NO770898L - Fremgangsm}te til stabilisering av erythrocyter - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til stabilisering av ebythrocyter.

Foreliggende oppfinnelse vedrører behandling av biologiske cellematerialer, og mer spesielt behandling av erythrocyter. Spesielt angår oppfinnelsen fiksering av erythrocyter- under anvendelse av en to-trinns sekvens-beleggings-teknikk, omfattende visse aldehydmaterialer.

På området medisinsk diagnose er det ofte meget hensiktsmessig å anvende erythrocyter som hjelp i påvisning av enten antigener eller antilegemer i en prøvevæske. Erythro-cytmaterialet i 'dette tilfelle anvendes som en bærerpartikkel for et tilfestet antigen eller antilegeme. Når et antigen-materiale bringes i kontakt med et antilegeme som er spesifikt for det materiale, får man som kjent en antigen-antilegeme-reaksjon. I noen systemer kan denne reaksjon tydelig sees og resulterer i et antigen-antilegeme-kompleks som kan skjelnes enten med det blotte øye eller ved hjelp av laboratorieutstyr.

I andre tilfeller er reaksjonsproduktet, selv om man har en antigen-antilegeme-reaksjon, imidlertid ikke synlig med det blotte øye eller med hjelpeutstyr ved noe hensiktsmessig nivå.

I slike situasjoner er det meget nyttig å ha et spesielt medium som bærer for enten antigenet eller antilegemet, slik at etter-følgende reaksjon med det kompleksdannende materiale kan syn-liggjøres på grunn av at man får sammenklumping eller agglutinering av partiklene.

Man har tidligere benyttet en rekke forskjellige partikkelformige materialer som basis, hvorpå antigenet eller antilegem4t kan festes for etterfølgende reaksjon, inkludert latexpartikler slik som styren, butadien, akrylpolymerer og forskjellige blodceller slik som menneske- og animalske erythrocyter (røde blodceller). Erythrocyter er en meget skjør og følsom komponent i blod og utgjør hovedmediet,hvorpå antigener føres gjennom vertssystemet. Røde blodlegemer hos mennesker med-bringer som kjent en rekke forskjellige antigener , hvis be-skaffenhet og sammensetning gir opphav til et "fingeravtrykk" som er nyttig ved bestemmelse av hvilken blodtype en mottager kan tolerere ved en blodoverføring.

Når røde blodlegemer anvendes for å påvise antigen-antilegeme reaksjon, betegnes den resulterende agglutinering hemagglutinering, og når møde blodlegemer anvendes til å med-bringe eller bære et antilegeme snarere enn et antigen for påvisning av et antatt antigen i et vertserum, betegnes fenomenet reversert passiv hemagglutinering.

Som illustrasjon på en reversert passiv hemagglutinering kan nevnes det velkjente påvisningssystem for tilstede-værelsen av hepatit forbundet med antigen i en pasients serum. Vanskeligheten med anvendelse av røde blodlegemer i et slikt hemagglutineringssystem, eller i et hvert antigen-antilegeme-påvisningssystem, er at røde blodlegemer er meget skjøre, føl-somme og ustabile.

Dersom man lar røde blodlegemer være suspendert i

et isotonisk medium, vil de lyseres iløpet av ca. 21 dager..

Det vil si at den understøttende eller bærende struktur av

røde blodlegemer vil begynne å svekkes og bevirke utskilning eller tap av hemoglobin til omgivelsene. Man får lysering av cellene, hvilket gjør materialet fullstendig uegnet for even-tuell bruk i et agglutinerings-påvisningssystem.

Foreliggende oppfinnelse angår behandling av røde blodlegemer for å forbedre deres stabilitet og for at de skal kunne brukes i påvisningssystemer for antigen-antilegeme-reaksjon. Fremgangsmåten til en slik behandling av røde blodlegemer kalles fiksering.

Fiksering av erythrocyter for å forbedre stabilitet er en velkjent teknikk. Ved valget av passende fikseringsmidler må man naturligvis passe på at fikseringsmidlene ikke selv bi-drar til lysering av erythrocytene i ikke-tolererbar grad eller har en vesentlig skadeinnvirkning på de etterfølgende agglutineringssystemer. Selv om fenomenet med cellebeskyttelse ikke er helt ut forstått, antas det at fikseringsmidlet bevirker en kjemisk reaksjon med proteinkomponenter på overflaten av cellen, og det resulterer i en beskyttet celle.

I US-patent nr. 3-714-345 beskrives en dobbelt aldehyd-behandlingsprosess for belegging av erythrocyter under anvendelse av pyrodruesyre-aldehyd i et første behandlingstrinn fulgt av formaldehyd i et annet trinn, Denne stabilisering angis å være effektiv uten tilsynelatende forandring av de behandlede cellers evne til å reagere med anti-A eller anti-B serum. Dette betyr at det påstås at stabiliseringen ikke er effektiv når det gjelder å redusere antigenisiteten hos røde blodlegemer.

Andre publikasjoner viser forskjellige fikserings-teknikker. F.eks. viser Ling i Brit. J. Haemat. (1961), 7>side 299>behandling av røde blodlegemer med formaldehyd, pyrodruesyre-aldehyd, glyoksal,- glutarsyre-dialdehyd og glyoksylsyre.

Det rapporteres der at pyrodruesyre-aldehyd er det foretrukne aldehyd for fiksering av røde blodlegemer. Bruken av store mengder glyoksal resulterte i en behandlet celle som ikke kunne brukes konsekvent og med pålitelighet som en basis for tilfesting av serum proteiner (slik som antigener og antilegemer). Det konkluderes i nevnte publikasjon at glyoksal-teknikken var uegnet. Dårlig stabilitet etter seks måneder ble oppnådd med glyoksal

i motsetning til de pyrodruesyre-aldehyd-behandlede cellene.

Røde celler har også blitt behandlet med peroksy-saltoppløsninger (Chem.Abstracts (I96I), side 27495)°g benyttet i antigen-airtilegeme agglutineringssystemer (Chem. Abstracts ( I96I), side 20672).

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det nå oppdaget

at erythrocyter kan stabiliseres ved en to-trinns behandling som innebærer at man bringer cellene i kontakt med en mengde glyoksal i et første behandlingstrinn fulgt av å bringe de behandlede celler i kontakt med en mengde formaldehyd eller glyoksal i et annet behandlingstrinn. Glyoksal er et aldehyd som kan eksistere i monomer, dimer, trimer eller polymer tilstand. Monomeren kan illustreres strukturelt som

Materialet er et fast stoff og er kommersielt tilgjengelig som den faste, dihydratiserte trimere form som har tre- mol glyoksal og to mol vann pr. mol trimer, nemlig:

eller som en /\. 0% vandig oppløsning (basert på vekten av monomer fri glyoksal). Formaldehyd fåes oftest som en vandig oppløsning av formaldehydgass som er kommersielt tilgjengelig som formalin, 40% vekt/volum (40 g formaldehyd pr. 100 ml vandig oppløsning).

Mengden av røde blodlegemer i ethvert væskevolum enten cellelegemene er fra sauer, kalkuner, kaniner, mennesker eller andre dyr, refereres hensiktsmessig ved å angi det volum som de opptar. Et nyttid mål på mengden av røde blodlegemer i en hvilken som helst væskesuspensjon av slike cellelegemer, er volumet av cellelegemer uttrykt som en prosentandel av hele volumet på væskesuspensjonen i en gitt prøve. Denne parameter betegnes Hematocrit eller pakket cellevolum og gir en pålitelig angivelse av de røde celler når det gjelder å tilveiebringe en fellesnevner for angivelse av volumer. Hematocrit er en standard bestemt parameter og uttrykkes som et prosenttall. En Hematocrit på Q0% betyr således at de røde blodlegemene i 100 ml av en væskeformig suspensjon av røde blodlegemer opptar 40 ml. Dette betyr at det pakkede cellevolum er 40 ml« Det fremgår derfor at dersom volumet av den væskeformige suspensjon fordoblefe mens volumet a1? de røde blodlegemer i suspensjonen forblir det samme, vil Hematocrit-verdien være halvparten av den opprinnelige, d.v.s. 20% i tilfelle for det ovenfor angitte eksempel.

Hematocrit bestemmes konvensjonelt under anvendelse av en standard laboratorie makro-metode ifølge Wintrobe, som beskrevet i Clinical Diagnosis By Laboratory Methods, 14. utgave, W.B. Saunders Company (utgitt av Israel Davidsohn, M.D., F.A.C.P., og John Bernard Henry, M.C.). På side 146 i dette skrift er makro metoden beskrevet som følger:

Utstyr.

Wintrobe Hematocrit-røret er et tykkvegget glassrør med en ensartet indre boring og en flat bunn. Den er inndelt i millimeter fra 0 til 105 og har én gummihette for å hindre fordampning iløpet av den lange sentrifugering.

Av de forskjellige former for tilgjengelige ifgrllings-pipetter er en 2-ml sprøyte med en nål lang nok til å nå bunnen av hematocrit-røret praktisk og hensiktsmessig.

Det vesentlige krav til en sentrifuge er at den ut-vikler et sentrifugalfelt på ikke mindre enn 25OO G ved bunnen av beholderen.

Reagens.

Som et antikoagulasjonsmiddel er tørket heparin, utbalansert oksalat eller EDTA tilfredsstillende. Hvis en utilstrekkelig mengde blod føres ned i prøverøret, hvilket resulterer i et overskudd av oksalat eller EDTA§. vil erythrocytene krympe og hematocrit-verdien vil bli uriktig lav.

Metode.

Det oksalatbehandlede eller hapariniserte blod må blandes grundig med ikke mindre enn 30 langsomme og fullstendige vendinger av beholderen. Dreining av flasken er utilstrekkelig og rysting er mer uheldig fordi dette kan skade cellene.

Etter tilstrekkelig blanding fylles hematocrit-røret under anvendelse av en pipette eller en sprøyte fortrinnsvis i en operasjon. Pipettens spiss innføres til bunnen av røret. Ettersom fyllingen forløper, heves pipettespissen, men den forblir under den stigende blodmenisk for å unngå skumming. Blodnivået bør roteres og rørene tillukkes for å unngå fordampning under den nødvendige sentrifugering i 30 minutter ved 25OO §.

Avlesing foretas uten å forstyrre prøven. Resul-tatet beregnes ut fra følgende formel:

hvor er høyden på søylen av røde blodlegemer i mm og er høyden av hele blodprøven (røde blodlegemer og plasma). Det gråhvite lag av leukocyter og blodplater over erythrocytene er ikke inkludert i .

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det funnet at mengden av glyoksal og formaldehyd som anvendes i behandlings-trinnene hensiktsmessig kan forholdes til en enhet av Hematocrit-måling under anvendelse av den ovenfor beskrevne teknikk.

En hematocrit-verdi vil fortelle fagmannen hvilket pakket volum

de røde blodlegemer opptar. Dette volum vil vanligvis ikke forandres fra blodprøve til blodprøve i særlig grad i forbindelse med foreliggende oppfinnelse forutsatt at sentrifugeringsbeting-elsene for prøvene er vesentlig kekvivalente. Således kan en hematocrit-verdi oppnådd f.eks. for saue-erythrocyter sammen-lignes med en hematocrit-verdi oppnådd for kalkun-erythrocyter eller menneske-erythrocyter, med hensyn til bestemmelsen av mengden av fikseringsmiddel som skal anvendes ved utførelse av foreliggende oppfinnelse. Betegnelsen hematocrit-verdi betegner det pakkede cellevolum av røde blodlegemer ved anvendelse av makrometoden ifølge Wintrobe ved en sentrifugalkraft på minst 2500 G. i 2O-3O minutter. Videre menes med betegnelsen "pakket cellevolum" det volum av røde celler oppnådd under nevnte betingelser med mindre annet er angitt.

En passende hematocrit-verdi forutførelse av foreliggende oppfinnelse er Q%. Dette tilsvarer 0,8 ml pakket cellevolum pr. 10 ml væskeformig rød celle-suspensjon. Denne konsentrasjon gir en væskesuspensjon av røde blodlegemer som er hensiktsmessig å håndtere og som er langt mindre viskøs enn helt blod, men likevel konsentrert nok til å behandle betydelige mengder celler. Ifølge foreliggende oppfinnelse er mengden av glyoksal benyttet i det første behandiingstÉinn i området 0,1

til 0,4 g og fortrinnsvis 0,1 til 0,3 g glyoksal pr. 0,8 ml pakket cellevolum. Det er mest hensiktsmessig å tilføre den passende mengde glyoksal i form av en fortynnet oppløsning derav, av størrelsesorden 1 til 4% (1_4 g glyoksal(basert på fri monomer) oppløst pr. 100 ml oppløsning). Dette oppnås hensiktsmessig ved fortynning av kommersielt tilgjengelig ^0% glyoksal til den passende konsentrasjon.

Ved utførelse av foreliggende fremgangsmåte velges røde blodlegemer avhengig i stor utstrekning av den påfølgende antigen-antilegeme-reaksjon i forbindelse med hvilken de vil bli benyttet for å påvise. I mange situasjoner ønskes menneske-celler, men like egnet er erythrocytene av sau, hest, kylling, kalkun og kanin. Kontakten av erythrocytene med glyoksal utføres i nærvær av et vandig medium som har en tonisitetsgrad vesentlig forenelig med cellenes integritet, fortrinnsvis et hypertonisk medium,

slik som natriumcitrat-oppløsning, i tidsrom varierende fortrinnsvis fra l8 - 24- timer. Kortere eller lengere perioder resulterer vanligvis ikke i ytterligere nyttevirkning. Reaksjonstemperaturen er vanligvis 18 - 25°C, idet romtemperatur foretrekkes.

Den aktuelle konsentrasjon av natriumcitrat i slutt-mediet vil avhenge av flere faktorer inkludert fortynningene av aldehyd, de spesielle erythrocyter som er benyttet og lignende. Det vandige mediet omfatter hensiktsmessig natriumcitrat (basert på dihydrat) i området 4j5til 5% vekt/volum.

Det første behandlingstrinn i foreliggende fremgangsmåte er et kritisk øyeblikk når det. gjelder stabiliseringen av erythrocytene. De meget følsomme, skjøre, ubehandlede erythrocytene omdannes i dette trinn til en mer stabil form som kan tolerere variasjoner i miljø og forhold som de ubehandlede celler ikke kunne tåle. I betraktning av dette resultat kan betingel-sene i det andre behandlingstrinn være noe hardere enn de som benyttes i første behandlingstrinn, hvilket vil fremgå fra det nedenstående.

Etter behandlingen i det første trinnet vaskes cellene frie for eventuelle hemolyserte celler som kan ha resul-tert, vanligvis med en isotonisk saltvannsoppløsning, og behandles deretter i det andre trinnet med enten formaldehyd eller glyoksal i mengder på minst 0,1 og fortrinnsvis varierende fra 0,1 til 0,6 g og helst 0,1-0,3 gPr« °>8 ml pakket cellevolum.

Denne behandling utføres hensiktsmessig under de samme betingelser som den første glyoksalbehandling, skjønt konsentrasjoner av det andre aldehyd i den høyeste ende av mengde-området har tendens til å kreve kortere behandlingstid. Etter at den andre behandlingen er ferdig, vaskes cellene fortrinnsvis ved benyttelse av en saltvannsoppløsning eller et buffer-vaske-medium, og er deretter ferdig for belegging med antigen eller antilegeme for etterfølgende bruk i et påvisningssystem.

Celler behandlet ifølge foreliggende oppfinnelse har vært stabile ved 5°C i over åtte måneder, de har ikke vist noen tegn på hemolyse og er egnet for belegging med antigen eller antilegeme. Dette står i kontrast til den situasjon som fore- ligger med ubehandlede celler hvor hemolyse begynner nesten umiddelbart og er vanligvis fullstendig iløpet av ca. 21 dager.

I tillegg til dette bibeholder de behandlede celler sin evne til å kunne belegges med antilegeme eller antigen og å reagere spesikt. Antilegeme eller antigen kan f.eks. festes til den behandlede celle ved hjelp av velkjent teknikk. Forskjellige antigener og antilegemer slik som menneske chorion gonadatropin, hepatit antilegeme, fibrinogen, albumin, gamma-globulin og lignende, kan anvendes.

De ovenfor angitte betingelser for bestemmelse av hematocrit ble benyttet for a) å gi en standard for alle kilder av røde celler;

og

b) å benytte de vanligste laboratoriemetoder.

Dersom forskjellige bestemmelsesbetingelser anvendes

eller hvis elektroniske celle-tellere anvendes, hvilket resulterer i et pakket cellevolum som er forskjellig fra det som anvendes under anvendelse av de ovennevnte Wintrobe-betingelser, bør man relatere nevnte pakkede cellevolum med en hematocrit-verdi oppnådd under de beskrevne Wintrobe-betingelser for beregning av mengden av fikseringsmiddel som skal benyttes.

Benyttede buffere eller fortynningsmidler kan være ethvert av de biologisk egnede materialer som normalt anvendes innen teknikken, og som er vesentlig forenelige med cellenes integritet. Betegnelsen "biologisk egnede" inkluderer forenelig-het med de aktuelle antigen eller antilegemer og med ikke-lysering av erythrocyter. Slike materialer som normale saltvannsopp-løsninger, oppløsninger av natriumcitrat og lignende kan anvendes. Natriumcitrat-oppløsninger på ca. 4>5~5$ vekt-volum er mest fore-trukket .

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

100 ml av blodtype 0 Rh negativ ble oppsamlet fra et menneske i et standard syre-citrat-dextrose (ACD) antikoagulerende medium. Cellene ble vasket fire ganger i 10 volumer med isotonisk saltvann. Cellene ble resuspendert i en av to buffere som angitt nedenfor ved et nivå av Q% hematocrit (under anvendelse av Wintrobe-makrometoden). Bufferoppløsningene hadde følgende sammensetning: 1. Citrat - 5>0% vekt/volum vandig natriumcitrat, 2H20, pH 8,7 og 2. Fosfat - l6,l8 g Na2HPO^-vannfritt 4,9 g KHgPO^-fannfritt pH 7,2(0,15 M)

Forskjellige fortynninger av 40 g % vandig glyoksal (basert på fri monomer) ble fremstilt som angitt i nedenstående tabell under anvendelse av den angitte Buffer. 10 ml av den buf-rede glyoksaloppløsning ble deretter blandet med 10 ml cellesuspensjon. Således ble i hvert tilfelle 0,8 ml pakket cellevolum bragt i kontakt med den angitte mengde glyoksal.

Hver prøve ble blandet i en magnetisk rører ved 20-25°C i 18-24 timer. De fikserte celler i hver prøve ble deretter separat vasket fire ganger i saltvann, og deretter innstilt pånytt til Q% hematocrit i den angitte 5% citratbuffer.

Eksempel II

De angitte volumer av hver av prøvene A til H oppnådd i Eksempel I, ble behandlet med det nedenfor angitte aldehyd i de viste mengder.

Geilene ble blandet med aldehydet ved romtemperatur

i l8-24 timer. Deretter ble de vasket fire ganger i saltvann,

og innstilt til 8% hematocrit i 0,1 M fosfatbuffer med følgende sammensetning:

3,26 g KHgPO^(vannfri)

10,78 g Na2HP0/(_ (vannfri)

1 g NaN^

• q.s. til 1 liter

Cellene ble hensatt ved +5°C i en uke og ble deretter inspisert for kontroll av hemolyse. Den ovenstående væske i prøvene F, G og H var gul, hvilket indikerte at cellene ikke var helt stabiliserte.

Eksempel III

Hver av prøvene A til H oppnådd i Eksempel II ble benyttet i et antigen-antilegeme påvisningssystem som følger: 125 yul av 8% hematocrit-cellesuspensjonen i 0,1 M fosfatbuffer anbringes i et reagensrør. Cellene vaskes en gang med isotonisk saltvann, saltvannsoppløsningen dekanteres og 0,5 ml 0,1 M acetatbuffer<1>, pH 4 tilsettes tilcellene. Til dette tilsettes 5~20 mikrogram av affinitetsrenset hepatit B -antilegeme fra en sjimpanse, og suspensjonen blandes ved romtemperatur i 75 minutter. Cellene vaskes deretter fire ganger med isotonisk saltvann, saltvannsoppløsningen dekanteres og cellene suspenderes i 0,1 M fosfatbuffer angitt i Eksempel' II og ytterligere inneholdende 0,01 M EDTA, ifo normalt menneskeserum og 0,1% gelatin.

En 0,25 yUl prøve av hver cellesuspensjon ble deretter innført

i en mikrotite-brønn inneholdende 25/ul av et fortynningsmiddel og 7 yUl av enten

<1>2,45 g NaC2H302•. 3H20

4,7 ml eddiksyre (isaktig)

q.s. til 1.000 med destillert vann.

a) menneskeserum som man vet inneholder hepatit B-antigen(svakt positivt ved radio-immunoprøving-teknikk); b) menneskeserum som man vet er negativ for hepatit B-antigen ved radio^immunoprøvingsteknikk); eller

c) intet i tillegg til fortynningsmidlet (kontroll).

I hvert tilfelle ble de antilegeme-belagte celler

blandet ved rysting og hensatt uforstyrret i to timer ved romtemperatur. Mikrotiter-brønnene ble deretter undersøkt for til-stedeværelse av en agglutineringsreaksjon. Eksempler A til D

ga reaksjoner for det positive serum og ingen reaksjon med de kjente negativer. Kontrollprøven ga ingen reaksjon.

Prøve E ble fremstilt ved anvendelse av 0,6 g glyoksal/8ml pakket cellevolum, og ga ikke-spesifikke reaksjoner med negativer.

Man fant at prøver F til H ikke reagerte spesifikt hvilket tyder på at de var uegnet for bruk i et hepatit B s-antigen-påvishingssystem.

Som en oppsummering av de foregående eksempler vises

i det følgende mengdene av glyoksal og formaldehyd eller glyoksal på de behandlede celler, idet Gx indikerer glyoksal, F formaldehyd og tallene som står foran hver av disse angivelser er gram i tiendedeler pr. 0,8 ml pakket cellevolum.

Eksempel IV

Eksempel I ble gjentatt for oppnåelse av riktig behandlede røde blodlegemer under anvendelse av følgende mengder av materialer i det første behandlingstrinn.

Glyoksalbehandling i citratbuffer -

røde celler i citrat

Det andre fikseringstrinn ble utført ved å følge metoden i Eksempel II under anvendelse av det nedenfor angitte aldehyd: g aldehyd/

Prøver 1-4 og 9°g 10 viste spesifikke reaksjoner for HB Ag ved å følge den i Eksempel III angitte metode og ga ingen reaksjoner for kontroller og kjente negativer.

Prøver 5~8 gir ikke-spesifikke reaksjoner for HB Ag i de negative prøver.

Prøver 11 og 12 gir ingen spesifikk reaksjon for positiv HB Ag og er derfor uegnet.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte til stabilisering av erythrocyter, karakterisert ved at man bringer erythrocyter i et vandig medium i et første behandlingstrinn i kontakt med 0,1 til 0,4 g glyoksal pr. 0,8 ml pakket cellevolum av nevnte erythrocyter for å oppnå behandlede erythrocyter, og deretter bringer nevnte behandlede erythrocyter i et vandig medium i et annet behandlingstrinn i kontakt med minst 0,1 g formaldehyd eller glyoksal pr. 0,8 ml pakket cellevolum av nevnte behandlede erythrocyter.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det vandige reaksjonsmedium i første og annet behandlingstrinn har en tonisitetsgrad som i det vesentlige er forenelig med nevnte erythrocyter.

3- Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det vandige medium i første og andre behandlingstrinn omfatter en hypertonisk natriumcitrat-oppløsning.

4- Fremgangsmåte' ifølge krav 3>karakterisert ved at det første behandlingstrinn utføres i 18-24 timer ved temperaturer i området l8-25°C

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4>karakterisert ved at det andre behandlingstrinn utføres i 18-24 timer ved temperaturer i området l8-25°C.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3»karakterisert ved at erythrocytene behandles i trinn 1 med en vandig opp-løsning omfattende formaldehyd eller glyoksal.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 3>karakterisert ved at erythrocytene behandles i trinn 2 med 0,1-0,6 g formaldehyd eller glyoksal.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7>karakterisert ved at de behandlede erythrocyter fra det første behandlings trinn separeres fra det vandige medium og vaskes før behandling i det andre behandlingstrinn.

9. Fremgangsmåte til fremstilling av stabiliserte erythrocyter egnet for bruk i den passive hemagglutineringspåvisning av hepatit-forbundet antigen, karakterisert ved at man 1) bringer en hypertonisk vandig suspensjon omfattende menneske-erythrocyter og 4>5~5 $ vekt-volum natriumcitrat, i kontakt -med 2) en mengde av en vandig oppløsning av glyoksal omfattende 4>5~5 $ vekt/volum natriumcitrat, idet denne mengde er tilstrekkelig til å tilføre 0,1-0,4 g glyoksal pr. 0,8 ml pakket cellevolum av nevnte erythrocyter; 3) separerer de glyoksalbehandlede celler fra suspensjonen ; 4) danner en annen hypertonisk vandig suspensjon omfattende nevnte behandlede erythrocyter og 4j5~5 $ vekt/volum natriumcitrat; og 5) bringer den andre nypertoniske vandige suspensjon av erythrocyter i kontakt med en mengde av en vandig oppløsning av glyoksal eller formaldehyd omfattende 4>5~5% vekt/volum natriumcitrat, idet" denne mengde er tilstrekkelig til å tilføre 0,1-0,6 g glyoksal eller formaldehyd pr. 0,8 ml pakket cellevolum av nevnte behandlede erythrocyter.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9* karakterisert ved at det første og andre behandlingstrinn utføres ved l8-25 °c.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det første og andre behandlingstrinn ut-føres i 18-24 timer.

12. Indikator-erythrocytsystem egnet for bruk i antigen-antilegeme-påvisningssystemer, karakterisert ved at det omfatter erythrocyter som er kjemisk omgått med en tilstrekkelig mengde glyoksal og en tilstrekkelig mengde formaldehyd til å gi erythrocyter som er stabile ved romtemperatur i minst seks måneder.