NO822063L - Rekombinant dna-teknikker for fremstilling av relaxin - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinante DNA-teknikker for fremstilling av relaxin, nærmere bestemt vedrører den syntetiske gener for relaxin og ekspresjonen av disse, tilsvarende plasmid-rekombinanter og transfor-

merte celler, samt fremstillingen derav.

Relaxin er et polypeptid-hormon som fremstilles

i ovariene og visse andre vev, særlig under svangerskap.

Selvom det syntetiseres og lagres i ovariiene, tiltar mengden serum immunoreaktivt relaxin ofte dramatisk mot slutten av et svangerskap hos svin, rotter, marsvin, mus og hamstere._ Relaxin er kjent for å ha virkninger på sammenvoksingen av skambenet, livmoren, melkekjertler og bindevev, det forår-saker utvikling av halsregionen og initierer fødselen (se f.eks. Steinetz, B.G., et al (1980, Dilatation of the Uterine Cervix, Eds. Naftolin, F. and Stubblefield, P.G.,

Raven Press, New York, 157-177; and Schwabe, C. et al (1980) Recent Progress In Hormone Research, Relaxin, 34, 123-199).

Relaxin oppviser bemerkelsesverdig reaktivitet

på andre arter enn det skriver seg fra, både in vivo og in vitro prøver og med hensyn til sin antigenvirkning i en slik grad at relaxin fra svin har vært brukt i kliniske for-søk på pasienter med behov for kirurgisk induksjon av fødsel, (se f.eks. Steinetz, B.G. et al., loe.eit.; Schwabe, C., et al, Loe eit.; 0'Byrne, E.M., and Steinetz,B.G, (1976), Proc.Soc. Exp. Biol. Med., 152, 272-276; and Larkin, L.H., et al, (1979), Acta Endocrinologica, 92, 568-576). Etter administrering av relaxin hadde de fleste pasienter forbedrede resultater og signifikant færre trengte fremskynding av fødselen med oksytocin enn i kontrollgruppen, ingen bivirkninger ble påvist (se f.eks. MacLennan, A.H., et al, (1980), The Lancet, 2.februar, 220-223). Relaxin fra svin ansees derfor som nyttig ved induksjon og kontroll av fødsel.

Administrering av relaxin fra svin til purker under grisingen kan også være nyttig for å redusere graden av dødfødsler blant grisunger. Det er funnet at,særlig ved store kull, dødeligheten har en tendens til å inntre med den siste i kullet (se f.eks.Asdell, S.A., and Willman, J.P.

(1941), J.Ag. Res., 63, 345-353) når relaxinnivået kan avta.

Relaxin er et av et antall insulinlignende polypeptider og omfatter to polypeptidkjeder, A og B, bundet sammen ved disulfidbroer (se f.eks. Schwabe, C, og McDonald, J.K., (1977), Science, 197, 914-915; Bedarkar, S.,

et al, (1977), Nature, 270, 449-451; og 1'saacs, N. , et al,

(1978), Nature, 271, 278-281). A-kjeden fra svin omfatter 22 aminosyrer som illustrert på fig. 1 i tegningene. Det opptrer åpenbart en del mikroheterogenitet ved at en del av relaxin er funnet å ha en A-kjede, hvor fra 10 til 20% av glutaminet i posisjon 10 er erstattet med glutaminsyre (se f.eks. Niall, H.D., et al, (1980), Insulin: chemistry,

structure and function of insulin and related hormones,

Eds. Brandenburg, D., and Wollmer, A., Walter de Gruyter,

New York, 719-726). B-kjeden fra svin omfatter fra 28 til 31 aminosyrer som illustrert på fig. 2 i tegningene, der PGA er pyroglutaminsyre. Karboksylsyreenden i B-kjeden synes å

være heterogen, dette er angitt på tegningen ved hjelp av vertikale linjer. Slik det vanligvis er isolert, har hoved-bestanddelene av topper kalt CM-a' (brukt i det kliniske forsøk) og CM-a B-kjeder med henholdsvis 29 og 31 rester

(se f.eks. Niall, H.D., et al, loe.eit.) En annen rapportert B-kjede-struktur omfatter 26 rester og svarer til den oven-

for nevnte struktur, med unntak av at restene 24-26 er Val-Trp-Ser (se f.eks. Schwabe, C, et al, (197 7) , Biochem. Biophys . Res.Comm., 75, 503-510). Det er også rapportert en lignende B-kjede-struktur som omfatter 30 rester med unntak av at

restene 27-30 er Thr-Trp-Gly-Arg (se f.eks. Kwok, S., og Bryant-Greenwood, G,(1977), Nature, 267, 544-546).

På bakgrunn av de kjente aminosyre-sekvenser illustrert på fig. 1 og 2, er det blitt bestemt nye synte-

tiske gen-sekvenser som svarer til A-kjeden og B-kjeden hver for seg, og som svarer til et hybrid B-C-A-gen, hvor C-sekvensen koder for en' peptidbinding mellom B-og A-kjedene.

Det ble besluttet å basere den sammenknytende C-sekvensen

på peptidet -Asp-Pro-, som er kjent for å være følsomt for hydrolyse ved ca. pH 2 (se f.eks. London, M., (1977), Methods in Enzymology, 47, 145). Den bestemte sekvens som ble valgt for peptidet var -Asp-Pro-Gly-Asp-Pro- (se fig. 3 på tegningene),

som tillater A og B-kjedene å anta den normale konformasjonen uten avvik. Hybride B-C-A fremstilles som et enkelt peptid, som kan brukes uten modifikasjon eller kan spaltes ved lav pH for å fjerne C-peptidet.

Ved valget av en optimum-sekvens fra det store antallet codon-muligheter, som har oppstått under utviklingen av den genetiske kode, er det tatt hensyn til flere kriterier. For det første bør det brukes trinucleotid-codoner som er

svært akseptable for cellene hvor genet skal uttrykkes,

særlig hos E. coli, (se f.eks. Grantham, R., et al. (1980), Nucl. Acids Res., 8, r47-r62). For det annet bør 5'-enden i genet ha et restriksjonspunkt, slik som et EcoRI-punkt, slik at når den "klebrige ende" behandles med Sl nuclease, vil den fremstilte "butte ende" være nøyaktig i 5<1->enden av den kodende sekvensen. For det tredje bør 3'-enden ha et kjede-avslutningscodon. For det fjerde bør 3'-enden ha et restriksjonspunkt, slik som et Hind III-punkt, for bruk ved innføring i et passende plasmid. For det femte bør restriksjonspunktene ved 5' og 3'-endene gjøre genet istand til å bli clonet inn i og fjernet fra et passende plasmid, slik som pBR 322 (se f.eks. Bolivar, F., et al. (1977), Gene, 2,-95-113). For det sjette bør antallet sekvenser i genet som er innbyrdes komplementære eller er komplementære med andre sekvenser (bortsett fra den riktige sekvens) på en av kjedene eller det dobbeltkjedede gen, holdes på et minimum.

Ved å bruke en datamaskin ble krefter som oppstår fra alle mulige gjensidige påvirkninger, beregnet (f.eks. Tinoco, Jr., I., et al. (1971), Nature, 230, 362-367; og Powers, G.J., et al. (1975), JACS, 97, 875-889), slik at ikke-diagonale gjensidige påvirkninger kunne bli unngått i størst mulig utstrekning.

I en utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse et syntetisk gen for ekspresjonen av svine-relaxin-A-kjeden som omfatter de følgende sekvenser:

Ved en ytterligere utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, inneholder A-genet i tillegg til den kodende sekvensen, et stopp-codon, restriksjonspunkter for Ecorl og Hind III for å lette innføringen i plasmider, slik som pAT 153, (se f.eks. Twigg, A.J., og Sherratt, D., (1980), Nature, 283, 216-218), eller ekpresjonsplasmider, særlig pWT 571 (se.f.eks. EP patentsøknad nr. 52002) , et Hinf I restriksjonspunkt som setter et gen som mangler codoner for Arg og Met, istand til å clones (produktet fra et slikt gen som mangler Arg og som har eller ikke har innført initiator methionin ved enden fra ekspresjonsplasmidet, kan være mer aktivt enn det originale genet som inneholder Arg-resten med eller uten initiator-methionin), og et EcoR2 restriksjonspunkt (se fig. 4 på tegningene).

Ved denne utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse et syntetisk gen for ekspresjonen av svine-relaxin-A-kjede som omfatter den følgende sekvens:

Ved en annen utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en syntetisk gen for ekspresjon av svine-relaxin B-kjede som omfatter den følgende sekvens:

Ved en ytterligere utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse inneholder B-genet i tillegg til den kodende sekvens, et stopp-codon, et codon for startmethionin, restriksjonspunkter for Cia I og Barn HI for å lette inn-føringen i plasmider, slik som pAT 153, og restriksjonspunkter for Sal I, Hind III, Bit II og Rsa I, (se fig. 5 i tegningene). Det er tre alternative former, hver med et forskjellig 3'-ende-område som koder for de forskjellige C-endene i B-kjedene.

Ved denne utførelsesformen vedrører foreliggende oppfinnelse et syntetisk gen for ekspresjonen av svine-relaxin B-kjede som omfatter den følgende sekvens:

Ved en annen ut f ørelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse et syntetisk gen for ekspresjonen av et svine-relaxin-hybrid med en peptidbinding -Asp-Pro-Gly-Asp-Pro-mellom B-kjeden og A-kjeden som omfatter den følgende sekvens:

Det hybride B-C-A-gen som inneholder bare en del av B-genet fra Bgl II-punktet, har restriksjonspunkter for Bgl II og Barn Hi for å lette innføringen i et plasmid, f.eks. pWT 551 (se f.eks. EP patentsøknad nr. 52002), som inneholder den andre delen av B-genet, indre restriksjonspunkter for Rsa I, Barn HI, Xma I, Hinf I og EcoR2 og et stopp-codon (se f.eks.

fig. 6 i tegningene, hvor - for bekvemmelighets skyld - bare den lengste B-kjeden er illustrert).

Genene ble bygget opp ved å syntetisere et antall oligonucleotid-blokker.

De syntetiske blokkene som ble valgt er illustrert i fig. 7, 8 og 9 i tegningene. Blokkene kan bygges opp ved å bruke kjente synteseteknikker,(se f.eks. Ito, et al (1982), Nucl. Acids Res., 10, 1755-1769).

Etter å være bygget opp, ble de oligomere blokkene av nucleotider hybridisert og knyttet sammen ved hjelp av kjente metoder (se f.eks. Agarwal et al., (1970), Nature, 227, 27-34).

Følgelig vedrører en ytterligere utførelsesform

av den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte fir f rems ti 1-Lingen av et slikt syntetisk gen som omfatter å bringe sammen

og knytte sammen et antall oligonucleotid-blokker.

Det neste trinn var å fremstille passende plasmid- rek ombinan te r og så omdanne egnede celler slik at den ønskede ekspresjon kan oppnås.

Følgelig vedrører en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse en plasmid-rekombinant som omfatter en plasmid-vektor hvor, det ved et innføringspunkt er innført et slikt syntetisk gen, idet plasmidvektoren avleses i den korrekte fase for ekspresjon av det innførte genet og har en bakteriell promoter foran og grensende opp til innføringspunktet.

Ved en ytterligere utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstillingen av en slik plasmidrekombinant som omfatter å innføre et slikt syntetisk gen i en passende plasmidvektor.

Dessuten vedrører en annen utførelsesform av

den foreliggende oppfinnelse en celle som er blitt transformert ved at det er innført et slikt syntetisk gen eller en slik plasmidrekombinant i den.

Ved en ytterligere utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstillingen av en slik celle som omfatter å innføre et slikt syntetisk gen eller en slik plasmidrekombinant i en passende celle.

Nærmere bestemt ble A-genet festet i det store fragmentet av pWT 571 etterfulgt av fjerning av det lille restriksjonsfragmentet fremstilt ved å behandle med EcoRI og Hind II og clonet. Plasmidet ble omdannet til et hvor relaxin-A-genet var ved siden av ATG-codonet for ekspresjon ved å behandle med EcoRI og bryte ned de en-kjedede endene med Sl-nuclease, hvorved det ble dannet jevne ender som på nytt ble knyttet sammen. B-genet ble først clonet inn i pAT 153 ved Cia I og Bam HI -punktene for replikasjon. For ekspresjon ble B-genet fjernet, endene ble gjort jevne ved Cia I-enden med Sl-nuclease og innført i det oppkuttede ekspresjonsplasmid med Hind III, hvoretter endene ble gjort jevne med Sl-nuclease. Delvis nedbryting med Sl-nuclease før sammenknyting gir plasmider med bare litt forskjellige ribosom-bindingspunkter. Som et alternativ var en metode å clone B-genet på å fremstille et syntetisk B-gen med en utjevnet 5<1->ende (ved å gjøre oligo-meren CGATGCAGTC to baser kortere ved 5'-enden) som ble felt inn i Hind III/Bam HI oppbrudt pWT 551 med et Hind III punkt som var utjevneti enden. Det hybride B-C-A-gen ble clonet inn i pWT 5 51 som allerede inneholdt det uttrykkende B-gen etterfulgt av oppkutting med Bgl II og Barn HI.

Som en følge av ekspresjon av A- og B-genene

etter innføring i de ovenfor nevnte plasmidene og cloning i E.coli, (se f.eks. Tacon, W.CA. , et al, (1980) MolecDGen. Genet., 177, 427), kan A- og B-kjedene ekstraheres og renses fra bakteriene og rekombineres, hvorved man får aktivt relaxin ved først å omdanne ende-glutaminet i B-kjeden til pyroglutaminsyre ved behandling ved 100°C og således danne disulfid-broene. (Se f.eks. Katsoyannis, P.G., et al (1967), Bio-chemistry, 6, 2642).

Etter ekspresjonen av B-C-A-genet, kan peptid-produktet spaltes ved hydrolyse ved lav pH (se fDeks. London,M.

(1977), loe eit.)

En alternativ måte å fremstille B-kjeden på er

den følgende. B-genet kan bindes til enden av et gen med ekspresjon for 3-galactosidase og B-kjeden kan fremstilles som et kondensert polypeptid med 3-galactosidase. Spalting med cyanogenbromid ved methioninet kodet for 5'-enden i B-genet gir et peptid som er identisk med B-kjeden, (se f.eks. Casabadan, M.J.,(1980), J. Bact, 143, 971); og Goeddel, D.V., et al (1979), Proe. Nati. Acad. Sei. USA,76, 106-110).

Følgelig vedrører en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstillingen av i det minste en kjede av svinerelaxin som omfatter å dyrke en slik celle.

Ved en ytterligere utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av svinerelaxin som omfatter å binde sammen relaxin A- og B-kjedene fremstilt ved en slik fremgangsmåte via disulfidbroer.

Ved en ytterligere utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstillingen av svinerelaxin som omfatter å spalte et svinerelaxinhybrid fremstilt ved en slik fremgangsmåte ved lav pH.

Det følgende illustrerer den foreliggende oppfinnelse : Syntese av tridecanucleotidet TpCpCpGpTpApApApGpAp-CpApT: Det fullstendig beskyttede tridecanucleotid ble bygget opp som illustrert på fig. 10 i tegningene, hvor beskyttelsesgrupper av bekveramelighetshensyn ikke er vist. Reak-sjonene angitt med piler i fig 10, ble utført ved de følgende fremgangsmåtene.

Kommersielt tilgjengelig, klormetylert,l% kryss-bundet polystyren (0,32 meq Cl/g) ble omdannet til amino-metyl-formen ( P ) ved hjelp av kjente metoder (se f.eks. Mitchell, et al, (1976), Tetrahedron Letters No. 42, 3795-3798). 5'-dimetoksytrityl-thymidin 3<1->O-succinat ble bundet til polystyren-resten via en amidbinding ved hjelp av kjente metoder (se f.eks. Miyoshi et al, (1980), Nucl. Acids Res., 8, 5507-5517).

Fremstillingen av dinucleotider ble utført ved

den følgende fremgangsmåte eksemplifisert ved syntesen av

som illustrert i fig. 11 i tegningene.

3 mmol

ble omsatt med 100 ml 2% (vekt/volum) benzensulfonsyre i diklormetan/metanol (7:3 v/v) i 5 minutter ved 0°C. Etter ekstraksjon med 5% vandig NaHCO^-oppløsning, ble diklormetan-sjiktet tørket og fordampet under vakuum til en olje.

Produktet (II) ble renset ved kromatografering på silicagel med en gradient eluering med diklormetan til 10% MeOH/diklormetan.

3,15 mmol

ble omsatt med Et^N/pyridin (1:1 v/v) i tre timer ved væreIsestemperatur og fordampet under vakuum til en olje. Produktet ble kondensert med

i vannfritt pyridin i nærvær av 8 mmol mesitylen-sulfonyl-nitro-triazol (MSNT) i "én time. Reaksjonen ble stoppet med 5% (vekt/volum) vandig natrium-bikarbonat og det ble ekstrahert med diklormetan. Ekstraktet ble fordampet under vakuum til en olje og produktet renset ved kromatografering på silicagel ved en gradient av diklormetan til 10% MeOH/diklormetan. Produktet (V) ble behandlet med Et3N/pyridin (1:1 v/v) for å fjerne cyanoetyl-beskyttelsesgruppen og det ble fordampet under vakuum til et fast skum (VI) med et totalt utbytte på 75%.

Det faste stoffet ble lagret ved -20°C klart

til bruk i oligonucleotid-syntese.

100 mg av polymerbæreren med tilknyttet DMTrT

ble behandlet i rekkefølge med:

1) 2% serumalbumin fra okse (BSA) i diklormetan/ butanol (7:3) i 5 minutter

2) diklormetan/butanol (7:3) x 5

3) tørt pyridin x 5

4) 100 mg dinucleotid og 100 mg MSNT i 0,5 ml tørt pyridin i 45 minutter

5) tørt pyridin x 2

6) 10% eddiksyreanhydrid/pyridin i 10 minutter

7) tørt pyridin x 2

8) diklormetan/butanol (7:3) x 5

Denne syklusen ble gjentatt med det passende dinucleotid inntil oligonucleotid-kjeden var fullstendig. Bindingseffektiviteten i hvert trinn ble bestemt ved spektro-fotometrisk undersøkelse av den frigjorte dimetoksytrityl-alkohol ved 504 nm.

Ved avslutningen av syntesen ble oligonucleotidet fjernet fra polymerbæreren og alle beskyttelsesgrupper ble fjernet ved å behandle i rekkefølge med 0,5 M 1,1,3,3-tetra-metyl-guanidin-p-nitrobenzaldoksimat i 48 timer ved værelsestemperatur, konsentrert ammoniakk i 5 timer ved 70°C og 80% eddiksyre i 30 minutter ved værelsestemperatur. Oligonucleo-tidene, hvor beskyttelsesgruppene var fjernet, ble renset ved ionebytter HPLC.

Hybridisering og sammenbinding av oligomere nucleotidelementer: Seriene av trinn ved oppbyggingen av den doble B-kjeden er illustrert i fig. 12 i tegningene.

Oligonucleotider ble fosforylert med 0,25 mM

ATP og 500 yCi y-[ 32P]-ATP pr. ml (50 mM tris-HCl (tris(hydrok-symetyl) aminometan hydroklorid) pH 9 , 4 , 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol (DTT) som inneholdt fra 100 til 150 yg oligonucleotid pr. ml og 125 enheter ( 1 enhet er mengden som kata-32

lyserer fremstillingen av 1 nmol av syreuoppløselig P etter inkubering i 30 minutter ved 37°C i henhold til Richardson, CC,

(1972) Progress in Nucleic Acids Research, 2,815) pr. ml T^- polynucleotid kinase (EC 2.7.1.78). De fosforylerte oligonucleotider ble utfelt med etanol og renset på en 20% (vekt/ volum) polyacrylamid-gel under denaturerende betingelser.

Etter eluering fra gelen, ble gjenvinningen bestemt ved Cerenkov-telling. Ved sammenbindingen av f.eks. blokkene 11

og 13:

12,5 pmol 5'-OH-relaxin 11, 10 pmol 5<*-32>P-

relaxin 13 og 10 pmol 5<1->OH-relaxin 12 i 50 pl vann ble her-

det ved oppvarming til 100°C, fulgt av sakte avkjøling til værelsestemperatur. Blandingen ble lyofilisert og tatt opp i 20 ul ligase-oppløsning (50 mM tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2,

20 mM DTT og 250 ym ATP) som inneholdt 200 enheter (en enhet

32

er mengden som katalyserer omdannelsen av et nmol PPi til a/3 P)-ATP i 20 minutter ved 37°C i henhold til Weiss, B.,

et al, (1968), J.Biol.Chem., 243, 4543) av T^-DNA ligase (EC 6.5.1.1). Etter 18 timer ved 22°C ble reaksjonen avsluttet ved tilsats av 20 yl 4 M ammonium-acetat, 10 yg tRNA og 3 volum-deler etanol. Etter utfelling ble produktet renset på en 15% polyacrylamid-gel under denaturerende betingelser.

Cloning av A-gen i pWT 5 71:

pWT 571 ble spaltet med restriksjonsendonucleaser EcoRI (EC 3.1.4.32) og Hind III ( EC 3.1.23.21) i overens-stemmelse med produsentenes instruksjoner (New England Biolabs, Inc. Beverley MD, USA) og de 3628 basepar store fragmentene

ble renset ved agarose-gel-elektroforese (1% lavtemperatur-gelerende agarose (Behtesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, USA) i 0,09 M tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM natrium EDTA, 0,089 M borsyre). Det brede båndet ble fjernet ved å smelte agarosestykket ved 65°C, ekstrahere med fenol/ CHCl^(1:1 v/v) og felle ut med etanol. A-genet ble bundet

til plasmidet i en 2 0 yl blanding inneholdende 10 yg A-kjede-gen, 20 yg av EcoRI/Hind III store fragmentet av pWT 571,

50 mM tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT,

200 enheter T4 DNA-ligase (New England Biolabs, Inc.) og inkubert i 18 timer ved 15°C. Det sammenbundne produkt ble transformert inn i E coli K12 WT 217 (ara D139, A(ara,leu)

7697 , Alac X74, gal V~, gal k~, hsr~, hsm , str A, rec A56), ved å bruke kjente fremgangsmåter (se f.eks. Cohen, et al,(1972),

Proe.Nati.Acad. Sei.USA, 69, 2110-2114) og det ble selektert for transformanter som var resistente mot lOOug/ml ampicillin. Flere transformanter ble analysert videre ved hjelp av restriksjons-enzym-spalting av plasmid DNA, og det ble valgt ut en som var påvist å inneholde et 70-80 basepar stort innskudd.ved spalting med EcoRI og Hind III og som inneholdt - åpenbart innenfor det samme innskuddet - et restriksjonspunkt for Hinf I som er kjent for å befinne seg i A-genet.

Dette plasmid - betegnet pRA 4 - ble deretter modifisert på en slik måte at det muliggjorde A-genets ekspresjon. Plasmidet ble kuttet med EcoRI. Den en-strengede DNA-"hale" ved hver ende av plasmidet ble fjernet, hvorved man fikk jevne ender ved å behandle med Sl-nuclease (EC 3.1.4.21). 1,5 yg EcoRI-kuttet plasmid pRA 4 ble inkubert med 7,5 enheter (1 enhet er mengden som oppløser 10 yg nucleinsyre på 10 minutter ved 45°C i henhold til Vogt, V.M.,(1973), Eur.J. Biochem., 33, 192) Sl-nuclease i 0,5 timer ved 15°C i 50 yl

av 250 mM natriumklorid, 30 mM natriumacetat, pH 4,5, 1 mM sinksuifat. Produktet ble ekstrahert med fenol, utfelt med etanol, bundet på en lignende måte som beskrevet ovenfor,

med unntak av at bindingen av den jevne enden ble fremmet ved å bruke 800 enheter T4 DNA-ligase og en temperatur på 25°C,

og brukt for å transformere E coli K12 WT 217 som angitt ovenfor. På denne måten plasseres ATG (start methionin-codon)

som grenser opp til EcoRI-punktet i plasmidet pWT 5 71, ved siden av det første codonet i A-kjede-genet i plasmidet av-ledet fra pRA 4 (betegnet pRA 63, slik at ekspresjonen av A-kjedegenet inntrer under passende betingelser. Kolonier som inneholdt det avledede plasmid ble selektert på ampicillin-resistens og plasmidene selektert ytterligere med hensyn til deres, motstandsstyrke mot EcoRI-behandling. Nucleotidsekvensen i området like foran det gamle EcoRI-punktet og som inkluderer hele A-genet, ble bestemt ved hjelp av kjente metoder (se f.eks. Maxam, A.M., and Gilbert, W., (1977),Proe.Nati. Acad.Sei. USA, 74, 560).

Ekspresjon av A-gen:

Ekspresjon av relaxin A-gen ble indusert ved dyrking av celler i M9-medium som inneholdt pr. liter 6 g Na2HP04, 3 g KH2PC>4, 0,5 g NaCl, 1 g NH4C1, 0,25 g MgS04. 7H20, 0,02 g CaCl2. 6H20, 5 g casaminosyrer uten tryptofan (Difco), 5 g glukose, 1 mg thiamin og 100 mg carbenicillin (a-karboksy-benzylpenicillin) : Beecham) , til en<Arr>._ på 0,4.

oOOnm 3-3-indol acrylsyre ble tilsatt til 2 0 mg/liter og inkubert i 4 timer ved 37°C. Under disse betingelser er det kjent at maksimal tryptofan promoter-aktivitet oppstår og derved ekspresjon av A-kjeden (se f.eks. G.B.,patentsøknad nr. 2.068.970).

(Ekspresjon av B- og B-C-A-genene ble indusert

på en lignende måte).

Cloning av B-gen i pWT 551:

Genet ble først innført i pAT 15 3 og clonet.

pAT 153 ble kuttet med restriksjonsendonucleaser Cia I og Bam HI (EC 3.1.23.6), (Bethesda Research Laboratories) og det resulterende store fragmentet renset ved elektroforese på

lav temperatur-gelerende agarose og ekstrahert som beskrevet tidligere. B-genet ble bundet til dette plasmidfragment,

det sammenbundne produkt brukt til å transformere E coli K12 WT 217 og transformantene selektert på ampicillin-resistens som tidligere beskrevet. Flere trans formanter ble analysert videre ved restriksjonsenzym-spalting av plasmid DNA for å bekrefte nærværet av en 100 basepart stort innskudd som inneholdt restriksjonspunkter for Sal I(Hine II), Hind III, Bgl II, Rsa I og bundet ved punkter for Cia I og Bam HI.

B-genet ble deretter overført fra pAT 15 3 til

et ekspresjonspunkt i pWT 551. pAT 153 som inneholdt B-genet ble kuttet med restriksjonsenzym Cia I og behandlet med Sl-nuclease som tidligere beskrevet, idet det ble brukt 10 enheter Sl nuclease med 10ug plasmid-DNA for å fjerne den enstrengede DNA i hver ende av plasmidet. For å sikre jevne ender ble plasmidet behandlet med DNA polymerase I (EC 2.7.7.7).

10 ym Cia I, Sl-behandlet plasmid ble inkubert ved 15°C i

2 0 minutter med 2 0 enheter (1 enhet er mengden som inkorporerer 10 nmol av alle nucleotider i en syreutfellbar fraksjon iløpet av 30 minutter ved 37°C ved å bruke poly-d(A-T) som oppstarter i henhold til Richardson, C.C, et al, (1964), J. Biol.Chem., 239, 222) DNA-polyrnerase I (stort fragment - Bethesda Research Laboratories) i 100 mM tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl2, 4 mM dithiothreitol og 0,5 mM hver av dATP, dCTP, dGTP, dTTP i lOOyl.

Plasmidet ble deretter kuttet med restriksjonsenzym Ava I og det erholdte mindre fragment renset ved agarose-gel elektroforese.

pWT 551 ble kuttet med restriksjonsenzym Hind III, deretter behandlet med Sl-nuclease og DNA-polymerase I som beskrevet ovenfor for å fjerne de enstrengede endene av plasmidet. Produktet ble kuttet med Ava I og det store fragmentet renset ved agarose-gel-elektroforese.

De således fremstilte to fragmentene ble bundet sammen under betingelser som favoriserer sammenbinding av jevne ender (beskrevet ovenfor) og brukt for å transformere

E. coli K12 WT 217 som omtalt tidligere.

Rekombinanter som inneholdt pWT 551 med den inn-førte B-kjeden ble påvist ved hjelp av størrelsen på de intakte plasmidene, ved nærværet av restriksjonspunktene innen B-genét og ved hjelp av størrelsen på B-gen-innskuddet. Sikker be-kreftelse på nærværet av hele B-genet, likesåvel som den delen av plasmidet som grenser opp til 5<1->enden i genet, ble oppnådd ved hjelp av nucleotid-sekvensering.

Som nevnt ovenfor omfattet en alternativ utførelse å fremstille et B-gen med en jevn 5'-ende fra dets oligomer-bestanddeler (oligomer ATGCAGTC brukes i stedet for CGATGCAGTC

i fig. 8) og å innføre dette i pWT 551 som er blitt behandlet med Hind III og Bam HI (Hind III enden er utjevnet med Sl-nuclease) . Rekombinanter ble sortert som beskrevet ovenfor.

Ettersom Sl-behandlingen av og til var ufullstendig eller overdreven, ble rekombinanter som inneholdt B-genet fremstilt ved disse to metodene idet de inneholdt fra 1 til 6 baser i overskudd eller mindre enn detønskede plasmid i området som svarer til ribosom-bindingspunktet ved siden av B-genet. Ekspresjonen av B-genet påvirkes av sekvensen i dette området.

Cloning av hybrid-B-C-A-gen i pWT 551:

pWT 551 som innehold B-genet ved ekspresjons-punktet for Trp, ble behandlet med restriksjons-enzymer Bgl II og Bam HI og det store fragmentet renset ved agarose gel-elektroforese. B-C-A-genet ble bundet til dette fragmentet og brukt for å transformere E.coli K12 WT 217 som beskrevet ovenfor. Flere transformanter ble analysert ved restriksjonsenzym-spalting av plasmid DNA for å bekrefte nærværet av et 119 bp stort innskudd i den ønskede plassering og som inneholdt restriksjonspunkter for Rsa I, Xma I, Hinf I, Bst NI og bundet ved punkter for Bgl II og Bam HI. Nucleotidsekvensen for et utvalgt plasmid ble bestemt for å bekrefte nærværet av detønskede gen.

Claims (13)

1. Syntetisk gen for ekspresjonen av svine-relaxin A-kjede,karakterisert vedat det omfatter følgende sekvens:

2. Syntetisk gen ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter den følgende sekvens:

3. Syntetisk gen for ekspresjonen av svine-relaxin B-kjede,karakterisert vedat det omfatter den følgende sekvens:

4. Syntetisk gen ifølge krav 3,karakterisert vedat det omfatter den følgende sekvens:

5. Syntetisk gen for ekspresjonen av et svine-relaxin hybrid med en peptidbinding -Asp-Pro-Gly-Asp-Pro- mellom B-kjeden og A-kjeden,karakterisert vedat det . omfatter den følgende sekvens:

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et syntetisk gen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisert vedat den omfatter å samle og binde sammen et antall oligonucleotid-elementer.

7. Plasmidrekombinant,karakterisertved at den omfatter en plasmid-vector, hvori det ved et innføringspunkt er innført et syntetisk gen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, idet plasmidvectoren avleser i riktig fase for ekspresjon av det innførte gen og har en bakteriell promotor foran og inntil innføringspunktet.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en plasmid-rekombinant ifølge krav 7,karakterisert vedat den omfatter å innføre et syntetisk gen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 inn i en passende plasmidvector.

9. Celle,karakterisert vedat den er blitt transformert ved innføring deri av et syntetisk gen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 eller en plasmid-rekombinant ifølge krav 7.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av en celle ifølge krav 9,karakterisert vedat den omfatter å innføre et syntetisk gen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 eller en plasmid-rekombinant ifølge krav 7 inn i en passende celle.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av i det minste en kjede av svine-relaxin,karakterisert vedat den omfatter å dyrke en celle ifølge krav 9.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av svine-relaxin,karakterisert vedat den omfatter å binde relaxin A-og B-kjeder fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge krav 11, via disulfid-broer.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av svine-relaxin,karakterisert vedat den omfatter å spalte et svine-relaxin-hybrid fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge krav 11 ved lav pH.