NO762586L - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et hepatitis

B immunglobulin.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av

et nytt gammaglobulin og mer spesielt en fremgangsmåte til fremstilling av et nytt spesifikt hyperimmunt gammaglobulin betegnet hepatitis B immunglobulin.

Siden dets. første rapporterte bruk i 1945 av Neefe, J.R., og Stokes, J.Jr. i "Journal of the American Medical Associ-ation", 145, 128, 1063, har nesten alle normale immunglobulinpreparater for mennesker hatt verdi i profylaksen av hepatitis ty-e A. Normalglobulin har blitt anbefalt for rutinebruk for hindring av sekundære tilfeller blant utsatte hustandskontakter. Bare tilfeldige partier har vist seg å ha en effektivitet under standard for dette formål.

Verdien av slike normale globulinpreparater har derimot for profylakse av hapatitis B virus (HBV)-infeksjon lenge vært et spørsmål. Se f.eks. Mosley, J.W., Galabos, J.T. "Diseases of the Liver" (utgitt av L. Schiff); side 410, Philadelphia, 1969 og National Academy og Sciences - "National Research Council Comittee on Viral Hepatitis", Morbidity and Mortality Weekly Report, 1972, 21, 133. De forskjellige konklusjoner fra de forskjellige undersøkelser av effektivitet til normale glubulinpreparater for hindring av hepatitis type B, kan ha resultert fra en rekke faktorer, inkludert variasjoner i konsentrasjonen av spesifikke antilegemer (anti-HBg) i de benyttede partier, og diagnoseupå-litelighet ved studier forut for testing av hapatitis B overflate-antigen (HB2Ag). Det er imidlertid bred enighet om at effektiv propylakse med normalglobulin er for utstadig til å berettige en anbefaling at det kan anvendes i forsøk på å hindre type B-sykdom.

Den spesifikke evne til å diagnostisere type B hepatitis frembragte den erkjennelse at fortsatt nær kontakt med bærere, kan resultere i en overføring innenfor husstanden, og dette har enda mer ansporet interessen for' oppnåelse av et immunoglobulin som effektivt kunne immunsiére mot B-typen av

sykdommen.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes derfor et slikt materiale samt en fremgangsmåte til dets fremstilling og anvendelse av materiale for immunisering av mottagelige verter.

Det nye anti-HBg immungammaglobulin ifølge oppfinnelsen er rent og er vesentlig fritt for fibrinogen, 19 S globulin, plasminogen og lipider. Det fremstilles fra menneskeplasma inneholdende fortrinnsvis en høy titer av det antilegemet. En fagmann kan lett identifisere og oppnå et slikt plasma som utgangsmater-iale. Som kjent inneholder mennesekplasma mange komponenter slik som albumin, plasminogen, alfa-, beta- og gammeglobuliner og forskjellige lipider. Fraksjonen av et slikt materiale for oppnåelse av den ønskede komponent ifølge oppfinnelsen , er avhengig av opp-løseligheten av forskjellige komponenter i plasmaet ved forskjellige trinn og under forskjellige betingelser.

Ved hvert trinn i fraksjoneringen bestemmes separer-ingen av fraksjonen og den sluttlige fjerning av de komponenter som er uønsket i anti-HBs~globulinet ut fra nøye kontroll av pH-verdi, temperatur, konsentrasjon av utfellingsmidlet og system-ets ionestyrke. Oppfinnelsen anvender derfor en rekke trinn,for å bevirke fjerning av de komponenter som er uønsket via reguler-ing av betingelser som forandrer oppløseligheten til disse

komponenter.

Forskjellige organiske oppløsningsmidler med lav dielektrisk konstant slik som ketoner og alkoholer, utfeller pro-teiner og har blitt benyttet ved fraksjonering av plasma. Det organiske oppløsningsmiddel som anvendes ved foreliggende fremgangsmåte er fortrinnsvis metanol, skjønt andre lavere alkanoler. slik som etanol go propanol kan anvendes. Evnen til å opprett-holde de kritiske ionestyrker ved de forskjellige trinn i fraksjoneringen, lettes ved bruk av metanol. Når andre oppløsnings-midler anvendes, vil det forta passende forandringer i prosess-betingelser ettersom de påvirker oppløseligheten.

For å hindre denaturering av proteinene under fraksjonering, utføres utfelling ved lave temperaturer. Siden pro-teinoppløselighet er temperaturavhengig, bør den valgte temperatur i hvert trinn av fraksjoneringer, av økonomiske grunner, være den lavest mulige som tillater den ønskede separering for å hindre denaturering.

Under henvisning til det medfølgende flytskjema forløper fraksjoneringen fra hel menneskeplasma. Plasmaet av-kjøles til ca. 0-5°C og sentrifugeres deretter for å separere et kaldt uoppløselig bunnfall fra en ovenstående væske (supernatant). Den ovenstående væske blir ytterligere fraksjonert for oppnåelse av bunnfall I og ovenstående væske I.. Bunnfall I som består hovedsakelig av fibrinogen kasseres. Ovenstående væske I frak-sjoneres ytterligere for dannelse av ovenstående væske II + III og bunnfall II + III. Ovenstående væske II + III, som kasseres, inneholder alfa- og betaglobulin og lipider. Bunnfall II + III består hovedsakelig av beta- og gammaglobuliner og isoagglutininer, men inneholder også protrombin, plasminogen, kolesterol og andre lipider.. Bunnfall II + III gir ved videre fraksjonering ovenstående væske II + III W og bunnfall II + III W. Betaglobulinet, kolesterol og andre lipider er hovedsakelig fjernet i ovenstående væske II + III W som kasseres. Bunnfall II + III W består hovedsakelig av gammaglobuliner, isoaalutininer, plasminogen og protrombin og noe betaglobulin, kolesterol og andre lipider. Ved ytterligere fraksjonering gir bunnfall II + III W ovenstående væske II + bunnfall III. Bunnfall III som kasseres, inneholder isoagglutininer, plasminogen og protrombin. Ovenstående væske III består hovedsakelig av gammaglobuliner og mindre mengder fibrinogen og lipider. Det sluttlige trinn i fraksjoneringen gir bunnfall II som er hovedsakelig rent anti-HBs-immungammeglobulin nesten helt fritt for 19 S globulin, plasminogen og lipider.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til følgende eksempel.

Eksempel 1

Menneskeplasma med en anti-HBg-titer på ca. 6000, avkjøles til 1°+ 1°C. Plasmaet sentrifugeres i en Sharples Supersentrifuge med en 3-ving-kule, ved 1° + 1°C med mating i en mengde på 1000 + 50 ml pr. minutt. Det kalde uoppløselige bunnfall kasseres. pH-verdien til. den ovenstående væske innstilles til 7,2 + 0,2. Metanolinnholdet i forsøksmassen bringes til 10,7 + 0,1% (vol/vol.) ved tilsetning av 177 ml 71% (vol/vol.) metanol pr. 1 plasma. Oppløsningen omrøres langsomt ved -5° + 0,5°C i 1 time og holdes ved -5° + 0,5°C natten over. Oppløsningen sentrifugeres i en Sharples Supersentrifuge med en 3-ving-kule ved -5° + 0,5°C, med mating i en mengde på 1000 + 100 ml pr. min. Den ovenstående væske I oppsamles i en kule forsynt med kjølean-anordning.

Til hver liter ovenstående væske I tilsettes, under avkjøling, 601 ml 71% (vol./vol.) metanol, 0,88 ml 10N eddiksyre og 0,44 ml 4N natriumacetat. Dette bringer metanolkonsentrasjon-en til 33,3%, ionestyrken til 0,086 gi./l og pH-verdien til 6,9. Oppløsningen bringes til en temperatur på -5° + 0,5°C og omrør-ing foretas langsomt i 2 timer. Oppløsningen hensettes deretter ved -5,5° + 0,5°C i 16 timer.

Oppløsningen sentrifugeres i en Sharples Supersentrifuge ved en 3-ving-kule ved -5° + 0,5°C ved en matemengde på 1000 ml +.100 ml/min. Bunnfall II + III fjernes fra kulen, veies.og lagres ved en temperatur på -20°C.

Ved opprettholdelse av en temperatur på 0°C suspenderes bunnfall II + III i 2 volumer (2 ganger den opprinnelige vekt av bunnfall II + III) vann ved 0°C i likevekt med is, ved å oppdele pasta med en spatel av rustfritt stål i en beholder av rustfritt stål og omrøring inntil suspensjonen er ensartet. 3 volumer (3 ganger den opprinnelige vekt av bunnfall II + III) av 0,0187 M dinatriumfosfatoppløsning tilsettes til suspensjonen under omrøring,'20 volumer (20 ganger den opprinnelige vekt av bunnfall II + III) av vann ved 0°C tilsettes og omrøring ved.0°C fortsettes i 30-60 min. pH-verdien er 7,2 + 0,2. For oppnåelse av en metanolandel på 26,7 + 0,2%, tilsettes 15 volumer (15 ganger den opprinnelige vekt av bunnfall II + III) av en 71% (vol./vol.) metanol ved -10°C. Ionestyrken til oppløsningen er 0,0052 + 0,0005 gi./liter.

Oppløsningen bringes til en temperatur på -5°C og sentrifugeres i Sharples Supersentrifugen med en 3-ving-kule ved en temperatur på -5,5 + 0,5°C ved en matningsmengde på 500 + 50 ml/min. Bunnfall II + III W fjernes fra kulen og veies.

Bunnfall II +.III W suspenderes i 2 volumer (2 ganger vekten av bunnfall II + III W) av isvann. Til suspensjonen tilsettes 2 volumer (2 ganger vekten av bunnfall II + III W) av 0,175 M natriumacetat. Ytterligere 1 volum (1 ganger vekten av bunnfall II + III W) av isvann inneholdende 0,216 ml acetatbuffer for hvert gram bunnfall II + III W-pasta tilsettes. Acetatbufferen fremstilles ved fortynning av 40 ml 10N eddiksyre og 20 ml 4N natriumacetat til 100 ml med destillert vann. pH-verdien til oppløsningen er 5,2 + 0,2. Oppløsningen omrøres langsomt i 1 time. Deretter tilsettes 13,5 volumer ('13,5 ganger den opprinnelige vekt av bunnfall II + III W) av isvann og 8\66 volumer (8,66 ganger den opprinnelige vekt av bunnfall II + III W) av 71% (vol./vol.) metanol under opprettholdelse av temperaturen ved -6°+ 0,5°C. Oppløsningen omrøres langsomt i 1 time og hensettes natten over. Oppløsningen inneholder 22,7% metanol og har en pH-verdi på 5,2 og en ionestyrke på 0,015 gi./l.

Oppløsningen sentrifugeres i en Sharples Supersentrifuge med en 3-ving-kule ved en temperatur på -6° + 0,5°C og en matningsmengde på 500 + 50 ml/min. Volumet av ovenstående væske III måles. Bunnfall III kasseres.

Ovenstående væske III behandles med 0,4% vekt/vol. "Celite 512" og omrøres i 20 min. Blandingen filtreres gjennom en Eitel-filterpresse inneholdende "D-8"-filterputer.

En acetatbuffer med pH-verdi på 5,2 lages som følger: 25 ml 4N natriumacetat og 3 ml 10N eddiksyre lages opp til 100 ml

med destillert vann. Acetatbufferen fortynnes 100 ganger med 22,7% metanol i Denne oppløsning har en ionestyrke på 0,01 gi./l. En Eitel-filterpresse forbelagt med acetatbufferen pluss "Celite 512" (0,5 g/tomme 2 puteoverflate) under anvendelse av 40 ml acet-at-metanolbuffer/tomme 2 puteoverflate. Ovenstående væske III

filtreres og til filtratet tilsettes 50 millimol (2,923 g) natri-umklorid og 7,65 ml IM natriumbikarbonat pr. liter filtrert ovenstående væske III. pH-verdien til filtratet er 7,2 +0,2.

Til filtratet tilsettes 160 volumdeler 100% metanol ved en temperatur under -5°C. Blandingen omrøres langsomt i 1 time ved en, temperatur på -6,5° + 0,5°C. Blandingen hensettes natten over.

Oppløsningen sentrifugeres i en Sharples Supersentrifuge med en 3-ving-kule, ved en temperatur på -6° + 0,5°C og en matemengde på 500 + 50 ml/min. Den ovenstående væske kasseres.

Bunnfallet II fjernes, suspenderes i 4 volumer isvann og frysetørkes. Det frysetørkede pulver veies og lagres ved en temperatur på -5°C.

Bunnfall II som fremstilt i dette eksempel er 99% rent anti-HBs-immungammaglobulin fritt for plasminogen, fibrinogen, lipider og 19 S globuliner.

Eksempel II

To menneskeimmunglobuliner ble fremstilt som 13,5

+ 1,5 g/dl oppløsninger ved bruk av metoderi4 i eks. I. Menneskeplasma-utgangsmateriale ble avledet fra plasmaenheter som man visste inneholdt anti-HBg i moderate til høye titere, ved pass-

iv hemagglutinering. Kontrollglobulinet ble avledet fra plasmaenheter hvor man ikke kunne påvise noe anti-HBg ved passiv hemagglutinering. Begge immunglobulinpreparater ble fordelt som 5 ml volumer i identiske, enkeltdoseprøverør podet med en til-feldig valgt to-sifferbetegnelse. Begge preparater tilfreds-stilte alle anvendelige standarder for "immunglobulin (menneske)" til Bureau of Biologics, Food and Drud Administration, U.S. Depart-ment of Health, Education and Welfare. Hepatitis B immunglobulinet innehold 442 yg av spesifikt anti-HB2/ml ved en kvantitativ fast-fase-radioimmunoprøve. Dets anti-HBg-titer ved passiv hemggluti-nering var 1-200.000 og 1-150.000, respektivt, mot celler belagt med HBgAg-subtyper adw og ayw.

I løpet av 29 måneders perioden fra july 1972 til desember 1974, ble 96 menneske-stamidivider identifisert til å ha ictiritisk hepatitis med symptomer, tegn og laboratoriefunn samm-enlignbare med akutt viral hepatitis og en positiv test for HBgAg bekreftet ved subtypebestemmelse eller spesifisitet. I løpet av denne periode hadde disse individer et totale på 100 seksual-partnere med hvilke de levde i løpet av perioden som omfattet 2 uker til 2 måneder før sykdomsutbrudd. To behandlingsgrupper ble dannet av ektefellene til de nevnte individer, og en enkelt intra-muskulær injeksjon på 5 ml av anti-HBs-immunglobulinet fremstilt som beskrevet ovenfor, ble ingitt. Ytterligere kliterier for ektefellen inkluderte at det ikke var noen forutgående hepatitis eller gulsott eller kronisk leverskydom, at de ikke var brukere av injeksjonsstoffer, at de ikke hadde hatt noen transfusjon i løpet av 6 månder og at de var tilgjengelige for tilstands-opp-følging i løpet av de etterfølgende 10 månder.

Blant de 100 ektefeller ble 47 fordelt til behandlet gruppe og 53 til kontrollgruppe. På grunn av eksklusjoner av en eller annen type forble 33 til analyse i den behandlende gruppe og-40 i kontrollgruppen. For nærværende har 58 av de 73 kvalifiserte ektefeller blitt studert i 150 dager eller mer etter injeksjonen av globulinet som fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse.

Intervaller fra oppdagelsen av gulsott hos stam-individene til injeksjonen av ektefellene varierte fra 7 dager før til 30 dager etter med en median på 9 d<*>ager. Totalt var det 11 tilfeller av hepatitt rapportert hos ektefellene, hvorav 9 av icteriske. 9 tilfeller av hepatitt B-sykdom forekom hos kontrollgruppen og ingen hos ektefellene behandlet med hepatitis B-immunglobulin som fremstilt ifølge oppfinnelsen.

For studie i denne sammenheng ble icteritisk hepatitt definert som mistenkt gulsott i huden eller øynene bekreftet av et serum bilirubin-nivå på 2 mg/dl eller høyere. Anicteritisk hepatitt ble definert som symptomatisk hepatitt bekreftet av passende nivåer og mønstere av serum aminotrafsferaseaktiviteter, men uten at det ble observert et serum bilirubin-nivå så høyt som 2,0 mg/dl. Både icteritiske og anicteritiske former av symptomatisk hepatitt ble definert som type B-sykdom på basis av føglende kriterier: (1) de novo tilsynekomst av HBgAg; (2) de novo tilsynekomst av anti-HBg hos mottagere av kontrollglobulin; (3) en fallende titer for anti-HBsetter hepatitis immunglobulininjek-sjon fulgt av en 4-gangers eller større økning. Symptomatiske tilfeller som ikke oppfylte disse kriterier ble klassifisert som "ikke-B"-hepatitis.

En effektiv mengde av materialet fremstilt ifølge oppfinnelsen egnet for å hindre frembrytning av hepatitis B<y>iral sykdom hos mottagelige verter, varierer fortrinnsvis fra 25-50 yg av spesifikt anti-HBs/ml/kg legemsvekt. Materialet adiminstreres parenteralt og fortrinnsvis intramuskulært som en enkeltdoseinjek-sjon.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et anti-HBg-gammaglobulin fra menneskeplasma, karakterisert ved følgende trinn: (a) avkjøling av menneskeplasma til ca. 1°C og fraseparering fra nevnte plasma av en første ovenstående væske og et første bunnfall; (b) tilsetning av metanol til den første ovenstående væske og innstilling av temperaturen til ca. -2°C, idet mengden av metanolen er mellom 10,5 og 10,9%, pH-verdien mellom 7 og 7,4 og ionestyrken 0,136 gi:/l, og fraseparering av et annet bunnfall og en annen ovenstående væske fra det resulterende væskesystem; (c) tilsetning av metanol til den andre ovenstående væske og innstilling av temperaturen til ca. -5°C, idet metanolmengden er mellom 33,25% og 35,35%, pH-verdien mellom 6,7 og 7,1 og ionestyrken mellom 0,081 og 0,091 gi./l, og fraseparering av et tredje bunnfall og en tredje ovenstående væske fra det resulterende væskesystem; (d) tilsetning av metanol til det tredje bunnfall og innstilling av temperaturen til ca. -5°C, idet metanolmengden er mellom 26,5 og 26,9%, pH-verdien mellom 7,0 og 7,4 og ionestyrken mellom 0,0047 og 0,00057 gi./l, og fraseparering av en fjerde bunnfall og en fjerde ovenstående væske fra det resulterende væskesystem; (e) tilsetning av metanol til det fjerde bunnfall og innstilling av temperaturen til ca. -6°C, idet metanolmengden er mellom 22,5 og 22,9%, pH-verdien mellom 5,0 og 5,4 og ionestyrken mellom 0,008 og 0,018 gi./l, og fraseparering av et femte bunnfall og en femte ovenstående væske fra det resulterende væskesystem; (f) tilsetning av metanol til den femte ovenstående væske og innstilling av temperaturen til -6,5°C, idet metanolmengden er mellom 33,0 og 33,4%, pH-verdien mellom 7,0 og 7,4 og ionestyrken mellom 0,055 og 0,065 gi./l, og fraseparering av et sjette bunnfall og en sjette ovenstående væske til det resulterende væskesystem.

2. Fremgangsmåte.ifølge krav 1, karakterisert ved at det sjette bunnfall frysetørkes.

3. Vesentlig rent anti-HBs -gammaglobulin, karakterisert ved at det er i det vesentlige fritt for plasminogen, fibrinogen, lipider og 19 S globuliner.

4. Fremgangsmåte til immunisering mot forekomst av hepatitt B viral sykdom, karakterisert ved at man til en mottagelig vert administrerer en effektiv mengde av et vesentlig rent anti-HBs -gammaglobulin som i det vesentlige er fritt for plasminogen, fibrinogen, lipider og 19 S globuliner.

5. Vesentlig rent anti-HBs -gammaglobulin, karakterisert ved at det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge hvilket som helst av kravene 1 eller 2.