NO791690L - Fremgangsmaate for immunisering av fisk - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en bivalent vaksine

for beskyttelse mot vibrose. Vaksinen oppnås fra to serotyper av Vibrio anguillarum. Vaksineringen av fisk med vaksinen gjennomføres ved. enkel neddykking.

Vibriose, en bakteriesykdom hos all marin fisk er et alvorlig verdensomspennende problem i forbindelse med all intens dyrket marin fisk og er en av de begrensende faktorer ved dyrking av laksefisk. Sykdommen kan opptre på et hvilket som helst tidspunkt, og er meldt ved vanntemperaturer helt ned til 4°C. Imidlertid er den mest fremherskende i varme sommermåneder. Utbrudd kan forventes når vanntemperaturene når 14-20°C.

Vibriose forårsakes av organismen Vibrio anguillarum.

Denne bakterie er en gramnegativ bevegelig stav, vanligvis

lett krummet når den stammer fra friske isolater. Cellenes størrelse ligger innen området 0,5 x 1,4 ym til 10 x 2,7 ym.

De bevegelige organismer kan hyppig sees i våtsnitt av friske miltpreparater fra infisert fisk ved 900 gangers forstørrelse. Det er vanligvis en saltkrevende organisme, men kan finnes i brakkvannsområder med salthetsgrader ned til 5 promille.

Vaksinasjon mot vibriose vinner stadig i popularitet blant fiskeoppdrettere som en profylaktisk kontrollmetode. Imidlertid har mangelen på en hensiktsmessig og effektiv inn-givelsesmetode for masseimmunisering av fisk begrenset bruken av vaksiner for å kontrollere vibriose. Selv om diverse tek-nikker er tilgjengelige for masseinokulering, f.eks. oralinn-givelse, injeksjon, trykksprøytevaksinasjon (vanligvis med et trykk på ca. 6,3-7 kg/cm ) og fremgangsmåter med tvunget fluid- innløp slik som vakuuminflitrering og hyperosmotisk infiltre-ring har bortsett fra injeksjon gitt ikke-kvantitative vaksine-doser.

Innarbeiding av vaksinebakteriene i dietten er f.eks. et ønskelig avgivelsessystem på grunn av lettheten. Imidlertid er graden og varigheten for immuniteten som oppnås vanligvis mindre enn ved'injeksjon. Dette skyldes muligens vanskeligheten ved å sikre.enhetlig doseringsopptak i dietten. Med henblikk på injeksjonsteknikken er den iboende mangel åpenbar. Selv om fisken kan injiseres individuelt i begrenset skala, er indivi-duell injisering av millioner av små fisk ikke praktisk gjen-nomførbar. Manglene ved trykksprayvaksine er uanvendeligheten på småfisk som veier mindre enn 4 g og mulig hypersensitering til vaksinen av brukeren på grunn av den medfølgende aerosol-tåke som oppstår ved denne teknikk. En alvorlig mangel ved tvungen fluidstrømning er den traumatiske fysiologiske respons hos fisken overfor påkjenninger indusert ved disse trykkmeto-der .

Det er nå funnet at masseinokulering av marin fisk mot vibriose lett kan oppnås uten de ovenfor angitte mangler ved enkel neddykking uten trykk i en bivalent vaksine oppnådd fra Vibrio anguillarum.

Gjenstand for oppfinnelsen er således en vaksineoppløs-ning brukbar for immunisering av marin fisk mot vibriose.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å frem-bringe en slik vaksine omfattende bakterier oppnådd fra to serotyper av Vibrio anguillarum som immunogene midler.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å frem-bringe en fremgangsmåte for immunisering av marin fisk ved enkel neddypping uten trykk i den ovenfor angitte vaksineopp-løsning.

De hovedvirkende midler som er funnet å stå i forbindelse med vibriose er to serotyper av vibrio anguillarum angitt som Vibrio anguillarum 775 eller Type I og Vibrio sp. 1669

eller Type II (se f.eks. T.P.T. Evenul,"J. Fish. Res. Board Can." 28, 517 (1971) og L.W. Harrel et al., i "Fish Bull.", USA, 74, 447 (1976)). Når den levende virulent av disse to midler inngis til benfisk, vises de kliniske symptomer på vibriose inkludert død. Inngivelse av disse to levende virulente midler kan således

benyttes som en metode for å utfordre en potensiell vaksine for å prøve de immunogene egenskaper mot den samme. Vaksinen ifølge oppfinnelsen har i henhold til dette funnet å være effektiv ved immunisering av følsom fisk utsatt for infeksiøse doser av de to midler. Det antas således at vaksinen'ifølge oppfinnelsen kan benyttes for signifikant å kontrollere angrep av vibriose på;fisk.

De to virulente bakterielle midler, serotype I (775)

og serotype II (1669) som benyttes for fremstilling av vaksinen som nedenfor beskrives ble oppnådd fra National Marine Fisheries Service, Seattle, Washington.

Vibrio Anguillarum 77 5, Type I, ble isolert fra coho-laks (Oncorhynchus kisutch) i april 1973 ved National Marine Service, Manchester site, Washington. Isolatet som heri ble benyttet ble oppnådd fra National Marine Fisheries Service 16. juli 1976. Dette er en typisk marin vibrio; gramnegativ, bevegelige krumme staver, oksydase positiv, anaerogen fermen-ter, og følsom overfor den vibriostatiske forbindelse 0/129 (2,4-diamino-6-7-di-isopropyl pteridinfosfat).

Vibrio sp. 1669, Type II, ble isolert fra coho-laks november 1975 vedDomesa Farms, Nanchester, Washington. Isolatet som heri ble benyttet ble oppnådd fra National Marine Fisheries Service 2. august 1976. Dette er også en typisk vibrio, men skiller seg fra Type I som følger: (1) Serologisk forskjellig; (2) Arginine - Type II alkalisk reaksjon på Møller<1>s medium er negativ i motsetning til Type I's positive reaksjon; og (3) Type II produserer.ikke syre fra arabinose slik Type I gjør. Videre er den midlere generasjonstid noe langsommere.

Biokjemiske og serologiske profiler av typene I og II

er angitt av L. W. Harrell et al., ibid., i Tabell I på side 44.8.

Generelt krever foreliggende oppfinnelse at etter separat vekst av Vibrio anguillarum Type I og Type II celler i et egnet flytende næringsmedium fremstilles en vaksine ved avliving av cellene, fortrinnsvis ved kjemiske inaktiveringsmåter selv om andre slik som f.eks. varme kan benyttes, og deretter kombi-nasjon av de to inaktiverte bakteriepreparater med eller uten foregående justering av organismetelling til omtrent like nivåer.

Celler av Vibrio anguillarum kan dyrkes i et hvilket som helst sterilt flytende medium som kan oppfylle alle de metabolske krav slik som Bacto trypisk soyakraft eller vibriokraft (se eksempel VII) eller Bacto Furunculosismedia. Foretrukne temperaturer for veksten er 20 til 28°C og for maksimalt utbytte bør kulturene beluftes under veksten. Utbyttet kan også økes ved å tilsette glukose etter en 10 timers inkuberings-periode for å erstatte karbonkilden.

I foreliggende søknad beskrives en foretrukket utførel-sesform av oppfinnelsen under henvisning til utvikling av en bivalent vaksine fra de to ovenfor angitte isolater av Vibrio anguillarum Type I og Type II. Oppfinnelsen er imidlertid ikke ansett å være begrenset av disse spesielle isolater.

Injeksjoner av hver serotype fra de to ovenfor nevnte isolater til følsom "sockeye" laks (en stillehavslaks) ved 15 °C bekreftet virulens. Hver virulent serotype ble deretter isolert igjen ved å dyrke den infiserte nyreprøve fra den døende fisk, oppnådd ved å føre en steril nål inri i fiskenyren, på vibrio agar (se eksempel V) ved 20°C i 24 timer. Koloniene ble sjek-ket på renhet og typiske serologiske og biokjemiske reaksjoner bekreftet for hver serotype for derved å gi en ren subkultur

på vibrio agar for hver serotype. En "master seed" ble oppnådd ved deretter å dyrke hver serotype i forstøvningsdesikatorer (se eksempel VI) ved 20°C i 24 timer fulgt av lyofilisering i 2 ml ampuller som deretter lagres ved -70°C.

For hver serotype ble det fremstilt en "working seed" ved aseptisk å tilsette 0,5 ml vibriokraft (se eksempel VII) til en ampulle av lyofilisert "master seed". Innholdet av den dehydratiserte kultur ble deretter tilsatt til en 3 liters kolbe inneholdende 1500 ml vibriokraft» "Working seed" ble inkubert under omrøring ved 22°C i 24 timer for å gi tilstrekkelig vekst av den virulente organisme. Veksten ble målt ved å registrere turbiditeten. Etter 24 timers inkubering .ble det nådd en optisk tetthet på minst 0,8 ved bruk av et 13 mm rør i et spektrofotometer av typen "Spectronic 20" ved 525 nm.

De ovenfor angitte 1500 ml "working seed" ga inokulum for den respektive produksjonskultur for hver serotype: De 1500 ml ble tilsatt til 1200 liter vibriokraft i en 1800iliters rustfri stålfermenter. Produksjonskulturen ble inkubert ved 22°C i 48 timer under konstant omrøring og beluftning ved bruk av steril luft gjennom en spyleenhet i en mengde på 0,25 kubikk-fot, pr. minutt. pH-verdien for produksjonskulturen ble holdt mellom 7,2 og 7,4 ved tilsetning av ION natriumhydroksyd. Før inaktivering av de levende virulente organismer ble hver kultur undersøkt på renhet ved konvensjonell prosedyre, nemlig gramflekking, dyrking og serologisk reaksjon på spesifikke antisera.

Produksjonskulturene ble deretter kjemisk inaktivert ved tilsetning av 0,3% vol/vol formalin fulgt av inkubering ved 4°C i 48 timer. Det inaktiverte bakteriepreparat utgjorde bakteriemateriale for hver serotype. Hver bakterie ble prøvet på sterilitet før bruk, f.eks. ved standard prosedyrer med inkubering av vibriokraft og tioglykolatkraft i 14 dager ved 22°C og 37°C for å observere organismeveksten. Til hvert bakteriemedium ble deretter satt 1,2 g/liter oksytetracyklin hydroklorid som preserveringsmiddel. Forrådsoppløsningen av oksytetracyklin hydroklorid ble fremstilt ved å bruke 24 g pr. liter destillert vann og sterilisering av oppløsningen ved 121°C i 30 minutter.

De ovenfor angitte bakterieholdige preparater kan benyttes slik de er ved fremstilling av de heri nevnte bivalente vaksiner. Imidlertid kan det være ønskelig å ha bakterieinn-holdet i hvert preparat justert til i det vesentlige samme mengde serotyp, dvs. antall organismer pr. ml. I henhold til dette ble hvert bakteriepreparat fortynnet med 0,85% saltopp-løsning for å oppnå en optisk tetthet på 1,0 slik som beskrevet ovenfor, noe som ble funnet å være ekvivalent med ca. 1 x 10 9organismer pr. ml. For serotype I var det nødvendig med 4 ml saltoppløsning pr. 1 ml bakteriemedium og for serotype II med 2 ml saltoppløsning pr. 1 ml bakteriemedium for å oppnå en optisk tetthet på 1,0.

Den bivalente vaksine ble fremstilt ved å blande like volumer av hvert bakteriepreparat (1:1) for å oppnå et preparat inneholdende ca. 5 x 10 8 organismer pr. ml av hver serotype med en optisk tetthet på 1,0.

For bruk som sammenlignende kontroller ble hver av

de monovalente bakteriemedia fortynnet med det samme volum vanlig saltoppløsning (1:1) for på samme måte å oppnå 5 x 10<8>

organismer pr. ml. De følgende tre bakteriemedia var således tilgjengelige for prøving. 1. Bivalent vaksine Typene I & II...' 5 x 10 8 organismer/ml av hver type. 2. Monovalent bakterie Type I ... 5 x 10 8organismer/ml Type I. 3. Monovalent bakterie Type II ... 5 x 10 8organismer/ml Type II..

Hvert av de tre bakteriemedia ble deretter ytterligere fortynnet med vann eller vann inneholdende natriumklorid til en maksimal konsentrasjon på 0,85% (vanlig saltvann) i ti gangers inkrementer som følger: IO-1 (1:10), 10~<2>(1:100), 10~<3>(1:1000) og 10~4 (1:10.000). Disse fortynninger ble fremstilt for å sammenligne potensen for hvert preparat og for å bestemme om interferenser i immunisering kunne.oppdages ved å kombinere de to vibrioserotyper.

Antigen stoffer fremstilt ved fremgangsmåten som er angitt i den foregående beskrivelse ble bedømt i de følgende prøver.

Eksempel I

Separate grupper av omtrent 80 "sockeye" laks med en vekt på 8 g hver ble vaksinert ved neddypping av hver gruppe fisk i en av de ti gangers fortynnede saltoppløsninger av bakteriemedium som er beskrevet ovenfor i 2 minutter. Det ende-lige neddyppingsforhold var 4 54 g fisk pr. liter bakteriemedium. Kontrollene besto av å dyppe en separat gruppe fisk i vanlig saltoppløsning alene i 2 minutter. All fisk ble deretter holdt i 24 dager ved 10°C for å fremkalle immunitet.

Ca. halvparten av fisken fra hver gruppe ble deretter utsatt for Type I og den andre for Type II Vibrio anguillarum. Disse oppløsninger var i hvert tilfelle en 24 timers kultur

av hver serotype dyrket i vibriokraft ved 2 2°C. Hver kultur ble deretter fortynnet 1000 ganger med vanlig saltoppløsning som bad. Fisken ble anbrakt i dette bad i ca. 17 minutter. Det nøyaktige nivå for hver serotype var:

Type I ... 4,9 x 10 organismer pr. ml.

Type II... 2,1 x 10 organismer pr. ml.

Etter eksponeringen til disse bakterier ble fisken holdt ved 16°C i 14 dager. Dødsårsaken ble bekreftet ved iso- lasjon av organismer fra nyren av død fisk på vibrioagar fulgt av standardteknikker slik som kolonnemorfolo.gi, kornflekking, snittagglutinering og sensitivering overfor vibriostat 0/129.

Resultatene som ble oppnådd fra disse prøver er angitt i tabellene 1 og 2.

Fisk som var immunisert med Type II eller bivalent bakteriemedium ble beskyttet fra en Type II påvirkning, men immunisering med Type I resulterte ikke i signifikant beskyttelse mot Type II påvirkning (Tabell 1). Det bivalente Type J/ Type II bakteriemedium var like effektivt som monovalent •Type II bakteriemedium for beskyttelse av fisk fra vibriose. Det var ingen antigen interferens. Fortynninger på 10 ^ til 10 -3 viste meget effektiv beskyttelse og 10 _4 fortynninger.

var mindre beskyttende.

Påvirkning med Type I resulterte i høye tap av Type II vaksinatene mens Type I og bivalente grupper ble beskyttet (Tabell 2). Den 19%-ige dødelighet for utsatt kontrollgruppe var signifikant lavere enn 41%, 45% hhv. 57% dødelighet i de tre laveste fortynninger av Type II vaksinater (P=0,05). Det ble ikke observert noen antigen interferens i fortynningene i den bivalente gruppe. Beskyttelsen fra Type I preparater

-4

var ig^en mindre ved 10 ~ fortynningene.

En sammenligning av alle fortynninger av monovalent mot bivalent neddyppingsmedium viste ikke antigen konkurranse. Effektivitet ble observert ved en enkel neddypping uten signifikant tap av potens. Neddypping av fisk i bivalent bakteriemedium synes å være et effektivt immuniseringsmiddel.

Eksempel II

I denne prøve ble den bivalente vaksine som er beskrevet ovenfor fortynnet 10 ganger med vann i stedet for saltopp-løsning. En slik 10 gangers fortynning er den foretrukne feltdose for kommersielle fiskerier. I tillegg ble det 1:10 van-dige bakteriemedium ytterligere fortynnet 1:1 med vann hvorved det ble oppnådd et 1:20 vandig bakteriemedium tilsvarende halvparten av den anbefalte feltdose. "Sockeye" laks med en gjennomsnittsvekt på 2,6 g ble dyppet i disse oppløsninger i 2 min. og deretter utsatt for Type I eller Type II Vibrio anguillarum i 20 minutter som angitt i de følgende tabeller 3 og 4. Den kumulative dødelighetsprosent ble anført.

Eksempel III

Dette eksempel viser en annen vandig neddyppingsvaksi-nasjonprøve ved bruk av chinook laks med en gjennomsnittlig vekt på 2,5 g. 1:10 og 1:20 fortynningene av bivalent bakteriemedium ble fremstilt som i eksempel II. Fisken ble neddyppet i disse fortynninger i 2 minutter og deretter utsatt for de doser som er angitt i tabell 5 av Vibrio anguillarum Type I i 20 minutter. Prosentandelen kumulativ dødelighet ble anført.

Eksempel IV

Dette eksempel viser at neddyppingstider på mindre enn 2 min. kan benyttes for effektivt å immunisere fisk med det bivalente bakteriemedium ifølge oppfinnelsen. "Sockeye" laks med en gjennomsnittsvekt på 2,5 g ble neddyppet i de'vandige 1:10 og 1:20 fortynninger som er beskrevet i eksempel II for tidsrom på 5, 15, 30, 60 og 120 sekunder. Ca. 40 fisk ble prøvet i hver gruppe. En separat gruppe ble plassert i vann i 120 sekunder som en prøve. Etter neddypping i bakteriemedie-fortynningen, ble fisken holdt ved 10°C i ca. 30 dager før den ble utsatt for påvirkning. Denne påvirkning ble gjennom-ført med Vibrio anguillarum Type I på to forskjellige nivåer (8,4 x 10 5 og 1,7 x 10 5 organismer pr. ml). Disse oppløsnin-ger ble fremstilt fra 1 24 timers kraftkultur av Vibrio anguillarum Type I inneholdende 8,4 x 10 g organismer pr. ml, fortynnet med vann til 1:1000 hhv. 1:5000. Fisken ble neddyppet i påvirkningsoppløsningen i 20 minutter og deretter holdt ved 18°C i 10 dager. Død fisk ble fjernet fra hver gruppe daglig. Standard prosedyrer, ble benyttet for å bekrefte vibriose som dødsårsak. Prosentual dødelighet og den relative prosentuale overlevelse RPS ble beregnet. Disse resultater er angitt i tabell 6.

Effektiviteten ved neddyppingstiden ble bestemt ved å sammenligne tapet av immunisert fisk med tapet av ikke vaksi-nerte kontroller. Dødeligheten for ikke immuniserte kontroller var 9 6,4% ved 8,4 x 10 5 organismer pr. ml påvirkningsnivå og 74,4% ved 1,7 x 10 organismer pr. ml nivåer. Dødeligheten var derfor tilfredsstillende for potensutprøving ved hvert påvirkningsnivå. Overlevelse i alle grupper inkluderte alle neddyppingstider som ble prøvet og begge immuniseringsnivåer og var 82,2% eller større (dvs. statistisk signifikant) slik at alle prøvegrupper passerte tilfredsstillende potensprøven. Beskyttelsen var ca. den samme i alle grupper og generelt var fisk neddyppet i 5 sekunder like godt beskyttet som de som var neddyppet i 120 sekunder.

TABELL 6. Sammenligning av dødeligheten og overlevelse for "sockeye" laks immunisert ved neddypping i bivalent bakteriemedium i forskjellige tidsintervaller og ved to doseringer av bakteriemedium.

a = 8,4 x 10 organismer pr. ml

b = 1,7 x IO<5>organismer pr. ml

c = RPS = relativ prosent overlevelse

Eksempel V

Følgende resept ga 1000 ml Vibrio Agar.

Bestanddelene ble blandet i egnede beholdere, f.eks. 1500 ml mengder i en 3 liters kolbe og deretter sterilisert, f.eks. ved autoklavering ved 121°C.

Eksempel VI

Den følgende resept ga 4000 ml tåkedesikans.

Destillert vann, q.s. ad 1000 ml

Sterilt hesteserum, q.s. ad 4000 ml

De første fire bestanddeler kombineres og steriliseres, f.eks. ved filtrering gjennom et 0,22 ym membranfilter. Etter sterilisering ble sterilt hesteserum tilsatt og det sterile medium dispensert til egnede sterile beholdere. Mediet som under-søkes på eventuell forurensing før bruk, lagres ved 2-8°C inn-til bruk eller i et tidsrom ikke lenger enn 120 dager.

Eksempel VII

Den følgende resept gir ca. 1 liter vibriokraft.

Destillert vann, q.s. ad 1000 ml

B. Antiskummingsmiddel ..5 ml.

Bestanddelene i del A kombineres, og helles på egnede beholdere. Antiskummingsmidlet, "Medical Antifoam C Emulsion" i del B ble deretter tilsatt under omrøring. Beholdere og den ferdige blanding ble deretter sterilisert, og f.eks. ved autoklavering ved 121°C.

Fra den ovenfor angitte beskrivelse og de gitte eksemp-ler er det åpenbart at foreliggende oppfinnelse tilbyr en fremgangsmåte for fremstilling av en bivalent vaksine for immunisering av fisk mot vibriosykdommer og som omfatter: a. Å inokulere en flytende bakteriologisk kultur som tilfredsstiller alle metabolske krav for bakteriene Vibrio anguillarum med vibrioserotypen Vibrio anguillarum 77 5; b. inokulering av et andre.slikt kulturmedium med . vibrioserotypen Vibrio sp. 1669; c. inkubering av hvert inokulert kulturmedium ved en temperatur og i et tidsrom tilstrekkelig til å gi et vesentlig antall bakterieceller;

d. inaktivering av hvert kulturmedium; og

e. grundig å blande de to inaktiverte kulturmedier.

Foregående prøveresultater viser også at den beste beskyttelse mot vibriose oppnås når foreliggende vaksine omfatter en immunologisk virksom mengde av de to beskrevne bakteriemediekomponenter sammenlignet med hver av de monovalente bakteriemediekomponenter alene fordi kryssbeskyttelse ikke var påvist. Konsentrasjonen av hver bakterie i foreliggende biva-4 5

lente vaksine bør være minst 10 og fortrinnsvis fra 10 til 10<9>. inaktiverte organismer pr. ml vaksine. Høyere konsentra-sjoner er også egnet/men ansees unødvendig med henblikk på effektiviteten av sluttproduktet. Den mest foretrukne konsentrasjon for hvert bakteriemedium er fra 10 6 til 10 8 organismer pr. ml. Det skal påpekes at konsentrasjonen av hvert bakterié-medium i den foreliggende bivalente vaksine ikke behøver være den samme.

Som tidligere vist, omfatter fremgangsmåten for immunisering enkel neddypping av fisken i den bivalente vaksine i et tidsrom tilstrekkelig til. å gi immunitet, vanligvis minst 5 sekunder og fortrinnsvis fra 5 til 120 sekunder, selv om.-lengere perioder kan tolereres.

For feltbruk benyttes den foreliggende bivalente vaksine fortrinnsvis i form av et konsentrat som på enkel måte kan for-tynnes, f.eks. med vann eller saltoppløsning, til den ønskede effektive konsentrasjon av bakteriemedium. I henhold til dette omfatter foreliggende oppfinnelse fremstilling som beskrevet ovenfor av slike konsentrerte vaksiner som f.eks. ved egnet fortynning, f.eks. 1:1 til 1:20 (vaksine:fortynningsmiddel) i et neddyppingsbad med en konsentrasjon på minst 10 4 av hver av de inaktiverte organismer pr. ml bad.

Temperaturen i neddyppingsbadet er ikke vesentlig og grensene bestemmes av fisken. Imidlertid kan immunitetens be-gynnelse variere direkte med temperaturen. F.eks. er det be-merket at immuniteten oppnås etter ca. 4 0 dager ved 4°C mens den bemerkes ved 5-10 dager ved 18°C. Den foretrukne temperatur for neddyppingsbadet er fra 8 til 15°C.

Det skal være åpenbart at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til immunisering kun av de fisker som er. angitt ovenfor, men inkluderer annen benfisk slik som regn-bueørret, gullfisk, flyndre, forskjellige laksetyper, ål osv.

I tillegg skal det være åpenbart at oppfinnelsen ikke er begrenset til den spesielle utførelsesform eller de meto- . der som er beskrevet, men omfatter alle slike modifiserte former som kan. ligge innenfor rammen av de foreliggende krav.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for immunisering av fisk mot vibriosyk-dom, karakterisert ved at den omfatter å dyppe fisken i en bivalent vaksine omfattende en immunologisk effektiv mengde av avlivede organismer Vibrio anguillarum 775 og Vibrio sp. 1669 i et tidsrom tilstrekkelig til å gi fisken immunitet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved neddypping av fisken i en bivalent vaksine omfattende en immunologisk effektiv mengde av avlivede organismer Vibrio anguillarum 775 og Vibrio sp. 1669 i en konsentrasjon på minst 10 4 av hver organisme pr. ml vaksine i minst 5 sekunder.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at konsentrasjonen er fra 10 6 til 10 8 av hver organisme pr. ml vaksine.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at neddyppingstiden er fra 5 til 120 sekunder.

5. Bivalent vaksine for immunisering av fisk mot vibriosykdommer, karakterisert ' ved en immunologisk effektiv mengde av avlivede organismer Vibrio anguillarum 775 og Vibrio sp. 1669.

6. Bivalent vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved avlivede organismer Vibrio anguillarum 775 og Vibrio sp.

1669 i en konsentrasjon på minst 10^ av hver organisme pr. ml vaksine.

7. Vaksine ifølge krav 6, karakterisert ved 6 8 at konsentrasjonen er fra 10 til 10 av hver organisme pr. ml vaksine.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en bivalent vaksine for immunisering av fisk mot vibriosykdommer, karakterisert ved at den omfatter: a. Å inokulere en flytende bakteriologisk kultur som tilfredsstiller alle metabolske krav for bakterien Vibrio anguillarum med vibrioserotypen Vibrio anguillarum 775; b. inokulering åv et andre slikt kulturmedium med vibrioserotype Vibrio sp. 1669; c. inkubering av hvert inokulert kulturmedium ved en temperatur og i et tidsrom tilstrekkelig til å gi et vesentlig antall bakterieceller; d. inaktivering av hvert kulturmedium; og e. intimt å blande de to inaktiverte kulturmedier.