NO841499L

NO841499L - Fremgangsmaate til fremstilling av optisk aktive cefalosporin-analoge

Info

Publication number: NO841499L
Application number: NO841499A
Authority: NO
Inventors: Tadashi Hirata; Yukio Hashimoto; Takehire Ogasa; Shigeru Kobayashi; Shigeo Yoshiie; Ikuo Matsukuma; Kazuo Kimura; Kiyoshi Sato; Yoichi Ohashi; Seigo Takasawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1979-02-10
Filing date: 1984-04-13
Publication date: 1980-08-11
Also published as: DE3064509D1; AU5538280A; NO155548B; NO800315L; NO155548C; EP0014476A1; CA1171373A; DK54880A; EP0014476B1; DK170255B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte til fremstilling av cefalosporin-analoge, og den angår spesielt optisk aktive cefalosporin-analog-forbindelser med den generelle formel

1 2 hvor R "betyr hydrogen eller en lavere alkylgruppe, R betyr • hydrogen eller halogen, R 3 betyr hydrogen eller en karboksylsyre-beskyttelsesgruppe, og X betyr en acylgruppe som kan beskrives med formelen X~*"CO, hvor Y?~ kan bety fblgende to grupper: ;(1) en gruppe med den generelle formel:; ; hvor B betyr en umettet, seksleddet karbocyklisk gruppe som kan være valgt blant cykloheksenyl, cykloheksadienyl og fenyl, eller en fem- eller seksleddet heterocyklisk gruppe, og hvor A^" betyr substituent(er) som kan være hydrogen, ;hydroksyl, lavere alkoksy inneholdende 1-4 karbonatomer, halogen, nitro, amino, aminometyl, metylsulfonamido eller en lavere acyloksygruppe inneholdende 1-4 karbonatomer, og hvor n er et tall fra 0 - 5, og A 2 betyr amino, hydroksyl, karboksyl eller sulfo, ;(2) En gruppe med den generelle formel:; 1 3 hvor A , B og n har den ovenfor angitte betydning, og A betyr hydrogen, lavere alkyl inneholdende 1-6 karbonatomer, lavere alkenyl inneholdende 2-6 karbonatomer, lavere alkynyl inneholdende 2-6 karbonatomer, cykloalkyl inneholdende 3-6 karbonatomer eller aryl, idet disse grupper kan være usubstituert eller substituert med passende substituent(er) valgt blant karboksyl, cyano, halogen, karbamoyl og lavere alkyloksykarbonyl med 1-5 ka-bonatomer, cykloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl eller acyl med 1-5 karbonatomer; og hvor hydrogenatomene i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon, samt de farmasbytisk akseptable salter derav. ;En karbacefemforbindelse som er beskrevet i overensstemmelse med nomenklaturen i J.Am.Chem.Soc. 96, 7584 ;(1974), og hvor svovelatomet i cefalosporinmolekylet er substituert med et karbonatom, og som har en substituert metylgruppe i 3-stillingen, er omtalt i ovennvnte litte-raturhenvisning samt i J. Med.Chem. 20, 551 (1977). Man har imidlertid ikke omtalt noen forbindelse som er i besiddelse av særlig sterk antibakteriell virkning. I den japanske publiserte patentaoknad nr. 9296/79 (DE-OS nr. 2716707) er det omtalt forbindelser med den ovenfor angitte generelle formel (I), hvor R 1 og R 2 er hydrogen, X er en 2-amino-4-diazolyl-2-zyn-metoksyiminoacetylgruppe, men i denne referanse omtales ikke praktiske utforelses-former for eksemplene på fremstillinger av slike forbindelser samt de antibakterielle virkninger av slike forbindelser . ;Det er nå lyktes å fremstille karbacefemforbindelser som er i besiddelse av forskjellige substituenter i 4-, 5- eller 3-stillingene (nummereringssystemet er det som er vist i forbindelse med den generelle formel (I)). Forbindelsene er omtalt i beskrivelsene i de japanske publiserte patentsoknader nr. 128591/79 (DE-OS nr. 2911786) og nr. 162008/78. ;Man har ytterligere vært istand til å fremstille hittil ukjente, acylerte karbacefemforbindelser som ut-gjor hittil ukjente antibiotika med sterk antibakteriell virkning. Forbindelsene er omtalt i japanske patentsøk-nader nr. 34696/78, 122402/78, 127027/78, 133071/78, 162006/78, 162007/78, 8409/79 (DE-OS nr. 2911787) samt nr. 162008/78. ;Blant de her omtalte forbindelser som er angitt med generell formel: ; hvor X' er en konvensjonell acylgruppe, slik som den anvendes innenfor cefalosporinenes og pencillineneres kjemi, R betyr hydrogen, lavere alkyl eller lavere acyloksy, ^ i betyr hydrogen eller en esterbeskyttende gruppe slik som den konvensjonelt anvendes innenfor penicillinenes og ;cefalosporinenes kjemi, dvs. en alkylgruppe med 1-5 karbonatomer slik som metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert.-butyl osv;., en halogenert alkylgruppe med 1-5 karbonatomer slik som klormetyl, 2,2,2-trikloretyl, 2,2, 2-trifluoretyl''osv., en arylmetylgruppe med 7-20 karbonatomer slik som benzyl, difenylmetyl, trifenylmetyl osv., en arylmetylgruppe med 7-20 karbonatomer samt en metoksygruppe, nitrogruppe osv. på fenylringen, en substituert silylgruppe slik som trimetylsilyl eller trifenyl- ;silyl, eller en gruppe som enzymatisk eller ikke-enzymatisk lett lar seg fjerne in vivo,'f.eks. en gruppe med den agleknyel remlled e formel -r CI H5 OCOR 4 1, h-v6 or kR ar5bboneatytr omheyrd, rR o Tg lebn eteylr lelr avlaevr-e ;alkyl med 1-6 karbonatomer, lavere alkyloksy med 1-6 karbonatomer eller en fenylgruppe osv., og hvor R 2har den ovenfor angitte betydning; har acylforbindelsen med formelen: ; ; 12 5 ;hvor R , R , R og X har den ovenfor angitte betydning,;som har den karbacefemring som er vist ved den i det fblgende angitte formel (III), vist seg å ha kraftig antimikrobiell virkning overfor gram-positive og gram-negative mikroorganismer ifblge japanske patentsøknader nr. 122402/78, _ 133071/78, 162006/78, 162007/78 (DE-OS nr. 2911787) etc. Særlig angis i de nevnte patentsøknader at de acylforbindelser som har den karbacefemring som er angitt med den generelle formel: ; ; hvor ky 3 har den ovenfor angitte betydning, R<1>"betyr hydrogen eller metyl, og OA^ har syn-kbnfigurasjonen, er i besiddelse av en kraftig antimikrobiell virkning overfor gram-positive og gram-negative mikroorganismer. I det folgende vil forbindelser med generell formel (I), (II), (III), bli betegnet som forbindelse [ TJ, forbindelse /Il7, forbindelse [ lllj, respektivt. ;De ovenfor omtalte cefalosporin-analoge fremstilles imidlertid ved hjelp av syntetiske fremgangsmåter under anvendelse av optisk inaktive utgangsforbindelser, og de er nesten optisk inaktive d,1-forbindelser.med unntagelse av en forbindelse som er i besiddelse av en i noen utstrekning optisk aktiv acylgruppe, f.eks. d-fenylglycin osv., som er omtalt japansk patentsoknad nr. 162006/78 (DE-OS nr. 2911787). ;Det er således behov for optisk aktive analoge og fremgangsmåter til fremstilling derav. Man har nå funnet at man kan fremstille visse optisk aktive cefalosporin-forbindelser som er i besiddelse av uventet forhoyet biolo-gisk virkning. ;Ved foreliggende fremgangsmåte fremstilles optisk aktive acylforbindelser med den ovenfor angitte generelle formel (I) fra optisk aktive cefalosporinanalog-forbindelser med den generelle formel: ; hvor R 1, R 2 og 5 har den ovenfor angitte betydning og hvori hydrogenatomene i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon. De aktuelle forbindelser utviser uventet kraf- ;tigere antibakteriell virkning, dvs. 2-4 ganger kraftigere virkning, overfor forskjellige-gram-positive og gram-negative mikroorganismer enn de tilsvarende optisk inaktive d,1-forbindelser [ TJ. ;Fremgangsmåter til fremstilling av optisk aktive forbindelser (III) er detaljert beskrevet i sammenlignings-eksemplene"9- 11. Slike forbindelser og fremgangsmåter til fremstilling derav er gjenstand for en samtidig patent-søknad. ;I tillegg til de kjente konvensjonelle acyleringsmetoder er det videre lykkes å fremstille de samme onskede forbindelser ved optisk selektiv acyleringsmetoder, idet det er lykkes å fremstille optisk aktive cefalosporin-analoge med den generelle formel: ; hvor R betyr en substituert eller ikke-substituert, mettet eller umettet 6-leddet karbocyklisk gruppe eller 5-leddet heterocyklisk gruppe, R 1, R 2 og R 3 har den ovenfor angitte betydning, Y betyr en lavere alkylgruppe, hydroksy, karboksy eller amino, og hvor hydrogenatomene i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon, ved at man omsetter optisk inaktive forbindelser /III7 eller optisk aktive cefalosporin-analog-forbindelser med fblgende antatte absolutte strukturformel: hvor R 1 , R ? og Rv 5 har den ovenfor angitte betydning, med en a,a-disubstituert karboksylsyre med- formelen: ; hvor R og Y har den ovenfor angitte betydning, eller et funksjonelt ekvivalent reaksjonsdyktig derivat derav i nærvær av (1) en mikroorganisme som er i besiddelse av evnen til å fremstille optisk aktive cefalosporin-analog-forbindelser med den generelle formel (IV) fra den a,a-disubsti-tuerte karboksylsyre eller det reaksjonsdyktige derivat derav samt forbindelsen med den generelle formel (III) eller (III-1), og som tilhbrer slektene Pseudomonas, Xanthomonas, Escherichia, Aeromonas, Achromobacter, Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Kluyvera, Gluconobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Sarcina, Staphylococcus, Spirillum, Bacillus, Flavobacterium, Brevibacterium, Protaminobacter, Beneckea, Micrococcus, Proteus, Mycoplana eller Rhodopseudomonas, (2) en dyrkningsvæske av mikroorganismene, (3) videre behandlet materiale fra dyrkningsvæsken eller (4) et enzym fremstilt av mikroorganismen til endelig fremstilling av de aktuelle forbindelser. ;De optisk inaktive d,1-forbindelser som tilsvarer forbindelsen /Ill7 er tilstede som en blanding av like store mengder av optiske isomerer (III-1) og (III-2) som er hver- ; 12 3 ;hvor R , R og R har den ovenfor angitte betydning.;De optisk aktive forbindelser som er fremstilt ved de i etterfølgende sammenligningseksempler angitte fremgangsmåter, antas å ha den absolutte struktur som er vist ved den ovenfor angitte generelle formel (III-l) ut fra den sterke antimikrobielle virkning av acylforbin-elsene sammenlignet med det tilsvarende optisk inaktive d,1-forbindelser, samt ut fra forholdet mellom cefalosporinenes absolutte struktur og disses virkninger. ;I det etterfblgende er de optisk aktive forbindelser beskrevet som å ha den absolutte konfigurasjon (6R, 7S), dvs. den konfigurasjon som er beskrevet med den gene-reile (III-l), og i de etterfølgende eksempler og sammenligningseksempler er forbindelsene betegnet i overensstemmelse med den antatte absolutte strukturformel. Det er unødvendig å anfore at de optisk aktive forbindelser er mer anvendelige som legemidler og som antimikrobielle midler enn de optisk inaktive forbindelser, og de aktuelle forbindelser er således nyttige som antibakterielle midler som kan benyttes på velkjent måte. ;De aktuelle optisk aktive cefalosporin-analoge kan beskrives med den generelle formel: ;i ; ; hvor R"*" betyr hydrogen eller en lavere alkylgruppe med 1 - 5 karbonatomer, slik som metyl, etyl, n-propyl, i-propyl,

n-butyl, i-butyl, tert.-butyl o.l. Særlig foretrukket er metylgruppen. Man foretrekker ytterligere at metylgruppen har samme konfigurasjon som hydrogenatomene i 6- og 7-stillingene, dvs. 4a-konfigurasjonen i strukturformelen (III-l). Forbindelser med en 4|3-metylgruppe samt blandede forbindelser med 4a- og 4|3-metylforbindelser er imidlertid også verdifulle.

2

Som R kan angis hydrogen eller halogen som kan være klore, brom eller jod.

R kan være hydrogen eller en karboksylsyrebeskyt-telsesgruppe slik den anvendes innen penicillinenes og cefalosporinenes kjemi.

Som denne gruppe R kan angis folgende eksempler: 1. Rett eller forgrenet alkylgruppe med 1-5 karbonatomer slik som metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, tert.-butyl o.l.

2. Rett eller forgrenet lavere alkoksymetylgruppe med 1 -

5 karbonatomer slik som metoksymetyl, etoksymetyl o.l. \ 5 ~• Rett eller forgrenet halogenert alkylgruppe med 1-5

karbonatomer, slik som klormetyl, 2,2,2-triklormetyl,

2,2,2-trifluormetyl o.l.

4. Lavere alkylsulfonyletylgruppe slik som metylsulfonyl-metyl, etylsulfonyletyl o.l.

,5. Arylmetylgruppe med 7-12 karbonatomer slik som benzyl,

difenylmetyl, trityl, trifenylmetyl o.l.

6. Substituert silylgruppe slik som trimetylsilyl, tri-

fenylsilyl o.l.

Substituert arylmetylgruppe med 7-20 karbonatomer hvor substituenten er en metoksygruppe eller en nitrogruppe, og hvor antallet av substituenter på fenylringen er 1 - 5.

Karboksylsyrebeskyttelsesgruppen med den generelle formel:

hvor R er en rett eller forgrenet lavere alkylgruppe med 1-6 karbonatomer, en rett eller forgrenet lavere alkoksygruppe med 1-6 karbonatomer, eller en fenyl-5

gruppe, og hvor R betyr hydrogen eller en rett eller forgrenet lavere alkylgruppe med 1-6 karbonatomer.

X betyr en acylgruppe med formel X^"C0, hvor X^" byr fdlgende to grupper:

) en gruppe med den generelle formel:

hvor B betyr en umettet 6-leddet karbocyklisk gruppe slik som cykloheksenyl, cykloheksadienyl, fenyl osv., eller en 5- eller 6-leddet heterocyklisk gruppe slik som furyl, tienyl, pyrrolyl, tiazolyl, oksazolyl, iso-tiazolyl, isoksazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, tria-zolyl, tetrazolyl, pyrridinyl, pyrrimidinyl, pyrazinyl, pyradazinyl, triazinyl, 5,6-dihydro-l,4-ditin-2-yl osv., og hvor A betyr substituent(er) som er valgt blant hydrogen, hydroksyl, lavere alkoksy med 1 - 4 karbonatomer, halogen, nitro, amino, aminometyl, metyl-sulfamid, lavere acyloksy med 1-4 karbonatomer, og

2

hvor n er et tall fra 0-5, samt A betyr amino, hydroksyl, karboksyl eller sulfo,

(2) en gruppe med den generelle formel:

hvor a\ B og n har den ovenfor angitte betydning, og kJ betyr hydrogen, lavere alkyl med 1-6 karbonatomer, lavere alkenyl med 2-6 karbonatomer, lavere alkyl med 2-6 karbonatomer, cykloalkyl med 3-6 karbonatomer eller aryl, idet disse grupper kan være ikke-substituerte eller substituerte med egnede substituenter(er), som kan være karboksyl, cyan, halogen, karbamoyl eller lavere alkyloksykarbonyl med 1-4 karbonatomer.

Det er vanlig kjent at. tiazolylgruppen med formel: viser reversibel innbyrdes omdannelse med tiazolinylgruppen, som vist nedenfor, og begge grupper betraktes normalt som identiske. I det etterfølgende anses begge isomerer som beskrevet gjennom tiazolylgruppen. Forbindelsen [ TJ inneholder folgelig begge isomerer basert på den reversible innbyrdes omdannelse:

Med hensyn til OA^ 3 "betyr syn-konfigurasjonen den isomere (A) av de fblgende angitte stereoisomere:

Som farmasøytisk akseptable salter kan nevnes saltene med uorganiske og organiske baser, f.eks. alkali-metallsalter slik som natriumsalter, kaliumsalter osv., jordalkalimetallsalter slik som magnesiumsalter osv., ammoniumsalter, trimetylaminsalter, trietylaminsalter, pyridinsalter, prokainsalter, purinsalter, lysinsalter, argininsalter osv., samt salter med uorganiske og organiske syrer f.eks. hydrogenkloridsalter, sulfater, karbo-nater, fosfater, formiater, trifluoracetater, malater osv. De farmasøytisk akseptable salter fremstilles ved kjente standardmetoder.

De aktuelle forbindelser fremstilles ved at man omsetter en optisk aktiv forbindelse med den generelle formel:

12 3 hvor R , R og R har den ovenfor angitte betydning, eller en funksjonelt ekvivalent forbindelse derav, med karboksylsyre med den generelle formel: X<2>C00H (VII)

hvor X 2 betyr folgende to grupper:

(l<1>) en gruppe med den generelle formel:

hvor B og n har den ovenfor angitte betydning, A betyr en substituent som kan være hydrogen, hydroksyl, beskyttet hydroksyl, lavere alkoksy med 1-4 karbonatomer, halogen, nitro, en beskyttet aminogruppe, en beskyttet aminometylgruppe, metylsulfon-amino eller en lavere acyloksygruppe med 1-4 kar-2'

bonatomer, og hvor A betyr en beskyttet aminogruppe, en hydroksylgruppe, en beskyttet hydroksylgruppe, karboksylgruppe, en beskyttet karboksylgruppe, sulfogruppe eller en beskyttet sulfogruppe.

(2') En gruppe med den generelle formel:

11

hvor A , B og n har den ovenfor angitte betydning, og A^ betyr hydrogen, lavere'alkyl med 1-6 karbonatomer, lavere alkenyl med 2-6 karbonatomer, lavere alkynyl med 2-6 karbonatomer, cykloalkyl med 3-6 karbonatomer eller aryl, idet disse grupper kan være ikke-substituert eller substituert med en passende substituent som kan være en karbamoylgruppe eller en lavere alkyloksykarbonylgruppe med 1-4 karbonatomer; eller med reaksjonsdyktige derivater av karboksylsyren og hvor man om dnsket kan fjerne beskyttelsen fra de beskyttede grupper X CO- og/eller

-COOR , og eventuelt omdannelse til farmasoytisk akseptable salter derav. En spesifikk og kjent acy-leringsmetode er omdannelsen i japansk patentsøk-

nad nr. 122402/53 (DE-OS nr. 2911787).

Enkelte av de aktuelle forbindelser er fremstilt under anvelse av den optisk inaktive forbindelse [ lllj. I slike tilfeller omsettes en optisk inaktiv forbindelse</IIl7 med en karboksylsyre med formelen: X<3>C00H (VIII)

hvor X betyr folgende gruppe med formelen:

hvor A , B og n har den ovenfor angitte betydning, A betyr en beskyttet aminogruppe, hydroksylgruppe, en beskyttet hydroksylgruppe, karboksylgruppe, en beskyttet karboksylgruppe, sulfogruppe eller en beskyttet sulfogruppe, idet man går frem analogt med det tidligere beskrevne til-felle ut fra den optisk aktive forbindelse /III7 som ut-gangsmateriale, og den således fremstilte blanding av diastereoisomere atskilles ved konvensjonelle metoder.

Optisk aktive cefalosporin-analoge med den generelle formel (IV) kan videre fremstilles ved optisk selektiv acylering mellom en optisk inaktiv forbindelse /Ill7 eller en optisk aktiv forbindelse /Ill-l7 og forbindelsen /V7 i nærvær av (1) en mikroorganisme som har evne til å produsere optisk aktive cefalosporin-analog-forbindelser med den generelle formel (IV) ut fra cc,a-disubstituert karboksylsyre eller et reaksjonsdyktig derivat derav og den forbindelse som er beskrevet med den generelle formel (III) eller (III-l), og som tilhører slektene Pseudomonas, Xanthomonas, Eshcerischia, Aeromonas, Achromobacter, Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Kluyvera, Gluconobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Sarcina, Staphylococcus, Spirillum, Bacillus, Flavobacterium, Brevibacterium, Protaminobacter, Beneckea, Micrococcus, Proteus, Mycoplana eller Rhodopseudomonas, (2) en dyrkningsvæske av mikroorganismene, (3) et opparbeidet materiale fra dyrkningsvæsken eller (4) et enzym produsert.av mikroorganismene.

Det er beskrevet en rekke enzymatiske acyler-inger av naturlig forekommende (3-laktamforbindelser, slik som 6-aminopenicillansyre som inneholder penivillinringen, 7-aminocefalosporansyre og 7-aminodesacetoksycefalosporan-syre som inneholder cefalosporinringen. Det er imidlertid ikke omtalt noe eksempel på enzymatisk acylering av en syntetisk fremstilt p-laktamforbindelse, slik som den om-handlede forbindelse, som har karbacefem-ringen. Den iakt-tagelse at slike mikroorganismer har evne til absolutt optisk selektiv acylering av en syntetisk fremstilt karba-' cefem-forbindelse, er helt ny. Den ved foreliggende oppfinnelse benyttede forbindelse /Ill7 fremstilles ved den metode som er beskrevet i japansk patentsøknad nr. 128591/79 (DE-OS nr. 2911786) samt japansk patentsøknad nr. 162008/78. En fremgangsmåte til fremstilling av den ikke-publiserte forbindelse /III7 er angitt detaljert i etterfølgende sammenligningseksempel. Forbindelsen / lll- lj fremstilles ifdlge den metode som er beskrevet i de japanske patentsøk- nader nr. 14533/79 og 146488/79. En fremgangsmåte til fremstilling av forbindelsen /Ill-l7 er beskrevet detaljert i etterfølgende sammenligningseksempel.

Som det reaksjonsdyktige derivat av forbindelsen (V), dvs. en forbindelse som forer til forbindelsene [ TJ

ved hydrolyse med en mikroorganisme benyttet ifolge foreliggende oppfinnelse, en dyrkningsvæske for mikroorganis-. men, et opparbeidet materiale fra dyrkningsvæsken og/eller

)et enzym fremstilt av mikroorganismen, slik som en alkyl-ester med metylgruppe, etylgruppe o.l., kan man nevne en tioetylester med tioglykolsyre.

Den optisk selektive acyleringsometning mellom forbindelsen /III? og forbindelsen [ YJ samt acyleringsom-setningen mellom forbindelsen [ Tll- lJ og forbindelsen ( TJ, utfores i nærvær av et enzym som stammer fra en mikroorganisme som er istand til å danne optisk aktive forbindel-

ser [ TJ eller ^I-l7 ved optisk selektiv acylering av optisk inaktive forbindelser /Ill7 eller optisk aktive forbindelser /IH-17.

Som mikroorganisme som har evne til en slik acyler-ingsomsetning eller optisk selektiv omsetning, idet en slik mikroorganisme har evne til å danne optisk aktiv forbindelse /Tv7 eller en forbindelse /IV-17 ut fra forbindelse

i LU eller et reaksjonsdyktig derivat derav samt forbindelsen ,/IIl7 eller forbindelsen /^IH-17, kan nevnes mikroorganismer tilhorende slektene Aeromonas, Achromobacter, Artrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Escherichia, Xanthomonas, Kluyvera, Gluconobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Sarcina, Staphylococcus, Spirillum, Bacillus, Pseudomonas, Flavorbacterium, Brevibacterium, Protaminobacter, Proteus, Beneckea, Micrococcus, Mycoplana og Rhodopseudomonas. De i det folgende angitte stammer er eksempler på slike mikroorganismer.

> Aeromonas hydrophila IFO 12634

Achromobacter aceris IFO 3320

Arthorbacter simplex ATCC 15799

Acetobacter aurantius IFO 3245 Acetobacter sp. ATCC 21760 Alcaligenes faecalis ATCC 8750 Escherichia coli ATCC 11105 Escherichia coli ATCC 13281 Xanthomonas psysalidicola IFO 3835 Xanthomonas physalidicola IFO 13555 Kluyvera citrophila ATCC 21285 Gluconobacter liquefaciens ATCC 14835 Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271 Clostridium acetobutylicum IFO 3346 Comamonas terrigena IFO 12685 Cornyebacterium tritici IFO 1216 Sarcina lutea ATCC 9341 Staphylococcus aureus IFO 3060 Spirillum metamorphum IFO 12012 Bacillus megaterium ATCC 14945 ' Pseudomonas melanogenum ATCC 17808 Pseudomonas aeruginosa IFO 3451 Flavobacerium sp. ATCC 21429 Brevibacterium cerinum ATCC 15112 Protaminobacter alboflavus IFO 13221 Proteus rettgeri ATCC 9250 i Benekea hyperoptica ATCC 15803 Micrococcus luteus AHU 1427 Mycoplana bullata IFO 13267 Rhodopseudomonas spheroides ATCC 21286

For gjennomføring av den optisk selektive acyl-eringsomsetning kan enzymet spesielt tilveiebringes i en hvilken som helst av folgende former: 1. Som dyrkningsvæsken for mikroorganismen eller som et opparbeidet materiale derfra;

' 2. Som cellelegemer innvunnet fra dyrkningsvæsken ved sentrifugering, og som kan være vasket med saltvann (vanligvis ca. 1%), bufferopplosning eller lignende,

eller i form av en suspensjon av celler; 3. Som en suspensjon av sprengte celler, dvs. en suspensjon av cellelegemer som er blitt mekanisk eller kjem-isk nedbrutt; 4. Som et ekstrakt befridd for celler, dvs. en væske som er fremstilt ved å fjerne de sprengte cellelegemer fra suspensjonen av sprengte celler; eller 5. Som en renset enzymopplosning som er fremstilt ved å innvinne enzymproteinet med ammoniumsulfat fra ekstraktet, som er befridd for celler, og ved å under-kaste enzymproteinet gelfiltrering, kromatografering på ionevekslingscellulosesoyler, kromatografering på ionevekslingssephadexsoyler eller lignende.

Man kan benytte cellene eller det rensede enzym som er immobilisert ved konvensjonelle metoder.

Omsetningen utfores ved en temperatur på 0 - 50°C, fortrinnsvis 15 - 35°C, og ved en pH-verdi på 5 - 8 i et inaktivt opplosningsmiddel som ikke innvirker på omsetningen.

Som opplosningsmiddel anvendes fortrinnsvis vann. Organiske opplbsningsmidler slik som aceton, metanol, etanol, N,N-dimetylformamid, dimetylsulfoksyd o.l. kan benyttes alene eller i forbindelse med vann. Det er effektivi-tetsfremmende å tilsette fosfatbuffer, Veronal-buffer eller sitronsyrebuffer for regulering av pH i omsetningen. Reak-sjonstiden som reguleres avhengig av enzymenes art og konsentrasjon, av substratenenes art og konsentrasjon, av reaksjonstemperaturen og av pH-verdien under omsetningen, er vanligvis fra 30 minutter til 24 timer. Man foretrekker å avslutte omsetningen når omsetningsforholdet har nådd sitt maksimum.

Cellekonsentrasjonen er fortrinnsvis 1 - 50 mg pr. ml regnet på torrstoff i omsetningsopplosningen. Når man benytter et renset enzym, er det rimelig å benytte den mengde enzym som har samme aktivitet som de tbrkede celler. Substratforbindelsen [ Vj anvendes" i en mengde på 0,5 - 50 mg pr. ml av omsetningsopplbsningen. Forbindelsen [ l- llj benyttes i en mengde på 0, 1 - 50 mg pr. ml av omsetningsopplbsningen.

Når det i cellelegemet finnes enzymer som for-hindrer omsetningen, slik som p-laktamase, esterase o.l., kan man anvende en mutant-stamme som har en forminsket pro-duktivitet med hensyn til dette enzym. Dessuten kan man til reaksjonssystemet tilsette inhibitorer for slike enzymer for å heve omsetningsforholdet.

Etter avslutning av omsetningen gjennomfbres isoleringen av den bnskede forbindelse ved en konvensjonell fremgangsmåte benyttet til isolering og rensing av organiske forbindelser fra dyrkningsvæsker, slik som absorbsjon under anvendelse av forskjellige bærestoffer, ionevekslingskromatografering, gelfiltrering, væske-væske-ekstraksjon o.l.

Foreliggende oppfinnelse angår også farmasbytiske preparater, som som aktiv bestanddel inneholder forbindelse [ TJ eller et farmasbytisk akseptabelt salt derav sammen med en farmasbytisk bærer eller fortynningsmiddel. De aktuelle forbindelser inngis parenteralt (intramusku-lært, intraperitonealt, intravenbst eller subkutant ved injeksjon), peroralt eller rektal administrasjon, og de kan formuleres til doseringsformer som er egnet til en hvilken som helst av disse administrasjonsmetoder.

Preparater med de aktuelle forbindelser til par-enteral tilfbrsel omfatter sterile vandige eller ikke-vandige oppløsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige opplbsningsmidler eller bærere er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer slik som olivenolje, samt organiske estere slik som etyloleat, som er egnet til injeksjon. Slike former for doseringsklare midler kan også inneholde tilsetningsstoffer slik som konserveringsmidler, fuktemidler, emulgatorer eller disper- geringsmidler. De kan steriliseres f.eks. ved filtrering gjennom et filter som tilbakeholder bakterier, ved å in-korporere steriliseringsmidler i preparatene, ved bestrål-ing av preparatene eller ved oppvarming av preparatene. De kan også fremstilles i form av sterile, faste faste preparater som kan opplbses i sterilt vann eller i et annet sterilt medium som egner for injeksjon, umiddelbart for anvendelsen.

Preparatene til peroral administrasjon kan foreligge i en form som er egnet for absorbsjon gjennom mage-tarmkanalen. Tabletter eller kapsler til peroral administrasjon kan foreligge i en enhetsdoseringsform og de kan inneholde vanlige strekkemidler slik som bindemidler, f. eks. sirup, akasiegummi, gelatin, sorbitol, tragantgummi eller polyvinylpyrrolidon; fyllstoffer, f.eks. laktose, sukker, maisstivelse, kalsiumfosfat, sorbitol eller gly-cin; smoremidler f.eks. magnesiumstearat, talkum, polyetylenglykol, silisiumdioksyd; desintegreringsmidler, f.eks. potetstivelse, eller akseptable fuktemidler slik som natriumlaurylsulfat. Tablettene kan ha overtrekk ifSi-ge velkjente metoder. Flytende preparater for peroral anvendelse kan foreligge i form av vandige eller oljesuspen-sjoner, opplSsning, emulsjoner, sirupper osv., eller de i

kan foreligge som et tort produkt som kan rekombineres med vann eller et annet egnet medium for anvendelsen. Slike flytende blandinger kan inneholde konvensjonelle tilsetningsstoffer slik som suspensjonsmidler, f.eks. sorbitol-sirul, metylcellulose, glukosesukkersirup, gelatin, hydrok-syetylcellulose, karboksymetylcellulose, aluminiumstearat-gel, emulgeringsmidler f.eks. lecitin, eller sorbitanmono-oleat; ikke-vandige bæremidler som kan omfatte spiseoljer, f.eks. madelolje, kokosolje, propylenglykol eller etylalko-hol; konserveringsmidler, f.eks. metyl- eller propyl-p-hydroksybenzoater eller sorbinsyre.

Preparater for rektal administrasjon er fortrinns vis suppositorier som i tillegg til den aktive forbindelse kan inneholde eksipienter slik som kakaosmor eller en suppositorievoksart.

Man kan variere doseringen av aktiv bestanddel'i blandingene fremstilt med de aktuelle forbindelser; det er imidlertid nodvendig at mengden av aktivt materiale er så stor at man oppnår en passende doseringsform. Den val-gte doseringsmengde avhenger av den bnskede terapeutiske virkning, av administrasjonsmåte samt av behandlingens varighet. Vanligvis benytter man ved administrasjon til pattedyr doseringsnivåer.på mellom 5 og 350 mg/kg legems-vekt pr. dag for oppnåelse av en antibiotisk virkning.

Folgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling av it^ z^ t^ zlzl^ zi^ Z^ i^ Z^ Z^^^ Y^- lz^ Z^ YUz metoksYiminoacetamido^-l-azab karboksylsyre (den optisk aktive forbindelse av den forbindelse som er angitt med generelle formel (I') hvor A<3>er CH^, R 1 » er H, cis angir stereokjemien i forbindelse med 6- og 7-stillingene, og dette vil være gjeldende i det folgende).

131,3 mg (0,30 mmol) 2-(2-tritylamino-4-tiazolyl-2-syn-metoksyimioeddiksyre opplbses i 1 ml vannfri klor-metan og til opplosningsmidlet tilsettes 4,1/ul trietylamin ved en temperatur på -20 oC.

Etter tilsetning av 61,7 mg fosforpentaklorid omrores blandingen ved en temperatur på -20°C i 30 minutter. Reaksjonsblandingen inndampes under vakuum og inndampningsresten opplbses i 1 ml vannfri tetrahydrofuran

i for dannelse av en syrekloridopplbsning.

40,2 mg (0,17 mmol) av monohydratet av hydrogenkloridsaltet av ( +)-cia-7-amino-l-azabicykloi/5, 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre,som er fremstilt som i sammenligningseksempel 2, opplbses separat i en blanding av 1 ml

i tetrahydrofuran og 1 ml vann, og 116,2^ul trietylamin tilsettes.

Under omrbring og under isavkjbling tilsettes dråpevis den ovenfor fremstilte syrekloridopplbsning til opplbsningen, og blandingen får omsettes i 1 time. Reak-

i sjonsopplbsningen reguleres til en pH-verdi på 2,0 med 5% saltsyre og ekstraheres tre ganger med 10 ml etylacetat. Etylacetatlaget vaskes med 10 ml mettet saltopplbsning, tbrkes med natriumhydrogenkarbonat og inndampes under vakuum til dannelse av 93 mg av en rå acylforbindelse

i (den optisk aktive forbindelse som er beskrevet med gene-reil formel (I')» hvor A<J>er CH^, R er H, og hvor et hydrogenatom fra NP^er erstattet med Trt). Denne forbindelse opplbses i 10' ml 50% eddiksyre og opplbsningen omrores ved en temperatur på 50°C i 30 minutter. Etter avkjbl-i ing til romtemperatur og fjerning av et utfelt hvitt bunnfall ved filtrering inndampes reaksjonsopplbsningen og

inndampningsresten opplbses i en liten mengde dimetylsulfoksyd. Opplbsningen påfbres en sbyle pakket med 10 ml "HP-10". Eluering utfores med vann opp til en blanding , av vann og metanol (1:2). De fraksjoner som viser en Rf-verdi på 0,3 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (plate: "Merck rt. 5719", opplosningsmiddel: butanol: eddiksyre:vann = 4:1:1) oppsamles og inndampes under vakuum til dannelse av 13,5 mg (utbytte 22,4%) hvite krystaller av den onskede forbindelse.

Forbindelsenes egenskaper er som folger:

Smeltepunkt: 172°C (dekomponering)

( vj^ +32,6° (DMSO, c=0,5)

-1

IR (KBr)Y™ks<; 1765,1-60, I63O, 1545

PMR (DMSO-d5)£: 9,26 (1H, d)

7,19 (2H,' s)

6,75 (1H, s)

6,28 (1H, t)

5,50 (1H, d-d, J=8,9, 4,7)

3,83 (3H, s)

2,5 - 1,0 (4H, m)

Disse verdier stemmer godt overens med de som oppnås for tilsvarende d,1-forbindelse. Ut fra den kraftige antimikrobielle virkning antas denne forbindelses absolutte konfigurasjon å være (6R, 7S).

Eksempel 2

F£§ms;t^l^ing_av_( - ^ z2i^~ zl§~ l^ Z^^^ Z^ Z^-^^ Y^ lz^ Z^ Y^ Z metoksyiminoacetamido7_-4a^ §l22l22karboks^lsyre (den optisk aktive forbindelse av den forbindelse som er angitt med den generelle formel (I') hvorA<3>og R<1>' beyt CH^).

76 mg (0,17 mmol) 2-(2-tritylamino-4-tiazolyl)-2-syn-metoksyiminoeddiksyre opplbses i 1,52 ml vannfri diklormetan og 17,3 mg (0,17 mmol) trietylamin tilsettes ved en temperatur på -15°C. Etter tilsetning av 35,7 mg (0,17 mmol) fosforpentaklorid ombres blandingen ved en temperatur på -15°C i 30 minutter. Reaks.jonsblandingen inndampes under vakuum og inndampningsresten opplbses i 2 ml vannfri tetrahydrofuran for dannelse avn syrekloridopplbsning. 28 mg (0,10 mmol) av dihydratet av kalsiumsaltet av (- )-cis-7(3-amino-4oc-metyl-l-azabocyklo</5, 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt som i sammenligningseksempel 4, bringes separat i suspensjon i en blanding av 1,5 ml tetrahydrofuran og vann (1:1), og 36,3 mg (0,36 mmol) trietylamin tilsettes hertil for dannelse av en homogen opplbsning. Under omrbring og under isavkjbling tilsettes syrekloridopplbsningen dråpevis til opplbsningen og blandingen får omsettes i 45 minutter. Reaksjonsblandingen ekstraheres fire ganger med 3 ml etylacetat og etylacetatlaget vaskes med 5 ml mettet saltopplbsning. Det vaskede materiale tbrkes med natriumhydrogenkarbonat og inndampes under vakuum til dannelse av 7,1 mg av en rå acylforbindelse (den optisk aktive forbindelse av den forbindelse som er angitt med den generelle formel (I') hvor

"5 1'

t\ og R er CH^og et hydrogenatom i Nf^er erstattet med Trt). Denne forbindelse opplbses i 4,5 ml 50% eddiksyre

og opplbsningen omrbres ved en temperatur på 50 - 55°C i 45 minutter. Opplbsningen avkjblés til romtemperature og det utfelte hvite bunnfall fjernes ved filtrering. Filter-kaken vaskes med 2 ml 50% eddiksyre. Filtratet og vaske-vannet forenes og inndampes under vakuum. Inndampningsresten opplbses i en liten mengde dimetylsulfoksyd og påfbres en sbyle som er pakket med 10 ml "HP-10". Elueringen utfores med en blanding av vann og metanol (5:1 - 2:1). De fraksjoner som viser en Rf-verdi på 0,54 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatofri (under anvendelse av de tidligere benyttede betingelser), oppsamles og inndampes under vakuum til dannelse av 12,9 mg (utbytte 23,8%) hvi'te krystaller av den bnskede forbindelse.

Denne forbindelses egenskaper er som folger: Smeltepunkt: ca. 180°C (dekomponering)

Za7^5° -27° (DMSO, C=0,5)

IR (KBr)V^ks>: 1770, 1672, 1733, 1540

PMR(DMS0-d6) &: 9,26 (1H, d, J=8,3)

7,18 (2H, 3)

6,75 (1H, s)

6,31 (1H, d, J=5,l)

5,51 (1H, d-d, J=8,3, 5,0)

3,83 (3H, s)

1,67 (2H, m)

1,07 (3H, d, J=7,3)

Disse verdier stemmer godt overens med de til den tilsvarende d,1-forbindelse. Ut fra den kraftige antimikrobielle virkning antas den absolutte konfigurasjon av denne forbindelse å være (4S, 6R, 7S).

Eksempel 3

El!§!S§iiiii2S_5Y_l± lz2^ zlzlÅ^ lz^ zté^ Y^ Z^ Z^^ 2^ 22^^^ 2Zz ] :Z^ z^ icY.^ 0l^ x^ L9. Z2^ Z^ Z^ Z^~ 2^ Z^ Z^ t^ 2-^ Y2:^ Y^ 2 (som i det folgende vil bli beregnet som forbindelse (A)):

3-1) Fremstilling av en suspensjon av sprengte celler (a) Dyrking av en mikroorganisme som har evne til optisk selektiv acylering.

Som podningsstamme benytter man Pseudomonas melanogenum ATCC 17808 (biologiske egenskaper er beskrevet i Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, 37, 71 (1963)).

Som podningssubstrat anvendes en vandig opplosning inneholdende 1% polypepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjottekstrakt, 0,5% natriumglutamat og 0,25% natriumklorid, og som er regulert ved en pH-verdi på 7,0 med 5N NaOH. En lokkefull av podningsstammen podes i 10 ml podningssubstrat i et 50 ml reagensglass og dyrkingen utfores ved en temperatur på 30°C i 24 timer. Den samlede mengde podningssubstrat anbringes i 300 ml dyrkningssubstrat i en 2-liters Erlenmeyer-kolbe og dyrkingen utfores under rysting ved en temperatur på 30°C. Sammensetningen av dyrkningssubstratet er den samme som sammensetningen av podningssubstratet.

(b) Fremstilling av cellesuspensjonen

Etter dyrking i 24 timer gjenvinnes cellelegemene fra dyrkningsvæsken ved sentrifugering, og de vaskes

2 ganger med 50 ml 0,9% saltvann. Cellene bringes

i suspensjon ved en konsentrasjon på 40 mg/ml beregnet på torrstoff i en 1/30 molar fosfatbuffer. Suspensjonen (10 ml) anbringes i et 50 ml reagensglass og underkastes ultrasonisk disintegrering ved 200 ¥ i 2 minutter til fremstilling av en suspensjon av sprengte celler. Ved denne behandling ble det benyttet en ultrasonisk disintegrator, modell "UR 200 P".

3-2) Fremstilling av substratoppldsning

120 mg (-)-cis-7-amino-l-azabicyklo/4,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, fremstilt som i DE-OS nr. 2911786, samt 500 mg av hydrokloridsaltet av d-fenylgly-sinmetylester tilsettes il 9 ml 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). 5N K0H tilsettes i små mengder og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 6,5 til opplosning av de to utgangsmaterialer. Tilslutt tilsettes ionevekslet vann for dannelse av 10 ml opplosning.

3-3) Enzymomsetning

10 ml av suspensjonen av sprengte celler tilsettes til 10 ml av substratopplosningen og enzymomsetningen utfores ved en temperatur på 30°C i 5 timer. Reaksjonen overvåkes ved hurtig væskekromatografering under anvendelse av "TRI ROTAR" samt av "Prepack"-sb'ylen "Nucleosil 10C18". Eluering utfores med 7% metanol-0,2 molar KH2P0^-opplosning. Omsetningen når et maksimum i lbpet av 5 timer.

3-4) Isolering og rensing av den bnskede forbindelse.

Etter avslutning av omsetningen fjernes celle-lagene fra reaksjonsopplbsningen ved sentrifugering. Den ovenstående væske inndampes under vakuum og påfbres en sbyle (1,6 cm bred, 50 cm hby) som er pakket med 100 ml "Diaion HP-10". Etter vasking med 200 ml ionvekslet vann utfores eluering med en 30% vandig metanolopplbsning. Eluatet oppsamles i fraksjoner på 10 ml. Deretter inndampes fraksjonene nr. 20 - 25, som inneholder den onskede forbindelse, under vakuum til dannelse av 0,5 ml konsentrat. Dette konsentrat påfores en soyle (1,6 cm bred, 64,5 cm

hoy) som er pakket med 130 ml "Sephadex-LH20", og elueringen utfores med en blanding av vann og metanol (50:50 vol-umdeler, hvilket vil også gjelde i det folgende). Eluatet oppsamles i fraksjoner på 5 ml. Den onskede forbindelse elueres i fraksjonene 60 ml til 80 ml. Fraksjonene inndampes under vakuum for fjerning av metanol og inndampningsresten lyofiliseres til dannelse av 81 mg av et hvitt pulver. Dette reaksjonsprodukts egenskaper er som folger: L17^ ° (H20, c=0,5): +57,2

-1

IR (KBr)v^aks.: 1760'1690'1640

PMR (D20) S (ppm): 7,51 (5H, s)

6,08 (1H, 5, J=4,2 Hz)

5,41 (1H, d, J=4,9 Hz)

5,19 (1H, s)

3,83 (1H, oktett, J=8,6, 3,7,

4,9 Hz)

2,28 - 1,01 (4H, m)

De ovenfor angitte verdier stemmer godt overens med de som oppnås for den mindre polare isomer i eksempel 6 DE-OS nr. 2911787. Basert på de ovenfor angitte data identifiseres det hvite pulver som den onskede forbindelse. Ut fra den sterke antimikrobielle virkning antas den absolutte konfigurasjon av denne forbindelse å være (6R, 7S).

Eksempel 4

Er§m§iilliD£_§Y_l±}l2isz7^3{R2-2-f §nyl-2-amirioacetamido^-^£:l2§iYlilzazaMcYklo 7^2^07^

(I det folgende betegnet som forbindelse (B)):

4-1) Fremstilling av cellesuspensjon

En cellesuspensjon fremstilles analogt med eksempel 3-1) med unntagelse av at man som podningsstamme anvender Xanthomonas citri IFO 3835 (biologiske egenskaper er beskrevet i Bergey's Manual of Dterminative Bacteriology VI, side 156 (1948)).

4-2) Fremstilling av substratopplosning

200 mg av trifluoracetatet av (-)-cis-7(3-amino-4a-metyl-l-azabicyklo(/4, 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt som i DE-OS nr. 2911786, og 500 mg av hydrogenkloridsaltet av d-fenylglycinmetylester tilsettes til 9 ml 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). 5N K0H tilsettes i små mengder og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 6,5 for opplbsning av de to utgangsforbindelser. Endelig tilsettes ionevekslet vann til dannelse av 10 ml opplbsning.

4-3) Enzymomsetning og

4-4) Isolering og rensing av den onskede forbindelse

10 ml av suspensjonen av sprengte celler tilsettes til 10 ml av substratopplbsningen og enzymomsetningen utfores ved en temperatur på 30 C i 4 timer. Omsetningen overvåkes som i eksempel 3-Omsetningen når sitt maksimum i lbpet av 4 timer. Deretter gjentas den samme fremgangsmåte som i eksempel 3-4) til dannelse av 76 mg av et hvitt pulver. Dette reaksjonsprodukts egenskaper er som folger: /a7j5° (H20, c=0,52): +4,23°

IR (KBr)V^k^: 3420, 1760, 1695, 1633

PMR (D20) &(ppm): 7,51 (5H, s)

6,10 (1H, d, J=5,l Hz)

5,47 (1H, d, J=4,7 Hz)

5,19 (1H, s)

3,89 (1H, m)

2,45 (1H, m)

1,44 - 1,04 (2H, m)

1,00 (3H, d, J=7,4 Hz)

De ovenfor angitte verdier stemmer godt overens med de som oppnås for den mindre polare isomere som er fremstilt i eksempel 12 i DE-OS nr. 2911787. Basert på disse data identifiseres det hvite pulver som den onske-

de forbindelse. Ut fra den kraftige mikrobielle virkning 'antas denne forbindelses absolutte konfigurasjon å være

(4S, 6R, 7S).

Eksempel 5

Fremstilling av forbindelse ( A) ( alternativ fremgangsmåte)

Som podningsstamme anvendes Escherichia coli

ATCC 11105 (biologiske egenskaper er beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology VIII, side 295 (1974)). Man gjentar samme fremgangsmåte som i eksempel 3 med unntagelse av at enzymomsetningen utfores i lbpet av 12 timer til dannelse av 39 mg av et hvitt pulver.

Egenskapene til dette reaksjonsprodukt stemmer godt overens med de som er oppnådd for produktet fremstilt

i eksempel 3-

Eksempel 6

Fremstilling af (+)-cis-7;;/TR)~^ z^' z] l' l^ :1£2.^' 1^ 21^ l^ :~^-~ am^ 0~ acetamido^-l-azabicvklo/5i2i0^okt- :

6-1) Fremstilling av cellesuspensjonen

(a) Dyrking av en mikroorganisme som har evne til optisk selektiv acylering.

Man gjentar samme fremgangsmåte som i eksempel 3-1 (a) med unntagelse av at man som podningsstamme benytter Kluyere citrophila ATCC 21285 (biologiske egenskaper er beskrevet i J. General Applied Microbiology 3, 28-31

(1957)).

(b) Fremstilling av cellesuspensjonen

Etter dyrking i 24 timer innvinnes selve legem-ene fra dyrkningsvæsken ved sentrifugering og de vaskes to ganger med 50 ml 0,9% saltopplosning. Cellene bringes i suspensjon i en konsentrasjon på 40 mg/ml beregnet etter torrstoff i en 1/30 molar fosfatbuffer.

6-2) Fremstilling av substratopplbsning

120 mg ()-cis-7-amino-l-azabicyklo/4,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt som i DE-OS nr. 2911786, samt 500 mg av hydrogenkloridsaltet av d-p-hydroksyfenylglycinmetylester tilsettes til 9 ml 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). Det tilsettes 5N K0H i små por-sjoner og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 6,5 for opplbsning av de to utgangsforbindelser. Tilslutt

tilsettes ionvekslet vann til dannelse av en 10 ml oppløs-ning.

6-3) Enzymomsetning og

6-4) Isolering og rensing av den onskede forbindelse

10 ml av cellesuspensjonen tilsettes til 10 ml

av substratopplbsningen og enzymomsetningen utfores ved en temperatur på 30°C i 20 timer. Omsetningen overvåkes som i eksempel 3-Omsetningen når sitt maksimum i lopet av 20 timer.

' Man gjentar samme fremgangsmåte som i eksempel 3-4) til dannelse av 65 mg hvitt pulver. Dette reaksjonsprodukts egenskaper er som folger: /aJ^P =+107,5° (c=0,5, 1 molar fosfat-ubuffer (pH 7,0))

-1

IR (KBr)V^kq: 3450, 3290, 3090, 1760,

maKs 1700 (sh), 1685

PMR (D20) 6 (ppm): 7,36 (2H, d, J=8,8 Hz)

6,95 (2H, d, J=8,8 Hz)

6,06 (1H, 5, J=3,9 Hz)

5,40 (1H, d, J=4,6 Hz)

5,12 (1H, s)

3,84 (1H, m)

2,22 (2H, m)

1,62 (1H, m)

1,12 (1H, m)

Basert på de ovenfor angitte data idenfiseres

det hvite pulver som den onskede forbindelse. Ut fra den kraftige antimikrobielle virkning antas den absolutte konfigurasjon av denne forbindelse å være (6R, 7S).

Eksempel 7

Fremstilling_av i+ X- cis^ Z^ Ll^ lz^ Z^ Z^ lX^^^ X^^ Y^ Z^ Z^ h^ Z gcetamido^-^a-metyjl^l-azabi^ karboksYlsyre:

7-1) Fremstilling av cellesuspensjon

Man fremstiller en cellesuspensjon på samme måte som i eksempel 6 med unntagelse av at man benytter podningsstammen Xanthomonas citri IFO 3835.

7-2) Fremstilling av substratopplosning

Det fremstilles en substratopplosning analogt med eksempel 4-2).

7-3) Enzymomsetning og

7-4) Isolering og rensing av den onskede forbindelse:

Man gjentar samme fremgangsmåte som i eksempel 3-3) og 3-4), idet man anvender de ovenfor omtalte celle-suspensjoner og substratopplbsninger til dannelse av 75 mg av et hvitt pulver. Omsetningen utfores i 3 timer. Reaksjonsproduktets egenskaper er som folger:IcJtT= +12,8° (c=0,5, 1 molar fosfat-ubuffer (pH 7,0))

-1

IR (KBr)v<;>°3ks#: 3420'326°'1?60'1685

PMR (D20)£(ppm): 7,35 (2H, d, J=8,0 Hz)

6,96-(2H, d, J=8,0Hz)

6.10 (1H, d, J=5,l Hz)

5,45 (1H, d, J=4,9 Hz)

5.11 (1H, s)

3,92 (1H, m)

2,45 (1H, m)

1,50 - 1,08 (2H, m)

1,01 (3H, d, J=7,l Hz)

Basert på de ovenfor angitte data identifiseres det hvite pulver som den onskede forbindelse. Ut fra den kraftige antimikrobielle virkning antas den absolutte konfigurasjon for denne forbindelse å være (4S, 6R, 7S).

Eksempel 8

Fremstilling av forbindelse ( A) ( alternativ fremgangsmåte)

Man benytter samme fremgangsmåte som i eksempel

3 med den unntagelse at man anvender 120 mg (+)-cis-7-amino-l-azabicyklo/4,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er.fremstilt i sammenligningseksempel 2, istedenfor (- )-cis-7-amino-l-azabicyklo(/^, 2, Q7okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre til dannelse av 160 mg av et hvitt pulver. Egenskapene til dette reaksjonsprodukt faller sammen med egenskapene for den forbindelse som er fremstilt i eksempel 3«

Eksempel 9

Fremstilling av forbindelse ( B) ( alternativ fremgangsmåte)

Man gjentar samme fremgangsmåte som i eksempel 4 med unntagelse av at man benytter 150 mg av (-)-cis-7(3-amino-4a-metyl-l-azabicyklo;/^, 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt i sammenligningseksempel 4, istedenfor trifluoracetatsaltet av (-)-cis-7p<->amino-4o:-metyl-l-azabicyklo/3,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre til dannelse av 150 mg av et hvitt pulver. Dette reaksjonsprodukts egenskaper faller sammen med de som er funnet for forbindelsen fremstilt i eksempel 4.

Eksempel 10

De antibakterielle virkninger av de forbindelser som er fremstilt i eksemplene 3, 4, 6 og 7 er belyst i tabell 1. De forbindelser som er fremstilt i de senere angitte sammenligningseksempler, samt forbindelsen cefazolin er benyttet som referanseforbindelser. Man benyttet hjerteinfusjonsagar-fortynningsmetoden (pH 7,0).

I tabell 1 betyr numrene for forbindelsene de

) etterfølgende forbindelser, og bokstavene A til 0 betyr de nedenfor angitte bakteriestammer.

1. (+) forbindelse fremstilt i eks. 3

2. (-) forbindelse fremstilt i eks. 6 i DE-OS 2911787

3. (-) forbindelse fremstilt i eksi 6 i DE-OS 2911787

4. (+) forbindelse fremstilt i eks. 4

5. (-) forbindelse fremstilt i eks. 12 i DE-OS 2911787 6. (-) forbindelse fremstilt i eks. 12 i DE-OS 2911787

7. (+) forbindelse fremstilt i eks. 6

8. (+) forbindelse fremstilt i eks. 47 i DE-OS 2911787

<3>9. (+) forbindelse fremstilt i eks. 7

10. (+) forbindelse fremstilt i eks. 44 i DE-OS 291187

11. Cefazolin (kontroll).

MIC (minimum inhiberingskonsentrasjon) av de med (+) merkede forbindelser,som er fremstilt i eksemplene 5 6 og 12 i DE-OS nr. 2911787, stemmer overens med MIC for

de med (+) merkede forbindelser som er fremstilt i eksemplene 3 og 4.

A. Staphylococcus aureus 209-P

)B. Staphylococcus aureus Smith

C. Staphylococcus epidermidis

D. Escherichia coli MIHJC-2

E. Escherichia coli Juhl

F. Klebsiella pneumoniae 8045

3 G. Klebsielle pneumoniae Y-60

H. Serratia marcescens T-26

I. Serratia marcescens T-55

J. Proteus mirabilis 1287

K. Proteus vulgaris 6897

L. Proteus morganii KY 4298 M. Proteus rettgeri KY 4289 N. Pseudomonas aeruginosa 145 0. Pseudomonas putida F 264

Eksempel 11

Fremstilling §Y_5§£iil2yiYiÉ£;t^r_av_ (i)zcis=72(2-fen^l-2^ t-buty;loksYkarbony;l-aminoacetamido )-3^ Z5i2i2Z2k^~2-en=8-on=2-karboksYlsYre:

150 mg (0,55 mmol) {-)-cis-7-amino-3-klor-2-tert.-butyloksykarbonyl-l-azabicyklo/5,2,07okt-2-en-8-on opploses i 3 ml vannfritt metylenklorid. 166 mg (0,66 mmol) (R)-N-tert.-butyloksykarbonylfenylglycin opploses i 5 ml vannfritt tetrahydrofuran og oppløsningen avkjoles til -15 til -10°C. 0,66 ml (0,66 mmol) IN N-metylmorfo-lin i tetrahydrofuran og 0,66 ml (0,66 mmol) IN isobutyl-klorformiat i tetrahydrofuran tilsettes dråpevis og blandingen omrores ved den samme temperatur i 20 minutter. Den ovenfor fremstilte aminooppldsning tilsettes dråpevis til blandingen, idet man opprettholder samme temperatur og temperaturen til blandingen får stige gradvis til romtemperatur. Blandingen omrores ved romtemperatur natten over. 10 ml metylenklorid tilsettes til reaksjonsblandingen og. blandingen vaskes med 10% sitronsyre, med mettet vandig natriumhydrogenkarbonat og med mettet vandig natriumklorid i denne rekkefolge, og den tbrkes med vannfritt natriumsulfat. Blandingen inndampes under vakuum og renses ved silisiumdioksydgel-kromatografering (silisiumdioksydgel: 20 g "C-200", opplosningsmiddel: etylacetat: n-heksan = 1:5, regnet på volum, dette er gjeldende i det folgende) til dannelse av 124 mg (utbytte 44,6%) av den onskede for-

bindelse (en blanding av diasteroisomerer) som har folgende egenskaper: IR (KBr)V^ks>: 1780, 1730, 1680, 1550

NMR (CDC13) 6 (ppm): 7,34 (5/2 H, s)

7,31 (5/2 H, s)

6,93 (1H, m)

5,63 (1H, m)

5,30 (1/2 H, dd, J=5,4, 6,8 Hz)

5,11 - 5,22 (3/2 H, m)

3,76 - 3,91 (1H, m)

2,33 - 2,66 (2H, m)

1,52 (9H, s)

1,41 (9H, s)

0,92 - 1,97 (2H, m)

Eksempel 12

Fremstilling av_£6Ri7S)-7- (H\;£^ Y^ S^ l^^^ i^ zlz^^ Lziz azabicyklo/^ 2^020^^-2=en=8-on-2-ka^ ,

2Dl§l°2i2-karboksYlsYre_{D2

1 ml metylenklorid og 1 ml trifluoreddiksyre

tilsettes til 128,4 mg (0,25 mmol) tert^butylester av (-)-cis-7-(2-feny1-2-tert.-butyloksykarbonylaminoacetamido)-3-klor-l-azabicyklo^, 2,07okt-2-en-8-on-karboksylsyre under.

isavkjdling og blandingen omrores ved romtemperatur i 1,5 timer. Opplosningsmidlet avdestilleres og det således oppnådde oljeaktige materiale underkastes hurtig væskekromatografi (sbyle: "Microbondapak C-18", opplosningsmiddel: 7% metanol og 0,2N KH2P0^) for atskillelse av diastereoisomerer. Hver av de atskilte eluatfrak-sjoner inndampes under vakuum og saltet fjernes under anvendelse av 10 ml "Diaion HP-10" harpiks (opplosningsmiddel: metanol:vann = 1:1) til dannelse av 9,4 mg av

den mer polare isomer (D) og 7,6 mg av den mindre polare isomer (C) (totalt utbytte 19,1%).

Mer polare isomer (D)

L17^ °' -75,8° (c=0,4,H20)

Smeltepunkt: 300°C eller hoyere, brunfarging.

-1

IR(KBr)^^ks>: 1765, 1700, 1550

NMR(D20) £(ppm): 7,49 (5H, s)

5,16 (1H, d, J=4,7Hz)

5,05 (1H, s)

3,78 - 4,03 (1H, m)

2,53 - 2,67 (2H, m)

1,26 - 2,09 (2H, m)

Mindre polar isomer (C)

Ll7^ °'+34,0° (c=0,35, H20)

Smeltepunkt: 300°C eller hoyere, brunfarging

-1

IR(KBrV^ks>: 1770, 1700, 1620

NMR(D20) / (ppm).: 7,51 (5H, s)

5,36 (1H, d, J=4,6 Hz)

NMR (D20) ^(ppm) (forts.): 5,19 (1H, s)

3,83- - 4,00 (1H, m)

2,41 - 2,56 (2H, m)

1,49 - 1,76 (1H, m)

1,14 - 1,45 (1H, m)

Som angitt nedenfor utviser den mindre polare isomer (C) kraftigere antimikrobiell aktivitet, og den antas å ha (6R, 7S) som absolutt konfigurasjon.

Eksempel 15

Fremstilling_av_^)-cis-7-fenylacet

150 mg (0,45 mmol) av trifluoracetatet av (-)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicykloj/5, 2,07okt-2-en-8-2-karboksylsyre bringes i suspensjon i et blandet opplosningsmiddel av 2 ml vann og 2 ml aceton, og til dette tilsettes 134 mg (1,5 mmol) natriumhydrogenkarbonat for fremstilling av en homogen opplbsning. Til opplbsningen tilsettes dråpevis en opplbsning av 84,2 mg (0,54 mmol) fenylacetylklorid og 0,5 ml aceton under isavkjbling i lbpet av 1 time. Blandingen holdes under omrbring i 3 timer, justeres til pH 2 med IN saltsyre og ekstraheres frem ganger med 2 ml etylacetat. Ekstraktet inndampes under vakuum og inndampningsresten tbrkes til dannelse av 80 mg (55,0%) av den onskede forbindelse.

-1

IR(KBr)^^ks>: 1790, 1705, 1630, 1560.

NMR(CD3OD) ^'(ppm): 7,25 (5H, s)

5,36' (1H, d, J=5Hz)

3,79 - 3,99 (1H, m)

2,56 - 2,75 (2H, m)

1,17 - 2,02 (2H, m)

Eksempel 14

Fremstilling av (§Ri7§^Z-^R^E-hydroksyfenvlglycinamido-3-klor=l-azabicYklo/4i2i0Zokt-22en- : 1 ml metylenklorid og 1 ml trifluoreddiksyre tilsettes under isavkjoling til 104,3 mg (20 mmol) tert.-butylester av (i)-cis-7-j/2-(p-hydroksyfenyl)-2-t,-butyloksykar-bonylaminoacetamido7-3-klor-l-azabicyklo/5,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (blanding av de diastereoisomere), som er syntetisert ut fra den tertiære butylester av (-)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicyklo/5,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre og N-tert.-butyloksykarbonyl-(R)-p-hydroksyfenylglycin. Blandingen omrores ved den rådende temperatur i 1,5 timer og inndampes under vakuum. Det således oppnådde oljeaktige materiale underkastes hurtig væskekromatografering (sbyle: "Mikrobondapak C-18", opplosningsmiddel: 7% metanol, 0,2N kaliumdihydrogenfosfat) til atskillelse av de diastereoisomere. Fraksjonene som inneholder den mindre polare isomer inndampes under vakuum og saltet fjernes med 10 ml "HP-10"-harpiks (opplosningsmiddel: metanol:vann = 1:1) til dannelse av 10,5 mg (28,7%) av den onskede forbindelse.

Za7n°°: +44° (c=0,25- 1 molar fosfat-"u■ 'buffer, pH 7,0)

-1

IR(KBr)V^ks>: 1765 ' 1695'1615 ' 1520

NMR(D20) S (ppm): 7,36 (2H, d, J=8,8Hz)

6,96 (2H, d, J=8,8 Hz)

5,36 (1H, d, J=4,6 Hz)

5,11 (1H, s)

3,81 - 4,00 (1H, m)

2,42 - 2,58 (2H, m)

1,59 - 1,77 (lH,m)

Den antibakterielle virkning av de forbindelser som er fremstilt i eksemplene 12 og 14 er vist i neden-stående tabell. Aktiviteten er fastlagt ved hjelp av hjerteinfusjonsagar-fortynningsmetoden (pH = 7,2). Forbindelsene cephalexin og cefazolin er benyttet som referanseforbindelser. Ut fra den antimikrobielle aktivitet antas den absolutte konfigurasjon av denne forbindelse å være (6R,7S).

a: Forbindelsen (C) fremstilt i eksempel 12

b: Forbindelsen fremstilt i eksempel 14

c: Cephalexin

d: Cefazolin

Eksempel 15

Fremstilling_av_forbindels :

15-1) Dyrking av mikroorganismene

Som podestamme ble folgende stammer benyttet: Aeromonas hydrophila IFO 12634 Achromobacter aceris IFO 3320 Arthrobacter simplex ATCC 15799 Acetobacter aurantius IFO 3245

Acetobacter sp. ATCC 21760 Alcaligenes faecalis ATCC 8750 Escherichia coli ATCC 13281 Xanthomonas physalidicola IFO 13555 Gluconobacter liquefaciens ATCC 14835 Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271

Comamonas terrigena IFO 12685 Corynebacterium tritici IFO 1216

Sarcina lutea ATCC 9341 Staphylococcus aureus IFO 3060

Spirillum methamorphum IFO 12012

Bacillus megaterium ATCC 14945 Pseudomonas aeruginosa IFO 3451 Flavobacterium cerinum ATCC 21429 Brevibacterium cerinum ATCC 13221 Protaminobacter alboflavus IFO 13221

Proteus rettgeri ATCC 9250

Beneckea hyperoptica ATCC 15803 Micrococcus luteus AHU 1427

Mycoplana bullata IFO 13267

Mycoplana dimorpha IFO 13213 Thodopseudomonas spheroides ATCC 21286

Som substrat anvendes en vandig opplbsning inneholdende 1% kjbttekstrakt, 1% pepton, 0,3% natriumklorid, 0,5% gjærekstrakt, og som reguleres til en pH-verdi på 7,2 med 5N NaOH. En lbkkefull podemateriale podes ut i 30 ml av substratet i en 300 ml Erlenmeyer-kolbe, og dyrkingen utfores under omrbring ved en temperatur på 30°C i lbpet av 24 timer. Cellelegemene fjernes fra dyrkingsvæsken ved filtrering og vaskes med 5 ml 0,9% natrium-

, kloridopplbsning. Cellene innvinnes deretter ved sentrifugering og bringes i suspensjon i en konsentrasjon på 40 mg/ml beregnet på tbrrstoff i 1/30 molar fosfatbuffer (pH 6,5).

15-2) Fremstilling av substratopplbsningen

En substratopplosning fremstilt analogt med eksempel 3-2), dvs. av 123 mg (-)-cis-7-amino-l-azabicyklo/4,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre og 400 mg av hydrogenkloridsaltet av d-fenylflycinmetylester tilsettes til 15 ml 1/30 molar fosfatbuffer (pH 6,5). Det tilsettes 5N K0H i små mengder og blandingen reguleres til en pH-verdi på 6,5 til opplbsning av de to utgangsforbindelser. Endelig tilsettes ionevekslet vann til dannelse av 20 ml opp--lbsning.

i 15-3) Enzymomsetning

Man foretar samme fremgangsmåte som i eksempel 6, idet man benytter 0,5 ml av den i 15-1) fremstilte suspensjon av celler og 0,5 ml av substratopplbsningen. Omsetningen utfores ved en temperatur på 30°C i lbpet av 24

1timer.

15-4) Identifikasjon av den onskede forbindelse.

Omsetningen overvåkes ved hurtig væskekromatografi på samme måte som i eksempel 1.

Som det fremgår av tabell 3, dannes den onskede mer polare diastereoisomere forbindelse, dvs. (-)-cis-7- /(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido7-l-azabocyklo(/5, 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (DE-OS 2911787) i det hele tatt ikke, og det dannes kun den onskede mindre polare isomer, dvs. (+)-cis-7-/XR)-2-fenyl-2-aminoacetamido7-l-azabicyklo-[ h, 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre. Det enzym som er fremstilt av alle de i tabell 3 angitte stammer, har evne til optisk'selektiv acylering av cefalosporin-analoge.

2,66 mg forbindelse ville produseres ved et utbytte på

100%.

Eksempel 16

Fremstilling av forbindelsen (A) (alternativ fremgangsmåte)

Ved dette eksempel podes Clostridium acetobutylicum IFO 3346 i 100 ml potetdekstrose-buljong. Fermenter-ingsapparaturen forsegles etter at luften er erstattet med sterilisert nitrogen og dyrkingen utfores ved en temperatur på 30°C i lbpet av 48 timer. Cellelegemene innvinnes og vaskes med fysiologisk saltopplbsning. Cellene bringes i suspensjon i 2 ml 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). Man foretar samme omsetning som i eksempel 15 til dannelse av 0,12 mg av forbindelsen (A).

Eksempel 17

Fremstilling av_(§RL7S)-73(R)-fenylgl^cinamido-3-klor-l-2z^ i2X) S^ 2Z^ jL^ z^ Z2] S^ z^ z2^ z§z2^ z^ z^ I^ 2] S^ Y.^-^ J.^ S i§ii®r£§~

17-1) Fremstilling av cellesuspensjon

(a) Dyrking av en mikroorganisme som har evne til optisk selektiv acylering.

Som podestamme anvendes Pseudomonas melanogenum ATCC 17808 (biologiske egenskaper er beskrevet i Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 37, 71 (I963)).

Som podningssubstrat anvendes en vandig opplosning inneholdende 1% polypepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjottekstrakt, 0,5% natriumglutamat og 0,25% natrium-

klorid, og som er regulert til en pH-verdi på 7,0 med 5N NaOH. En lokkefull podemateriale podes i 10 ml pode-substrat i et 50 ml reagensror og dyrkingen utfores ved en temperatur på 30°C i 24 timer. Den samlede mengde pode-substrat anbringes i 300 ml dyrkningssubstrat i en 2 liter Erlenmeyer-kolbe og dyrkingen utfores ved en temperatur på 30°C. Sammensetningen av dyrkningssubstratet er den samme som sammensetningen av podesubstratet.

(b) Fremstilling av cellesuspensjonen

Etter dyrking i 24 timer fjernes cellelegemene

fra dyrkningsvæsken ved sentrifugering og de vaskes to ganger med 50 ml 0,9% saltopplbsning. Cellene bringes i suspensjon i en konsentrasjon på 20 mg/ml beregnet på torrstoff i 1/30 molar fosfatbuffer (pH 6,5).

17-2) Fremstilling av en substratopplosning

200 mg av trifluoracetatet av (-)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicyklo/^,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (utgangsforbindelse (a)), som er fremstilt analogt med sammenligningseksempel 8, og 800 mg av hydrogenkloridsaltet av d-fenylglycinmetylester (utgangsforbindelse (b)) tilsettes i 9 ml av 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). Det tilsettes 5N K0H i små mengder og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 6,5 for opplbsning av de to ut-gangsf orbindelser. Endelig tilsettes ionevekslet vann til dannelse av 10 ml opplosning.

17-3) Enzymomsetning

10 ml av .suspensjonen av sprengte celler tilset-

tes til 10 ml av substratopplbsningen og enzymomsetningen utfores ved. en temperatur på 30°C i lbpet av 1,5 timer. Omsetningen overvåkes ved hurtig væskekromatograi under

anvendelse av "Trio Rotar" samt "prepack"-sbyle "Nucleosil 10C18".

Eluering utfores med 7% metanol-0,2 molar KH2P0^-opplbsning. Omsetningen når sitt maksimum med et.utbytte på 90% i forhold til utgangsforbindelsen (a) i lopet av 1,5 timer.

17-4) Isolering, og rensing av den onskede forbindelse

Etter avslutning av omsetningen fjernes cellelegemene fra reaksjonsopplbsningen ved sentrifugering.

Det ovre væskelag inndampes under vakuum og påfbres sbylen (1,6 cm bred, 50 cm hby) som er pakket med "Diaion HP-10".

Etter tilsetning av 200 ml ionevekslet vann utfores eluering med 25" vandig metanolopplbsning. Der-

etter inndampes de fraksjoner som inneholder den onskede forbindelse under vakuum til dannelse av 5 ml konsentrat. Konsentratet påfbres en sbyle (1,6 cm bred, 64,5 cm hby)

som er pakket med 130 ml "Sephadex-LH20", og elueringen utfores med et opplosningsmiddel bestående av vann og metanol (50:50). Den onskede forbindelse eluéres i fraksjonene 55 ral - 75 ml. Fraksjonene inndampes under vakuum og lyofiliseres til dannelse av 78 mg av et hvitt pulver. Egenskapene av reaksjonsproduktet faller sammen med egenskapene for den mindre polare isomer (C) i eksempel .12.

De antibakterielle egenskaper av den forbindelse som er fremstilt i eksempel 17 er vist i tabell 2 under betegnelsen forbindelse (a). Man benyttet hjerteinfusjonsagar-fortynningsmetoden (pH 7,2). Céfazalin ble benyttet som referanse. Ut fra den antimikrobielle aktivitet antas den absolutte konfigurasjon for denne forbindelse å være (6R,7S).

Eksempel 18

acetamido-3-klor-l-azabicYklo/^ oksylsyre:

18-1). Fremstilling av cellesuspens jon

Dyrking av en mikroorganisme

Man gjentar samme fremgangsmåte som i eksempel 17- 1) med unntagelse av at man som podestamme benytter Xanthomonas citri IFO 3835 (biologiske egenskaper er beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology VI, side 156 (1948)).

18- 2) Fremstilling av substratopplosning

200 mg av trifluoraeetat av (-)-cis-7(3-amino-3-klor-l-azabicyklo/5-, 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt som i sammenligningseksempel 8, og 800 mg av hydrogenkloridsaltet av d-p-hydroksyfenylglycinmetylester tilsettes i 9 ml av 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). Det tilsettes 5N K0H i små mengder og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 6,5 for opplosning av utgangsfor-bindelsene. Til slutt tilsettes ionevekslet vann til dannelse av 10 ml opplosning.

18-3) Enzymomsetning samt

18-4) Isolering og rensing av den onskede forbindelse

Etter avslutning av omsetningen fjernes cellene ved sentrifugering og det derved oppnådde filtrat inndampes under vakuum. Konsentratet anbringes på en soyle (1,6 cm

. bred, 50 cm hby) som er pakket med 100 ml "Diaion HP-20AG"

(100 - 200 mesh). Deretter helles 150 ml vann og 150 ml 10% vandig metanol gjennom kolonnen og elueringen utfores med 20% vandig metanol. Fraksjonene (fra 210 til 750 ml) av eluert 20% vandig metanol forenes og inndampes under vakuum. Det således fremstilte konsentrat påfbres en sbyle (0,88 cm bred, 70 cm hby) som er pakket med 43 ml "Sephadex LH20" og elueringen utfores med en blanding av vann og metanol (1:1 beregnet på volum). Fraksjonene (28 - 34 ml) forenes og inndampes under vakuum for fjerning av metanolen.

Den således oppnådde inndampningsrest lyofiliseres til dannelse av 47 mg av et hvitt pulver. Sluttproduktet identifiseres som den onskede forbindelse basert på folgende egenskaper: /a7n°° = +44,0° (c=0,25, 1 molar fosfat-u • buffer (pH 7,0))

-1

IR (KBr)yJJ;mks<: 1765, 1695, 1615

NMR (100M, D20-DDS)i~: 7,36 (2H, d, J=8,8 Hz)

6,96 (2H, d, J=8,8Hz)

5,36 (1H, d, J=4,6 Hz)

5,11 (1H, s)

3,81 - 4,00 (1H, m)

2,42 - 2,58 (2H, m)

1,59 - 1,77 (1H, m)

1,17 - 1,48 (1H, m)

Den antimikrobielle aktivitet av forbindelsen

som er fremstilt i ovenstående eksempel, er vist i tabell 2 under betegnelsen forbindelse (b).

Eksempel 19

Ergmstilling_av_(6Ri7S>=7:(^ azabicYklo/^i2A07okt-2=enI8=on=2-karb fremgangsmåte}:

19-1) Fremstilling av cellesuspensjonen

(a) Dyrking av en mikroorganisme som har evne til optisk selektiv acylering

Som podestamme benyttes Pseudomonas melanogenum ATCC 17808 (biologiske egenskaper er beskrevet i Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, 37, 71 (1963)).

Som podningssubstrat benyttes en vandig opplosning inneholdende 1% polypepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjbttekstrakt, 0,5% natriumglutamat og 0,5% natriumklorid, og som er regulert til en pH-verdi på 7,0 med 5N NaOH.

En lokkefull podemateriale podes i 10 ml podningssubstrat

i et 50 ml reagensror og dyrkingen utfores ved en temperatur på 30°C i lopet av 24 timer. Den samlede mengde pode-substrat anbringes i 300 ml dyrkningssubstrat i en 2-liters Erlenmeyer-kolbe og dyrkingen utfores under omrysting ved en temperatur på 30°C. Sammensetningen av dyrkingssubstratet er den samme som sammensetningen av podesubstratet.

(b) Fremstilling av cellesuspensjonen

Etter dyrking i 24 timer innvinnes cellelegemene fra dyrkningsvæsken ved sentrifugering og de vaskes to gang er med 50 ml 0,9% saltopplosning. Konsentratet påfdres på en sdyle (1,6 cm bred, 64,5 cm hby) som er pakket med 130 ml "Sephadex-LH20" og elueringen utfores med en blanding av vann og metanol (50:50). Den onskede forbindelse elueres. i fraksjonene 55 ml til 75 ml. Fraksjonene inndampes under vakuum og inndampningsresten lyofiliseres til dannelse av 12,8 g av et hvitt pulver. Egenskapene til dette reaksjon-produkt faller sammen med egenskapene til det produkt som

i er fremstilt i eksempel 17. Cellene bringes i suspensjon i en konsentrasjon på 20 mg/ml beregnet på tbrrstoff i 1/30 molar fosfatbuffer (pH 6,5).

19-2) Fremstilling av substratopplbsningen

100 mg av (-)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicyklo/4,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (utgangsforbindelse (a)), som er fremstilt som i sammenligningseksempel 9, og 800 mg av hydrogenkloridsaltet av d-fenylglycinmetylester tilsettes i 9 ml av 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). Det tilsettes 5N K0H i små mengder og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 6,5 for opplbsning av de to utgangsforbindelser. Til slutt tilsettes ionvekslet vann til dannelse av 10 ml opplbsning.

19-3) Enzymomsetning

10 ml cellesuspensjon tilsettes til 10 ml substratopplosning og enzymomsetningen utfores ved en temperatur på 30°C i 1,5 timer. Omsetningen overvåkes ved hurtig væskekromatografi under anvendelse av Trirotar og Prepack-sbyle "Nucleosil 10C18". Elueringen utfores med 7% metanol-0,2 molar KH2P0^-opplbsning. Omsetningen når sitt maksimum i lbpet av 1,5 timer. Utbyttet i forhold til utgangsforbindelsen (a) er 90%.

19-4) Isolering og rensing av den onskede forbindelse

i Etter avslutning av omsetningen fjernes cellelegemene fra reaksjonsopplbsningen ved sentrifugering. Den ovenliggende væske inndampes under vakuum og påfbres på en

kolonne (1,6 cm bred, 50 cm hby), pakket med 100 ml "Diaion HP-10". Etter tilsetning av 200 ml ionevekslet vann utfores elueringen med 25% vandig metanolopplosning. De fraksjoner som inneholder den onskede forbindelse inndampes under vakuum til dannelse av 5 ml konsentrat. Dette konsentrat påfbres på en kolonne (1,6 cm bred, 64,7 cm hoy), som er pakket med 130 ml "Sephadex LH20", og elueringen utfores med en blanding av vann og metanol (50:50). Den onskede forbindelse elueres i fraksjonene 55 ml - 75 ml. Fraksjonene inndampes under vakuum og lyofiliseres til dannelse av 128 mg av et hvitt pulver. Reaksjonsproduktets egenskaper er sammenfallende med egenskapene for det produkt som er fremstilt i eksempel 17.

Eksempel 20

FremsJilling_av_(6Rz7S Izlzll^ lI^ifenylz2=aminozacetamidoZ;

3-klor-l-azabicyklo/4i2i0^okt-2-en-8-on-2-karboksylsY<re>

Eksempel 17-1) gjentas med unntagelse av at man som podestamme anvender Kluyvera citrophila ATCC 21285 (biologiske egenskaper er beskrevet i J. General Applied Microbiology 3, 27 - 31 (1957)). Etter 24 timer av den egentlige dyrking fjernes cellene fra dyrkningsvæsken ved sentrifugering og man fremstiller en cellesuspensjon analogt med behandlingen gjennomfort i eksempel 17-1). Frem-stillingen av en substratopplosning og enzymomsetningen utfores på samme måte som i henholdsvis eksempel 17-2) og 17-3) med unntagelse av at omsetningen utfores i lbpet av 20 timer. Rensingen utfores ved sbylekromatografi under anvendelse av "HP-10" og "Sephadex LH20" analogt

med eksempel 17-4). De fraksjoner som inneholder den onskede forbindelse lyofiliseres til dannelse av 86 mg av et hvitt pulver. Reaksjonsproduktets egenskaper er sammenfallende med egenskapene for forbindelsen fremstilt i eksempel 17.

Sammenligningseksemel 1

De antimikrobielle aktiviteter av de forbindelser som er fremstilt i eksemplene 1 og 2, er som angitt i det folgende. Det benyttes hjerteinfusjonsagar-fortynningsmetoden (pH 7,2). Som referanse anvendes den cefalospo-rinforbindelse som har samme acylsidekjede tilsvarende d,1-forbindelsen.

A: Forbindelsen fremstilt i eksempel 1

A': d,1-forbindelsen tilsvarende forbindelsen fremstilt

i eksempel 1

B: Forbindelsen fremstilt i eksempel 2

B': d,1-forbindelsen tilsvarende forbindelsen fremstilt

i eksempel 2

C: Cefalosporinforbindelsen som har folgende formel:

Sammenligningseksempel 2

Fremstilling_ay_£+)=cis-7^ §l2£l?-karboksYlsYre

2-1) Fremstilling av suspensjon av sprengte celler l) Dyrking av en mikroorganisme som har evnen til optisk selektiv acylering

Som podemateriale anvendes Kluyvera citrophila ATCC 21285 (biologiske egenskaper er beskrevet i J. General Applied Microbiology 3, 28 - 31 (1957)).

Som podningsmedium anvendes en vandig opplosning inneholdende 1% polypepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjottekstrakt, 0,5% natriumglutamat og 0,25% natriumglutamat og 0,25% natriumklorid, og som er regulert til en pH-verdi på 7,0 med 5N NaOH. En lokkefull av podematerialet podes i 10 ml podningssubstrat i et 50 ml reagensrbr, og dyrkingen utfores ved en temperatur på 30°C i lbpet av 24

timer. Den samlede mengde podningsvæske podes i 300 ml dyrkningssubstrat i en 2-liters Erlenmeyer-kolbe og dyrkingen utfores ved en temperatur på 40°C under rysting. Sammensetningen av dyrkingssubstratet er den samme som sammensetningen av podesubstratet.

(2) Fremstilling av en suspensjon av sprengte celler

Etter dyrking i 24 timer underkastes dyrkingsvæsken sentrifugering for tilveiebringelse av cellelegemene. Cellene vaskes to ganger med 50 ml 0,9% saltopplbsning og bringes i suspensjon i en konsentrasjon av 40 mg/ml beregnet på tbrrstoff i 1/30 molar fosfatbufferopplbsning. Deretter anbringes 10 ml av cellesuspensjonen i et 50 ml reagensrbr og underkastes ultrasonisk disintegrering ved 200 W i 2 minutter til dannelse av en suspensjon av sprengte celler. Ved behandlingen anvendes en ultrasonisk disintegrator, modell UR200P.

2-2) Fremstilling av en substratopplosning

200 mg ()-cis-7-fenylacetamid-l-azabocyklo/4,2,07-

okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre fremstilt som i DE-OS nr. 2911787, tilsettes til 9 ml 1/30 molar fosfatbuffer (pH 6,5). Ettersom forbindelsen ikke opploses tilsettes 2N NaOH i små mengder og blandingen justeres igjen til en pH-verdi på 6,5 for opplosning av forbindelsen. Til slutt tilsettes ionevekslet vann til dannelse av 10 ml opplosning.

2-3) Enzymomsetning

10 ml av den ovenfor nevnte suspensjon av sprengte celler tilsettes til 10 ml av substratopplbsningen og enzymomsetningen utfores ved en temperatur på 30°C i 80 minutter. Det tidsmessige forlop av omsetningen belyses i tabell 5.

Som det fremgår av tabell 5, forblir omsetningen og utbyttet stasjonært når forst en omdannelsesgrad på blandingen av de optiske isomerer når 50% (molforhold).

1 2- U) Isolering og rensing av den onskede forbindelse

Etter avslutning av omsetningen fjernes cellene ved sentrifugering fra reaksjonsopplbsningen. Den ovenliggende væske reguleres til en pH-verdi på 3,0 med 2N saltsyre og den påfbres på en sbyle (2,6 cm bred, 51 cm hby) som er pakket med 270 ml "Diaion HP-10".

Elueringen utfores med ionevekslet vann og eluatet oppsamles i fraksjoner på 5 ml. Den onskede forbindelse elueres fra fraksjonene 280 - 315 ml. Fraksjonene inndampes under vakuum, lyofiliseres og opploses i en liten mengde av en blanding av vann og metanol (50:50 beregnet på volum, hvilket vil gjelde i det folgende). Opplbsningen påfbres på en sbyle (1,6 cm bred, 64,5 cm hby), som er pakket med 130 ml "Sephadex LH-20". Elueringen utfores med en blanding av vann og metanol (50:50). Eluatet oppsamles til fraksjoner på 5 ml. Fraksjonene fra 65 ml til 85 ml .. kombineres og inndampes under vakuum for fjerning av metanol. Deretter lyofiliseres inndampningsresten til dannelse av 48 mg av et hvitt pulver. Reaksjonsproduktets egenskaper er som folger: -1

IR(KBr)V^<k>s>: 1800, 1790, 1775, 1640, 1620

NMR(100M D20-DDS) & : 6,46 (1H, dd, J=3,5,-4,7 Hz)

4,88 (1H, d, J=5,2 Hz)

4,06 (1H, m)

2,5 - 1,5 (4H, m)

Det fremgår herfra at forbindelsen har et mole-kyl hydrogenklorid og vann. Forbindelsens egenskaper er i god overensstemmelse med egenskapene for den tilsvarende

,--rl5°d, 1-f orbindelse. Verdien av den optiske rotasjon er /a/<py>= +48° (c=0,5 i 1-molar fosfatbufferopplbsning (pH 7,0)), hvilket stemmer godt overens med verdien i nedenfor angitte sammenligningseksempel 3 r& l^~ ° = ^8,5° (c=0,5, i 1-molar fosfatbufferopplbsning (pH 7,0)).

Forbindelsen utviser en ninhydrin positiv enkelt flekk ved en Rf-verdi på 0,22 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (tynnsjiktsplate "Merck Art 5721", opplosningsmiddel for fremkalling: isopropanol:eddiksyre:vann = 4:1:1). Rf-verdien er sammenfallende med den som tilsvarer den optisk inaktive dl-forbindelse. Sammenligningseksemel 5 Fremstilling ay_(+)-cis=7-amino-l-azabicYk 2Dz§z22~2-karboksylsyre_{alternatiy_fremgangsmåte)

3-1) Fremstilling av en suspensjon av sprengte celler

Man gjentar samme fremgangsmåte som benyttet i sammenligningseksempel 2-1).

3-2) Fremstilling av en substratopplosning

100 mg (+)-cis-7-ZlR)-2-fenyl-2-aminoacetamido7-l-azabocyklo/4,2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt som i DE-OS nr. 2911787, opploses i 5 ml 1/30 molar fosfatbufferopplbsning (pH 6,5).

3-3) Enzymomsetning

5 ml av den ovenfor nevnte suspensjon av sprengte celler tilsettes til 5 ml av substratopplbsningen, og enzymomsetningen utfores ved 30°C i 24 timer.

3- 4) Isolering og rensing

Man oppnår 46 mg av et hvitt pulver ved analog fremgangsmåte til den som er angitt i sammenligningseksempel 2-4). Denne forbindelses egenskaper stemmer godt overens med egenskapene for den forbindelse som er fremstilt i sammenligningseksempel 2.

Za7n 15° = 48,5 o(c=0,5, i 1-molar fosfatbufferopplbsning

"U(pH 7,0))

Sammenligningseksempel 4

?r22}stilling_av_ (z2z2i§zZ§-amino-4a-metYl-l-azabicYklo/4^2i07_okt-2-en-8-on-2-karboksYlsYre;

4- 1) Fremstilling av en suspensjon av sprengte celler

Man gjentar en fremgangsmåte som er analog med den som er angitt i sammenligningseksempel 2-1).

4-2) Fremstilling av en substratopplosning

Man gjentar en fremgangsmåte som er analog med den som er angitt i sammenligningseksempel 2-2) med unntagelse av at man benytter (-)-cis-7B-fenylacetamid-4a-metyl-l-azabocyklo/4,2,07okt-2-en-9-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt som i DE-OS nr. 2911787.

4-3) Enzymomsetning

Man gjentar en fremgangsmåte som er analog med den som er angitt i sammenligningseksempel 2-3) med unntagelse av at man benytter den i 4-1) og 4-2) fremstilte suspensjon av sprengte celler og substratopplosning. Omsetningsforholdet blir stasjonært på 1 time. Omsetningen fortsettes i 120 minutter. Utbyttet er 50% (molforhold) av blandingen av de optisk aktive forbindelser.

4-4) Isolering og rensing av den onskede forbindelse

Man gjentar en omtrent analog fremgangsmåte med den som er angitt i sammenligningseksempel 2-4). Etter avslutning av omsetningen fjernes cellene ved sentrifugering fra reaksjonsopplbsningen. Den ovenliggende væske påfbres på en sbyle (2,5 cm bred, 46 cm hby), som er pakket med 220 ml "Diaion HP-10". Elueringen utfores med ionevekslet vann og eluatet oppsamles i fraksjoner på 5 ml. Den onskede forbindelse elueres i fraksjonene 200 til 270 ml. Fraksjonene inndampes i vakuum, lyofiliseres og opplbses i en liten mengde vann og metanol (50:50). Opplbsningen påfbres på en sbyle (1,6 cm bred, 64,5 cm hby) som er pakket med 130 ml "Sephadex LH-20" og elueringen utfores med en blanding av vann og metanol (50:50). Eluatet oppsamles i fraksjoner på 5 ml. Fraksjonene 65 ml til 80 ml kombineres og inndampes for fjerning av metanol. Deretter lyofiliseres inndampningsresten til dannelse av 30,5 mg av et hvitt pulver. Forbindelsens egenskaper er som folger: IR(KBr)v<;>^ks>: 1800, 1770 (sh), 1760 (sh),

1740, 1680, 1630

NMR(100M D20-DSS) £ : 6,16 (1H, d, J=5,l Hz)

4,52'(1H, d, J=4,9 Hz)

3,86 (1H, m)

2,64 (1H, m)

1.9 - 1,4 (2H, m)

1.10 (3H, d, J=7,3:Hz)

Det avsldres at forbindelsen er et kaliumsalt

med to molekyler vann. De ovenfor angitte egenskaper

<3>faller godt sammen med egenskapene for den tilsvarende d,l-forbindelse. Forbindelsen utviser en ninhydrin positiv enkeltflekk med Rf = 0,33 ved silisumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (samme silisiumdioksydgel anvendes som i eksempel l). Rf-verdien faller sammen med verdien for den

<5>optisk inaktive d,1-forbindelse.

Optisk rotasjon [ aj^<=>-30° (c=0,5, i 1-molar fosfatbufferopplbsning). Verdien stemmer godt overens med verdien i sammenligningseksempel 4, LWj~^ ="30,8° (c=0,5, i 1-molar fosfatbufferopplbsning (pH 7,0)).

<3>Sammenligningseksempel 5

Fremstilling_av_£=)-cis-7j32§^/5i?i2Z2iSiz2-en-8=on-2-karboksYlsYre {alt erna ti v_ fremgangsmåte)

5-1) Fremstilling av suspensjon av sprengte celler

5

Man gjentar samme fremgangsmåte som i sammenligningseksempel 4-1).

5-2) Fremstilling av en substratopplosning

100 mg (+)-cis-7B-/XR)-2-fenyl-2-aminoacetamido7-3 4a-metyl-l-azabocyklo1/5-, 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som var fremstilt som i DE-OS nr. 2911787, opplbses i 5 ml 1/30 molar fosfatbufferopplbsning.

5-3) Enzymomsetning

5 ml av den ovenfor beskrevne suspensjon av sprengte celler tilsettes til 5 ml av substratopplbsningen og enzymomsetningen utfores ved en temperatur på 30°C i 24 timer.

5-4) Isolering og rensing av det onskede produkt

Man gjentar samme fremgangsmåte som i sammenligningseksempel 4-4), hvorved man oppnår 55 g av et hvitt pulver. Forbindelsens egenskaper er i god overensstemmelse med dem som fremgår fra sammenligningseksempel 4.

Optisk rotasjon /a7D = -30,8 (c=0,5, i 1-molar fosfatbufferopplbsning (pH 7,0)).

Sammenligningseksempel 6

Fremstilling_av_{i)-cis-7-azi^ karbonYl-l-azabicYklo/^^O/okt-g-en-S-ori:

Foreliggende forbindelse fremstilles ved de etter-følgende beskrevne prosesser (a), (b), (c) og (d).

6-a) Fremstilling av (-)-cis-7-azido-3-fenyltio-l-azabicyklo/4,2,07oktan-3-2-karboksylsyre, tert.-butylester:

528 mg (2 mmol) {-)-cis-7-azido-l-azabicyklo/4\ 2,07-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, tert.-butylester fremstilles analogt med den metode som er angitt i japansk publisert patentsøknad nr. 128591/79, opplbses i 15 ml vannfri benzen

og 0,2 ml (2 mmol) tiofenol og 0,2 ml (2 mmol) piperidin tilsettes. Blandingen omrores ved romtemperatur i 2 timer. Etter avslutning av omsetningen vaskes reaksjonsopplbsningen med 10% sitronsyre og med mettet saltopplosning og den tdrkes med vannfritt natriumsulfat. Opplbsningsmidlet fjernes ved destillasjon under vakuum og den således oppnådde oljeaktige "inndampningsrest renses ved silisiumdioksydgel-sbylekromatografi under anvendelse av 30 g silisiumdiok-

j sydgel og et opplosningsmiddel bestående av et acetat og n-heksan (1:4) til dannelse av 720 mg (96,3%) av den onskede forbindelse: Smeltepunkt: 77,5 - 78,0°C.

IRV™Js>(cm<_1>): 2110, 1765, 1745

NMR (CDCl^)^ : 7,28 - 7,60 (5H, m)

4,78 (1H, d, J=5 Hz)

4-,33 (1H, s)

) 3,78 - 3,98 (1H, m)

3,81 (1H, s)

1,50 - 2,34 (4H, m)

1,42 (9H, s)

6-b) Fremstilling av (-)-cis-7-azido-3-fenylsulfinyl-1-azabicyklo/4,2,07oktan-8-on-2-karboksylsyre, tert.-butylester:

480 mg (1,28 mmol) av den 3-fenyltioforbindelse, som er fremstilt analogt med sammenligningseksempel 6-a), opplbses i 50 ml vannfri kloroform og 240 mg (1,41 mmol) m-klorperbenzosyre under isavkjbling. Blandingen får omsettes under omrbring og under isavkjbling i 30 minutter. Re-aks jonsblandingen vaskes med mettet natriumhydrogenkarbonat og mettet natriumklorid og den tbrkes med vannfritt natrium sulfat. Opplosningsmidlet fjernes ved destillasjon under vakuum for oppnåelse av 500 mg (99,9%) av den onskede forbindelse.

Smeltepunkt: 95,6 - 96,5°C

0

IRV™ks.(cm_1): 2120'2100'1780'1735'1035

NMR (CDC13) £: 7,55 - 7,91 (5H, m)

4,87 (1H, d, J=4,6 Hz)

<5>4,05 (1H, s)

3,90 - 4,10 (1H, m)

3,10 (1H, s)

1,70 - 2,84 (4H, m)

1,30 (9H, s)

0

6-c) Fremstilling_av_{i)-cis-7-azido=3-klo tert.-butylester:

109 mg av den sulfoksydforbindelse som er fremstilt i sammenligningseksempel 6-b), opplbses i 1 ml vannfritt metylenklorid og 23,5 mg (0,42 mmol) kalsiumoksyd tilsettes. Etter tilsetning av 27/Ug (0,34 mmol) sulfinyl-5 klorid får blandingen omsettes under omrbring og under isavkjbling i 1 time. Reaksjonsblandingen vaskes med 10% sitronsyre, med mettet natriumhydrogenkarbonat og med mettet natriumkloridopplbsning, og den tbrkes over vannfritt natriumsulfat. Opplosningsmidlet fjernes ved destillasjon og den således oppnådde oljeaktige inndampningsrest underkastes silisiumdioksydgel-kramatografering under anvendelse av 5 g silisiumdioksydgel og et opplosningsmiddel av etylacetat og n-heksan (1:5) til dannelse av 66,5 mg (56,1%) av den rensede, onskede, oljeaktige forbindelse.

I<Rv>^aks? (cm_1): 2130»1770, 1735, 1055

NMR ,(CDC13) 5 : 7,53 - 8,00 (5H, m)

4,90 (1H,' d, J=5 Hz)

4,43 (1H, s)

i 4,15 - 4,35 (1H, m)

1,83 - 2,85 (4H, m)

1,38 (9H, s)

6-d) Fremstilling_av_{3)-cis-7-azid Ai2i0Zokt-2=en-8=on-2-karboksylsyr )

1,3 g (3,06 mmol) 3-klor-3-fenylsulfonyl-forbindelse, som fremstilt i sammenligningseksempel 6-c), oppvarmes under tilbakelop sammen med 100 ml karbontetraklorid i 6 timer. Etter avslutning av omsetningen underkastes reaksjonsopplbsningen destillasjon under vakuum for fjerning av opplosningsmidlet. Den således oppnådde inndampningsrest ' underkastes rensing ved silisiumdioksydgel-kromatografering under anvendelse av 100 g silisiumdioksydgel og et opplbs-

ningsmiddel bestående av etylacetat og n-heksan (1:5) til dannelse av 596 mg (65,2%) av den onskede forbindelse.

Smeltepunkt: 96 - 97°C.

IRV™ks(cm_1): 2120, 1765, 1735, 1630

PMR (CDCl^) & : 4,93 (1H, d, J=5 Hz)

3,72 - 3,92 (1H, m)

2,56 - 2,70 (2H, m)

1,86 - 2,32 (2H, m)

1,55 (9H,'s)

CMR (CDC13)S: 127,7, 125,0.

Sammenligningseksemel 7

Fristilling §Y_I~2lci§zZ~§IBi!}2l32klor-l-azabicYk okt =2-en-8-on-2-karboksYlsYre i tert . -but^lester :

350 mg (1,17 mmol) av den i sammenligningseksempel 6 fremstilte azidoforbindelse, opplbses i 20 ml etanol samt 1,2 ml IN saltsyre og 70 g 10% palladium-på-karbon. Gassformig hydrogen bobles gjennom blandingen ved romtemperatur og atmosfæretrykk i 3 timer, og palladium-på-karbon fjernes ved filtrering. Filtratet inndampes under vakuum til dannelse av et fast stoff. Det faste stoff opplbses i vann og vaskes med eter. Etter tilsetning av natriumhydrogenkarbonat til svakt alkalisk reaksjon ekstraheres vann-laget med etylacetat. Etylacetatlaget vaskes med mettet salt-

opplosning og tbrkes under vandig natriumsulfat. Opplosningsmidlet fjernes ved destillasjon under vakuum under dannelse av 218,4 mg (68,4%) av et pulver bestående av den onskede forbindelse.

Smeltepunkt: 102,4 - 104,5°C

IRÆks5cm"<1>): 1770, 1720, 1620

NMR (CDC13) V: ^3 (1H, d, J=5 Hz)

3,52 - 3,90 (1H, m)

2,52 - 2,72 (2H, m)

2,22 (2H, br)

1,87 - 2,17 (2H, m)

1,55 (9H, s)

Sammenligningseksempel 8

Eremstill^ng_ay_trif ^ 2^ acet:at:-^ Y-- Lzlzc^ z§z^^ 2z^ z^ :] :21£z il§5§fricXi5i2Z^i2i27okt-2-en-82on-22kar^ :

102,2 mg (0,31 mmol) av den i sammenligningseksempel 7 fremstilte amino-esterforbindelse og 1 ml trifluoreddiksyre tilsettes under isavkjoling. Blandingen omrores ved romtemperatur i-30 minutter. Opplosningsmidlet fjernes ved destillasjon under vakuum for fjerning av den oljeaktige inndampningsrest. Til inndampningsresten tilsettes eter og det således oppnådde pulver isoleres ved filtrering. Pulveret lyofiliseres til dannelse av 95,5 mg (60,9%) av den

onskede forbindelse.

Smeltepunkt: 208 - 220°C (dekomponering)

IR^maL5cm<-1>): 1795'1630

Sammenligningseksempel 9

Fremstilling_av_ (- )icis=72amin2l2z^l2rlll2522i2Z!5i2/^i2i2Zl okt-2-en-8-on-2-karboksy;lsyre:

9-1) Fremstilling av en suspensjon av sprengte celler.

1) Dyrking av en mikroorganisme som har evne til optisk aktiv deacylering.

Som podningsstamme anvendes Kluyvera citrophila ATCC 21285 (biologiske egenskaper er beskrevet i J. General Applied Microbiology 3, 28 - 31 (1957)).

Som podningssubstrat anvendes en vandig opplbsning inneholdende 1% polypepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjbttekstrakt, 0,5% natriumglutamat og 0,25% natriumklorid, , og som er justert til en pH-verdi på 7,0 med 5N NaOH. En lbkkefull podemateriale podes inn i 10 ml av podningssubstratet i et 50 ml reagensrbr, og dyrkingen utfores ved en temperatur på 30°C i 24 timer. Den samlede mengde podningsvæske podes i 300 ml dyrkningssubstrat i en 2-liters Erlen-I meyer-kolbe og dyrkingen utfores ved en temperatur på 30°C under rysting. Sammensetningen av dyrkningssubstratet er den samme som sammensetningen av podningssubstratet.

2) Fremstilling av suspensjonen av sprengte celler

Etter dyrking i 24 timer underkastes dyrkings-1 væsken sentrifugering for oppsamling av cellelegemene. Cellene vaskes to ganger med 50 ml 0,9% saltopplbsning og

de bringes i suspensjon i en konsentrasjon på 40 mg/ml beregnet på tbrrstoff- i 1/30 molar fosfatbufferopplbsning (pH = 8,0).

i

9-2) Fremstilling av en substratopplosning

200 mg (-)-cis-7-fenylacetamido-3-klor-l-azabi-

cyklo/4, 2,Q7okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, fremstilt som i eksempel 13, tilsettes til 9 ml 1/30 molar fosfatbuffer

(pH = 8,0). Ettersom forbindelsen ikke opploses,tilsettes 2N NaOH i små mengder og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 8,0 for opplosning av forbindelsen. Til slutt tilsettes ionevekslet vann til dannelse av 10 ml opplbsning.

9-3) Enzymomsetning

10 ml av den ovenfor nevnte suspensjon av sprengte celler tilsettes til 10 ml av substratopplbsningen, og enzymomsetningen utfores ved en temperatur på 40°C i 80 minutter. Det tidsavhengige forlbp av omsetningen er belyst i tabell 6.

9-4) Isolering og rensing av den onskede forbindelse

Etter avslutning av omsetningen fjernes cellene fra reaksjonsopplbsningen ved sentrifugering. Det ovre væskelag inndampes under vakuum til dannelse av 5 ml opplbsning. Denne opplbsning påfbres en sbyle (1,75 cm bred, 42 cm hby) som er pakket med "Diaion HP-10". Eluering utfores med ionevekslet vann. Den onskede forbindelse elueres med fraksjonene fra 90 ml til 120 ml. Disse fraksjoner inndampes under vakuum til dannelse av 2 ml opplbsning, og denne opplbsning justeres til pH-verdien 3,5 med IM saltsyre til utskillelse av krystaller. Krystallene innvinnes ved filtrering, vaskes med en liten mengde metanol og tor-kes til dannelse av 38 mg av et hvitt pulver. Reaksjonsproduktets egenskaper er folgende: IR(KBrV^k^: 3200, 1800, 1790 (sh), 1640

(sh), 1630, 1555

NMR(100M D20-DSS) S : 4,47 (1H, d, J=5,l Hz)

3,88 (1H, m)

2,64 (2H, m)

1,93 (2H,.m)

Optisk rotasjon /a7D = -2,7 (c=0,24, 1 molar fosfatbuffer, pH 7,0).

Sammenligningseksempel 10

Fremstilling_av (-}-7S-amino-4a-metvl-l-azabicYklo/4i2i0Z2 okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

10-1) Fremstilling av suspensjon av sprengte celler

Man gjentar den samme fremgangsmåte som i sammenligningseksempel 2-1) .

10-2) Fremstilling av en substratopplosning

Man gjentar fremgangsmåten i sammenligningseksempel 2-2) med unntagelse av at man benytter (-)-cis-7(3-f enyl-acetamido-4a-metyl-l-azabicyklo/5-, 2,07okt-2-en-8-on-karboksylsyre, som er fremstilt i DE-OS nr. 2911787-

10-3) Enzymomsetning

Man gjentar fremgangsmåten i sammenligningseksempel 2-3) med unntagelse av at man benytter den i 10-1) og 10-2) fremstilte suspensjon av sprengte celler'og substratopplosning. Omsetningsforholdet blir stasjonært i lopet av 1 time. Omsetningen fortsettes i 120 minutter. Utbyttet er 50% (molforhold) av blandingen av optisk aktive forbindelser .

10-4) Isolering og rensing av den onskede forbindelse

Man gjentar fremgangsmåten som er analog med den som er angitt i sammenligningseksempel 2-4). Etter av-slutningen av omsetningen fjernes cellene ved sentrifugering fra reaksjonsopplbsningen. Den ovre væske påfbres på en sbyle (2,5 cm bred, 46 cm hby) som er pakket med 220 ml "Diaion HP-10". Elueringen utfores med ionevekslet vann og eluatet oppsamles i fraksjoner på 5 ml. Den onskede forbindelse elueres i fraksjonene 200 ml til 270 ml. Fraksjonene inndampes under vakuum, lyofiliseres og opplbses i en liten mengde vann og metanol (50:50). Opplbsningen påfbres en kolonne (1,6 cm bred, 64,5 cm hby), som er pakket med 130 ml "Sephadex LH-20", og elueringen utfores med en blanding av vann og metanol (50:50). Eluatet oppsamles i fraksjoner på 5 ml. Fraksjonene fra 65 ml til 80 ml kombineres og inndampes for fjerning av metanolen. Deretter lyofiliseres inndampningsresten til dannelse av 30,5 mg av et hvitt pulver. Denne forbindelses egenskaper er folgende: IR(KBr)v^k^: 1800, 1770 (sh), 1760 (sh),

1740, 1680, 1630

MMR(100M D20-DSS)i: 6,16 (1H, d, J=5,l Hz)

4,52 (1H, d, J=4,9 Hz)

3,86 (1H, m)

2,64 (1H, m)

1.9 - 1,4 (2H, m)

1.10 (3H, d, J=7,3 Hz)

Det avslbres at forbindelsen er et kaliumsalt med to molekyler vann. De ovenfor angitte egenskaper er i god overensstemmelse med egenskapene for den tilsvarended,1-forbindelse. Forbindelsen viser en ninhydrin positiv enkeltflekk ved Rf = 0,33 ved silisiumdioksydgel-tynnsjikt-kromatografi (man benytter samme silisiumdioksydgel som i sammenligningseksempel 2-4). Rf-verdien faller sammen med den til den tilsvarende optisk inaktive d,1-forbindelsen.

Optisk rotasjon /«7D 15° = -30 o (c=0,5, i 1 molar fosfatbufferopplbsning). Denne verdi faller godt sammen - 15 med den som er oppnådd i sammenligningseksempel 11, /<a>7j}= -30,8° (c=Q,5, i 1 molar fosfatbufferopplosning (pH 7,0)).

Sammenligningseksempel 11

Fremstilling_av_(-2=7g-amino=4^ okt-2=en-8=on-2-karboksYlsyre (alternativ_fremgangsmåte):

11-1) Fremstilling av suspensjon av sprengte celler

Man gjentar en analog fremgangsmåte til den som er benyttet i sammenligningseksempel 10-1).

11-2) Fremstilling av en substratopplosning

100 mg (-)-cis-7(3-/TR)-2-fenyl-2-aminoacetamido7-4cc-metyl-l-azabocyklo/4\ 2,07okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt i DE-OS nr. 2911787, opplost i 5 ml 1/30 molar fosfatbufferopplbsning (pH 6,5).

11-3) Enzymomsetning

Analogt med sammenligningseksemel 2-3) tilsettes 5 ml av den ovenfor angitte suspensjon av sprengte celler til 5 ml av substratopplbsningen, og enzymomsetningen utfores ved en temperatur på 30°C i 24 timer.

11-4) Isolering og rensing av det onskede produkt

Man gjentar en fremgangsmåte som er analog med den som er angitt i sammenligningseksempel 10-4) til dannelse av 55 mg av et hvitt pulver. Denne forbindelses egenskaper stemmer godt overens med egenskapene til det i sammenligningseksempel 10 oppnådde produkt.

Optisk rotasjon /«7q 15° = -30,8 o (c=0,5, i 1 molar fos-fatbuf f eropplbsning (pH 7,0)).

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av optisk aktive cefalosporin-analoge med den generelle formel:

hvor R betyr hydrogen eller alkyl med 1-5 karbonatomer,

2 3 R betyr hydrogen eller halogen, R betyr hydrogen eller en karboksylbeskyttende gruppe, og X betyr en acylgruppe med formelen X^CO, hvor X <1> betyr én av folgende to grupper:

hvor B betyr en umettet 6-leddet karbocyklisk gruppe valgt blant cykloheksenyl, cykloheksadienyl og fenyl, eller en 5- eller 6-leddet heterocyklisk gruppe, A <1> betyr ringsubstituenter valgt blant hydrogen, hydroksy, alkoksy med 1-4 karbonatomer, halogen, nitro, amino, aminometyl, metylsulfonamid og acyloksy med 1-4 kar-2 bonatomer, n er et helt tall fra 0-5, og A betyr amino, hydroksy, karboksyl eller sulfo, eller

hvor B, A og n har den ovenfor angitte betydning, og kJ betyr hydrogen eller alkyl med 1-6 karbonatomer, alkenyl med 2-6 karbonatomer, alkynyl med 2-6 karbonatomer, cykloalkyl med 3-6 karbonatomer eller aryl, hvilke grupper eventuelt er substituert med karboksyl, cyan, halogen, karbamoyl eller alkoksykarbonyl med 1-4 karbonatomer i alkoksydelen, eller farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at(a) en optisk aktiv cefalosporin-analog med formelen:

12 3 hvor R , R og R har den ovenfor angitte betydning, eller en funksjonelt ekvivalent forbindelse, acyleres med en karboksylsyre med formelen:

hvor X 2betyr én av folgende to grupper:

hvor B og n har den ovenfor angitte betydning, A 1' betyr ringsubstituenter valgt blant hydrogen, hydroksy, beskyttet hydroksy, alkoksy med 1-4 karbonatomer, halogen, nitro, beskyttet amino, beskyttet aminometyl, metylsulfonamido og acyloksy med I-A- karbonatomer, og A 2' betyr beskyttet amino, hydroksy, beskyttet hydroksy, karboksyl, beskyttet karboksyl, sulfo eller beskyttet sulfo, eller

hvor B, n og A 1 f har den ovenfor angitte betydning, 4 r og A betyr hydrogen eller alkyl med 1-6 kar bonatomer, alkenyl med 2-6'karbonatomer, alkynyl med 2 - 6 karbonatomer, cykloalkyl med 3-6 karbonatomer eller aryl, hvilke grupper eventuelt er substituert med beskyttet karboksyl, cyan, halogen, karbamoyl eller alkoksykarbonyl med 1-4 karbonatomer i alkoksydelen, eller med et reaktivt derivat av karboksylsyren (VII), hvoretter eventuelle beskyttende grupper i X <2> CO- og/ eller -COOR^-gruppen, om bnsket, kan fjernes, eller (b) en optisk inaktiv forbindelse med formelen:

hvor R 1 og R 3 har den ovenfor angitte betydning, og R 2' betyr halogen, eller en funksjonelt ekvivalent forbindelse, acyleres med en karboksylsyre med formelen: X <4> C00H (VIII) hvor X <4> betyr en gruppe med formelen:

11 2' hvor B,- A , n og A har den ovenfor angitte betydning, eller med et reaktivt derivat av karboksylsyren, hvoretter eventuelle beskyttende grupper i X CO- og/eller-COOR 3-gruppen, om bnsket, fjernes, og den oppnådde diastereoisomere blanding atskilles på konvensjonell måte til oppnåelse av optisk aktive cefalosporin-analoge med formelen (I") tilsvarende den generelle formel (I), 13 2 hvor R og R har den ovenfor angitte betydning, R er halogen og X er en acylgruppe med formelen X CO, hvor X-^ betyr en gruppe med formelen:

1 2 hvor B, A , n og A har den ovenfor angitte betydning, hvoretter, om onsket, en under (a) eller (b) dannet forbindelse overfores til et farmasbytisk akseptabelt salt derav.

2. Fremgangsmåte ifblge krav 1, karakterisert ved at hydrogenatomene i 6- og 7-stillingen i formel (III) har cis-konfigurasjon.