NO821233L - Hoeyrenset informatorisk ribonukleinsyre (i-rna), fremgangsmaate for fremstilling derav og anvendelse derav - Google Patents

Description

Oppfinnelsens gjenstand, er i-RNS ( " inf ormatoriske"', tidligere også kalt "immun" ribonukleinsyre) som er spesifikk mot antigener..,, og som utvinnes i det cellefrie system og er så høyrenset at den er fordragelig hos menneske og dyr ved parenteral, fortrinnsvis intravenøs administrering. Videre vedrører oppfinnelsen fremgangsmåter for. fremstilling av den slags høyrenset

.i-RNS, såvel som anvendelse av den.

i-RNS dannes normalt av forskjellige 'immun-kompetente celler i legemet etter kontakt med et antigen. Den inneholder og overfører informasjon for syntese' av antistoff er,. regulator-prbtein og cellebunden immunitet . i-RNS er_altså alltid å

finne i det perifere blod og i lymfatiske organer, når makro-organismen kommer'ut av det med et antigen. Med enhver blod-transfusjon, overføres et stort antall forskjellige i-RNS-sorter,'uten at de er kjent med de antigener som reagerer med de i

hvert tilfelle syntetiserte antistoffer. Konsentrasjonen av de enkelte i-RNS-sorter er dog alt for liten til å kunne påvises.

Forutsetning for utvinnelse av en bestemt i-RNS er

derfor den eksperimentelle skjeldning av antigenerkjennelsen fra antistoffsyntesen. Dette lykkes best i cellefrie bio-syntetiske systemer, som enten bare kan erkjenne det valgte antigen, eller som for det annet bare kan syntetisere antistoffer.

Fra arbeidene til Jachertz og andre er det kjent' at det første konkrete produkt fra en antigenerkjennelse i- det cellefrie system er i-RNS. Kfr. Jachertz "Zeitschrift fiir medizin-is.che Mikrobiologie und Immunologie" 154 (1968), s. 245 ,

"Annals of the Nev/ York Academy of Science" 207 (1973), s. 122, "Zeitschrift fiir Immunitatsforschung und experimentelle Therapie" 144 (1972), s. 260, såvel som "Journal of Immuno-Genetics "• 1 (1974 ), s. 355-36.2. De av Jachertz beskrevne prepareringer av i-RNS har fremdeles vært sterkt forurenset og derfor uegnet, for administrering til mennesker. En forbedring av rensningen offentliggjorde Jachertz i "Mole.cular and cellular Biochemistry"..

.24 (1979) 93. Også her var imidlertid, som i de andre arbeider, den eksperimentelle del. så ■ ufullstendig at det å arbeide etter dette flere ganger var uten hell, og derfor ble resultatene i sin helhet trukket i tvil. Dette førte til at hverken resul-

tåtene eller tolkningen av disse resultatene er blitt akseptert av fagfolkene.

Det ble også forsøkt å fremstille i-RNS in vivo, for. deretter å utvinne den fra milten og lymfeknutene til et dyr;

kfr. Liu Shi-Shan m.fl. "The Lancet" , januar 23, 1982, s". 197.. Bortsett fra den brysomme fremstilling (det ble anvendt hester,

■ som i hvert tilfelle måtte slaktes), lyktes det heller ikke her med noen fullstendig rensning.

.Oppfinnelsen "har som oppgave å utvinne høyrenset i-RNS i det cellefrie system, som er spesifikk mot antigener og for-'dragelig hos mennesket ved administrering, spesielt ved injeksjon. Dette er overraskende nok lyktes, hvorved den således utvunne i-RNS er fordragelig hos mennesker og dyr ved parenteral,. særlig • intravenøs , administrering,, hvorved det særlig er tenkt på varmblodige .dyr og pattedyr. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for fremstilling av i-RNS som er utvunnet i det cellefrie system,, er høyrenset, spesifikk mot antigener og fordragelig hos mennesket ved parenteral, særlig, intravenøs,' administrering, ved omsetning av antigen, DNS (inklusive i-DNS), nukleotider og et enzymsystem som er utvunnet av leukocytter, lymfocytter, andre slags • celler eller cellebestanddelér, ekstraksjon med.en. vandig løsning av fenol og natriumdodecylsulfat og videre rensning, erkarakterisert vedat. man for rensning sentrifugerer over en tetthetsgradient,'nemlig fortrinnsvis over en tetthetsgradient av cesiumklorid, sakkarose og tris-puffer:ved ca. 130.000 G. Denne sentrifugering varer i ca. 4 timer. Fortrinnsvis foretas i tillegg en ytterligere sentrifugering over cesiumsulfat.

Særlig fordelaktig er det hvis man anvender et enzymsystem som er utvunnet av leukocytter eller lymfocytter fra et milt-homogenisat ved sentrifugering over en tetthetsgradient. For dette formål har særlig en tetthetsgradient av sakkarose i tris-puffer av 30 - 60% sakkarose ved ca. 100.000 G vist seg,gunstig. En forutgående stimulering av immunsystemet hos'dyret hvis milt-■homogenisat anvendes for utvinning av detcellefrie system,

er fordelaktig.. Denne stimulering kan vanligvis foregå med Freunds adjuvans, BCG, men også særlig med Pirtd-Avi .(stråle-inaktivert hønsekoppervirus).

En ytterligere fremgangsmåte for skånsom rensning best.år i affinitetskromatografi'. 'Matrisen kan'f. eks. bestå av poly(u)-sefarose 4B eller oligo-desoksytymidin.

Den i henhold til oppfinnelsen i det cellefrie system utvunne, høyrensede i-RNS som er spesifikk mot antigener og fordragelig hos mennesker og dyr ved parenteral, særlig intra-venøs, administrering, er faktisk egnet til anvendelse ved den direkte terapi. Den fører faktisk til syntese av - antistoffer, regulatorprotein og cellebunden. immunitet. Man kan derfor uten

videre'anvende den til .aktiv immunisering såvel som til utvinning av antisera og antistoffer in vivo og in vitro. De således

utvunne antisera og■antistoffer kan på sin side også anvendes til målrettet passiv immunisering. De kan dessuten anvendes til. analytiske formål, da^de er høyspesifikke overfor de aktuelle antigener. En i-RNS i henhold til oppfinnelsen er således en nøkkelsubstans med hvilken det er overordentlig enkelt og elegant og derved mulig uten ettervirkninger å løse

de forskjelligste problemer eller å løse dem bedre..Selv-følgelig kan man også administrere dem sammen med andre fordragelige stoffer, f.eks. som tilsetning til transfusjoner av helt blod, helblodkonserver, plasma, plasmafraksjoner, plasma-ekspanderende midler o.s.v. ■

Typiske antigener er f.eks. bakterier, vira, viruider, sopper, tumorer og parasitter. Det kan imidlertid også være høyeremolekylære kjemiske substanser, f.eks. steroider, plante-og dyre-gifter, såvel som allergener. Særlig fordelaktig er stråle-inaktivert.e vira, da de ikke lenger er patogene, men allikevel har bevart sin antigenisitet.

Det er funnet at en i-RNS i henhold til oppfinnelsen også' i det cellefrie system er .i stand til a syntetisere spesi-fikke antistoffer. Av større betydning er det funn at i-RNS i celler induserer syntesen av et regulatorprotein so,m induserer ' nysyntesen av celléegen i-RNS i mottagercellen. Den injiserte

i-RNS og den nydannede i-RNS er på sin side i stand til- å

indusere dannelsen av antistoffer. i-RNS er således fremragende egnet, med henblikk på spesifikk terapi å bli administrert parenteralt, særlig intravenøst,, og derved'å mobilisere de kroppsegne forsvarskrefter raskt og målrettet. Såfremt kroppen -fremdeles ikke inneholder antigenet, så finner det sted en aktiv immunisering som forløper raskere og mer komplikasjons-fritt enn den vanlige vaksinering med antigen.

Da de en viss tid etter injeksjonen av i-RNS'i henhold til oppfinnelsen også danner betydelige mengder av antistoffer, kan serumet noen tid senere anvendes for den passive immunisering. eller utvinning av antistoffer,..• Den slags sera og antistoffer egner seg selvfølgelig også fremragende for spesifikk diagnostikk og erkjennelse av.antigener.

Fremstilling i henhold til oppfinnelsen av i-RNS foregår

. uten noen som'helst manipuleringer av det genetiske materiale

i betydningen'av en rekombinasjon.. Til tross for syntesen i cellefrie systemer er i-RNS i henhold til oppfinnelsen å anse som normal bestanddel i det perifere blod. Kriterier på

ubetenkeligheten ved en anvendelse av i-RNS hos mennesket kan

. derfor orientere seg til■kriteriene og erfaringene fra blod-overføringer. Dé injeksjoner av i-RNS som hittil, er.utført hos mennesket har heller ikke i noe tilfelle vist de minste bivirkninger. Den 'ønskede biologiske virkning ble imidlertid

registrert i så og si alle tilfeller. Av dette kan den slutning-trekkes'at den i-RNS som er dannet i det cellefrie system av immunkompetente celler etter stimulering med antigen, faktisk oppviser hele den nødvendige informasjon for.syntesen av antistoffer og for utpregning av cellebundet immunitet. Videre er i-RNS fri for antigener og antigen-bruddstykker såvel som andre slags forurensninger, såsom proteiner, DNS- pg RNS-di-fferente informasjonsinnhold. Dette kan eksempelvis, påvises ved agarose-gel-elektroforese eller tynnsjiktkromatografi.-

For utførelse av den.direkte terapi er det vanligvis tilstrekkelig å injisere den høyrensede i-RNS i henhold til oppfinnelsen én gang. Bare i noen tilfeller har det vist.seg å være å anbefale å gjenta injeksjonen etter f. eks. 10 dager'.

I de følgende eksempler er oppfinnelsen.nærmere belyst:

Ek sempel 1

a) Fremstilling' av enzymsysternet For fremstilling av det egnede' enzymsystem kan leukocytter og lymfocytter anvendes.. Særlig enkelt foregår, frem-, . stillingen ut fra milt. Til dette støtes 1-2 g frisk, dypfryst milt (f.eks. svinemilt) i morter med tørris og flytende nitrogen til pulver..Pulveret settes til 1,5 ml tris-puffer A i et sentrif ugeglajss,. og suspensjonen innfryses ved -70°C. Denne prosess gjentas ca. 10 x. Deretter avsentrifugeres de oppsluttede celler i 30 minutter i en Beckman-ultrasentrifuge, Rotor SW 50.1 ved 30.000 G. Etter sentrifugeringen tas

1-1,5 ml av .den røde, klare, overstående del av og bringes til en-diskontinuerlig sakkarose-gradient. Denne gradient består av 1 ml 60 %ig sakkarose i tris-puffer A, over hvilken 2,75 ml 30 %ig sakkaroseløsning befinner seg i tris-puffer A.

I en Beckman-ultrasentrifuge, Rotor SW-50.1' sentrifugeres ved 100.000 G, 0°C. Etter 4 timer får' man'den ønskede fraksjon som rødlig,, klart sjikt over den 30 %ige sakkarose. Sjiktet tas av med en forhåndsavkjølt pipette og fortynnes med kold ■ .tris-puffer. A i forholdet 1:1. Løsningen kan oppbevares, i flytende nitrogen. - ..

b) DNS (desoksyribonukleinsyre) inklusive i-DNS

(info.rmatorisk desoksyribonukleinsyre)

1-2 g .dypfryst milt som er oppbevart i nitrogen, tines langsomt i 5 ml tris-puffer A og homogeniseres i homogeni-satoren ved ca. 30 kolbebevegelser. ■ Suspensjonen tilsettes dråpevis i en erlenmeyerkolbe med 20 ml av en emulsjon av 2 %ig' vandig natriumdodecylsulfat-løsning. med frisk destillert'

fenol (forhold 1:1), hvorved kolben svinges sterkt for opp-nåelse av. homogen fordeling. Ved for viskøs, blanding kan 3. %ig koksaltløsning- tilsettes. Etter .24 timer sentrifugeres den melkeaktige emulsjon i en sentrifuge i 15 minutter ved 2000 G, hvorved det fremkommer to faser. Den vandige øvre fase tilsettes samme volum (+ lo%) vannfri etanol, slik at DNS faller ut. DNS overføres'med en utgiødet platinaløkké til- 10. ml steril,, 0,85' %ig natriumkloridløsnlng. 5 ml .av. 1 %ig natrium-, dodecylsulfat-løsning, 5 ml av 0,05 mol/l. tris-A .og 0,05 mol/l

EDTA-puffer pH 7,6 og 2 mg proteinase K tilsettes, og alt blandes. Oppløsningen av DNS varer ca. 1 dag, og. etter dette kan den igjen utfelles med alkohol. Oppløsning pg fornyet utfelling gjentas 3 til 7 ganger, til forholdet mellom E260' og ^ 2S0 harrnådd en verdi mellom 1,9 og 2 og den hyperkrome effekt utgjør minst 20%. ekstinksjonsøkning ved 260 nm. En absorpsjon av DNS ved-2 60 nm på lo.D. 'tilsvarer omtrent en. konsentrasjon på..40 ug/ml.. Ved hjelp av denne relasjon

•fortynnes DNS-løsningén slik at man får en konsentrasjon på.

1 ug/ml. Denne bruksløsning innfryses i porsjoner på 0,5 ml<p>g oppbevares ved -20°C.

c) Syntese,av i-RNS (informatorisk ribonukleinsyre)

I isbad tilsettes det rensede enzymsystem og antigenet

i tris-puffer A ved pH. 8,0 og tilsettes en blanding av nukleo-tidene ATP, GTP, CTP og UTP. Til kontroll lages en liten sats -, i det. samme mengdeforhold, som. imidlertid tilsettes tritium-markert UTP... Det pipetteres alltid med avkjølte pipetter.^

De optimale konsentrasjoner av de enkelte komponenter fås

ved flere forsøk. Hver av prøvene inkuberes i.vannbad ved 37°C og tilsettes allerede etter 3-6 minutter.en vandig løsning av 1% natriumdodecylsulfat og.1% vandig fenol. Også den optimale inkubasjonstid avhenger'noe.av konsentrasjonene og det aktuelle antigen og kan1 .beregnes ved noen håndforsøk på'forhånd."Det avkjøles i isbad og avséntrifugeres ved■2.000 .G. DetOverstående inneholder den syntetiserte rå i-RNS.

d.) Rensning av i-RNS

Av det overstående isoleres i-RNS over én diskontinuerlig cesiumklorid/sakkaros.e.-gradient. Således' blir i ' sentrif uge- ' røret av celluloseacetat i .'hvert tilfelle 1 ml cesiumklor id--løsning med tetthet g 1,9 g/ml oversjiktet med o,7 5 ml av en 30 %ig sakkaroseløsning i. tris-puffer A pH 8,0. Hver .2 ml av prøvene has på gradienten,'og rørene lukkes med steril paraffin.. Etter åt sentrifugen har løpt ved 18°C, 130.000 G,

i 4 timer i Beckman R<p>tor SW 50.1, tas cesiumkloridsjiktet vekk. SåledesStikkes isentrifugerørene med en utglødet-nål i bunnen, og hele ceciumkloridløsningen overføres til sakkarose-sjiktet i rør. Den således oppnådde' løsning fortynnes med -

sterilt"vann 1:2'og kan innfryst oppbevares ved -20°C. Den videre, rensning foregår ved at man s.edimenterer over en cesiumsulfat-gradient. Således fylles 4,8 ml cesiumsulfat-løsning med tetthet 1,5 g/ml i sentrifugerør av celluloseacetat

.(Rotor Beckman SW 50.1). Over dette sjikter'mari 0,3 ml av prøven.og sentrifugerer minst 4 "timer (fortrinnsvis 12-19 timer) ved 18°C og 130.000 G. Etter sentrifugeringen gjennomstikkes . rørene i bunnen, og 13-14 fraksjoner, hver av- 9 dråper

,(= -0,4 ml) snittes i fraksjoner. 0,1. ml av hver fraksjon anvendes for bestemmelse av radioaktiviteten, og de resterende. 0„ 3 ml fortynnes med samme volum vann og. oppbevares ved -20°C. Etter at det fastslås i hvilke fraksjoner den høyeste radio-, aktivitet inneholdes, velges også de tilsvarende fraksjoner av hovedsatsenv De inneholder den høyrensede i-RNS.

Fraksjonene, kan om ønsket umiddelbart injiseres uten videre rensetrinn.

Det. er. mulig å påvise i-RNS elektro.nopt.isk, 'hvorved det er iakttatt molekyllengder på mellom 1.500 og 2000 nm. Renhetsgraden lar seg eksempelvis påvise ved agarose-gel-elektroforese.

Enda en påvisning av i-RNS består i at man syntetiserer antistoffer i.det cellefrie system. For dette formål føres en .prøve av i-RNS, høyrensede ribosomer, det ovennevnte enzymsystem og leucin og valin sammen i tris-puffer A pH 8,0, Prøvene inkuberes i.4 5 sek. ved 7°C, og deretter stoppes proteinsyntesen.ved innfrysing ved -20°C. Antistoffene.kan separeres og renses ved affinitetskromatografi på immun-adsorpsjonssøyler og påvises analytisk.

De høyeste konsentrasjoner av antistoffer fremkalles ved tilsetning av båre 10 i-RNS. Dette viser at et molekyl i-RNS i det cellefrie system er i stand til å syntetisere minst 10<4>molekyler antistoffer.

Det er videre, mulig, med en RNS-replikase å forhøye mengden av i-RNS med faktoren 10 4 til 10 5. Ved flere gangers gjentagelse av disse trinn finner det sted en klonisering.

Da også den således oppnådde i-RNS fremdeles har de samme egenskaper med hensyn til antistoffsyntesen som den opprinnelig utvunne, kan den slutning trekkes at antistoffer ennå frem-stilles ved medslepne antigenrester.

Analysen av i-RNS gav at molekylvekten utgjør ca.. 1-2 x 10 6. Som antigener.ble det anvendt Aujeszky-virus, H.erpes-sim<p>lex-virus,.irifluensa-virus, MKS-virus, Varicella-. virus, Masern-virus, HBs-antigen, E.coli 0-antigen, saue-erytrocytter, ADH, tetanus-toksin, såvel som systemer med tumorceller, såsom LC^fra marsvin, p815 fra DBA2<->mus., L' 1210 fra DBA2_mus såvel som den ved poliomavirus induserte tumor hos Lewis-rotter. De første vellykkede resultater■ble videre oppnådd med det attenuerte Masern-virus "Moraten" ogHBS-antigen. Tilsvarende forsøk viste at det ikke inntrer.noen kryssreaksjoner. Det oppstår således høyspesifikk i-RNS i avhengighet av det. i hvert tilfelle anvendte antigen.

Eksempel 2

Det ble fremstilt en spesifikk i-RNS mot hepatitis B,

og denne ble prøvd på over 200 pasienter med hensyn på for-dragelighet, og virksomhet. Dosen av i-RNS var 10 mol/ml. Pasientene fikk av "denne løsning i de fleste tilfeller én .gang 1-2 ml, men i sjeldne,alvorlige tilfeller ble det foretatt en injeksjon til. Den for tiden overskubare 'helbredelseskvote utgjør-på det nærmeste 100%.

Eksempel 3-BALB/c-mus ble i ukentlige avstander spr.øytet tre ganger, hver gang med 100 'yl komplett Freunds adjuvans. Det komplette Freu.nds adjuvans som er å få i handelen, ble blandet : 1:1 .med ■ fysiologisk koksaltløsning. Etter den siste -injeksjon ventet

roan 4 uker.. Deretter ble milten til dyrene fjernet pg opp-arbeidet for utvinnelse av det cellefrie system.

De med dette cellefrie system oppnådde utbytter av i-RNS var med en faktor 10 høyere.

Claims (11)

1. Høyrenset i-RNS, utvunnet i det cellefrie system, spesifikk mot antigener, fordragelig av .mennesker og.dyr ved administrering.

2. i-RNS som angitt i krav. 1,,karakterisertved at'den er fordragelig ved parenteral, særlig intravenøs, administrering.

3.. Fremgangsmåte for fremstilling' av i-RNS som er utvunnet i det cellefrie system, er høyrenset, spesifikk mot antigener., fordragelig av mennesker og dyr ved parenteral., spesielt intravenøs,, administrering, ved omsetning, av antigen, DNS (inklusive i-DNS)', nukleotider pg et enzymsystem som er utvunnet av leukocytter, lymfocytter, andre slags celler eller cellebestanddeler, ekstraksjon med en vandig løsning- av fenol og natriumdodecylsulfat-og videre rensning, kar a k t e r ,i - sert ved at man for rensning sentrifugerer over en-tetthetsgradient.

4. Fremgangsmåte som angitt■i krav 3, k a r a k/t e r i - sert ve d atman 'sentrifugerer over en tetthetsgradient av cesiumklorid/sakkarose og tris-puffer ved.ca. 130.000 G.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4,karakterisert vedat man deretter renser i-RNS ved hjelp av ■affinitetskromatografi.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav .4.,karakterisert ved- at- man i tillegg sentrifugerer over cesiumsulfat.

7.. Fremgangsmåte som angitt i -et ■ av kravene 3.-6,'karakterisert, ved at man anvender éf enzymsystem som utvinnes ved rensning av et homogenisat av vev fra det retikulo-endotheliale system (RES), fortrinnsvis milt ved sentrifugering over"en tetthetsgradient.

8.. Fremgangsmåte som angitt i krav 7,karakterisert vedat det immunsystem fra dyr, som anvendes f<p>r utvinning. av homogenisatet fra vev i det retikulo-endotheliale system, på forhånd stimuleres, fortrinnsvis med BCG, Freunds adjuvans og Pind-Avi.

9. Fremgangsmåte som angitt- i krav 7, kar ak t e ri - s e r t .v e d at man sentrifugerer over en tetthetsgradient av sakkarose i tris-puffer ved ca. 100.000 G. ;

10. Anvendelse av i-RNS som er utvunnet i det cellefrie system, er høyrenset, spesifikk mot antigener, fordragelig av mennesker, og dyr ved parenteral, fortrinnsvis intravenøs, administrering, for direkte terapi, for aktiv immunisering eller. utvinning av antisera og antistoffer in vivo og in. vitro..

11. Anvendelse i henhold til krav 10, hvorved administrer-ingen ■ foregår sammen med andre fordragelige stoffer.