er fusjonert til en DNA-sekvens som koder for en ikke-immunglobulin aminosyresekvens slik som en polypeptideffektor eller reportermolekyl.

I et humanisert antistoff har foretrukket de variable domenene i både human tunge og lette kjeder blitt konstruert ved én eller flere CDR-erstatninger. Det er mulig å anvende alle seks CDR'ene eller ulike kombinasjoner av mindre enn de seks CDR'ene. Foretrukket erstattes alle seks CDR'ene. Det er mulig å erstatte CDR'ene bare i den humane tunge kjeden, ved å anvende, som lett kjede, den umodifiserte lette kjeden fra det humane akseptor-antistoffet. Alternativt kan en kompatibel lett kjede velges fra et annet humant antistoff ved å ty til de konvensjonelle antistoff-databasene. Resten av det konstruerte antistoffet kan avledes fra hvilket som helst egnet humant akseptor-immunglobulin.

Det konstruerte humaniserte antistoffet har følgelig foretrukket strukturen fra et naturlig humant antistoff eller et fragment derav, og har kombinasjonen av egenskaper som er nødvendig for effektiv terapeutisk anvendelse.

Det vil være forstått av fagfolk at et konstruert antistoff kan modifiseres ytterligere ved endringer i aminosyrer i det variable domenet uten nødvendigvis å påvirke spesifisiteten og den høye affiniteten for donor-antistoffet (dvs. en analog). Det forventes at tung og lett kjede-aminosyrer kan erstattes av andre aminosyrer enten i de variable domenestrukturene eller CDR'ene eller begge.

I tillegg kan den konstante regionen endres for å forøke eller minske selektive egenskaper for molekylene. For eksempel dimerisering, binding til Fc-reseptorer eller evnen til å binde og aktivere komplement (se, for eksempel, Angal et al., Mol. Immunol, 30: 105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem, 269: 3469-3474 (1994), Winter et al., EP 307,434-B).

Et endret antistoff som er et kimært antistoff er forskjellig fra de humaniserte antistoffene beskrevet ovenfor ved å tilveiebringe de komplette ikke-humane donor-antistoff tung kjede og lett kjede variable regionene, inkludert struktur-regioner, i forbindelse med immunglobulin konstante regioner fra andre arter, foretrukket humane for begge kjedene.

Foretrukket benyttes de variable lette og/eller tunge kjede-sekvensene og CDR'ene for egnede donor-mAb'er, og deres kodende nukleinsyresekvenser, ved konstruksjon av endrede antistoffer, foretrukket humaniserte antistoffer, ved følgende fremgangsmåte. De samme eller lignende teknikker kan også anvendes for å frembringe andre utførelser.

Et hybridom som produserer et valgt donor-mAb klones konvensjonelt, og DNA'et for dets tunge og lette kjede variable regioner oppnås ved teknikker kjent for en fagmann innen feltet, for eksempel teknikkene beskrevet i Sambrook et al, ( Molecular Cloning ( A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). De variable tunge og lette regionene som i det minste inneholder de CDR-kodende regionene og de andelene av akseptor-mAb lett og/eller tung variabelt domene struktur-regionene som er nødvendige for å bibeholde donor-mAb bindingsspesifisitet, så vel som de gjenværende immunglobulin-avledede delene av antistoffkjeden avledet fra et humant immunglobulin oppnås ved anvendelse av polynukleotidprimere og revers transkriptase. De CDR-kodende regionene identifiseres ved anvendelse av en kjent database og ved sammenligning med andre antistoffer.

Et mus/humant kimært antistoff kan deretter fremstilles og analyseres med hensyn til bindingsevne. Et slikt kimært antistoff inneholder de fullstendige ikke- humane donor-antistoff VH og VL-regionene, i forbindelse med humane lg konstante regioner for begge kjeder.

Homologe rammeregioner fra en tung kjede variabel region fra et humant antistoff kan identifiseres ved anvendelse av datastyrte databaser, for eksempel KABAT®, og et humant antistoff med homologi til donor-antistoffet vil velges som akseptor-antistoffet. En egnet lett kjede variabel rammeregion kan konstrueres på lignende måte.

Et humanisert antistoff kan avledes fra det kimære antistoffet, eller foretrukket, fremstilles syntetisk ved å insertere donor-mAb CDR-kodende regioner fra de tunge og lette kjedene passende innenfor den valgte tunge og lett kjede rammen. Alternativt kan et humanisert antistoff fremstilles ved anvendelse av standard mutageneseteknikker. Det resulterende humaniserte antistoffet inneholder følgelig humane rammeregioner og donor-mAb CDR-kodende regioner. Det kan finne sted senere manipulering av rammerester. Det resulterende humaniserte antistoffet kan uttrykkes i rekombinante vertsceller, for eksempel COS, CHO eller myelomceller.

En konvensjonell ekspresjonsvektor eller rekombinant plasmid fremstilles ved å plassere disse kodende sekvensene for antistoffet i operativ forbindelse med konvensjonelle regulerende kontrollsekvenser i stand til å kontrollere replikasjon og ekspresjon i, og/eller sekresjon fra, en vertscelle. Regulatorsekvenser omfatter promotersekvenser, for eksempel CMV-promoter, og signalsekvenser, som kan avledes fra andre kjente antistoffer. På lignende måte kan det fremstilles en andre ekspresjonsvektor som har en DNA-sekvens som koder for et komplementært antistoff lett eller tung kjede. Foretrukket er denne andre ekspresjonsvektoren identisk med den første med unntak av hva angår de kodende sekvensene og selekterbare markørene, for å sørge for så vidt mulig at hver polypeptidkjede uttrykkes funksjonelt. Alternativt kan de kodende sekvensene for tung og lett kjede for det endrede antistoffet innehas på en enkelt vektor.

En utvalgt vertscelle ko-transfekteres ved bruk av konvensjonelle teknikker med både de første og andre vektorene (eller transfekteres helt enkelt med en enkelt vektor) for å danne den transfekterte vertscellen som omfatter både de rekombinante eller syntetiske lette og tunge kjedene. Den transfekterte cellen dyrkes deretter ved bruk av konvensjonelle teknikker for å fremstille det konstruerte antistoffet ifølge oppfinnelsen. Det humaniserte antistoffet som omfatter forbindelsen av både den rekombinante tunge kjede og/eller lette kjede screenes fra kultur ved egnet analyse, for eksempel ELISA eller RIA. Lignende konvensjonelle teknikker kan anvendes for å konstruere andre endrede antistoffer og molekyler.

Egnede vektorer for klonings- og subkloningstrinnene anvendt i metodene og konstruksjonen av sammensetningene kan velges av fagfolk innen feltet. For eksempel kan de konvensjonelle pUC-seriene av kloningsvektorer anvendes. En vektor, pUC19, er kommersielt tilgjengelig fra firmaer, for eksempel Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) eller Pharmacia (Uppsala, Sverige). Ytterligere kan enhver vektor som er i stand til å replikere uten vansker, har overflod av kloningsseter og selekterbare gener (for eksempel antibiotikaresistens), og som lett kan manipuleres, anvendes for kloning. Følgelig er ikke valg av kloningsvektoren en begrensende faktor.

På lignende måte kan vektorene anvendt for ekspresjon av antistoffene velges av fagfolk innen feltet fra hvilken som helst konvensjonell vektor. Vektorene inneholder også valgte regulatorsekvenser (for eksempel CMV-promoterer) som styrer replikasjon og ekspresjon av heterologe DNA-sekvenser i valgte vertsceller. Disse vektorene inneholder de ovenfor beskrevne DNA-sekvensene som koder for antistoffet eller endret immunglobulinkodende region. I tillegg kan vektorene inkorporere de valgte immunglobulinsekvensene modifisert ved insersjon av ønskelige restriksjonsseter for tilgjengelig manipulering.

Ekspresjonsvektorene kan også karakteriseres ved gener egnet for å amplifisere ekspresjon av de heterologe DNA-sekvensene, for eksempel det mammalske dihydrofolat reduktase-genet (DHFR). Andre foretrukne vektorsekvenser omfatter en poly A-signalsekvens, for eksempel fra bovint veksthormon (BGH) og betaglobin-promotersekvensen (betaglopro). Ekspresjonsvektorer nyttige her kan syntetiseres ved teknikker velkjente for fagfolk innen dette feltet.

Bestanddelene i slike vektorer, for eksempel replikon, seleksjonsgener, enhancere, promotere, signalsekvenser og lignende, kan oppnås fra kommersielle eller naturlige kilder eller syntetiseres ved kjente fremgangsmåter for å anvendes til å styre ekspresjonen og/eller sekresjonen av produktet av det rekombinante DNA i en valgt vert. Andre egnede ekspresjonsvektorer av hvilke mange typer er kjent innen fagfeltet for mammalsk, bakteriell, insekt, gjær og fungal ekspresjon kan også velges for dette formålet.

En cellelinje transfektert med et rekombinant plasmid inneholdende de kodende sekvensene for antistoffene eller endrede immunglobulinmolekyler derav er også beskrevet. Vertsceller nyttige for kloning og andre manipuleringer av disse kloningsvektorene er også standard. Imidlertid anvendes mest ønskelig celler fra forskjellige stammer av E. co//'for replikasjon av kloningsvektorene og andre trinn ved konstruksjonen av endrede antistoffer.

Egnede vertsceller eller cellelinjer for ekspresjon av antistoffet ifølge oppfinnelsen er foretrukket mammalske celler slik som NSO, Sp2/0, CHO, COS, en fibroblastcelle (for eksempel 3T3) og myelomceller, og mer foretrukket en CHO eller en myelomcelle. Humane celler kan anvendes, noe som følgelig setter molekylet i stand til å modifiseres med humane glykosyleringsmønstre. Alternativt kan andre eukaryote cellelinjer anvendes. Seleksjon av egnede mammalske vertsceller og metoder for transformasjon, dyrking, amplifisering, screening og produktproduksjon og rensing er tidligere kjent. Se, for eksempel, Sambrook et al., omtalt ovenfor.

Bakterieceller kan vise seg å være nyttige som vertsceller egnet for ekspresjon av rekombinante Fab (se for eksempel Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188

(1992)). På grunn av at proteiner uttrykt i bakterieceller har en tendens til å eksistere i ufoldet eller feilaktig foldet form eller i en ikke-glykosylert form, ville imidlertid ethvert rekombinant Fab som ble produsert i en bakteriecelle måtte screenes for bibeholdelse av antigenbindende evne. Dersom molekylet uttrykt av bakteriecellen ble produsert i riktig foldet form, ville denne bakteriecellen være en ønsket vert. For eksempel er forskjellige stammer av E. coli som anvendes for ekspresjon velkjente som vertsceller innen fagfeltet bioteknologi. Forskjellige stammer av B. subtilis, Streptomyces, andre bacilli og lignende kan også anvendes i denne fremgangsmåten.

Hvor ønsket er stammer av gjærceller kjent for fagfolk innen feltet også tilgjengelige som vertsceller, så vel som insektceller, for eksempel Drosophila og Lepidoptera og virale ekspresjonssystemer. Se, for eksempel Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) og referanser henvist til deri.

De generelle metodene ved hvilke vektorene kan konstrueres, transfeksjonsmetodene som er nødvendige for å fremstille vertscellene, og dyrkingsmetoder nødvendige for å fremstille det endrede antistoffet fra en slik vertscelle er alle standardteknikker. Likeledes kan antistoffene når de først er fremstilt, renses fra cellekulturinnholdene i henhold til standardmetoder innen fagfeltet, omfattende ammoniumsulfat-presipitering, affinitetskolonner, kolonnekromatografi, gelelektroforese og lignende. Slike teknikker er innenfor teknikkens stand. For eksempel er fremstilling av endrede antistoffer beskrevet i WO 99/58679 og WO 96/16990.

Atter en annen metode for ekspresjon av antistoffene kan anvende ekspresjon i et transgent dyr, slik som beskrevet i U.S. patent nr. 4.873.316. Dette angår et ekspresjonssystem som anvender dyrets kaseinpromoter som, når den er transgent inkorporert i et pattedyr, tillater hunnen å produsere det ønskede rekombinante proteinet i melken sin.

Når det først er uttrykt ved ønsket metode undersøkes deretter antistoffet for in wfro-aktivitet ved anvendelse av en egnet analyse. For øyeblikket anvendes standard ELISA-analyseformater for å vurdere kvalitativ og kvantitativ binding av antistoffet til MAG. I tillegg kan andre in wfro-analyser også anvendes for å validere nøytraliserende aktivitet før senere humane kliniske studier utført for å evaluere persistensen av antistoffet i kroppen til tross for de vanlige oppryddings ("clearance")-mekanismene.

De terapeutiske agensene kan administreres som et profylaktisk agens eller etter skade, eller som ønsket på annen måte. Dosen og varigheten av behandling står i forbindelse med den relative varigheten av molekylene i den humane sirkulasjonen, og kan tilpasses av fagfolk innen feltet avhengig av tilstanden som behandles og pasientens generelle helse.

Administrasjonsmetoden for det terapeutiske agenset kan være hvilken som helst egnet rute som leverer agenset til verten. Antagonistene og antistoffene, og farmasøytiske preparater er spesielt nyttige for parenteral administrering, dvs., subkutan, intramuskulær, intravenøs eller intranasal.

Terapeutiske agenser kan fremstilles som farmasøytiske preparater inneholdende en effektiv mengde av antagonisten eller antistoffet ifølge oppfinnelsen som en aktiv ingrediens i en farmasøytisk akseptabel bærer. I det profylaktiske agenset er en vandig suspensjon eller løsning inneholdende det konstruerte antistoffet, foretrukket bufret ved fysiologisk pH, i en form klar for injeksjon foretrukket. Preparatene for parenteral administrering vil vanligvis omfatte en løsning av antagonisten eller antistoffet ifølge oppfinnelsen eller en blanding derav oppløst i en farmasøytisk akseptabel bærer, foretrukket en vandig bærer. Mange forskjellige vandige bærer kan anvendes, for eksempel 0,9% saltoppløsning, 0,3% glysin og lignende. Disse løsningene er sterile og generelt fri for partikulært materiale. Disse løsningene kan steriliseres ved standard, velkjente steriliseringsteknikker (for eksempel filtrering). Preparatene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpestoffer etter behov for å komme nær opptil fysiologiske betingelser slik som pH-justerings-og bufringsmidler, osv. Konsentrasjonen av antagonisten eller antistoffet ifølge oppfinnelsen i slik farmasøytisk formulering kan variere mye, dvs., fra mindre enn omtrent 0,5%, vanligvis ved eller minst omtrent 1% til så mye som 15 eller 20% med hensyn til vekt og vil velges primært basert på væskevolumer, viskositeter, osv., i henhold til den bestemte administreringsmetoden som er valgt.

Et farmasøytisk preparatifølge oppfinnelsen for intramuskulær injeksjon kunne følgelig fremstilles til å inneholde 1 ml_ sterilt bufret vann, og mellom omtrent 1 ng til omtrent 100 mg, for eksempel omtrent 50 ng til omtrent 30 mg eller mer foretrukket, omtrent 5 mg til omtrent 25 mg, av en antagonist eller et antistoff ifølge oppfinnelsen. På lignende måte kunne et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen for intravenøs tilførsel fremstilles til å inneholde omtrent 250 ml steril Ringers løsning, og omtrent 1 til omtrent 30 og foretrukket 5 mg til omtrent 25 mg av et konstruert antistoff ifølge oppfinnelsen. Aktuelle metoder for fremstilling av parenteralt administrerbare preparater velkjente eller vil være tydelige for fagfolk innen feltet og er beskrevet i nærmere detaljer i, for eksempel, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Det er foretrukket at det terapeutiske midlet, når det er i et farmasøytisk preparat, er tilstede i enhets-doseringsformuleringer. Passende terapeutisk effektiv dose kan lett bestemmes av fagfolk innen feltet. For å behandle slag og andre nevrologiske sykdommer effektivt hos et menneske bør en dose på opptil 700 mg per 70 kg kroppsvekt av en antagonist eller et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse administreres parenteralt, foretrukket/'. v. eller/'. m. (intramuskulært). Slik dosering kan, om nødvendig, gjentas ved passende tidsintervaller valgt som hensiktsmessig av en lege.

Antistoffene beskrevet her kan lyofiliseres for lagring og rekonstitueres i en egnet bærer før anvendelse. Denne teknikken har blitt vist å være effektiv med konvensjonelle immunglobuliner og det kan anvendes lyofiliserings- og rekonstitusjonsteknikker kjent innen fagfeltet.

Eksempel 1 - Anti- MAG antistoff i slag- modell

Materialer og metoder

Anti- MAG monoklonalt antistoff

Anti-MAG monoklonalt antistoff var mus anti-kylling MAG antistoff MAB 1567 ervervet fra Chemicon. Antistoffet har følgende karakteristika: Antigen: myelin-assosiert glykoprotein (human, mus, rotte, kveg, kylling, frosk) Isotype: lgG1

Nøytraliserende evne: se DeBellard et al (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K og Lundborg G

(1997) Exp. Neurology. 150, 254-262.

Kontroll lgG1-mab ble anskaffet fra R+D Systems.

Intra- cerebral ventrikulærkanylering ( kun forstudie 1)

Under halotan-anestesi ble intra-cerebrale ventrikulære (i. c. v.) kanyler anbrakt i venstre lateral cerebral ventrikkel (koordinater: 1,6 mm fra midtlinjen, 0,8 mm kaudal fra bregma, 4,1 mm fra kranieoverflate, incisiv bar - 3,2 mm under null i henhold til Paxinos og Watson, 1986) Alle rotter ble oppstallet enkeltvis for å unngå skade på guide- eller dummy-kanylen. 7 dager etter kirurgi ble korrekt kanyleplassering bekreftet ved en intens drikkerespons til Angiotensin II (100 ng, Simpson, et al. 1978). Ni dager senere gjennomgikk dyrene cerebral iskemi.

Transient fokal cerebral iskemi

Transient (90 min) fokal cerebral iskemi ble indusert i hann Sprague Dawley rotter, som hver veide mellom 300-350 g. Dyrene ble initielt anestesert med en blanding av 5% halotan, 60% dinitrogenoksid og 30% oksygen, plassert på en ansiktsmaske og anestesi derpå opprettholdt ved 1,5% halotan. Middle cerebral arterie okklusjon (MCAO) ble utført ved anvendelse av "intraluminal thread"-teknikken som beskrevet tidligere (Zea Longa, et. al., 1989). Dyr ble opprettholdt normoterme gjennom hele den kirurgiske operasjonen, tillatt å rekonvalesere i 11 i en inkubator før de ble oppstallet enkeltvis. Bare de dyrene som hadde nevrologisk score på 3 1 t post-okklusjon ble tatt med i studiet (som vurdert ved anvendelse av et 5-poengs scoringssystem: 0, ingen defisitt; 1, kontralateral refleks; 2, svekket grep; 3, sirklende; 4, immobil; 5, død). Dyr ble livnært i opptil 1 uke ved hvilket tidspunkt dyr ble avlivet ved transkardial perfusjon med 0,9% saltoppløsning etterfulgt av 4% paraformaldehyd i 100 mM fosfatbuffer. Hjernene ble post-fiksert i 4% paraformaldehyd ved 4°C i 48 t ved hvilket tidspunkt de ble fjernet fra kraniene og kuttet i 2 mm blokker ved anvendelse av en rottehjerne-matrix. Snittene på 2 mm ble deretter innesluttet i parafin ved anvendelse av en Shandon Citadel 1000 vevs-prosessor, kuttet i 6 um snitt ved anvendelse av en mikrotom og montert på poly-L-lysin-overtrukkede slides. Snitt ble deretter bearbeidet for Cresyl Fast Violet (CFV)-farging.

Doseringsregime

Anti-MAG monoklonalt antistoff og mus lgG1 isotype kontrollantistoff ble dialysert mot sterilt 0,9 % natriumklorid over natten og konsentrert passende.

Studie 1: Dyr mottok 2,5 ug anti-MAGmab eller 2,5 ug mus IgG i.c.v. 1, 24 og 721 etter MCAO (5ul per dose).

Studie 2: Dyr mottak 200 ug anti-MAG mab eller 200 ug mus IgG i.v. 1 og 24 etter

MCAO.

Forsker var blindet med hensyn til identiteten av hver doseringsløsning.

Nevrologisk vurdering

Før indusering av cerebral iskemi fikk rotter for Studie 1 trening i "vandring på bom"- og "limbånd" ("sticky label")-test. Dyr som ikke nådde kriteriene i begge testene ble utelukket fra videre studie. Etter trening ble resten av dyrene delt inn i lag i henhold til yteevne i to balanserte grupper. Gjennom hele den nevrologiske vurderingen var forskerne blindet med hensyn til dyrets behandlingsgruppe.

Bilateral limbånd- test

Bilateral limbånd-test (Schallert et al., Pharmacology Biochemistry and Behaviour 16: 455-462, (1983)) ble anvendt for å vurdere kontralateral forsømmelse ("neglect")/ipsilateral bias. Dette viser taktil opphevelse observert hos humane slagpasienter (Rose, et al. 1994). Denne testen har blitt beskrevet i detalj tidligere (Hunter, et al., Neuropharmacology 39: 806-816 (2000); Virley et al Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20 : 563-582 (2000)). I korthet ble et rundt papir-limbånd anbragt fast rundt det hårløse området av forlabbene med likt trykk med system for plassering randomisert (venstre, høyre). Treningssesjoner ble gjennomført i 6 dager før MCAO, data fra dag 6 ble benyttet som den pre-operative baselinen (Dag 0). Dyr ble gitt to forsøk 24 og 7 dager etter MCAO, dataene representerer et gjennomsnitt for de to forsøkene. Latenstiden for å berøre og fjerne limbåndende ble registrert og analysert ved anvendelse av logrank-testen (Cox, J. Royal Statistical Society B 34: 187-220 (1972)).

Vandring på bom

Vandring på bom ble anvendt som et mål på koordinering av bakben og forben ved hjelp av avstand gått over en forhøyet 100 cm bom (2,3 cm diameter, 48 cm over gulvet) som tidligere beskrevet i detalj (Virley et al Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20: 563-582 (2000)). Rotter ble trenet til å krysse bommen fra begynnelse til slutt. For testing ble hver rotte gitt 2 forsøk 241 og 7d etter MCAO, dataene representerer middelverdier for de to forsøkene. Statistisk analyse var ANOVA fulgt av Students t-test.

Den 27- poengs nevrologiske scoren ( Studie- 1)

Dette studiet består av en serie tester for å vurdere nevrologisk status inkludert, plassering av labb, synlig strekking av forlabb, horisontal stang, kontralateral rotasjon, skråplan, opprettingsrefleks, kontralateral refleks, motilitet & generell tilstand, som beskrevet tidligere (Hunter, et al. Neuropharmacology 39 : 806-816 (2000)) med tillegg av målinger av gripestyrke (score 2 for godt grep på høyre forlabb,1 for svakt grep). Total score = 27 for normalt dyr.

For studie 2 ble testen ytterligere modifisert: Gripestyrke -normal score 3, god - 2, svak -1, svært svak - 0; Motilitet - normal score 4, utmerket - 3, svært god - 2, god -1, tydelig - 0; Generell tilstand - normal score 4, utmerket - 3, svært god - 2, god -1, tydelig - 0; Sirklende - ingen score 5, favoriserer en side score 4, stor sirkel - 3, medium sirkel - 2, liten sirkel -1, roterende -0). Total score = 32 for et normalt dyr.

I begge studiene ble dyr testet 1, 24, 481 og 7d etter MCAO, et friskt normalt dyr scorer henholdsvis 27 eller 32. Data er vist som medianverdier, Statistisk analysis var Kruskil Wallis ANOVA.

Lesjonsvurdering

Studie 1 - For hvert dyr ble lesjonsarealer vurdert i snitt fra tre forutbestemte nivåer i hjernen (0, -2,0 og -6,0 mm fra Bregma henholdsvis). Neuronal skade ble vurdert ved anvendelse av cresyl fast violet-farging og arealet av skaden målt ved anvendelse av en Optimas 6.1 imaging pakke. Data er uttrykt som gjennomsnittlig areal (mm<2>) ± sem.

Studie 2 - For hvert dyr ble lesjonsarealer vurdert i snitt fra sju forutbestemte plan i hjernen (+3 mm til -8 mm w.r.t. Bregma). Neuronal skade ble vurdert ved anvendelse av cresyl fast violet-farging og arealet av skaden målt ved anvendelse av en Optimas 6.1 imaging pakke. Data er uttrykt som gjennomsnittlig areal (mm<2>) ± sem.

Resultater

Studie 1 - Intra-cerebral ventrical (i. c. v.) administrering av anti-MAG mab Nevrologisk score

En time etter MCAO viste dyr i begge behandlingsgruppene tydelig svekkelse i nevrologisk score (median score 12 i hver gruppe). Det var ingen betydelig forskjell mellom gruppene på dette tidspunktet. 24 (p=0,02), 48 (p=0,005) t og 7 d (p=0,006) etter MCAO viste imidlertid dyr behandlet med anti-MAG mab (2,5 ug, 1, 24 og 721 etter MCAO), betydelig forbedret Total Nevrologisk score sammenlignet med de behandlet med kontroll-lgG. Median nevrologiske score 24, 48 t og 7dager etter MCAO i den lgG1-behandlede gruppen var henholdsvis 15, 14 og 18 sammenlignet med 19,5, 21,5 og 22 hos de anti-MAG mab behandlede dyrene. Ved videre analyse av de individuelle adferdene omfattende total score, ble denne betydelige forbedringen hovedsakelig tilskrevet forbedret yteevne i de følgende testene: plassering av labber (241, p=0,045; 48 t, p=0,016; 7 d, p=0,008), gripestyrke (24 t, p=0,049 48 t, p=0,0495; 7 d, p=0,243), motilitet (24 t, p=0,199; 48 t, p=0,012; 7 d, p=0,067), horisontal stang (24 t, p=0,065; 48 t, p=0,005; 7 d, p=0,016), skråplan (24 t, p=0,006; 48 t, p=0,006; 7 d, p=0,169), synlig strekking av forlabb (48 t, p=0,049, 7 d, p=0,049) og graden av sirkelbevegelse (24 t, p=0,417; 48 t, p=0,034; 7 d, p=0,183).

Vandring på bom

Før kirurgi ble alle dyrene trenet i å krysse bommen (100 cm).

Tjuefire timer etter kirurgi var det en betydelig svekkelse med hensyn til avstanden gått på bommen hos både anti-MAG (50±18 cm) og IgGi(22±14 cm)-behandlede dyr sammenlignet med pre-operative verdier. Selv om det ikke er signifikant viste anti-MAG-behandlede dyr tydelig forbedring overfor IgGrbehandlede dyr i at de gikk to ganger avstanden for IgG 1-behandlede dyr 241 etter MCAO. Sju dager etter kirurgi, mens begge gruppene viste tydelig forbedring over tid, forble imidlertid yteevnen for dyr behandlet med IgG betydelig svekket sammenlignet med baselinen (55±15 cm; p=0,005). I kontrast var imidlertid, 7 d etter MCAO, yteevne for dyr behandlet med anti-MAG mab (2,5 ug 1,24 og 721, i.c.v etter MCAO) ikke betydelig forskjellig fra baseline (75±15 cm; p=0,07). Disse dataene viser at anti-MAG mab-behandling fremskyndet rekonvalesens for denne bomvandringsoppgaven sammenlignet med IgGrbehandlede kontrollmus.

Limband

Før kirurgi berørte og fjernet dyr i hver av behandlingsgruppene raskt limbåndende fra hver forlabb, det var ingen betydelig forskjell i gruppene før behandling (Tabell 1). Tjuefire timer og 7 d etter MCAO forble latenstiden til å berøre den venstre labben i hver av behandlingsgruppene relativt uendret, mens den for den høyre var tydelig forøket. Imidlertid var det ingen signifikante forskjeller mellom fjerningstidene for anti-MAG og IgGrbehandlede dyr. 24 t etter MCAO var i tillegg latenstiden for fjerning fra både den venstre og den høyre forlabben forøket betydelig i begge behandlingsgruppene sammenlignet med baseline, imidlertid var, hos anti-MAG-behandlede dyr, latenstiden for fjerning fra den venstre labben signifikant kortere enn den for IgGrbehandlede dyr (p=0,03). Det var også en tendens til redusert latenstid for fjerning fra den høyre labben hos anti-MAG-behandlede dyr sammenlignet med de behandlet med IgGi(p=0,08) (Tabell 1). Ved 7 d var det noen grad av bedring i IgGrbehandlede dyr i det at latenstiden for fjerningstider for hver forlabb ble redusert sammenlignet med de ved 241 (Tabell 1). Dette dataet antyder at behandling av rotter med anti-MAG mab fremskyndet bedringen i denne limbånd-testen etter tMCAO.

Målinger av lesjonsareal

Administrering av anti-MAG mab i.c.v, reduserte lesjonsaralet betydelig i to av tre hjerneplan ("level") undersøkt sammenlignet med de dyrene som var behandlet med like mengder mus IgGinår undersøkt 7 dager etter tMCAO (Tabell 2).

Studie 2 - Intravenøs (i.v.) administrering

Nevrologisk score

En og 24 timer etter MCAO viste dyr i begge grupper tydelig svekkelse i nevrologisk score. Det var ingen signifikant forskjell mellom grupper på dette tidspunktet, median score 241 etter anti-MAG mab og IgGi-behandling var henholdsvis 20 og 18 (p=0,5). Førtiåtte timer etter MCAO viste dyr behandlet med anti-MAG mab (200 ug, i.v. 1 og 241 post-MCAO) signifikant forbedring i plassering av labb (p=0,048) og gripestyrke (p=0,033). Sju dager etter cerebral iskemi fortsatte dyr behandlet med anti-MAG mab å gjøre fremskritt (plassering av labb p=0,041; gripestyrke, p=0,048; motilitet, p=0,05) og viste signifikant forbedring i total nevrologisk score (median score 25) sammenlignet med de behandlet med mus IgGi(Median score 23, p=0,047).

Målinger av lesjonsareal

Når administrert i.v. MCAO reduserte anti-MAG antistoffet lesjonsareal signifikant ved 5 av 7 forutbestemte hjerneplan ("levels") (+3 til -8 mm w.r.t. Bregma) sammenlignet med isotype-kontroller, når undersøkt 7 d etter MCAO.

Konklusjoner

Et anti-MAG monoklonalt antistoff administrert enten direkte inn i CSF eller intravenøst etter transient middle-cerebral artery occlusion hos rotte, reduserte både arealet av celledød og forbedret funksjonell bedring sammenlignet med kontrollbehandlede dyr. Graden av neurobeskyttelse sett i disse studiene antyder at denne effekten ikke kan tilskrives axonal utvekst da dette ikke ville resultere i neuronal sparsommelighet. Forbedringen i funksjonell bedring sett 24 og 48 t etter MCAO reflekterer trolig graden av neurobeskyttelse som gis av dette antistoffet sammenlignet med kontrollbehandlede dyr. Imidlertid synes dyrene overtid å gjøre ytterligere fremskritt, noe som antyder at blokkering av MAG-aktivitet også kan fremme funksjonell bedring over tid.

Studiene presentert her tilveiebringer bevis på at blokkering av MAGs funksjoner gir både neurobeskyttelse og forøkt funksjonell bedring i en rottemodell for slag, og derfor tilveiebringer anti-MAG-antistoffer potensielle terapeutiske agenser for akutt neurobeskyttelse og/eller for å fremme funksjonsbedring etter slag. De lave mengdene av antistoff administrert via i.v-ruten og de resulterende lave serumnivåene av antistoffet ville i sin tur antyde svært lave antistoffkonsentrasjoner i hjernen på grunn av blod-hjernebarrierens restriksjoner for gjennomtrengning av antistoff. Overraskende resulterte dette imidlertid likevel i begge, neurobeskyttelse og forøkt funksjonsbedring ble observert. Anti-MAG antistoffer har også potensiell anvendelse for behandling av andre nevrologiske sykdommer hvor degenerering av celler og eller nervefibrer er tydelig slik som ryggmargskade, traumatisk hjerneskade, perifer neuropati, Alzheimers sykdom, fronto-temporal demens (tauopatier), Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og Multippel sklerose. I eksemplene som følger er CDR'ene for de kimære og humaniserte antistoffene fremlagt deri, CDR'ene for antistoffet ifølge eksempel 1.

Eksempel 2 - Kimært antistoff

Endrede antistoffer inkluderer kimære antistoffer som omfatter variable regioner avledet fra en art bundet til konstante regioner fra en annen art. Eksempler på mus-human kimære anti-MAG immunglobulinkjeder ifølge oppfinnelsen er gitt i Figurene 1, 2 og 3. Det kan fremstilles mus-humane kimærer som anvender human lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM, IgD konstante regioner, og også kimærer som forbinder de variable regionene fra mus med tung eller lett kjede konstante regioner fra ikke-humane arter. Figur 1 (SEKV ID NR. 27) gir aminosyresekvensen for en kimær immunglobulin tung kjede i hvilken den murine anti-MAG tung kjede variable regionen er forbundet med en funksjonell immunglobulin sekresjonssignalsekvens, og med en endret form av den humane lgG1 konstante regionen, i hvilken Kabat-restene 248 og 250 har blitt mutert til alanin i den hensikt å koble ut effektorfunksjonene for binding til FcyRI og komplementprotein C1q (Duncan, A. R. og Winter, G. Localization of the Clq binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A. R., Woolf, J. M., Partridge, L. J., Burton, D. R. og Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Slike mutasjoner fremstilles eventuelt for å skreddersy egenskapene for et endret antistoff for å oppnå en bestemt terapeutisk effekt - for eksempel binding til og blokkering av et antigens funksjon uten å aktivere lytiske effektormekanismer.

Figur 2 (SEKV ID NR. 28) tilveiebringer aminosyresekvensen for en kimær immunglobulin lett kjede i hvilken den murine anti-MAG lett kjede variable regionen er forbundet med en funksjonell immunglobulin sekresjonssignalsekvens, og med den humane kappa konstante regionen.

På lignende måte kan anti-MAG variable regioner forbindes med immunglobulin konstante regioner som mangler mutasjons-ødeleggende effektorfunksjoner. Figur 3 (SEKV ID NR. 29) fremsetter aminosyresekvensen for et kimært immunglobulin tung kjede i hvilken den murine anti-MAG tung kjede variable regionen er forbundet med en funksjonell immunglobulin sekresjonssignalsekvens, og med en villtype-form av den humane IgG 1-konstante regionen.

Fra informasjonen gitt i Figurene 1 til 3, kan cDNA-inserts som koder for disse kimære kjedene fremstilles ved standard molekylærbiologiteknikker som er velkjente for fagfolk innen feltet. I korthet anvendes den genetiske koden for å identifisere nukleotidkodoner som koder for de ønskede aminosyrene, og danne en virtuell cDNA-sekvens som koder for det kimære proteinet. Dersom det er ønsket at cDNA-insertene skal uttrykkes i en bestemt organisme, kan spesielt foretrukne kodon velges i henhold til kjent forkjærlighet med hensyn til kodonbruk. Den ønskede nukleotidsekvensen syntetiseres deretter ved hjelp av PCR-amplifisering av et templat omfattende overlappende syntetiske oligonukleotider som, som sammenhengende, representerer den ønskede sekvensen. Det resulterende produktet kan også modifiseres ved PCR eller mutagenese for å føye til restriksjonsseter for å lette kloning inn i et egnet plasmid for ekspresjon eller ytterligere manipuleringer.

Eksempel 3 - Kimære antistoffer binder til rotte- MAG i ELISA

Kimært anti-MAG antistoff som inneholder de lette og tunge kjede CDR'ene ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved transient transfeksjon av CHO-celler. Til dette ble Transfast transfeksjonsreagens (Promega; E2431) anvendt og transfeksjoner utført i henhold til fabrikantens instruksjoner. I korthet ble~10<6>CHO-celler platet ut per brønn i 6-brønners dyrkingsplater. Dagen etter ble mammalsk ekspresjonsvektor-DNA som koder for passende tung eller lett kjede blandet ved 1:1 ratio (5 ug totalt DNA) i medium (Optimeml med Glutamax; Gibco #51985-026). Transfast transfeksjonsreagens ble tilsatt og løsningen overført til brønner med konfluent cellelag. Etter 1 t ved 37°C i celleinkubatoren ble DNA/Transfast-blandingen dekket med 2 ml Optimem-medium og etterlatt i 48-721 i inkubatoren. Supernatanter ble høstet, renset ved sentrifugering og latt passere gjennom 0,2 um filtre. Antistoffkonsentrasjonen i CHO-cellekultursupernatanter ble bestemt ved ELISA og anslått til å være rundt 0,5Mg/ml. For MAG-binding ble kommersielt tilgjengelig rotte-MAG-Fc anvendt. På grunn av fusjonen med humant Fc kunne ikke bundne kimære antistoffer detekteres ved anvendelse av anti-humane IgG sekundære antistoffer. I stedet ble anti-human kappa lett kjede-spesifikke antistoffer anvendt. Figur 4 viser at dette kimære antistoffet binder til MAG selv ved 1/64-fortynning. Et ikke-relatert humanisert antistoff og kultursupernatant fra simulert ("mock")-transfekterte celler genererte ikke noe signal i denne analysen.

Fremgangsmåte:

ELISA mikrotiterplater (Nunc Maxisorp) ble overtrukket med 1 ug/ml rotte MAG-Fc-fusjonsprotein (R & D systems; 538-MG) i PBS ved 4°C over natten. Plater ble vasket to ganger med PBS og deretter blokkert med PBS/BSA (1% vekt/volum) i 1 t ved romtemperatur (RT). Kultursupernatanter fra transient transfekterte CHO-celler ble latt passere gjennom 0,2 um filtre og seriefortynnet i PBS/BSA ved å starte med ublandet supernatant til 1/64-fortynning. Prøvefortynninger ble etterlatt ved RT i 1 t. Plater ble deretter vasket tre ganger med PBS/Tween 20 (0,1% volum/volum). Deteksjonsantistoff var geit anti-human kappa lett kjede spesifikk-peroksidasekonjugat (Sigma A-7164) fortynnet til 1/2000 i PBS/BSA. Deteksjonsantistoffet ble inkubert i 1 t ved RT og platene vasket som ovenfor. Substratløsning (Sigma Fast OPD P-9187) ble tilsatt og inkubert inntil passende fargeutvikling ble detektert og deretter stoppet ved anvendelse av 3 M H2SO4. Fargeutvikling ble avlest ved 490nm.

Eksempel 4 - Humaniserte antistoffer

Endrede antistoffer inkluderer humaniserte antistoffer som omfatter humaniserte variable regioner bundet til humane konstante regioner. Eksempler på humaniserte anti-MAG immunglobulinkjeder ifølge oppfinnelsen er gitt i Figur 5. Det kan fremstilles humaniserte antistoffer ved anvendelse av human lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM, IgD konstante regioner. Figur 5 (SEKV ID NR: 30) gir et eksempel på aminosyresekvensen for en humanisert immunglobulin tung kjede i hvilken den humaniserte anti-MAG tung kjede variable regionen er forbundet med en funksjonell immunglobulin sekresjonssignalsekvens, og med en endret form av den humane lgG1 konstante regionen, i hvilken Kabat-restene 248 og 250 er mutert til alanin i den hensikt å koble ut effektorfuksjonene for binding til FcyRI og komplementprotein Clq (Duncan, A. R. og Winter, G. Localization of the Clq binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A. R., Woolf, J. M., Partridge, L.J., Burton, D. R. og Winter, G. Localisation of the binding site for human FcRI on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Slike mutasjoner fremstilles eventuelt i den hensikt å skreddersy egenskapene for et endret antistoff for å oppnå en bestemt terapeutisk effekt - for eksempel binding til og blokkering av funksjonen av et antigen uten å aktivere lytiske effektormekanismer. Figur 5 (SEKV ID NR. 31) gir også et eksempel på aminosyresekvensen for en humanisert immunglobulin lett kjede i hvilken den humaniserte anti-MAG lett kjede variable regionen er forbundet med en funksjonell immunglobulin sekresjonssignalsekvens, og med den humane kappa konstante regionen.

På lignende måte kan anti-MAG variable regioner forbindes med immunglobulin konstante regioner som mangler mutasjonsødeleggende effektorfunksjoner. Figur 5 (SEKV ID NR. 32) fremsetter aminosyresekvensen for en humanisert immunglobulin tung kjede i hvilken den humaniserte anti-MAG tung kjede variable regionen er forbundet med en funksjonell immunglobulin sekresjonssignalsekvens, og med en villtypeform av den humane lgG1 konstante regionen.

Fra informasjonen gitt i Figur 5 kan cDNA-insert som koder for disse humaniserte kjedene fremstilles ved standard molekylærbiologiske teknikker velkjente for fagfolk innen feltet. I korthet anvendes den genetiske koden for å identifisere nukleotidkodoner som koder for de ønskede aminosyrene, og danne en reell cDNA-sekvens som koder for proteinet. Hvis det er ønsket at cDNA-insertet skal uttrykkes i en bestemt organisme kan spesielt foretrukne kodon velges i henhold til kjent forkjærlighet med hensyn til kodonbruk. Den ønskede nukleotidsekvensen syntetiseres deretter ved hjelp av PCR-amplifisering av et templat omfattende overlappende syntetiske oligonukleotider som, som sammenhengende, representerer den ønskede sekvensen. Det resulterende produktet kan også modifiseres ved PCR eller mutagenese for å føye til restriksjonsseter for å lette kloning inn i et egnet plasmid for ekspresjon eller ytterligere manipuleringer

Eksempel 5 : Humaniserte anti- MAG antistoffer binder til rotte og human MAG i Elisa

1) Direkte bindings- ELISA til rotte MAG- Fc fusjonsprotein av normaliserte mengder av kultursupernatant for 9 humaniserte tung og lett kjede-kombinasjoner

Humaniserte anti-MAG antistoffer som inneholder lett og tung kjede komplementær-bestemmende regioner (CDR) ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved transient transfeksjon av CHO-celler. Til dette ble Transfast transfeksjonsreagens (Promega; E2431) anvendt og transfeksjoner ble utført i henhold til fabrikantens instruksjoner. I korthet ble~10<6>CHO-celler platet ut per brønn i 6-brønners dyrkingsplater. Dagen etter ble mammalsk ekspresjonsvektor-DNA som koder for passende tung eller lett kjede blandet ved 1:1 ratio (5 ug totalt DNA) i medium (Optimeml med Glutamax; Gibco #51985-026). Transfast transfeksjonsreagens ble tilsatt og løsningen overført til brønner med konfluent cellelag. Etter 1 t ved 37°C i celleinkubatoren ble DNA/Transfast-blandingen dekket med 2 ml Optimem-medium og etterlatt i 48-721 i inkubatoren. Supernatanter ble høstet, renset ved sentrifugering og latt passere gjennom 0,2 um filtre. 9 kombinasjoner av tung og lett kjede ble fremstilt fra sekvensene vist i tabellen nedenfor og lgG1 tung kjede konstant regioner var funksjonelle i henhold til Sekv. ID.

Antistoffkonsentrasjon ble bestemt ved ELISA og mengdene av supernatant anvendt

i analysen ble normalisert til en startkonsentrasjon på 250 eller 500 ng/ml (avhengig av konsentrasjon av kultursupernatant). Som antigen ble det anvendt kommersielt tilgjengelig rotte-MAG-Fc (R&D Systems; 538-MG). På grunn av fusjon av dette antigenet med humant Fc, kunne bundne kimære antistoffer ikke detekteres ved anvendelse av generelle anti-human IgG sekundære antistoffer. I stedet ble det anvendt anti-human kappa lett kjede-spesifikt antistoff. Figur 6 viser at alle 9 humaniserte antistoffene undersøkt her binder til rotte-MAG med svært like bindingskurver ned til~4 ng/ml. Det kimære antistoffet benyttet som referanse viste bindingsegenskaper som faller inn under gruppen av humaniserte antistoffer undersøkt her. Selv om det ikke er absolutt, kan dette antyde at affinitetene for de humaniserte antistoffene undersøkt her ligger svært nær innenfor affinitetsområdet for det ikke-humaniserte kimære antistoffet anvendt her som en referanse.

Fremgangsmåte

96-brønners Nunc Maxisorp-plater ble overtrukket over natten ved 4°C med rotte-MAG-Fc-fusjonsprotein (1 ug/ml; R&D Systems; Cat. No. 538-MG) i PBS. Plater ble vasket to ganger med PBS inneholdende Tween20 (0,1% volum/volum; PBST) og blokkert med PBS inneholdende BSA (1% vekt/volum) i 1 t ved romtemperatur (RT). Variable mengder av kultursupernatanter ble seriefortynnet i blokkeringsbuffer og tilsatt til de blokkerte brønnene ved å starte ved omtrent 500 eller 250 ng/ml. Antistoffkonsentrasjoner for supernatanter var basert på uavhengige analyser som måler mengden av humanisert antistoff tilstede i hver kultursupernatant. Kimært mus-human (ikke-humaniserte) antistoff ble også tatt med som referanse. Antistoffprøver ble inkubert 11 ved RT og plater ble deretter vasket 3x med PBST. Sekundært antistoff (geit anti-human lett kjede spesifikk-peroksidasekonjugat; Sigma A-7164) ble tilsatt fortynnet 1/5000 i blokkeringsbuffer og inkubert i 1 t ved RT. Brønner ble vasket tre ganger som ovenfor og binding detektert ved å tilsette substrat (OPD-tabletter oppløst i henhold til instruksjoner; Sigma P-9187). Fargeutvikling ble registrert og reaksjonen ble stoppet ved anvendelse av 3 M H2SO4. Fargeutvikling ble avlest ved 490 nm.

2) Direkte binding-ELISA til rotte-MAG-Fc fusjonsprotein av to rensede humaniserte anti-MAG antistoff tung-lett kjede-kombinasjoner

To humaniserte antistoffer bestående av kombinasjoner av tung og lett kjede variable regioner BVh1/CVI1 og BVh3/CVI3 (tabell figur 5) og en mutert lgG1 konstant region som eksemplifisert ved SEKV. I.D. NR: 30 (som er BVM/CVI1 -mutert lgG1, fagfolk innen feltet kan uten problemer avlede sekvensen for BVh3/CVI3-ekvivalensen) ble fremstilt ved en oppskalert versjon av den transiente transfeksjonen beskrevet i eksempel 3 og renset ved anvendelse av protein A affinitetskromatografi. Renset antistoffmateriale ble dialysert mot PBS og konsentrasjonen ble bestemt ved måling av OD280. Antistoffkonsentrasjoner ble justert til 5000 ng/ml og anvendt som seriefortynninger i en rotte-MAG-Fc binding ELISA. Figur 7 viser at renset antistoffmateriale binder rotte-MAG-Fc og at begge tung og lett kjede variabel region-kombinasjoner testet her er svært like.

Metode:

96-brønners Nunc Maxisorp-plater ble overtrukket over natten ved 4°C med rotte MAG-Fc fusjonsprotein (2,5 ug/ml; R&D Systems; Cat. No. 538-MG) i PBS. Plater ble vasket to ganger med PBS inneholdende Tween20 (0,1% volum/volum; PBST) og blokkert med PBS inneholdende BSA (1% vekt/volum) i 1 t ved romtemperatur (RT). Renset humanisert antistoff ble justert til en startkonsentrasjon på 5 ug/ml i blokkeringsbuffer og deretter seriefortynnet. Antistoffprøver ble inkubert 1 t ved RT og plater ble deretter vasket 3x med PBST. Sekundært antistoff (Geit anti-human lett kjede spesifikk-peroksidasekonjugat; Sigma A-7164) ble tilsatt fortynnet 1/5000 i blokkeringsbuffer og inkubert i 1 t ved RT. Brønner ble vasket tre ganger som ovenfor og binding detektert ved å tilsette substrat (OPD-tabletter oppløst i henhold til instruksjoner; Sigma P-9187). Fargeutvikling ble registrert og reaksjonen ble stoppet ved anvendelse av 3M H2SO4. Fargeutvikling ble målt ved 490 nm.

Resultater:

Begg humaniserte antistoffer som bærer ingen eller flere struktur-mutasjoner viste svært lik binding til rotte-MAG. Resultatene er vist i Figur 7.

3) Binding til human MAG uttrykt på CHO- celler av normaliserte mengder av kultursupernatant for to humaniserte tung og lett kjede-kombinasjoner

De samme humaniserte variable tung og lett kjede-kombinasjonene som beskrevet i eksempel 5 2) ble testet som rensede kultursupernatanter mot human MAG uttrykt på overflaten av CHO-celler. Mengden av kultursupernatant anvendt for hvert antistoff ble normalisert basert på antistoffkonsentrasjoner bestemt ved ELISA. Til dette ble 96-brønners plater (Nunc Maxisorp) overtrukket over natten ved 4°C med geit anti-human IgG (gamma)-kjede (Sigma 1-3382; i bikarbonatbuffer pH 9,6; 2 ug/ml). Dagen etter ble plater vasket to ganger med vaskebuffer (PBST) og blokkert ved å tilsette minst 75 ul blokkeringsbuffer (PBS inneholdende BSA 1 % vekt/volum) i 1 t ved RT. Løsningen av antistoff-prøve ble seriefortynnet i blokkeringsbuffer (startfortynning ublandet eller 1/2) i duplikat. Ab standard var renset humanisert IgG 1-antistoff med en ikke-relatert spesifisitet og kjent konsentrasjon. Standardløsningen ble ogå seriefortynnet over plate med start ved 500 ng/ml. Alle antistoffløsninger ble inkubert i 1 t ved RT. Plater ble vasket 3x som ovenfor og deretter inkubert med geit anti-human lett (kappa) kjede spesifikk (fri og bundet) peroksidasekonjugat (Sigma; A-7164) ved 1/5000 i blokkeringsbuffer i 11 @ RT. Plater ble igjen vasket 3x som ovenfor og inkubert med substratløsning (OPD-tabletter; Sigma P-9187) inntil sterk fargeutvikling. Fargeutvikling ble stoppet ved å tilsette 25 ul 3M H2SO4og platen ble avlest ved 490 nm.

Figur 8 viser at begge antistoffene testet her gjenkjenner human MAG og er svært like i sine bindingsegenskaper. CHO/- er negative kontroller for CHO-celler med ingen MAG uttrykt.

Metode for Eu cellebasert ELISA

96-brønners plater (Costar 3595) ble fylt med 100 ul cellesuspensjon/brønn (se tabell nedenfor for anbefalt celletall for utførelse av analyse på dagene 1,2,3 eller 4). Dag celletall/ml

1 3x105

~2 1 x 105

~3 5x104

~4I 1 x 104

Kulturmedium ble fjernet og plater ble blokkert med DMEM/F12 (Sigma D6421) inneholdende FCS (10%), BSA (1%), NaN3 (1%; blokkeringsbuffer) i 1 time ved RT. Blokkeringsløsning ble deretter fjernet og prøve ble tilsatt (i blokkeringsbuffer 50 ul/brønn). Inkuberte prøver ved 4°C i 1 t. Plater ble deretter vasket 3x med PBS ved anvendelse av en Skatron platevasker. Etter vasking ble cellene fiksert med 0,5% paraformaldehyd (fortynnet i PBS) i 20 minutter ved 4°C og vasket igjen som ovenfor. 50 pl/brønn Europium-konjugert sekundært antistoff fortynnet i Europium buffer (50 mM Tris base, 150 mM NaCI, 0,5% BSA, 0,1 g/l, Tween 20, 7,86 mg/l DTPA ved pH 7,3) ble tilsatt og inkubert i 1 t ved 4°C.

Vasket plater som ovenfor og tilsatte 200 ul "Delphia enhancement solutionVbrønn. Inkuberte løsning ved RT i 5-10 minutter. Brønner ble avlest innen 24 timer på en Victor. 4) Konkurrerende ELISA for binding til rotte MAG- Fc- fusjonsprotein av to rensede humaniserte antistoffer og det ikke- humaniserte mus monoklonale antistoffet

Metode:

96-brønners Nunc Maxisorp-plater ble overtrukket over natten ved 4°C med rotte-MAG-Fc fusjonsprotein (2,5 ug/ml; R&D Systems; Cat. No. 538-MG) i PBS. Plater ble vasket to ganger med PBS inneholdende Tween20 (0,1% volum/volum; PBST) og blokkert med PBS inneholdende BSA (1% vekt/volum) i 1 t ved romtemperatur (RT). Renset humanisert antistoff ble justert til en konsentrasjon på 200 ng/ml og blandet ved likt volum med konkurrerent-molekyler representert i blokkeringsbuffer som spenner fra 6000 til 0 ng/ml. Konkurrent-molekyler var enten parental mus monoklonalt antistoff (anti-MAG) eller et urelatert mus monoklonalt antistoff (INN1) ved de samme konsentrasjonene (kun BVh1/CVI1). Antistoff/konkurrent-løsninger ble inkubert 1 t ved RT og plater ble deretter vasket 3x med PBST. Sekundært antistoff (geit anti-human lett kjede spesifikk-peroksidasekonjugat; Sigma A-7164) ble tilsatt fortynnet 1/5000 i blokkeringsbuffer og inkubert i 1 t ved RT. Brønner ble vasket tre ganger som ovenfor og binding detektert ved å tilsette substrat (OPD-tabletter oppløst i henhold til instruksjoner; Sigma P-9187). Fargeutvikling ble målt ved 490 nm.

Resultater:

Begge rensede antistoffpreparater er i like stor grad konkurrert av det opprinnelige mus monoklonale antistoffet men ikke av et mus monoklonalt antistoff som har en urelatert spesifisitet - se Figur 9. Dette viser at det opprinnelige mus monoklonale antistoffet og de humaniserte antistoffene testet her trolig gjenkjenner den samme epitopen og de har trolig svært like affiniteter til rotte-MAG.

Claims

1. Humanisert anti-MAG antistoff som binder til og nøytraliserer MAG,karakterisert vedat det omfatter et tung kjede variabelt domene valgt fra gruppen som består av: SEKV ID Nr. 13, SEKV ID Nr. 14 og SEKV ID Nr. 15, og et lett kjede variabelt domene valgt fra gruppen som består av: SEKV ID Nr. 16, SEKV ID Nr. 17, SEKV ID Nr. 18 og SEKV ID Nr. 19.

2. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 1, som videre omfatter en konstant del eller fragment derav av en human lett kjede og en konstant del eller fragment derav av en human tung kjede.

3. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 1 eller 2, hvor tung kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 13.

4. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 1 eller 2, hvor tung kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 14.

5. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 1 eller 2, hvor tung kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 15.

6. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 3 til 5, hvor lett kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 16.

7. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 3 til 5, hvor lett kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 17.

8. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 3 til 5, hvor lett kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 18.

9. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 3 til 5, hvor lett kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 19.

10. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 1, hvor tung kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 13 og lett kjede variabelt domenet er SEKV ID Nr. 16.

11. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det omfatter et humanisert anti-MAG antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 10, sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

12. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 10, for behandling eller profylakse av slag og nevrologiske sykdommer/lidelser.

13. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 12, for å hemme neurodegenerasjon og/eller fremme funksjonell bedring hos et menneske som lider av, eller med risiko for å utvikle, slag eller nevrologisk sykdom/lidelse.

14. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 12 eller 13, hvor antistoffet administeres parenteralt.

15. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 14, hvor antistoffet administeres intravenøst.

16. Humanisert anti-MAG antistoff ifølge krav 12 eller 13, hvor den nevrologiske sykdommen/lidelsen er valgt fra gruppen bestående av: traumatisk hjerneskade, ryggmarg, Alzheimers sykdom, fronto-temporal demens (tauopatier), perifer nevropati, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og multippel sklerose.