NO770897L - Stabiliserte hematologiske reagensoppl¦sninger - Google Patents

Description

Stabiliserte hematologiske reagensopplosninger.

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av 2-fenoksyetanol som et bakteriostatisk og fungistatisk agens og natriumfluorid som et stabiliserende agens i reagenser som anvendes i hematologiske studier der det anvendes elektroniske partikkelanalyseringsapparater av Coulter-typen.

I norsk patent nr (norsk sbknad nr. 753282) er det angitt et for flere formål ment fortynnihgsmid-del for anvendelse ved i fbrste rekke hematologiske fremgangsmåter, telling av blodceller og bestemmelse av hemoglobinkon-sentrasjon og andre betydningsfulle parametere i en blodprbve ved hjelp av en automatisert elektronisk partikkelanalyserings-apparatur av Coulter-typen. Opplosningen er osmotisk balansert for stabilisering av middelcellevolumet og den er azid-fri og anvender 2-fenoksyetanol som et bakteriostatisk og fungistatisk agens.

Natriumfluorid er anvendt for å motvirke den svek-ning av celleveggen som forårsakes av 2-fenoksyetanol og der-ved stabilisere de rode blodlegemers middelcellevolum. Natrium-fluoridet tjener også til å hjelpe til med overforing av hemoglobin til cyanmethemoglobin for kolorimetrisk bestemmelse av hemoglobin.

Anvendelsen av et bakteriostatisk og fungistatisk agens medforér hittil ikke Snskede variasjoner hva angår middelcellevolumet av de rode blodlegemer og dette forer til ustabi-litet når det gjelder de rode blodlegemers middelvolum. På grunn av ønskeligheten å anvende et bakteriostatisk agens som erstatning for natriumazid, slik som forklart i det ovenfor angitte patent, er 2-fenoksyetanol valgt på tross av det aldri tidligere er anvendt i denne egenskap. Imidlertid kan 2-fenok syetanol medfore ødeleggelse av celleveggene eller endring av cellevolumet. For å unngå problemer med hemolyse eller krene-lering er det anvendt en stabilisator i det resulterende sys-temet. Selv om natriumfluorid lenge har vært kjent som et kon-serveringsmiddel, f.eks. for å konservere glykose i blodprbver, var anvendelsen av dette som stabilisering i det resulterende system helt uventet.

Foreliggende oppfinnelse angår en kombinasjon av et etoksylert fenol, f.eks. 2-fenoksyetanol og et alkalimetall-fluorid, f.eks. natriumfluorid, som virksomt til anvendelse i andre reagensopplbsninger som anvendes for andre formål ved hematologiske fremgangsmåter, spesielt slike som anvender elektroniske partikkelundersokelsesmetoder.

Det har vist seg at 2-fenoksyetanol og natriumfluorid kan anvendes i et resulterende systém eller kombinasjon i et lyseringsreagens for rode blodlegemer. Et slikt lyseringsreagens må være istand til hurtig å lysere de rode blodlegemer og å bdelegge de rode blodlegemers membran til en partikkelstor-relse som er tilstrekkelig liten til at f.eks. hvite blodlegemer skal kunne erkjennes og telles. Samtidig må lyseringsagen-set frigjbre hemoglobin fra de rode legemer og overfore hemoglobin til cyanmethemoglobin for å muliggjbre en kolorimetrisk bestemmelse. Kombinasjonen av de nevnte to agenser har frem-bragt meget aktive antibakterielle og antifungicide funksjoner,

■spesielt når de kombineres med en fireverdig ammoniumforbindelse. Anvendelsen av natriumfluorid opprettholder fluoridkon-sentrasjonen og hjelper også til med overforing av hemoglobin til cyanmethemoglobin.

Anvendelse av kolorimetriske hemoglobinbestemmelser krever en kalibreringsopplbsning som anvendes for å kalibrere kolorimetere. Spesielt er å anbefale en kalibreringsopplbsning av ferske med salt vaskede rode blodlegemer fra mennesker og disse lyseres for å bdelegge de rode blodlegemers vegger. Etter fullstendig lysering av legemenes omdannes det frigjorte hemoglobin til cyanmethemoglobin og fortynnes til den nbdven-dige konsentrasjon for anvendelse ved kolorimetriske bestemmelser. Et problem som oppstår består i den letthet med hvilken bakterier vokser i hemoglobinopplbsningen, spesielt bakterier av den type der tilveksten understøttes av forekomsten av cyan-idioner som er den samme som kreves for dannelse av cyanmethemoglobin. Man kan anvende 2-fenoksyetanol og natriumfluorid, hvorved 2-fenoksyetanol tjener som et meget aktivt bakteriostatisk agens, spesielt ved nærvær av en firverdig ammoniumforbindelse.

Blodceller som er tatt fra mennesker eller dyr anvendes suspendért i et egnet medium .eller et syntetisk plasma som et "styre"- eller "kalibrerings"-medium ved arbeide med instrumenter for telling av blodlegemer. Blodlegemenes oppnås fra mennesker og sammenklumping forhindres ved anvendelse av antikoaguleringsmidler. Plasma fjernes ved sentrifugering og de rode blodlegemer vaskes under sterile forhold med steril saltopplbsning og cellene pakkes deretter ned for etterfølgende suspensjon i et konserverende og stabiliserende medium. For-delaktig er her et slikt medium som et kunstig plasma oppnådd i en slik form at det kan tilsettes til denslags separerte blodlegemer. Mediet inkluderer et fortynningsmiddel av den type som er angitt i det ovenfor angitte patent og omfatter videre oksalbumin, laktose og ytterligere 2-fenoksyetanol. Opp-løsningen blandes grundig og osmolaliteten innstilles ved hjelp av natriumklorid til ca. 370 milliosmol pr. kilogram vann. Etter at osmolaliteten er innstilt, filtreres oppløsningen og filtratet lagres i sterile glassflasker. Natriumfluorid finnes i oppløsningen og virker som en cellevolumstabilisator. Til-setningen av oksalbumin og laktose skjer for å oppnå ytterligere fysikalsk-kjemisk balanse hva angår vanngjennomgangen gjennom cellemembraner til cellens innside. Videre er 2-fenoksyetanol anvendt som et bakteriostatisk og fungistatisk agens. Mediet eller oppløsningen kan deretter tilsettes til vaskede blodlegemer i tilstrekkelig mengde til å frembringe den ønskede telling.

Anvendelsen av 2-fenoksyetanol og natriumfluorid som et såkalt blanking- eller utfyllingsreagens ved hematologiske bestemmelser er også forment.

Eksempler på fortrinnsvis anvendte utforelsesformer av oppfinnelsen gis nedenfor: . B. Som utfyllingsreagens ( blanking- reagens)

C. Som rengjøringsmiddel med bakteriostatiske, fungistatiske

og stabiliserende egenskaper

Eksempel ( 3)

D. Som tilsetning til vannbad

Eksempel ( 4)

(a), (b), (c) og (d) blandes med tilstrekkelig mengde destillert vann for å danne 1.000 ml og tilsettes sammen etter at de er blandet til samme volum (1.000 ml) 2-fenoksyetanol. Det an-befalte volum for effektiv anvendelse er 1 volum av den resulterende opplosning i 100 volumer destillert eller deionisert vann.

Hvis det under anvendelsen skulle skje en oppbygging av syre i vannbadet, skjer folgende fargeforandringer når pH- verdien synker: E. Som en styre- eller kalibreringsopplbsning Eksempel ( 5)

Destillert vann i en mengde som tilsammen gir 1 liter

Til 1.000 ml av denne opplbsning tilsettes:

Osmolaliteten innstilles til ca. 370 milliosmol/kg vann.

De nu spesifiserte opplosninger innstilles til én pH-verdi på mellom 7 og 8 og fortrinnsvis 7,2 - 7,5, ved hjelp av det egnede hufférmiddel, EDTA og fosfatsalt. Osmolaliteten i opplbsningen opprettholdes fortrinnsvis på 320 - 340 milliosmol. Konsentrasjonen av natriumfluorid strekker seg mellom

0,03 og 0,1 vektprosent, beregnet på den totale opplbsning, med en fortrinnsvisverdi på 0,05 vektprosent, og konsentrasjonen av 2-fenoksyetanol ligger i området 0,2 til 1,0 vektprosent, beregnet på den totale opplbsning, med en fortrinnsvis verdi på 0,34% i kalibrerings- eller styreopplbsningen og 0,2% i de opplosninger som anvendes for andre formål.

De bnskelige egenskaper hva angår osmotisk baLanse oppnås ved egnet anvendelse av både natrium- og kaliumklorid. Bufring ved anvendelse av natriumhydroksyd elimineres her.

Anvendelsen av agenser for osmotisk balansering, f. eks. natriumklorid, kaliumklorid og slike bufferagenser som natriumhydroksyd i den slags reagenser er kjente. Det er også kjent å anvende et gelateringsmiddel som i samvirke med det anvendte fosfatsalt tjener som buffermidler for å oppnå et onsket pH-område innenfor hvilket fortynningen er virksom.

Et slikt gelateringsmiddel er etylendiamintetraéddiksyre (EDTA).

Tilberedningen av oppløsningene krever ikke noen spesielle fremgangsmåter eller noen spesiell rekkefolge hva angår bestanddelenes tilsetning til vannet. Oppfinnelsen omfatter således ikke noen metodologi hva angår fortynnings-formelen. Blandingen av bestanddelene skjer mekanisk ved en egnet omroring i et tidsrom på 1 - 2 timer. Opplbsningen filtreres deretter gjennom et filter for 0,2^um og lagres direk-te i plastbeholdere.

Selv om fortrinnsvis anvendte sammensetninger er spe-sifisert, kan pH- og osmolalitetsomradene utvides for nyttige formål. Således kan pH-området opprettholdes mellom 7,0 og 8,0. Likeså kan det anvendbare område hva angår osmolalitets-verdien ligge mellom 300 og 380 milliosmol. Dette kan oppnås ' ved å variere mengden .av aktive bestanddeler.

For en fagmann er det åpenbart at de her beskrevne opplosninger kan anvendes på samme måte som tidligere tilgjenge-lige isotoniske opplosninger for de beskrevne formål, men man unngår de motstridende problemer som folger med anvendelsen av den slags tidligere kjente opplosninger.

Claims (14)

1. Kjemisk stoff for anvendelse i forbindelse med hematologiske undersdkelser, spesielt et stabilisert konserverings-middel for hematologiske reagenser, karakterisert ved at det består av en etoksylert fenol og et alkalimetall-fluorid.

2. Stoff ifolge krav 1, karakterisert ved at den etoksylerte fenol utgjbres av 2-fenoksyetanol.

3. Stoff ifolge krav 1, karakterisert ved at alkalimetallfluoridet utgjbres av natriumfluorid.

4. Stoff ifolge krav 1, karakterisert ved at den etoksylerte fenol utgjbres av 2-fenoksyetanol og alkalimetallfluoridet av natriumfluorid.

5. Stoff ifolge krav 1, karakterisert ved at pH-verdien opprettholdes mellom 7,0 og 8,0 og at osmolaliteten opprettholdes mellom 300 og 380 milliosmol.

6. Stoff ifolge krav 4, karakterisert ved at natriumfluorid forefinnes i en konsentrasjon mellom 0,03 og 0,1 vektprosent,beregnet på den totale opplbsning.

7. Stoff ifolge krav 4, karakterisert ved at konsentrasjonen av 2-fenoksyetanol ligger mellom 0,2 og 1,0 vektprosent, beregnet på hele opplbsningen.

8. Stoff ifolge krav 1, anvendt som rengjbringsopplbs-ning spesielt for hematologiske apparater, karakterisert ved at det består av en osmotisk balansert opplbsning av natriumklorid, kaliumklorid, mononatriumfosfat (mono-hydrat), dinatriumfosfat, alkalimetall-etylendiamin-tetraeddik-syre, 2-fenoksyetanol, natriumfluorid og polyoksyetylert al-kylfenol i vannopplbsning.

9. Stoff ifolge krav 8, karakterisert ved at det inneholder et dispergert fargestoff.

10. Stoff ifolge krav 1 anvendt som lyseringsreagens for rode blodlegemer, karakterisert ved at det også består av a) en osmotisk balansert opplbsning av natriumklorid, kaliumklorid, mononatriumfosfat og dinatriumfosfat, b) en fireverdig ammoniumforbindelse, c) kaliumcyanid, d) natriumnitritt, hvorved lyseringsreagenset utgjbres av en vannopplbsning der alkalimetallfluoridet tjener til å opprettholde fluoridkonsen- trasjonen og til å understotte omdanning av hemoglobin til cyanmethemoglobin for hemoglobinbestemmelse og etoksylert fenol tjener som fungistat og bakteriostat.

11. Stoff ifolge krav 10, karakterisert ved at den etoksylerte fenol er 2-etoksyetanol og alkalimetallfluoridet er natriumfluorid.

12. Stoff ifolge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det består av osmotisk balansert opplosning av natriumklorid, kaliumklorid, mononatriumfosfat og dinatriumfosfat, natriumfluorid, 2-fenoksyetanol, etylendiamintetraeddiksyre, oksalbumin og laktose, i en vannopplbsning der det opprettholdes en osmolalitet på ca.

300 til 380 milliosmol pr. kg.

13. Stoff ifolge et hvilket som helst av de foregående krav og tjenende som vannbadtilsetning som har antikorrosjons-egenskaper og fungistatiske og bakteriostatiske egenskaper for analyseapparater for kjemisk analyse, karakterisert ved at det omfatter et alkalitrietanolaminsalt, etylendiamintetraeddiksyre, et ikke-ioneaktivt fuktemiddel og 2-fenoksyetanol og natriumfluorid.

14. Stoff ifolge krav 13, karakterisert ved at det inneholder et fargestoff for pH-indikering.