JPS61149089A - Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 - Google Patents

Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物

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JPS61149089A JP59271206A JP27120684A JPS61149089A JP S61149089 A JPS61149089 A JP S61149089A JP 59271206 A JP59271206 A JP 59271206A JP 27120684 A JP27120684 A JP 27120684A JP S61149089 A JPS61149089 A JP S61149089A
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Noriyuki Tochifusa
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Toshiki Kitazawa
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 厳１」３１五月ＪｌｊＬ 本発明はポリペプチド分泌発現用ベクター、該ベクター
で形質転換した微生物及び該微生物によるポリペプチド
の製造に関する。
の 遺伝子工学的手法を用いて、インターフェロン、成長ホ
ルモン等を始めとする様々なポリペプチドを大腸菌、枯
草菌、酵母等の宿主細胞の利用により製造する方法は既
に確立されている。しかしながら確立された方法といえ
ども未だ幾つかの未解決の問題点を有しており、天然品
と全く同一のポリペプチドを製造することは必ずしも容
易ではない、上記問題点の中で最も重要なもののひとつ
としては、ポリペプチドのＮ末端を、天然品と同一の構
造とするのが困難なことを挙げることができる。即ち、
之等のポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で
直接発現させるとき、遺伝子からポリペプチドへの翻訳
は、通常開始コドン（ＡＴＧ）から始まるため、発現さ
れるポリペプチドのＮ末端は、ホルミルメチオニン残基
となってしまう。天然型ポリペプチドのＮ末端がホルミ
ルメチオニンである場合は少なく、他のＮ末端を有する
ポリペプチドの製造にはこの方法は利用できない。上記
ホルミルメチオニン残基は、シアノゲンプロマイドを用
いた化学反応によりポリペプチドから除去することがで
きるが、ポリペプチドがＮ末端の他にもメチオとン残基
を有する場合、上記方法ではポリペプチド鎖自体が該個
所で切断されてしまい、やはり目的のポリペプチドは製
造′　できない。
また目的ポリペプチドをコードする遺伝子を、他のポリ
ペプチドをコードする遺伝子、と結合させて、融合ポリ
ペプチドとして発現させる方法も知られている。この方
法では、得られる融合ポリペプチドからの目的ポリペプ
チドの分離は、トリプシン等の酵素による処理やシアノ
ゲンプロマイド等を用いた化学的処理によっている。し
かしながらこの方法においても目的のポリペプチド鎖内
に使用する酵素又は化学薬品の標的となるアミノ酸が存
在すれば、その個所でペプチド鎖が切断され、結局目的
ポリペプチドは製造はできない。また、上記方法により
融合ポリペプチドからの目的ポリペプチドの分離が可能
な場合といえども、目的ポリペプチドの単離のためには
、通常菌体粗抽出液から融合ポリペプチドを分離する工
程及び融合ポリペプチドを切断した反応組成物から目的
ポリペプチドを分離する工程の２回の精製操作が必要と
なり、その操作及び工程自体煩雑となり、しかも目的吻
の収率の低下は避けられない。
以上のように、天然型と全く同一のポリペプチドを遺伝
子工学的手法で入手することは、従来非常に困難であり
、この天然型と全く同一のポリペプチドを宿主細胞から
直接製造できる改良された方法の研究開発が、斯界で要
望されている現状にある。
が　　しようとする 本発明は、上記斯界で要望されている天然型と全く同一
のポリペプチドを宿主細胞から直接製造できる改良され
た方法を提供することを目的とする。また本発明は、該
方法の実施のための新しいベクター及び該ベクターを保
有する微生物を提供することをもその目的としている。
を　　するだ　の 本発明によれば、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
塩基配列と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列とを直接連結させて目的ポリペプチドを分泌発現させ
るための、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列を含むことを特徴とするポリペプチド分泌発現用ベク
ター、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と
目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とが直接
連結されてなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩
基配列を含む上記ベクター、該ベクターで形質転換され
た微生物及び該微生物を培養して分泌されるポリペプチ
ドを採取するポリペプチドの１造法が提供される。
本明細書において、アミノ酸、核酸塩基、その他に関し
て略号で表示する場合はＩＵＰＡＣｌｌＵＢの規定或い
は当該分野における慣用記号に従うものとし、その例を
次に挙げる。
Ｓ　ｅｒ　：セリン　　　　ｌｅｕ；ｏイシンＡ　ｒａ
　：アルギニン　　ｃｙｓニジスティンＧｉｎ；グルタ
ミン　　ｌｌｅ；イソロイシンＰ「０ニブロリン　　　
■ａＩ：バリンＨｉｔ：ヒスチジン　　Ｍｅｔ：メチオ
ニンＡｌミニアラニン　　　ｐ　ｈｅ　；フェニルアラ
ニンＧｌｙニゲリシン　　　Ａｓｐ：アスパラギン酸Ａ
　ｓｎ　：アスパラギン Ａ　：アデニン　　　Ｔ　：チミン Ｇ　ニゲアニン　　　Ｃ；シトシン シグナルペプチドとは、細胞内で生産されたポリペプチ
ドを細胞外に分泌する働きをするアミノ酸配列である。
一般に微生物に限らず全ての細胞の生産するポリペプチ
ドには、細胞内に留まってその働きをなすものと、細胞
外に分泌されるものとがある。この細胞外に分泌される
ポリペプチドでは、まず、そのＮ末端に士数個乃至数十
個のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドが付加され
た前駆体としてｖａｎ内に生産され、次いで該前駆体は
その有するシグナルペプチドの作用により該シグナルペ
プチドを介して細胞膜を通過すると同時にシグナルペプ
チダーゼの作用によりシグナルペプチドが切り離され、
その結果−切の不要アミノ酸を持たない目的ポリペプチ
ドのみが細胞外に分泌される（以下、このように細胞外
に分泌される目的ポリペプチドを「成熟ポリペプチド」
とりう）。例えば、犬馬菌のβラクタマーゼは、菌体内
でβラクタマーゼ前駆体、即ちβラクタマーゼと２３個
の７ミノ曹からなるシグナルペプチドとの融合蛋白質と
して生産された後、該シグナルペプチドの作用により細
胞膜を通過してペリプラズム、即ち細胞膜と外膜との間
の空間に０分泌され、その際、シグナルペプチドは、シ
グナルペプチダーゼにより切断され、ペリプラズム内に
は成熟ポリペプチド、即ち活性型のβラクタマーゼが蓄
積されルコトが知られている（　Ｊ　、　Ｇ、　５ｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ。
Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ、Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、Ｕ
　Ｓ　Ａ　、　７５　。
３７３７−３７４１　（１９７８））。
本発明者らは、上記シグナルペプチドの特性に肴目し、
該シグナルペプチドを利用して、目的とする外来蛋白質
をシグナルペプチドとの融合ポリペプチドとして宿主細
胞内で生産させるときには、外来蛋白質のみが細胞外に
成熟ポリペプチドとして分泌され、かくして目的ポリペ
プチドを容易に製造入手し得るとの着想から鋭意研究を
重ねた。
その結果、実際に宿主細胞内に導入することによって、
目的ポリペプチドを成熟ポリペプチドとして細胞外に分
泌させ得る新しいベクター（プラスミド）及び該ベクタ
ーのためのポリペプチド分泌発現用ベクターの構築に成
功すると共に、このベクターの利用による目的ポリペプ
チドの製造に成功した。
本発明のポリペプチド分泌発現用ベクターは、目的ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を直接連結できる
ように設計されたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
塩基配列を保有している。
従って該ベクターには、そのシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列に直接目的ポリペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列を連結させることができ、かくして得
られる発現ベクターは、これを宿主細胞に導入して形質
転換させることにより、該宿主細胞の培養によって細胞
外又はペリプラズムに目的ポリペプチドを成熟ポリペプ
チドとして分泌生産させることができる。
以下、本発明ベクターの製造技術につき詳述する。
本発明ベクターの必須構成要件とするシグナルペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列としては、従来より知られ
ているシグナルペプチドのそれをいずれも利用すること
ができる。該シグナルペプチドの代表的具体例としては
、例えば大腸菌のβラクタマーゼのそれを例示すること
ができる。該シグナルペプチドは、下記式（１）に示す
アミノ酸配列を有している。
Ｍｅｔ　−Ｓｅｒ　−１１ｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｈｉｓ　
−Ｐｈｉ　−Ａ　ｒ９−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−夏
　１ｅ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　
１ａ−Ａ　Ｉａ　−Ｐｈｅ　−Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｐ
ｒｏ−、Ｖａｌ　−Ｐｈｅ−Ａｌａ　　　　　　　　　
　　　　（１）また、該シグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列は、各アミノ酸に対応する以下のＤＮＡ
塩基配列から任意に選択することができる。尚、下記Ｄ
ＮＡは、メチル化等の常法に従い修飾された塩基をも含
むものとする。
Ｍｅｔ；ＡＴＧ Ｓｅｒ−：・ＴＣＴ、ＴＣＣ，ＴＣＡ、ＴＣＧ。
ＡＧＴ、ＡＧＣ １ｉｅ：ＡＴＴ、ＡＴＣ，ＡＴＡ Ｇｌｎ：　ＣＡＡ、ＣＡＧ Ｈｉｓ；　ＣＡＴ、ＣＡＣ Ｐｈｅ：　ＴＴＴ％ＴＴＣ Ａｒｍ：ＡＧＡ％ＡＧＧ、ＣＧＴ、ＣＧＣ。
ＣＧＡ、ＣＧＧ Ｖａｔ：　ＧＴＴｌＧＴＯ，ＧＴＡ％ＧＴＧＡｌａ：Ｇ
ＣＴＳＧＣＣ％ＧＣＡ、ＧＣＧＬｅｕ：　ＴＴＡ、ＴＴ
Ｇ、ＣＴＴ、ＣＴＣ。
ＣＴＡ、ＣＴＧ　　　　− Ｐｒｏ：　ＣＣＴ、ＣＣＣ，ＣＣＡ、ＣＣＧｃｙｓ：　
ＴＧＴ、ＴＧＣ 上記ＤＮＡ塩基配列のうちで、特に好ましく選択された
組合せとしては、下記式（２）に示すものを例示できる
。
ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧ
ＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＧ（２） また本発明ベクターに保有されるシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ塩基配列は、上記のごとき具体的ＤＮＡ
塩基配列を基本として、その３′側付近、即ちこれに目
的ポリペプチドが連結される側付近、好ましくはその１
０塩基以内に、又はこれに更に１０塩基以内のＤＮＡ配
列を付加してこの付加部分に、制限酵素Ｉ！識配列を含
ませるものとする。これは上記シグナルペプチドをコー
ドす゛るＤＮＡ塩基配列と、目的ポリペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列とを直接連結させるために必須のも
のである。しかしてこの制御酵素Ｉ！識配列をＮＩＩす
る酵素としては、公知の制限酵素のいずれでもよいが、
好ましくは５ａ基以上の塩基配列を！！諏するものがよ
く、この酵素に応じて上記３′側付近のＤＮＡ塩基配列
は、任意に変化させることができる。
例えば、上記具体的例示のβラクタマーゼのシグナルペ
プチドを例にとり詳述すれば、そのＣ端のアミノ酸であ
るＡｌａをコードする塩基配列として、ＧＣＣを選択し
た場合、更にこれにＧＧＣの塩基配列を連結させれば、
このＧＣＣＧＧＣの６塩基配列は、制限酵素ＮａｅＩに
よりｌ！識される。
該シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列は、Ｎ
ａｅＩによりその中央で切断され、かくして３′末端が
ＧＣＣ（シグナルペプチドのＣ端アミノ酸Ａｌａに対応
する）であるＤＮＡが得られ、該ＤＮＡにはその直後に
目的ポリペプチドをコードする任意のＤＮＡ塩基配列を
直接連結させることができる。
また例えば、上記シグナルペプチドＣ端の２つのアミノ
酸配列を構成するＰｈｅ−Ａｌａをコードする塩基配列
として、ＴＴＣＧＣＧを選択する場合、その３′側に更
にアデニン塩基（Ａ）を連結させて得られるＴＴＣＧＣ
ＧＡの７塩基配列のうち、ＴＣＧＣＧＡは制限酵素Ｎｒ
ｕ工によりＮＩＩされ、この中央で切断され、これによ
り得られるＤＮＡ塩基配列は、その３′末端がＴＴＣＧ
となる。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
として、この塩基配列を利用するときには、これと連結
すべき目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の
５′側に、更にＣＴ、ＣＧ、ＯＡ又はＣＧの２塩基配列
を付加することにより、所望の融合ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ塩基配列が得られる。
更に例えば、上記シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
塩基配列の３′側に、ＡＡＣＴＣＡＧＣＴＧの１０塩基
配列を連結させれば、この配列中、ＣＡＧＣＴＧの６塩
基配列は、ＰｖｕＩ［により認識され、その中央で切断
される。かくして得られるＤＮＡ塩基配列は、シグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の３′側に、更に
ＡＡＣＴＣＡＧの７塩基配列が結合されたものであり、
この７塩基配列のうち、最羽の３塩基配列ＡＡＣ１，ｔ
Ａｓｎをコードしており、次の３塩基配列ＴＣＡは３ｅ
ｒをコードしており、最後のグアニン（Ｇ）は、Ａｌａ
ｌＧｌｙ、　Ｖａｌ、ＡＳｌｌ及び（３Ｉｎのいずれか
をコードしている。従ってこれを、シグナルペプチドを
コードするＤＮＡ塩基配列として用いるときには、例え
ばβウロガストロン等のようにＮ末端アミムｉがＡ　ｓ
ｎ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　ｓｐであるポリペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列からその５′側の７塩基配列（例えば
ＡＡＣＴＣＡＧ）を除いたＤＮＡ塩基配列を結合させる
ことによって所望の融合ポリペプチド（βウロガストロ
ンとシグナルペプチドとの融合ポリペプチド）をコード
するＤＮＡ塩基配列を容易に形成させることができる。
従って、本発明ベクターの構成要素とするシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基配列としては、前記に具体
的に例示したＤＮＡ塩基配列の他に、例えばこれに更に
１０個以内のＤＮＡ塩基配列を付加させたものをも、好
ましいものとして利用することができる。その−具体例
は、上記した１０塩基配列を付加させた下記式（３）に
示すＤＮＡ塩基配列を有するものである。
ＡＴＧＡＧＴＡ丁ＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧ
ＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡ
ＧＣＴＧ　　　（３）本発明における上記シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基配列又はこれを含む塩基配
列は、従来公知の各種の方法、例えばこれを含有する微
生物、それから単離されたプラスミド等、好ましくは例
えばＥ）ＢＲ３２２等から制限酵素等を利用して切断単
離する方法、そのＤＮＡ塩基配列に従い化学合成する方
法、之等の方法の組合せ等により容易に製造することが
できる。また上記シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
塩基配列と、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基
配列との連結乃至結合手段も、従来公知の各種方法、例
えばＴａＤＮＡリガーゼ等を用いる酵素反応等に従うこ
とができる。
上記のごとくして得られるシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列を含む本発明ベクターは、該ＤＮＡ塩
基配列を、例えばプラスミド、ウィルスＤＮＡ、コスミ
ド〔例えばｐ　ＪＢ８、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ、Ｄ
　　ａｎｄ　　Ｂｕｒｋｅ、　　Ｊ、　　Ｆ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、９．２９８９　（１９
８１）　）等の従来より外来遺伝子のクローニングに用
いられている各種のベクターに組込むことにより得られ
る。このＤＮＡ塩基配列の組込みのために好適な起源ベ
クターの具体例としては、上記したプラスミドｏＢＲ３
２２の他、例えば以下のものを例示できる。
０プラスミドｏ　ＴＵＢ４　（バチルス・ズブチリス由
来のα−アミラーゼのシグナルペプチド、ＨｌＹａｍａ
ｚａｋｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、１５６゜３２７−３３７　（１９８３））、 ０プラスミドｐ　ＨＯ２（Ｅ、コリー由来のマルトース
結合蛋白のシグナルペプチド、ＨｌＢｅｄｏｕｅｌｌｅ
　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　、　２８５．７８
−８１　（１９８０））、 ロブラスミドｐ　５Ｎ５１８　（Ｅ、コリー由来のリン
酸結合蛋白のシグナルペプチド、Ｋ。
Ｍａｏｏｔａ　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、１５７　。
９０９−９１７　（１９８４））、 ０プラスミドｐ　ＪＰｌ　２　（Ｅ、コリー由来のリン
酸制限下に誘導される外膜蛋白のシグナルペプチド、Ｎ
、　０ｖｅｒｂｅｅｋｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、　Ｍ
ｏｌ。
Ｂｌｏｌ、、１６３．５１３−５３２　（１９８３））
等。
上記起源ベクターへのシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ塩基配列の導入操作は、従来よりこの種外来遺伝子
をベクターに組込む際に用いられているこれら操作に従
うことができる。その例としては、前述した通りである
。
また上記のごとくして得られる本発明のシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むポリペプチド分泌
発現用ベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して目
的ポリペプチドを分泌発現させるためには、これに目的
ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列をさらに導入
しなければならないことは勿論のこと、他にプロモータ
ー、リポゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結
因子等の転写調節因子や翻訳調節因子等を含んでいなけ
ればならない。これらの各因子は、既に起源ベクターに
含まれている場合があり、この場合には該起源ベクター
、例えばｐＢＲ３２２由来のβラクタマーゼの調節因子
等をそのまま用いることできる。これに限定されること
なく、従来公知の他の微生物又はウィルス由来の各種Ｄ
ＮＡもまた通常これらの調節因子を含んでおり、従って
これらを用いることもできる。その例としては、例えば
大腸菌ラクトースオペロン、トリプトファンオペロン、
λファージのＰＬ等のプロモーター、βガラクトシダー
ゼのＳＤ配列等のりボゾーム結合部位、λファージのｔ
Ｌｌ等の転写終結因子等を例示できる。また翻訳停止シ
グナルとしては、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡの３通りの
塩基配列を利用できる。更に上記調節因子は、これらを
含むＤＮＡより常法に従い取り出した後、必要なものを
適当なベクターに通常の方法に従い導入することもでき
る。
特に好ましい上記調節因子と、シグナルペプチドとを保
有する本発明ベクターの一具体例としては、ＥＩＢＲ３
２２を起源ベクターとして構築されたＤ　ｕＧ５４及び
ＤＵＧ５５を例示できる。これらのプラスミドの内でｐ
　ＵＧ５４は、βラクタマーゼのプロモーター及びリポ
ゾーム結合部位に続いてβラクタマーゼのシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基配列を有し、この塩基配列
の３′末端にＮｒｔｌＩ及びＰｖｕｌ［の制Ｍｉｌｌ素
認識配列を有するものである。その特性は、その製造概
略操作と共に第１図に示した通りである。第１図より、
Ｄ　ＵＧ５４は図示された制限酵素開裂地図により特徴
付けられる。また該Ｅ）ＵＧ５４の大きさは、１．０％
アガロースゲル電気泳動による測定の結果、約３．９Ｋ
ｂである。このプラス、ミド１）ＵＧ５４を保有する大
腸菌Ｈ８１０１株は、通商産業省工業技術院微生物−工
業技術研究所にｒＨＢｌｏｌ　（ｐＧＨ５４）Ｊなる表
示で、微工研条寄第６７９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６７
９）として寄託されている。
またＤＵＧ５５は、βラクタマーゼのプロモーター及び
リポゾーム結合部位に続いてβラクタマーゼのシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を有している点に
おいてｐ　ＵＧ５４と共通するが、該ｐ　ｕＧ５４にお
ける第２のＰｖｕｌＩ制限サイトを含む６３７塩基のＤ
ＮＡを欠くものであり、第１のＰｖｕｌ［ＩＩＪ限サイ
トをシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の３
′末端付近に有している。その特性は、その製造概略操
作と共に第２図に示した通りである。
第２図より、ｐ　ＵＧ５５は図示された制限酵素開裂地
図により特徴付けられ、その大きさは、上記方法に従り
測定した結果、約３．３Ｋｂである。
このプラスミドＥＩ　ＵＧ５５を保有する大腸１１８Ｂ
１０１株は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所にｒＨ８１０１（ｐ　ＧＨ５５）Ｊなる表示で、微工
研条、寄第９８０号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６８０）とし
て寄託されている。
上記各種の調節因子を含み、且つシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ塩基配列とこれに直接結合された目的ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とを有する本発
明のポリペプチド分泌発現ベクターは、上記した本発明
ベクターと同様にして構築され、本発明はかかる成熟ポ
リペプチド分泌発現ベクターをも提供するものである。
本発明のこの成熟ポリペプチド分泌発現ベクターに、シ
グナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と連結され
て融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列として
保有されるポリペプチド及びそのＤＮＡｆ！Ａ基配列と
しては、任意のポリペプチド及びそれをコードするＤＮ
Ａ塩基配列がいずれも利用できる。上記ポリペプチドの
例としては、例えば表皮細胞増殖促進因子、ンマトスタ
チン、インシュリン、ＧＩＰ、Ｒ−ＭＳＡ、サイモシン
β４、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子等のホルモ
ン及び成長因子類、インターフェロン、インターロイキ
ン２、腫瘍壊死因子等のリンフ才力イン免疫調節物質類
、血清アルブミン、プラスミノーゲンアクティベーター
、アポリボプロティン等の血液構成物質、Ｂ型肝炎ウィ
ルス表面抗原等のワクチン用抗原蛋白質等を例示できる
。之等の各種ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
は、それらの起源とする細胞等から通常の方法に従い抽
出単離してもよく、２等ポリペプチドのアミノ酸配列に
従い化学合成するごともできる。
上記ポリペプチド及び／又はそのＤＮＡ配列の具体例を
次に示す。
０ソマトスタチン ＧＴＡＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡ
ＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＣＴＡ
ＴＣＣＴＡＧ　　５’Ｏプロインシユリン Ｐｈｅ　　Ｖａｔ　　ＡＳｎ　　Ｇｉｎ　　Ｈｉｓ　　
Ｌｆｌｊ　　ＣＶＳ　　Ｇｔｙ　　Ｓｅｒ　　Ｈｉｓ　
　１−ｅｕＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧ
ＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＶａｌ　　Ｇｌｕ　　Ａｌ
ａ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　ＡｒｇＧＴＧＧＡＡＧＣＴ
ＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧ
ｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｏ　　Ａｒａ　　Ｇ
ｌｕＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＣ
ＣＣＧＣＣＧＧＧＡＧＡｌａ　　Ｇｌｕ　　ＡＳＩ）　
　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　
　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｌａ１ＧＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　　Ｇｌ
’Ｖ　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ｐｒ。
ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣ
ＴＧＣＡＧＣＣＣｌｅｔｌ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　Ｑｌｕ
　ａｎｙ　３ｅｒ　　ＬｅＬＩ　Ｇｌｎ　　Ｌｙｓ　Ａ
ｒｇＧｎｙＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＣＣＴ
ＧＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣ１＋６　Ｖａｔ　　Ｇｌｕ
　Ｇｌｎ　　ＣＶＳ　　ＣＶＳ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　　Ｉ
ｌｅ　ａｙｓ　５ｅｒＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＣ
ＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＬｅｕ　　Ｔｙ
ｒ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　Ｔｙｒ
　　Ｃｙｓ　ＡｓｎＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡ
ＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣ（Ｎａｔｕｒｅ　、　Ｖｏｌ、
　２８２．２９．　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　　１９７９）Ｑ
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原 ＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴ
ＴＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＣ
ＴＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＴＣ
ＣＴＴＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣ
ＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧＧＧＡＴＧＣＣ
ＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＣ
ＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣ
ＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＣＴＴＡＡＴＧ
ＡＣＴＣＴＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡ
ＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＧＧＧＡ
ＣＣＴＡＧＴＡＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＡＣＴ
ＡＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡＧＡＣＡＡＴ
ＴＡＴＴＧＴＧＧ丁ＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴ
ＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＴＡ
ＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＧＴ
ＧＧＡ丁ＴＣＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＡＴＡＧ
ＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＣＴＡＴＣＡ
ＡＣＧＣＴＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡ
ＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧ
ＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧＡ
ＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡ
ＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＡＴＧ
ＴＴＡＧ ＯＢ型肝炎ウィルス表面抗原 ＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣ
ＴＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＣ
ＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＴＣ
ＣＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴ
ＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴ
ＡＧＧＧＧＧＡＡＣＴＡＣＣＧＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＣ
ＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡ
ＡＴＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣ
ＡＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧ
ＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣ
ＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴ
ＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴ
ＣＡＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＣ
ＴＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧ
ＣＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＧ
ＡＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＡＴＣＴＣＴＡＴＧＴ
ＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＣＣ
ＴＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＴＴ
ＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＣＧ
ＧＡＡＡ′ＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴ
ＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴ
ＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＴＣ
ＧＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＴＴＧＧＣ
ＴＴＴＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＡ、ＴＧＡＴＧＴＧＧＴ
ＡＴＴＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴ
ＣＴＴＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＡ
ＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＣＡＴ
ＡＣＡＴＴＴＡ０表皮細胞増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｌａ
ｌ　　Ｇｒａｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒ）Ｈ−Ａｓｎ−８
ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−８ｅ
ｒ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−ＡＳｆｌ−ＧＩＶ−ＴＶｒ−ＣＶ
Ｓ−ＬｅＬＩ−ＡＳｎ−ＧＩＶ−ＧＩＶ−Ｖａｌ−ＣＶ
Ｓ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉ　ｌｅ−Ｇ　ｌｕ−５ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−ＡＳＩ）−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａ
ｓｎ−ＣＶＳ−Ｖａｌ−１１８−ＧＩＶ−ＴＶｒ−８ｅ
ｒ−ＧＩＶ−ＡＳＤ−ＡｒＯ−ＣＶＳ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ
−Ａｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｉ−Ｔｒｐ−ＴｒＥｌ
−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｏ−ＯＨｏＧＩＰ（Ｇａｓｔｒ
ｉｃ　　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　　Ｐｏ１ｙＥ＞ｅｐｔ
ｉｄｅ）Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
−Ｐｈｅ−１１ｅ−８ｅｒ−ＡＳＤ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−
１１ｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＡＳＤ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ａ
ｒＯ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＡＳＤ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＬＪＳ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−ＡＳＤ−
ＴｒＤ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｎ−ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ａｍ　、　Ｃｈｅｗ　、
　Ｓｏｃ、　、　Ｃｊ−１，５５９３（１９７５））０
成長ホルモン放出因子＜Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｈｏｒｓｏｎ
ｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｏ　　Ｆａｃｔｏｒ）Ｈ−Ｖａｌ
　−ＨＩｓ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ａ　Ｉａ−ＯＨＣｏｍｎ、、
ｊ４．２３５（１９７１））０ソマトスタチン（Ｓｏｓ
ａｔｏｓｔａｔｉｎ　）Ｈ−ＡＩａ−ＧＩＶ−ＣＶＳ−
ＬＪＳ−ＡＳｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＴｒＥｌ−ＬＪＳ−
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｃｙｓ−ＯＨ Ａ（ｉｔｌＶｉｔｙ） Ｈ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｕ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ａｒａ−Ｐｒｏ
−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｏ−Ａ、１ａ−Ａｓｎ−Ａｒａ
−Ａｒａ−８ｅｒ−Ａｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｖａｌ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｐｈｅ−ＡｒＯ−
８ｅｒ−Ｃｙｓ−ＡＳＩ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ　−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−ＧＬｕ　−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ
−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−
ＯＨ （Ｈ，Ｍａｒ＋１ｌｕａｒｔ　、　Ｇ、　Ｊ、　Ｔｏｄ
ａｒｏ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｗ　、、　２
旦旦。
ｏソマトスタチン−２８（Ｓｏｍｔｏｓｔａｔｉｎ　−
２８）Ｈ−８ｅｒ−Ａｌａ７Ａｓｎ−８ｅｒ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒ１２−
Ｇｌｕ−ＡｒｌＪ−ＬＪＳ−Ａｌａ−ＧＩＶ−ＣＶＳ−
ＩＪＳ−ＡＳｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＴｒＤ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−ｃｙｓ−ＯＨＲｅｓ、
　Ｃｏｍ１ｌｕｎ　、　、　９５．９．４５　（１９８
０）　）０サイモシンβｔ　　（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ　　
β、）ＡＯ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＡＳＩ
）−Ｍｅｔ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｉ　１ｅ−Ｇ　Ｉｕ
−ＬＪＳ−Ｐｈｅ−ＡＳＥ）−Ｌｙｓ−３ｅｒ−ｃｙｓ
−１ｅｕ−Ｌｙｓ−ＩＪｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−
Ｇ　ｌｎ−Ｇ　ｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ
−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｕ　−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｎ
−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｕ−８ｅｒ−Ｈ （Ｔ、　Ｌ、　Ｋ、　Ｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ　　、　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、、７８．１１６２　（１９８１））上記ポ
リペプチドのＤＮＡ塩基配列と、シグナルペプチドのＤ
ＮＡ塩基配列との連結は、例えばシグナルペプチドのＤ
ＮＡ塩基配列を保有する本発明のポリペプチド分泌発現
用ベクターに、上記ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列を、
前述した方法に従い制限酵素を用いる酵素反応及び例え
ば王。
リガーゼを用いる酵素反応を利用して導入することによ
り実施できる。また、予め上記ポリペプチドとシグナル
ペプチドとの融合ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列を化学
合成した後、このＤＮＡ塩基配列を、前記シグナルペプ
チドのＤＮＡ塩基配列の導入と同様にして、適当な調節
因子を保有するベクターに導入することによっても行な
うことができる。
かり−シて融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列を保有する本発明のポリペプチド分泌発現ベクターを
得ることができる。これは、上記融合ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ塩基配列の前にプロモーター及びリポゾ
ーム結合部位を有し、且つ上記塩基配列を構成する目的
ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列の直後に翻訳停止シグナ
ルを有しており、適当な宿主細胞に導入することにより
、該細胞を形質転換してポリペプチド分泌発現型とする
ことができる。
上記ポリペプチド分泌発現ベクターの好ましい一具体例
としては、Ｄ　ＬＩＧ２０１を例示できる。
該０ＬＪＧ２０１は、βラクタマーゼのプロモーター、
リポゾーム結合部位、βラクタマーゼのシグナルペプチ
ドのＤＮＡ塩基配列、βつ０ガストロン（目的ポリペプ
チド）のＤＮＡ塩基配列及びその翻訳停止シグナルが正
確にこの順序で配列されたＤＮＡ塩基配列を有している
。その配列は、侵記実施例において第４表として示した
通りである。
該ベクター（プラスミド）ｐＬＩＧ２０１を保有する大
腸菌Ｈ８１０１株は、ｒＨＢｌｏｌ　（ｐ　ＵＧ２０１
）Ｊなる表示で、微工研条寄第６８１号（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−６８１）として寄託されている。
本発明のポリペプチド分泌発現ベクターの宿主細胞への
導入は、公知の各種方法に従って行なうことができ、用
いられる宿主ｓ１１としても特に限定はなく、公知の各
種のものでよい。この宿主細胞として利用されるものと
しては、例えば大腸菌等のグラム陽性細菌、枯草菌等の
グラム陽性細菌、放線菌、酵母等を例示できる。これら
の内で特に大腸菌に１２株由来のＨ８１０１株は好まし
い。
之等の宿主細胞はいずれも菌体外分泌成分１、外膜構成
成分等の、細胞の正常な機能維持に必要なポリペプチド
の分泌のための機構としてシグナルペプチダーゼを有し
ており、また各種微生物由来のシグナルペプチダーゼの
基質特異性には殆んど差のないことが知られている（　
Ｄ、　ｐ　ｅｒｌｍａｎａｎｄ　ＨｏＯ，Ｈａｌｖｏｒ
ｓｏｎ、　ＪｏＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、。
１６７．３９１　（１９８３））。
上記宿主細胞への導入方法の具体例としては、例えば宿
主細胞を低温で塩化カルシウムを含む水溶液中で処理し
、該溶液中にベクターを添加する方法（Ｅ　、　Ｌｅｄ
ｅｒｂｅｒａ、　Ｓ　、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ　。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１９．１０７２　（１９７４
）　）を例示できる。
上記のようにして本発明ベクターを導入して形質転換し
た細胞を培養するときには、細胞内で融合ポリペプチド
が生産され、続いて細胞外又はペリプラズムに成熟ポリ
ペプチドが分泌蓄積される。
即ち、まず、ベクター中の融合ポリペプチドをコードす
る遺伝子から、ベクター中の転写調節因子並びに宿主［
ｌ膣中の諸因子の作用でｌ　ＲＮＡが生産される。次い
で、ｍ　ＲＮＡから翻訳調節因子並びに宿主細胞中の諸
々因子の作用で融合ポリペプチドが生産される。更にこ
こで生産される融合ボリペブチドは、シグナルペプチド
の作用により、細胞外又はペリプラズムに分泌され、同
時にシグナルペプチダーゼの作用により、融合ポリペプ
チドからシグナルペプチドが切り離されるのである。
その結果、シグナルペプチドも、また他の如何なる不要
なアミノ酸配列をも含まない成熟ポリペプチドが細胞外
又はペリプラズムに分泌、蓄積される。
かくして分泌、蓄積された成熟ポリペプチドは、これを
常法に従い分離することができ、また精製することがで
きる。この分離、精製操作としては例えば培養上澄又は
浸遡圧カショック法により調整したペリプラズム画分か
ら、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換り
Ｏマドグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適
宜組合せた方法を採用することができる。特に本発明に
従い得られる目的ポリペプチドは、成熟ポリペプチドし
て分泌されるものであるため、その分離、精製が比較的
容易である利点がある。
哀−」Ｌ」１ 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。
尚、各側において用いられている各方法及び操作は、−
特に明記しない限り、以下の通り行なわれたものである
。
１、制限酵素によるＤＮＡの切断操作 ＤＮＡの水溶液（又は緩衝液溶液）或いは粉末に、下記
第１表に示した各ｉｉｗ液の濃縮液及び水を混和し、次
いで制限酵素を加え、３７℃の水浴中で３時間静置して
反応させる。制限酵素の標準的使用量は、ＤＮＡ１μｇ
に対して１ユニツトであり、最終液量は１０μＱとなる
ようにする。
第　　１　　表 組　　成　　　低塩濃度　中塩濃度　高塩濃度（ＩＩＭ
）　　　　＠　　液　　緩衝液　　　両液塩化ナトリウ
ム　　　　０　　　５０　　１００トリス塩酸 （Ｅ）Ｈ７，５）　　　　　１０　　　１０　　　５０
塩化マグネシウム　　１０　　　１０　　　１０ジチオ
スレイトール　　１　　　１　　　１２、フェノール抽
出法 酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこの抽出法を行なった。即ち、反応液に、その液量
の半量となるＴＥ飽和フェノール（１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む１０■Ｍトリス塩酸（ｐ　Ｈ８，０）緩衝液をフ
ェノールに飽和させたもの）を加えて充分混和した後、
同じく半量のクロロホルムを加えて更に混和し、次いで
遠心分離してＤＮＡに含まれる緩衝液層を取る。更に０
．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）と
２倍量の冷エタノールとを加えて混和して、−２０℃、
で１時間以上放置してＤＮＡを沈澱として回収するごと
によりフェノールを完全に除去する。
３、ＤＮＡポリメラーゼエ（クレノー断片）によるＤＮ
Ａのプラントエンド化方法　　　９４０＋ｅＭリン酸カ
リウム（１）８７．４）、６ｉＭ塩化マグネシウム、１
１Ｍβ−メルカプトエタノール、１ｓＭ　　ＡＴＰ及び
各１１Ｍのｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴＰ％ｄ　ＧＴＰ孕びｄ
　ＴＴＰを含む水溶液中に、ＤＮＡを溶かし、ＤＮＡＩ
μＯに対して１ユニツトとなる量のＤＮＡポリメラーゼ
エ（クレノー断片、宝酒造■製）を加え、１２℃で３．
０分間反応させる。
４、Ｔａ　Ｄｆ’ＪＡリガーゼによるＤＮＡ断片の結合
（環状化）操作 ６６−Ｍトリス塩酸（ＥＩ　Ｈ７，５）、６．６−Ｍ塩
化マグネシウム、１０■Ｍジチオスレイトール及び１■
Ｍ　　ＡＴＰｌ、：０．０１％の牛血清アルブミンを添
加した水溶液中で、ＤＮＡ断片と、その１μＱ当り３ユ
ニツトとなる量のＴａＤＮＡリガーゼ（宝酒造■製）と
を、１２℃で５時間以上反応させることによりＤＮＡを
結合（環状化）させる。
５、形質転換方法 宿主細胞としては、大腸菌に１２株由来のＨ８１０１株
を用いる。
Ｈ８１０１株を、ＬＢ培地（１％バクトドリブトン、０
．５％バクトイ−ストエキス、０．５％塩化ナトリウム
）で、３７℃下、６１０ｎｍの吸光度が０．２５になる
まで増殖させる。この培養液４０−を遠心分離（６００
０回転／分×１０分）して菌体を回収し、次いで氷冷す
る。これを０．１Ｍ塩化マグネシウム２０ｍ２で洗浄し
、続いて氷冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５
Ｍ塩化マグネシウム溶液２０−に懸濁させ、１時間氷冷
する。遠心分離（６０００回転／分Ｘ１０分）後、菌体
を氷冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５Ｍ塩化
マグネシウム溶液２１１２に再懸濁させる。この懸濁液
０．２１Ｑに、ＴａＤＮＡリガーゼを用いて結合させた
ＤＮＡ断片の反応組成液ｏ、０１ｍＱを加え、１時間水
冷する。次いで４２．５℃の水浴で９０秒間加温し、Ｌ
Ｂ培地２．８１１を加え、これを３７′Ｃの水浴中で１
時間静置する。
次に−、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性で選
択する。即ち、１．５％寒天を含む１Ｂ培地にアンピシ
リン５０μｇ／−又はテトラサイクリン２０μｇ／ｌ１
１２を添加して調整した平板培地に、上記で得た反応組
成液の溶液各０．３１！Ｉｉ２ずつを拡げ、これを３７
℃で一晩培養し、生育する大ｍ［コロニーを分離する。
６、プラスミドの単離 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン５ｏμＩＪ
／１１２又はテトラサイクリン２０μＩＪ／１１１２を
添加したＬＢ培地５００−で、６１０ｎ■での吸光度が
約０．６になるまで３７℃で振盪培養する。
次いでクロラムフェニコール８０■ｇを加え、３７℃で
１２〜１６時間振盪培養する。これを遠心分離（６００
０回転／分×１０分）して菌体を集め、０．８５％塩化
ナトリウム水溶液で洗浄する。菌体を２０％蔗糖及び５
０ＩＩＭトリス塩酸（１）８８．０）溶液２．５−に懸
濁させ、次に１％リゾチームを含む０．２５Ｍトリス塩
１　（ｐ　Ｈ８，０）溶液０．５ｍ１２を加え、１０分
間氷冷する。更に０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（Ｄ　Ｈ８
，０）１ｍｇを加え、１０分間氷冷する。次に６ｍＭト
リス塩１１（ｐＨ８，０＞、６０１Ｍ　　ＥＤＴＡ及び
０．１％トリトンｘ−ｉｏｏの溶液４Ｉｉ２を加える。
これを超遠心（２５０００回転／分Ｘ９０分）して上清
を採取する。この上清８．２１１２に塩化セシウム９．
０りを加えて溶かし、次いで１％エチジウムブロマイド
溶液０．８１Ｑを加える。これを遠、心分離（２０００
回転／分×１０分）して浮遊物を除き、溶液を超遠心（
５００００回転／分Ｘ１５時間）する。次いで紫外線照
射により螢光を発するプラスミドを分離する。これを５
Ｍ塩化ナトリウム溶液で飽和したイソプロパツールで５
〜６回抽出してこれからエチジウムブロマイドを除去す
る。最後に１０１Ｍトリス塩酸（ｐ　Ｈ８，０）及び１
１Ｍ　　ＥＤＴＡに対して透析して塩化セシウムを除去
する。
７、オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドの合成は、下記に示す固相合成法（
同相リン酸トリエステル法）により行なった（Ｈ，Ｉｔ
ｏ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｎｅｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０．１７５５−１７６９（１９８
２））。
即ち、まず１％架橋ポリスチレン樹脂５−Ｘｌ（２００
〜４００メツシユ、バイオラドラボラトリーズ社製）を
アミノメチル化したものと、５′−〇−ジメトキシトリ
チルヌクレオシドのモノコハク酸エステルとを反応させ
て、ヌクレオシド担持樹脂を得る。次に、バーチエム社
製ＤＮＡ合成様を用いて以下の操作を行なう。
上記樹脂４０１ｇを反応管に入れ、１Ｍ臭化亜鉛のジク
ロロメタン−イソプロパツール（８５：１５）溶液を用
いて５′位のジメトキシトリチル基を脱離させる。次に
完全に保護されたジヌクレオチド（Ｃ，Ｂｒｏｋａ　　
ｅｔ　　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
ｅａｒｃｈ、８．５４６１−５４７１　（１９８０’）
の方法により調製した〕のトリエチルアンモニウム塩５
０■０を加え、縮合剤（メシチレンスルホニル−５−ニ
トロトリアゾール）を用いて縮合させる。以上の操作を
繰返して、順次鎖長をのばして、保護されたオリゴヌク
レオチドを担持した樹脂を得る。尚、最後の縮合工程で
は、必要に応じてジヌクレオチドの代りに、前記文献に
記載の方法により調製されるモノヌクレオチドのトリエ
チルアンモニウム塩２５−〇を使用する。
次に０．５Ｍビリジン力ルドキシメートのピリジン−水
（１：１）溶液を用いて、保護されたオリゴヌクレオチ
ドを樹脂から脱離させる。これをセファデックスＧ−５
０カラム（ファルマシア社製、２Ｘ１００ｃｍ）で、更
に高速液体クロマトグラフィー（ポンブ：ウォーターズ
社ｆＪ６０００Ａ型、検出器：４４０’Ｊ！デイテクタ
ー、カラム二マイクロポンダーバック０１８、溶出溶媒
：（５→４０％）アセトニトリル−０，１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム水溶液）で精製する。次に８０％酢酸
により脱保護反応を行ない、再度高速液体クロマトグラ
フィーにより単一ピークになるまで精製する。□この＾
速液体クロマトグラフィーの条件は、溶出溶媒として（
５→２５％）アセトニトリル−０，１Ｍ酢酸トリエチル
アンモニウム水溶液を用い−る以外は、上記と同一とす
る。
８、ＤＮＡ塩基配列の分析 ＤＮＡ塩基配列の分析は、メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）
の方法〔Ｍ２Ｓ法、Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　Ｅ　ｎｚｙｇ
ｇｏｌ、、　１０１　。
２０　（１９８３））に従い、以下のように行なった。
即ち、まずＤＮＡ断片を制限酵素により切り出し、１％
アガロースゲル電気泳動により分離する。このＤＮＡ断
片をＭ１３■１）８ＲＦ（アマ−ジャム社製）をベクタ
ーとしてり０−ニングする。
得られる組換えファージＤＮＡをマンデル（Ｍａｎｄｅ
ｌ　）とヒガ（Ｈｌ（ｌａ）の方法（Ｊ。
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　ＬＬ、　１５４　（１９７０
）　）により、大腸菌ＪＭ１０７株へ形質導入する。こ
の菌体懸濁液０．２−に、２５１Ｍ−のイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド２５μＱ及び２０■９／−の
５−プロモー４−りＯロー３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド４０μＱを加え、次いで加熱溶解させた後、
５０℃で保温したＨ−トップアガー液（１％バクトドリ
プシン、０．８％塩化ナトリウム及び０．５％寒天）３
１９を加え、１．５％寒天を加えて固化させた２ＸＴＹ
培地び０．５％塩化ナトリウム）の平板に重−し、３７
℃で一晩培養する。ＤＮＡ断片の挿入された組換えファ
ージは無色のプラークを生じるのに対し、親株のＭ１３
ｍｐ８は青色のプラークを生じるので、目的の組換えフ
ァージ＝＝易に選別できる。
次に単一の無色プラークをパスツールピペットにて取り
出し、これとＪＭ１０３株の培養液０．０１−とを２Ｘ
ＴＹ培地１−に加え、約５時間、３７℃で！１ｌｊ８１
して粗換えファーらを増殖させる。培養後、遠心にそ菌
体を除き、上清に２０％ポリエチレングリコール６００
０の０．２−を混合し、室温で１５分以上静置した後、
遠６にて沈澱するファージを集め、フェノール抽出によ
って、ファージから一本鎖ＤＮＡを抽出し、これを鋳型
−末鎖ＤＮＡとして用いる。
ｖＩ−一本１１ＤＮＡとプライマー（宝酒造■製、Ｍ１
３の１５塩基プライマー）とのそれぞれ０．５ｐ■０１
ずつを混合し、６０℃で２０分間熱処理後、徐冷する。
次にこの混合液にα３２Ｐ二ｄＣＴＰ　’＜アマジャム
社製、４００Ｃｉ　／ｍ　ｓｏｌ　）２μＱとＤＮＡポ
リメラーゼＩ（クレノー、宝酒造−一）２ユニツトとを
加え、充分に混合した俵、その３．２μＱずつを、下記
第２表に示した４種のｄ　ＮＴＰ−ｄｄＮＴＰ１合液の
それぞれ２μＱを含む反応管に加える。室温で２０分薗
反応させた後、チェース反−液（ｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴ
Ｐ、ｄ　ＧＴＰ及びｄ　ＴＴＰの各１■Ｍ）の１μＱを
そアミド−正波（９４％Ｖ／ｖホルムアミド、０．１％
キシレンシフノール及び０．１％ブロムフェノールブル
ー）を６μＱずつ加え、９５℃も３分ｉｎ神熱した後、
急冷する。次にサンプル２μＱずつを６％又は８％ポリ
アクリルアミドゲルに重層し、電気泳動（１８００Ｖ、
３０■Ａ、２゛〜３時間）を行なう。泳動後、ゲルを濾
紙（ワットマン３ＭＭ）に移し、ゲル乾燥器にて乾燥し
、オートラジオグラムをとり、ＤＮＡ塩基配列を解読す
る。
第　　２　　表 ｄ　ＮＴＰ−ｄｄＮＴＰ混合液組成　（μＱ）但し第２
表中、ｄｄＡはジデオキシアデノシンを、ｄｄＣはジデ
オキシシチジンを、ｄｄＧはジデオキシグアノシンを、
またｄｄＴはジデオキシチミジンをそれぞれ示す。
９、アガロースゲル電気泳動 シュライフ（Ｓ　ｃｈｌｅｉｆ）とウエンシンク（Ｗｅ
ｎｓｌｎｋ）の手引書（“Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ″（１９８１）。
Ｓ　ｐｒｌｎａｅｒ　−Ｖ　ｅｒｌａａ社、ｐｐ１１４
−１２５）に記載の方法に従って、アガロースゲル電気
泳動及び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なう
。
泳動用電源としては、アトー社製フンスターパワー５Ｊ
１０６５型を、泳動槽としては１２Ｘ１５ＣＩのプラス
チック製水槽（白金電極付）を、アガロースとしてはア
ガロースエ（同仁化学研究所製）を、また泳動用緩衝液
としては４０＋ｅＭトリス塩ｍ　（５ｇ＋　Ｍ酢酸ナト
リウム及びｉｓ　Ｍ　　ＥＤＴＡ含有、ｐＨ７，９）を
それぞれ用いる。
１０、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上記手引書の第
７８−８７頁及び第１１４−１２５頁に記載の方法に従
い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び泳動後のゲル
からのＤＮＡ断片の分離を行なう。泳動用電源としては
、アトー社製フンスターパワー５Ｊ１０６５型を、泳動
槽としてはアト−社製５Ｊ１０６０ＳＤ型を用いる。
アクリルアミド溶液として、アクリルアミドとＮ。
Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（２９：１）との水
溶液を、重合促進剤としてＮ、Ｎ、Ｎ’　。
Ｎ′−テトラメチレンエチレンジアミンを、重合触媒と
して過硫酸アンモンをそれぞれ用いる。また泳動用緩衝
液として９０■Ｍトリス塩酸（９０１Ｍ硼酸、２．５■
Ｍ　　ＥＤＴＡ含有１、ｐＨ８，３）を用いる。
実施例１ 成熟ポリペプチド分泌発現用ベクターｐＧＨ５４及びｐ
ＧＨ５５の構築 （Ａ）　　中間体プラスミドｐ　ＧＨ５３の構築■　大
員菌のβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドの一部をコ
ードするＤＮＡ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの
合成のために、以下の塩基配列を有する４種のオリゴヌ
クレオチドのそれぞれを、前記した固相リン酸トリエス
テル法により合成した。
＜１＞　　　（５’　　）ＣＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＧ
ＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣ（３’　） ＜２＞　　　　　　ＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡＧＣＧＣ
Ａ ＜３＞　　　　　　　　ＧＣＴＧＡＧＴＴＣＧＣＧＡＡ
ＡＣＡＧ ＜４＞　　　　　　ＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣ
ＧＡＴ 上記オリゴヌクレオチド〈２〉及びく４〉の５′端をそ
れぞれＴ４ボリヌクレオチジルキナーゼ（ＢＲＬ社製）
を用いてリン酸化した。即ち、各々１０μａのオリゴヌ
クレオチドを５０ｍＭトリス塩酸水溶液（１０■Ｍ塩化
マグネシウム、５■Ｍジチオスレイトール、１１Ｍ　　
ＡＴＰを含む、ｏ　Ｈ９，５）５０μＱに溶かし、これ
にＴ、ポリヌクレオデジルキナーゼ５ユニツトを加え、
３７℃で３０分間反応させ、フェノール抽出により反応
を停止させた。
■　クローニングベクターとして、プラスミドｐＢＲ３
２２（Ｂｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　
、　Ｌ。
９５−１１３　（１９７７））を利用した。
該プラスミドｐＢＲ３２２の１０μＱを、制限酵素ＰＳ
ｔＩ（宝酒造■製）とＰｖｕＩ（ＮＥＢ社製）とを用い
て高塩濃度！ＩＩＩ中で切断し、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、４２３７塩基のＤＮＡ断片を分離
した。
■　上記■で得たＤＮＡ断片を、上記■でＩＩ製された
リン酸化したオリゴヌクレオチド〈２〉及び〈４〉並び
にリン酸化していないオリゴヌクレオチドく１〉及び〈
３〉のそれぞれ約１μｇずつと合せて、Ｔａ　ＤＮＡリ
ガーゼで結合反応させた。
反応終了後、この反応組成液で大腸菌に一１２株由来の
８８１０１株を形質転換させた。得られたテトラサイク
リン耐性を示す形質転換株の中から１株を選び、これか
らプラスミドを単離し、目的のＤ　ＧＨ５３を得た。
一連の操作の概略は第１図に示す通りである。
得られたＥ）ＧＨ５３は、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、４．３Ｋｆｌの大きさを有しており、その
ＤＮＡ塩基配列をＭ１３法により分析した結−果、Ｉ）
ＢＲ３２２のｐｓＢ及びＰｖｕＩの両制限サイト間が欠
失し、代りに次に示すように、オリゴヌクレオチド〈１
〉、く２〉、く３〉及び〈４〉が挿入されていることが
確認された。
該ｐ　ＧＨ５３は、通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所にｒＨＢｌｏｌ　（Ｄ　ＧＨ５３）Ｊなる表示
で微工研条寄第６７８号（ＦＥＲＭＢＰ−６７８）とし
て寄託されている。
（Ｂ）　　成熟ポリペプチド分泌発現用ベクターｐＧＨ
５４の構築 ■　上記（Ａ）で得たＥ）ＧＨ５３の１０μりを制限酵
素ＮａｅＩ（ＮＥＢ社製）及びＡｖａＩ（宝酒造■製）
を用いて生塩濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％ア
ガロースゲル電気泳動を行なって、２２１７塩基のＤＮ
Ａ断片（Ａ）を分離した。
この断片は、合成オリゴヌクレオチド由来のＤＮＡ配列
の大部分と７ラスミドの複製員始領域を含んでいる。
■　１）ＢＨ３，２２を制限酵素ＡＶａｌ及、びＨｉｎ
ｄｌｌ（いずれも宝酒造■製）で、生塩濃度１１１液を
用いて切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行な
って、１３９６塩基のＤＮＡ断片＜８＞を得た。
この断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部とテトラサイクリン耐性の構造遺伝子の全て
が含まれている。
■　ｐＢＲ３２２の２０μＱを制限酵素Ｆｎｕ４Ｈ１（
ＮＥＢ社製）で低塩濃度緩衝液を用いて切断し、次いで
Ｓ１ヌクレアーゼによりＤＮＡ断片末端の突出塩基を分
解除去した。これはフェノール抽出後のＤＮＡを６ｇ＋
Ｍ酢酸ナトリウム、４０１Ｍ塩化ナトリウム及び１■Ｍ
硫酸亜鉛緩Ｉ！ＦＭ（ｐ　Ｈ４，５）１−に溶かし、こ
れに２０００ユニツトの８１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ社製
）を加えて２０℃で３０分間反応させることにより行な
った。次いで、フェノール抽出後の、ＤＮＡを制限酵素
Ｈ１ｎｄｌｌで生塩濃度緩衝液を用いて切断し、６％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、２８２塩基の
ＤＮＡ断片（Ｃ）を得た。
この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リポ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードする遺伝子
の一部の他、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモータ
ーの一部が含まれている。
■　上記で得た３つの断片＜Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を
、ＴａＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、こ
の反応組成液でＨ８１０１株を形質転換した。得られた
テトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から１株を
選びプラスミドを単離した。かくしてｏＧＨ５４を得た
。
ｐＧＨ５４は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、β
ラクタマーゼのプロモーター及びリポゾーム結合部位に
続いてシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を
有し、この塩基配列の３′末端の上流側にＮｒｕ工及び
下流側にｐｖｕｌ［のそれぞれの制限酵素ｉ！識配列を
有していることが確認された。
一連の操作の概略は、第２図に示される通りである。
ＥＩＧＨ５４は、前記した通り約３．９Ｋｂの大きさ及
び第２図に示す制限酵素開裂地図により特徴付けられ、
またＭ１３法による塩基配列分析の結果、前記式（３）
に示した塩基配列によりコードされるβラクタマーゼシ
グナルペプチドの遺伝子を有することが確認された。
（Ｃ）　　成熟ポリペプチド分泌発現用ベクターｐＧＨ
５５の構築 ■　ｐＢＲ３２２のＡＶａＩ及びｐｖｕｌ［制限サイト
間の塩基配列を欠失させたプラスミドであるｐ　ＢＲＨ
Ｏ２を次の操作により作成した。即ちｐＢＲ３２２の５
μｇを、生塩濃度緩衝液中で、制限酵素ＡＶａＩ及びＰ
ｖｕＩ［（いずれも宝酒造■製）で切断も、フェノール
抽出後、ＤＮＡポリメラーゼエ（クレノー断片、宝酒造
■製）で切断断片をプラントエンド化した。次に１．０
％アガロースゲル電気泳動で３７２６塩基のＤＮＡ断片
を分離し、この断片をＴＡ　ＤＮＡリガーゼで環状化さ
せた。反応終了後、この反応組成液で８８１０１株を形
質転換し、得られるアンピシリン耐性及びテトラサイク
リン耐性を示す形質転換株の中から一株を選択してプラ
スミドを単離しｐ　ＢＲＨ０２を得た。得られたｐ　Ｂ
ＲＨＯ２はｐＢＲ３２２とは異なって、ＡＶａＩでもＰ
ｖｕｌＩでも切断されなかった。
■　上記■で得たｐ　ＢＲＨ０２の５μｇを制限酵素Ｐ
ＳｔＩ及びＢａｍＨＩ（いずれも宝酒造■製）を用いて
生塩濃度暖管液中で切断し、次いで１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行なって、２５９７塩基のＤＮＡ断片（
Ｄ）を分離した。
この断片は、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部及びプ
ラスミドの複製開始領域を含んでいる。
■　ＤＧＨ５４の１０μｇを制限酵素ＰＳｔＩ及びＢａ
１ＨＩで生塩濃度緩衝液を用いて切断し、次いで１．０
％アガロースゲル電気泳動を行ない、６６１塩基のＤＮ
Ａ断片（Ｅ）を得た。
この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リポ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列及びテトラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれて
いる。
■　上記で得た２、つの断片（Ｄ）及び（Ｅ）を、ＴＡ
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応
組成液でＨ８１０１株を形質転換した。
得られたテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中か
ら１株を選びプラスミドを単離した。かくしてｐＧＨ５
５を得た。
一連の操作の概略は、第３図に示される通りである。
ＤＧＨ５５は、上記第３図に示される制限酵素開裂地図
により特徴付けられ、１．０％アガロースゲル電気泳動
の結果、約３．３Ｋｂの大きさを有していた。また該ｐ
ＧＨ５５は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、ｐＧ
Ｈ５４における第２のｐｖｕｌ［制限サイトを含む６３
７塩基のＤＮＡを欠く以外は、該ＥＩＧＨ５４と同様で
あり、その第１のｐｖｕ■制限サイトは、シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基配列の３′末端の近傍に存
在していることが確認された。
実施例２ シグナルペプチド−βウロガストロン融合ポリペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列を有する分泌発現ベクター
の構築 （Ａ）　　βウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配
列の合成 この塩基配列は、グレゴリ−（Ｈ，Ｇｒｅｏｏｒｙ）に
より報告されたアミノ酸配列ＣＮａｔｕｒｅ、２５７　
。
３２５−３２７　（１９７５））を参考にして、まずβ
ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配列の前後に開
始コドン、終止コドン及び制限酵素認謙部位を付加して
なる下記第３表に示すＤＮＡ塩基配列を構築することよ
り行なった。このＤＮＡ塩基配列は、本発明者らにより
既に特願昭５９−１３７６９１号として特許出願されて
いる。
第　　３　　表 ＣＴＡ　ＡＧＡ　ＣＴＣＡＣＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＡＧＡ
　ＧＴＧＣＴＴ　ＡＡＣＧＣＡ　ＡＴＴ　ＡＴＣＡＣＴ
　ＴＣＴ　ＡＧＡＧ　　３’ ＣＣＴ　ＡＧ　５’ （Ｂ）　　βつＯガストロンをコードするＤＮＡ塩基配
列を保有するプラスミドの構築 ■　Ｅ）ＢＲ３２２の１０μＯを、まず高塩濃度層ａｌ
ｌ中でＥｃｏＲＩ（宝酒造＠製）と９ａｓＨＩとで切断
し、次いで１．０％アガロースゲル電気泳動を行ない、
３９８６塩基のＤＮＡ断片をＳａｔ、、た。
■′上記■で得たＤＮＡ断片と、上記（Ａ）で得たβウ
ロガストロンをコードするＤＮＡＩ！基配列とを、Ｔａ
ＤＮＡリガーゼで結合させた１反応後、反応組成物でＨ
８１０１株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性を
示す形質転換株の中から一株を選びプラスミドを単離し
た。かくしてβつＯガストロンをコードするＤＮＡ塩基
配列をＤＢＲ”３２２のεｃｏＲＩ及びＢａ■ＨＩ制限
サイ制限サイ入園れたプラスミドｐ　ＬＪＧ３を得た。
このプラスミドｐ　ＵＯ３を保有する８８１０１株は、
ｒＨＢｌｏｌ　（ｐ　ＵＯ３）Ｊなる表示で微工研菌条
第５４３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５４３）として寄託さ
れている。
（Ｃ）　　ＥＩ　ＵＧ２０１の構築 上記（Ｂ）で得たＤ　ＵＯ３を制限酵素ＨｉｎｆＩで切
断して得られるＤＮＡ断片を、９ＧＨ５５のＰｖｕｆ制
限サイトに挿入して、シグナルペプチド−βゲロがスト
ｏｙ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含
む分泌発現ベクターであるＥＩ　ＵＧ２０１を、以下の
方法により構築した。
■　Ｄ　ＵＯ３の１５μａを、高塩濃度緩衝液中でＨｆ
ｎｆＩ（宝酒造＠製）で切断し、フェノール抽出機、Ｄ
ＮＡポリメラーゼエ（クレノー断片）で切断断片をプラ
ントエンド化した。次いで６％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行ない、４２８−塩基のＤＮＡ断片（Ｆ）を
単離した。
この断ｋには、βウロガストロンをコードする０ＮＡ１
１基配殉（翻訳停止コドンを含む）のうち５′端の７塩
基を除く塩基配列が含まれていた。
■　ＤＧＨ５５は、βラクタマーゼのシグナルペプチド
をコードするＤＮＡ塩基配列の後に、βウロガストロン
のＮ端領域をコードする最初の７個のＤＮＡ塩基配列が
直結し、且つその直後で制限ｌ業Ｐｖｕｉにより切断さ
れるように構成されたＤＮＡ塩基配列を有するものであ
り、該ｐＧＨ５５の５μＱを中温濃度緩衝液中で、ｐｖ
ｕｌ［で切断して、３２５８塩基のＤＮＡ断片（Ｇ）を
得た。
この断片は、ｐＧＨ５５の全ての遺伝情報を有している
。
■　上記■で得た断片（Ｆ）の約１μｇと、上記■で得
た断片（Ｇ）の約０．５ａとをＴＡＤＮＡリガーゼで結
合させた。反応後、この反応組成液で８８１０１株を形
質転換し、得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株
の中から一株を選び、プラスミドｐ　ＬＪＧ２０１を単
離した。
ｏ　ＬＩＧ２０１は、１．０％アガロースゲル電気泳動
の結果、約３．８Ｋｂの大きさを有していた。
これをＢａ鳳ＨＩ又はＨｉｎｄｌｌで切断すると、それ
ぞれ２種類のＤＮＡ断片が得られることから、該ＥＩＵ
Ｇ２０１にはβウロガストロン遺伝子が含まれているこ
とが判り、また該断片の大きざを調べた結果より、目的
のプラスミドであることが判った。更に、１）ｔＪＧ２
０１について、βラクタマーゼのプロモータ一部分から
βウロガストロン遺伝子までを含むＤＮＡ断片の塩基配
列を、Ｍ１３法による塩基配列分析により調べた。その
結果、該ＤＮＡ塩基配列は下記第４表の通りであり、ｐ
ＵＧ２０１がプロモーター、リポゾーム結合部位並びに
βラクタマーゼのシグナルペプチドをコードする塩基配
列及びβウロガストロンをコードする塩基配列（融合ポ
リペプチドをコードする塩基配列）が、正確にこの順序
で配列されていることが確認された。また第４表にはＤ
ＮＡ塩基配列に対応するアミノ酸配列も併記する。
上記ｐ　ＬＩＧ２０１は、これを大腸菌ＨＢ１０１に保
有させ、この保有株をｒＨＢｌｏｌ　（ＥＩ　ＧＨ２０
１）Ｊなる表示で通商産業省工業技術院微生物工業研究
所に寄託されている。その寄託番号は、微工研条寄第６
８１号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６８１）である。
第　　４　　表 ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧ
ＡＴＡＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣ
ＣＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡ
ＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴ
ＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴ
ＡＴＴＡＣＧＡＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧ
ＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＣ
ＡＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＴＴＧ
ＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴ
ＴＴＴＣＴＡＡＣＡＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＡ
ＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＴ□　ブ　　０　　モ　　
−　　タ　　−ＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡ
ＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＴＴＡＴＧＴＡＡＧＴ
ＴＴＡＴＡＣＡＴＡＧＧＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＧＴ−二 ＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡ
ＴＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧ
ＡＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴ／リポゾーム結合部
位 ＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴ　　ＡＴＧ　　ＡＧＴ　　ＡＴＴ
　　ＣＡＡ　　ＣＡＴＴＴＣＣＧＴ　　ＧＴＣＧＣＣＣ
ＴＴ　　ＡＴＴ　　ＣＣＣＴＴＴシ　　グ　　す　　ル
　　ベ　　ブ　　チ　　ドＴＴＴ　　ＧＣＧ　　ＧＣＣ
ＴＴＴ　　ＴＧＯＣＴＴ　　ＣＣＴ　　ＧＴＣＴＴＣＧ
ＣＧ　ＡＡＣＴＣＡ　　ＧＡＴ　　ＴＣＴ　　ＧＡＧ　
　ＴＧＣＣＣＡ　　ＣＴＧ　　ＴＣＴ　　ＣＡＣＧＡＴ
　　ＧＧＣＴＡＴ　　ＴＧＴＣＴＧ　　ＣＡＣＧＡＣＧ
ＧＴ　　ＧＴＴ　　ＴＧＣＡＴＧ　　ＴＡＣＡＴＣＧＡ
Ａ　　ＧＣＴ　　ＴＴＧ　　ＧＡＴ　　ＡＡＡ　　ＴＡ
ＣＧＣＧＴＧＴ　ＡＡＣＴＧＴ　　ＧＴＡ　　ＧＴＧ　
　ＧＧＴ　　ＴＡＴ　ＡＴＣＧＧＴ　ＧＡＡ　　ＣＧＣ
ＴＧＴ　　ＣＡＡ　　ＴＡＣＣＧＴ　　ＧＡＴＣＣＡ　
　ＣＴＴ　　ＧＣＧ　ＡＣＡ　　ＧＴＴ　　ＡＴＧ　　
ＧＣＡ　　ＣＴＡＧＩ　　　ＧＩＵ　　Ａｒｃ　　ＣＹ
Ｓ　　Ｑｌｎ　　Ｔｒ　　ＡｒｇＡＳＩ）ＣＴＧ　　Ａ
ＡＡ　　ＴＧＧ　　ＴＧＧ　　ＧＡＡ　　ＴＴＧ　　Ｇ
ＧＴ　　ＴＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣ ＡＴＣＡＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧ 実施例３ １）ＵＧ２０１を保有する大腸菌による成熟βつＯガス
トロンの分泌発現 （Ａ）　　ｐ　ＵＧ２０１を保有する８８１０１株の培
養 下記組成の修正Ｅ培地を用いた。
〈修正Ｅ培地（１Ｑ当りの組成）〉 硫酸マグネシウム・７水塩　　　　０．２ｇクエン酸・
１水和物　　　　　　　２．０ｇ無水リン酸２カリウム
　　　　　１０．Ｏ。
リン酸水素アンモニウム・ナトリ ラム・４水塩　　　　　　　　　　３．５ｇブドウ糖　
　　　　　　　　　　　２．０ｇカザミノ酸　　　　　
　　　　　　　１．０゜Ｌ−プロリン　　　　　　　　
　　　０．２３ＯＬ−ロイシン　　　　　　　　　３９
．５■り塩酸チアミン　　　　　　　　　１６．８５■
０テトラサイクリン・塩酸塩　　　２０．Ｏ■Ｏｐ　Ｕ
Ｇ２０１株の前培養液１ｍ１２を、修正Ｅ培地２００ｍ
を含むフラスコに加え、３７℃で２４時間振盪培養した
。
（Ｂ）　　菌体からのペリプラズム画分と細胞内画分と
の抽出 上記（Ａ）で得た培養液から遠心分離 （６０００回転／分×１０分）で菌体を集め、培養液の
０．５倍量の洗浄緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸及び３０
園Ｍ塩化ナトリウム、Ｄ　Ｈ８，０）で菌体を洗浄した
後、浸透圧ショック法（Ｈ，Ｃ。
ＮｅｕとＬ　、　Ａ　、　　Ｈｅｐｐｅｌ、Ｊ　、　　
Ｂ　、　　Ｃ、、ＬＪＬ。
３６８５−３６９２　（１９６５））に従い、ペリプラ
ズム画分を抽出した。この抽出操作は、まず湿重量１ｇ
の菌体を２０％蔗糖を含む３０ｇＭトリス塩冒緩塩液緩
衝液８．０）８０１１１に懸濁させ、０．２５Ｍ　　Ｅ
ＯＴＡ水溶液（ｐ　Ｈ８，０）の℃にて１８０回転／分
で１０分間撹拌した後、遠心分離（９０００回転／分×
１０分）して菌体を集め、次いでこの菌体を氷冷した水
βＯＩｇに再懸濁させ、水中に１０分間静置して時々撹
拌し、遠心分離（９０００回転／分×１０分）により菌
体と上澄とを分離することにより行なったものであり、
得られた上澄がペリプラズム画分である。
次いで、上記ペリプラズム、画分を抽出した後の菌体を
、前記と同一の洗浄板ｗｌ！で洗浄後、ＰＢＳ（１５０
■Ｍ塩化す、トリウムを含む２０■Ｍリン酸ナトリウム
、ＤＨ７，０）６−に懸濁させ、超音波破砕機（人感製
作所製５２０２型）を用いて出力１００Ｗにて３０秒ず
つ３１ｉ１ｆｆｌ音波破砕処理し、遠心分離（１８００
０回転／分×２０分）して上澄を得た。これを細胞内画
分履した。
（Ｃ）　　ラジオイムノアッセイによるβつＯガストロ
ンの測定 上記（Ｂ）で得たそれぞれの両分につき、以下の通りβ
ウロガストロンの存在をβつＯガストロン特異ラジオイ
ムノアッセイにより検討した。ラジオイムノアッセイの
方法は次の通りである。即ち、精製ヒトβウロガストロ
ンを抗原として、家兎を免疫し抗血清を作成−だ。βウ
ロガストロン３００μ９を蒸留水０．２１１！１に溶解
後、５０％ポリビニルピロリドン液１．５１９を加え室
温で２時図撹拌した。コンプリート・フロイント・アジ
ュバント２．０１１１を加えて乳化し、家兎３匹の胸部
に皮下注射駿た。２週間毎に免疫を４回くり返した後、
さらに５０μ９の抗原を静注し、３日後に全採血を行な
い、血清を分離した。
次にアッセイに用いる抗血清の希釈倍率を求め。
るタイトレージョンカーブ、アッセイ条件を最適化する
ためインキュベーション時間、抗体結合標識抗原（バウ
ンド）と遊離標識抗原（フリー）の分離方法等の検討を
加え、下記測定条件を設定した。
即ち、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１４０
■Ｍ塩化ナトリウム、２５−Ｍ　　ＥＤＴＡ二ナトリウ
ムを含む１０ｗＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を希釈液
として用い、該希釈液４００μＱ１測定試料又は標準ヒ
トβウロガストロン１００μＱ及び抗ヒトβウロガスト
ロン血清１００μＱを加えて４℃にて２４時間インキュ
ベートした後、１２５工標識ヒトβウロガストロン１０
０μＱ（約５０００ｃｐ園）を加えた。更に４℃にて４
８時間インキュベートした後、第２抗体（抗家兎γ−グ
ロブリンヤギ血清）（１：２０）１００μＱ、正常家兎
血清（１：　２００）１００μＱ及び５％ポリエチレン
グリコールを含む１０ＩＭ　　ＰＢＳ液９００μＱを加
えて４℃にて３時間インキュベートした。次に３０００
　ｒｐ−で３０分間遠心分離し、上清を除き沈澱物をカ
ウントした。標準ヒトβウロガストロンより得られた標
準曲線より試料中のヒトβウロガストロン免疫活性物の
含量を求めた。。
上記結果を上記第５！Ｉに示す。また第５表には、ｐ　
ＵＧ２０１を保有する８８１０１株に代えて、同様にし
て作成されたｐＧＨ５５及びｐ　ＵＯ３のそれぞれで形
質転換された８８１０１株を用いて同様にした結果を併
記する。
第　　５　　表 βウロガストロン免疫 菌　　株　　　　　活性（μＱ／Ｑ培養液）ペリプラズ
ム　　　細胞　画 （１）ＧＨ５５）　　　　＜０．０３　　　＜Ｑ、０３
ＣＤ　ＵＯ３）　　　　　＜０．０３　　　＜０．０３
ＢＩＯＩ ＬＩＧ２０１　　　　２６３　　　　０．６２上記第５
表より、シグナルペプチドのみをコードするＤＮＡ塩基
配列を含むベクターを保有する大腸菌（ＨＢｌｏｌ　（
Ｄ　ＧＨ５５）’）及びβつＯガストロンのみをコード
するＤＮＡ塩基配列を含むプラスミドを保有する大腸１
（Ｈ８１０１（ｐ　ＵＯ３））では、それらの培養抽出
液中にβウロガストロンの免疫活性物質は実質的に検出
されないが、シグナルペプチドとβつＯガストロンの融
合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含み、そ
の前にプロモーター及びリポゾーム結合部位が連結され
た本発明の成熟ポリペプチド分泌発現ベクターを保有す
る大腸菌（ＨＢｌｏｌ（ｐ　ＵＧ２０１　））では、そ
の培養抽出液中に顕著なβつａガストロンの免疫活性が
検出されることが明らかである。
また本発明ベクターで形質転換した上記微生物の＠養で
は、βウロガストロンの免疫活性物質の殆んどすべて（
９９，８％）が、ペリプラズムに分布していることも確
認される。このことから、シグナルペプチドとβウロガ
ストロンとの融合ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列を利用
した本発明によれば、βウロガストロンは細胞膜を通過
してペリプラズムに分泌されることが判る。
（Ｄ）　　ポリペプチドの精製 上記ペリプラズム抽出液中のβウロガストロンの免疫活
性物質を、ブチルトヨバール（東洋曹達■製）を用いた
吸若りＯマドグラフィー、ＣＭ−トヨパール（東洋曹達
株式会社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー、
Ｐｅ１ｌＲＰＣカラム（ファルマシア社製）を用いた高
速液体クロマトグラフィー操作により、それぞれ単一の
ポリペプチドになるまで精製した。
その結果、精製されたポリペプチドは、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動、アミノ酸分析、Ｎ末端分析のすべてにおいてヒ
ト尿より単離精製されたβウロガストロンと同一物質で
あることが確認された。
【図面の簡単な説明】
第１図は起源ベクターＤ　ＢＲ３２２に合成オリゴヌク
レオチド〈１〉、〈２〉、〈３）及び〈４〉をクローニ
ングしてプラスミドｐ　ＧＨ５３を得る工程及びこれに
より得られるｏ　ＧＨ５３の特徴を示す図であり、図中
口は合成オリゴヌクレオチド由来の塩基配列を示してい
る。 第２図はｐ　ＧＨ５３とＩ）ＢＲ３２２とから本発明ポ
リペプチド分泌発現用ベクターＤ　ＧＨ５４を得る工程
及び得られたベクター１）ＧＨ５４の特性を示す図であ
り、図中■はシグナルペプチドをコードする塩基配列を
示す。 第３図はＥ）ＢＲ３２２からＥ）ＢＲＨＯ２を得、該１
）ＢＲＨ−０２と１）ＧＨ５４とから本発明ポリペプチ
ド分泌発現用ベクターｐＧＨ５５を得る工程及び得られ
るＤＧＨ５５の特性を示す図である。 第４図はｐＧＨ５５とＥＩ　ＵＯ３とからシグナルペプ
チドと目的ポリペプチド（βウロガストロン）との融合
ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含む本発明
のポリペプチド分泌発現ベクターｏ　ＵＧ２０１を得る
工程及び得られるベクターｐＵＧ２０１の特性を示す図
であり、図中臼ヌキの矢印はβウロガストロンの遺伝子
を示す。 （以　上）

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と
    目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とを直接
    連結させて目的ポリペプチドを分泌発現させるための、
    シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むこ
    とを特徴とするポリペプチド分泌発現用ベクター。
  2. （２）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と
    共に該塩基配列の前にプロモーター及びリポゾーム結合
    部位を有する特許請求の範囲第１項に記載のベクター。
  3. （３）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列に
    連結されるべき目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩
    基配列の直後に翻訳停止シグナルを直接連結されるべく
    した特許請求の範囲第１項又は第２項に記載のベクター
    。
  4. （４）翻訳停止シグナルの後に更に転写終結因子が連結
    されてなる特許請求の範囲第３項に記載のベクター。
  5. （５）シグナルペプチドが大腸菌βラクタマーゼのもの
    である特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のベ
    クター。
  6. （６）プロモーター、リポゾーム結合部位及び転写終結
    因子が大腸菌βラクタマーゼのものである特許請求の範
    囲第１〜５項のいずれかに記載のベクター。
  7. （７）ｐＵＧ５４である特許請求の範囲第１項に記載の
    ベクター。
  8. （８）ｐＵＧ５５である特許請求の範囲第１項に記載の
    ベクター。
  9. （９）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と
    目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とが直接
    連結されてなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩
    基配列を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１〜８
    項のいずれかに記載のベクター。
  10. （１０）目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
    がβウロガストロンをコードするものである特許請求の
    範囲第９項に記載のベクター。
  11. （１１）ｐＵＧ２０１である特許請求の範囲第９項に記
    載のベクター。
  12. （１２）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
    と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とが直
    接連結されてなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ
    塩基配列を含むベクターで形質転換された微生物。
  13. （１３）大腸菌である特許請求の範囲第１２項に記載の
    微生物。
  14. （１４）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
    と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とが直
    接連結されてなる場合ポリペプチドをコードするＤＮＡ
    塩基配列を含むベクターで形質転換された微生物を培養
    して分泌されるポリペプチドを採取することを特徴とす
    るポリペプチドの製造法。
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