NO762923L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen S 11743/A' i syreforraen med formel I

og dens salter.

Det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for fremstilling av forbindelsen S 11743/A i forra av syren og dens salter er at en S 11743/A produserende stamme av actinoraycetenarten streptomyces rautabills dyrkes i nærvær av et næringcraedium.

Forbindelsen S 11743/ft i form av dens amorfe og aceton-holdige, krystallinske natrinmsalter og krystallinske kaliurasalter, som beskrevet i eksemplene/har folgende karakteristiske egenskapers Na-salter av S 11743/A

Den elementære sammensetning av det amorfe natriumsalt gir folgende

verdier for c4iHQ9°x2Na:

teoretisk C 63,4 % H 9,0 % Na 2,9 % 0 24,7 % funnet C 63,5 % H 9,1 % Na 3,2 % O 24,1 %

IB-spektrumet1av det amorfe natriumsalt i CH0C10 er vist i fig. 1.

Fig. 2 viser cH-NMR-spektrumet (90 MHz) av det amorfe Na-salt i CDC13med tetrametylsilan som intern standard.

Na-saltene er godt loselige i organiske ldsningsmidler som toluen, benzen, diklormetan, etylacetat, isopropylacetat, etanol og metanol.

I vann er saltene bare lite loselige.

I tabellen er Rf-verdiene for det amorfe salt i tynnskiktkromatogram på kiesegelplater, Merck, Kieselgel 60, F 254, med 0,25 mra skikt-tykkelse vist i sammenlikning med to andre ionoforer i form av sine natriurasalter.

Fotnote f lytemiddel (Flm«):

1) Toluen-aceton (4 s 1) + 1 % trietylamin

2) Kloroforra-etylacetat (1:1)

3) Kloroforar-metanol (95 s 5)

For å gjore flekkene synlige anvendes jod eller en losning av 0,2 % Ce(S04)2i 50% svovelsyre og etterfolgende oppvarming til 120 - 150°C.

K-salt av S 11743/A

Den elementære sammensetning.av det krystallinske kaliumsalt gir f51genda verdier for

<C>41<H>69°12<K:>

teoretisk C 62,1 % H 8,8 % K 4,9 % 0 24,2 %

funnet C 61,9 % H 8,9 % K 4,8 % O (ikke bestemmbar)

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen lar seg gjennomfdre etter kjente metoder. En foretrukket kultur av den S 11743/A produserende stamme ble deponert ved United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, 111., USA og står til disposisjon for offentligheten under betegnelsen NRRL 8088.

Imidlertid kan også S 11743/A produserende stammer anvendes, som kunne erholdes fra utgangsstammen av actinomycetenarten streptomyces mutabilis ved behandling med mutagene substanser eller stråler eller ved seleksjon.

Kar alet er i sering av stammen NRRL 8088

Den nye i henhold til oppfinnelsen anvendte stamme av actinomyeeten-arten streptomyces mutabilis hie isolert fra en i 1965 iwden .Sentral-afrikanske republikk innsamlet jordprdve.

Den nye stamme HHRL 8088 vokser godt på komplekset og syntetiske næringsmedier.Luf tmucelet er bly- til sSlvgrått og sporkj edene er hovedsakelig monopodiale men mange ganger også sympodialt forgrenet. Sporekjedene kan være sammensatt av uregelmessige, åpne spiraler med mange ganger 2 feil 3 viklinger, men passer dog generelt til teminologlen "Retinaculum-Apertum". Spesielt på syntetiske medier dannes også bolgede sporekj eder. I elektronmikroskop syttes spore-overflåtene glatte, sporeformen er oval, elliptisk til sylindrisk. Sporene 0,7 - 0,9 ^u brede og 1,33 - 1,5 ai lange. Under de "grå serier" av streptomyceter med sporekjeder av "Spira-typen", glatte sporeoverflater og manglende melanin-dannende kunne stammen WRRL 8088 etter nokkelen til H. Nonomura, J. Ferment. Technol. 52, 78-92

(1974) ikke identifiseres under de "grå serier'*. Ved tilordningen til de "hvit-grå serier" var identifikasjonen som streptomyces mutabilis oppfylt. Under anvendelse av Tresner-Backus-fargeskivesystem (1963) falt stammen NRRL 8088 entydig under de "grå serier" og kunne da ved hjelp av Bergey's håndbok,side 749, 772 og 777 (8. opplag) bestemnes som streptomyces mutabilis Pridham et al. 1958i Gauze et al. 1957,

Vekstegenskapene av stammen NRRL 8088 på normale biologiske medier og dens karbonassimilasjon er oppfort i de folgende tabeller.

Vékstegenskaper

Assimilasjon av karbonforbindelser i

Den nye stamme WRRL 8088 har fSigende fysiologiske egenskaper:

Den nye stamme NRRL 8088 lar seg dyrke på forskjellige næringsmedier med de vanlige næringsstoffer, f.eks. som beskrevet i det etterfølgende eksempel.

Dyrkingen av stammen NRRL 8088 kan skje ved hjelp av aerob overflate-dyrking eller neddykkings-dyrkingt;.

For å unngå en forsinkelse ved produksjon av S 11743/A anvendes foretrukket den vegitabivje form i stedet for sporeformen av mikroorganismen for inokuleringen av produksjonsmediet. Tilsvarende fremstilles forst et vegitativt inoculum av mikroorganismen ved inokulering av en liten mengde av et dyrkingsmedium med en sporesuspensjon av stammen NRRL 8088.

Mycelandelen av dyrlcingsbuljongen oppsluttes eventuelt og forbindelsen utvinnes ved ekstraksjon og/eller adsorpsjons-metoder på i og for seg kjent måte. Man kan imidlertid også frasentrifugere mycelet fra dyrkingsbuljongen, ekstrahere dyrkingsfiltratet og mycelet separat etter oppslutning og videreforarbeide ekstraktene enkeltvis eller saralel Forbindelsen S.11743/A. isoleres foretrukket i form av saltene, idet foretrukket alkalimetall-, jordalkalimetallreller ammoniumsaltene kommer på tale.

Forbindelsen S 11743/A er egnet som legemiddel.

Forbindelsen S 11743/A viser en hemmende virkning overfor mikroorganismer som gram-pQSitive bakterier og sopper. I den fblgende tabell er de minste hemmende konsentrasjoner (MlC-verdier) mot noen mikroorganismer angitt. MIC-verdiene ble bestemt på kjent måte ved hjelp av fortynningsrekker. Bestemmelsen skjedde ved bakteriene ved inkubasjon 1 Brain Heart Infusion-buljong ved pH 7,4 og 37°C, ved soppene i maltekstraktmedium (2 %) ved pH 5,2 til 5,4 og 27°C i 48 til 72 timer*

Videre utmerker forbindelsen S 11743/A i form av syren og saltene

seg ved den f armakologiste proving ved styrking av hjertemuskalkraft og okning av koronar-gjennomstrSmningen oggkan folgelig finne anvendelse som legemiddel. Forbindelsen S 11743/A og deres fysiologisk tålbare salter er indikert for anvendelse ved akufct hjertesvikt, for sjokkterapi såvel som for behandling av koronarsykdommer.

Som legemiddel kan S 11743/A henholdsvis dens fysiologisk tålbare salter tilfores alene eller i egnet preparatform med farmakologisk indifferente hjelpestoffer.

Forbindelsen S 11743/A i form av syren eller dens salter kan anvendes for humanmedisinske formål som legemiddel alene, og da i ren form eller i tilsvarende preparater for intravenost, enteral eller parenteral tilforsel.

I den fortsatte beskrivelse er alle temperaturangivelser i °C.

De etterfølgende eksempler illustrerer utfSrelsen av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1: Dyrking av metaboliten S 11743/A i en rystekultur

a) Agar-_utgangskultur

Den som utgangsmaterial anvendte agarkultur av stammen NRRL 8088

erholdes ved at man poder et dyrkingsmedium med folgende sammensetning:

med en på i og for seg kjent måte fremstilt sporesuspensjon av den opprinnelig isolerte stamme NRRL 8088.

Mediet innstilles for steriliseringen med NaOH til pH 8,3 til 8,6. Etter steriliseringen (20 minutter ved 120°C) har pH innstilt seg til 6,9 til 7,3.

b) Sporesusgens^ori

En godt sporulerende agar-utgangskultur av stammen WRRL 8088

tilsettes 5 ral steril, 0,9 % koksaltlbsning, som gir en tykk sporesuspensjon.

c) Forkultur

Av denne sporesuspens jon anvendes 1 ml for poding av en 500 ml

Erlenmeyerkolbe, som inneholder 100 ml av fSigende forkultur-medium:

pH- verdien utgjdr 6,5 til 6,8. Forkulturmediet steriliseres i en autoklav ved 120°C i 20 minutter, hvorved pH-verdien utgjdr 6,7 til 7,2.

d) Hovedkultur

Den således podede forkultur inkuberes aerobt i 3 dogn ved 27°C

på en roterende rystemaskin (200 omdr./min.) og anvendes så direkte for poding av en hovedkultur, idet 5 ml av forkulturen i en 500 ral Erlenmeyerkolbe podes med 100 ml av f Sigende medium:

pH innstilles etter steriliseringen (20 minutter ved 120°C) med NaOH til 6,8 til 7,2. Den således podede hovedkultur inkuberes 1 6 døgn ved 27°C på en roterende rystemaskin (200 omdr. /min.).

EKSEMPEL 2: Dyrking av forbindelsen S 11743/A i en gjæringskultur

a) Forkultur

En kultur av den opprinnelig isolerte stamme 13RRL 8088 erholdes

ved dyrking i 10 dogn ved 27°C på et medium III. Sporene og mycelet i denne kultur opptas i fysiologisk koksaltløsning.

Med denne suspensjon podes Jnliter av næringsløsning som inneholder folgende medium:

b) Hovedkultur

Denne forkultur inkuberes i 3 ddgn ved 27°C på en roterende

rystemaskin (180 omdr./min.). 10 liter av denne næringsløsning inneholdende medium II podes med forkulturen og inkuberes i et gjsringskar av glass under omrøring (200 omdr./min.) og lufting (1 liter luft/min./liter næringsløsning) i 5 dogn ved 27°C.

EKSEMPEL 3: Isolering av forbindelsen S 11743/A (JJa-saltet)

100 liter dyrkingsbuljong, fremstilt i eks. 1 eller 2, sentrifugeres

hvorved det oppnås ca* 90 liter dyrkingsfilt rat og ca. 6 leg mycel. Dyrkingsfiltratet innstilles til pH 9 med 1 M natriumhydroksydlosning og filtreres klar ved hjelp av filter-hjelpemiddelet "Celite 545'<*>. Filtratet ekstraheres 3 ganger ved 20°C med hver gang 90 liter etylacetat og ekstraktene vaskes med 15 liter vann. Etter inndamping av den organiske fase i vakuum ved 20 - 40°C

oppnås ca. 16 g rå ekstrakt.

Mycelet ekstraheres forst med 12 liter metanol, deretter to ganger

med hver gang 12 liter metan&L vann (9 s 1) i hver gang 1 time ved 20 - 25°C, hvorved det samtidig homogeniseres ved hjelp av et ultra-turraksapparat. Cellematerialet frafiltreres deretter gjennom "Celite 545". Til filtratet tilsettes 5 liter vann, i vakuum inndampeé det ved 20 - 40°C til et volum på ca. 3 liter og det innstilles til pH 9 med 1 N natriumhydroksydlosning. Det ekstraheres tre 3 ganger med hver gang 3 liter etylacetat, ekstraktene vaskes med

1,5 liter vann og den organiske fase inndampes i vakuum med 20 - 40°C hvorved det oppnås 9,4 g ekstrakt.

De to ekstrakter forenes, opptas i 500 ml vann og ekstraheres tre gangei? med hver gang 250 ral toluen. Toluenfasen vaskes en gang måd 100 ml vann, torkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum ved 40°C, hvorved det oppnås 11 g av en gul, oljeaktig rest. Den rest-kromatograferes på den 50-dobbelte mengde kieselgel 60, Merck, kornstSrrelse 0,06 - 0,2 mm. For forberedelse av kolonnen og for påforing av substansen anvendes toluen-aceton (98 j 2) + 1 % trietylamin. Elueringen med toluen-aceton (98 : 2) + 1 % trietylamin og med toluen-aceton (9 : 1) + 1 % trietylamin gir overveiende inaktive fSlgestoffer. Med toluen-aceton (4 : 1) og toluen-aceton (1 s I) under tilsetning av i det enkelte tilfelle 1 % trietylamin elueres S 11743/A i anriket form. Fraksjonene inndampes i vakuum ved 20 - 40°C og resten proves tynnskiktkromatograf isk og biologisk mot stafulococcus aureus på innholdet av S 11743/A. De aktive fraksj oner forenes og kromatograferes på nytt på den 40-dobbelte mengde kieselgel, idet kloroform med stigende metanolinnhold anvendes for elueringen. Klo<p>oformmetanol (98 : 2) eluerer S 11743/A i meget anriket form. Etter inndamping av de aktive fraksjoner i vakuum ved 20 - 40 C oppldses den lysegule rest kloroform, utrystes en gang med 1 N natriumnut, den organiske fase vaskes med vann, inndampes i vakuum og resten krystalliseres fra den 1,5-dobbelte mengde aceton, hvorved S 11743/A-Na-salt oppnås <;i form av fargeløse, acetonholdige krystaller med et smeltepunkt 159 - 163°C. For fjernelse av krystallacetonet oppvarmes i vakuum flere ganger med benzen og deretter méd metanol.*Det amorfe, rene natriumsalt av S 11743/A tørkes i hoyvakuum ved 60°C og smelter da ved 166 - 169 C.

EKSEMPEL 4: Kaliumsalt av S 11743/A

280 rag S 11743/A Na-salt 15ses i 40 ml kloroform og utrystes to . ganger med hver gang 40 ral 2 N saltsyre og vaskes med 40 ml vann. Den organiske fase med den fri syre av S 11743/A blir deretter med

en gang utjsystet to ganger med hver gang 40 ml 2 N KOH og vasket en gang med 40 ml vann. Kloroformfasen tørkes med fint kaliumkarbonat og inndampes etter filtrering under vakuum. Resten loses i 2 ml metanol og filtreres gjennom talkum. Etter 4 timer frafiltreres krystallisatet og omkrystalliseres fra 2 ml kokende metanol. Etter henstand over natten frafiltreres og resten tørkes under hoyvakuum i 1 time ved 40°C hvorved det erholdes fargeløse krystaller med et smeltepunkt 158 - 160°C.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen S 11743/A i form av syren med formel I

og dens salter,karakterisert vedat en S 11743/A produserende ny stamme av actinoraycetenarten streptomyces mutabilis dyrkes på eller i et næringsmedium og deretter isoleres forbindelsen S 11743/A fra næringsmediet i form av syren og dens salter og renses.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, ,karakterisert vedat det som ny stamme av acinoraycetenarten streptomyces mutabilis anvendes stammen NRRL 8088.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat man anvender en stamme utvunnet fra stammen NRRL 8088 ved behandling raed mutagene substanser eller stråler eller ved seleksjon.