NO793101L

NO793101L - Fremgangsmaate for enzym-tilbakefoering.

Info

Publication number: NO793101L
Application number: NO793101A
Authority: NO
Inventors: George H Emert; Paul J Blotkamp
Original assignee: Gulf Oil Corp
Priority date: 1979-04-27
Filing date: 1979-09-27
Publication date: 1980-10-28
Also published as: FR2455081B1; GB2047709B; NL7908082A; FR2455081A1; CA1128884A; DE2943684A1; JPS55144885A; SE7907773L; DK104280A; BE882926A; US4220721A; GB2047709A; FI792997A7; SE443802B

Abstract

Fremgangsmåte ved enzym-tilbakeføring.

Description

Utnyttelse av avfallscellulose ved forsukringer til sukkeret og samtidig fremstilling av encelleprotein og ved forsukringer-fermenteringer til alkoholer, syrer og liknende, har ført til forskning etter nye, mer aktive og rimeligere kilder for en enzymcellulase.

En av metodene som har vært benyttet er å lete etter sopper og soppmutanter som naturlig fremstiller høye utbytter av enzymer når de dyrkes på utvalgte næringsmedia.

En annen metode er å bruke om igjen enzym som allerede, har katalysert en eller flere forsukringsreaksjoner ved til-bakeføring av enzymet'. U.S.- patent nr. 4 . 009 .075 beskriver i detalj en fremgangsmåte for vakuumdestillasjon av en forsukrings-fermentéringsreaksjon for å gjenvinne flyktige produkter,

i dette tilfellet etanol-vann, ved en temperatur, under de-komponeringspunktet for enzymet, og å bruke opp igjen den gjen-værende reaksjonsoppløsning inneholdende enzymet i etterfølg-ende forsukrings-fermentéringsreaksjoner. Denne siste prosedyre kan tilpasses på tilbakeføring av cellulase fra en reaksjon som gir et flyktig produkt i stand til å fjernes fra reaksjons-beholderen ved en temperatur der enzymet er stabilt, det vil si under 35°C, slik som f.eks. beskrevet i U.S. patent 3.990.045.

Imidlertid er den energi som er nødvendig for å vakuum-destillere etanol fra reaksjonsblandingen ved tilstrekkelig lav temperatur for ikke å nedbryte enzymene, av tilstrekkelig størrelsesorden til at alternative måter er atraktive ved til-bakeføring av det aktive enzymsystem eller en del av dette.

Det er tidligere påvist at cellulase er sammensatt av minst tre større aktive komponenter som er virksomme ved nedbrytning av cellulose til glukoseenheter. Disse komponenter kalles her for hensiktsmessighetens skyld, cellubiohydrolase, endoglucanase og B-glucosidase. Av disse komponenter er cellobiohydrolasen (E.C.3.2.1.91) ansett som ansvarlig for hydrolysen av cellulose med samtidig fremstilling av cellobiose-rester, endoglucanasen (E . C. 3 . 2 .1. 4 ) er ansvarlig for spalting av cellulosen internt på virlkårlige punkter, med samtidig fremstilling av oligosakkarider med lavere molekylvekt, og glukosidasen (E.C.2.2.1.21) som, selv om den ikke er cellu-losenedbrytningsenzym på samme måte som de ovenfor nevnte stoffer, katalyserer dekomponeringen av cellobiose til glukose.

Det har også vært vist at ren cellulose slik som f.eks. "Avicel", absorberer og binder cellobiohydrolase og endoglucanase, og kan således konsentreres,';- fra vandige blandinger.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for tilbakeføring og bruk om igjen av cellulasekomponenter ved samtidig forsukring og fermentering av avfallscelluloseholdige stoffer.

Mere spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for tilbakeføring og bruk om igjen av cellulasekomponenter ved samtidig forsukring og fermentering av avfallscelluloseholdige stoffer, omfattende adsorpsjon av minst to komponenter i cellulaseenzymsysternet på eri friskt fremstilt andel av avfalls-cellulosematerialet og bruk av enzym-avfallscellulosekombina-sjonen som en andel av råstoffet til en ytterligere kombinert forsukring og fermentéringsreaksjon.

Under forsukring av cellulose i nærvær av enzymet cellulase i vandig suspensjon blir de faste cellulosestoffer gjort flytende og oppløses i vann. Avhengig av krystallini-teten og cellulosens tendens til nedbrytning vil ca. 20-80%

faste stoffer forsvinne fra suspensjonen. Av de tre hoved-komponenter i cellulaseenzymsystemet bindes to, cellubiohydrolase og endoglucanase, til fast cellulose og frigis under nedbrytning og flytendegjøring til den vandige oppløsning. Den tredje, B-glucosidasen, bindes ikke til cellulosen og forblir i vandig fase hele tiden. Ved eller nær fullføring av forsukringsreaksjonen er komponentene i cellulasen således i opp-løsning og tilgjengelige for egnede gjenvinningsmetoder.

Det er nu funnet at cellulasekomponentene bibeholder

sin aktivitet og også foreligger i oppløsning etter en sam-

tidig forsukrings-fermentéringsreaksjon som forårsaker ned-

brytning av cellulose til etanol. Videre inhiberer nærvær av etanol ikke gjenvinningen av cellobiohydrolase og endoglucanase fra oppløsningen.

Videre er det oppdaget at å øke konsentrasjonen av kun endoglucanase og cellobiohydrolase i en samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon kan forbedre graden og utbyttet av etanolgjenvinning. Under samtidig forsukring-fermentering forbedres den enzymkatalyserte nedbrytningshastighet for cellulose til et punkt der glukoseinnholdet i produktet øker hurtig-ere enn gjæren kan forbruke den ved omdanning til etanol. Ved gjenvinning og bruk om igjen av enzymkomponentene som kan adsorberes på cellulose, kan man således ikke bare bevare enzymkomponentene, men også forbedre utbyttet og gjenvinningshas-tigheten for etanol fra en foregående samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon.

Adsorpsjonen gjennomføres fortrinnsvis ved å filtrere reaksjonsblandingen for å fjerne faststoffene og deretter adsorbere enzymene fra filtratet ved å føre reaksjonsoppløs-ningene gjennom en løst pakket plugg av en andel av celluloseholdig utgangsmateriale, som skal benyttes for etterfølgende samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjoner.

Denne plugg inneholdende gjenvunnet endoglucanase og cellobiohydrolase kan kombineres med ytterligere utgangsmateriale, inkludert ytterligere enzyminoculum for å nå dene opprinnelige konsentrasjon av B-glucosidase, hvoretter det hele underkastes forsukrings-fermentering på vanlig måte. Alternativt tilsettes tilstrekkelig friskt inoculum til å gjenopp-rette den vanlige opprinnelige konsentrasjon av cellobiohydrolase og endoglucanase. Dette gir et underskudd på (3-glucosidase, cellobiosehydrolyseringsenzymet. Manglene på g-glucoidase påvirker imidlertid ikke i vesentlig grad utbyttet eller hastig-heten for etanoldannelsen selv om de vanligvis benyttede gjær-typer som fermenterer glukose til etanol, slik som f.eks. Saccharomyces cerevisiae, Candida brassicae og Rhizopus javanicus, ikke i vesentlig grad fermenterer cellobiose til etanol.

Som en ytterligere prosedyre kan den vandige etanol-oppløsning hvorfra endoglucanasen og cellobiohydrolasen gjenvinnes, filtreres gjennom en plugg av et oligosaccharid av 6 eller flere glukoseenheter i laktonform. Oligosaccharidlaktonet binder 3-glucosidasefraksjonen som også kan tilsettes til den etterfølgende forstkringsreaks jon. Alternativt kan 3-glucosidase adsorberes på conconavalin A, et hemagglutiniserende protein

som er isolert fra "jack bean". Conconavalin A er kommersielt tilgjengelig som Con A og Con A sefarose.

Avfallsstoffer som inneholder cellulose som tidligere

er beskrevet som potensielle kilder for nedbrytning til enkle organiske molekyler med samtidig fremstilling av et protein til bruk som dyrefor, er også brukbare som adsorpsjonsmidler for en enzymtilbakeføringsprosess. Kilder for slikt avfalls-materiale inkluderer kommunalt avfall, papirfabrikkavfall., sag-brukavfall, og liknende. Av spesiell anvendelighet er avfalls-papir og -papp som kan forsvelles eller omgjøres til masse og som danner en løst pakket plugg som kan brukes for filtrering eller for oppslemningsadsorpsjon, og som inneholder tilstrekke-lige overflateplasser for enzymadsorpsjon.

Alternativt kan et renset celluloseprodukt brukes som adsorpsjonsmiddel som deretter tilsettes til utgangsstoffet.

En slik renset cellulose er kommersielt tilgjengelig under betegnelsen "Avicel".

Når en samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon er ferdig, dvs. at den er gått frem til vesentlig likevekt, inneholder reaksjonsmediét ikke omsatt cellulose, faste oligo-saccharider, lignocellulosestoffer og andre ikke definerte faste nedbrytningsprodukter, såvel som alkohol, næringsstoffer, cellulaseenzymkomponenter og gjær og gjærceller.

Filtrering for å fjerne de faste stoffer er vanligvis

det første trinn for rensing av deønskede etanolprodukter. Filtratet underkastes deretter en vakuumstripping. for å fjerne etanolen. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjenvinnes enzymene fra forsukringsreaksjonen og disse tilbakeføres før etanolstrippingen.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir et hvilket

som helst celluloseholdig fast stoff med tilstrekkelig over-flateareal til å gi bindingsplasser for enzymene brakt i kon-, takt med det enzymholdige filtrat fra en samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon som har nådd i det vesentlige likevekt. Kontaktmetoden kan være å tilsette cellulose-faststoffer for

å danne en oppslemming og hurtig filtrering av denne for å gjenvinne enzym-cellulosefaststoff eller ved å føre det enzymholdige filtrat gjennom en plugg av løst pakket cellulosefast-stof f.

For å oppnå den hurtige binding som er nødvendig ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det fastslått at kon-takten må skje ved en pH over 5 og ved én ionestyrke over 0,05M. Ved ionestyrker fra 0,05M til 0 vil enzymene ikke bindes og det oppstår eluering, og ved pH-verdier under ca. 4,8 vil det samme inntreffe. Fordi, imidlertid, enzymene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir adsorbert på et substrat som de selv kan bringe til en nedbrytning under egnede reaksjonsbetingelser, og derved frigjøres til mediet, gjennomføres fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen videre ved å kombinere blandingen av cellulose og adsorbert enzym med frisk cellulose i en etterfølgende, samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon uten mellomliggende eluering.

Ved en pH verdi over ca. 8 er- 'endoglucanasevirkningen tapt ved denaturering av proteinet. Av denne grunn må adsorp-sjonenskje ved en pH verdi mellom 5 og 8, fortrinnsvis mellom ca. 5 og ca. 7.

Fordi, som nevnt ovenfor, enzymkomponentene hurtig bevirker nedbrytning og flytendegjøring av celluloseadsorpsjonsmidlet, en reaksjon som skjer ved temperaturer over ca. 30°C, er det ønskelig å gjennomføre adsorpsjonen ved temperaturer ved eller under omgivelsestemperatur for å inhibere nedbrytning av celluloseadsorpsjonsmidlet. Temperaturer fra ca. 5 til ca. 20°C er foretrukket.

Når forsukrings-fermentéringsreaksjonen er ferdig, vil noen faststoffer være igjen, og disse kan omfatte ikke omsatt cellulose og faste nedbrytningsprodukter, lignocellulosestoffer, ikke reaktive faste komponenter fra utgangsavfållsstoffet og liknende. I og med at en del av cellulosen vil forbli i denne akkumulering av ikke-reaktive produkter er utbyttet av gjenvunnet cellulose ikke teoretisk og nytt, friskt enzym må også benyttes. Behovet for ekstra enzym avhenger av mengden og arten av faste stoffer i reaksjonsblandingen og kan kun fast-slåes ved prøving av det gjenvundne enzym.

Denne metode benyttes fordelaktig for å øke mengden av cellulose-hydrolyse-hastighetsbestemmende enzymer ved å tilsette friskt inocolum til en standard 3-glucosidaseaktivitet eller fremgangsmåten kan benyttes for å økonomisere på bruken,, av friskt inocolum for å sikre et standard endoglucanase-eller cellobiohydrolasenivå.

Cellulase inoculum som kan brukes ifølge oppfinnelsen kan kommersielt oppnås som "Meicelase P" eller fremstilt som en metabolitt fra dyrking av Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Fusarium solani, Fusarium javanicum og liknende. Fremstillingsmåte for den vandige kulturmasse inneholdende det cellolytiske enzymkompleks er konvensjonell, mikroorganismene dyrkes på kjent måte i et vandig næringsmiddel i nærvær av et cellulosemateriale i ristekolber eller som neddykket kultur. Typiske metoder er beskrevet i en artikkel "Advances in Chemistry" Mandels&Weber, ACS 95, 39-414 (1969).

Fortrinnsvis blir den vandige kulturmasse eller en del derav benyttet direkte i celluloseforsukringsprosessen uten ytterligere behandling bortsett fra å justere pH verdien hvis dette er nødvendig slik det er beskrevet av Huff&Yata i U.S. patent nr. 3.990.945.

Som alkoholproduserende mikroorganisme som skal benyttes samtidig med cellulasen, kan man benytte slike mikro-organismer som f.eks. Saccharomyces cerevisiae og Rhizopus javanicus som tidligere har vært benyttet for omdanning av glucose til etanol.

Tilbakeføringsprosedyren for cellulasekomponentene

kan tilpasses satsvis drift slik det skal beskrives nærmere nedenfor. Man må ved adsorpsjon av enzymet på cellulose og over-føring av dette påse at det skjer ved rimelig hastighet fordi enzymkomponentene som er adsorbert vil oppløseliggjøre cellulosen heller hurtig på grunn av deres katalytiske virkning på hydrolysen. Når oppløseliggjøring først er inntrådt, vil enzymet selv om det fremdeles er adsorbert på de oppløselige oligosakkarider, gå tapt til den overstående væske. Prosessen kan også tilpasses halvkontinuerlig drift ved bruk av mot-strømskolonneadsorpsjon hvori forsukringen-fermenteringspro-duktet etter filtrering motstrøms tvinges gjennom en konsen-trert oppløsning av en andel av det celluloséholdige utgangs-

stoff. Ved denne teknikk er det viktig å begrense kontakt-tiden for å minimalisere den forsukring som skjer i over-føringskammeret. Som beskrevet ovenfor kan oppløsning av cellulose uten fullstendig nedbrytning til glukose inntre i adsorp-sjonskammeret, noe som vil fjerne steder for adsorpsjon av enzymet.

Eksempel I

To like 1 liters kolber (merket A og B) ble det tilsatt: 229 g av en vandig oppslemming av såkalt "hydropulped pulp mill fines" inneholdende 6% cellulose;

200 ml av en cellulaseoppløsning med følgende be-skrivelse:

Filterpapir-reduksjonsvirkning i henhold til Mandels

og Weber, "The Production of Cellulases" Advances in Chemistry Series, ACS 95,391-414 28.20xl0~<3>, B-glucosidase i henhold

til Emert, "Purification and Characterization og Cellobiase from Trichoderma viride, University of Microfilms 74-12,343, Virginia Polytechnic Instityte and State University 1973, side 28-29, 106.60 x 10 -2,\og protein i henhold til Emert, Loe.eit. side 34, 4,4 0 mg/ml; 2 50 ml av et næringsmedium bestående av følgende 15 bestanddeler pr. liter oppløsning:.

KH2P04 2.2 g, MgS04'7H20 0,5 g, KC1 1,7 g, K sitrat monohydrat 4,0 g sitronsyre monohydrat 0,8 g, CaCl2 0,25 g, urea 2,5 g, gjærekstrakt 1,0 g, FeS04" 7H20 10 mg. MnS04<*>H20 10 mg, ZnS04"7H20 10 g, CuS041 mg;

21 ml vann; og

2 5 ml av en suspensjon av Saccharomyces cerevisiae ATCC 4132 med en celletelling på 200-250 x 10 6 celler/ml som tidligere var dyrket i 18 timer. Innholdet i kolbene ble omrørt ved 150 omdr./min. og 40°C i 72 timer.

Under den ovenfor angitte reaksjon ble ytterligere duplikater prøvet på 229. g hver av de ovenfor angitte stoffer, dynket i en oppløsning av 0,04 m acetatbuffer ved pH5 i 5 min. oa filtrert for å fjerne i det minste det væskevolum som re-presenterte bufferen.. Innholdene i kolbene A og B ble sentri-fugert og den overstående væske tilsatt de bufrede prøver av findelte stoffer i en kontakttid på 15 min.,dg deretter filtrert for å fjerne i det minste mengden av tilsatt væske.

Den resulterende blandingen angitt som 3 og 4, og to kontrollblandinger, angitt som 1 og 2, hver inneholdende 229 g finoppdelte stoffer ble behandlet på følgende måte: To hver ble tilsatt 25 ml av.det ovenfor angitte næringsmedium, 200 ml cellulaseoppløsning som er beskrevet ovenfor, 25 g gjæroppløs-ning, beskrevet ovenfor, og nok vann til å oppnå en total vekt på 500 g. Blandingene ble tillatt å reagere ved 40°C og 150 omdr./min i 168 timer. Glukose og etanolkonsentrasjonene og om-danningsgradene ble bestemt etter 48, 72, 96, 14 4 og 168 timer.

Prøvene 3 og 4 som var brakt i kontakt med ovenstående. væske, oppnådd fra den foregående reaksjon, viste øket etanol-utbytte og omdanningsgrad, opptil 168 timer reaksjonstid. Fremgangsmåte for tilbakeføring av endoglucanase (E.C.3.2.1.4) og cellobiohydrolase (E.C.3.2.1.91) deler av cellulaseenzymer som har vært brukt som cellulosehydrolyserings-enzym i en samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon av cellulose-til-etanol,karakterisert vedat den omfatter: (1) å separere væskefraksjonen fra reaks jons.blandingen; (2) å bringe dette enzym og den alkoholholdige væskefraksjon i kontakt med et celluloseholdig, fast stoff som kan brukes for samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon ved en pH-verdi mellom ca. 5 og ca.8l<;>og over en ionestyrke på 0,05M for å adsorbere enzymene; (3) separering av den faste fraksjon inneholdende ad-sorberte enzymer; og

(4) å benytte den faste enzym-cellulosekombinasjon

som en andel av råstoffet til en ytterligere samtidig forsukrings-f ermentéringsreaks jon .

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertv e d at enzymet og den alkoholholdige væskefraksjon og det celluloseholdige faststoff bringes i kontakt med hverandre mellom ca. 5 og ca. 20°C. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertv e d at enzymet og den alkoholholdige væskefraksjonen og det celluloseholdige faststoffet bringes i kontakt ved å tilsette faststoffet til væsken for å danne en oppslemming. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertv e d at enzymet og den alkoholholdige væskefraksjonen og det celluloseholdige faststoff bringes i kontakt med å helle væsken gjennom en løst pakket plugg av faststoff. 5. En serie samtidige forsukrings-fermentéringsreaksjoner for fremstilling av etanol fra cellulose,karakterisert vedat den omfatter å gjennomføre en samtidig

-forsukrings-fermentéringsreaksjon til i det vesentlige reak-sjonslikevekt, separering av væskefraksjonen, og kontakte væskefraksjonen med cellulose brukbar for en etterfølgende samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon ved en pH-verdi mellom ca. 5 og ca. 8 og over en ionestyrke på 0,05M, for å adsorbere endoglucanase- (E.C.3.2.1.4) og cellobiohydrolase-

(E.C.3.2.1.91) andelene av cellulaseaktiviteten derfra, separere den faste fraksjon, tilsetning av den faste fraksjon til den etterfølgende samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon, og tilsetning av friskt cellulaseinoculumet for å supplere

cellobiohydrolase og endoglucanase til standard nivå.

6. En serie samtidige forsukrings-fermentéringsreaksjoner

for fremstilling av etanol fra cellulose,karakterisert vedat den omfatter å gjennomføre en samtidig forsukrings-f ermentéringsreaks jon til i det vesentlige reaksjons-likevekt, separering av væskefraksjonen derfra, og kontakte væskefraksjonen med cellulose brukbar for en etterfølgende samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon ved en pH-verdi mellom ca. 5 og ca. 8 og over en ionestyrke på 0,05M for å adsorbere endoglucanase (E.C.3.2.1.4) og cellobiohydrolase-(E.C.3.2.1.91) andelene av cellulaseaktiviteten, separering av den faste fraksjon, tilsetning av den faste fraksjon til en etterfølgende samtidig forsukrings-fermentéringsreaksjon og tilsetning av frisk cellulase inoculum for å supplere 8~glucosidase-(E.C.3.2.1.21) enzymaktiviteten til standard nivå.