JPS58500026A - 魚類用ワクチン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 魚類用ワクチン類 本発明は一般的にはワクチン類に関する。更に詳細には、本発明はビブリオアン グイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｔｎｇｕｉ−１１ａｒｕｒｎ、）およびその他の 近縁のビブリオ属菌類に対するワクチンの製造方法に関する。この発明は連邦契 約Ｎ０ＡＡ海洋許可Ａ６ＮＡ７９ＡＡ　Ｄ　０００５４のもとてなされた。

養魚せたは養殖の商業的成功の主要な障害は病気である。サケ（サケ科の魚）お よびその他の多くの遡河性ならびに降流性の魚類に影響を及ぼす特に高い死亡率 の病気の１つはビブリオ菌症である（１）。この病気はビブリオアングイラルム およびその他の近縁のビブリオ属菌類に感染することによってひきおこされる。

この病気の特徴は出血性敗血症である。１だ、罹病率は各種の細胞および組織タ イプの大量死をともなう（２）。

この病気に対する有効なワクチンを開発するために多くの試みがなされてきたが 、結果はいずれも失望するものばかりであった。更に詳細には、よシ毒性の強い 形のピプリオアングイラルムに対して保護する試みは完全な失敗か、あるいは、 極めて限定的な成功しかおさめて０１ない（３）【４）。

本発明の目的はビブリオアングイラルムおよびその他の近縁のビブリオ属歯類に 対する改良されたワクチンを提供することである。

本発明の他の目的はビブリオアングイラルムおよびその他の近縁ビブリオ属菌類 に７１するワクチンの改良された製造方法を提供することである。

本発明の別の目的はビブリオアングイラルムおよびその他の近縁のビブリオ属菌 類に対するワクチンを提供することである。このワクチンは多くの強毒性菌株類 に対して極めて有効である。

本発明のその他の目的は下記の記載および添付図面力為ら当業者に明らかとなる 。

第１図は鉄欠乏条件下におけるビブリオアングイラルムの非増殖細胞による放射 性鉄の吸収速度を例証するグラフでちる。および、 第２図はビプリオアングイラルムの特定の表面蛋白質の生成が誘発される塩化鉄 濃度の範囲を例証する写真複写である。

極めて一般的には、本発明の方法の一実施態様は８６、０００ダルトン蛋白ＯＭ ２を発現する細胞を増殖させることからなる。８６．０００ダルトン蛋白ＯＭ２ は鉄欠乏下で増殖するビブリオアングイラルムの外膜中に存在する。このような 細胞はビブリオアングイラルムか、または、０Ｍ２蛋白の少なくとも本質的部分 を暗号解読する複製可能ＤＮＡを有する非病原性宿主である細胞のいずれかでち る。続いて、この細胞を弱毒比重たは死滅させ、そして、ワクチンとして使用す るか、ある１７′Ｉは、０Ｍ２蛋白を細胞から単離し、そして、ワクチンとじて ヒブリオアンクイラルムの毒性は病原体中の特定のプラスミドの存在に関係する ことが示されている（５）。この特定の種類のプラスミドは低毒性菌株には存在 しない（６）。

この特定の種類のプラスミドとビブリオアノグイラルムとの関係は既に実証され ている（７）。更に、ビブリオアングイラルムの毒性プラスミドは極めて効率的 な鉄隔絶系を形成することを裏付ける確証の存在が報告されている（７）。これ によって、細菌は鉄の利用可能性が制限された条件下でも生存できる。従って、 この事実の重要性は、たとえ宿主防衛機構が鉄を蛋白トランスフェリンおよびラ クトフェリンに結合させたとしても、細菌は生存し、そして、増殖できるという ことである。

アメリカ合衆国のバシフイノクノースウエスて単離されたピブリオアングイラル ム生物型Ｉの強毒性菌株の多くは特定の種類のプラスミドｐＪＭ１をかくしもっ ていることが報告されている（５）。低毒性菌株はこのようなプラスミドを有し ない（５）。数多くの実験は、毒性はこの特別な種類のプラスミドにともなうも のであることを示唆した。この毒性機構は、たとえ、感染宿主魚類の防衛機構が トランスフェリンおよびラクトフェリンと鉄を結合させたとしても、前記プラス ミド含有強毒性菌株中で鉄を摂取する能力であると思われる（６）。従って、こ のプラスミドを含有するビブリオアングイラルムは鉄結合蛋白から結合鉄を掃去 することによって、鉄欠乏条件下でも増殖できる能力を有するので、侵入細菌は 体液および組織中で増殖できる。

プラスミド仲介摂取系を特徴とするビブリオアングイラルムのこれら菌株はある 種の特別な外膜蛋白を有し、毒性プラスミドが存在する場合、この蛋白のうちの 少なくとも１つは必らず生成されることが発見された。これらの外膜蛋白は鉄摂 取機能に関係があるものと思われる。

これらの外膜蛋白はその細胞への輸送に必要なシダロホーレ（５ｉｄｅｒｏｐｈ ｏｒｅ）第２鉄（細菌によって生成される鉄結合化合物）用の受容体を形成する ものと思われる。

毒性プラスミド含有ビブリオアングイラルム中に存在する外膜タンパクを分析し たきころ、鉄があるレベル１て欠乏されている生育条件下で少なくとも２個の外 膜蛋白が誘発されることが実証された。これらの蛋白のうちの１つは０Ｍ２と呼 ばれる８　６，０００ダルトン分子量のものであり、ｐＪＭＥプラスミドの存在 に関連する。この蛋白はプラスミド含有菌株中にのみ存在するが、この蛋白はプ ラスミドによって本当に暗号解読され、そして、鉄濃度の減少に反応して誘発さ れるのか否か、あるいは、この蛋白はプラスミド特定物質によって調節される染 色体生成物であるのか否かい捷たにはつきシしていない。

外膜中にみいだされる２番目の蛋白は０Ｍ３と呼ばれ、７９．０００ダルトン分 子量のものである。この蛋白とプラスミドｐＪＭ１の関係はいまたに不明確であ る。

本発明によれば、ワクチンは０Ｍ２蛋白が発現される５ ような方法で増殖される細胞の培養物から製造される。

このような細胞は０Ｍ２蛋白の発現を誘発するのに十分な鉄欠乏下で増殖される ビブリオアングイラルム細胞であることが好ましい。しかし、この蛋白は、０Ｍ ２蛋白の少なくとも本質的な部分の暗号を解読する複製可能ＤＮＡを有する宿主 細胞を調製するこ♂によっても製造できる。組みかえＤＮＡ技術は当業者に周知 であり、このような宿主細胞を調製するのに使用てきる。いずれの場合において も、細胞をその後弱毒比重たは死滅させ、ワクチンとして使用するか、若しくは ０Ｍ２蛋白を細胞から単離し、そして、それ自体をワクチンとして使用する。例 えば、あるものは毒性プラスミドを含有し、また、あるものはプラスミド運搬菌 株の矯正された誘導体であったビプリオアングイラルムの菌株を次のようにして 研究した。

鉄摂取、プラスミドの存在およびピプリオアングイラルムの菌株の毒性との間の 相互関係 ？７５（７＋ＪＭ１）　＋　１１．５００　１．Ｏｘ１Ｏｘ１０３１３３Ｓ（ｐ Ｊ　＋　１２．０００　１．３ｘｌＯ３Ｚ、５１７４（ｐＪＡ／１）　＋　１５ ．０００　５．０ｘ１０２Ｚ、５１７４−ＷＴＩ　７００　２．０ｘ１０７Ｈ７ ７５−３−５５０３Ｘ１０７ Ｈ７７５−８４５０２，５ｘｌＯ’ Ｅ７７５−１００　−　６００　２ｘｌＯ’■　プラスミドＤＮＡは（６）に開 示されたようなアガロース電気泳動法によって決定した。

■　この値は２０分間の時間点における５５Ｆｅ　ｃｐｍ／時間の比を決定する ことによって第１図における速度実験と同様な速度実験から得た。

■　ＬＤ５０値は下記のようにして測定した。

表に述べたように、特定の菌株の鉄摂取能力および平均致死量について研究した 。鉄損取量の測定は次のようにして行なった。

０．５ｗｔ／υｏ１％グルコースおよび２０μ７鷹の必須アミノ酸、アスパラギ ン酸およびヒスチジの追加された低鉄最小培地（１４）（鉄含量２μＭ）中で２ ２℃で細菌菌株を数世代にわたって増殖させた。指数的に増殖した培養物を遠心 分離し、細胞を洗浄し、そして、鉄含量が０．５μＭ、未満であること以外は前 記と同じ培地中に０，４×１０８　個の細胞密度にまで再懸濁させた。２２℃で 更に２時間培養して鉄細胞内プールを涸渇させた後、培養物を遠心分離し、細・ 胞を洗浄し、そして、必須アミノ酸を含有せず、そのかわりにニトリロトリ酢酸 ナトリウムを１００μＭ含有する前記と同じ培地中に４Ｘ１０”細胞／ｍｅの密 度になるまて再懸濁させた。いくつかの実験では、この段階てＫＣＮ（呼吸阻害 剤）を２　ｍＡ／添加した。

無担体”ＦｅＣ１３（１ｐｃｉ／ｍｌ）を振とうｍ　胞懸濁ＫＫ　添加し、定期 的にサンプルｌ　ｍｌを回収し、ミリポアメンブランフィルタ−（孔径０．４５ μＭ）を通してｐ過しだ。Ｐ液を１００　ｍＭ硝酸す）　ＩＪウムて洗浄し、乾 燥させ、そして、オムニフラワー（Ｏｒｎ、ｎｉ　ｆ　ｌ　ｏｗｒ　）　（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇ　ｌ　ａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を４７／β含有するトルエンをベース にしたシンチレーション混液ヲ使用し、Ｐａｃ、ｋａｒｄ　Ｔｒｉ液体シンチレ ーションカウンターで計数した。

プラスミド保有強毒性ピプリオアングイラルム菌株が鉄欠乏条件下で増殖できる 能力は効率的な鉄摂取系によるものであるのか否かを決定するために非増殖細胞 による放射性鉄の摂取を直接測定した。プラスミド保有ビブリオアングイラルム ７７５　ＣｐＪＭｌ）およびプラスミド非保有誘導体Ｈ７７５−３をＦｅＣ１， 約２μＡ／（Ｈ７７５−３菌株が増殖できる最小鉄濃度）含有最小培地中で数世 代にわたって増殖させた。指数的に増殖した培養物を遠心分離し、細胞を低鉄培 地（鉄含量０．５μＭ未満）て洗浄し、そして、鉄を０５μＭ未満含有する同様 な培地中に０．４Ｘ１０８細胞／　ｍｌの密度になるまで再懸濁させた。

この培地中て培養し細胞内鉄プールを涸渇させた後、培養物を遠心分離し、細胞 を洗浄し、そして、必須アミノ酸を含有せず、二）　ＩＪロトリ酢酸塩を含有す る同様な培地中に４Ｘ１０８細胞の密度になるまで再懸濁させ、その後、゛材料 および方法”中に開示したように５５Ｆｅに暴露させた。第１図および前記の表 は、同じ摂取条件下ではフラスミド保有強毒性ビプリオアングイラルム７７５（ ｐＪＭｌ）、１３８　ＳＣｐＪＭｌ）またはＬＳＩ７４（ｐＪＭｌ）の非増殖細 胞は同遺伝子型プラスミド非保有低毒性誘導体Ｈ７７５−８よりも一層迅速に放 射性鉄を摂取することを示している。同様な低摂取は表中に開示されたその他の プラスミド非保有低毒性誘導体についても認められた。

鉄蓄積をひきおこす結果に関する追加の情報は呼吸阻害剤ＫＣＮを使用すること によって得られた。鉄の内部輸送と類似のエネルギー依存方法では、細胞はＫＣ Ｎで阻害されるが、エネルギー非依存性の細胞膜への鉄の結合は阻害されない。

第１図はビプリオアングイラルム７７５　（ｐ、７Ａ／１）のプラスミド保有菌 株による鉄蓄積はＫＣＮ２ｍｕで著しく阻害されるこ々を示している。このこと は、ＫＣＨの存在下における少量のエネルギー非依存性鉄蓄積の存在はプラスミ ドによって介在されるものと思われるある種の会合工程によるものでちるが、方 法は細菌膜への単純な結合よりもむしろ摂取でなければ９ ブｊらないこ古を示唆し２ている。

こｔｔらの結束は、ビブリオア／グイラルム中に毒性プラスミドが存在すると実 際、極めて迅速で、しかも効率的な鉄摂取がおこることを実証している。この観 察はプラスミド保有ビブリオア／グイラルムが鉄キレ−−−１−化剤の存在下で も増殖できることを説明する。

ビブリオアングイラルム中のプラスミド介在鉄摂取系の存在を更に調査するため に、どのような特定的細胞エンベローブ蛋白は鉄欠乏条件下で誘発されるが否か について実験を行なった。これは、ある種の腸内細菌中の鉄摂取系に関する事例 である。この目的のだめに、ヒブリオアノダイア＃ム７７５　（ｐＪＡｌｌ）お よびそのプラスミド非保有低毒性誘導体Ｈ７７５−８を最小培地中で増殖させた 。この培地には鉄分としてＦｅＣｌ３が様々な濃度で添加されていた。いくつか の場合では、８μＭのトランスフェリンを増殖培地に添加した。このような様々 な条件下て増殖させた細胞から全細胞エンベロープおよび外膜を調製し、そして 、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。第２図のレー ンＡ−Ｈは様々なＦｅＣｌ３濃度における両菌株の全細胞エンベロープを示す。

一方、レーンＩおよびＪは２μＭのＦｅＣｌ３で増殖された細胞から得られた例 膜蛋白である。２μＭのＦｅＣ１，濃度で増殖されたプラスミド保有菌株中には ５個の主要な外膜蛋白Ｃ０Ｍ１〜０Ｍ５）が存在する。これらの０Ｍ２のうちの １つはプラスミド非保有誘導体にはＪＯ特待：５８−５００［１２Ｆ；　（４） 存在しない。

プラスミド保有菌株の全細胞エンベロープの分析は、０Ｍ２および０Ｍ３の両蛋 白を誘発できろＦ　ｅ　Ｃｌ　３濃度の閾値（４μＭ以上〜）が存在し、そして 、０Ｍ２および０Ｍ３蛋白はこれより高い鉄濃度ではプラスミド保有菌株中に発 見てきない（レーンＡ−７’ｉ’）ことを明確に示している。レーンＡは、３μ Ｍのトランスフェリンの存在下で増殖されたプラスミド保有菌株中に予想どおり ０Ｍ２ならびに０Ｍ３の両蛋白が存在していることを示す。プラスミド非保有菌 株の場合、０Ｍ３蛋白は２μＭのＦｅＣｌ３て誘発される唯一の蛋白である（こ の濃度はこの菌株が増殖できる最底鉄濃度である）（レーン（〕、ＪおよびＨと 比較せよ）。従って、プラスミド保有ビブリオアングイラルム菌株による極めて 迅速な放射性鉄の摂取を可能にする鉄欠乏条件は壕だそれぞれ８６．０００およ び７９，０００ダルトン（蛋白分子量標準（示されていない）で測定）の２つの 特定の外膜蛋白ＯＭ２およびＯＭＢの合成も誘発する。０Ｍ２蛋白はプラスミド ｐＪＭ１の存在と関係がある。

鉄欠乏条件下における０Ｍ２蛋白の高められた合成はこれらと同じ条件下におけ る毒性プラスミドの増大コピー数の反映であるとすることができるだろう。しか し、事実はそうてはない。トランスフェリンの存在下および様々な鉄濃度で」１ １定したプラスミドのコピー数はコピー数にさほどの変化もないことを示したが 、この同じ濃度１ 範囲ては、ＯＡｆ　２蛋白の誘発に劇的な変化がおきた（第２図）。

前記の結果は、表面蛋白ＯＡｆ　２およびおそらく表面蛋白ＯＭ３は問題の病原 体の毒性の程度における重要な因子であることを実証している。従って、これら 蛋白の存在は感染宿主魚＠種においてこ１１ら蛋白に反応する抗体の産生に意義 がある。従来のワクチンはこの事実を考慮していない。従って、必要ならば、常 法によって菌株を弱毒化まだは死滅させることによって、この蛋白を発現する細 菌菌株からワクチンを製造できる。別法として、ワクチン化剤さして表面蛋白そ れ自体を精製することによってもワクチンを製造できる。

従って、本発明によって製造されたワクチンはヒブリオアングイラルムおよびそ の他の近縁のヒブリオ用菌の強毒性菌株に対して一層精密な免疫性をさすけるこ とが理解できる。

本書に開示した内容の他に本発明の様々な変更例は前記の記載お−よび添伺図面 から当業者には明らかとなる。

例えば、本書に開示した生成物はその他のビブリオ血清型の生成物と一緒に使用 して一層広い免疫性をもたらすことができる。これらの変更例も添付の晶求の範 囲内に］、、Ｆｒｙｅｒら、、”　Ｖｉｂｒｉｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｆｉｓｈ　”　 、　Ｐｒｏｇ。

Ｆｉｓｈ、　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、、５　：１２９−１３１　（１９７２）。

２、Ｈａ、ｒｂｅｌｌら、、　”　Ｓｔｗｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｐａｔｈ、 ｏｌｏｑ’／　ｏｆＶｉｂｒｉｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｃｏ１１ｏ　Ｓａ、ｉｍｏｎ、 （ＯｎｃｏｒｈＪｎｃｈｗｓｋｉｓｕｔｃ　）＋、）　、Ｊ、Ｆｉｓｈ、Ｄｉｓ 、２　：　５　２　７−５　３　５　（１９７９）　。

３　、Ｇｕｎｎ　ｅ　ｌ　Ｓら、、”　Ｆａｉｌｕ、ｒｅ　ｏｆ　ｌ１ａｃｃｉ ｎ、ｅｓ　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｃｔＳａ、ｉｍｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｖｉｂｒｉｏｓｉ ｓ　Ｅｎｚｏｏｔｉｃ　ｉｎ　Ｐｕｇｃｔ４＋、Ｇｏｕｌｄ　ｒ−）、　”　Ｉ ｍｍｅｒｓｉｏｎ　Ｖａ、ｃｃｉｎ。ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳｏｃｌｃｅｙｅＳａ ｌｍ、ｏｎ　（ＯｎｃｏｒｈＪｎｃｈｕｓ　ｎｅｒｋａ）Ｗｉｔｈ　Ｔｗｏ　Ｐ ａｔノｌＯ−ｇｅｎｉｃ　５ｔｒａ、ｉｎｓ　ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉ ｌｌａ、ｒｗｍ”、Ｊ。

Ｆｉｓｈ　Ｒｅｓ、Ｂｏａｒｄ　Ｃａｎ、、’３６　：　２２２−２２５　（１ ９７９）５、Ｃｒｏｓａら、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｃ ｍｔｒｉｂｕｔｉｃｍ６、　Ｃｒｏｓａ、ら、”　Ｃｗｒｉｎｇ　ｏｆ　ａ　Ｐ ｌａｓｍｉｄ　ｉｓ　ＣｏｒｒｅｌａｔｅｄＷｉｔｈ　ａ７＋Ａｔｔｅｎｕａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅＪｎｆｅｃｔ、Ｉｗｒｂｕｎ 、２’７　：８９７−９０２（１９８０）。

？、Ｃｒｏｓａら、　”　Ａ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　Ｗｉｔ ｈ　Ｖｉｒｕ−３’／　ｓ　ｔ　ｅｍ″、Ｎａｔｕｒｅ、’２Ｂ４　：５６６− ５６７（１９８０）。

ＦＩＧ、　１ 時間　分 ＦＩＧ、　２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．８６，０００ダルトノ外膜蛋白ＱＡ／２の発現を誘発させるのに十分な鉄欠 乏条件下でビブリオアングイラルム細胞を増殖させ、そして、該細胞を弱毒化ま たは死滅させることからなるビブリオアングイラルムおよびその他の近縁のビブ リオ属菌類に対するワクチンの製造方法。 ２、細胞が増殖される生育培地中の鉄含量が約４μＭ未満である請求の範囲第１ 項に記載の方法。 ８．７９，０００ダルトン外膜蛋白ＯＭ８も発現される請求の範囲第１項に記載 の方法。 ４、鉄欠乏条件下で増殖するビプリオアングイラルムの外膜中に存在する８　６ ．０００ダルトン蛋白ＯＭ２を発現する細胞を増殖させることからなるビブリオ アングイラルムおよびその他の近縁のビブリオ属菌類に対するワクチンの製造方 法。 ５、前記細胞はビブリオアングイラルムである請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、前記細胞は０Ｍ２蛋白の少なくとも本質的部分の暗号を解読する複製゛可能 ＤＮＡを有する非病原性宿主細胞である請求の範囲第４項に記載の方法。 ７、前記細胞は弱毒化される請求の範囲第４項に記載の方法。 ８、前記細胞は死滅される請求の範囲第４項に記載の方法。 ９．０Ｍ２蛋白は細胞から単離される請求の範囲第４項工４ に記載の方法。 損、請求の範囲第１項に記載の方法によって製造されたワクチン。 ■、請求の範囲第４項に記載の方法によって製造されたワクチン。 １