NO762825L

NO762825L -

Info

Publication number: NO762825L
Application number: NO762825A
Authority: NO
Inventors: O Terada; T Uwajima
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1975-08-28
Filing date: 1976-08-16
Publication date: 1977-03-01
Also published as: ES461550A1; SE436575B; SE8201497L; GB1515805A; DK374676A; AU504596B2; FR2322200B1; AU1702376A; SE7609154L; CA1066211A; DE2637671C3; ES450823A1; DE2637671A1; NL7609184A; FR2322200A1; DE2637671B2; IT1069699B; US4087329A

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av kreatinindesimidase og fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av kreatinin under anvendelse av denne.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av kreatinindesimidase og dens anvendelse til kvantitativ bestemmelse av kreatinin.

Kreatinin er et metabolisk biprodukt dannet ved ikke-enzymatisk dehydratisering av kreatin, som produseres fra kreatinfosforsyre, en av kildene til muskulær kontraksjons-energi. Kreatinin utnyttes ikke in vivo og utskilles som slutt-metabolitt i urinen. Kreatinin finnes også i blod i en normal konsentrasjon på fra ca. 0,7 til ca. 1,7 g/100 ml serum. Bestemmelsen av kreatininmengden i blod og urin er derfor meget nyttig til diagnostiske formål ved bestemmelsen av nyresykdom-mer,slik som akutt nefritis og kronisk nefritis, og av forstyr-relser slik som urethrophraxis, mercurialisme, nephrosis, osv.

Hittil er den kvantitative bestemmelse av kreatinin blitt utført ved kolorimetrisk bestemmelse under anvendelse av Jaffe's reaksjon som omfatter en fargereaksjon med alkalisk pikrat. Selv om kolorimetrisk bestemmelse av kreatinin under anvendelse av alkalisk pikrat er praktisk ved at arbeidsmåten er enkel og stabil, innebærer denne metode visse ulemper. På grunn av dårlig følsomhet er det nødvendig å benytte en forøket mengde serum; '"reaksjonen er ikke spesifikk; og reaksjonen er utsatt for innvirkning av stoffer i blodet slik som aktive metylenforbindelser, proteiner, antibiotika, osv. For å over-vinne disse ulemper er det nødvendig å fjerne stoffene i prøven eller å ekstrahere kreatininet. Imidlertid kompliserer slike arbeidsmåter metoden, og er derfor ufordelaktige for automati-sering .

Det har nå vist seg at mengden av kreatinin i en prøve kan bestemmes enklere, mer korrekt og hurtigere sammen- lignet med den hittil kjente metode, ved nedbrytning av kreatinin under anvendelse av et enzym som katalyserer en reaksjon, hvorved kreatinin hydrolyseres til N-metylhydantoin og ammoniakk og etterfølgende måling av mengden av dannet N-metylhydantoin eller ammoniakk.

Det katalytiske enzym som benyttes ved foreliggende fremgangsmåte er kreatinin-desimidase.

Kreatinin-desimidase (EC 3.5.4.21) ble rapportert av J. Szulmajster (J. Bacteriology 75, 633, 1958 og Biochimica et Biophysica Acta 30, 154, 1958) å forekomme i mikroorganismecellene av Clostridium paraputrificum i 1958. Enzymet deltar i nedbrytningen av kreatinin og katalyserer en reaksjon hvorved kreatinin hydrolyseres til dannelse av N-metylhydantoin og ammoniakk.

Imidlertid er mikroorganismer av slekten Clostridium anaerobe, og når de anvendes til fremstilling av enzymet, kreves et langt tidsrom til gjæringen; mikrobeveksten er liten og utbyttet av enzymet er lavt. Derfor har det ikke vært mulig å utføre fremstillingen av kreatinin-desimidase i industriell målestokk.

Andre forskere har tidligere rapportert funn av stammer av aerobe organismer tilhørende slekten Pseudomonas, som kunne nedbryte kreatinin. Imidlertid har ingen av disse tidligere forskere rapportert en mikroorganisme som produserer et enzym som er i stand til å katalysere en hydrolysereaksjon, hvorved kreatinin nedbrytes til dannelse av N-metylhydantoin og ammoniakk. Videre var disse forskere ifølge de publiserte rap-porter ute av stand til å isolere et bestemt enzym som kunne katalysere ovennevnte reaksjon.

Det har nå ifølge foreliggende oppfinnelse vist seg at mikroorganismer tilhørende slektene Brevibacterium, Cory.ne-bacterium, Pseudomonas og Arthrobacter, når de dyrkes i et næringsmedium, produserer betydelige mengder av kreatinin-desimidase i dyrkningsvæsken og/eller i mikroorganismecellene.

Den ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte kreatinin-desimidase kan lett anvendes til kvantitativ bestemmelse av mengden av kreatinin i en prøve ved en automatisk arbeidsmåte som ikke tidligere kunne oppnås. Nærmere betegnet kan mengden av kreatinin i en prøve bestemmes lett og hurtig ved måling av den mengde N-metylhydantoin eller ammoniakk som er dannet ved enzymets katalytiske virkning.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at en kreatinin-desimidase-produserende mikroorganisme tilhørende en av slektene Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas og Arthrobacter dyrkes i et næringsmedium inntil det spores kreatinin-desimidase i kulturen, hvoretter den dannede kreatinin-desimidase utvinnes.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til kvantitativ bestemmelse av kreatinin i en prøve er kjennetegnet ved at prøven omsettes med en oppløsning av kreatinin-desimidase inntil kreatininet er hydrolysert til dannelse av ammoniakk og N-metyl- ' hydantoin, hvoretter mengden av den ved reaksjonen dannede ammoniakk eller N-metylhydantoin eller begge deler, måles.

Når en mikroorganisme tilhørende en av slektene Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas og Arthrobacter og med evne til å produsere kreatinin-desimidase dyrkes i et næringsmedium inneholdende en passende karbonkilde, nitrogenkilde, uorganiske materialer og andre næringsstoffer, dannes kreatinin-desimidase i dyrkningsvæsken og/eller i mikroorganismecellene hvorfra den utvinnes.

Ved foreliggende fremgangsmåte kan anvendes enhver mikroorganisme som tilhører slektene Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas eller Arthrobacter, og som har evnen til å produsere.kreatinin-desimidase. Eksempler på de idag foretrukne stammer er følgende:

(1) Brevibacterium ammoniagenes KY 3462

(2) Brevibacterium divaricatum KY 38l0

(3) Corynebacterium lilium KY 3509

(4) Corynebacterium glutamicum KY 3801

(5) Pseudomonas ovalis KY 4651

(6) Pseudomonas cruciviae KY 3961

(7) Arthrobacter ureafaciens KY 3152

(8) Arthrobacter histidinolovorans KY 3158.

De mikrobiologiske egenskaper til de under punktene

(1), (6) og (7) nevnte arter, er beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. utg., henholdsvis side 499, 114 og 610. De mikrobiologiske egenskaper til den under (2) ovenfor nevnte art er beskrevet i japansk publikasjon nr. 20294/63, og egenskapene til den under (3) ovenfor nevnte art er beskrevet i US-patent nr. 3.087.863. Videre er de mikrobiologiske egenskaper til den under (4) ovenfor nevnte art beskrevet i J. Gen. Appl. Microbiol'-.' 13, 279-301, 1967, egenskapene til den under (5) beskrevne art i Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8. utg., side 222, og egenskapene til den under (8) nevnte art i J. Biol. Chem. 209, 829 (1954).

De ovennevnte stammer er blitt deponert i the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tokio, Japan under FERM-P numrene 3207, 3208, 3209, 3210, 3211, 3212, 3213 og 3214, respektivt.

Disse stammer er også blitt deponert i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA og er blitt tildelt ATCC-numrene 31169, 14020, 15990, 31170, 31171, 31172, 7562 og 11442, respektivt.

Såvel et syntetisk som et naturlig medium kan anvendes til dyrkning av mikroorganismer ved foreliggende fremgangsmåte, så lenge det inneholder en karbonkilde, en nitrogenkilde, uorganisme materialer og andre næringsstoffer som er assimiler-bare for den bestemte benyttede stamme.

Som karbonkilde kan anvendes forskjellige karbohydra-ter slik som glukose, fruktose, saccharose, maltose, mannose, stivelse, stivelseshydrolysatvæske, melasse, osv., forskjellige sukkeralkoholer slik som glycerol, sorbitol, mannitol, osv., organiske syrer slik som eddiksyre, melkesyre, pyrodruesyre, fumarsyre, citronsyre, osv., alkoholer slik som metanol, e.tanol, osv., glyceroler slik som etylenglykol, propyienglykol, osv., aminosyrer og hydrokarboner slik som n-heksadecan.

Som nitrogenkilde kan anvendes ammoniakk, uorganiske og organiske ammoniumsalter slik som ammoniumklorid, ammonium-karbonat, ammoniumfosfat, ammoniumnitrat, ammoniumacetat, osv., urea, aminosyrer og andre nitrogenholdige forbindelser såvel som nitrogenholdige organiske materialer slik som pepton, NZ-amin,, kjøttekstrakt, maisstøpevann, kaseinhydrolysat, chrysalishydro-lysat, fiskemel, dets oppløsningsprodukt, avfettet soyabønnemel, dets oppløsningsprodukt, osv.

Som uorganiske materialer er f.eks. kåliumdihydrogen-fosfat, dikaliumhydrogenfosfat, kaliumklorid, magnesiumsulfat, mangansulfat, jern(II)-sulfat, natriumklorid, kalsiumkarbonat,

osv., egnet.

Det har vist seg at kreatinin-desimidase er et adap-tivt, enzym. I overensstemmelse med dette kan utbyttet av kreatinin-desimidase ved foreliggende fremgangsmåte forøkes sterkt ved tilsetning av kreatinin eller et kreatininholdig naturlig stoff, slik som fiskekjøttekstrakt og oksekjøttekstrakt, til mediet som enzymfremkaller. •

Spesielt gode resultater oppnås ved tilsetning av kreatinin i en mengde på 0,0 5 - 2 % (vekt/vol.) til mediet.

Vanligvis utføres dyrkningen ved en temperatur på 15-40°C, fortrinnsvis 28-33°C. Under dyrkningen holdes pH-verdien ved 6,0 - 8,5, fortrinnsvis ved 6,5 - 8,5.

Dyrkningen fortsettes inntil enzymet er dannet og spores i dyrkningsvæsken, vanligvis i 20-30 timer. Under disse betingelser dannes en betydelig mengde kreatinin-desimidase i dyrkningsvæske og/eller i mikroorganismecellene.

For å utvinne enzymet ødelegges mikroorganismecellene ved bruk av en konvensjonell metode slik som ultralydbehandling, formaling, mekanisk trykk, autolyse, osv., for oppnåelse av et celleekstrakt. Ekstraksjonen av kreatinin-desimidase fra dyrkningsvæsken og fra celleekstraktet utføres på følgende måte. Først oppnås et bunnfall ved anvendelse av salter slik som ammoniumsulfat og natriumsulfat, eller oppløsningsmidler slik som aceton, metanol og etanol. Når det anvendes ammoniumsulfat utvinnes den del som oppløses i ammoniumsulfat med 40 % metning og utfelles i ammoniumsulfat med 70 % metning. Når aceton anvendes, utvinnes den del som utfelles i aceton med 60 % konsentrasjon.

Det på denne måte oppnådde bunnfall underkastes deretter dialyse eller gelfiltrering for å fjerne det i bunnfallet forekommende salt eller oppløsningsmiddel. Til dialysen er- en dialysemembran, slik som cellofan, urinblæremembran og kollodium-membran, egnet. Det foretrukne dialyseoppløsningsmiddel er 0,01M fosfatbuffer, pH 7,0. Til gelfiltrering foretrekkes anvendelse av "Sephadex ® G-25" eller "G-50" sammen med 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0).

For å fjerne nucleinsyre fra membranen, tilsettes dråpevis en vandig oppløsning av protamin (inneholdende en mengde protamin tilsvarende 1/10 av proteininnholdet i væsken innenfor membranen)(under omrøring, og den resulterende blanding hensettes ved 0-4°C i omtrent 30 min. for dannelse av et bunnfall. Det dannede bunnfall fjernes ved sentrifugering (10.000 x G, 20 min.) og den ovenstående væske innvinnes.

Den ovenstående væske sendes deretter gjennom en søyle av DEAE-cellulose som på forhånd er behandlet med 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0). Deretter føres 0,01M fosfatbuffer gjennom søylen for å eluere urent protein. Deretter utføres elue-ring ifølge gradientelueringsmetoden begynnende med 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0) og idet man slutter med 0,1M fosfatbuffer inneholdende 0, 3M NaCl. (pH 7,0). Eluatet oppsamles i fraksjoner. Den aktivitet av kreatinin-desimidase som inneholdes i hver av fraksjonene, måles ved den nedenfor beskrevne metode og de aktive fraksjoner kombineres og tilsettes det dobbelte volum aceton for dannelse av et bunnfall. Bunnfallet oppsamles ved filtrering og underkastes dialyse. Væsken.i membranen frysetørkes deretter

for oppnåelse av renset kreatinin-desimidase i pulverform.

Den enzymatiske aktivitet av kreatinin-desimidase utregnes ved bestemmelse av den mengde ammoniakk som dannes når kreatinin anvendes som substratet ifølge indofenolmetoden. Mer spesifikt blandes 0,5 ml 1% vandig kreatinin-hydroklorid-oppløs-ning, 0,5 ml 0,IM fosfatbuffer (pH 7,5), 0,4 ml vann og 0,1 ml av en enzymoppløsning og inkuberes ved 3 7°C i 10 min. Til blandingen tilsettes 1 ml fenoloppløsning (fremstilt ved å oppløse 5,0 g fenol og 25 g natriumnitroprussid i tilstrekkelig vann til å gi et volum på 500 ml), og den resulterende blanding omrøres. Til denne blanding tilsettes 1 ml alkalisk natriumhydroklorifit-oppløsning (fremstilt ved å oppløse 2,5 g natriumhydroksyd i omkring 300 ml vann, tilsette 1,25 ml natriumhypokloritt (inneholdende 10% effektivt klor) og deretter fortynne blandingen i vann til et volum på 500 ml), og blandingen omrøres og hensettes ved romtemperatur i 20 min.Absorbansen ved 63 0 mn måles ved hjelp av et fotoelektrisk kolorimeter. For kontroll gjennomføres den samme operasjon under anvendelse av en enzymoppløsning som på forhånd er oppvarmet til 100°C i 5 min. Absorbansen ved 630 mn av kontrolloppløsningen trekkes fra absorbansen ved 63 0 mn av prøveoppløsningen. Separat oppnås kalibreringskurven for konsentrasjonen av ammoniakk og absorbansen ved 63 0 mn. Ut fra den verdi som oppnås ved subtraksjon av absorbansene, oppnås mengden av den dannede ammoniakk. På dette grunnlag utregnes den i prøven inneholdte enzymatiske aktivitet.

Den enzymatiske aktivitet angis som en enhet, idet

en enhet defineres som den mengde av enzymet som nedbryter 1 umol kreatinin ved 37°C og ved pH 7,5 i løpet av 1 minutt.

Kreatinin-desimidase fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte virker karakteristisk på kreatinin og katalyserer reaksjonen til nedbrytning av kreatihinet til N-metylhydantoin og ammoniakk. Enzymet virker ikke på kreatinin, kreatinin-fosforsyre, urea, arginin, glutaminsyre, canavanin, glutamin, cytosin, guanin, osv.

Bestemt ved gelfiltreringsmetoden som beskrevet i Biochemical Journal 96, 595, 1965 under anvendelse av "Sephadex ® G-200", er molekylvekten av kreatinin-desimidase omkring 200.000.

Den optimale pH-verdi for enzymet når det behandles ved 37°C i 10 min., er nær 8, og det stabile pH-område, når det behandles ved 30°C i 30 min., er fra 4,0 - 9,0. Den optimale temperatur for enzymet ved reaksjonen ved 8,0 i 10 min. er nær 50°C. Når det behandles ved en pH-verdi på 7,0 i 30 min., er enzymet stabilt opp til 50°C og taper omkring 20 % av sin aktivitet ved 55°C.

Virkningen av det angjeldende enzym inhiberes av 1 nM tungmetallioner, slik som Cu 2+ , Hg 2+ , Ag +, osv. og p-klormerkuri-benzoesyre. Det antas således at en SH-gruppe deltar i enzymets virkning.

Kreatinin-desimidase, fremstilt på den ovenfor angitte måte, er spesielt egnet til kvantitativ bestemmelse av mengden av kreatinin i en prøve ifølge oppfinnelsen. Dette gjennomføres lett f.eks. ved omsetning av en prøve inneholdende kreatinin med en fosfatbufferoppløsning inneholdende en mengde på 0,1-1,0 mg/ml kreatinin-desimidase ved en temperatur på 3 0-50°C i fra ca. 10 til ca. 30 min. for å hydrolysere kreatininet til N-metylhydantoin og ammoniakk og deretter måle mengden av det dannede N-metylhydantoin eller mengden av den dannede ammoniakk.

Ved foreliggende fremgangsmåte kan mengden av kreatinin bestemmes i enhver prøve inneholdende kreatinin, og fremgangsmåten kan spesielt anvendes til bestemmelse av mengden av kreatinin i blod og urin. Ved utførelse av bestemmelsen av kreatininmengden i blod underkastes en blodprøvesentrifugering ved 2500 - 3000 omdr./minutt i omkring 5 min., og det oppnådde serum anvendes til reaksjonen. I tilfelle av urin kan prøven være en urinprøve slik den er, eller fortynnet til en passende konsentrasjon, vanligvis 2 eller 5 ganger, med vann.

Bestemmelsen av den ved reaksjonen dannede mengde N-metyl-hydantoin kan utføres ifølge den metode som er beskrevet av Kirby og Berry i Paper and Paperelectrophoresis, Academic Press, New York, side 348, 1958. Kort beskrevet består metoden i tilsetning av alkalisk ferricyanid-nitroprussid-reagens (fremstilt ved blanding av like deler 10 % natriumhydroksydoppløsning, 10 % natriumnitroprussidoppløsning og 10 % kaliumferricyanid-oppløsning og fortynning av blandingen til det tredobbelte med vann) til en prøve inneholdende N-metylhydantoin. Blandingen hensettes ved romtemperatur i et visst tidsrom, vanligvis i 15-3 0 min., til fargedannelse, og deretter utregnes mengden av N-metyl-hydantoin ved måling av den optiske tetthet ved 500 nm.

Bestemmelsen av den ved reaksjonen dannede mengde ammoniakk kan utføres ifølge enhver av de kjente fysikalsk-kjemiske eller enzymatiske metoder. Egnede fysikalsk-kjemiske metoder inkluderer titreringsmetoden, Nesslers prøvemetode, ninhydrin-prøvemetoden, Berthelots reaksjonsmetode og fenosafranin-reaksjonsmetoden.

Ved titreringsmetoden bestemmes mengden av ammoniakk i prøven ved nøytraliseringstitæering av prøveoppløsningen med en standardoppløsning av en syre eller ved tilbaketitrering av prøven, hvori den dannede ammoniakk er absorbert av en viss mengde syre (Biochem.,Z. 152, 1, 1924).

Ifølge Nesslers prøvemetode behandles prøven inneholdende ammoniakk med Nessler-reagens for dannelse av farge, og mengden ammoniakk bestemmes kolorimetrisk (Standard Methods of Clinical Chemistry Vol. 2, side 186, Academic Press, N.Y. 1958).

Ninhydrin-prøvemetoden er en metode ifølge hvilken den dannede ammoniakk omsettes med ninhydrin og mengden av reak-sjonsproduktet bestemmes kolorimetrisk (J. Lab. Clin. Med., 49, 779, 1957).

Ifølge Berthelots reaksjonsmetode omsettes ammoniak-ken i prøven med fenolreagens og alkalisk natriumhypokloritt-■reagens til dannelse av farge, og mengden ammoniakk i prøven bestemmes kolorimetrisk (Clin. Chimica Acta, 8_, 5, 1963) .

Fenosafranin-reaksjonsmetoden utnytter det fenomen at fenosafranin (rødfarget) avfarges i forhold til mengden av hypokloritt. Ifølge denne metode omsettes prøven inneholdende ammoniakk med hypokloritt, til blandingen tilsettes deretter en safraninoppløsning til avfarging i forhold til konsentrasjonen av

o

det resterende hypokloritt, og mengden av ammoniakk utregnes etter at absorbansen av oppløsningen av det resterende safranin er målt (Proe. Soc. Exptl. Biol. Med., 93, 589, 1956).

En egnet enzymatisk metode for bestemmelse av mengden ammoniakk utnytter L-glutamat-dehydrogenase (EC 1.4.1.2, i det følgende betegnet GLDH), som er en NAD (nikotinamid-adenin-di-nukleotid)-oksido-reduktase. GLDH er et enzym som katalyserer reaksjonen til dannelse av L-glutaminsyre fra 2-oksoglutarat og ammoniakk. I absorbsjonsspekteret for NAD, som virker som ko-enzym ved denne reaksjon, utviser NAD av enten den oksyderte type eller den reduserte type en maksimumsabsorbsjon ved 260 nm. Den reduserte type NAD viser en annen maksimumsabsorbsjon ved

340 nm, men dette gjør ikke den oksyderte type NAD. Derfor kan absorbansen ved 34 0 nm utnyttes til kvantitativ bestemmelse av den reduserte type NAD (NADH2).

Ved anvendelse av denne måling kan mengden ammoniakk bestemmes ved utførelse av en enzymatisk reaksjon av ammoniakk i prøven med 2-oksoglutarat under anvendelse av GLDH som enzymet og NAD som koenzym og måling av senkningen i reaksjonsblandingens absorbans ved 340 nm.

Mengden kreatinin i menneske-blodserum måles ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og også ved den konvensjonelle fremgangsmåte. Resultatene er anført i følgende tabell I.

I tabell I er den konvensjonelle metode basert på den metode som er beskrevet i Kitamura, Genshi; Jissen Rinsho Kagaku (Practise of Therapeutic Chemistry), Ishiyaku Shuppan Kabushiki, Kaisha, side 243-255, 1974. Også i tabell I anvendes, for bestemmelse av den dannede ammoniakk ved foreliggende fremgangsmåte, en typisk fysikalsk-kjemisk metode; den modifiserte m-tode ifølge Okuda og Fujii (Saishin Igaku, 21, 622, 1966) under anvendelse av Berthelots reaksjon, og som enzymatisk metode under anvendelse av GLDH anvendes metoden ifølge A. Levitzki (Anal.Biochem. 33, 335, 1970). Til bestemmelse av den dannede mengde N-metylhydantoin ved foreliggende fremgangsmåte anvendes metoden ifølge Kirby og Berry (Paper and Paperelectrophroesis, side 348).

Av de i den ovenstående tabell I anførte resultater vil fagmannen lett innse at fremgangsmåten til kreatininbestem-melse ifølge oppfinnelsen gir bedre resultater med forøket samtidig reproduserbarhet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen belyses nærmere ved de etterfølgende utførelseseksempler.

Eksempel 1

I dette eksempel innpodes en kultur av Brevibacterium ammoniagenes KY 3462, FERM-P No. 3207, ATCC 31169 i 10 liter av et dyrkningsmedium inneholdende 2 g/dl glukose, 0,5 g/dl kreatinin-hydroklorid, 0,1 g/dl K2HP04, 0,05 g/dl MgS04.7H20, 0,05 g/dl KC1 og 0,1 g/dl gjærekstrakt (pH 7,5) i et 30 liters gjæringskar og dyrkes med lufting og omrøring ved 30°C i 24 timer. Deretter behandles 10 liter av dyrkningsmediet i en kontinuert sentrifuge og det oppsamles 100 g mikroorganismeceller. Cellene vaskes med 5 liter 0,0IM fosfatbuffer (pH 7,0) og suspenderes i 2 liter 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0). Suspensjonen underkastes behandling i en "Dynomill" til formåling av cellene. Etter formaling underkastes produktet sentrifugering (20.000 x G, 20 min.) under anvendelse av en avkjølt sentrifuge, og den ovenstående væske oppsamles. Det oppnås ca. 30 g av et bunnfall ved behandling av den ovenstående væske med en 40-70 % mettet ammoniumsulfatopp-løsning. Utbytte med hensyn til aktivitet av kreatinin-desimidase i bunnfallet er 80 % og den spesifikke aktivitet er forhøyet til det tredobbelte. Bunnfallet oppsamles deretter i 500 ml ,0,01 M fosfatbuffer (pH 7,0) og oppløsningen dialyseres i 48 timer i en dialysator av cellofanrør mot 20?Mter 0,01M fosfatbuffer

(pH 7,0), mens oppløsningsmidlet skiftes for hver 12. time.

For å fjerne nukleinsyre tilsettes deretter 100 ml av en 3 % vandig oppløsning av protamin gradvis til 1 liter dialysat under omrøring, og den resulterende blanding hensettes ved 0-4°C i omkring 3 0 min. for dannelse av et bunnfall. Det således dannede bunnfall skilles fra ved sentrif ugering j[10.000 x G, 20 min.). Utbyttet med hensyn til aktivitet av kreatinin-desimidase i den ovenstående væske er 90 %, og den spesifikke aktivitet er for-høyet til det dobbelte. Den ovenstående væske sendes gjennom en søyle av 1 kg DEAE-cellulose som på forhånd er behandlet med •0,0IM fosfatbuffer (pH 7,0) for absorbsjon av kreatinin-desimidase. Søylen vaskes deretter med 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0) for

å fjerne urene proteiner. Deretter fremstilles en konsentra-sjonsgradient på fra 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0) til 0,1M fosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 0,3M NaCl og sendes gjennomssøylen. De aktive fraksjoner av kreatinin-desimidase elueres som et enkelt maksimum. De. aktive fraksjoner kombineres og det tilsettes, det dobbelte volum aceton for dannelse av et bunnfall. Bunnfallet oppsamles ved sentrifugering (10.000 x G, 20 min.) og oppløses i 100 ml vann som er blitt avmineralisert ved ioneut-vekslerbehandling. Oppløsningen dialyseres i en dialysator av cellofanrør mot 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0) og dialysatet fryse-tørkes, hvorved man oppnår omkring 1 g renset kreatinin-desimidase som utviser en spesifikk aktivitet på 2,5 enh./mg. Det totale utbytte med hensyn til aktivitet av kreatinin-desimidase ar 56 %, og den spesifikke aktivitet er omkring 60-doblet.

Eksempel 2

I dette eksempel anvendes Corynebacterium lilium KY 3509, FERM-P No. 3209, ATCC 15990 som dyrkningsstamme og det anvendes et medium inneholdende 3 ml/dl bonito-kjøttekstrakt (inneholdende omkring 3,3 g/dl kreatinin), 0,5 g/dl pepton og 0,5 g/dl glukose (pH 7,5). Dyrkingen utføres på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Som resultat oppnås omkring 150 g mikroorganismeceller. Cellene underkastes ekstraksjons- og rensingsmetoden som beskrevet i eksempel 1, og derved oppnås omkring 1,5 g renset kreatinin-desimidase med en spesifikk aktivitet på 1,5 enh./mg. Utbyttet er 55 %.

Eksempel 3

I dette eksempel dyrkes Pseudomonas ovalis KY 4 651, FERM-P No. 3 211, ATCC 31171 i et medium inneholdende 3 g/dl kjøttekstrakt, 0,5 g/dl pepton og 0,3 g/dl glukose (pH 7,5). Dyrkingen utføres på samme måte som beskrevet i eksempel 1 for oppnåelse av omkring 180 g mikroorganismeceller. Cellene underkastes ekstraksjons- og rensingsmetoden som beskrevet i eksempel 1, hvorved det oppnås omkring 2 g renset kreatinin-desimidase med en spesifikk aktivitet på 1,0 enh./mg. Utbytte: 57 %.

Eksempel 4

I dette eksempel dyrkes Arthrobacter ureafaciens KY 3152, FERM-P No. 3213, ATCC 7562 på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Som resultat oppnås omkring 150 g mikroorganisme celler. Cellene underkastes ekstraksjons- og rensingsmetoden som beskrevet i eksempel 1, hvorved det oppnås 0,5 g renset kreatinin-desimidase med en spesifikk aktivitet på 2,0 enh./mg, utbytte: 57 %.

Eksempel 5

I dette eksempel underkastes 10 liter av en dyrkningsvæske, oppnådd ved utførelse av dyrkning på samme måte som beskrevet i eksempel 1, en kontinuert sentrifugering for oppnåelse av 9,5 liter ovenstående væske. Den ovenstående væske behandles med 40-70 % mettet ammoniumsulfatoppløsning for oppnåelse av omkring 5 g av et bunnfall. Utbytte med hensyn til aktivitet av kreatinin-desimidase i bunnfallet er 8 0 %, og den spesifikke aktivitet er hevet til det tredobbelte. Bunnfallet oppløses i 100 ml 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0) og oppløsningen dialyseres i 48 timer i,en dialysator av cellofanrør mot 20 liter 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0), mens oppløsningsmidlet skiftes for hver 12. time. Deretter underkastes 200 ml av dialysatet en fjerning av nukleinsyre, DEAE-cellulose-søylekromatografi, utfelling med aceton og frysetørking på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Det oppnås omkring 120 mg renset kreatinin-desimidase med en spesifikk aktivitet på 2,0 enh./mg. Utbytte: 52 %.

Eksempel 6

I dette eksempel innpodes kulturer av de i nedenstående tabell II identifiserte stammer i 50 ml av et medium med den samme sammensetning som i eksempel 1 i 50 0 ml Sakaguchi-kolber og dyrkes ved 30°C i 24 timer med rysting. Dyrknings-væskene behandles i en avkjølt sentrifuge (10.000 x G, 20 min.), og mikroorganismecellene oppsamles. Deretter vaskes 0,5 g av cellene med 50 ml 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0) og suspenderes i 10 ml 0,01M fosfatbuffer (pH 7,0). Suspensjonene underkastes ultralydbehandling i 20 min. under .anvendelse av en ultralyd-desintegrator og underkastes ytterligere avkjølt sentrifugering (20.000 x G, 20 min.). De således oppnådde ovenstående-væsker oppsamles og kreatinin-desimidase-aktiviteten og protein-konsentrasjonene måles. Resultatene er angitt i tabell II.

Eksempel 7

I dette eksempel tilsettes henholdsvis 20 yl serum ("Moni-trol I", inneholdende 1,1 mg/dl kreatinin) og 20 yl av en standardoppløsning av kreatinin (en vandig oppløsning inneholdende 4 00 yg/dl kreatinin) til en oppløsning bestående av 1,0 ml av en enzymoppløsning (0,01M fosfatbuffer med pH 7,5 inneholdende 0,1 mg kreatinin-desimidase med en spesifikk aktivitet på 0,1 enh./mg) og 1,0 ml 0,IM fosfatbuffer (pH 7,5) og de resulterende blandinger inkuberes ved 37°C i 10 min.

Etter reaksjonsperioden tilsettes 1 ml fenolreagens (fremstilt ved oppløsning av 5,0 g fenol og 25 mg natriumnitroprussid i vann til et totalvolum på 500 ml) og 1 ml alkalisk natriumhypokloritt-reagens (fremstilt ved oppløsning av 2,5 g natriumhydroksyd i omkring 300 ml vann, tilsetning av 1,2 5 ml natriumhypokloritt til oppløsningen og oppfylling med vann til et volum på 500 ml) til blandingene, som deretter hensettes ved 37°C i 20 min. for dannelse av farge, og anvendes som prøveopp-løsninger.

Separat tilsettes henholdsvis 20 yl serum og 20 yl standardoppløsning av kreatinin til en oppløsning bestående av 1,0 ml av enzymoppløsningen og 1,0 ml 0,IM fosfatbuffer (pH 7,5). Samtidig tilsettes 1 ml fenolreagens og 1 ml alkalisk natrium-hypoklorittreagens, og de resulterende blandinger anvendes som

blindoppløsninger.

Prøveoppløsningenes optiske tetthet måles ved 640 nm mot blindoppløsningene. Ut fra målingen av standardoppløsningen av kreatinin oppnås kalibreringskurven for den optiske tetthet ved 640 nm og konsentrasjonen av kreatinin. På basis av disse data utregnes konsentrasjonen av kreatinin i serumet ut fra målingen av den optiske tetthet av serumet ved 640 nm.

Resultatene er anført i de nedenstående tabeller III og IV. Tabell III viser verdiene når mengden av kreatinin i standardserumet bestemmes suksessivt ti ganger, og standard-avviket og variasjonskoeffisienten beregnes ut fra disse verdier.

Tabell IV viser resultatene når mengden av kreatinin i 20 prøver av serum bestemmes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og den kjente metode.

Eksempel 8

I dette eksempel tilsettes henholdsvis 20 yl serum (Moni-trol I") og 20 y1 av en standardoppløsning av kreatinin (en vandig oppløsning inneholdende 400 yg/dl kreatinin) til 1,0

ml av en. kreatinin-desimidase-oppløsning.(0,01M fosfatbuffer med pH 7,5 inneholdende 0,1 mg kreatinin-desimidase med en spesifikk aktivitet på 0,1 enh./mg) og 1,0 ml 0,IM fosfatbuffer (pH 7,5) og

de resulterende blandinger inkuberes ved 3 7°C i 10 min.

Til reaksjonsblandingene tilsettes 1 ml 4mM NADH,

40 mM 2-oksoglutarat og 1 ml av en oppløsning av L-glutamat-dehydrogenase (inneholdende 0,1 mg L-glutamat-dehydrogenase med en spesifikk aktivitet på 90 enh./mg eller mer), og de resulterende blandinger inkuberes ved 37°C i 10 min. Fallet i reak-sjonsblandingenes absorbsjon ved 340 nm måles.

Resultatene er angitt i tabell V og VI.

Tabell V viser verdiene når mengden av kreatinin i standardserumet bestemmes suksessivt 10 ganger, og standardavvi-ket for variasjonskoeffisienten beregnes ut fra de oppnådde verdier.

Tabell VI viser resultatene når mengden av kreatinin i 20 prøver av serum bestemmes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og den kjente fremgangsmåte.

Eksempel 9

I dette eksempel tilsettes henholdsvis 20 yl serum ("Moni-trol I") og 20 Ul av en standardoppløsning av kreatinin (en vandig oppløsning inneholdende 400 Ug/dl kreatinin) til en oppløsning bestående av \,0 ml av en enzymoppløsning (0,01M fosfatbuffer med pH 7,5 inneholdende 0,1 mg kreatinin-desimidase med en spesifikk aktivitet på 0,1 enh./mg)°91/0 ml 0,1M fosfatbuffer (pH 7,5), og de resulterende blandinger inkuberes ved 37°C i 10 min.

Til reaksjonsblandingene tilsettes deretter 1 ml alkalisk ferricyanid-nitroprussid-reagens (fremstilt ved blanding av like deler 10 % natriumhydroksydoppløsning, 10 % natriumnitroprussidoppløsning og 10 % kaliumferricyanidoppløs-ning og fortynning av blandingen til det tredobbelte med vann, og de resulterende blandinger hensettes ved romtemperatur i 20 min. for dannelse av en farge og anvendes som prøveoppløsninger.

Separat tilsettes henholdsvis 20 1 serum og 20 1 av standardoppløsningen av kreatinin til en oppløsning bestående av 1,0 ml av enzymoppløsningen og 1,0 ml 0,1M fosfatbuffer (pH 7,5), hvortil det samtidig tilsettes 1 ml alkalisk ferricyanid-nitroprussid-reagens. De resulterende blandinger anvendes som blindoppløsninger.

Prøveoppløsningenes optiske.tetthet måles ved 500 nm mot blindoppløsningene. Fra målingen på standardoppløsningen av kreatinin oppnås kalibreringskurven for den optiske tetthet ved 500 nm og konsentrasjonen av kreatinin. På basis av dette beregnes konsentrasjonen av kreatinin i serumet ut fra målingen av serumets optiske tetthet ved 500 nm.

Resultatene er anført i tabell VII og VIII.

Tabell VII viser verdiene når mengden av kreatinin

i standardserumet bestemmes suksessivt 10 ganger, og standard-avviket og variasjonskoeffisienten beregnes ut fra de oppnådde verdier.

Tabell VIII viser resultatene når mengden av kreatinin i 20 prøver av serum bestemmes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og den kjente fremgangsmåte.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av kreatinin-desimidase karakterisert ved at en kreatinin-desimidase-produserende mikroorganisme tilhørende en av slektene Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas og Arthrobacter dyrkes i et næringsmedium inntil det spores kreatinin-desimidase i kulturen, hvoretter den dannede kreatinin-desimidase isoleres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det tilsettes kreatinin til næringsmediet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vve d at dyrkningstrinnet utføres ved en temperatur på 28-33°C og en pH-verdi på 6,5 - 8,5 i 20-30 timer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen er valgt blant Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas cruciviae, Arthrobacter ureafaciens og Arthrobacter histidinolovorans.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at mikroorganismen er valgt blant Brevibacterium ammoniagenes ATCC 31169, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium glutamicum ATCC 31172, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 og Arthrobacter histidinolovorans ATCC 11442.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kreatinin-desimidasen isoleres ved at mikroorganismecellene brytes til dannelse av et celleekstrakt, og dette celleekstrakt underkastes utfelling og adsorbsjon og desorbsjon for oppnåelse av et renset enzym.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kreatinin-desimidasen isoleres fra dyrkningsvæsken ved utfelling og adsorbsjon og desorbsjon for oppnåelse av et renset enzym.

8. Fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av kreatinin i en prøve, karakterisert ved at prøven omsettes med en oppløsning av kreatinin-desimidase inntil kreatininet er hydrolysert til dannelse av ammoniakk og N-metyl-hydantoin, og at den ved reaksjonen dannede mengde ammoniakk eller N-metyl-hydantoin eller begge deler, måles.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at reaksjonen gjennomføres ved fra omkring 30 til omkring 50°C i fra omkring 10 til omkring 30 minutter.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at det som prøve anvendes urin.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at det som prøve anvendes blodserum.