NO783724L - Syntetisk dna samt fremgangsmaate til dets fremstilling - Google Patents

Description

Syntetisk DNA og■fremgangsmåte for fremstilling av dette.

Genetisk informasjon er innkodet på dobbeltrådet deoksyribonukleinsyre ("DNA" eller "gener") etter den rekkefolge i hvilken den DNA-kodende tråden presenterer de karak- • teristiske basene i trådens repeterende nukleotidkomponenter. "Uttrykkingen" av den innformede informasjonen slik at det dannes polypeptider innbefatter en todelt prosess. Ifolge påbud fra visse kontrollområder ("reguloner") langs genet,

vil RNA-polymerase bevege seg langs den kodende tråden, slik at det dannes såkalt "budbringer-RNA" (ribonukleinsyre) i en prosess som vanligvis kalles "transkribsjon". Ved den etter-følgende "oversettelsestrinnet" vil cellens ribosomer sammen med overforings-RNA omdanne nevnte mRNA-"budskap" til polypeptider. I den- informasjon som mRNA transkriberer fra DNA inngår også signaler for start og avslutning av den robosomale oversettelsen, såvel som identitet og rekkefolge av aminosyrene som utgjor selve polypeptidet. Den DNA-kodende tråden består av lange sekvenser av nukleotidtripletter som kalles "kodoner" fordi de karakteristiske baser som finnes i nukleo-tidene i hver triplett. eller kodon innkoder spesifikke deler av informasjonen. F.eks. vil 3 nukleotider avlest som ATG (adenin-tymin-guanin) resultere i et mRNA-signal som.kan tol-kes som "start oversettelse", mens avslutnings'kodonene" TAG, TAA og TGA blir tolket som "stopp oversettelse". Mellom start-' og stoppkodonene ligger det såkalte strukturelle genet, hvis, kodoner definerer den aminosyresekvens som blir oversatt til slutt. Denne definisjonen er den man kjenner fra den vel-kjente "genetiske koden" (se f.eks. J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene W.A. Benjamin Inc., N.Y. 3. utgave 1976)

som beskriver kodonene for de forskjellige aminosyrene. Den genetiske koden er degenerert i den forstand at forskjellige kodoner kan gi den samme aminosyren, men presis idet at for hver aminosyre så er det én eller flere kodoner og ingen andre. Således vil f.eks. alle kodonene TTT, TTC, TTA og TTG når de avleses som sådanne, innkode for serin og ingen

annen aminosyre. Under transkribsjonen må det opprettholdes en passende avlesningsfase eller avlesningsramme. La oss f.eks. se hva som skjer når den transkriberende RNA-polymerasen avleser forskjellige baser ved begynnelsen.av et kodon (understreket) i rekkefølgen ... GCTGGTTGTAAG ...:

Det polypeptid som til slutt vil bli fremstilt, vil være helt avhengig av romforholdet på den strukturelle gene med hensyn til regulonet.

En klarere forståelse av fremgangsmåten som inngår

i den såkalte genetiske uttrykkingen vil lettere kunne fremgå når man har definert visse komponenter i genene: Operon -- Et gene som består av strukturelle gener for polypeptiduttrykk og har et kontrollområde ("regulon") som regulerer dette uttrykk.

Promotor. — Et gene. i regulonet hvor RNA-polymerasen

må binde seg for å få startet transkribsjonen.

Operator — Et gene til hvilket man kan binde et såkalt undertrykkende protein, slik at man hindrer RNA-polymerase å binde seg til en tilstotende promotor.

Induser — Et stoff som deaktiverer undertrykkende protein og frigjor operatoren og derved muliggjor at RNA-polymerase kan binde seg til promotor og fortsette transkribsjonen.

Katabolittaktivatorprotein (" CAP")- bindeposisjon — Et gen som binder syklisk adenosinmonofosfat ("c AMP") - formid-lende CAP, som også vanligvis er nodvendig for å starte transkribsjonen.. Den CAP-bindende posisjonen kan i visse tilfeller være unodvendig. Således vil f.eks. en promotormutasjon i laktoseoperonet i fagen?» plac UV5 eliminere behovet for CAMP og CAP for uttrykking. J. Beckwith et al., J. Mol. Biol 69, ISS-160 (1972).

Promotor- operatorsystem — Slik det er definert her så er dette et opererbart kontrollområde på en operon, med eller uten hensyn til hvorvidt det inngår i en CAP-bindende posisjon eller er istand til å kode inn et uttrykk for undertrykkende protein.

For å lette diskusjonen og beskrivelsen i det etterfølgende når det gjelden rekombinert DNA, så har man folgende definisjoner: Klone. bærende element Ikke-kromosomalt dobbelttrådet DNA som innbefatter en intakt "replikon" slik at elementet blir repetert når det plaseres inne i en éncellet organisme ("mikrobe") ved en såkalt "transformasjons"-prosess. En organisme som blir omformet på denne måten kalles ofte en "transformant".

Plasmid- - I denne sammenheng defineres dette som et klonende element som er avledet fra virus eller bakterie, og i det sistnevnte tilfelle betegnes det ofte som "bakterie-plasmider".

Komplementaritet En egenskap som tilveiebringes av basesekvenser i et enkelttrådet DNA som muliggjor dannel-sen av dobbelttrådet DNA gjennom hydrogenbinding mellom de komplementære baser på de respektive trådene. Adenin (A) er et komplement til tymin (T), mens guanin (G) komplementerer cytosin (C).

Biokjemisk forskning i de senere år har fort til konstruksjon av såkalte "rekombinerte" klonende elementer hvor f.eks. plasmider kan fremstilles slik at de inneholder ekso- . gent DNA. I visse tilfeller kan rekombinanten innbefatte "heterologt" DNA, dvs. DNA som utkoder polypeptider^ som vanligvis ikke fremstilles av den organismen som er folsom overfor transformasjon ved hjelp av såkalte rekombinerte elementer. Plasmidene er således spaltet slik at de gir linært DNA med såkalte sammenslutningsbare sluttposisjoner. Disse bindes til et eksogent gen med lignende sammensluttbare sluttposisjoner slik at man får en biologisk funksjonell forbindelse med et intakt replikon med en forbnsket fenotypisk egenskap. Den rekombinerte forbindelsen innsettes så i en mikroorganisme ved transformasjon og transformerte organismer blir deretter isolert og klonet med den hensikt at man oppnår store populasjon-er som er istand til å uttrykke den nye genetiske informasjon. Fremgangsmåter og anordning for å danne rekombinerte klonede elementer og omdanne eller transformere organismer med slike elementer, er meget omtalt i litteraturen. Se f.eks. H. L. Heynecker et al, Nature 263, 748 - 752 (1956); Cohen et al, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 69,- 2110 (1972); samme, 70, 1293

(1973); samme, 70, 3240 (1973); samme, 71, 1030 (1974); Morrow et al, Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 71, 1743 (1974); Novick, Bacteriological Rev., 33, 210 (1969)} Hershfield et al, Proc. Soc. Nat'1." Acad. Sei . U.S. A. 71, 3455 (1974) og... Jackon et al, ibid, 69, 2904 (1972). En generell diskusjon

av emnet er skrevet av S. Cohen, Scientific American 233, 24

(1975). Ovennevnte publikasjoner inngår her som referanser.

Det er en rekke teknikker som er tilgjengelige for DNA-rekombinering hvor tilstotende ender av separate DNA-fragmenter justeres på en eller annen måte for derved å lette sammenbinding. Denne sammenbindingen refererer seg til dannel-sen av fosfodiesterbindinger mecLlom tilstotende nukleotider, vanligvis ved hjelp av enzymet T4 DNA ligase. Således kan butte ender direkte sammenbindes. Alternativt kan fragmenter som inneholder komplementære enkelt.tråder som nær sine tilstotende ender sammenbindes ved hjelp av hydrogenbindinger som så vil plasere de respektive endene for etterfølgende sammenbinding. Slike enkelttråder som her betegnes som sammenbundne avslutningsposisjoner eller termini, kan dannes ved tilsetning av nukleotider til butte ender ved å bruke terminal transferase, i visse tilfeller kun ved å bryte ned en tråd med en butt ende med et enzym såsom A -eksonuklease. Den mest vanlige teknikken er å bruke såkalte begrensende endonukleaser som spalter fbsfodiesterbindingene i og omkring en enestående sekvens' av nukleotider, vanligvis av en lengde på fra 4-6 basepar. Mange begrensende endonukleaser pg deres gjenkjennende posisjoner er kjente, og mest vanlig er det å bruke såkalt Eco RI-endonuklease. Begrensende endonukleaser vil spalte dobbelttrådet DNA ved rotasjonsmessig symmetriske "palindromer" og vil således etterlate seg sammenbundne termini. Således kan et plasmid eller et annet klonende element spaltes, hvorved man får termini som hver innbefatter halvparten' av den gjenkjennende posisjonen for den begrensende endonukleasen. Et spaltet produkt av eksogent DNA oppnådd med den samme begrensende endonukleasen vil ha ender som er komplementære til de man finner i plasmiden. Alternativt kan man tilveiebringe syntetisk'DNA som innbefatter sammenbundne termini som kan innsettes i det spaltede element. For å ned-sette sammenbinding av elementets sammenbundne termini for man får. innsatt eksogent DNA, så kan nevnte termini nedbrytes med alklisk fosfatase, hvorved man får molekylær seleksjon for lukkinger som innbefatter de eksogene fragmenter. Innbe-fatning av et fragment med passende orientering i forhold til de andre aspekter på elementet, kan bedres når fragmentet supplerer et klonende DNA som er bearbeidet av to forskjellige begrensende endonukleaser, og når det selv innbefatter termini som altså utgjor halvparten av de gjenkjennende posisjoner man hadde i de forskjellige endonukleaser.

Skjbnt det har vært utfort intensiv forskning i

de senere år med rekombinert DNA, så er det få resultater som umiddelbart har fort til praktiske fremgangsmåter. Dette har spesielt vist seg i forbindelse med en rekke forsok på å uttrykke polypeptider og lignende ved hjelp av koding ved såkalt "syntetisk DNA", enten man nå har konstruert nukleotid for nukleotid på vanlig måte eller oppnådd det ved såkalt revers traiskribsjon fra isolert in RNA (komplementær eller "cDNA"). I foreliggende oppfinnelse er det beskrevet en frem-^gangsmåte som muliggjor tilsynelatende for forste gang, at man kan få fremstilt et funksjonelt polypeptidprodukt fra et syntetisk gen, og en slik fremgangsmåte kan ha stor anvendelse. Det produkt man her refererer til er somatostatln (Guillemin U.S.P. 3.904.594), en hemmer for.sekresjonen av veksthormon, såsom insulin og glukagon, og effektene av nevnte somatostatin tyder på at det kan brukes ved behandlingen av akromelagi, akutt pankreatitis og insulin-avhengig sukkersyke. Se R. Guillemin et al, Annual Rev. Med 27, . 379 (1976)-. Somatostatinmodellen viser klart at fremgangsmåten har vid anvendbarhet på

en rekke forskjellige måter, noe som vil fremgå av de vedlagte tegninger og den etterfølgende detaljerte beskrivelse.

De vedlagte tegninger illustrerer et felt hvor foretrukne anvendelser av oppfinnelsen kan komme til uttrykk, f.eks. i uttrykking av hormonet somatostatin ved hjelp av omdannede bakterier som inneholder rekombinerte plasmider. Fig. 1. Skjematisk oppsetning av prosessen: genet for somatostatin fremstilt ved kjemisk DNA-syntese, fes-tes til E. coli p-galaktosidasegenet på plasmiden pBR322. Etter transformering over i E. coli vil den rekombinerte plasmiden styre syntesen av et forloperprotein som spesielt kan spaltes in vitro ved metioninresidua ved hjelp av cyanogenbromid, hvorved man får et aktivt.pattedyrpolypeptidhormon. A, T, C og G angir de karakteristiske baser (henholdsvis adenin, tymin, cytosin og guanin) i deoksyribonukleotidene i den kodende tråden i somatostatingenet. Fig. 2. En skjematisk struktur av et syntetisk gen hvis kodende tråd (dvs. den "ovre" tråd) består av kodoner for aminosyresekvensen i somatostatin (gitt). Fig. 3- Skjematisk illustrasjon av en foretrukken fremgangsmåte for konstruksjon av de nukleotidtrimerer som brukes under konstruksjonen av syntetiske gener..På fig. 3 har man brukt den vanlige fremgangsmåte for å illustrere nukleotider, dvs. 5' OH er til venstre, mens 3' OH er til hoyre., f. eks. Fig. 4. Dette er et prosessdiagram for konstruksjonen av et rekombinert plasmid (f.eks. pSOMll-3) som er istand til å uttrykke et somatostatin ("SOM")-holdig protein, hvor man begynner med plasmidet pBR322. På fig. 4 er de. omtrent-lige molekylvekter for hvert enkelt plasmid angitt i dalton ('&"). Ap og Tc henholdsvis .betegner gener for ampicillin og tetracyklinresistens, mens Tcs betegner tetracyklinfSlsom-het på grunn av at man har fjernet en del av genet Tc v». De relative posisjoner for forskjellige spesifikke spaltnings-stillinger for begrensende endonuklease på plasmidene er angitt (f.eks. Eco RI, Barn I, etc.')." Fig. 5A og 5B. Her er nukleotidesekvensen for to viktige deler av to plasmider angitt, såvel som retningen for transkribsjonen for det overforende RNA ("mRNA"), som alltid starter fra 5'-enden på den kodende tråden. Begren sende endonukleasesubstratposisjoner er også vist. Hver angitt sekvens inneholder både kontrollelementene for lak (laktose)-operonet, og kodonene for uttrykking av aminosyresekvensen i somatostatin (kursiv). Aminosyresekvensnummerne for (3-galaktosidase ("f3-gal") er angitt i parenteser. Fig. 6- 8. Som mer detaljert beskrevet i den eksperimentelle diskusjonen, så angir disse figurer resultatene fra sammenlignende radioimmun-prbveeksperimenter som viser somatostatinaktiviteten på produktet fremstilt ved hjelp av de rekombinerte plasmider. Fig. 9. Skjematisk struktur på syntetiske gener hvis kodende tråder består av kodoner for aminosyresekvenser for A- og B-trådene i menneskeinsulin. Fig. 10. Prosessdiagram for konstruksjonen av et rekombinert plasmid som er istand til å uttrykke B-kjeden i menneskeinsulin.

Detaljert beskrivelse

1. Fremstilling av gener som koder for heterologt polypeptid

DNA-koding for ethvert polypeptid med kjent aminosyresekvens kan fremstilles ved at man velger kodonet ifblge den genetiske koden. For å lette rensingen, så kan f.eks. oligodeoksyribonukleotidfragmenter, på f.eks. fra 11 - 16 nukleotider, fremstilles separat og så settes sammen i den for-ønskede sekvens. Man fremstiller således en fbrste og en annen serie av oligodeoksyribonukleotidfragmenter av hensikts-messig stbrrelse. Den fbrste serien som når den er satt sam men i passende sekvens, vil gi en DNA-kodende tråd for poly-peptiduttrykking (se f.eks. fig. 2, fragmentene A, B, C og D). Den andre serien vil på lignende måte når den er satt sammen på en passende måte, gi en tråd som er komplementær til den kodende tråden (f.eks. fig. 2, fragmentene E, F, G og H).-Fragmentene for de respektive trådene bor fortrinnsvis over-lappe hverandre slik at deres komplementaritet fremmer en selvsammensetning via hydrogenbindinger på de sammenbindende avslutningsposisjoner på fragmentblokkene. Etter sammensetningen kan det konstruerte genet avsluttes på vanlig kjent måte.

Degenerasjonen av den genetiske koden gir relativt stor frihet med hensyn til'valg av kodoner for enhver gitt aminosyresekvens. For det foreliggende formål imidlertid, var det tre betraktninger som ble lagt til grunn ved valg av kodon. For det fbrste ble kodoner og fragmenter valgt og satt sammen på en slik måte at man unngikk for stor komplementaritet på fragmentene, unntatt.for fragmenter som stbtte inntil hverandre i' det ferdige gen. For det andre unngikk man sekvenser som var rike på AT-basepar (f.eks. fem eller mer), spesielt når man hadde en sekvens som var rik på GC-basepar, noe som ble gjort for å unngå en for tidlig avslutning av transkribsjonen. For det tredje velger man en stbrre mengde kodoner av déhtype som er foretrukket ved uttrykkingen av mikrobielle genomer (se f.eks. W. Fiers.et al, Nature 260, 500 (1976)). For det foreliggende formål har man definert det fblgende som kodoner "foretrukket for uttrykkingen av mikrobielle genomer":

I forbindelse med somatostatin er det mest foretrukne aminosyre (kodon)-forholdet i det strukturelle gen folgende: gly (GGT), cys (TGT), lys (AAG), trp (TGG), ala (GCT, GCG), asn (AAT, AAC), phe (TTC, TTT), thr (ACT, ACG) og ser (TCC,

TCG).

Når det strukturelle genet for et forbnsket polypeptid skal innsettes i et klonende element for uttrykking som sådan, så vil genet folge etter et "startH-kodon (f.eks. ATG) og umiddelbart fblges av én eller flere avslutnings-eller stopp-kodoner (se fig. 2). Som nevnt nedenfor imidler-: tid, så kan aminosyresekvensen for et spesielt polypeptid uttrykkes med ytterligere protein som går foran og/eller folger etter. Hvis bruken av polypeptidet krever en avspalt-ning av det ytterligere protein, så kan passende spaltnings-^ posisjoner kodes inn for den posisjon hvor hovedpolypeptidet og det ytterligere protein henger sammen. Som-vist; på fig. 1 som et eksempel, er det uttrykte produkt der et forlbperpro-tein som inneholder både somatostatin og størstedelen av |3-galaktosideasepolypeptidet. Her er ATG ikke nbdvendig for innkoding for derved å få en start på oversettelsen, ettersom den ribosomale konstruksjonen på det tilstotende (3-gal-aktosideaseproteinet gjor at det leses direkte over i somatostatingenet. En inkorporering av ATG-signalet vil imidler tid kode for fremstilling av metionin, en aminosyre som spesielt spaltes lett av cyanogenbromid, hvorved man får en lett fremgangsmåte for å omdanne forloperproteinet til det for-ønskede polypeptid.

Fig. 2 viser også et eksempel på et trekk som er foretrukket i heterologt DNA som siden skal brukes for rekombinering, dvs. at man tilveiebringer sammenbindende avslutningsposisjoner eller termini, fortrinnsvis slik at disse inngår en begrensende endonuklease-gjenkjennelsesposisjon på én av de to trådene.. Som nevnt ovenfor bor nevnte termini eller a^slutningsposisjoner fortrinnsvis utformes slik at de skaper henholdsvis forskjellige gjenkjennelsesposisjoner ved rekombinering. '

Skjont det som er angitt ovenfor hår vist seg å gi fint resultat med somatostatinmodellen, så er det underfor-stått at heterolog DNA-koding kan brukes også for nesten enhver kjent aminosyresekvens, mutatis mutandis. Således er den teknikk som er beskrevet ovenfor og som vil bli mer detaljert beskrevet i det etterfølgende, også anvendbar mutatis mutandis, for fremstillingen av poly(amino)syrer, såsom poly-. leucin og polyalahin, enzymer, serumproteiner, smertestillen-de polypeptider såsom p-endorfiner, som modulerer smerte-terskeler etc. Det er mest foretrukket at man fremstiller polypeptider som vil være pattedyrhormoner eller mellomprodukter for slike. Blant slike hormoner kan f.eks. nevnes somatostatin, menneskeinsulin, veksthormoner for mennesker og kveg, leutiniserende hormon, ACTH, pankreaspolypeptid etc. Mellomprodukter innbefatter f.eks. preproinsulin for mennesker, proinsulin for mennesker, A- og B-kjedene for menneskeinsulin osv. I tillegg til DNA fremstilt in vitro, så kan det hetero-loge DNA også innbefatte cDNA som er et resultat av^ en revers transkribsjon fra mRNA. Se f.eks. Ullrich et ål, Science 196, 1313 (1977).

2. Rekombinert koding for uttrykking av forloperprotein

I den fremgangsmåte som skjematisk er vist på fig. 1, vil uttrykkingen gi et forloperprotein som inneholder både et polypeptid utkodet ved hjelp av et spesifikt heterologt strukturelt gen (somatostatin) og ytterligere protein (bestående av en del av |3-galaktosidaseenzymet). En selektiv spaltingsposi-sjon nær somatostatinaminosyresekvensen muliggjør, en etter-følgende separasjon av det forønskede polypeptid fra det over-flødige protein. Det tilfelle som er vist er representativt for en rekke fremgangsmåter som er muliggjort ved den teknikk som her er beskrevet.

Mest vanlig vil spaltingen utføres utenfor det re-pliserende miljø for plasmiden eller for et annet element, f.eks. etter at man har høstet den mikrobielle kulturen. På denne måten så vil en temporær konjugering av små polypeptider med overflødig protein bevare det førstnevnte mot f.eks. en in vivo-nedbrytning med endogene enzymer. Samtidig vil det overflødige protein vanligvis ta noe av bioaktiviteten fra det forønskede polypeptid mens man venter på den ekstra-cellulære spaltingen, med den effekt at man øker biosikkerheten på fremgangsmåten. I visse tilfeller kan det selvsagt være ønskelig å utføre spaltingen inne i cellen. Således kan man tilveiebringe klonende elementer med DNA-koding for enzymer som danner insulinforløperne til den aktive form og som oper-erer samtidig med annet DNA kodet for uttrykking av forløper-formen.

I foretrukne tilfeller vil det spesielle forønskede polypeptid mangle interne spaltingsposisjoner som.tilsvarer

de man anvender for å kvitte seg med overflødig protein, og i de tilfeller hvor denne betingelse ikke er oppfylt, så vil man altså få konkurrerende reaksjoner som dog vil gi det for-ønskede produkt, dog.i mindre utbytte. I de tilfeller hvor det forønskede produkt er metionin-fritt, så har det vist seg

å være meget effektivt å utfore spaltingen ved hjelp av cyanogenbromidspalting ved metionin som støter inntil den forønskede sekvens. På lignende måte kan arginin- og lysin-frie produkter enzymatisk spaltes med f.eks. trypsin eller, chymotryp&in ved arg-arg, lys-lys eller lignende spaltingsposisjoner inntil den forønskede sekvens. I de tilfeller hvor spaltingen etter-later seg f.eks. uønsket arginin festet til det forønskede produkt, så kan dette fjernes ved karboksypeptidase-nedbrytning. Når man bruker trypsin for å spalte ved arg-arg, så kan lysin-posisjoner inne i det forønskede polypeptid først beskyttes,

f.eks. ved maleinsyre eller citrakoninsyreanhydrider. De spaltingsteknikker som her er beskrevet er kun angitt som eksempler.

Spaltbart protein kan uttrykkes inntil enten Celler N-terminalene på et spesifikt polypeptid, eller endog inne i polypeptidet selv, noe som er tilfelle, i den sekvens som skiller proinsulin og insulin. Det element som brukes for kodingen kan igjen uttrykke et protein som består av gjen-tatte sekvenser av det forønskede polypeptid, som så hver kan skilles ved selektive spaltingsposisjoner. Det er imidlertid mest foretrukket at kodoner for overflødig protein vil være, oversatt på forhånd i det strukturelle genet for det forønsk-ede produkt, noe som er vist på figurene. I ethvert tilfelle . må man være forsiktig slik at- man opprettholder en passende avlesningsramme i forhold til regulonét.

2. Uttrykking av immunogener

Evnen til å uttrykke både et spesifikt polypeptid og overflødig protein gjør det mulig å fremstille immunogen-iske stoffer. Polypeptid-"haptene" (dvs. stoffer som inneholder determinanter som er spesielt bundet ved hjelp av antistoffer o.l., men vanligvis for små til å utløse en immunolo-gisk reaksjon) kan uttrykkes som konjugater med ytterligere protein i tilstrekkelig størrelse til at man får immunogenitet. Det p-gal-somatostatin-konjugat som her er fremstilt som et eksempel, er i virkeligheten av immunogenisk størrelse og kan forventes å frembringe antistoffer som vil binde soma-tostatinhaptenet. Proteiner som inneholder over 100 aminosyrer, vanligvis over 200 slike, vil ha immunogenisk karakter.

Konjugater fremstilt på den forannevnte måte kan brukes for å utløse antistoffer som kan brukes under radio-immunologiske prøver eller andre prøver for haptenet; og alternativt ved fremstillingen av vaksiner. Man vil i det etter-følgende beskrive et eksempel på sistnevnte anvendelse. Cyanogenbromid - eller andre spaltingspr<p>dukter av viralt beleggende protein vil gi oligopeptider som vil binde antistoff ut-løst av proteinet selv. Hvis man derfor har gitt aminosyresekvensen for et slikt oligopeptidhapten, kan man følgelig uttrykke heterologt DNA som et konjugat med ytterligere protein som' gir immunogenitet. Bruken av slike konjugater som vaksiner skulle forventes å gi mindre sidereaksjoner som vanligvis folger bruken av selve det beleggende protein for å

få immunitet.

4. Kontrollelementene

Fig..1 viser en fremgangsmåte hvor en transformer-ende organisme uttrykker polypeptidprodukt fra heterologt DNA som er brågt under kontroll av et regulon "homologt" til organismen i dens uomdannede -tilstand. Således vil laktose-avhengig E. coli-kromosomalt DNA bestå av et laktose eller "lak" operon som styrer laktosenedbrytning, f.eks. ved å utlbse enzymet (3-galaktosidease. I det spesielle tilfellet som er vist vil. lak-kontrollelementene være oppnådd fra en bakterofag/N, plak 5, som er' ineffektiv overfor E. coli. Fagens lak-operon er på sin side avledet ved'transduksjon fra den samme bakteriearten, fblgelig "homogoliteten". Homologe reguloner som egner seg for bruk i den beskrevne fremgangsmåte kan alternativt avledes fra plasmidisk DNA som er opp-rinnelig i organismen.

Enkelheten og „effektiviteten for det angitte lak-fremmer-operatorsystem gjor det enkelt å bruke i det system som er beskrevet ovenfor, noe som også er tilbelle med dets evne til å bli indusert av IPTG (isopropyltio-(3-D-galaktosid). Selvsagt kan man også bruke andre operoner eller deler av disse, f.eks. lamda-fremmer-operator, arabinose-operon (fi 80 dara), eller colicin El, galaktose, alkalisk fosfatase eller tryptofan-operoner. Fremmer-operatorer avledet fra sistnevnte (dvs. "tryp-operon") kan forventes å gi 100% undertrykking mens man avventer induksjon (med indolakrylsyre) og etterfølgende innhøstning.

5. Generell plasmidkonstr. uksjon

Detaljene i den fremgangsmåte som skjematisk er vist på fig. 4 vil fremgå av den etterfølgende eksperimentelle del. Det kan imidlertid på dette punkt være nyttig kort å diskutere de forskjellige teknikker som brukes under konstruksjon av rekombinert plasmid i den foretrukne utførelse. Kloningen og uttrykkingen av det syntetiske somatostatingenet bruker to plasmider. Hvert plasmid har en EcoRI- substratposisjon i et forskjellig område på (3-galaktosidase-strukturgenet (se fig. 4 og 5). Innsettingen av det syntetiske somato.stati on-DNA-fragment i EcoRI-po sis jonen i disse plasmider vil folgelig bringe uttrykkingen av den genetiske informasjonen man har i dette fragment, under kontroll av de lak-operon-kontrollerende elementer. Etter at man har innsatt somatostatinfragmentet i disse plasmider, så skulle en oversettelse resultere i et somatostatinpolypeptid som foran seg enten har 10 aminosyrer (jpSOMl) eller i virkeligheten hele p-galaktosidase-underenhetstrukturen (pSOMll-3).

Selve plasmidkonstruksjonen starter med plasmid pBR322, et velkarakterisert klonende element. En introduk-sjon av lak-elementer i dette plasmid ble utfort ved å inn-sette et Haelll-begrensende endonukleasefragment (203 : nukleotider) som bar med seg lak-fremmeren,,CAP-bindeposisjonen, operatoren, ribosombindeposisjonen og de fbrste 7 aminosyre-kodonene i det p-galaktosidase-strukturelle gen. Nevnte Haelll-fragment ble avledet fra }\plak 5 DNA. Det EcoRI-spaltede PBR322-plasmid som hadde sine termini reparert med T4 DNA-, polymerase og -deoksyribonukleotid-trifosfater, ble ende mot ende bundet til HaelII-fragmentet slik at man skapte EcoRI-termini ved innsetningspunktene. En sammenfoyning av disse Haelll- og reparerte EcoRI-termini gir EcoRi-begrensende posisjoner (se fig. 4 og 5)~ved hver enkelt terminus. Transformanter av E. coli RR1 med denne DNA ble så valgt for re-sistens mot tetracycline (Tc) og ampicillin (Ap) på et medium av 5-brom-4-klor-incolylgalaktosid (X-gal). På dette indika-tormedium kunne man identifisere kolonier som var istand til å syntetisere p-galaktosidase på grunn av et bkende antall titrerende repressorer for. lak-operatorer, på grunn av kolo-nienes blå farge. Det er to mulige orienteringer på, Haelll-fragmentet, men disse kan skilles ved en asymmetrisk plaser-ing av en Hha-begrensende posisjon på fragmentet. Plasmid pBHIO ble ytterligere modifisert slik at man eliminerte en EcoRI-endonukleaseposisjon distalt i forhold til lak-operatoren (pBH20).

De åtte kjemisk syntetiserte oligodéoksyribonukleo-tidene (fig. 2) ble merket .ved nevnte 5'-termini med (^p)-oc-ATP ved polynukleotid-kinase' og ble bundet sammen med T4 DNA- ligase. Gjennom hydrogenbinding mellom de overlappende fragmenter vil somatostatingenet sette seg sammen selv og even-tuelt polymerisere seg til storre molekyler på grunn av de kohesive restriksjonsposisjonstermini. De sammenbundne produkter ble behandlet med EcoRI- og BamHI-begrensende endonukleaser for å utvikle det somatostatingen som er angitt på fig. 2.

Det syntetiske somatostatingenefragment med EcoRI-og Baml-termini ble bundet tri pBH20-plasmiden på forhånd behandlet med EcoRI- og BamHI-begrensende endonukleaser og alkalisk fosfatase. Behandlingen med alkalisk fosfatase gir molekylær seleksjon for plasmider som bærer det innsatte fragment. Ampicillin-resistente transformanter oppnådd med dette sammenbundne DNA ble undersokt for tetracyclinfblsom-het og flere ble undersokt med hensyn til innsettelsen av et EcoRi- BamHI-fragment av passende storrelse.

Begge tråder av EcoRI-BamHI-fragmentene av plasmider fra to kloner ble analysert med hensyn til nukleotidsekvens-analyse idet man startet ut fra BamHI-og EcoRI-posisjonene. Sekvensanalysen ble forlenget over dé lak-kontrollerende elementer, og lak-fragmentsekvensen var intakt,' :og i ett tilfelle, pSOMl, så ble nukleotidsekvensen i begge tråder undersokt uavhengig av hverandre og hver ga den sekvens som er angitt på fig. 5A.

EcoRI- Pst-fragmentet i pSOMl-plasmiden med det lak-regulerende eller -kontrollerende element, ble fjernet og erstattet med EcoRI- Pst-fragment av pBR322 slik atman fikk plasmiden pSOMll. EcoRI-fragmentet fra)\plak 5, som bar det lak-operon-kontrollerende området og mesteparten av det nevnte P-galaktosidase-strukturelle gen, ble innsatt i EcoRI-posisjonen i plasmiden pSOMll. Man forventet to orienteringer av Eco RI-lak-fragmentet i>plak 5. En av disse orienteringer ville gi passende avlesningsramme over i somatostatingenet, den andre ikke. Analyser av uavhengig isolerte kloner for somatostatin-aktivitet kunne så identifisere de kloner som inneholdt det passende orienterte gen, og av disse så fant man klonen som hadde betegnelsen pSOMll-3.

6. Mikroorganisme

Forskjellige encellede mikroorganismer har vært fore- slått som kandidater for transformasjon, såsom "bakterier, sopp og alger. Dvs. de encellede organismer som kan dyrkes i kultur eller under fermenteringsbetingelser. Bakterier er i de fleste tilfeller den mest hensiktsmessige organisme å arbeide med. Bakterier som lar seg. transformere innbefatter arter i familien Enterobacteriaceae, såsom forskjellige raser av Escherichia coli og Salmonella, familien Bacillaceae, såsom Bacillus subtilis, Pneumococcus, Streptococcus og Haemophilus influenzae.

Den spesielle organisme som ble valgt for somatostatin-undersokelsen som er mer detaljert beskrevet i det etter-følgende, var E. coli, rase RR1, genotype: Pro~Leu~Thi~Rg"MBrec A<+>Str<r>Lac y". E. coliRRI er" avlédet av. E.. coli HB101 (H.W. Boyer et al, J. Mol. Biol. (1969) 41, 459 - 472) ved å krysse den med E. coli K12 rase' KL16 som Hfr-donoren. Se J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kulturer av både E. coli RR1 og

E. coli RR1 (pBR322) er blitt levert den amerikanske type kultur kolleksjon uten begrensninger med hensyn til anvendelse, og har henholdsvis fått ATCC nr. 31.343 og 31.344.

Den somatostin-produserende organisme er på lignende måte levert' under ATCC nr. 31.447.

I forbindelse med menneskeinsulin, ble A- og B-kjede-gener klonet i E. coli K-12 rase 294 (ende A, thi", hsr~, hsm^<+>), ATCC nr. 31.446, og den organisme som ble brukt-under uttrykkelse av A-kjeden er E. coli K-12 rase 294 (pIAl),

ATCC nr. 31.448. B-kjeden i menneskeinsulin ble forst ut-trykt som et derivat av HB101, dvs. E. coli K-12 rase D1210

en lak<+>(i^o^^y"<1>"), og den B-geneholdige organismen er på lignende måte levert under nr. ATCC 31.449. Alternativt kan B-genet innsettes i og uttrykkes fra den organismen som ble nevnt forst, dvs. rase 294. Eksperimentell del

I. Somatostatin

1. Konstruksjon av somatostatingenefragmenter,

Åtte oligodeoksyribonukleotider henholdsvis merket

A til og med H på fig. 2 ble forst konstruert, prinsipielt

ved den modifiserte triestermetode som er beskrevet av K. Ita-

kura et al, J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975). I forbindelse med fragmentene C, E og H brukte man imidlertid en forbedret teknikk hvor fullt beskyttede trimerer forst fremstilles som basisenheter for oppbygning til lengre oligodeoksyribonukleotider. Den bedrede teknikk er skjematisk angitt på fig. 3, hvor B er tymin, N-benzoylert adenin, N-benzoylert cytosin eller N-isobutyrulert guanin. Som angitt på fig. 3 ble et overskudd av I (2 mmol) koblet med forbindelsen II (1 mmol) i ibpet av 60 minutter ved hjelp av et sterkt koplingsmiddel, nemlig 2,4,6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolid (TPSTe,

4 mmol, 2). Etter fjerning av den 5'-beskyttende gruppe med 2% benzensulfonsyreopplbsning, så kunne 5'-hydroksyldimeren V utskiles fra et overskudd av 3'-fosfodiestermonomeren IV ved enkel opplbsningsmiddelekstraksjon med vandig NaHCO^-opplbs-ning i CHCl-^. Den fullt beskyttede tfimerblokken ble fremstilt suksessivt fra 51-hydroksyldimer V, I (2 mmol) og TPSTe (4 mmol) og isolert ved hjelp av kromatografi på silisiumdioksydgel slik det er beskrevet av B. T. Hunt et al, Chem. and Ind., 19<6>7, 1868 (1967). Utbyttene av trimerer fremstilt ved hjelp av denne forbedrede teknikk, er angitt 1 tabell II.-

De åtte oligodeoksyribonukleotidene etter fjerning av alle beskyttende grupper, ble renset ved hbytrykks væskekromatografi på "Permaphase AAX" (R.A. Henry et al, J. Chrom. Sei. II, 358 (1973)). Renheten av hver oligomer ble undersokt ved homokromatografi på tyrmsjikt DEAE-cellulose og dessuten ved gelelektroforese i 20% akrylamidstykker etter merking av oligomerene med ( X - P)-ATP i nærvær av polynukleotidkinase. Man fikk bare ett merket produkt fra hvert DNA-fragment.

2. Sammenbinding og akrylamidgelanalyse av somatostatin DNA

5'-OH-termini på de kjemiske syntetiserte fragment-" er A til og med H ble separat fosforylert med T4-polynukleotidkinase. ( P)-)f-ATP ble brukt under fosforyleringen slik at reaksjonsproduktene kunne undersøkes autoradiografisk, skjbnt det er forstått at man også kan bruke umerket ATP. Like for kinasereaksjonen ble 25 uCi av { Y -^<2>P)ATP (ca.

1500 Ci/mmol) (Maxam and Gilbert, Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A.

. 74, 1507 (1977)) fordampet til torrhet i 0,5 ml Eppendorfrbr. 5 mikrogram av fragmentet ble inkubert med 2 enheter T4-DNA-kinase (hydroksylapatittfraksjon, 2500 enheter/ml, 27), i

70 mmol tris-HCl pH 7,6, 10 mmol MgCl^, 5 mmol ditiotreitol

i et totalt volum på 150<y>ul i 20 minutter ved 37°C. For å sikre maksimal fosforylisering av fragmentene for.den senere sammenbindende reaksjonen, ble 10^ul av en blanding bestående av 70 mmol tris-HCl pH 7,6, 10 mmol MgClg, 5. mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og to enheter DNA-kinase tilsatt og inkuberingen fortsatt i ytterligere 20 minutter ved 7°C. Fragmentene (250 nanog/yul) ble lagret ved -20°C uten ytterligere behandling. Kinaserte fragmenter A, B, E og F (1,25/Ug hver) ble bundet sammen i et totalt volum på 50^ul i 20 mmol tris-HCl pH 7,6, 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og 2 enheter T4-DNA-ligase (hydroksylapatittfraksjon, 400 enheter/ml, 27) i 16 timer ved 4°C. Fragmentene C, D, G og H ble bundet

sammen under lignende betingelser. Prover på 2 yul ble fjernet for analyse ved elektroforese på 10% polyakrylamidgel fulgt av autoradiografi (H.L. Heyneker et al, Nature 263, 748

(1976)) hvor de uomsatte DNA-fragmenter er representert ved

raskt, vandrende materiale og hvor den monomeriske formen av de sammenbundne fragmenter vandrer sammen med bromfenolblått (BPB).. Det skjer også en viss. dimerisering på, grunn av de kohesive ender på de sammenbunde fragmenter A, B, E og F, og på de sammenbundne fragmenter C, D, G og H. Disse dimerer er det som vandrer langsomst, og kan spaltes ved begrensende endonuklease EcoRI og BamHI, henholdsvis.

De to halve molekylene (sammenbundet A + B + E + F og sammenbundet C + D + G + H) ble forenet ved et ytterligere sammenbindingstrinn utfort i et sluttvolum på 150/ul ved 4°C i 16 timer. 1 mikroliter ble fjernet ffor analyse. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 15 minutter ved 65°C for å inak-tivere nevnte T4-DNA-ligase. Varmebehandlingen påvirker ikke vandringsmonsteret på DNA-blandingen. Tilstrekkelig begrensende endonuklease BamHI ble tilsatt reaksjonsblåndingen for å spalte multimeriske former.av nevnte somatostatin DNA i lopet av 30 minutter ved 37°C. Etter tilsetningen av NaCl til

100 mmol, ble DNA reagert med EcoRI-endonuklease. Den begrensende endonukleasereaksjonen ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon av DNA. Somatostatin-DNA-fragmentet ble renset fra uomsatt og delvis sammenbundne DNA-fragmenter ved preparativ elektroforese på én 10% polyakrylamidgel.

Det båndet som inneholdt somatostatin DNA-fragmentet ble skåret ut av gelen og DNA.ble eluert ved å kutte gelen opp i små stykker og ekstrahere DNA med en elueringsbuffer (0,5 mol ammoniumacetat, 10 mmol MgCl2, 0,1 mmol EDTA, 0,1% SDS)

over natten ved 65°G. DNA ble så utfelt med 2 volumer etanol, sentrifugert og gjenopplbst i 200^/ul 10 mmol tris-HCl, pH 7,6, og dialysert mot den samme buffer hvorved man fikk en somatostatin DNA-konsentrasjon på 4^ug/ml.

3. Konstruksjon av rekombinerte plasmider

Fig. 4 viser skjematisk hvordan man konstruerer rekombinerte plasmider som irinbefatter somatostatingenet,

og det vil f den etterfølgende beskrivelsen bli henvist til denne tegningen.

A. Parenteralt plasmid pBR522

Det plasmid som ble valgt for den eksperimentelle somatostatin-kloningen var pBR322, et lite (molekylvekt ca. 2,6 megadalton) plasmid som hadde resistensgener mot anti-biotika ampicillin (Ap) og tetracycline (Tc. Som vist på fig. 4. innbefatter ampicillinresistensgenet en spaltnings^-posisjon for den begrensende endonukleasen PstI, og tetra-cyclineresistensgenet innbefatter en lignende posisjon for begrensende endonuklease BamHI, og en EcoRI-posisjon er plasert mellom Ap<r->og TC<r->genene. Plasmidet pBR322 er avledet fra pBR313, et 5,8 megadalton Ap<r>Tc<r>Col<imm->plasmid (R.L. Rodriquez et al, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Bio logy 5,.471 - 77 (1976), R.L. Rodriquez et al, Construction and Characterization of Cloning Vehicles, i Molecular Mecha-nisms in the Control of Gene Expression, side 471 - 77, Academic Press, Inc. (1976)). Plasmid pBR322 er beskrevet

mer detaljert i F. Bolivar et.al, "Construction and Char-• acterization of New Cloning Vehicles II.A Multipurpose Cloning System", Gene (november 1977).

B. Konstruksjon av plasmid pBHIO

5 mikrogram av plasmid pBR322 DNA ble reagert med

10 enheter av den begrensende endonukleasen EcoRI i 100 mmol tris-HCl, pH 7,6, 100 mmol NaCl, 6 mmol MgCl2, ved 37°C i 30 minutter. Reaksjonen ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon; DNA-en ble så utfelt med 2,5 volumer etanol og resuspendert i 50^ul T4-DNA-polymerasebuffer (67 mmol tris-HCl, pH 8,8, 6,7 mmol MgCl2, 16,6 mmol (NH^<S>O^, 167/Ug/ml storfeserumalbumin, 50^um hver av de angitte dNTP,(A. Panet et al, Biochem. 12, 5045 (1973)). Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 2 enheter T4-DNA-polymerase. Etter inkubering .

i 30 minutter ved 37°C ble reaksjonen avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon av DNA fulgt av utfelling med etanol.

3 mikrogram 7\plak5-DNA (Shapiro et al Nature 224, 768 (1969))

ble brutt ned i 1 time ved 37°C' med det begrensende enzym

. Haelll (3 enheter) i 6 mmol tris-HCl, pH 7,6, 6 mmol MgCl2,

6 mmol (3-merkaptoetanol i et sluttvolum på 20/ul. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming i 10 minutter ved 65 C. pBR322-behandlet DNA ble blandet med den Haelll-reagerte Xplak -DNA og ende mot ende bundet sammen i et sluttvolum på 30^ul med 1,2 enheter T4-DNA-ligase (hydroksylapatittfraksjon, A. -Panet et al, supra) i 20 mmol tris-HCl, pH 7,6, 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP i 12 timer ved 12°C. Den reagerte DNA-blanding ble dialysert mot 10 mmol tris-HCl,

pH 7,6, og brukt for omdannelse eller transformering av E. coli-rase RR1. Transformanter ble valgt for tetracycline- og ampi-cillinresistens på minimumsmediumplater inneholdende 40^ug/ml 5-brom-4-klor-indolylgalaktosid (X-gal)-medium (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972) ). Kolonier som kunne brukes, for syntesen av . (3-galaktosidase ble identifisert ved sin blå farge. Etter undersøkelse av 45 uavhengig isolerte blå kolonier ble 3 av

dem funnet å inneholde plasmid DNA som hadde to EcoRI-posisjoner atskilt med ca. 200 basepar. Posisjonen på et asymmetrisk plasert Hhal-fragment i det 203 b.p. Haell-lak-kontrol-lerrende fragment (W. Gilbert et al i Protein-Ligand Inter-actions, H. Sand and G. Blauer, Eds. (De Gruyter, Berlin

(1975) side 193 - 210) muliggjor en bestemmelse av orienteringen påHaeIII-fragmentet, nå■et EcoRI-fragment i disse plasmider. Man kunne påvise at plasmid pBHIO hadde dette fragment i den foronskede orientering, dvs. at lak-transkribsjonen går over i Tc r-genet i plasmiden.

C. Konstruksjon av plasmid pBH20

Plasmid pBHIO ble deretter modifisert for å eliminere EcoRI-posisjonen distalt i forhold til lak-operatoren. Dette ble utfort ved selektiv EcoRI-endonuklease-spalting ved den distale posisjon, noe som innbefatter delvis beskyt-telse ved hjelp av RNA-polymerase av den andre EcoRI-posisjonen, som er lokalisert mellom nevnte Tc<r->og lak-promotorene, som bare ligger ca. 40 basepar fra hverandre. Etter binding med RNA-polymerase ble DNA (5/Ug) reagert med EcoRI (1 enhet)

i et sluttvolum på 10/ul i 10 minutter ved 37°C. Reaksjon- " en ble stoppet ved oppvarming til 65 C i 10 minutter. De EcoRI-kohesive termini ble reagert med Sl-nuklease i 25 mmol Na-ace.tat, pH 4,5, 300 mmol NaCl, 1 mmol ZnCl2ved 25°C i

5 minutter. Reaksjonsblandingen ble stoppet ved tilsetning av EDTA (10 mmol til slutt) og tris-HCl, pH 8, (50 mmol til slutt). DNA-en ble fenol-kloroform-ekstrahert, etanol-utfelt og resuspendert i 100/ul T4-DNA-sammenbindingsbuffer. T4-DNA-ligase (1/ul) ble tilsatt, og blandingen inkubert ved 12 C

i 12 timer. Det sammenbundne DNA ble transformert i E. coli-rase RRI og Ap<r>Tc<r->transformantene ble utvalgt på et X-gal-anti-biotikamedium. Begrensende enzymanalyse av DNA utvalgt fra

10 isolerte blå kolonier viste at disse kloner bar plasmid-

DNA med én EcoRI-posisjon. 7 av disse koloniene hadde beholdt EcoRI-posisjonen plasert mellom lak-operatoren og Tcr-promotor-en. Nukleotidsekvensen fra EcoRI-posisjonen og over i den lak-regulerende delen av én av disse plasmider, nemlig pBH20, kunne bekreftes. Plasmiden ble deretter brukt for å klone somatostatingenet.

D. Konstruksjon av plasmid pSOM 1

20 mikrogram av plasmidet pBH20 ble reagert til fullstendighet med begrensende endonukleaser EcoRI og BamHI 1 et sluttvolum. på 50 ^ul. Bakteriell alkalisk fosfatase ble tilsatt (0,1 enhet"Worthington BAPF"), og inkuberingen ble fortsatt i 10 minutter ved 65°C. Reaksjonene ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstrasjon, og DNA utfelt med 2 volumer etanol, sentrifugert og opplost i 50<y>ul 10 mmol tris-HCl, pH 7,6, 1 mmol EDTA.'Den alkaliske fosfatase-behandlingen vil. effektivt hindre selvsammenbinding av EcoRI-og BamHI-behandlet pBH20-DNA, men sirkulære rekombinerte plasmider som inneholder somatostatin DNA ,kan dog dannes ved sammenbinding. Ettersom E. coli RR1 blir omformet med meget lav effektivitet av det lineære plasmid DNA, så vil hovedmengden av transformantene inneholde rekombinerte plasmider. 50 mikroliter somatostatin DNA (4^ug/ml) ble bundet sammen med. 25/ul av BamHI, EcoRI, alkalisk fosfatase-behandlet pBH20-DNA i et totalt volum på 50^ul inneholdende 20 mmol tris-HCl, pH 7,7, 10 mmol MgCl2>:10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og 4 enheter t4-DNA-ligase ved 22°C. Etter 10, 20

og 30 minutter ble ytterligere somatostatin DNA (40 nanogram) tilsatt reaksjonsblandingen (gradvis tilsetning av somatostatin DNA begunstiger sammenbinding til plasmidets fremfor en selvsammenbinding). Sammenbinding ble fortsatt i 1 time fulgt av en dialyse av blandingen mot 10 mmol tris-HCl, pH 7,6. I et kontrolleksperiment ble BamHI, EcoRI, alkalisk fosfatase-behandlet pBH20-DNA bundet sammen i fravær av somastotatin DNA under tilsvarende betingelser. Begge preparater ble brukt uten ytterligere behandling for transformering av E. coli RR1. Transformeringseksperimentet ble utfort i et såkalt "P3-apparat" (National Institutes of Health, U.S.A., Recombinant DNA Research Guidelines, 1976). Transformantene ble utvalgt på minimums-mediumplater inneholdende 20^ug/ml<A>Ap og 40 /ug/ml X-gali Det ble isolert 10 transformanter som alle var sensitive overfor Tc. Av hensiktsmessighetsgrunner ble disse betegnet pSOMl, pS0M2 etc. til pSOMlO. Under kon-trolleksperimentet oppnådde man ingen transformanter. 4 av de 10 transformantene inneholdt plasmider med både en EcoRI-posisjon og en BamHI-posisjon. Størrelsen på det lille EcoRI-,

BamHI-fragmentet i disse rekombinerte plasmider var i alle fire tilfellene lik størrelsen på det in vitro-fremstilte somatostatin DNA. Basesekvensanalyse. ifølge Maxam and Gilbert Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 74, 560 (1977) viste at'plasmiden

■pSOMl hadde fått innsatt det .forønskede somatostation DNA-fragment.

DNA-sekvensanalysen av klonen som bar plasmiden pSOMl forutsa at den skulle produsere et peptid bestående

av somatostatin. Imidlertid 'kunne ingen somatostation-radio-immunitets-aktivitet påvises i ekstrakter av celleklumper eller kulturvæsker, heller ikke kunne man påvise et nærvær av somatostation når en voksende kultur ble tilsatt direkte til 70% maursyre og cyanogenbromid. Man har kunnet observere at E. coli RRl-ekstrakter meget raskt nedbryter eksogen somatostatin. Fraværet av somatostatinaktivitet i kloner som bærer plasmid pSOM 1 kunne derfor være et resultat av intra-cellulær nedbrytning ved hjelp av endogene proteolytiske enzymer. Plasmid pSOM 1 ble følgelig brukt for å konstruere en plasmid som koder for et forløperprotein som innbefatter somatostatin og som er tilstrekkelig stort tii at man kan for-vente at det skal være resistent overfor proteolytisk nedbrytning.

E. Konstruksjon av plasmidene pSOM 11 og pSOM 11- 3

Det ble konstruert et plasmid hvor somatostatingenet kunne plaseres ved C-terminus på (3-galaktosidasegenet, idet man holdt oversettelsen i fase. Nærværet av en EcoRI-posis jon nær nevnte C-terminus i dette gen og den tilgjengelige aminosyresekvensen i dette protein (B. Polisky et al, Proe. Nat. Acad. Sei., U.S.A. 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al, Id., 74, 1507 (1976), A.I. Bukhari et al, Nature New Biology 243, 238 (1973) og K.E. Langley, J. Biol. Chem.'250,

2587 (1975)) muliggjorde en innsettelse av EcoRI BamHI-somatostatingenet i EcoRI-posisjonen samtidig som man opprettholdt en riktig avlesningsramme. For konstruksjon av en slik plasmid, ble pSOM 1 DNA (50/Ug) brutt ned med de begrensende enzymer EcoRI og Pstl i et sluttvolum på 100 yul. En preparativ 5% polyakrylamidgel ble brukt for å skille det store Pst- EcoRI-fragment som bærer somatostatingenet fra det mindre

fragmentet som bærer de lak-kontrollerende elementene. Det store båndet ble,skåret ut av gelen og DNA-eluert ved å skjære gelen opp i mindre stykker og ekstrahere DNA ved 65°C over natten. På lignende måte ble plasmid pBR322 DNA (50<y>ug) nedbrutt med PstI- og EcoRI-begrensende endonukleaser, og de to. resulterende DNA-fragment er renset ved preparativ elektroforese på en 5% polyakrylamidgel. Det mindre Pstl-EcoRI-fragment fra pBR322, (1^ug) ble bundet sammen méd det store Pstl- EcoRI DNA-fragment (5/Ug) fra pSOM 1 i et sluttvolum på 50/ul med 1 enhet av T4-DNA-ligase ved 12°C i 12 timer. Den sammenbundne blandingen ble brukt for å transformere

E. coli RRI, og transformanter ble utvalgt méd hensyn til ampicillin-resLstens på X-gal-medium. Som ventet ga nesten alle APr-transformantene (95%) hvite kolonier (ingen lak-oerator) på X-gål-indikatorplater. Det resulterende plasmid pSOM 11 ble brukt for konstruksjon av plasmid p SOM 11-3.

En blanding av 5/Ug pSOM 11 DNA og 5/ug }\ plak5-DNA ble nedbrutt med EcoRI (10 enheter i 3o minutter ved 37°C). Den begrensende endonukléasereaksjonen ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon. DNA ble så etanol-utfelt og resuspendert i T4-DNA-ligasebuffer (50^ul). 1 enhet T4-DNA-ligase ble tilsatt blandingen og inkubering utfort i 12 timer ved 12°C. Blandingen med de sammenbundne fragmenter ble dialysert mot 10 mmol tris-HCl, pH 7,6,.og brukt for å transformere E. coli-rase RRI. Transformanter ble utvalgt for Ap<r>på X-gal-plater inneholdende ampicillin og undersokt for mulighet for (3-galaktosidaseproduksjon. Ca. 2% av koloniene var blå (pSOM 11-1, 11-2 etc). En analyse av begrensende enzym fra plasmid-DNA oppnådd fra disse kloner viste at alle plasmidene bar et nytt EcoRI-fragment på ca. 4,4 megadalton, som bærer de lak-operon-kontrollerende posisjonene og mesteparten av (3-galaktosidasegenet. Ettersom det er mulig med , to orienteringer på EcoRi-fragmentet, ble den asymmetriske plaseringen på en HindiII-begrensende posisjon brukt for å bestemme hvilke av disse kolonier som bar dette EcoRI-fragment med en lak-transkribsjon som gikk over i somatostatingenet. En HindIII- Bam HI-dobbelnedbrytning indikerte at bare de kloner som bar plasmidene pSOM 11-3, pSOM 11-5, pSOM 11-6

og pSOMll-7 inneholdt EcoRI-fragmentet i denne orientering.

4. Radioimmunprdve for somatostatinaktivitet

Den kjente standard radioimmunprdve (RI) for somastotatin (A. Arimura et al, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975) "ble modifisert ved å senke prdvevolumet og ved å bruke f osf atbuf f er. Tyr^-somatostatin ble jodisert ved å bruke en kloramin-T-fremgangsmåte (Id.). For å undersdke for somatostatin ble prdven vanligvis i 70% maursyre inneholdende 5 mg cyanogenbromid pr. ml tdrket i et konisk poly-propylenrdr (0,7 ml, Sar stedt)' over fuktig KOH under vakuum. 20 mikroliter PBSA-buffer (75 mmol NaCl, 75 mmol natrium-fosfat, pH 7,2, 1 mg/ml av storfeserumalbumin, og 0,2 mg/ml natriumazid) ble tilsatt fulgt av 40^ul av en 0~^ 1)-somatostatin-"cocktail" og 20 yul av en 1000-gangers fortynning i PBSA av kanin-antisomatostatin-immunitetsserum S39 (Vale et al, Metabolism 25, 1491 (1976)). Nevnte (<125>I)-somatostatin-.cocktail inneholdt pr. ml PBSA-buffer: 250 yug normalt kanin-gammaglobulin (Antibodies, Inc.), 1500 entheter protease-inhibitor ("Trasylol", Calbiochem) og ca. 100.000 "counts" av (^^^Tyr^-somatostatin. Etter minst 16 timer ved romtemperatur tilsatte man 0,333 ml geit-anti-kanin-gammaglobu-. lin (Antibodies, Inc., P 0,03) i PBSA-buffer til prove-rdrene. Blandingen ble inkubert i 2 timer ved 37°C, av-kjølt til 5°C og så sentrifugert ved 10.000 ganger g i 5 minutter. Den overliggende væske ble fjernet og bunn- ' fallet tellet i en gammateller. Med den mengde antiserum som ble brukt ble 20% av "the counts" utfelt uten umerket konkurrerende somatostatin. Bakgrunnen med somatostatin (200 nanogram) var vanligvis 3%. En halvmaksimal konkurranse ble oppnådd, med 10 pg somatostatin. Initielle eks-prementer med ekstrakter av E. coli-rase RRI (den mottagende rasen) indikerte at mindre enn 10 pg somatostatin kunne lett påvises i nærvær av 16 yug eller mer av det cyahogenbromid-behandlede, bakterielle protein. Mer enn 2^ug protein fra de maursyre-behandlede bakterielle ekstrakter forstyrret til en viss grad ved å oke bakgrunnen, men cyanogenbromidspalting ville i hdy grad redusere denne forstyrrelse. Rekon-struksjonseksperimenter viste at somatostatin er stabilt i cyanogén-bromid-behandlede ekstrakter.

A. Konkurranse ved hjelp av b. akterieekstrakter

Rasene E. coli RRI (pSOM 11-5) og E. coli RRI (pSOMll-4) ble dyrket ved 37°C til et antall av 5 x IO<8>celler pr. ml i Luriamedium. Deretter ble IPTG tilsatt til 1 mmol og veksten fortsatte i.2 timer. 1-ml prover ble sentrifugert i et par sekunder i en Eppendorf-sentrifuge og bunnfallet ble suspendert i 500^ul 70% maursyre inneholdende 5 mg cyanogenbromid pr. ml. Etter ca. 24 timer ved romtemperatur ble provene fortynnet 10 ganger i vann og de volumer som er angitt på fig. 6A ble undersokt i tre paraleller for somatostatin. På fig. 6A er "B/B " forholdet mellom (125l)-somatostatin bundet i nærvær av prøven i forhold til det som er bundet i fravær av konkurrerende somatostatin. Hver punkt er et middel av tre paralleller. Proteininnholdet i de ufor-tynnede prover ble bestemt til 2,2^ug/ml for E. coli RRI (pSOMll-5) og 1,5 mg/ml for E. coli RRI (pS0M-4).

B. Første undersøkelse av pSOMH- kloner for somatostatin

Cyanogenbromid-behandlede ekstrakter av 11 kloner (pSOMll-2, pSOMll-3 etc.) ble gjort som beskrevet ovenfor i forbindelse med fig. 6A. 30 mikroliter av hvert ekstrakt ble brukt I tre paralleller for en radioimmunitetsprove, og resultatene er angitt på fig. 6B. Variasjonsområdet for provepunktene er angitt. Verdiene for picogram-somatostatin ble avlest fra en standardkurve oppnådd som en del av det samme eksperimentet.

De radioimmunproveresultater som er beskrevet så langt kan summeres på følgende måte. I motsetning til resultatene fra eksperimentene med pSOMl, få fant man at 4 kloner (pSOMll-3, 11-5, 11-6 og 11-7) hadde en lett påvisbar somatostatin-radioimmunaktivitet, fig. 6A og 6B. En analyse av begrensende fragmenter viste at pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 og pSOMll-7 hadde den forønskede orienteringen på lak-operonet, mens pSOMll-2 og 11-4 hadde motsatt orientering. Det er således en fullstendig korrelasjon mellom korrekt orientering på lak-operonet og produksjonen av somatostatin-radioimmunaktivitet.

C. Effekter av IPRG-induksjon og CNBr-spalting på positive og negative kloner

Utformingen på somatostatin-plasmidét forutsier at syntesen av somatostatin skulle være under kontroll av lak-operonet. Lak-undertrykkergenet er ikke inkludert i plasmidet og den mottagende rasen (E. coli RRI) inneholder bare kromosomalt lak-undertrykkergen av den vilde typen som gir bare fra 10 - 20 undertrykkermolekyler pr. celle (15). Plas-midkopitallet (og derfor antallet lak-operatorer) er ca. 20 - 30 pr. celle, slik at en fullstendig undertrykking er umulig.

Som vist i tabell III i det etterfølgende så.ble den spesifikke aktiviteten for somatostatin i E. coli RRI (pSOMll-3) oket ved IPTG, en induserende forbindelse for lak-operonet. Som ventet var induksjonsnivået lavt, varierende fra 2,4 - 7 ganger. I eksperiment 7 (tabell III) ble også oc-aktiviteten, et mål for de forste 92 aminosyrene i P-galaktosidase, også oket med en faktor på 2. I flere eksperimenter var det slik at man ikke kunne påvise noe somatostatin-radiimmunakti-vitet for cyanogenbromidspalting av det totale cellulære protein. Ettersom det antiserum som er brukt ved radioimmum-prbven, nemlig S 39, krever et fritt N-terminalt alanin, så er det ikke forventet noen aktivitet for cyanogenbromid-,spaltingen.

D. Gelfiltrering a<y>cyanogenbromid- behandlede ekstrakter

Maursyre og cyanogen-behandlede ekstrakter av posi^-tive kloner (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 og 11-7) ble slått sammen, (totalt volum 250 yul), torket og resuspendert i 0,1 ml 50% eddiksyre. (^H)leucin'ble tilsatt og proven påsatt en 0,7 x 47 cm kolonne av "Sephadex G-50"i 50% eddiksyre. Prover på 50 mikroliter av kolonnefraksjonene ble undersokt for somatostatin. •Sammenslåtte negative kloneekstrakter (11-2, 11-4 og 11-11) ble behandlet identisk. Resultatene fremgår av fig. 5C .På samme kolonne er kjente somåtostatineluater (Beckman Corp.) angitt (SS). I dette system er somatostatin. vel skilt fra eksluderte storre peptider og fullt inkluderte mindre molekyler. Bare ekstrakter av kloner som var positive for somatostatin viste radioimmunaktivitet i kolonnefraksjonene og denne aktivitet vil elueres i samme posisjon som kjemisk syntetisert somatostatin.

Oppsummering av aktivitetsinformasjon

De data som fastslår en syntese.av et polypeptid inneholdende en somatostatin-aminosyresekvens kan angis på folgende måte: (1) Somatostatin-radioimmunaktivitet er til-stede i E. coli-celler med plasmiden pSOMll-3, som inneholder et somatostatingen som har en riktig sekvens og har riktig orientering av lak- EcoRI-DNA-fragmentet. Celler med denne nærstående plasmid pSOMll-2, som har samme somatostatingen, men motsatt orientering på lak- EcoRI-fragmentet, gir ingen påvisbar somatostatin-aktivitet: (2) Som forutsatt på grunn av sammensetningen kunne man ikke påvise noen somatostatin-radioimmunaktivitet for etter en cyanogenbromid-behandling av celleekstraktet; (3) Somatostatin-aktiviteten er under kontroll av lak-operonet, noe som kunne påvises ved en indu-sering med IPTG, en induserende forbindelse for lak-operonet;

(4) Somatostatin-aktiviteten vil utkromatograferes samtidig med kjent somatostatin på "Sephadex G-50"; (5) DNA-sekven-

sen i det klonede somatostatingen er korrekt. Hvis oversettelsen er ute av fase, så vil man få fremstilt et peptid som er forskjellig fra somatostatin i hver eneste posisjon. Radioimmunaktivitet kan påvises som indikerer at et peptid nærstående til somatostatin blir fremstilt, og oversettelsen må således være i fase. Ettersom oversettelsen skjer i fase, vil den genetiske koden gjore at man får fremstilt et peptid med nøyaktig samme sekvens som i somatostatin; (6) til slutt kan det angis at de ovennevnte prover av E. coli RRI (pSOMll-3)-ekstrakter hemmer frigjøringen av voksehormoner fra rotte-hypofyseceller, mens prover av E. coli RRI (pSOMll-2) fremstilt helt parallelt og med samme proteinkonséntrasjon ikke hadde noen effekt på veksthormonfrigjoringen.

Stabilitet, utbytte og rensing av somastotatin

De raser som bærer EcoRI-lak-operonfragmentet (pSOMll-2, pSOMll-3 etc.) skiller seg med hensyn til plasmidets fenotype. Ett'er 15 generasjoner vil således bare halvparten av É. coli RRI (pSOMll-3)-kulturen være intakt for fremstilling av (3-galaktosidase, dvs. at den har lak-operatoren,. og av disse kolonier var ca. halvparten ampicillin-resistent. Raser som var positive (pSOMll-3) og negative .'

(pSOM-11-2) for somatostatin var ustabile, og vekstuskjev-

heten antar man følgelig kommer at der produseres for meget av ufullstendige og inaktiv galaktosidase. Utbyttet av somatostatin varierte fra 0,001 til 0,03% av det totale cellu-

lære protein (tabell 1) antagelig et resultat av seleksjonen for celler i kultur med plasmider med et uttrøket lak-område. De høyeste utbytter av somatostatin fikk man fra preparater

hvor veksten var startet ut fra en enkelt ampicillin-resistent

koloni. Selv i slike tilfeller, ville 30% av cellene ved inn-høsting ha utelukkelser - i lak-området. Lagring i frossen tilstand _lyofilisering) og vekst for innhøsting av en enkelt slik.koloni kan følgelig brukes. Utbyttet kan også økes ved - f.eks. å bruke bakterieraser som overproduserer lak-under-trykker slik at uttrykningen av forløperproteinet i alt vesentlig blir totalt undertrykket før induksjon og innhøsting. Alternativt, som nevnt tidligere, kan man også bruke et tryptofan eller et annet oper.ator-promotor-system som vanligvis er totalt undertrykket.

I det rå ekstrakt som oppstår fra en cellenedbryt-ning, f.eks. i en Eaton-presse, så vil (3-galaktosidase-somatostatinforløperproteinet være uoppløselig og ble funnet i et første bunnfall fremstilt ved lav sentrifugeringshas-tighet. Aktiviteten kan oppløseliggjør i 70% maursyre, 6-molar guanididiumhydroklorid eller 2% natriumdodecylsulfat. Mest foretrukket ble imidlertid råekstraktet fra Eaton-pressen ekstrahert med 8-molar urea og residuet spaltet med cyanogenbromid. I innledende eksperimenter ble somatostatin-aktiviteten avledet fra E. coli-rase RRI (pSOMll-3) anriket ca. 100 ganger ved alkoholekstraksjon av det spaltede produkt og etterfølgende kromatografi på "Sephadex G-50" i 50% eddik-. syre. Når produktet igjen ble kromatografert på "Sephadex G-50" og så underkastet høytrykks-væskekromatografi, fikk man i alt vesentlig rent somatostatin.

II. Menneskeinsulin

Den teknikk som tidligere er blitt beskrevet ble således prøvet for fremstilling av menneskeinsulin. Således ble genene for insulin B-kjede (104 basepar) og for insulin A-kjede (77 basepar) utformet fra aminosyresekvensen i menne-skepolypeptidene, hvert med enkelttrådete kohesive terminii for EcoRIx og BamHI-begrensende endonukleaser og hver enkelt utformet for separat innsetning i pBR322-plasmider. De syntetiske fragmenter, deca- til pentadeca-nukleotider ble syntetisert ved den såkalte blokk-fosfotriestermetoden idet man brukte trinukleotider som byggeblokker ot til slutt renset med høytrykks-væskekromatografi (HPLC). De syntetiske gener for menneskeinsulinets A- og B-kjeder ble så klonet separat inn i plasmid pBR322.. De klonede syntetiske gener ble festet til et E. coli (3-galaktasidasegen som beskrevet tidligere hvorved man fikk en effektiv transkribsjon, oversettelse og et stabilt forloperprotein. Insulinpeptider ble spaltet fra - P-galaktasidaseforloperen, påvist ved radioimmunitetsprover og deretter resnet. Insulin-radioimmunitetsprbve-aktiviteter ble så utviklet ved blanding med E. coli-produkter.

1. Utforming og syntese av menneskeinsulingener

De gener som ble konstruert for menneskeinsulin er-vist på'fig. 9. Genene for menneskeinsulin, B-kjede og A-kjede, ble utformet fra aminosyresekvensene i menneskepoly-peptider. 5'-endene i hvert gen har en enkelttrådet kohesiv termini for EcoRI- og BamHI-begrensende endonukleaser, for å få en korrekt innsetning av hvert gen i plasmid pBR322. En Hindlll-endonukleasegjenkjennende posisjon ble inkorporert i midten av B-kjedegenet for aminosyresekvensen Glu-Ala for å lette sammensetning og verifisering av hver halvpart av genet separat for man konstruerte hele B-kjedegenet. B-kjede-og A-kjedegenet ble utformet slik at det ble bygget opp fra 29 forskjellige oligodeoksyfibonukleotider, varierende fra deca-mer til pentadecamerer. Hver pil indikerer det fragment som ble syntetisert ved den forbedrede fosfotriestermetoden, Hl til H8 og Bl til B12 for B-kjedegenet og Al til All for A-kjedegenet.

2. Kjemisk syntese av oligodeoksyribonukleotider

Materialer og metoder for syntese av oligodeoksyribonukleotider var i alt vesentlig som beskrevet av Itakura, K. et al (1975) J. Biol. Chem. 250, 4592 og Itakura, K.. et al

(1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327, bortsett fra disse modi-fikasjoner:' a) De helt beskyttelde mononukleotider, 5-' -0-di-metoksytrityl-3' -p-klorf enyl-|3-cyanoetyl-f osf at er ble syntetisert fra nukleosidderivatene ved å bruke et monofunksjonelt f osf oryleringsmiddel, .dvs. p-klorf enyl-(3-cyanoetyl-f osf oro-kloridat (1,5-molar ekvivalent) i acetonitril i nærvær av 1-metyl-imidazol Van Boom, J. H. et al (1975) Tetrahedron el, 2953. Produktene ble isolert i.stor skala (100 - 300 g) ved preparativ væskekromatografi (Prep 500 LC, Waters Associates). b) Ved å bruke opplbsningsmiddelekstraksjonsmetoden

(Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449) ble 32 bifunksjonelle trimerer syntetisert (se tabell IV) i 5 - 10 mmol-skala, og 13 trimerer, 3;tetramerer og 4 dimerer som 3'-terminusblokker i 1 mmol-skala. Homogeniteten på de fullt beskyttede trimerer ble undersokt ved tynnsjiktkromatografi på silisiumdioksydgel i 2 metandl/kloroform-opplosningsmiddel-systemer: opplosningsmiddel a, 5% volum/volum og opplosningsmiddel b, 10% volum/volum (se tabell IV). Ut fra disse for-bindelser syntetiserte man 29 oligodeoksyribonukleotider med definert sekvens, 18 for B-kjeden og 11 for A-kjedegenet.

Basisenhetene som ble brukt for å konstruere poly-nukleotidene var 2 typer av trimerblokk, dvs. de bifunksjonelle trimerblokkene som er angitt i tabell IV og de tilsvarende 3'-terminus-trimerer beskyttet med en anisoylgruppe ved 3'-hydroksygruppen. Den bifunksjonelle trimeren ble hyd-rolysert til den tilsvarende 3'-fosfodiesterkomponenten med en blanding av pyridin-trietylamin-vann (3:1:1 volum/volum)

og dessuten til den tilsvarende 5'-hydroksylkomponenten med 2% benzensulfonsyre. Nevnte 3'-terminusblokk.ble behandlet

med 2% benzensulfonsyre slik at man fikk den tilsvarende 5'-. hydroksylforbindelsen. Koplingsreaksjonen mellom et over-

skudd av nevnte 3'-fosfodiestertrimer"(1,5-molar. ekvivalent)

og med 5'-hydroksylkomponenten (1-molar ekvivalent) i nærvær av fra 3-4 ekvivalenter av 2,4,6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolid (TPSTe) var nesten fullstendig i lopet av 3 timer. For å fjerne overskuddet av 3'-fosfodiesterblokk-reaktanten

ble reaksjonsblandingen fort gjennom en kort silisiumdioksyd-gelkolonne satt på på et sintrert glassfilter. Kolonnen ble vasket forst med CHCl-^for å eluere noen sideprodukter og koplingsmidlet, og deretter med CHCl-^MeOH (95:5 volum/volum) hvor nesten alt av den fullt beskyttede oligomer ble eluert. Under disse betingelser ble den ladede 3'-fosfodiesterblokk-reaktanten tilbake i kolonnen. På lignende måte ble blokk-koplinger gjentatt inntil man fikk den forbnskede mengde.

r

Hbytrykksvæskekromatografi (HPLC) ble brukt under oligonukleotidsyntesen for a) analyse av hver trimer og tetramerblokk, b) analyse av 'de intermediære fragmenter (heksamerer, monamerer og decamerer), c) analyse av siste koplingsreaksjon og d) rensing av sluttproduktet. Kromato-grafien ble utfort ved å bruke en "Spectra-Physics 3500B" væskekromatograf.. Etter fjerning av alle beskyttende grupper med konsentrert NH^OH ved 50°C (6 timer).og 80% AcOH ved romtemperatur (15. minutter), ble forbindelsene analysert på en "Permaphase AAX"(DuPont) (Van Boom, J. et al (1977) J. Chromatography 131, 169) kolonne (1 m x 2mm) ved å bruke en .lineær gradient av opplosningsmiddel B (0,05 molar K^PO^ - 1,0 molar KC1, pH 4,5) i opplosningsmiddel A (0,01 molar KHgPO^, pH 4,5). Gradienten ble dannet ved å starte med buffer A og påsette 3% av buffer B pr. minutt. Elueringen ble utfort ved 60°C med en hastighet på 2 ml pr. minutt. Rensingen av de .29 ferdige oligonukleotidene ble også utfort på "Permaphase AAX" under de samme betingelser som angitt, ovenfor. Den forønskede topp ble slått sammen, avspaltet ved dialyse og lyofilisert. Etter merking av nevnte 5'-termini med (V -^<2>p)ATP ved å bruke T4-polynukleotidkinase, ble homogeniteten på hvert oligonukleotid undersokt ved elektroforese på en 20% polyakrylamidgel. 3. Sammensetning og kloning av B- kjedegen på A- kjedegenet

Genet for B-kjeden i insulin ble utformet.slik at man hadde en EcoRI-begrensende posisjon på den venstre énden, en Hindlll-posisjon i midten og BamHI-posisjonen i den hoyre enden. Dette ble gjort slik at begge halvdelene, dvs. den venstre EcoRI- HindiII-halvparten (BH) og den hoyre HindiII-BamHI-halvdelen (BB) kunne separat klones på et hensikts-messig klonende element pBR322 og etter at deres sekvenser var blitt verifisert, bindes sammen slik at man.fikk et komplett B-gen (fig. 10). BB-halvparten ble satt sammen ved sammenbinding av 10 oligodeoksyribonukleotider, merket Bl til B10 på fig. 9, fremstilt ved fosfotriester-kjemisk syntese. Bl og B10 var ikke fosforylert, hvorved man eliminerte-uønsket polymerisering av disse fragmenter gjennom deres kohesive ender (Hindlll og BamHI). Etter rensing ved preparativ akrylamidgel-elektroforese og eluering av det.største DNA-båndet, ble BB-fragmentet innsatt i plasmid pBR322 som

var blitt spaltet med Hindlll og BamHI. Ca. 50% av de ampH-licinresistente kolonier avledet fra nevnte DNA var følsomme for tetracycline, noe som indikerte at et ikke-plasmid Hindlll-BamHI-fragment var blitt innsatt. De små HindiII-BamHI-fragmentene fra fire av disse koloniene (pBBlOl - pBB104) ble undersokt for sin sekvens og funnet å være.korrekte.

BH-fragmentet ble fremstilt'på lignende måte og innsatt i pBR322 som var blitt spaltet med EcoRI- og HindiII-begrensende endonukleaser. Plasmider fra tre ampicillin-resistente og tetracycline-folsomme transformanter (pBHl - pBH3) ble analysert. Man fant at de småe EcoRI- Hindlll-fragmentene hadde den forønskede og forventede nukleotidsekvens.

A-kjedegenet ble satt sammen i tre deler. De venstre fire, de midtre fire og de hoyre fire oligonukleotidene (se fig. 9) ble bundet sammen separat, deretter blandet og bundet sammen (oligonukleotidene Al til Al2 var ufosforylert). Det sammensatte A-kjedegenet ble fosforylert, renset ved gelelektroforese og klonet i pBR 322 ved EcoRI- BamHI-posisjonene. EcoRI-Bam-HI-fragmentene fra to ampicillinresistente og tetra-cyclinfolsomme kloner (pA10, pAll). inneholdt den forønskede A-genesekvens.

4. Konstruksjon av plasmider for uttrykking av A- og B-insulingener

Fig. 10 illustrerer konstruksjonen av1 lak-insulin-B-plasmidet (pIBl). Plasmidene pBHl og pBBlOl ble nedbrutt med EcoRI- og Hindlll-endonukleaser. Det lille BH-fragmentet fra pBHl og det store fragmentet fra pBBlOl (inneholdende BB-fragmentet og mesteparten av pBR322) ble renset ved gelelektroforese, blandet og bundet sammen i nærvær av EcoRI-spaltet Yplak 5. Megadalton- EcoRI-fragmentet av )\ plak 5 inneholder lak-kontrollerende område'og hovedmengden av det p-galaktosi dase-strukturelle gen. Konfigurasjonen på de begrensende posisjoner sikrer korrét sammenbinding av BH til BB. lak-EcoRI-fragmentet kan innsettes i to orienteringer, således

at bare halvparten av klonene etter transformeringen skulle ha den forønskede orienteringen. Orienteringen på 10 ampicillinresistente, p-galaktosidase-kloner ble undersokt ved begrensende analyse. 5. av disse kolonier inneholdt hele B-genesekvensen og den korrekte avlesningsrammen fra p-galaktosidasegenet over i B-kjedegenet. En av disse, nemlig pIBl, ble valgt for de etterfølgende eksperimenter..

I et lignende eksperiment ble 4,4 megadalton lak-fragmentet fra > plak 5 innført i pAll-plasmidet ved EcoRI-posis jonen slik at man fikk pIAl. Nevnte pIAl er Identisk' med pIBl bortsett fra at A-genefragmentet er erstattet med B-genefragmentet. DNA-sekvensanalyse viste at man hadde

fått opprettholdt de korrekte A- og B-kjedegenesekvensene i pIAl og pIBl henholdsvis.

5: Uttrykking

Trådene som inneholder insulingener korrekt bundet til (3-galaktosidase vil begge produsere store mengder av et protein med størrelse som |3-galaktosidase. Ca. 20% av det totale cellulære protein var denne P-galaktosidase-insulin '.A- eller B-kjedehybrid. Hybridproteinene er uoppløselige og ble funnet i første bunnfall fremstilt ved lav séntrifugerings-hastighet, hvor de utgjør ca. 50% av proteinet.

For å påvise uttrykkingen av insulin A- og B-kjedene brukte man en radioimmunoproøve (RIA) basert på rekonstituering av det fullstendige insulin fra de separate kjeder. Man tilpasset den insulinrekonstitueringsfremgangs-måte som er beskrevet av Katsoyannis et al (1967) Biochemistry 6, 2642 - 2655 til et prøvevolum på 27 mikroliter, noe som gir en godt egnet prøve. Lett påvisbar insulinaktivitet ble oppnådd etter blanding og rekonstituering av S-sulfonerte derivater av insulinkjedene. De separate S-sulfonerte kjeder av insulin vil ikke reagere etter reduksjon og oksydasjon. med det anti-insulin-antistoff som ble brukt.

Når man skal bruke denne rekonstitueringsprøve,

må man delvis rense |3-galaktosidase-A- eller B-k jedehybrid-

proteinet, spalte det med cyanogenbromid og danne S-sulfonerte -derivater.

Beviset for at man har oppnådd korrekt uttrykking fra kjemisk syntetiserte gener for menneskeinsulin kan summeres på fblgende måte: a) RadioimmunaktivNitet er påvist for begge kjeder, b) De DNA-sekvenser man har oppnådd etter kloning og plasmidkonstruksjon kan direkte verifiseres til å være korrekt slik de er blitt utformet. Siden man oppnår radioimmunaktivitet må oversettelsen være i fase. Fblgelig vil den genetiske kode forutsi at peptidene har den samme sekvens som i menneskeinsulin. c) E. coli-produktene vil etter cyanogenbromid-spalting opptre som ihsulinkjeder i tre forskjellige kromatografiske systemer som skiller på forskjellige prinsipper (gelfiltrering, ioneutbytning og reversert fase-hbytrykksvæskekromatografi. d) E. coli-produsert A-kjede er blitt renset i mindre skala ved hbytrykksvæskekromatografi og har den korrekte aminosyresamménsetning.

Claims (22)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et strukturelt gen som koder for en mikrobiell uttrykking av et polypeptid hvor man fremstiller en serie oligodeoksyribonukleotidfragmenter og setter disse sammen ved at man: (a) forst fremstiller en serie oligodeoksyribonukleotidfragmenter som når de settes sammen i en passende sekvens, gir en DNA-kodende tråd for aminosyresekvensen i polypeptidet; (b) fremstiller en annen serie oligodeoksyribonukleotidfragmenter som når de' settes sammen i en passende sekvens, gir en DNA-tråd som er komplementær til nevnte kodende tråd; (c) frembringer en hydrogenbinding mellom gjensidig komplementære deler av fbrste og annen series fragmenter slik at man danner en dobbelttrådet struktur; og (d) komplementerer de respektive tråder ved sam-menføyning* karakterisert ved at (1) det resulterende gen koder for uttrykking av et pattedyrpolypeptid; (2) at i det minste en stbrre mengde av kodonene i den kodende tråden er de som er foretrukket for uttrykking av mikrobielle genomer; og (3) hvor fragmentene som er bundet sammen i trinn (c) mangler komplementaritet i forhold til hverandre, bortsett fra fragmenter nær hverandre i nevnte strukturelle.gen.

2. Fremgangsmåte ifblge krav 1, karakterisert ved at fragmentene velges slik at den kodende tråd i det strukturelle gen umiddelbart har foran seg kodonet ATG og umiddelbart folges av én eller flere avslutnings-kodoner.

3. Fremgangsmåte ifblge krav 2, karakterisert ved at fragmentene, ytterligere utstyrer det resulterende gen med kohesive terminii som i én av de to trådene innbefatter en begrensende endonuklease-gjenkjenningsposisjon.

4. Fremgangsmåte ifblge krav 3,karakter i- sert ved at polypeptidet er et hormon eller en intermediær forbindelse for et slikt hormon.

5. Fremgangsmåte ifblge krav 4, k a r å k t e r i-sert ved at polypeptidet er somatostatin. og hvor kodonene for aminosyrene i somatostatin velges på fblgende måte:

6. Fremgangsmåte ifblge krav 4, karakterisert ved at polypeptidet velges fra gruppen bestående av menneske-preproinsulin, menneske-proinsulin, A-kjeden i menneskeinsulin, B-kjeden i menneske-insulin, menneske- eller storfeveksthormon, leutiniserende hormon, ACTH og pankreatisk polypeptid.

7 i Fremgangsmåte ifblge krav 3, karakterisert ved at motsatte terminii på det resulterende gen innbefatter én av de to trådene med forskjellige begrensende endonuklease-gjenkjenningsposisjoner.

8. Fremgangsmåte ifblge krav 3,k arakter I-sert ved at nevnte fragmenter hver inneholder ca. 11 til ca. 16 nukleotider.

9. Fremgangsmåte ifblge krav 4, karakterisert ved at nevnte fragmenter hver inneholder fra ca. 11 til ca. 16 nukleotider.

10 . Dobbelttrådet polydeoksyribonukleotid, karakterisert ved å inneholde kohesive terminii som hver innbefatter én tråd av en dobbelttrådet begrensende endonuklease-gjenkjenningsposisjon og mellom nevnte terminii, et strukturelt gen som koder for uttrykking av et pattedyrpolypeptid, og hvor mesteparten av kodonene i den kodende tråden i nevnte gen er kodoner som er foretrukket for uttrykking av mikrobielle genomer.

11. Polydeoksyribonukleotid ifblge krav 10, karakterisert ved at polypeptidet er et hormon eller en intermediær forbindelse for et slikt hormon.

12. Polydeoksyribonukleotid ifolge krav 11, k a r a k- . ter i- sert 'ved at polypeptidet velges fra gruppen bestående av menneske-preproinsulin, menneske-proinsulin, A-kjeden i menneskeinsulin, B-kjeden i menneskeinsulin, menneske- eller storfeveksthormon, leutiniserende hormon, ACTH og pankreatisk polypeptid.

13. Polydeoksyribonukleotid ifolge krav 11, karakterisert ved at po-lypeptidet er somatostatin.

14. Polydeoksyribonukleotid ifolge krav 13, karakterisert ved at motsatte termini innbefatter én av de to trådene i forskjellige begrensende endonuklease-g jenk jenningsposis joner.

15. Polydeoksyribonukleotid ifolge krav ^.karakterisert ved at kodonene for aminosyrene i somatostation er valgt på folgende måte:

16. Polydeoksyribonukleotid ifolge krav 15, karakterisert ved å inneholde folgende baseparsekvens:

17. Polydeoksyribonukleotid, karakterisert ved. folgende nukleotidsekvens:

18. Rekombinert mikrobielt klonende element inneholdende en forste begrensende endonuklease-gjenkjenningsposisjon, et strukturelt gen som koder for uttrykking av et polypeptid og en annen begrensende endonukleaseposisjon, karakterisert ved at nevnte gen koder for ut trykking av et pattedyr-polypepisid eller en intermediær forbindelse for et slikt peptid, og hvor mesteparten av kodonene i nevnte strukturelle gen er slike kodoner som er foretrukket for uttrykking av mikrobielle genomer.

19. Bakterieplasmid ifolge krav 18, karakterisert ved at polypeptidet er et hormon.

20. Plasmid ifolge krav 19, karakterisert ved at nevnte hormon er somatostatin.

21. Plasmid ifolge krav .20, karakterisert ved at kodonene for somatostatin er valgt på folgende måte:

22. Plasmid ifblge krav 20, karakterisert ved å innbefatte folgende baseparsekvens: