NO790512L

NO790512L - Fremgangsmaate ved fremstilling av et enzym fra bakteriekilder og farmasoeytiske komposisjoner som inneholder dette

Info

Publication number: NO790512L
Application number: NO790512A
Authority: NO
Inventors: Nicole Simon Lavoine; Marcel Forgeot
Original assignee: Science Union & Cie
Priority date: 1978-02-16
Filing date: 1979-02-15
Publication date: 1979-08-17
Also published as: DE2905678A1; PL213477A1; JPS54147911A; DK64379A; ZA79697B; PT69235A; AU4427879A; BR7900951A; DD141903A5; IL56679A0; FI790483A7; GR68088B; AR219372A1; OA06185A; EP0004214A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye farmasøytiske komposisjoner som inneholder som aktiv bestanddel et enzym.eller blanding

av enzymer av mikrobiell opprinnelse.

Nærmere bestemt er formålet for oppfinnelsen å tilveiebringe

nye farmasøytiske komposisjoner, nemlig ment for behandling av virussykdommer, hvis aktive1 bestanddel er glykosidohydrolase erholdt fra kulturer av en mikrobiell stamme.

Spesielt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske komposisjoner som inneholder som aktiv bestanddel en N-acetylmuraminat-glykohydrolase fremstilt fra kulturer av Streptococcus pneumoniae (slekten micrococcaceae).

N-acetylmuraminat-glykohydrolase er et enzym som er i stand til

å avspalte N-acetylmuraminsyre fra glykoproteinene når det an-bringes ved den ikke-reduktive endedel av kjeden av et poly-sakkarid .

Mange N-acetylmuraminat-glykohydrolaser er allerede kjent. De stammer enten fra virus eller fra mikrober. N-acetylmuraminat-glykohydrolaser fra Vibrio cholerae, fra Clostridium perfringens, fra 'Vibrio comma, fra Arthrobacter sialophilium er allerede omtalt i litteraturen. Videre er N-acetylmuraminat-glykohydrolase erholdt ved kjemisk behandling av forskjellige stammer av Myxovirus influenzae.

Hver av disse glykohydrolasene har én bestemt kjemisk struktur som stammer fra forskjellige kombinasjoner . av glykoproteinkjed-ene. Det fremgår av dette at de har spesielle fysikalske og kjemiske egenskaper.

I I

N-acetylmuraminåt-glykohydrolasen som her anvendes i form av farmasøytiske komposisjoner erholdes fra en spesifikk stamme av 'Streptococcus pneumoniae deponert ved samlingen til Pasteur-• instituttet i Paris som nr. 1-044 16. februar 1978. Den har fysikalske egenskaper som er helt avgrenset fra de allerede kjente overfor andre N-acetylmuraminat-glykohydrolaser. Dette enzymet eller blandingen av enzymer viser ikke noen galacto--sidase, protease, N-acetylglucosaminidase, fukosidase og aryl-• sulfataseegenskaper i motsetning til hva som er vist for enzymene i litteraturen.

Videre er Michaelis konstanten som er bestemt på bronkial glyko--4

peptider som substrat ca..Km = 2.3.10. som er et meget høyt tall hvilket viser en sterk affinitet til glykopeptidene. . Dette isoelektriske punktet som er bestemt ved isoelektrofokuser-ing viser to aktive topper i enzymet hvilket indikerer tilstede-værelsen av, to isoenzymer med et isoelektrisk punkt på 4,2 og 3,7. Disse to isoenzymer gjør enzymet fra Streptococcus pneumoniae-stammen 1.044 tydelig forskjellig fra det fra Clostridium perfringens som er homogent ved elektrofokusering og det isoelektriske punktet til dette er 4,7.

Enzymet eller blandingen av enzymer fraStreptococcus pneumoniae

spalter N-acetylneuraminsyre fra det sure humane -1 glykoprotein med hastighet på 82% i 7 timer og frigjør nær kvantitativt (mer enn 90%) N-acetylneuraminsyre fra et bronkialt siolomucin etter 6 timers kontakt.

Den kjemiske strukturen til N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra Streptococcus pneumoniae (stammen 1-044) er allerede bestemt av

P. Bienvenu and al. CR. Acad. Sei. (Paris) ) 285 (section D) 837

(1977). Innholdet av de forskjellige aminosyrer viser klart

dets "soecificity" i forhold til enzymet som er erholdte ved enzymatisk hydrolyse av Myxovirus influenzae A (Hong Kong) 1/68.

Derfor er formålet for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe farmasøytiske komposisjoner med enzymet eller blanding av enzymer jfrembragt ved kulturer av Streptococcus pneumoniae (stamme 1-044) som aktiv bestanddel i blanding eller sammenheng med en inert ! ■ ■■ ' ikke-toksisk terapeutisk fordragelig bærer eller et hjelpestoff.

De farmasøytiske komposisjoner ifølge foreliggende oppfinnelse

er sådanne som er egnet for parenteral , perkutan, permukøs, perlingual eller rektal administrering. Fortrinnsvis er de injiserbare løsninger oppdelt i ampuller, multidoserinqsflask-er, selvinjiserbare sprøyter, sublinguale tabletter, trykk-. komposisjoner klare for sprøytning på nasale eller pharyngus-slimhinner, løsninger i et polart løsningsmiddel egnet for per-, kutaht bruk, sublinguale.tabletter og suppositorier.

De farmasøytiske komposisjoner kan også inneholde en eller flere eksipienter, fyllmidler, fortynningsmidler, dispersjonsmidler, overflateaktive midler, emulgeringsmidler, smaksstoffer eller midler som muliggjør en langsom frigjøring av den aktive bestanddel i legemet. Avhengig av den valgte administreringsveg kan innholdet av aktiv bestanddel variere sterkt. Den varierer fra 300 U til 5 000 U pr. doseringsenhet, nemlig for de farma-søytiske komposisjoner som er ment for human terapi. For barn nedsettes innholdet av aktiv bestanddel i de farmasøytiske komposisjoner ifølge oppfinnelsen avhengig av pasientens alder og vekt.

De farmasøytiske komposisjoner ifølge oppfinnelsen skal gis en til fire ganger pr. dag hos mennesker.

Ved administrering gjennom slimhinner i nese eller i munn er

det lett å bruke de farmasøytiske komposisjoner ifølge oppfinnelsen i form av spray under trykk i et vandig hjelpemiddel tre ganger om dagen i to dager.

Ved parenteral administrering injiseres de farmasøytiske komposisjoner hver dag i en uke og deretter en gang om uken videre to måneder.

De farmasøytiske komposisjoner ifølge foreliggende oppfinnelse

er ment for behandling av virus sykdommer, særlig sådanne hvor jen virus som danner en kapsel er årsaken og behandlingen av

i

mikrobielle infeksjoner hyppig forbundet med virusinfeksjonen.

De er spesielt aktive mot Myxovirus influenzae, Rhinovirus og ander arter av virus som har en neuraminidase. Denne aktivetet-en kan tilskrives enten en direkte virkning på viruskapselen av glykoproteinstruktur som induserer en nedsettelse av antall cellulære lesjoner på reproduksjonen av virionene, eller en

spesifikk immunostimulerende virkning på arter hvis patogene "virkning skyldes en neuraminidase med antigen-egenskaper som er nær beslektet med N-acetylneuraminidat-glykohydrolase fra Streptococcus pneumoniae som f.eks. Erysipellothrix.

Videre viser de en ikke-spesifikk immunostimulerénde virkning som gjør det mulig å bruke dem som hjelpestoffer i behandling av rhinitis., rhinopharyngitis, sinusitis, angina, amygdalytis, laryngitis, tracheitis, akutt bronchities, broncholites, bron-chpneumonias og kroniske åndedrettsykdommer.

I sykdommer hvor kroppens forsvar er nedsatt p.g.a. en inhib-ering kan komposisjonene ifølge oppfinnelsen undertrykke inhiberingen ved å hydrolysere glykoproteinet som er ansvarlig for inhiberingen og eliminere sialsyre fra overflaten av celle-membranene.

De farmasøytiske komposisjonene ifølge oppfinnelsen kan gis forebyggende for å hindre influensa de to første dager hver måned i de seks vintermånedene til mennesker eller dyr som er utsatt for smitte for å forhindre det første trinnet av virusinfeksjonen eller for å unngå de kliniske infeksjonssymptomer som skyldes influensa.

De kan også gis etter de første influensasymptomer. De øker helbredelseshastigheten og helingen av mucosae-cellene og de stopper komplikasjonene som skyldes overinfeksjoner. De farma-søytiske komposisjonene ifølge oppfinnelsen tolereres meget godt fordi N-acetylmuraminatglykohydrolasen fra Streptococcus pneumoniae kan erholdes.i meget ren tilstand og er nøytral og fri for fremmede proteiner.<I>De har derfor ikke bieffektene til vaksiner fra uskadeliggjort eller drept virus.

Aktiviteten deres kan tilskrives en aktivering av makrofagene

som vises in vitro ved en større spredningsevne, en økning av fagocytose, en økning av antall E-rosetter og EAC-rosetter og en økning av syntesen av DNA i nærvær av lektiner. In vitro vises denne aktivering ved en økning av humoral respons og

•ved stimulering forsinket hypersensitivitet.

Disse immunostimulerende og antivirus-virkninger er overrask-

ende og ikke å forutse i lys av litteraturen (nemlig P. Binder C R Acad.Sci. (Paris) 481 (1975) D, 1545) som viser økningen av dødligheten hos rotter med et malpighian carcinom.

Videre har andre arbeider beskrevet at neuraminidase fra bak-terier er uten noen beskyttende virkning mot virusinfeksjoner som skyldes Myxovirus Influenzae.

Derfor viser de overraskende terapeutiske egenskaper, ved de farmasøytiske komposisjoner ifølge oppfinnelsen en klar av-grensning mellom neuraminidasene som tidligere er kjent og N-acetyl-nuramidat-glykohydrase fra Streptococcus pneumoniae-stammen 1-044 .

De følgende eksempler har bare til hensikt å illustrere oppfinnelsen og vise den beste utførelsesform.

I EKSEMPEL I

Fremstilling av N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra Streptococcus pneumoniae.

I_Stamme

Stammen som produserer dette enzymet er en Streptococcus som til-hører slekten Micrococcaceae deponert i Pasteur-instituttets samling i Paris under nr. 1-044.

Streptococcusen viser seg å være gram-positiv, to og to eller

en meget kort kjede, noen ganger innkapslede kokker. De er fakultativt aerobe. Den optimale temperatur for kulturen er ca.

37°C

Lagring

Denne stammen kan holdes på gelose med 10% hesteblod tilsatt nalidixinsyre.

Poding

Podingen utføres ved strykning på skrånende gelose.

Inkubering av de podede prøverørene utføres 18 til 24 timer ved 37°C. De lyofiliseres deretter på skummet melk.

III_E£§m§tiiling_av_ingkulumet

Innholdet av et lyofilisert prøverør oppslemmes i ca. 2 ml av

det følgende medium:

jpH-verdien for dette medium justeres til 7,8 og mediet sterili-|

I

I o

seres ved 120 i 3 0 min.

Dette sterile medium anvendes for poding i en kolbe som inneholder 4 liter av dette mediet. Inkuberingen utføres anaerobt ved 37°C uten røring eller luftinnblåsing i 24 timer.

3Y_EE§i£Stilling_av_N^

4 liter av det foregående sterile medium benyttes for poding av fermenteringstanken som inneholder 1000 liter av den følg-ende blanding:

Miljøets pH-verdi justeres til 7,8-8,0

Det steriliseres ved 120° i 20 min.

Fermenteringen utføres ved 37°C i 29 timer uten røring eller luftinnblåsing. Ved slutten av fermenteringen tilsettes mediet

0,1 g pr. liter lysozym -for å lette' nedbrytningen av mikrobe-cellene og bedre diffusjonen over i mediet av det således produserte N-acetylmuraminat-glykohydrolase. Mediet holdes under røring ved 37°C i 3 timer og får deretter vende tilbake til ca. 20°C.

Fermenteringsforløpet kontrolleres ved mikroskopiske under-søkelser, bestemmelse av pH-verdien og den neuraminidasiske

aktivitet.

Ekstraksjonen av enzymet utføres ved fraksjonert felling..

i

aj__f ^rste_trinn

500 g/l ammoniumsulfat og 3 g hyflo supercel tilsettes for hver liter fermentat. Blandingen holdes under røring i 1 time og filtreres. Restkaken vaskes med en 40% vandig løsning av ammoniumsulfat. Den gjenværende pasta tas opp i vann ved +4°C

3 ganger med 5 liter..

^i_<a>DD§t_trinn

De 15 litere vaskevann tilsettes tilstrekkelig ammoniumsulfat til å gi en konsentrasjon på 250 g/l. Løsningen tilsettes også 40 g/l hyflo. supercel og røres 1 time. Hele blandingen filtreres under sug.

cj__tred je_trinn

Det foregående filtrat tilsettes 150 g/l ammoniumsulfat og 10 g/l hyflo supercel og blandingen røres 1 time. Fellingen fra-skilles ved•vakumfiltrering og de uløselige materialer vaskes med 4 0% vandig oppløsning av ammoniumsulfat. Den tilbakebliv-ende pasta tas opp med 2 ganger 2 liter vann ved 4°C. De resulterende løsninger slås sammen og dialyseres mot vann ved 4°C i 16 timer (vannutbytte 20 liter/time).

YI_Kromatigraf i_EÉ_!S5E^2!S§:Ym§£Yl£§ii-i2§§_i2M_23.1

En kolonne med 15 cm diameter og 100 cm høyde fremstilles for kromatografien. Den fylles med 1,6 kg CM 23 karboksymetyl-cellulose og vaskes med 55 liter 0,0025 M fosfatpufferløsning (ph 6,8).

De dialyserte ekstraktene klares først ved filtrering og just^eres til pH 6,8 ved tilsetning av 1 M sitronsyreløsning. De føres så på kolonnen og deretter påføres de til 15 liter av en 0,0025 M fosfatpufferløsning. Det fikserte N-acetylmuraminat-glykohydrolase elueres med 10-15 liter 0,2 M sitrat-• fosfat-pufferløsning (pH 6,8) ved et gjennomløp på 4 liter/timei

IHovedfraksjonen har et volum på ca. 5 liter og dialyseres deretter mot en strøm av 1% natriumkloridløsning i 16 timer ved +4°C (utløp 4 liter/time). Dialysatet lyofiliseres. Den ut-vunnede rest består av rått N-acetylmuraminat-glykohydrolase med en spesifikk aktivitet på ca. 500.

YII_B§D§Qi29_Y§^_]SE25}§É22ESli_El_§§El}§^§2_5_50 20 g av det forut erholdte råmateriale (svarende til 10 g proteiner bestemt ved Lowry's metode) oppløses i 150 ml 0,1 M fosfatsitrat-pufferløsning (pH 6,8) og føres på en kolonne fylt med sephadex G50 forut vasket med en 0,1 M fosfatsitrat-puf f erløsning . Etter fiksering vaskes kolonnen med den samme pufferløsning og 20 ml fraksjoner oppsamles. Fraksjonene som inneholder N-acetylmuraminidat-glykohydrolase samles, dialyseres mot en 1% natriumkloridløsning og dialysatet lyofiliseres. Den spesifikke aktivitet av det resulterende konsen-trat er ca. 20 000. Den bestemmes ved å måle mengden av sialsyre som frigjøres i 1 min. ved 37°C fra N-acetyl. neuraminyl-laktose i mg protein og uttrykkes i nanomol.

Den følgende tabell sammenfatter renseforløpet.

EKSEMPEL II

Mangel på immunologisk sammenheng mellom virus heuraminidaser og N-acetyl Muraminidat-glykohydrolase fra Streptococcus pneumoniae.

a) Forsøk på å nedsette neuraminidaseaktiviteten av N-acetylmur-aminidatglykohydrolase fra Streptococcus pneumoniae (stamme 1-044)

med serum fra kaniner forut immunisert med neuraminidaser av virus-opprinnelse gir ikke noen resultater. Neuraminidasene fra virus-opprinnelse kommer fra human Myxovirus Influenzae Singapore 57, Hong Kong 68, England 72, fra dyrestammer A equi I, A equi og

fra human Myxovirus parainfluenzae type 1, 2 og 3, klumper, Sendai SV 5.

b) Forsøk på å nøytralisere virusneuraminidasene med kaninsera forut immunisert mot N-acetylmuraminidat-glykohydrolase forblir

iinegative.

EKSEMPEL III

Virkning av N-acetylmuraminat-glykohydrolase på formeringen av influensavirus stamme A Port Chalmers 1/73 H^N2.

De forskjellige satsene av N-acetylmuraminat-glykohydrolase

fra Streptococcus pneumoniae (stamme 1-044) er blitt forsøkt

mot eggebitmetoden beskrevet av Fazekas. Eggebitene har blitt holdt i live i små kopper av Perspexplater som inneholder små

stykker av chlorio-allantoinmembran. " Cellene er blitt inokulert med A-virus Port Chalmers (0,1 ml fortynning + 0,9 ml kulturmedium som gir en infeksjonstyrke av virus lik 10 ID /0,1 ml). Etter inkubering i 6 timer ved 33°C tilsettes N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S.pneumoniae (0,1 ml fortynning 10 -2for en spesifikk aktivitet på 8000 og en konsentrasjon på 1 mg proteiner pr. ml).

Virkningen av enzymet på formeringen av virusen varer ca. 7 2 timer. Etter dette tidsrommet måles infeksjonsstyrken av den produserte virus ved bestemmelse av hemagglutineringsstyrken på eggebiter. De erholdte resultater er sammenfattet i tabell I. Alle forsøkene er utført ved å bruke samme fortynning, samme tider og samme proteinkonsentrasjon.

Virkningen av N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S.pneumoniae er blitt forsøkt ved inokulering hver sjette time med samme dose av enzymet. Virusen vokser i de første 6 timene på eggebitene inkubert ved 33°C. Etter 6 timer tilsettes N-acétyl-neuraminat-glykohydrolasen og inkuberingen utføres videre frem til 72. time. Infeksjonsstyrken bestemmes på lignende måte ved hemagglutinering ved bruk av røde blodceller fra høne i en 2% suspensjon.

Multiplikasjonskinetikken til influensavirusen med eller uten N-acetylmuraminat-glykohydrolase uttrykkes i tabell I. Den

viser at N-acetylmuraminatet-glykohydrolasen ifølge oppfinnelsen spiller en meget viktig rolle på formeringen av virusen.

I

1 I EKSEMPEL IV

Bestemmelse av virkning av N-acetylmuraminat-glykohydrolase

fra S. pneumoniae på rotte for formering av Myxovirus (ville stammer) i forbindelse med introduksjonstiden.

Første_f orsøk

N-acetylmuraminat-glykohydrolasen fra S.pneumoniae er blitt inokulert i kulturer av Myxovirus på eggebiter i en dosering på 2,7 U/ml/plate.

Virusens formering uten N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S.pneumonia utføres i 72 timer ved 33°C. Etter dette tidsrommet tas en del av kulturen ut og hemagglutineringsstyrken bestemmes, de gjenværende fraksjoner oppsamles og forenes i en samlig av fraksjoner. Hemagglutineringsaktiviteten, neuraminidaseaktiviteten fra denne samlingen og_infeksjonsstyrkene på embryonerte egg bestemmes. Samlingen reinokuléres videre på friske eggebiter. En ytterligere virusformering erholdes således etter 72 timer ved 33°. Fraksjoner av denne samles for de samme bestemmelser. De gjenværende porsjoner inokuleres på nytt for å gi en tredje virusmultiplikasjon under de samme eksperimentelle betingelser.

Lignende utføres tre etterfølgende formeringer av virus i nærvær av N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S.pneumoniae inokulert . den sjette timen i formeringstrinnet.

Den gjenværende del av sammenslåingene av hver formering høstet etter 7 2 timer konsentreres, renses så for å bestemme de morfologiske aspekter av virusveksten med eller uten N-acetylmuraminat-glykohydrolase.

Noen eggebiter belagt med et stykke ehorio-allantoinmembran tas ut etter 2 6 timer under formeringstrinnet for hvert trinn.

De fikseres i '2% glutaraldehyd for å vise at virusen har gått vekk fra membranen ved elektronmikroskopering. Andre fikseres i 1% glytaraldehyd for å utføre fryseetsinger og å bestemme noenj morfologiske forskjeller i de ikke-infiserte og infiserte, be-handlede og ubehandlede membraner..

i

<A2Q§£>_<f2Es>ø<k>

N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S-pneumoniae inokuleres

i kulturer av Myxovirus A2PC/7 3 og Myxovirus A2VIC /3/7.5 i en konsentrasjon på 0,5 U/ml/plate. De virologiske data av Myxovirus A2 VIC /3/75 er som følger:

De analytiske konstanter av den anvendte N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S-pneumoniae er som følger:

Forsøket utføres med de vanlige teknikker av eggebitene, bestemmelse av hemagglutineringsstyrke, bestemmelse av neuraminidaseaktiviteten og bestemmelse av infeksjonsstyrken (EID^q) på embryonerte egg.

Prepareringen av membranene utføres videre for inspeksjon ved elektronmikroskopering og fryseetsing.

Resultat

De således erholdte resultater er samlet i de følgende histo-grammer I, II og III. De viser at tilsetningen av N-acetylmuraminat-glykohydrolasen fra S-pneumoniae etter 6 og 24 timers' !dyrking av Myxovirusinfluenzae på eggebiter induserer en vekst-j

f

<I>hastighet som er 2 log 10 mindre enn de ubehandlede kulturer. Tilsetning etter 3 0 timers dyrkning har ennå en positiv virkning. Tilsetning etter 48 til 54 timers dyrkning induserer bare en

svak effekt.

EKSEMPEL V

Bestemmelse av veksthastigheten av influensavirus i nærvær av forskjellige mengder N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S-pneumoniae.

Løsninger av dette enzymet fremstilles.som inneholder 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1 mg proteiner pr. ml. En dose av hyer løs-ning (0,1 ml.10 2) inokuleres på viruskulturer på eggebiter med MCA og virkningene av enzymet på formeringshastigheten prøves.

Metode

§l_uDd§rsøkte_ stammer

Dyrkningsteknikken er publisert av Fazekas (1958). Etter 6

timers inkubering ved 33°C tilsettes kulturene en mengde av løsningen av N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S-pneumoniae i forskjellige konsentrasjoner. Formeringen fortsettes i 72 timer ved 3 3°C. Etter dette tidsrommet tas 0,1 ml av mediet ut i hver plate og formeringshastigheten til virusen bestemmes som en funksjon av den varierende konsentrasjon av N-acetylmuraminat-glykohydrolase (bestemmelse av hemagglutinerings- og

neuraminidaseaktiviteter). Videre utføres et hamagglutinerings-forsøk direkte i hver plate med en 0,2% suspensjon av røde blodceller fra høne som tillater en sammenligning mellom infeksjons-j styrken av virusen med og uten N-acetylmuraminat-glykohydrolasej.

t

i Resultater

De således erholdte resultater er samlet i tabellene II, III og

IV.

EKSEMPEL VI

"In vivo" studium av antivirusvirkning av N-acetylmuraminat-. glykohydrolase fra S-pneumohiae.

Aj__ Inhiber ende YiE3SDi23_Eå_£2£m§£iD2§D_5Y_iD£ i^SD§§Yi£y§ •

Den er blitt prøvet in vivo i satser av fritter hvortil en bestemt dose MRG 11 Myxovirus Influenzae er inokulert intrana-salt. 6 eller 18 timer senere gis en dose av N-acetylmuraminat-glykohydrolase samme veg.

Virkningen av N-acetylmuraminat-glykohydrolasen på'formeringshastigheten til virusen bestemmes ved måling som en tidsfunk-sjon av

--forsvinnen av inokulert virus

- bestemmelse av hemagglutineringsaktivitet.

- bestemmelse av neuraminidaseaktivitet.. • - bestemmelse av infeksjonstiter på egg i vattpinner fra strupen i forskjellige tidsintervaller etter inokulering av virusen (3 dager, 6 dager, 9 dager, 15 dager).

Lignende bestemmelser er utført på kontroller som fikk bare dosering av viruskulturen.

Enzymets virkning er også bestemt i fritter ved å måle senkning-en i produksjon av virusantihemagglutin og antineuraminidase antistoffer ved å søke de lokale antistoffer i vattpinnene fra strupe og søking i sera av sirkulerende antistoffer.

Satsene har fritter som har mottatt bare viruskulturene viser

de karakteristiske influensasymptomer. De nyser mye og seks dager etter infeksjonen renner snutene rikelig. Derimot viser... jfrittene som fikk N-acetylmuraminat-glykohydrolase ikke symo-

J /

«tomene.

§1 "lD_YiY2" _§tudie_av_den_inhiberende YiElSDiD3_Eå_f 2Em§£±D3§I !}§§£i9l}§£9D_§Y_iDf iy§D§^yiry§ •

Tre satser av fritter inokuleres i nesen med en enkelt dose

MRC 11-virus (1 ml allantoinblanding). N-acetylmuraminat-glykohydrolasen injiseres samme veg 6 timer etter inokuleringen av virus ved en enkelt infeksjon av en dose som svarer til 1 mg protein i 0,5 ml saltvannsoppløsning.

Vask av strupen ble utført hver tredje dag etter inokuleringen. Absorpsjonskinetikkene og virusformeringene i trakialcellene bestemmes med eller uten N-acetylmuraminat-glykohydrolase.

- en sats fritter fikk bare viruskulturen

- satser av fritter fikk viruskulturen og 6 timer senere N-acetylmuraminat-glykohydrolase. - satser av fritter fikk viruskulturen og 6 timer før denne inokuleringen N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S-pneumoniae. Vaskningen utføres i strupen hver tredje dag. Prøvene opp slemmes så i 1,5 ml Parker's survival medium og hamagglutiner-ings- og hemagglutineringsinhiberingsvirkriingen (HA titer mot MRC 11-virus bestemmes). En liten kardialpunktering utføres 15. og 21. dag etter inokulering for å bestemme den sirkulerende mengde antistoffer.

5§§yi£§£§£

Kontroller: satsene av fritter inokuleres med en enkelt dose MRC-virus ved null tid. 6 timer senere får de en saltløsning. Alle frittene viser meget tydelige symptomer på influensa fra sjette dag etter inokulering. En betydelig andel av frittene døde. De gjenværende overlevende fritter var fullstendig friske rundt 9. dag.

! .. i IHemagglutineringsstyrken - som viser nærværet av virusen - viser

i 'en.økning inntil 6. dag med et maksimum fra 3. til 6. dag,, av-tar deretter og forsvinner fullstendig den 15. dag.

Antihemagglutineringsantistoffene viser seg fra 6. dag og.øker tiltagende inntil .21. dag.

l§h§ndl§de_satser

Satsene av fritter som er blitt inokulert med viruskulturen

og 6 timer senere med N-acetylneuraminat-glykohydrolase fra ' S.pneumoniae viser litt nysing etter inokulering av viruskulturen. De således erholdte resultater er samlet i tabellene

V og VI.

EKSEMPEL VII

Klinisk studium av N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra S.pneumoniae.

Dé: farmasøytiske komposisjoner, ifølge oppfinnelsen er blitt prøvet på 9 familier bestående av 19 vokse og 8 barn.

gl_Dosering

De fikk tre ganger hver dag ved nesespray en\ vandig løsning av enzymet som inneholdt 333 enheter, pr. enhetsdosering 2 etter-følgende dager. De fikk tilsammen hver 4000 enheter N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra Streptococcus pneumoniae.

=l==i===åi=i=

17 pasienter fikk løsningen av enzymet etter infeksjon. De

viste en signifikant subjektiv bedring. Ingen bivirkninger er blitt påvist.

I Av de 12 frivillige som forebyggende fikk enzymløsningen ble •bare en dårlig. Derimot var 4 av 6 kontroller dårlige.

Claims

'".1. Fremgangsmåte ved fremstilling av farmasøytiske komposisjoner som inneholder som aktiv bestanddel N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra. Streptococcus pneumoniae i blanding eller forbindelse med en inert ikke-toksisk terapeutisk fordragelig farma-søytisk bærer eller hjelpestoff.
2. Fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske komposisjoner ifølge krav 1 karakterisert ved at den aktive bestanddel foreligger i en dosering på ca. 300 til 5000 enheter pr. enhetsdosering.
3. Fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske komposisjoner ifølge krav 1 karakterisert ved at bære-midlene eller hjelpemidlene er sådanne som er egnet for parenteral permucous, perkutan, eller rektal administreringsveg.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske komposisjoner ifølge krav 1 karakterisert ved . at N-acetylmuraminat-glykohydrolase fra Streptococcus pneumoniae fremstilles av stammen 1-044 deponert i Institut Pasteurs samling i Paris.