NO823124L - Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot vibrio anguillarum. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt vaksiner og

mer spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av en vak-i., sine mot Vibrio anguillarum og andre nær beslektede vibriotyper. Denne oppfinnelse ble gjort under Federal contract NOAA Se Grant No. NA79AA-D-000 54.

En vesentlig hindring for heldig gjennomføring av kommer-sielt fiskeoppdrett eller akvakultur er sykdom. En sykdom med særlig høy dødelighet som påvirker laks (salmonider)

og mange andre anadrome og katadrome fiskearter er vibriose (1) (Fryer et al "Vibriosis in Fish", Prog. Fish Food Sei., 5129131 (1972)). Denne sykdom bevirkes

ved infeksjon med Vibrio anguillarum og andre nær beslektede vibriotyper. Sykdommen erkarakterisert vedhjelp av en bløtende septicemia og morbiditeten følges av en massiv ødeleggelse av en rekke forskjellige celler og vevtyper (2) ( Harbell et al., "Studies on the Patahology of

Vibriosis in Coho Salmon (Oncorhynchus kisutch)", J.

Fish. Dis. 2527535 (1979)).

Selvom mange forsøk har vært gjennomført for å utvikle

en brukbar vaksine mot denne sykdom har resultatene vært skuffende. Mer spesielt har forsøk på å beskytte mot de mer virulente former av Vibrio anguillarum enten slått feil eller bare vært meget begrenset vellykket (3) (Gunnels et al., "Failure of Vaccines to Protect Salmon from Vibriosis Enzootic in Puget Sound, Washington", Am. J. Vet. Res., 377373740 (1976)) (4) (Gould et al., "Immersion Vaccination of Sockeye Salmon (Oncorhynchus nerka) with Two Pathogenic Strains ofVibrio anguillarum", J. Fish Res. Board Can., 36222225 (1979)).

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret vaksine mot Vibrio anguillarum og andre nær beslektede vibriotyper.

Et annet formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe en .forbedret metode for fremstilling av en vaksine mot Vibrio anguillarum og andre nær beslektede vibriotyper.

Et ytterligere formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe

en vaksine mot Vibrio anguillarum og andre nær beslektede vibriotyper som er meget effektiv mot mange av de virulente stammer.

Andre formål for oppfinnelsen vil. fremgå for den fagkyndige ut fra den etterfølgende beskrivelse i forbind-else med de vedføyde grafiske fremstillinger hvori: Fig. 1 er en grafisk fremstilling som viser kinetikken med opptagning av radioaktivt jern i ikke-voksende celler av Vibrio anguillarum under betingelser med jernbegrensning, og

Fi<q>. 2 er .en fotoarafiskDrdduksion av en SOS polYakrylamid-geL .....

som viser området for jernkloridkonsentrasjoner hvor produksjon av spesifikke overflateproteiner li- Vibrio 'anguillarum induseres.

Helt generelt omfatter en fremgangsmåte i samsvar med oppfinnelsen dyrking av celler som gir ekspresjon-for 86000 dalton protein OM2 som er tilstede i den ytre membran av Vibrio anguillarum som dyrkes under jernbegrensning. Slike celler kan være enten Vibrio anguillarum eller celler som er en ikke-patogenisk vert som har replikerbar DNA-koding for i det minste en vesentlig del av OM2 proteinet. Cellene blir deretter enten svekket eller drept og anvendt som en vaksine, eller OM2 protein isoleres fra cellene og anvendes som en vaksine.

Det har vært vist at virulens i Vibrio anguillarum er forbundet med nærvær av et spesielt plasmid i patogenet (5)

(Crosa et al., "Evidence for Plasmid Contribution to the Virulence of the Fish Pathogen Vibrio anguillarum", Infect. Immun. 18509513 (1977)). Denne spesifikke plåsmid-klåsse

er fraværende i lav-virulens stammer (6) (Crosa et al., "Curing of a Plasmid is Correlated with an Attenuation of Virulence in the Marine Fish Pathogen Vibrio anguillarum", Infect. Immun. 27',897-902 (1980)).. " Sammenhengen mellom denne spesifikke plasmid-klasse og virulensen avVibrio anguillarum er blitt påvist (7) ( Crosa et al., "A Plasmid Associated with Virulence in the Marine Fish Pathogen

Vibrio anguillarum Specifies an Iron Sequestering System", Nature,28:4566-567 (1980)), Dette muliggjør at bakterien kan overleve under betingelse med begrenset jern-tilgjenge-lighet. Betydningen av dette forhold er at bakterien derfor blir i stand til å overleve og vokse selv når vert-forsvarsmekanismene bevirker binding av jern til protein-ene transferrin og lactoferrin.

Det er rapportert at mange av de virulente stammer av Vibrio anguillarum .biotyper I isolert i den Nordvestre Stillehavsdel av USA inneholder en spesifikk plasmid— klasse pJM1 som er fraværende i lavvirulens stammer (5). Forsøkene antydet at virulens var forbundet med denne spesielle plasmid-klasse. Virulens mekanismen synes å være evnen i de virulente stammer som inneholder plasmidet, til å oppta jern selv om den infiserte vertsfisk's for-svarsmekanisme frembringer transferrin og lactoferrin til å binde seg til jernet (6). På grunn av Vibrio anguillarum innholdende dette plasmid derfor har evnen til å vokse under betingelser med jernbegrensning vil den invaderende bakterie være i stand til å formere seg i kroppsvæsker og ' vev ved å trekke ut det bundne jern fra det jernbindende protein.

Det er oppdaget at de stammer av Vibrio anguillarum som

erkarakterisert veddet plasmid-formidlede opptagnings-system har visse spesifikke ytre membranproteiner hvorav i det minste et bare fremstilles når virulens-plasmidet er til stede. Disse ytre membranproteiner synes å være forbundet med jernopptagningsfunksjonen. Det antas at disse ytre membranproteiner danner en reseptor for ferri-siderofor (jernbindende forbindelser frembrakt av bakterien) nødvendig for transport derav inn i cellen.

Analyse av ytre membranproteiner til stede i Vibrio anguillarum inneholdende virulens-plasmidet viser at i det minste to ytre membranproteiner induseres under vekst—^betingelser - hvori jern er begrenset til visse nivåer.

Et av disse proteiner, betegnet 0M2, er 86000 dalton molekylvekt og er forbundet med nærværet av pJM1 plasmidet. Selvom dette protein bare er til stede i stammer inneholdende plasmidet, er det til nå uvisst om dette protein faktisk godes for av plasmidet og induseres som en følge av en nedsettelse i jernkonsentrasjonen eller om det er et ki-omosonalt produkt som reguleres ved hjelp av en plasmid spesifikk substans.

Det annet protein som er påvist i den ytre membran er betegnet 0M3 er 79000 dalton molekylvekt. Sammenhengen mellom dette protein og plasmidet pJM1 er ennå uklar.

I samsvar med oppfinnelsen fremstilles vaksinen fra celle-kulturer som dyrkes på en slik måte at OM2 protein får ekspressjon. Foretrukket er disse celler Vibrio anguillarum celler dyrket under jernbegrensning tilstrekkelig til å indusere ekspressjon av OM2 protein. Proteinet kan■ imidlertid også produseres ved å produsere en vert celle med en replikerbar DNA koding for i det minste en vesentlig andel av OM2 proteinet. Rekombinant DNA teknikk er vel kjent for den fagkyndige og kan følges for å frembringe slike vert celler. I alle fall blir cellene deretter svekket eller drept og anvendt som vaksine, eller 0M2 proteinet isoleres fra cellene og anvendes selv som vaks-.'. • ine. Som et eksempel ble stammer av Vibrio anguillarum, hvorav noen inneholdt virulens-plasmidet og hvorav noen var behandlede derivater av plasmidbærende stammer under-søkt som følger: Sammenheng mellom jernopptagning, nærvær av plasmid og virulens i stammer av Vibrio anguillarum. a) Plasmid DNA ble bestemt ved hjelp av en agarose elek-troforetisk metode som beskrevet i (6). b) Verdiene ble oppnådd fra kinetiske forsøk liknende som i fig. 1 ved å bestemme forholdet<55>Fe cpm/tid ved tids-punktet 20 minutter. c) ; LD50 verdier ble bestemt som beskrevet i det følgende. Som angitt i tabellen ble de spesielle stammer undersøkt med hensyn til evnen til å ta opp jern og midlere letale doser. Målingen av jernopptaket ble gjennomført som følger: Bakteriestammer ble dyrket i flere generasjoner ved 22°G i et minimal medium med lavt jerninnhold (Langman, L. et al, J.Bacteriol 112:1142-1149 (1972)) (jerninnhold 2^um) supplert med 0,5% (vekt/volum) glukose og de nødvendige aminosyrer, aspartinsyre og histidin, med 20Aig/ml. Eksponentielt dyrkede kulturer ble sentrifugert, cellene ble vasket og resuspendert til en densitet på 0,4 x 10 8 celler i tilsvarende medium med unntagelse av at jerninnholdet nå var mindre enn 0,5^,uM jern. Etter ytterligere inkubasjon i 2 timer ved 22°C for å tømme jernholdige intracellulære ansamlinger ble kulturene sentrifugert, cellene ble vasket og resuspendert til en densitet på 4 x 10 8 celler/ml i et liknende medium som manglet essensielle aminosyrer men inneholdende 100 yUM natrium- nitrilotriacetat.. I noen forsøk ble to "mM KCN (en respirasjons inhibitor) inkludert i dette trinn. Bærer-fritt<55>FeCl3C u Ci/ml) ble tilsatt til cellesuspensjonene under rysting, 1 ml prøver ble fjernet med mellomrom og filtrert gjennom millipore-membranfiltere (0,45^uM porestørrelse). Filteret ble vasket med 100 mM natriumnitrat, tørket og tellet i en "Packard-TriCarb" væske-scintillasjons-teller under anvendelse av en

toluen-basert scintillasjons-blanding inneholdende "Omnifluor" (New England Nuclear) med 4 gram/liter.

For. å bestemme om evnen til plasmid—bærende høy-virulens Vibrio anguillarum-stammer til å dyrkes under jern-begrensede betingelser skyldes et effektivt jernopptag-ningssystem ble opptagningen av radioaktivt jern av ikke-voksende celler målt direkte. Plasmid-bærende Vibrio anguillarum 775 (pJM1) og det plasmidløse deri-

vat H775-3 ble dyrket i et minimal medium inneholdende omtrent 2 uM FeCl^ (minimal jernkonsentrasjon ved hvilken stammen H775-3 kan vokse) i flere generasjoner. Eksponentielt dyrkede kulturer ble sentrifugert, cellene ble vasket med lav-jernmedium (jerninnhold mindre enn 0,5 uM) og resuspendert til 0,4 x 10 o celler/ml i liknende medium.inneholdende mindre enn 0,5 uM jern. Etter inkubasjon i dette medium for å tømme intracellulære jern-ansamlinger ble kulturene sentrifugert, cellene vasket og resuspendert til en densitet på 4 x 10 celler i liknende medium som manglet essensielle aminosyrer men inneholdende nitrilotriacetat og deretter utsatt „ for -- 55 Fe som be-! skrevet i det foregående. Fig. 1 og den foregående tabell viser at under de samme opptagningsbetingelser opptar ikke-voksende celler av plåsmidbærende høyvirulens Vibrio anguillarum 775 (pJM1), 133 s "(pJM1) eller LS174 (pJM1) radioaktivt jern hurtigere enn det isogene; , ' plasmidløse lawirulens derivat H775-3. I fig." 1 er plasmid-bærende 775 (pJM1) data indikert ired en åpen sirkel (o-); i plasmid-bærende 775 (pJI.11) data i medium inneholdende - 2 roM^KCN er indikert med et lukket tr;iangel((A) og plasmid-løst derivat H775-3 er indikert med en lukket sirkel Jo). Liknende lav opptagning ble oppnådd med andre_plasmid-løse lawirulens derivater vist i tabellen.

Ytterligere informasjon vedrørende de forhold som fører til jern-akkumulering ble oppnådd ved å anvende respirasjons-inhibitoren KCN. En energiavhengig prosess som transport av jern inn i_cellen inhiberes av KCN mens derimot binding av jern til bakteriemembranen som er enérgi-uavhengig inhiberes.ikke1." Fig. 1 viser at jernakkumulering\av plasmid-bærende stammer av den plasmid-bærende stamme av Vibrio anguillarum 775 (pJM1) inhiberes i, sterk; grad av-.to 2mMKCN.•

og dette tyder på at prosessen

må være en cpptagning snarere enn enkel binding til bakteriemem-branene, selv om nærværet av en liten grad av energiuavhengig akkumu-lering av jern (i nærvær av KCN) kunne skyldes et eller annet slags assosieringstrinn som også synes å være plasmid-formidlet.

Disse resultater viser at nærvær av virulensplasmid i Vibrio anguillarum faktisk iiinbefatter en hurtigere og mer effektiv jernopptagning. Denne iakttagelse forklarer evnen til plasmid-bærende Vibrio anguillarum til å vokse i nærvær av jern-chelatorer.

For ytterligere å undersøke nærværet av det plasmid-medierte jern-opptagningssystem i Vibrio anguillarum ble det foretatt en under-søkelse cm noe spesifikt celleomhyllingsprotein ble indusert under betingelser med jernbegrensning. Dette er tilfellet med jernopptag-ningssystemene i visse enteriske bakterier. For dette formål ble Vibrio anguillarum 775 (pJM1) og dens plasmidløse lawirulensderivat H775-3 dyrket i ininimal medium til jern som FeCl^ ble tilsatt i forskjellige konsentrasjoner. I noen tilfeller ble 3 yUM transferrin tilsatt til dyrkingsmediet. Totale celleomhyllinger såvel som ytre membraner ble fremstilt fra celler dyrket under disse forskjellige betingelser og ble analysert ved hjelp av et SDS-polyakrylamid-gel elektroforese. Fig. 2 forsøk A-H viser totale célleromhyllinger for begge stammer ved forskjellige FeCl^konsentrasjoner, mens forsøk I og J er yttermembranproteiner oppnådd fra celler dyrket ved 2

uM FeCl-j. Mer spesifikt viser banene A til F totale celleomhyllinger av plasmid som bærer Vibrio anguillarum 775 (pJM1). Geilene i bane A ble dyrket i nærvær av 3^uM transferrin. Cellene i baner B til F

ble dyrket i nærvær av FeCl3. Bane B illustrerer 2^uM av EeCl3, bane C illustrerer 4^uM FeCl^, bane D illustrerer 8^uM FeCl^, bane E illustrerer 12^uM FeCl3og bane F illustrerer 24^uM FeCl3. Baner G og H viser de totale celleomhyllinger av plasmidløst derivat H775-3 når cellene ble dyrket i nærvær av FeCl^. Bane G illustrerer 2^uM FeCl^og bane H illustrerer 8^uM FeCl^. Baner I og J er de ytre membraner oppnådd fra celler dyrket med 2^uM FeCl^. Bane I er plasmid-bærende Vibrio anguillarum 775 (pJM1) og bane J er plasmidløs H775-3. Som fig. 2 illustrerer er der fem hoved-yttermembranproteiner (QM1-5)

i det plåsmidbærende stammer dyrket ved 2 uM FeCl^. En av disse GM2 mangler i det plasmidløse derivat.

Analyse av totale celleromhyllinger fra den plasmidholdige stamme viser klart at der er en terskel med FeCl^-kansen-trasjon (under 4 uM) hvor både 0M2 og 0M3 kan induseres mens disse proteiner ikke kan påvises ved høyere jern-konsentrasjoner i plåsmidbærende stammer (forsøk A-F). Forsøk A viser at både 0M2 og 0M3, som forventet, er tilstede i den plåsmidbærende stamme dyrket i nærvær av 3^uM transferrin. I tilfellet med den plasmidløse stamme er 0M3 proteinet det eneste protein som induseres ved 2^uM FeCl-j (laveste jernkonsentrasjon som tillater dyrking av denne stamme) (sammenlikn forsøk G, J og H). Således vil jernbegrensningsbeéingelser som tillater en meget hurtig opptagning av radioaktivt jern av plåsmidbærende Vibrio anguillarum stammer også indusere syntese av to spesifikke yttermembran proteiner 0M2 og 0M3 ved 86000 henholdsvis 79000 dalton (som målt med proteinmolekylvekt standarder (ikke vist). OM2 proteinet er forbundet med nærvær av plasmidet pJM1.

En forhøyet syntese av OM2 proteinet under jernbegrens-ningsbetingelser kunne reflektere et øket antall kopier av virulensplasmidet under disse samme betingelser. Dette er imidlertid ikke tilfellet. Plasmid-kopitall bestemt i nærvær av transferring og ved forskjellige jernkonsentra-sjoner (0,05-12^uM) indikerte at der ikke var noen særlig endringer i kopiantallet mens der i dette samme området av konsentrasjoner er dramatiske endringer i induk-sjonen av OM2 proteinet (fig. 2).

De foregående resultater viser at overflateproteinet 0M2

og om mulig overflateproteinet 0M3 er betydningsfulle fak-torer i virulenskvaliteten av det patogen som her interes-serer. Deres nærvær er derfor signifikant ved fremstilling av en antistoff reaksjon for disse proteiner i en in-fisert vertfisk-art. Tidligere vaksiner tar ikke hensyn til dette forhold. Følgelig kan vaksiner fremstilles fra bakteriestammer som gir ekspresjon for dette protein, ved svekking eller dreping av stammene om nødvendig ved hjelp

av konvensjonell teknikk. Som et alternativ kan vaksiner fremstilles ved å rense selve overflateproteinet som vak-sinasjonsmidlet.

Det kan derfor sees at vaksiner fremstilt i samsvar med oppfinnelsen medfører mer nøyaktig immunitet til de sterkt virulente stammer av Vibrio anguillarum og andre nær beslektede vibriotyper.

Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg .til den som er vist og beskrevet heri vil fremstå klart for den fagkyndige fra den foregående beskrivelse og de ved-føyde illustrasjoner. F.eks. kan produkter beskrevet heri anvendes sammen med produkter av andre vibrio-serotyper til å tilveiebringe bredere immunitet. Slike modifikasjon-., er er ment å falle innenfor rammen av de etterfølgende patentkrav.

Litteraturhenvisninger.

1. Freyer et al., "Vibriosis in Fish", Prog. Fish Food Sei., 5129131 (1972).

2. Harbell et al., "Studies on the Pathology of

Vibriosis in Coho Salmon (Oncorhynchus kisutch)".

J. Fish. Dis. 2527535 (1979).

3. Gunnels et al., "Failure of Vaccines to Protect

Salmon from Vibriosis Enzootic in Puget Sound, Washington", Am. J. Vet. Res., "37737740 (1976).

4. Gould et al., "Immersion Vaccination of Sockeye

Salmon (Oncorhynchus nerka) with Two Pathogenic

Strains of Vibrio anguillarum", J. Fish Res. Board Can., 36222225 (1979) . 5. Crosa et al., "Evidence for Plasmid Contribution to the Virulence of the Fish Pathogen Vibrio anguillarum", Infect, Immun. 18509513 (1977). 6. Crosa et al., "Curing of a Plasmid is Correlated with an Attenuation of Virulence in the Marine Fish Pathogen Vibrio anguillarum", Infect. Immun. 27897902.: (1980) .

7. Crosa et al., "A Plasmid Associated with Virulence in the Marine Fish Pathogen Vibrio anguillarum Specifies an Iron Sequestering System", Nature, 284566567

(1980).

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Vibrio anguillarum og andre nær beslektede vibriotyper, karakterisert ved at å dyrke Vibrio anguillarum-celler under jernbegrensning tilstrekkelig til å indusere ekspresjon av 86000 dalton yttermembran-protein OM2 og svekking eller dreping av disse celler.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at jerninnholdet i dyrkingsmediet hvori cellene dyrkes er mindre enn omtrent 4^ uM.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at 79000 dalton ytter-membranproteinet OM3 også bringes til ekspresjon.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Vibrio anguillarum og andre nær beslektede vibriotyper, karakterisert ved at dyrking av celler som gir ekspresjon av 86000 dalton protein 0M2 som er tilstede i den ytre membran av Vibrio anguillarum som dyrkes under j ernbegrensning.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at de nevnte celler er Vibrio anguillarum.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at de nevnte celler er en ikke-patogenisk vert celle med replikerbar DNA koding for i det minste en vesentlig del av 0M2 proteinet.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at cellene svekkes.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at cellene drepes.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at 0M2 proteinet isoleres fra cellene.