NO781267L - Alfa-amylase-inhibitor fra en streptomycet og fremgangsmaate til deres utvinning - Google Patents

Description

a-amylase-inhibitor fra et streptomycet og fremgangsmåte til dets utvinning.

Oppfinnelsen vedrører en ny inhibitor av glycosidhydrolaser i fordøyelseskanalen, spesielt a-amylase fra pankreas. Oppfinnelsen vedrører videre fremstillingen av en slik inhibitor ved fermentering av den spesifikke mikroorganismes streptomyces tendae, stamme 4158, samt dets varianter og metan-ter., den nevnte mikrobestamme som sådan og også fremgangsmåte til utvinning av inhibitoren fra fermentasjonsblandingen og til dens rensning.

Inhibitorer av glycosidhydrolaser av.mikroorganismer, spesielt av aktinomyceter er kjent. De hittil nærmere under-søkte stoffer .tilhører kjemisk i klassen av oligo- eller poly-sakkarider. Tilsvarende inhibitorer med sannsynlig peptidkarak-ter er å beskrive som varmelabil, mer eller mindre lett ved hjelp av trypsin inaktiverbar og fremfor alt sammenligningsmes-sig mindre aktiv.

Det ble nu i fermentasjonsblandinger av streptomyces tendae, stamme 4158, funnet et høyaktivt hemstoff av a-amylase fra pankreas som lar seg innordne kjemisk til peptidene.

Inhibitoren erkarakterisert veden molekylvekt fra 5000 - 10000, et absorbsjonsmaksimum i ultrafiolett lys ved 276 nm, et isoelektrisk punkt på 4,4 og. en aminosyresammensetning som nærmere angitt nedenfor.

Inhibitoren ifølge oppfinnelsen har en relativt høy molekylvekt. Den diffunderer ikke eller i beste fall til en meget liten del gjennom handelsvanlige dialyseringsmembraner som "Visking"-slanger. Selvsagt er bestemmelsen av den nøyaktige molekylvekt vanskelig, og man kommer med forskjellige bestemmel-sesmetoder til forskjellige resultater. Benytter man til mole-kylvektbestemmelsen den analytiske ultrasentrifuge (Biochemisches Taschenbuch, 2. del, side 746 - 767), så får man verdier på om trent 10000. Anvendes derimot molekylarsikter som "Sephadex" G-50 superfin, så fastslår man en molekylvekt på 5000 eller sågar lavere. Det er følgelig på grunn av de hittil foreliggende undersøkelsesresultater å anta en molekylvekt mellom 5000 og 10000.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen er et farveløst stoff. Det absorberer imidlertid ultrafiolett lys med et ved 276 nm liggende maksimum, som ved 281'nm har en skulder.

El cm = —" Fi9' 1 gjengir et absorbsjonsspektrum.

Inhibitoren er ifølge sin kjemiske struktur et<!>pepid.-Det kan spaltes ved hydrolyse i aminosyre. Det er hittil ikke lykkes ved siden av aminosyrene å påvise andre bestanddeler. Bestemmer man aminosyresammensetningen med den metode som er angitt av St. Moore og W. H. Stein (Methods in Enzymology, bind VI, side 819 - 831, utgitt, av Colovick og Kaplan i Academic Press, New York, London, 1963), så kan man fastslå følgende sammensetning:

Verdien av tryptofan ble vurdert av absorbsjonen av ultrafiolett lys. Det er selvsagt at resultatene av aminosyre-undersøkelsen ikke alltid tyder på et eneste heltallet mengdeforhold og at slike målinger generelt er beheftet med visse feil. Følgelig beror de i oppramsningen gjengitte variasjons- grenser ikke på en uenhetlighet av inhibitoren, men på den uunn-gålige målunøyaktighet av analysefremgangsmåten. Karakteristisk for inhibitoren ifølge oppfinnelsen er imidlertid at aminosyrene asparaginsyre, glutaminsyre, treonin, glycin, alanin og valin inntar en overgjennomsnittlig høy molekylar del av peptidet og at methionin i det rene stoff synes helt å mangle. Da methionin er en vidt utbredt aminosyre, er dens sterke fravær et godt karakteristisk trekk for inhibitoren ifølge oppfinnelsen og kan spesielt også ved anrikningsfremgangsmåter tjene til renhetsfastslå-ing av produktet.

Inhibitoren ifølge oppfinnelsen reagerer positivt.på peptidreagenser,men negativt på fenolsvovelsyre.

a-amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen inneholder ingen sukkerdel. Derved, samt ved dens aminosyresammensetning, dens molekylvekt og dens isoelektriske punkt, adskiller den seg fra alle kjente a-amylase-inhibitorer. Rene preparater av inhibitoren har en aktivitet på 2 - 3 x 10- AIE/g.

For et stoff av peptidnatur har amylaseinhibitoren ifølge oppfinnelsen en bemerkelsesverdig termisk stabilitet.

Selv kokning i et nøytralt eller svakt surt medium (pH ca. 4 - 8) i løpet av ett minutt er uten nevneverdig innvirkning på dens glycosihydrolase-hemmende egenskaper.

Inhibitoren inaktiveres ved hjelp av pepsin, trypsin eller chymotrypsin sammenlignet med andre proteiner bare meget langsomt proteolytisk. Under det terapeutiske virkningstidsrom er det derfor ikke å regne med en nevneverdig aktivitetsnedsett-else i fordøyelseskanalen.

Inhibitoren har en høy virkningsspesifitet.. a-amylasen fra pankreas hemmes overordentlig sterkt, mens derimot bakteri-elle a-amylaser, f.eks. slike fra bacillus subtilis, ikke inhi-beres målbart. Videre er det ikke iakttatt noen virkning overfor 3-amylaser.

Allerede mindre doseringer av amylaseinhibitoren iføl-ge oppfinnelsen fører til en fullstendig hemning av den enzymatiske aktivitet av pankreasamylase. Dette funn kan ikke forkla-res med de klassiske hemmemekanismer, hvor hemmingen av den enzymatiske katalyse avhenger av relative mengdeforhold mellom inhibitor og substrat (stivelse). Det må heller antas en irre-versibel inaktivering av pankreasamylasen ved inhibitoren ifølge oppfinnelsen.

For fremstilling av amylaseinhibitoren betjener man seg ifølge oppfinnelsen av stammens streptomyces tendae 4158. Denne stamme adskiller seg fra originalstammen streptomyces tendae (Ettlinger et al., Arch.Mikrobiol. 31, 351 (1959)) med hensyn til dens spore-morfologi. Sporene er kuleformet og har en diameter på 1 y . Stammens egenskaper er som følger: Substratmycelets farve: gulbrun, ingen farveendring

ved pH-forskyvning

Det sporedannede luftmycels gråbrun (light grayish farve: redish brown ifølge ISCC

methods of designating

colors)

Sporekjedenes morfologi: retinaculum apertum (RA) Sporemorfologi: kuleformede spor med en gjennomsnittlig diameter på 1 y. Glatte til lett vorte-lignende overflater Melanindannelse på peptonmedium: positiv

Nitratreduksjon: positiv

Substratvurderingsspektrum: glucose ++

arabinose +

sakkarose +

xylose +

inositol ++

mannitol ++

fruktose +

rhamnose ++

raffinose

cellulose

Stammens streptomyces tendae 4158 er deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) under registreringsnr. 31210.

Fermenteringen kan gjennomføres ved 25 - 35°C, fortrinnsvis ved 28 - 30°C, enten submerst i ristekultur eller i forskjellig grove fermentasjonskar under omrøring og lufting.

Som kulturmedium har det vist seg spesielt egnet en kombinasjon av karbon- og nitrogenkilder. Et slikt kulturmedium inneholder f. eks. ved siden av de ved kultur av mikroorganismer vanligvis anvendte uorganiske salter minst en karbonkilde, som stivelse, glucose, rørsukker, frukto.se, laktose, glycerol eller melasse samt minst en nitrogenkilde, som soyamel, kornsvellevann, gjærekstrakt, bomullsfrømel, jordnøttmel, peptoner, melke-pulver, nitrater eller ammoniumsalter.

Som optimal sammensetning har det vist seg (vektpro-sent i oppløsning) 3 - 5 % oppløselig stivelse, 0,2 - 0,6 kornsvellevann, 0,5 - 1>5 % glucose, 0,5 - 1 % (NH4)2HP04, 0,3 -

0,6 % soyamel, 0,5 - 1,5 % kaseinpepton. Også ved andre stivelsesholdige næringsmedier, f. eks. et slikt av 2 - 6 % jordnøtt-mel, 1-3 % potetstivelse, 3 - 5 % havremel, 3 - 5 % mysepulver, 1 - 2 % mysesirup, 1 - 2 % melkesukker, fås amylaseinhibitoren

i gode utbytter, idet valg av nitrogenkilde og pufferdel, hvis man er i det fysiologiske område, ikke er så avgjørende. Ned-settes imidlertid innholdets stivelse eller utglattes fullstendig, så går inhibitorutbyttet drastisk tilbake. Øker man på den annen side stivelseskonsentrasjonen vesentlig over 7 %, så blir på grunn av den høye viskositet mikroorganismenes oksygen-forfølgning suboptimal. Forbundet dermed synker inhibitorutbyttet.

I fermenteringsblandinger arter dannelsen av inhibitoren vanligvis mellom 10. og 30. time av fermenteringen. I løpet av de neste 20 timer avsluttes den mest mulig. Lengre fermentasjonstider har ingen uheldig innvirkning på inhibitorutbyttet. Imidlertid øker dette heller ikke nevneverdig. Herav fremgår at fermenteringsblandingen er å holde i drift ca. 30 - 7 0 timer.

Til isolering av inhibitoren fjernes fra fermenter-ingsoppløsningen cellemassen ved sentrifugering, filtrering eller frasugning, da den største del av det virksomme stoff vanligvis befinner seg i den klare kulturvæske.

Hvis på grunn av spesielle fermenteringsbetingelser en del av inhibitoren forblir i cellematerialet, så byr det ikke på noen vanskeligheter å ekstrahere det virksomme stoff herav ved egnede metoder, f. eks. ved utrøring med et vannblandbart organisk oppløsningsmiddel, som metanol, idet det er en fordel med en ekstra maserering av cellematerialet. Det i ekstraher-ingsmidlet oppløste virksomme stoff kan ved hjelp av sentrifugering eller filtrering befris fra uoppløste cellebestanddeler og viderebearbeides som den klare kulturvæske.

Av kulturvæsken lar inhibitoren seg isolere ved i og for seg kjente fremgangsmåter fra protein- og peptidkjemien. Således egner det seg utfellingen med vannblandbare organiske oppløsningsmidler, som aceton, isopropanol eller andre.lavere alkoholer eller også med salter, som ammoniumsulfat.

Det er videre mulig å adsorbere inhibitoren på tilsvarende bærere, f. eks. på aktivkull, og å adskille disse ved filtrering eller sentrifugering fra den vandige oppløsning.

Det kan foregå i et vidt pH-område mellom 2 - 10, fortrinnsvis benytter mån imidlertid et område mellom pH 4 - 6. Ioneutvekslere kan likeledes anvendes til utskillelse av a-amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen. Da stoffet ifølge oppfinnelsen har såvel sure som også basiske egenskaper, altså er amfotært, kan det såvel reagere med kation- som også med anionutvekslere og fjernes ved hjelp av disse fra fermenteringsoppløsningen. Herved kan det anvendes de teknikker som prinsipielt er omtalt i kapitlet om ioneutvekslere i Biochemischen Taschenbuch, utgitt av H. M. Rauen i Springer-Verlag 1964, 2. del, side 808 - 824.

Ved opparbeidelse av fermenteringsblandinger som inneholder stoff ifølge oppfinnelsen i kulturvæsken, er det ofte hensiktsmessig å konsentrere disse. Hertil kan det anvendes de kjente fremgangsmåter for destillasjon, ultrafiltrering, forstøvnings- og frysetørking eller andre kjente metoder. Av det således dannede konsentrat lar inhibitoren seg igjen ut-skille med de ovennevnte fremgangsmåter. Fra konsentrater som de inndampede kulturfiltrater danner kan inhibitoren også anrikes ved at de vesentlige forurensninger fjernes. Således har det for adskillelse av fettlignende stoffer vist seg egnet ek-straheringer med organiske oppløsningsmidler. Ved dialyse eller eventuelt ultrafiltrering (C.J.O. Rund P. Morris "Separa-tion methods in Biochemistry", Ditman Publishing, London 1976, side 944 - 950) kan oppløsningen befris for lavere molekylære stoffer. Høymolekylære stoffer, som nukleinsyrer, polysakkari-der eller mange eggehvitestoffer kan adskilles ved hjelp av fraksjonert utfelling ved utsaltning eller ved tilsetning av et med vann blandbart oppløsningsmiddel, som aceton eller en lavere alkohol. Tilsetning av utfellingsmidlet doseres i disse til-feller således at de lett utfellbare stoffer med molekylvekter over 100000 utfelles, mens a-amylase-inhibitoren forblir i opp-løsning. De omtalte anrikningstrinn kan kombineres og varieres i ønskelig rekkefølge. På denne måte kommer man til oppløsnin-ger som er sterkt anriket på inhibitor.

Sluttrensningen kan foregå med forskjellige målrette-de fremgangsmåter som gel- og ioneutvekslerkromatografi eller med beslektede fremgangsmåter hvis skilleprinsipp ikke utelukk-ende beror på ioneutveksling, som f. eks. adskillelse på hydrok-sylapatit. Videre kan det anvendes oppløsningsmiddel- eller saltutfellinger, preparativ elektroforese eller andre i og for seg kjente fremgangsmåter. Spesielt har det vist seg egnet adskillelse på dietylaminoetyl-(DEAE-)-gruppeholdige ioneutvekslere samt fraksjonerte utfellinger med ammoniumsulfat eller eta-nol, idet det sågar kan fås krystallinsk materiale.

Egenskapene til inhibitoren ifølge oppfinnelsen er interessante med hensyn til dens anvendelse som terapeutikum mot diabetes og prediabetes samt adipositas og understøttelse av diet.

Stivelsesholdige nærings- og nytelsesmidler fører hos dyr og mennesker til en økning av blodsukkeret og derved også til en øket insulinsekresjon av pankreas. Hyperglykemi kommer istand ved oppspalting av stivelsen i fordøyelseskanalen under innvirkning av amylase og maltase til glukose.

Hos diabetikere er denne hyperglykemi spesielt utpre-get og langvarig.

Hos adipøse virker den formerte insulinsekresjon på lipogenesen og nedsetter lipolysen.

Den alimentære hyperglykemi samt hyperinsulinemi etter stivelsesopptak lar seg nedsette ved amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen. Denne virkning er dosisavhengig. Amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen lar seg derfor anvende som terapeutikum ved diabetes, prediabetes og adipositas samt til understøttelse av diet. For dette formål lønner det seg med en administrering, spesielt til måltidene. Doseringen som skal rette seg etter pasientens vekt samt det individuelle behov ut-gjør ca. 10000 - 300000 AIE, men kan imidlertid i begrunnede enkelttilfeller også ligge høyere eller lavere.

Amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen egner seg spesielt til oral administrering. Den kan anvendes som rent stoff, men også i form av en farmasøytisk tilberedning under anvendelse av de vanlige hjelpe- og bærestoffer.

Også en kombinert anvendelse med andre legemidler, som blodsukkersenkende .eller lipidsenkende stoffer, kan være

fordelaktig. Da høyeremolekulære peptider som sådanne ikke eller ikke i vesentlig grad resorberes fra fordøyelseskanalen, er det av stoffer ifølge oppfinnelsen ikke å vente noen toksikolo-gisk betenkelige bivirkninger. På grunn av den ikke uvanlige aminosyresammensetning er også eventuelle proteolytiske spalt-produkter å se på som fysiologisk ufarlige. Følgelig kan ved

oral inngivning også høyere doser av amylaseinhibitoren ikke ses noen påfallende symptomer på forsøksdyrene. Også ved intravenøs applikasjon på mus (1 g/kg) ble inhibitoren ifølge oppfinnelsen tålt ved 24 timers iakttagelsestid uten synlig toksisk virkning.

For undersøkelse av den farmakologiske virkning av amylaseinhibitoren fikk fastende, han-Wistar-rotter en vekt mellom 200 og 250 g hemstoff ifølge oppfinnelsen samtidig med 2 g

stivelse pr. kg legemsvekt administrert oral etter at det umid-delbart på forhånd foregikk et bloduttak for bestemmelse av ut-gansblodsukkerverdien. Ytterligere bloduttak foregikk etter 15 og 30 minutter samt etter 1, 2, 3 og 4 timer fra halevenen. Blodsukkerbestemmelsen ble gjennomført etter metoden av Hoffman i autoanalysør (J. Biol. Chem. 120, 51 (1937)).

NZO-mus har en forstyrret glukosetoleranse. De egner seg derfor spesielt godt for undersøkelser hvor blodglucose-speilet påvirkes. Forsøksanordningen tilsvarer den hos rotter. Bloduttak foregikk fra orbitalvene-plexus. Blodsukkerforløpet forfølges over 3 timer.

På analog måte foretas virksom stoffpåvisning på NMRI-mus. Bloduttak foregikk likeledes fra orbitalvene-plexus, og blodsukkerforløpet forfølges over 3 timer.

Under disse forsøksanordninger viste de med inhibitoren ifølge oppfinnelsen behandlende dyr en i forhold til ube-handlede dyr mindre protrahert blodsukkerøkning.

Amylaseprøve

En amylase-inhibitorenhet (AIE) er definert som den inhibitormengde som under prøvebetingelsene formår å hemme to amylaseenheter (AE) til-50 %. En amylaseenhet er etter inter-nasjonal overenskomst den enzymmengde som i løpet av ett minutt spalter 1 p ekvivalent glucosidiske bindinger i stivelsen. De yval spaltede glucosidiske bindinger bestemmer som uval redu-sert sukker fotometrisk med dinitrosalizylsyre. Angivelsene er beregnet som pmol maltose som fastslås ved hjelp av en maltose-vurderingslinje.

Prøvene gjennomføres på følgende måte:

a-amylase fra svinepankreas og oppløsningen som skal undersøkes forinkuberes sammen i 1,0 ml 20 mM fosfatpuffer,

pH 6,9 + 10 mM NaCl 10 - 20 minutter ved 37°C. Den enzymatiske reaksjon startes ved tilsetning av 1,0 ml oppløselig stivelse ifølge Zulkowski (0,25 % i den angitte puffer). Etter nøyaktig 10 minutter stoppes reaksjonen med 2,0 ml dinitrosalizylsyre-farvereagens (etter Boehringer Mannheim: Biochemica-Information

II) og oppvarmes for farvefremkalling 5 minutter i kokende vann-bad. Etter avkjøling måles ekstinksjonen ved 546 nm mot reagens-blindverdi. Den 50 prosentige hemming bestemmes i sammenligning til uhemmet enzymreaksjon ved anvendelse av forskjellige inhibi-tormengder grafisk ved hjelp av sannsynlighetsopptegning.

Eksempel 1

Stammen streptomyces tendae 4158 podes på skrårør med en næringsbunn av følgende sammensetning:

50 g havrefnokker

ad. 1000 ml H20 pHA7,2

De podede rør vikker .7 dager ved 3-0°C og holdes deretter ved +4°C. Sporene oppsvemmes med 10 ml sterilisert A. dest. eller fysiologisk NaCl-oppløsning fra skrårøret. 1,0 ml av suspensjonen tjener til podning. av en 300 ml Erlenmeyer-kolbe som er beskikket med 35 ml sterilisert næringsoppløsning med en pH-verdi på 7,7 og følgende sammensetning:

1 % glucose

1 % soyamel

0,2 5 % NaCl pH 7,7

Kolben ristes ved 220 omdreininger pr. minutt 48 timer ved +30°C på en rystemaskin med en amplitude på 4 cm. Deretter overføres hver gang 5 ml av denne forkultur i flere Erlenmeyer-kolber som er fylt med 35 ml sterilisert næringsoppløsning og har en pH-verdi på 8,3. Sammensetningen av denne hovedkultur er følgende:

4 % stivelse

0,4 % kornsvellevann

1,0 % glucose

0,8 % (NH4)2HP04

0,4% soyamel

1,0 % pepton pHA8,3 Hovedkulturene ristes likeledes ved +30°C med 200 omdreininger pr. minutt på en rystemaskin med en amplitude på 4 cm i 2 - 3 dager. Ved første, annen og tredje kulturdag bestemmes innholdet a-amylase-inhibitor i henhold til prøvefor-skriften.

Stammen streptomyces tendae 4158 gir under de omtalte forsøks- og kulturbetingelser gjennomsnittlig 100 AEI/ml ved en slutt-pH på 5,2.

Eksempel 2

Blanding som i eksempel 1 velger imidlertid som hovedkultur et fermenteringskar på 300 1 samlet volum, som er fylt med 200 1 av en sterilisert næringsoppløsning av følgende sammensetning:

4 % stivelse

0,4 % kornsvellevann

1,0 % glucose

0,8 % (NH4)2HP04

1,0 % kaseinpepton

0,1 % desmofen pH 8,3 - 8,5 Steriliseringstiden for blandingen utgjorde 45 minutter ved 121°C og 1 bar, idet glucosen steriliseres separat og etter avkjøling av fermenterere ved driftstemperatur ble tilført sterilt.

pH-verdien bør etter sterilisering utgjøre 6,8 og innstilles etter behov med sterilisert syre (2 n H^PC^) eller lut (2 n NaOH) på denne verdi. Poding blir hovedtrinnet med 20 1 tilsvarende 10 % og en som under eksempel 1 omtalt og i en liten fermenterer av 30 1 totalvolum fremstilt forkultur.

Det fermenteres 50 - 70 timer ved 30°C. Luftningen utgjør 6 m 3/time ved en omrøring på 250 omdreininger pr. minutt og et overtrykk på 0,3 bar.

Ved prøveuttak overvåkes og forfølges fermenterings-forløpet med hensyn til inhibitoraktivitet, substratavbygning, biomasseutvikling og kulturoppløsningens fysikalsk-tekniske forhold (overflatespenning, viskositet, tetthet, osmotisk trykk).

Den maksimale inhibitoraktivitet oppnås fra 60. kultur time ved gjennomsnittlig 105 AIE/ml. Deretter tilføres fermenterer innholdet til opparbeidelsen.

Eksempel 3

Blanding som i eksempel 1 og 2 benyttes imidlertid som hovedtrinn en bioreaktor av 4000 samlet volum som er fylt med 2500 1 av følgende næringsoppløsning:

6 % stivelse

1,0 % glucose

0,4 % kornsvellevann

0,8 % (NH4)2HP04

1,0 % soyapepton

0,1 % desmofen pH^7,0 - 7,3 Steriliseringstiden for denne blanding utgjør 60 minutter ved 121°C og 1 bar, idet glucosen sterilfiltreres separt og tilpumpes etter fermentererens avkjøling til driftstemperatur til denne under sterile betingelser.

pH-verdien innstilles, hvis nødvendig, med steril syre (H^PO^) eller lut (NaOH) på en begynnelsesverdi på 7,0 - 7,3.

Podes med 200 1 av en under eksempel 2 omtalt og fremstilt forkultur.

Fermenteringstiden utgjorde 70 timer, idet det fermenteres ved en temperatur på 3 0°C, en luftning på 6 0 Nm /time, et overtrykk på 0,5 bar og ved 18 0 omdreininger pr. minutt.

Ved prøveuttak, som omtalt under eksempel 2, følges alle viktige prosess-, organisme- og aktivitetsdata over den samlede fermenteringstid. Etter 7 0 timers fermentering er det oppnådd en gjennomsnittlig aktivitetskonsentrasjon på 95 AIE/ml. Fermenteringen avbrytes derpå, og kulturoppløsningen tilføres opparbeidelsen.

Eksempel 4

10 1 av en filtrert kulturvæske med en virksomhet på 100 AIE/ml tørkes i en forstøvningstørker og gir 400 g av et lysebrunt pulver. Dette blir deretter for avfetning grundig gjennomrørt med en blanding av 1 1 metanol og 1 1 kloroform og deretter frasilt. Det ennu oppløsningsmiddelfuktige, uoppløste produkt hvori det virksomme stoff er inneholdt, oppløses i 3 1 vann, innstilles til pH 6,5 og blandes med 4,5 1 metanol. Det oppstår herved en lys fnokket utfelling som fjernes ved sentri-fuger ing og kasseres, da det bare inneholder betydelige mengder a-amylase-hemstoff. Det mørke overstående av metanolutfellin-gen som inneholder den ønskede inhibitor, befris deretter i vakuum for metanol og den nu til 2,5 1 oppkonsentrerte oppløs-ning dialyseres saltfri mot destillert vann. Retenatet.inneholder 9 g tørrstoff (spesifikk aktivitet 96 AIE/mg). Retenatet bringes deretter ved pH 5,5 med ammoniumsulfat til 50 % metning, hvortil det ved 250 ml er nødvendig 79 g av saltet.

Ved utsaltning oppstår en utfelling som inneholder rundt 90 %

av det aktive stoff. Etter sentrifugering kasseres det overstående. Utfellingen oppløser man igjen i destillert vann, og ved pH 8 blandes igjen med ammoniumsulfat, men denne gang i første rekke bare inntil 15 % metning og etter fjerning av utfellingen videre til 35 % metning. Utfellingen av utsaltningen mellom 15 og 35 % inneholder hovedmengden av amylaseinhibitoren. Denne fraksjonerte utfelling gjentas.

Det dannede produkt er etter dialyse og tørkning

360 mg med en spesifikk aktivitet på 992 AIE/mg. 350 mg av dette, råstoff oppdeles og anrikes i "Sephadex" G-50 fine i en 100 cm lang og 1,2 1 tagende glassøyle. Som svelle- og elueringsmiddel tjener vandig 5 millimolar-fosfatpufferoppløsning av pH 8, hvortil det er blitt satt 0,02 % natriumazid. Råstoffet oppløses i 15 ml av samme puffer og påføres på søylen. Elueringen foregår i løpet av to dager, idet det avtas fraksjoner av 15 ml innhold. De fire mest aktive fraksjoner samles, dialyseres saltfrie og frysetørkes. De gir 60 mg av et hvitt pulver med en aktivitet på 2520 AIE oc-amy lase-inhibi tor /mg .

Eksempel 5

2200 1 kulturvæske avkjøles til 6°C og filtreres etter tilsetning av 2 % kiselgur over en kammerpresse. Filterka-ken (ca. 450 kg fuktig) kasseres, og det klare filtrat (1750 1 med en aktivitet på 95 AIE/ml) inndampes etter tilsetning av 500 g natriumazid over en fallstrømfordamper til 120 1. Det andre konsentrat avkjøles til 1°C og blandes med 120 1 forav-kjølt aceton langsomt under omrøring. Til fullstendig utfelling omrøres ennu en kvart time og etter tilsetning av 1 kg kiselgur klares over en senkepresse. Det faste stoff med filt-

reringshjelpemidlet kasseres. Det acetoniske filtrat, som inneholder det virksomme stoff, blandes under omrøring og avkjøling med 380 1 aceton, hvorved det oppstår en omtrent 80 prosentig acetonisk suspensjon. Den dannede (2.) utfelling inneholder den ønskede amylaseinhibitor.. Den dannes ved at man lar utfellings-væsken stå uten omrøring. Herved synker bunnfallet, og det

overstående kan fjernes med hevert. Av det overstående av denne annen acetonutfelling kan det adskillés mindre mengder utfelling ved sentrifugering. Dette faste stoff oppløses ved pH 7 og til-settes til oppløsningen, og utfellingen (se nedenfor). Den i utfellingskaret gjenblivehde hovedutfelling oppløses i 120 1 vann ved pH 7, og den dannede oppløsning klares med en gjennom-løpssentrifuge ("Cepa",;1200Jomdreininger pr. minutt). Herved fjernes 90 g inaktive svevepartikler. Den klare vannfase konsentreres og dialyseres nu med et DDS-ultrafiltreringsanlegg (membran nr. 800) i 15 1. For å fullstendiggjøre avsaltningen, fortynnes retenatet med destillert vann og konsentreres igjen. Etter to til tre gangers gjentagelse er retenatet, hvori amylase-inhibitoren er inneholdt, praktisk talt saltfritt. Fra 50 1 opp-løsning av retenatet utfelles deretter hemmestoffet ved pH 5,5 ved tilsetning av 19,5 kg ammoniumsulfat, frasentrifugeres og det overstående kasseres. Utfellingen oppløses igjen i 40 1 vann og utfelles denne gang ved pH 7,5 med 12,5 kg ammoniumsulfat. Etter adskillelse av klarfasen i en rørsentrifuge utfelles utfellingen fraksjonert som i eksempel 4: Fra 40 1 av det igjen oppløste stoff helles pH 5,5 ved tilsetning av 3,2 kg ammoniumsulfat i første rekke en inaktiv utfelling som adskillés og kasseres. Deretter utskilles ved ytterligere oppkonsen-trering av den flytende fase med 7,4 kg ammoniumsulfat hoved-, delen av aktiviteten fra væsken. Denne utfelling samles, dialyseres mot destillert vann og frysetørkes. Det fremkommer 114 g av et brunt pulver med en aktivitet på 1100 AIE/mg.

Til videre oppdeling fylles en glassøyle av 5 cm diameter og 50 cm høyde (omtrent 1 1 innhold) med DEAE-"Sephadex" A-25, som på forhånd blir ekvilibrert med -jq molar fosfor-puffer med pH 7,5 og 0,02 prosentig natriumazid. Nu oppløses 10 g stoff i 100 ml av samme puffer og påføres på søylen. Deretter vasker man søylen med 1 1 av samme puffer og så til-blandes til dette elueringsmiddel etterhvert kokesalt således at det sikres kontinuerlig gradient. Oppfanges søyleutstrømningen fraksjonert, så befinner amylaseinhibitoren seg i de fraksjoner hvori NaCl-konsentrasjonen .er ca. 0,5 molar.

Disse fraksjoner samles og dialyseres mot destillert vann. Frysetørkning gir 5,6 g lysebrunt stoff med en virkning på 2200 AIE/mg.

Hertil tilsluttes dessuten en gelkromatografisk rensning, som omtalt i eksempel 4. Av det 5,6 g materiale frem-kom 4,1 g av et farveløst pulver hvis aktivitet utgjorde 28 00 AIE/mg. Aminosyreanalysen av produktet gir etter en 20 timers saltsyrehydrolyse ved hjelp av en Beckman-multikromanalysator følgende sammensetning:

Claims (8)

1. Peptidisk glycosidhydrolase-inhibitor, karakterisert ved en molekylvekt fra 5000 - 10000, et absorbsjonsmaksimum i UV-lys ved 276 nm, et isoelektrisk punkt på 4,4 og følgende aminosyresammensetning:

2. Fremgangsmåte til fremstilling av en peptidisk. glu-cosidhydrolase-inhibitor ifølge krav 1, karakterisert ved at man kultiverer streptomyces tendea 4158 (ATCC nr. 31210) og fra kulturen utvinner inhibitoren.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man kultiverer streptomyces tendea 4158 i et kulturmedium som minst inneholder en karbonkilde, minst en nitrogenkilde og organiske salter.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at næringsmediet inneholder 3 - 5 % oppløselig stivelse, 0,2 - 0,6 % cornsteep (kornsvellevann), 0,5 - 1,5 % glucose, 0,5 - 1 % Na2HPC>4, 0,3 - 0,6 % soyamel og 0,5 - 1,5 % kaseinpepton.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at næringsmediet inneholder 2 - 6 % jordnøttmel,

1 - 3 % potetstivelse, 3 - 5 % havremel, 3 - 5 % mysepulver,

1 - 2 % mysesirup og 1 - 2 % melkesukker.

6. Streptomyces tendea 4158 (ATCC nr.-31210).

7. Anvendelse av inhibitoren ifølge krav 1 som middel til regulering av blodsukkerspeilet.

8. Middel til regulering av blodsukkerspeilet, karakterisert ved et innhold av en peptidisk glycosidhydrolase-inhibitor ifølge krav 1.