NO842015L

NO842015L - immune stimulator

Info

Publication number: NO842015L
Application number: NO842015A
Authority: NO
Inventors: John C Houck; Leonard M Patt
Original assignee: Endorphin Inc
Priority date: 1982-09-20
Filing date: 1984-05-21
Publication date: 1984-05-21
Also published as: DK249484A; EP0122926A1; FI842032L; FI842032A0; WO1984001090A1; DK249484D0; AU2079883A; EP0122926A4; FI842032A7; JPS59501786A

Description

Pattedyr og fugler, spesielt kommersielle fjærfefarmer,Mammals and birds, especially commercial poultry farms,

kan ofte risikere eksponering til forskjellige eller fungale infeksjoner. En slik eksponering kan oppstå i de naturlige omgivelser, spesielt i meierier eller fjærfefarmer eller fra uvanlige situasjoner slik som kirurgi, ulykker eller sår. Pattedyrlegemet forsvarer seg mot de virale og fungale infeksjoner ved en immunologisk sekvens av forhold som stimuleres av nærværet av de inntrengende elementer, slik som virus, bakterier eller sopp, der sluttresultatet er fremstilling av T-celler som bevirker i konjugasjon med makrofager for å fremme fagosytose. can often risk exposure to various or fungal infections. Such exposure can occur in the natural environment, especially in dairies or poultry farms or from unusual situations such as surgery, accidents or wounds. The mammalian body defends itself against the viral and fungal infections by an immunological sequence of conditions stimulated by the presence of the invading elements, such as viruses, bacteria or fungi, where the end result is the production of T cells which act in conjugation with macrophages to promote phagocytosis .

Noen pattedyr mangler denne immunologiske respons,Some mammals lack this immunological response,

enten p.g.a. visse metabolske mangler, eller p.g.a. medisinsk behandling slik som kjemoterapi eller miltektomi. Mange husdyr, spesielt fjærfe, synes konstant å være følsomme overfor slike infeksjoner og svarer ikke immunologisk med tilstrekkelig hurtighet til å forhindre et stort tap. Kalkunflokker er spesielt følsomme i denne henseende. Dette fører til betydelig økning av omkost-ningene ved kalkunoppdrettet. either due to certain metabolic deficiencies, or due to medical treatment such as chemotherapy or splenectomy. Many livestock, especially poultry, appear to be constantly susceptible to such infections and do not respond immunologically with sufficient rapidity to prevent a major loss. Turkey flocks are particularly sensitive in this regard. This leads to a significant increase in the costs of turkey farming.

En mulighet for økning av den immunologiske respons for pattedyr overfor infeksjoner ville være et viktig tillegg til de våpen en lege eller veterinær har. Et slikt stoff kunne benyttes profylaktisk på subjekter som konstant eksponeres til infeksjon, på defensiv måte i forbindelse med subjekter som skal opereres, eller som en støtte for å forbedre den immunologiske respons hos subjekter som allerede lider av en aktiv infeksjon, eller som er under rekonvalesens etter kirurgi eller annet. A possibility of increasing the immunological response of mammals to infections would be an important addition to the arsenal of a doctor or veterinarian. Such a substance could be used prophylactically in subjects who are constantly exposed to infection, in a defensive manner in connection with subjects who are to undergo surgery, or as a support to improve the immunological response in subjects who are already suffering from an active infection, or who are convalescing after surgery or otherwise.

Det er nå oppdaget at en immunostimulerende faktor som kan benyttes for å oppnå disse resultater, kan oppnås fra storfetymusvev. It has now been discovered that an immunostimulating factor which can be used to achieve these results can be obtained from bovine thymus tissue.

Denne faktor har et antall karakteriserende faktorer ved hjelp av hvilken den kan identifiseres og skilles fra andre stimulerende faktorer som er beskrevet, inkludert noen som er funnet i tymusvev. Blant disse karakteristika er de følgende: 1. Den er amfotær og adherer sterkt til Sephadex og Biogel-P ved både nøytral og noe sur pH-verdi. This factor has a number of characterizing factors by which it can be identified and distinguished from other stimulatory factors that have been described, including some found in thymic tissue. Among these characteristics are the following: 1. It is amphoteric and strongly adheres to Sephadex and Biogel-P at both neutral and slightly acidic pH values.

2. Det isoelektriske punkt er fra 7,0 til 7,8.2. The isoelectric point is from 7.0 to 7.8.

3. Den stimulerer den DNA-synteti ske respons av både murin og humanlymfocy11er til al1oanti genstimuler ing i blandet lymfocyttkultur (MLC). 4. Den øker ikke vesentlig stimuleringen av milt-murinlymfocytter med lipopolysakkarid fra Salmonella typhosa (LPS). 5. Det er ingen reduksjon i dens immunostimulerende aktivitet i nærvær av 2-merkaptoetanol• 6. Den stimulerende aktivitet er helt utreversibel. 7. Den virker mer effektivt i MLC-medium inneholdende humanserura enn i et slikt medium som inneholder fetalserum. 8. Dens stimulerende virkning i MLC er ikke påvirket av nærvær av museserum. 9. Den vil akselerere avvisning av histoinkompatible hudinnpodinger hos mus. 10. Ved dialyse gjennom dialyserør med 3500 Dalton-grense går den gjennom rørnettet. 11. Ved gelfiltrering ved pH 10,2 i 0,05 M ammoniumhydroksyd spaltes den i to immunostimulerende fraksjoner hvorav en har en molekylvekt på ca. 1400 Dalton og den andre mindre enn 1400 Dalton, men mer enn 100 Dalton. 3. It stimulates the DNA synthetic response of both murine and human lymphocytes to alloantigen stimulation in mixed lymphocyte culture (MLC). 4. It does not significantly increase the stimulation of splenic murine lymphocytes with lipopolysaccharide from Salmonella typhosa (LPS). 5. There is no reduction in its immunostimulatory activity in the presence of 2-mercaptoethanol• 6. The stimulatory activity is completely irreversible. 7. It works more effectively in MLC medium containing human serum than in such a medium containing fetal serum. 8. Its stimulatory action in MLC is not affected by the presence of mouse serum. 9. It will accelerate rejection of histoincompatible skin grafts in mice. 10. In the case of dialysis through dialysis tubing with a 3500 Dalton limit, it passes through the pipe network. 11. By gel filtration at pH 10.2 in 0.05 M ammonium hydroxide, it is split into two immunostimulating fractions, one of which has a molecular weight of approx. 1400 Dalton and the other less than 1400 Dalton but more than 100 Dalton.

Den immunostimu1erende faktor ifølge oppfinnelsen erThe immunostimulating factor according to the invention is

brukbar for stimulering av resistensen i pattedyr- eller fuglelegemer mot infeksjon, enten som et preventivt middel eller som et helbredende middel. useful for stimulating the resistance of mammalian or avian bodies to infection, either as a preventive agent or as a curative agent.

Oppfinnelsen vil forstås bedre under henvisning til tegningene, der: Fig. 1 er en Sephadex G-25 kolonnepr of i 1 av et kalve-tymusekstrakt-acetonpresipitat . Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorpsjon ved 280 nm ( ) og for aktivitet i en murin MLC ( ). Pilen A antyder alueringsposisjonen for storfeserunralbumin; B, bacitracin; og C, natriumklorid. Fig. 2 er en Sephadex G-50 kolonneprof il av en G-25 stimulator"poo1". Sephadex G-50 kolonnen ble bragt i like- The invention will be better understood with reference to the drawings, in which: Fig. 1 is a Sephadex G-25 column sample of a calf thymus extract acetone precipitate. The fractions were examined for absorbance at 280 nm ( ) and for activity in a murine MLC ( ). Arrow A indicates the aluation position for bovine serum albumin; B, bacitracin; and C, sodium chloride. Fig. 2 is a Sephadex G-50 column profile of a G-25 stimulator "poo1". The Sephadex G-50 column was brought into equal

vekt med en fosfatbufret sa1toppløsning (PBS). En 5 mg prøve av G-25 s t imula t o r poo 1 en ble innført i 1 ml PBS. weight with a phosphate-buffered saline (PBS) solution. A 5 mg sample of G-25 s t imula tor poo 1 en was introduced into 1 ml of PBS.

Pilene er A, storfeserumalbumin, B, cytokrom C, og C, basitracin. Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorbans ved 250 nm ( ) og med henblikk på aktivitet i The arrows are A, bovine serum albumin, B, cytochrome C, and C, basitracin. The fractions were examined for absorbance at 250 nm ( ) and for activity in

MLC ( ).MLC ( ).

Fig. 3 er en BioGel P-10 ko1onneprof i 1 av en G-25 stimulatorpoo1 . BioGel P-10 kolonnen ble bragt i likevekt med 0,5 M ammoniubikarbonat , pH 8,0. En 2,7 mg prøve av G-25 stimulatorpoolen ble innført i 1 ml elueringsbuffer. Fig. 3 is a BioGel P-10 column profile in 1 of a G-25 stimulator poo1. The BioGel P-10 column was equilibrated with 0.5 M ammonium bicarbonate, pH 8.0. A 2.7 mg sample of the G-25 stimulator pool was introduced into 1 ml of elution buffer.

Pilene er A lik stor feserumalbumin og B lik bacitracin. Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorbans ved The arrows are A equal to large phase serum albumin and B equal to bacitracin. The fractions were examined for absorbance by

250 nm ( ) og med henblikk på aktivitet i MLC ( ).250 nm ( ) and with a view to activity in MLC ( ).

Fig. 4 viser virkningen av passasjen av en kalvetymus-ekstrakt-acetonpresi pitatf raks jon gjennom anion (Ag-1) eller cation (AG-50) byttekolonner på evnen til å inhibere MLC. ASG-1 (o—o) viser den virkning som observeres med den fraksjon som ikke holdes tilbake av AG-1 kolonnen; AG-50 (0--0) viser inhiberingen som observeres ved den fraksjon som ikke holdes tilbake av AG-50 kolonnen. Kontrollen ( — ) viser den inhibering som observeres med den ubehandlede prøve. Fig. 5 viser ionebyttingskromatografi for G-25 stimulaor-poolen. En prøve av G-25 stimulat orpoolen på 4,5 mg ble innført i og eluert fra en kolonne av BioGel Ag-50 ione-by ttekarpiks . Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorbans ved 250 nm ( ) og med henblikk på aktivitet i MLC ( ). Fig. 6 viser virkningen av 2-merkaptoetanoIkons entrasjonen på aktiviteten av G-25 stimulatorpoolen. En murin MLC ble satt opp ved forskjellige konsentrasjoner av 2-merkaptoetanol og en konstant mengde G-25 stimulatorpool , nemlig 20 yg/ml. Innarbeiding av H-tymidin i kontroll-kulturene (o—o) og G-25 stmulatorholdige kulturer (0--0) ble bestemt. Fig. 7 viser ko1onneprofi 1en for G-25 stimulatorenpoolen på en BioGel P-2 kolonne. En 10 mg prøve av den akive pool ble innført i en 1 x 45 cm kolonne av BioGel P-2 som var bragt i likevekt i 0.05 M NH40H, ved pH 10,2 og eluert med det samme middel. Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorbans ved 250 nm ( ) og med henblikk på aktivitet i MLC ( ). Pilene er A lik s t o r f e s e r uma lbumin , og B lik natriumklorid• Fig. 4 shows the effect of the passage of a calf thymus extract-acetone precipitate through anion (Ag-1) or cation (AG-50) exchange columns on the ability to inhibit MLC. ASG-1 (o—o) shows the effect observed with the fraction not retained by the AG-1 column; AG-50 (0--0) shows the inhibition observed at the fraction not retained by the AG-50 column. The control ( — ) shows the inhibition observed with the untreated sample. Fig. 5 shows ion exchange chromatography for the G-25 stimulator pool. A 4.5 mg sample of the G-25 stimulator pool was introduced into and eluted from a column of BioGel Ag-50 ion-exchange ttekarpiks. The fractions were examined for absorbance at 250 nm ( ) and for activity in MLC ( ). Fig. 6 shows the effect of 2-mercaptoethanoicone entry on the activity of the G-25 stimulator pool. A murine MLC was set up at various concentrations of 2-mercaptoethanol and a constant amount of G-25 stimulator pool, namely 20 µg/ml. Incorporation of H-thymidine into the control cultures (o--o) and G-25 stimulant-containing cultures (0--0) was determined. Fig. 7 shows the column profile for the G-25 stimulator pool on a BioGel P-2 column. A 10 mg sample of the active pool was introduced into a 1 x 45 cm column of BioGel P-2 equilibrated in 0.05 M NH 4 OH, at pH 10.2 and eluted with the same agent. The fractions were examined for absorbance at 250 nm ( ) and for activity in MLC ( ). The arrows are A equal to s t o r f e s e r uma albumin , and B equal to sodium chloride•

Den immunosti mulerende faktor ifølge oppfinnelsen er isolert fra storfetymusvev, spesielt frossen kalvetymus eller tørket avfettet kalvetymus. Det sistnevnte materiale The immunostimulating factor according to the invention is isolated from bovine thymus tissue, especially frozen calf thymus or dried defatted calf thymus. The latter material

oppnås fra Viobin Corporation i Monticello, Illiois.obtained from Viobin Corporation of Monticello, Illinois.

I det første trinn i isolereringsprosedyren blir vev fra en av kildene skåo ret i små o stykker, - f.eks. 1 cm 2 og homogenisert i 3 til 4 volumer iskald buffer ved ca. 0° til ca. 5°C ved pH 7 til 9, f.eks. 50 mM aramonium-karbonat, pH 8,5, i en Polytron homogenisator i to minutter ved lav hastighet og to minutter ved høy hastighet. Homogenatet sentrifugeres ved 26.000 til 30.000 x G i 20 til 40 minutter ved ca. 0°C til 5°C, fortrinnsvis 28.000 x G i 30 minutter, og den resulterende overstående oppløsning fjernes. Pelleten ekstraheres igjen som ovenfor, og de oppsamlede supernatanter lyof i liseres• Det lyofiliserte pulver suspenderes i vann ved ca. 0 til 5°C og en konsentrasjon på 0,2 til 0,3 g pr. ml, og absolutt etanol tilsettes langsomt ved samme temperatur under omrøring til en s lu 11 kons en t r a s j on på 50 til 60% In the first step of the isolation procedure, tissue from one of the sources is cut into small pieces, - e.g. 1 cm 2 and homogenized in 3 to 4 volumes of ice-cold buffer at approx. 0° to approx. 5°C at pH 7 to 9, e.g. 50 mM aramonium carbonate, pH 8.5, in a Polytron homogenizer for two minutes at low speed and two minutes at high speed. The homogenate is centrifuged at 26,000 to 30,000 x G for 20 to 40 minutes at approx. 0°C to 5°C, preferably 28,000 x G for 30 minutes, and the resulting supernatant is removed. The pellet is extracted again as above, and the collected supernatants are lyophilized • The lyophilized powder is suspended in water at approx. 0 to 5°C and a concentration of 0.2 to 0.3 g per ml, and absolute ethanol is added slowly at the same temperature with stirring to a final concentration of 50 to 60%

(volum/volum). Oppløsningen omrøres i 16 til 18 timer ved 0 til 5°C fulgt av sentrifugering ved de samme hastigheter og tidsrom som nevnt ovenfor. Den resulterende klare supernatant tilsettes langsomt til 5 til 6 volumer aceton som på forhånd er avkjølt til -5 til -10°C og holdes ved -5 til -10°C i tre til seks dager. Presipitatet isoleres, f.eks. ved sentrifugering eller filtrering, suspenderes igjen i 100 til 100 ml destillert vann eller i den samme mengde 20 nM eddiksyre og lyofiliseres ved 0 til 5°C. (volume/volume). The solution is stirred for 16 to 18 hours at 0 to 5°C followed by centrifugation at the same speeds and times as mentioned above. The resulting clear supernatant is slowly added to 5 to 6 volumes of acetone previously cooled to -5 to -10°C and kept at -5 to -10°C for three to six days. The precipitate is isolated, e.g. by centrifugation or filtration, resuspend in 100 to 100 ml of distilled water or in the same amount of 20 nM acetic acid and lyophilize at 0 to 5°C.

Det materiale som isoleres ved denne prosedyre, er vanligvis et lysebrunt klebrig pulver som inneholder den stimulerende faktor ifølge oppfinnelsen så vel som et antall inhiberende faktorer og andre stoffer. Den ønskede faktor kan isoleres fra denne fraksjon ved ge1 f i 11rering eller ved ioneby11ekromatogra f i . For enkelhetens skyld kalles det her CTE-acetonpresipitatet . The material isolated by this procedure is usually a light brown sticky powder containing the stimulatory factor of the invention as well as a number of inhibitory factors and other substances. The desired factor can be isolated from this fraction by gelation or by ion exchange chromatography. For simplicity, it is here called the CTE acetone precipitate.

De forskjellige prosedyrer som benyttes ved isolering, karakterisering og påvisning av brukbarheten av den stimulerende faktor ifølge oppfinnelsen skal diskuteres nærmere. The various procedures used for isolation, characterization and demonstration of the usability of the stimulating factor according to the invention shall be discussed in more detail.

GelfiltreringGel filtration

I en ge1 fi 11reringsprosedyre føres CTE-acetonpresipitatet over Sephadex G-25 i en 90 x 2,2 cm kolonne bragt i likevekt med en sur lyofi 1iserbar buffer ved pH 4 til 5, slik som 0,1 M eddiksyre, 100 nM pyridinacetat , pH 4,5 eller 0,1 M ammoniumacetat, pH 5,0. To milliliters fraksjoner samles og undersøkes ved MLC. Resultatene med pyridin-acetatet er vist i fig. 1. In a gelation procedure, the CTE acetone precipitate is passed over Sephadex G-25 in a 90 x 2.2 cm column equilibrated with an acidic lyophilizable buffer at pH 4 to 5, such as 0.1 M acetic acid, 100 nM pyridine acetate, pH 4.5 or 0.1 M ammonium acetate, pH 5.0. Two milliliter fractions are collected and examined by MLC. The results with the pyridine acetate are shown in fig. 1.

En annen ge1fi1treringsprosedyre gjennomføres på en 1 x 45 cm kolonne av Sephadex G-50 i fosfatbuf ferets salt-oppløsning, (PBS) 0,02 M fosfat,, 0,15 natriumklorid, pH 7,4, og en 1 x 45 cm kolonne av BioGel P-10 i 0,5 M ammoniumbikarbonat, pH 8,0. Another filtration procedure is carried out on a 1 x 45 cm column of Sephadex G-50 in phosphate buffered saline, (PBS) 0.02 M phosphate, 0.15 sodium chloride, pH 7.4, and a 1 x 45 cm column of BioGel P-10 in 0.5 M ammonium bicarbonate, pH 8.0.

For moleky1vektsbestemme1se ble de oppsamlede stimulator-fraskjoner fra G-25 kolonnen ført over en valgt BioGel kolonne med samme dimensjoner ved pH 10,2 i 0,05 M NH^OH og eluert med det samme middel. For molecular weight determination, the collected stimulator fractions from the G-25 column were passed over a selected BioGel column of the same dimensions at pH 10.2 in 0.05 M NH^OH and eluted with the same agent.

Sphadex-produktene er en velkjent serie kryssbundne The Spadex products are a well-known range of cross-linked

dekstraner som er tilgjengelig fra Pharmacia Fine i Chemicals, Inc. i Piscataway, New Jersey. De finner vid anvendelse for separering av naturlige stoffer. Som vanligvis benyttet er den utvalgte Sephadex pakket i en kolonne, en oppløsning inneholdende det oppløste materiale dextrans available from Pharmacia Fine i Chemicals, Inc. of Piscataway, New Jersey. They are widely used for the separation of natural substances. As is usually used, the selected Sephadex is packed in a column, a solution containing the dissolved material

som skal analyseres, føres over kolonnen og elueres med et utvalgt oppløsningsmiddel eller en serie slike. Hver spesielle Sephadex separerer stoffer med spesielle molekylvektsområder. Oppløste materialer over dette to be analysed, is passed over the column and eluted with a selected solvent or a series of such. Each special Sephadex separates substances with special molecular weight ranges. Dissolved materials above this

moleky1vektsområdet vil gå gjennom kolonnen i oppløsning i opp 1øsningsmiddelfronten, det såkalte "void"-volumet. Stoffer som holdes tilbake, elueres suksessivt etter hvert som mer og mer oppløsningsmiddel passeres gjennom kolonnen. De elueres etter progressivt synkende molekylvekter. the molecular weight range will pass through the column in solution in the solvent front, the so-called "void" volume. Retained substances are successively eluted as more and more solvent is passed through the column. They are eluted according to progressively decreasing molecular weights.

Sephadex G-10 separerer stoffer med molekylvekter fra 200 til 700 Dalton. Sephadex G-10 separates substances with molecular weights from 200 to 700 Dalton.

Sephadex G-25 separerer stoffer med molekylvekter fra 5000 til 1000 Dalton. Sephadex G-25 separates substances with molecular weights from 5000 to 1000 Dalton.

Sephadex G-50 separerer stoffer med molekylvekter fra 30.000 til 1500 Dalton. Sephadex G-50 separates substances with molecular weights from 30,000 to 1,500 Daltons.

BioGel P er en serie porøse polyacrylamider som benyttes for høyoppløsnings-gelfiltrering på en måte tilsvarende Sphadex-gelene. Stoffet er kommersielt tilgjengelig fra Bio-Rad Labortories i Richmond, California. BioGel P is a series of porous polyacrylamides that are used for high-resolution gel filtration in a manner similar to the Spadex gels. The substance is commercially available from Bio-Rad Laboratories of Richmond, California.

Områdene for de forskjellige typer er som følger:The ranges for the different types are as follows:

BioGel P-10 separerer 20.000 til 1.500 Dalton; BioGel P-10 separates 20,000 to 1,500 Daltons;

BioGel P-4 separerer 4.000 til 800 Dalton; BioGel P-4 separates 4,000 to 800 Daltons;

Biogel P-2 separerer 1.800 til 100 Dalton.Biogel P-2 separates 1,800 to 100 Daltons.

Alle gelfiltreringskolonner er kalibrert med med standar-der med kjent molekylvekt og med natriumklorid. De stan-darder som benyttes i de heri beskrevne prosedyrer, er: All gel filtration columns are calibrated with standards of known molecular weight and with sodium chloride. The standards used in the procedures described here are:

Standardene påvises enten ved absorbans ved 280 nm eller The standards are detected either by absorbance at 280 nm or

ved reaksjon med ninhydrin. Elueringsposisjonen for natriumklorid bestemmes ved utfelling med surt sølvnitrat. Natriumklorid gir posisjonen for de minste molekyler by reaction with ninhydrin. The elution position for sodium chloride is determined by precipitation with acidic silver nitrate. Sodium chloride gives the position of the smallest molecules

som elueres fra kolonnen. Ved vanlig bruk vil alle fraksjoner under det laveste fraksjoneringsområdet elueres ut sammen med natriumklorid. which is eluted from the column. In normal use, all fractions below the lowest fractionation range will be eluted together with sodium chloride.

Ionebytt ekroma t o graf iIon exchange echroma t o graph i

Små ionebyttekolonner prepareres ved bruk av Bio-Rad,Small ion exchange columns are prepared using Bio-Rad,

AG-50 VX8 og AG-1-X8 harpikser, av ammonium- henholdsvis acetatformene. Harpiksene vaskes godt og bringes i likevekt med 10 mM ammoniumacetat ved pH 7,0. Små kolonner med et volum på ca. 8 ml prepareres i 10 ml plastsprøyter utstyrt med Luer-lokk ventiler. For analyse av den ioniske type av den stimulerende faktor blir 150 mg aceton utfelt produkt som beskrevet ovenfor, oppløst i destillert vann, AG-50 VX8 and AG-1-X8 resins, of the ammonium and acetate forms respectively. The resins are washed well and equilibrated with 10 mM ammonium acetate at pH 7.0. Small columns with a volume of approx. 8 ml is prepared in 10 ml plastic syringes equipped with Luer-cap valves. For analysis of the ionic type of the stimulating factor, 150 mg of the acetone precipitated product as described above is dissolved in distilled water,

slik at ledningsevnen er mindre enn den til 10 nM ammoniumacetat, og pH-verdien justeres til 7 til 7,5. En tredjedel av denne oppløsning bringes i hver kolonne mens resten tjener som kontroll. Prøven føres langsomt gjennom kolonnen, og kolonnen vaskes med 5 kolonnevolumer 10 nM ammoniumacetat ved pH 7,0. Den ikke-tilbakeho1dte fraksjon 1yofi 1iseres, oppløses igjen i destillert vann, lyofiliseres igjen og underkastes MLC-prøving. so that the conductivity is less than that of 10 nM ammonium acetate, and the pH is adjusted to 7 to 7.5. One third of this solution is brought into each column while the rest serves as a control. The sample is passed slowly through the column, and the column is washed with 5 column volumes of 10 nM ammonium acetate at pH 7.0. The non-retained fraction is lyophilized, redissolved in distilled water, lyophilized again and subjected to MLC testing.

Bio-Rad AG-harpiksene er kryssbundne polystyrenkuler derThe Bio-Rad AG resins are cross-linked polystyrene beads there

noen av fenyldelene er blitt substituert med ionisk funksjonelle grupper. AG-50 er en sterk kationbytteharpiks med sulfoniske grupper. AG-1 er en sterk anionbytteharpiks med kvaternære ammoniumsubstituenter. De er tilgjengelige some of the phenyl moieties have been substituted with ionic functional groups. AG-50 is a strong cation exchange resin with sulfonic groups. AG-1 is a strong anion exchange resin with quaternary ammonium substituents. They are available

fra Bio-Rad Laboratoriene.from the Bio-Rad Laboratories.

i in

Storskala-ionebyttekromatografi gjennomføres på en 1 x 30 cm kolonne av AG-50 VX8 harpiks i ammoniakkform, Large-scale ion-exchange chromatography is carried out on a 1 x 30 cm column of AG-50 VX8 resin in ammonia form,

bragt i likevekt med destillert vann. Samlede prøver av stimulatorpreparatet fra en G-25 kolonne oppløses i destillert vann og justeres til lav ledningsevne og en pH på 5 til 6 med 0,01 acetatbuffer. Kolonnen elueres med en gradient som oppnås ved blanding av 90 ml hver av destillert vann og en 1 M ammoniumhydroksyd. Fraksjoner på ca. 2 ml samles, lyofiliseres og aktivitetsprøves ved hjelp av MLC. brought to equilibrium with distilled water. Pooled samples of the stimulator preparation from a G-25 column are dissolved in distilled water and adjusted to low conductivity and a pH of 5 to 6 with 0.01 acetate buffer. The column is eluted with a gradient obtained by mixing 90 ml each of distilled water and a 1 M ammonium hydroxide. Fractions of approx. 2 ml are collected, lyophilized and tested for activity using MLC.

DialyseDialysis

Dialyse gjennomføres ved bruk av Spectrapor-3 dialyserør (Spectrum Medical Industries, Inc., 60916 Terminal Annex, Los Angeles 90054) med en produsentbestemt molekylvekts-grense på 3.500 Dalton. Ved likevekt holdes molekyler med en molekylvekt på over 3.500 Dalton tilbake i dialyseposen (retentatet), og de med molekylvekt mindre enn 3.500 vil gå gjennom posen, (dialysatet) . De relative mengder av aktivitet ved likevekt vil være i orhold til de relative volumer av hver fraksjon, i disse forsøk 30 ml retentat til 300 ml dialysat. For en komponent med en molekylvekt på mindre enn 3.500 vil ca. 10% forventes å bli funnet i retentatet og 90% i dialysatet. Dialysis is carried out using Spectrapor-3 dialysis tubing (Spectrum Medical Industries, Inc., 60916 Terminal Annex, Los Angeles 90054) with a manufacturer-specified molecular weight limit of 3,500 Daltons. At equilibrium, molecules with a molecular weight of over 3,500 Daltons are held back in the dialysis bag (the retentate), and those with a molecular weight of less than 3,500 will pass through the bag (the dialysate). The relative amounts of activity at equilibrium will be in accordance with the relative volumes of each fraction, in these experiments 30 ml of retentate to 300 ml of dialysate. For a component with a molecular weight of less than 3,500, approx. 10% is expected to be found in the retentate and 90% in the dialysate.

Blandet lymfocyttkultur ( MLC)Mixed lymphocyte culture (MLC)

) )

Milten fjernes sterilt fra C57/BL og Balb/C-mus og anbringes i en Petri skål inneholdende celle-samlingsmedia (Earl's Balanserte Saltoppløsning inneholdende 2,5% va rmeinakti ve rt fetalkalve- eller The spleen is sterilely removed from C57/BL and Balb/C mice and placed in a Petri dish containing cell collection media (Earl's Balanced Salt Solution containing 2.5% heat-activated fetal calf or

- humanserum, 100 U/ml penicillin, 100 yg/ml streptomycin og 100 IU/ml heparin). Milten perfuseres kort ved bruk av en 22- eller 25-nål for å fjerne røde blodceller, anbringes i - human serum, 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin and 100 IU/ml heparin). The spleen is perfused briefly using a 22- or 25-gauge needle to remove red blood cells, placed in

en andre skål og irriteres mildt for å fjerne mi 11lymfocy11er. De store stykker fjernes gjennom en 50-mesh duk, og lymfocyttene gjenvinnes ved sent rifugering ved 200 G i 10 min. Cellene vaskes en gang med celle-samlingsmedia og suspenderes igjen i fullprøveraedia (Minimum Essential Media, Giboco) 5% eller 10% varmeinaktivert human- eller fetalkalveserum og 5 x 10"<4>M 2-merkaptoetanol. Humanperiferblodlymfocytter oppnås fra blod gitt av frisk laboratoriepersonale. Blodet defibrineres ved risting med glasskuler og lymfocytter oppnådd ved sentrifugering gjennomen Ficole-Hypaque pute. Lymfocyttene samler seg i interfasen, vaskes ved sentrifugering med Earl's Balanserte Saltopp løsning (Gibco) og suspenderes i totalprøvemedia uten tilsatt 2-merkaptoetanol. a second bowl and is mildly irritated to remove my 11lymphocy11er. The large pieces are removed through a 50-mesh cloth, and the lymphocytes are recovered by slow rifugation at 200 G for 10 min. The cells are washed once with cell collection media and resuspended in complete sample media (Minimum Essential Media, Giboco) 5% or 10% heat-inactivated human or fetal calf serum and 5 x 10"<4>M 2-mercaptoethanol. Human peripheral blood lymphocytes are obtained from blood donated by healthy laboratory staff. The blood is defibrinated by shaking with glass beads and lymphocytes obtained by centrifugation through a Ficole-Hypaque pad. The lymphocytes collect in the interphase, are washed by centrifugation with Earl's Balanced Salt solution (Gibco) and suspended in total sample media without added 2-mercaptoethanol.

Toveis MLC settes opp ved tilsetning av 1,25 x 10^ celler pr. brønn fra hver rase eller donor på mikrobrønnplater (Falcon No. 30400 eller Linbro No. IS-FB-96). Platene inkuberes ved 37°C i 4 dager. Tritiert tymidin (0,5 yCi, 2 Ci/nmol) tilsettes i de siste 6 timer av dyrkningsperioden. Ved slutten av dyrkningsperioden blir utstrek-ningen av "blast"-celledannelse fastslått ved mikroskopisk undersøkelse av platene. Cellene høstes ved bruk av en Satron cellehøster, og mengden radioaktiv merkelapp som er innarbeidet, bestemmes. Innarbeiding av H-tymidin i kontrollmurin MLC i 10% humanserum er 30.000 cpm pr. brønn med et midlere standardavvik i alle prøver på 10% eller Two-way MLC is set up by adding 1.25 x 10^ cells per well from each breed or donor on microwell plates (Falcon No. 30400 or Linbro No. IS-FB-96). The plates are incubated at 37°C for 4 days. Tritiated thymidine (0.5 µCi, 2 Ci/nmol) is added during the last 6 hours of the culture period. At the end of the culture period, the extent of "blast" cell formation is determined by microscopic examination of the plates. The cells are harvested using a Satron cell harvester, and the amount of radioactive label incorporated is determined. Incorporation of H-thymidine in control murine MLC in 10% human serum is 30,000 cpm per well with an average standard deviation in all samples of 10% or

mindre av den bestemte totale innarbeiding. Innarbeidingen i av H-tymidin er et mål på blast celledannelse og derfor et mål på immonulogisk response. less of the determined total incorporation. The incorporation of H-thymidine is a measure of blast cell formation and therefore a measure of immunological response.

Mitogens t imule r in gMitogen t imule r in g

For stimulering av forskjellige lymfocytt sub-populasjoner med lektiner ble det preparert miltcellesuspensjoner som ovenfor og 2.500.000 celler av en stamme ble anbragt i hver brønn. Eksperimentelt bestemte optimale mengder mitogener ble tilsatt og inkuberingen fortsatt i 72 timer. De benyttede lektiner Con A (Difco, 0,1<y>g pr. brønn), Phytohemaglutini-M (PHA-M, Difco, 20 yg pr. brønn). og lipopolysakkarid fra Salmonella typhosa (LPS, Sigma, 1,5 g pr. brønn). Graden av blast celledannelse og merkelappinnarbeiding måles ved den samme prosedyren som er beskrevet for MLC. For stimulation of different lymphocyte sub-populations with lectins, spleen cell suspensions were prepared as above and 2,500,000 cells of one strain were placed in each well. Experimentally determined optimal amounts of mitogens were added and the incubation continued for 72 hours. The lectins used were Con A (Difco, 0.1<y>g per well), Phytohemaglutini-M (PHA-M, Difco, 20 yg per well). and lipopolysaccharide from Salmonella typhosa (LPS, Sigma, 1.5 g per well). The degree of blast cell formation and label incorporation is measured by the same procedure described for MLC.

UtpodingerGraftings

For dette in vivo studium av immunresponsen, ble C75/BL mottagere podet med ful1tykke1sestransplantat oppnådd fra histoinkompativ Balb/C mus. Transplantater på ca. 1 cm oppnås fra Balb/C donorer og sutureres til hjørnene av de preparerte steder på ryggen av grupper på seks C57/B1 For this in vivo study of the immune response, C75/BL recipients were engrafted with full-thickness grafts obtained from histoincompatible Balb/C mice. Transplants of approx. 1 cm is obtained from Balb/C donors and sutured to the corners of the prepared sites on the back of groups of six C57/B1

mottagere under Halothan-anestesi. Transplantatene under-I søkes daglig både visuelt og ved beføling fra 6. dag etter poding. Et sett dyr preimmuniseres ved poding og avvisning av et tilsvarende transplantat en måned før det endelige forsøk. Statistisk analyse skjer i henhold til Students' recipients under Halothane anesthesia. The sub-I transplants are checked daily both visually and by feeling from the 6th day after grafting. A set of animals is preimmunized by inoculation and rejection of a corresponding graft one month before the final experiment. Statistical analysis takes place according to Students'

T-prøve for parrede populasjoner.T-test for paired populations.

) )

Resultatene av de ovenfor angitte studier skal beskrives i detalj slik at fagmannen vil erkjenne de karakteriserende trekk ved den immunostimulerende faktor ifølge oppfinnelsen. The results of the above-mentioned studies must be described in detail so that the person skilled in the art will recognize the characteristic features of the immunostimulating factor according to the invention.

jiyes

De biologiske aktiviteter som er til stede i CTE-acetonpresipitatet ble fastslått ved ge1fi 11rering The biological activities present in the CTE acetone precipitate were determined by gelation

på kolonner av Sephadex G-25. Hele avløpet fra kolonnen undersøkes ved bestemmelse av virkningen av de forskjel- on columns of Sephadex G-25. The entire effluent from the column is examined by determining the effect of the different

lige fraksjoner om murin MLC i humanserum. Bruken av humanserum for å dyrke lymfoidce1ler ble observert å være vesentlig for å unngå de sterke inhiberende virkninger av polyaminer som er til stede i vevekstrakt ene. equal fractions of murine MLC in human serum. The use of human serum to culture lymphoid cells was observed to be essential to avoid the strong inhibitory effects of polyamines present in tissue extracts.

Resultatene av undersøkelsene med pyridinacetatbuffer vedThe results of the investigations with pyridine acetate buffer at

pH 4,5 er vist i fig. 1, hvorfra det ses at den inhibe-pH 4.5 is shown in fig. 1, from which it can be seen that the inhibit-

rende faktor elueres akkurat etter bacitracinpi len ved en<K>AVE På °»<76->factor is eluted just after the bacitracin pill at a<K>AVE of °»<76->

Den stimulerende faktor elueres umiddelbart bak saltet vedThe stimulating factor is eluted immediately behind the salt

en K^V£på 1,33 nær en stor 280 nm absorps jontopp. Utbyttet av stimulerende materiale som oppnås ved denne prosedyre, er ca. 1.5 mg pr. 1000 mg CTE-acetonpresipitat som ble tilført til kolonnen. a K^V£ of 1.33 near a large 280 nm absorption ion peak. The yield of stimulating material obtained by this procedure is approx. 1.5 mg per 1000 mg of CTE acetone precipitate was added to the column.

Tilsvarende resultater oppnås med kommesielt avfettet kalvetymus. Similar results are obtained with commercially defatted calf thymus.

Fra elueringsposisjonen for den stimulerende faktor er detFrom the elution position of the stimulating factor it is

klart at den må virke sterkt sammen med eller absorberes sterkt på Cephadex G-25 under de elueringsbetingelser som er beskrevet ovenfor. clearly it must act strongly with or be strongly absorbed on Cephadex G-25 under the elution conditions described above.

Som vist i fig. 2 er den stimulerende faktor også sterktAs shown in fig. 2, the stimulating factor is also strong

bundet til Sephadex G-50 som er bragt i likevekt med PBSbound to Sephadex G-50 which has been equilibrated with PBS

ved ph 7,4. Det ble observert i dette studium at den stimulerende faktor elueres godt ut over den molekylvekt som settes for andre tymusfaktorer. som er rapportert, og som gjelder for Interleukin-2 . Faktoren skiller seg også at pH 7.4. It was observed in this study that the stimulating factor is eluted well above the molecular weight set for other thymic factors. which has been reported, and which applies to Interleukin-2. The factor also differs

fra disse aktorer fordi disse ikke er angitt å absorbere til Sephadex under disse betingelser. Disse rapporter finnes i: Goldstein, G.: Nature 247: 11-14 (1974); from these prosecutors because these are not indicated to absorb to Sephadex under these conditions. These reports are found in: Goldstein, G.: Nature 247: 11-14 (1974);

Kook, A.I., Yakir, Y., and Trainin, H.:Kook, A.I., Yakir, Y., and Trainin, H.:

Cell Immunol. 19: 151-157 (1975); Cell Immunol. 19: 151-157 (1975);

Dardenne, M., Pleau, J.M., Man, N.K., and Bach, Dardenne, M., Pleau, J.M., Man, N.K., and Bach,

J.F.: J. Biol. Chem 252: 8040-8044, J.F.: J. Biol. Chem 252: 8040-8044,

(1977); (1977);

Low, T.L.K., Thurman, G.B., Chincanini, C.; Low, T.L.K., Thurman, G.B., Chincanini, C.;

McClure, J.E., Marshall, G.D., Hu, S.K., and Goldstein, A.L.: Ann. N.Y. Acad. Sei. 332: 33-48 (1979); McClure, J.E., Marshall, G.D., Hu, S.K., and Goldstein, A.L.: Ann. NEW. Acad. Pollock. 332: 33-48 (1979);

Mier, J.W. and Gallow, R.C.: Proe. Nati. Acad. Mier, J.W. and Gallow, R.C.: Proe. Nati. Acad.

Sei. U.S.A. 77: 6134-6138 (1980); Pollock. U.S.A. 77: 6134-6138 (1980);

Gillis, J., Snith, K.A., and Watson, J.:Gillis, J., Snith, K.A., and Watson, J.:

J. Immunol. 124: 1954-1962 (1980); J. Immunol. 124: 1954-1962 (1980);

Disabato, G.: Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 79: 3020-3023 (1982); Watson, J., Gillis, S., Marbrook, J . ,Mochizuki , D., and Smith, K. A.: J. Exp. Med. 150: 849-858. Disabato, G.: Proe. Nati. Acad. Pollock. U.S.A. 79: 3020-3023 (1982); Watson, J., Gillis, S., Marbrook, J . , Mochizuki, D., and Smith, K.A.: J. Exp. Med. 150: 849-858.

Ved pH 4,5 til 7,4 viser således den stimulerende faktor en kromatograf isk oppførsel på Sephadex-geler som distinkt er forskjellig fra tidligere beskrevne tymiske eller lymfokinfaktorer. Thus, at pH 4.5 to 7.4, the stimulating factor exhibits a chromatographic behavior on Sephadex gels distinctly different from previously described thymic or lymphokine factors.

Et antall peptider har egenskapen kjemabsorbans på Sephadex-geler. En av teknikkene for å minimalisere dette er å benytte en polyakrylamid-geImatriks slik som BioGel ved en alikalisk pH-verdi som beskrevet av Chin og Wold: "Anal. Biochem." 16: 585 (1972). En prøve på G-25 absorbert materiale ble underkastet kromatografi på BioGel P-10 under anvendelse av 0,5 M ammoniumbikarbonat ved pH 8,0. Elueringsmønsteret er vist i fig. 3. Det 280 nm absorberende materiale ble holdt tilbake under disse betingelser på samme måte som med resultatene med Sephadex G-25- og Sephadex G-50 kolonnene. Den stimulerende aktivitet ble også holdt tilbake, noe som antydet den sterkt absorberende evne for den stimulerende faktor. A number of peptides have the property of chemiabsorbance on Sephadex gels. One of the techniques to minimize this is to use a polyacrylamide gel matrix such as BioGel at an alkaline pH as described by Chin and Wold: "Anal. Biochem." 16: 585 (1972). A sample of G-25 absorbed material was subjected to chromatography on BioGel P-10 using 0.5 M ammonium bicarbonate at pH 8.0. The elution pattern is shown in fig. 3. The 280 nm absorbing material was retained under these conditions similar to the results with the Sephadex G-25 and Sephadex G-50 columns. The stimulatory activity was also retained, indicating the strong absorptive capacity of the stimulatory factor.

Ut fra det ovenfor anførte kan det konkluderes med at den stimulerende faktor ifølge oppfinnelsen sterkt adherer til enhver Sephadex ved pH 4,5 til 8,0 og til enhver BioGel ved ved pH 8,0. Based on the above, it can be concluded that the stimulating factor according to the invention strongly adheres to any Sephadex at pH 4.5 to 8.0 and to any BioGel at pH 8.0.

Når Chin og Wold's teknikk ble benyttet under sterkt basiske betingelser, ble den stimulerende faktor eluert ut før saltet på en BioGel P-2 kolonne som vist i fig. 7. I dette forsøk ble 10 mg av en G-25 stimulerende pool ført over en 1 x 45 cm kolonne med BioGel P-2 som var bragt i likevekt med 0.05 M NH^OH ved pH 10,2. Fraksjonen ble eluert med den samme reagens. Et resultat av denne behandling er at faktoren er spaltet i to fraksjoner. Mønsteret i fig. 7 antydet at en av disse fraksjoner har en molekylvekt på ca. 1400 Dalton og den andre en molekylvekt på mindre enn 1400 Dalton, men ikke mer enn 100 Dalton. Betydningen av opptreden av to fraksjoner under disse sterkt basiske betingelser er ikke helt forstått. Det kan være at faktoren ifølge oppfinnelsen virkelig inneholder to fraksjoner eller at den spaltes i to fraksjoner ved sterk alkalisk behandling. When Chin and Wold's technique was used under strongly basic conditions, the stimulating factor was eluted before the salt on a BioGel P-2 column as shown in fig. 7. In this experiment, 10 mg of a G-25 stimulating pool was passed over a 1 x 45 cm column of BioGel P-2 which had been equilibrated with 0.05 M NH^OH at pH 10.2. The fraction was eluted with the same reagent. A result of this treatment is that the factor is split into two fractions. The pattern in fig. 7 suggested that one of these fractions has a molecular weight of approx. 1400 Daltons and the other a molecular weight of less than 1400 Daltons but not more than 100 Daltons. The significance of the appearance of two fractions under these strongly basic conditions is not fully understood. It may be that the factor according to the invention really contains two fractions or that it is split into two fractions by strong alkaline treatment.

Uttrykket "adherer sterkt" slik det benyttes i beskrivelse og krav betyr at faktoren eluerer etter en natrium-kloridmarkør på en Sephadex-kolonne ved pH 4 til 8. The term "strongly adheres" as used in the description and claims means that the factor elutes after a sodium chloride marker on a Sephadex column at pH 4 to 8.

For dialysestudie ble en prøve G-25 pool tatt opp i 0,1 M ammoniumacetat, pH 5,0. Retentatet og dialysatet ble frysetørket og prøvet med MLC. Det ble funnet at 13% av aktiviteten var i retentatet og 87% av aktiviteten idialysatet. Dette påviser klart av den immunostimulerende faktor passerer gjennom dialyserøret med en 3.500 Dalton sperregrense. For dialysis study, a sample G-25 pool was taken up in 0.1 M ammonium acetate, pH 5.0. The retentate and dialysate were freeze-dried and tested by MLC. It was found that 13% of the activity was in the retentate and 87% of the activity in the dialysate. This clearly demonstrates that the immunostimulating factor passes through the dialysis tube with a 3,500 Dalton barrier.

Arten av den stimulerende aktivitet er undersøkt ved forskjellige forsøk. I det første ble CTE-aceton presipitert materiale underkastet analyse på små kolonner av ionebytteharpikser . Den CTE-acetonpresipiterte fraksjon ble bragt på små kolonner enten av en anion (AG-1)- eller en kation (AG-50) bytteharpiks ved pH 7. Fraksjonen som ikke ble tilbakeholdt av kolonnen, ble undersøkt for sin virkning på MLC. Som vist i fig. 4 stimulerte fraksjonen som ikke ble holdt tilbake av AG-1 harpiksen i betydelig grad<3>H-tymidin innarbeiding i MLC. Mikroskopisk under-søkelse viste åpenbar økning i antallet blast-celler ved slutten av dyrkningsperioden sammenlignet med kontroll-prøven. Fraksjonen som ikke ble holdt tilbake av AG-50 kolonnen viste en så å si tre gangers økning av den totale inhiberende aktivitet. Dette var åpenbart resultatet av fjerning av stimulerende aktivitet til stede i den urene CTE-acetonprecipitatf raksjon. Med dette bekreftes også resultatene med G-25 kolonnene som antyder nærvær av både stimulerende og inhiberende aktivitet i ekstraktene. The nature of the stimulating activity has been investigated in various experiments. In the first, CTE acetone precipitated material was subjected to analysis on small columns of ion exchange resins. The CTE acetone-precipitated fraction was applied to small columns of either an anion (AG-1) or a cation (AG-50) exchange resin at pH 7. The fraction not retained by the column was examined for its effect on MLC. As shown in fig. 4, the fraction not retained by the AG-1 resin significantly stimulated<3>H-thymidine incorporation into MLC. Microscopic examination showed an obvious increase in the number of blast cells at the end of the culture period compared to the control sample. The fraction that was not retained by the AG-50 column showed a so-called three-fold increase in total inhibitory activity. This was obviously the result of the removal of stimulatory activity present in the impure CTE-acetone precipitate reaction. This also confirms the results with the G-25 columns which suggest the presence of both stimulating and inhibitory activity in the extracts.

Den G-25 stimulerende pool ble også underkastet behandling på ionebytteharpiks, AG-50, bragt i likevekt med destillert vann. Elueringsprofi len er vist i fig. 5. Den stimulerende aktivitet ble klart separert fra resten av det 280 nm absorberende materiale som ikke ble forsinket av kolonnen under disse betingelser. Resultatene antyder at den stimulerende faktor ikke binder seg til en anione-bytteharpiks og holdes tilbake kun i lett grad av en kationby11eharpiks . Fra disse resultater kan det konkluderes at den stimulerende faktor har et nøytralt eller lett basisk isoelektrisk punkt, dvs. ca. 7,0 til 7,8. The G-25 stimulating pool was also subjected to treatment on ion exchange resin, AG-50, equilibrated with distilled water. The elution profile is shown in fig. 5. The stimulatory activity was clearly separated from the rest of the 280 nm absorbing material which was not delayed by the column under these conditions. The results suggest that the stimulating factor does not bind to an anion exchange resin and is retained only slightly by a cation exchange resin. From these results it can be concluded that the stimulating factor has a neutral or slightly basic isoelectric point, i.e. approx. 7.0 to 7.8.

Den G-25 stimulerende pool øker DNA-synteti ske respons både for murin- og humanlymfocytter overfor antigener i toveis MLC. Stimuleringen kan være signifikant, opp til fem ganger, avhengig av dyrkningsbetingelsene. Den midlere to gangers stimulerende dose ved G-25 trinnet er 10 til 20 y g/ml for en murin MLC i 10% humanserum. Som vist i tabell 1 blir responsen for murin og humanlymfocytter i MLC og murinlymfocytter til en suboptimal dose av Con A signifikant stimulert. Stimulering av mur inlymf ocyt ter ved LPS ble ikke signifikant øket ved nærvær av stimulatoren. Det er åpenbart at stimulatoren kun virker ved T-celle medierte responser. The G-25 stimulatory pool increases the DNA synthetic response of both murine and human lymphocytes to antigens in bidirectional MLC. The stimulation can be significant, up to five times, depending on the cultivation conditions. The average two-fold stimulatory dose at the G-25 step is 10 to 20 µg/ml for a murine MLC in 10% human serum. As shown in Table 1, the response of murine and human lymphocytes in MLC and murine lymphocytes to a suboptimal dose of Con A is significantly stimulated. Stimulation of murine lymphocytes by LPS was not significantly increased in the presence of the stimulator. It is obvious that the stimulator only works with T-cell mediated responses.

Den G-25 stimulerende pol har også en virkning på prolife-rering av murinelukemia, L1210, slik som vist i tabell 10. Dette antyder at faktoren kan ha en direkte mitogen virkning på kontinuerlig delende celler. The G-25 stimulatory pol also has an effect on the proliferation of murine leukemia, L1210, as shown in Table 10. This suggests that the factor may have a direct mitogenic effect on continuously dividing cells.

Det er vist at murinlymfocytter krever tiolforbindelser It has been shown that murine lymphocytes require thiol compounds

for maksimal reponse, (Broome et al> J. Exp. Med. 138: 574for maximum response, (Broome et al> J. Exp. Med. 138: 574

(1973). En måte en stimulerende faktor kunne virke på, (1973). One way in which a stimulating factor could act,

kunne være på noen måte å modifisere disse nødvendige tioler. For å undersøke denne mulighet bleen murin MLC could be in some way modifying these necessary thiols. To investigate this possibility, murine MLC were used

satt opp med forskjellige konsentrasjoner av 2-merkaptoetanol og sammenlignet med en konsentrasjon av G-25 stimulatorpool som på forhånd var vist å gi en to set up with different concentrations of 2-mercaptoethanol and compared to a concentration of G-25 stimulator pool which was previously shown to give a two

gangers stimulering under standard prøvebetinge1ser. Disse resultater er vist i fig. 6 som antyder at ved enhver 2-merkaptoetanol-konsentrasjon ved hvilken- det er en<3>H-tymidinarbeidning signifikant over bakgrunnen, dvs. en signifikant response på alloantigener av miltcellene, øket stimulatoren responsen. Stimulaoren var altså aktiv over et vidt område 2-merkaptoetanolkonsentrasjoner. Dette viser at endring av tiolnivåene ikke er involvert i stimulator-virkningen. Det bekrefter også resultatene med human MLC som ikke krever 2-merkaptoetanol i mediet for reaktivitet. times stimulation under standard test conditions. These results are shown in fig. 6 which suggests that at any 2-mercaptoethanol concentration at which there is a<3>H-thymidine processing significantly above background, i.e. a significant response to alloantigens by the spleen cells, the stimulator increased the response. The stimulator was thus active over a wide range of 2-mercaptoethanol concentrations. This shows that changing the thiol levels is not involved in the stimulator effect. It also confirms the results with human MLC which does not require 2-mercaptoethanol in the medium for reactivity.

Forsøk med forskjellige mengder G-25 stimulatorpoolExperiment with different amounts of G-25 stimulator pool

ble tilsatt ved forskjellige tidsrom eller fjernet på forskjellige tidsrom etter initiering av MLC er vist i tabell 2, 3 og 4. Resultatene viser at virkningen av stimulatoren var reversibel opp inntil det punkt der mikroskopisk synlige lymfoblastcelier er til stede i kulturene, 72 timer (tabellene 2 og 3), og at denne stimulator kun behøvde å være til stede de siste 24 timer eller mindre av dyrkningsperioden (tabell 4). Alle disse resultater er konsistente med at målecellen for den stimulerende faktor er lymfoblasten selv. Dette skiller denne faktor klart fra andre tymiske faktorer som hovedsakelig stimulerer maturering av umodne T-celler. were added at different times or removed at different times after the initiation of MLC are shown in Tables 2, 3 and 4. The results show that the effect of the stimulator was reversible up to the point where microscopically visible lymphoblast cells are present in the cultures, 72 hours (Tables 2 and 3), and that this stimulator only needed to be present for the last 24 hours or less of the cultivation period (table 4). All these results are consistent with the measuring cell for the stimulating factor being the lymphoblast itself. This clearly distinguishes this factor from other thymic factors which mainly stimulate the maturation of immature T cells.

Det er observert at G-25 stimulatorpoolen syntes å virkeIt has been observed that the G-25 stimulator pool appeared to work

mindre bra ved toveis MLC imediainneholdende 10% fetalkalveserum enn i mediainneholde 10% humanserum. Når less well with two-way MLC in media containing 10% fetal calf serum than in media containing 10% human serum. When

en toveis MLC av murinlymfocytter ble gjennomført i 5% fetalkalveserum, under hvilke betingelser det totale tymidinopptak er ca. 60% av det som kan vises ved 10% fetalkalveserum, kunne nå stimulatoren øke det totale tymidinopptak av disse kulturer til det som ble observert ved 10% serum. I 1% FCS kunne G-25 stimulatorpoolen ved en konsentrasjon av 40 Pg/ml øke responsen til det som ble observert 20% FCS. På denne måte kan stimulatoren partielt erstatte serumbehovet ved MLC. a two-way MLC of murine lymphocytes was carried out in 5% fetal calf serum, under which conditions the total thymidine uptake is approx. 60% of what can be shown with 10% fetal calf serum, now the stimulator could increase the total thymidine uptake of these cultures to what was observed with 10% serum. In 1% FCS, the G-25 stimulator pool at a concentration of 40 Pg/ml could increase the response to that observed in 20% FCS. In this way, the stimulator can partially replace the serum requirement in MLC.

Det er vist at museserum inhiberer efektiviteten for T-cellevekstfaktoren, Interleukin-2, Hardt et al: 42: 363 Mouse serum has been shown to inhibit the effectiveness of the T-cell growth factor, Interleukin-2, Hardt et al: 42: 363

(1982). Forskjellige konsentrasjoner av samlet museserum sammen med forskjellige konsentrasjoner av G-25 stimulatorpool ble tilsatt til toveis murinblandet lymfocyttkultur i 5% humanserum. Det er ingen tegn på at dette museserum ved noen konsentrasjon hadde en inhiberende virkning mot den stimulerende evne ved enhver konsentrasjon av den stimulerende faktor. Dette tjener ytterligere til å skille den tymiske stimulator ifølge oppfinnelsen fra Interleukin-2. (1982). Different concentrations of pooled mouse serum together with different concentrations of G-25 stimulator pool were added to two-way murine mixed lymphocyte culture in 5% human serum. There is no evidence that this mouse serum at any concentration had an inhibitory effect on the stimulatory ability at any concentration of the stimulatory factor. This further serves to distinguish the thymic stimulator according to the invention from Interleukin-2.

Et viktig trekk ved den immunstimulerende faktor er virkningen in vivo. Evnen for G-25 stimulatorpoo1 en til å akselerere avvisning av histoinkompati ble hudpodinger hos mus er undersøkt. Resultatene er vist i tabell 5. Ved to forskjellige doser akselererte den partielt rensede stimulator i vesentlig grad avvisningen av transplantatet. I det andre forsøket avviste de behandlede muse-transplantatene i en grad sammenlignbar med for immuniserte kontroller. Ved de benyttede doser var det ingen synlige toksiske virkninger. An important feature of the immunostimulating factor is its action in vivo. The ability of G-25 stimulator poo1 to accelerate rejection of histoincompatibility was skin grafts in mice has been investigated. The results are shown in Table 5. At two different doses, the partially purified stimulator significantly accelerated the rejection of the graft. In the second experiment, the treated mouse grafts rejected to a degree comparable to that of immunized controls. At the doses used, there were no visible toxic effects.

Reverserbarheten ble bestemt ved inkubering av 1 x 10^ miltceller av hver type i 1,6 ml standard kulturmedium pluss elle minus den antydede konsentrasjon av G-25 stimulatorpool i 3 ml piastkulturrør. Etter 24 timer ble alle rør sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter for å oppnå pellets av cellene, og mediet ble sugd av fra et sett av rør og erstattet med et likt volum på forhånd oppvarmet medium uten stimulator. Diosse rør ble sentrifugert og mediet erstattet igjen. Etter denne prosedyre ble rørene bragt tilbake til inkubatoren i ytterligere 72 timer. Ved slutten av inkuberingen ble cellene suspendert igjen og 0,2 ml andeler anbragt i mikrotiter-brønner for mikroskopisk undersøkelse, merking og høsting på vanlig måte. Reversibility was determined by incubating 1 x 10 5 spleen cells of each type in 1.6 ml standard culture medium plus or minus the suggested concentration of G-25 stimulator pool in 3 ml piast culture tubes. After 24 h, all tubes were centrifuged at 200 x g for 10 min to obtain pellets of the cells, and the medium was aspirated from one set of tubes and replaced with an equal volume of pre-warmed medium without stimulator. Diosse tubes were centrifuged and the medium replaced again. After this procedure, the tubes were returned to the incubator for a further 72 hours. At the end of the incubation, the cells were resuspended and 0.2 ml aliquots placed in microtiter wells for microscopic examination, labeling and harvesting in the usual manner.

4-1 4-1

4-1 I rrj H 4-1 I rrj H

UJ -H UJ -H

i—I4-1 i—I4-1

•H •H

-P CU -P CU

4J CU 01 iH -H 4J CU 01 iH -H

h a o0) h a o0)

O TJ O TJ

Pu Pooh

U U U U

0 CU +J 4-<1>4-> rH CU g 4J 0 CU +J 4-<1>4-> rH CU g 4J

•H CU •H CU

4-<>>10 4-<>>10

CU CU

in g in g

(N (N

1 CU O rH 0) 1 CU O rH 0)

TJ CU C CU TJ CU C CU

CU iH e -H CU iH e -H

a) a)

<D CJ <D CJ

TJ TJ

0) 0)

TJ G TJ G

>h <D 4J U C 3 rrj4-1 >h <D 4J U C 3 rrj4-1

i—I C 3 cu i—I C 3 cu

TJ TJ

en td o a td o

Cn a c di o u Cn a c di o u

CU CU

-P -H -P -H

4- 1 4J rrj -H cn c 4- 1 4J rrj -H cn c

•H •H

cu cu

XI CUXI CU

4-1 M4-1 4-1 M4-1

CU CUCU CU

-8. g u o Dj S-i -8. g u o Dj S-i

00 00

U TJ U TJ

S4-1 S4-1

C CU C CU

•H4-1 5- I4-1 g en •H4-1 5- I4-1 g one

cTJ ra i-i Cn rrj 4-) C cTJ ra i-i Cn rrj 4-) C

TJ CU -H C TJ C TJ CU -H C TJ C

rrj4-1 4-) orfl 0) CO Qjcn rrj4-1 4-) orfl 0) CO Qjcn

Hudpoding ble gjennomført som beskrevet ovenfor. Behand- Skin grafting was carried out as described above. treat-

lede mus fikk de angitte mengder G-25 stimulatorpool. control mice received the indicated amounts of G-25 stimulator pool.

ff

Signifikansen ble bestemt ved bruk av Students' T-prøve. Significance was determined using the Student's T-test.

Isoleringen og den biologiske karakterisering av en ny immunostimulerende faktor fra storfetymus er beskrevet. I den i dag foretrukne isolasjonsprosedyre ekstraheres denne faktor fra frisk eller kommersielt avfettet og tørket tymuspreparat med en basisk buffer fulgt av oppløsning i 60% etanol og utfelling med kald aceton. Rensingen kan skje på Sephadex- eller BioGel kolonraner ved valgte hydrogenionekonsentrasjoner. Den biologiske aktivitet for faktoren, selv når den kun er partielt renset, ligger i dens evne til å stimulere den DNA-syntetiske respons og antall resulterende blast celler både av murin og human T-lymfocytter som gir response på alloanti genstimulering. G-25 stimulatoren hadde ingen synlig virkning av murin B-lymfocyttresponsen til polyklonalmitogen LPS. Rever-sibi litetsforsøkene som er beskrevet ovenfor, viser at faktoren virker meget sent i MLC, etter eller under dannelsen av morfologisk erkjennbare lymfoblaster i kulturene. Den stimulerende virkning er totalt reversibel hvis, faktoren fjernes før utløp av 72 timer MLC, men ikke etter 96 timer. I tillegg vil faktoren stimulere MLC hvis den tilsettes så sent som 72 timer etter oppstarting. Den stimulering som oppnås, er lik nivået av stimulering som oppnås hvis faktoren er til stede kontinuerlig. The isolation and biological characterization of a new immunostimulating factor from bovine thymus is described. In the currently preferred isolation procedure, this factor is extracted from fresh or commercially defatted and dried thymus preparation with a basic buffer followed by dissolution in 60% ethanol and precipitation with cold acetone. The purification can take place on Sephadex or BioGel colon columns at selected hydrogen ion concentrations. The biological activity of the factor, even when only partially purified, lies in its ability to stimulate the DNA synthetic response and the number of resulting blast cells of both murine and human T-lymphocytes that respond to alloantigen stimulation. The G-25 stimulator had no apparent effect on the murine B-lymphocyte response to the polyclonal mitogenic LPS. The reversibility experiments described above show that the factor acts very late in MLC, after or during the formation of morphologically recognizable lymphoblasts in the cultures. The stimulating effect is totally reversible if the factor is removed before the expiration of 72 hours MLC, but not after 96 hours. In addition, the factor will stimulate MLC if added as late as 72 hours after initiation. The stimulation achieved is equal to the level of stimulation achieved if the factor is present continuously.

Den viktigste biologiske virkning av faktoren er evnen til å stimulere en in vivo immun response. I det benyttede modellsystem avviste de behandlede mus allogentransplanta-ter i en grad sammenlignbar med den for f or immuni s e r t e dyr. Dette er muligens den maksimale grad som kan oppnås i denne type sterkt histoinkompatible system. Det skal bemerkes at disse resultater ble oppnådd hos helt immunokomponente, voksne mus med respons på en sterk antigenisk stimulus. The most important biological effect of the factor is the ability to stimulate an in vivo immune response. In the model system used, the treated mice rejected allogeneic transplants to a degree comparable to that of previously immunized animals. This is possibly the maximum degree that can be achieved in this type of highly histoincompatible system. It should be noted that these results were obtained in fully immunocompetent adult mice responding to a strong antigenic stimulus.

De heri beskrevne kjemiske og biologiske resultater viser at den stimulerende faktor ifølge oppfinnelsen skiller seg fra andre kjente tymiske hormoner og fra Interleukin-2. Den følgende tabell 6 oppsummerer de mest betydelige av disse distinksjoner. Den immunostimulerende faktor ifølge oppfinnelsen kan oppnås i meget renset form i henhold til den heri beskrevne prosedyre. Imidlertid er det ikke vesentlig at det er total renhet for å oppnå den ønskede terapeutiske virkning. Preparater inneholdende faktoren kan isoleres og benyttes alene eller i forskjellige farmasøytiske sammen-setninger for å oppnå et terapeutisk nivå for faktoren i pattedyr- eller fugleblod eller vev som er effektivt med henblikk på å gi en immunostimulerende respons. The chemical and biological results described herein show that the stimulating factor according to the invention differs from other known thymic hormones and from Interleukin-2. The following table 6 summarizes the most significant of these distinctions. The immunostimulating factor according to the invention can be obtained in highly purified form according to the procedure described herein. However, total purity is not essential to achieve the desired therapeutic effect. Preparations containing the factor can be isolated and used alone or in various pharmaceutical compositions to achieve a therapeutic level of the factor in mammalian or avian blood or tissue which is effective for the purpose of providing an immunostimulatory response.

Flere forskjellige kommersielt tilgjengelige faktorer med immunostimulerende aktivitet ble prøvet i MLC systemet. Resultatet av disse prøver er vist i tabell 7. Dosen ble valgt for å dekke det området som syntes å være optimalt basert på studier av de publikasjoner som vises i tabellen og andre standa rdbetraktninger. a) kontroll MLC verdi med kun saltoppiøsningsti 1setning. Several different commercially available factors with immunostimulating activity were tested in the MLC system. The results of these tests are shown in table 7. The dose was chosen to cover the range that appeared to be optimal based on studies of the publications shown in the table and other standard considerations. a) control MLC value with only salt solution path 1 sentence.

b) standard G-25 aktiv immunostimulatorpool.b) standard G-25 active immunostimulator pool.

c) Interleukin-2, Collaborative Research, oppnådd fra c) Interleukin-2, Collaborative Research, obtained from

Con A stimulerte "rat-table" supernatant ved ammonium-su1fatutfe11ing og DEAE-Sephadex. Enheter som definert ved aktivitet mot rausesytotoksisk T-lyrafocytt1inje. Con A stimulated "rat-table" supernatant by ammonium sulfate extraction and DEAE-Sephadex. Units as defined by activity against rause cytotoxic T-lyraphocyt1inje.

(Rascett et all Blood 57, 399 (1981); Mier et al Proe Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77, 6134 (1980); Di Sabato (Rascett et al Blood 57, 399 (1981); Mier et al Proe Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77, 6134 (1980); Di Sabato

Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 79, 3020 (1982)).Pro. Nat. Acad. Pollock. U.S.A. 79, 3020 (1982)).

d) Epidermisk vekstfaktor, Collaraborative Research. Ingen angitt immunomodulerende aktivitet, men adborbe-rer til BioGel P-10, Savage et al, J. Biol, Chem. 247, d) Epidermal growth factor, Collaraborative Research. No indicated immunomodulatory activity, but adsorbs to BioGel P-10, Savage et al, J. Biol, Chem. 247,

7609 (1972). 7609 (1972).

e) Thymopoietin II aktiv peptidfragment, United States Biochemica1s, syntetisk peptid (Goldstine Nature e) Thymopoietin II active peptide fragment, United States Biochemica1s, synthetic peptide (Goldstine Nature

(London) 274, 11 (1974); Schlesinger et al, Cell 5, (London) 274, 11 (1974); Schlesinger et al, Cell 5,

367 (1974)). 367 (1974)).

f&g) Facteur Thymique Serique, syntetisk peptid, Pen-ninsula Labs. Komplekset med Zn er den rapporterte aktive form for det syntetiske peptid (Dardenna et al, f&g) Facteur Thymique Serique, synthetic peptide, Penninsula Labs. The complex with Zn is the reported active form of the synthetic peptide (Dardenna et al,

Trans, Proe. XIV 509 (1982)).Trans, Proe. XIV 509 (1982)).

h) Tufsin, Vega Biocheraicals, syntetisk tetrapeptid,h) Tufsin, Vega Biocheraicals, synthetic tetrapeptide,

vist å stimulere makrofager, Nishioka et al, Bio-shown to stimulate macrophages, Nishioka et al, Bio-

chem. Biophys. Res. Comm. 47, 172 (1972).chem. Biophys. Res. Comm. 47, 172 (1972).

i) Levamisole, Sigma Chemical Co., syntetisk forbindelse med immunomodulerende egenskaper, Hadden, J.W. i The Pharraacology of Immunoregulation. Eds. Werner, G.H. i) Levamisole, Sigma Chemical Co., synthetic compound with immunomodulatory properties, Hadden, J.W. in The Pharmacology of Immunoregulation. Eds. Werner, G.H.

og Floch/h, F. Academis Press, (1978) side 369 og f ølgende. and Floch/h, F. Academis Press, (1978) page 369 et seq.

Slik det fremgår av tabellen viste kun lymfokin IL-2 noen økende virkning. Således var det, slik det fremgår av den neste tabell, en meget sterk synergistisk virkning av de to faktorer. Det er åpenbart at preparater inneholdende både den immunostimulerende faktor ifølge oppfinnelsen og IL-2 er verdifulle ved behandling av pasienter som har bevhov for immunostimulering. Slike preparater vil karakteristisk inneholde fra 10 til 90 vekt-% IL-2, beregnet på den totale vekt av de immunostimulerende faktorer. Preparatene kan inneholde hvilken som helst av de vanlige farmasøytiske midler. As can be seen from the table, only lymphokine IL-2 showed any increasing effect. Thus, as can be seen from the next table, there was a very strong synergistic effect of the two factors. It is obvious that preparations containing both the immunostimulating factor according to the invention and IL-2 are valuable in the treatment of patients in need of immunostimulation. Such preparations will characteristically contain from 10 to 90% by weight of IL-2, calculated on the total weight of the immunostimulating factors. The preparations may contain any of the usual pharmaceutical agents.

Produktene ifølge oppfinnelsen, dvs. faktoren i meget ren form, salter av faktoren eller isolerte fraksjoner inneholdende faktoren, er brukbare terapeutiske midler for pattedyr og fugler og er effektive med henblikk på stimulering av en immunrespons hos pasienter som trenger slik behandling. The products according to the invention, i.e. the factor in very pure form, salts of the factor or isolated fractions containing the factor, are usable therapeutic agents for mammals and birds and are effective for the purpose of stimulating an immune response in patients who need such treatment.

Den immunostimulerende faktor ifølge oppfinnelsen er brukbar ved behandling av enhver fjærfe- eller pattedyr-sykdom forbundet med depresjon av cellemediert immunitet. Alvorlige virale, bakterielle eller fungale infeksjoner henger ofte sammen med slike depresjoner. Faktoren kan benyttes for å øke virkningene av standard terapi som vanligvis benyttes for slike infeksjoner. The immunostimulating factor according to the invention is useful in the treatment of any poultry or mammalian disease associated with depression of cell-mediated immunity. Serious viral, bacterial or fungal infections are often associated with such depressions. The factor can be used to increase the effects of standard therapy usually used for such infections.

Faktoren er spesielt verdifull for å understøtte stimulering av immunresponsen hos pasienter som får stråle-behandling eller kjemoterapi for behandling av alvorlige sykdommer. The factor is particularly valuable for supporting the stimulation of the immune response in patients receiving radiotherapy or chemotherapy for the treatment of serious diseases.

Den er også brukbar med henblikk på å beskytte subjekter under slike belastninger at de kan få infeksjoner som de vanligvis er i stand til å motstå. Karakteristiske eksempler på en slik anvendelse er beskyttelse av dyr mot trans portfeber, eller beskyttelse av mennesker etter kirurgi. It is also useful for the purpose of protecting subjects under such stress that they may acquire infections which they are normally able to resist. Characteristic examples of such an application are the protection of animals against transport fever, or the protection of people after surgery.

Legen eller veterinæren vil bestemme den dosering som vil være mest egnet i et spesielt tilfelle. Den kan variere fra pasient til pasient, avhengig av pasientens størrelse, behand1ingsti1standen og andre faktorer som lett bedømmes av disse fagmenn. For kontinuerlig administrering i lengre tidsrom til individer med alvorlige eller mindre metabolske abnormaliteter eller mi 11ektomiserte individer, vil produktene vanligvis foreligge i forskjellige doseringsformer som varierer fra relativt store for å bygge opp et øyeblikkelig blodnivå til relativt små for å opprettholde et effektivt nivå. For intermitterende behandling for å bekjemte akutte eller kroniske infeksjoner kan det være varierende doser. The doctor or veterinarian will determine the dosage that will be most suitable in a particular case. It can vary from patient to patient, depending on the size of the patient, the level of treatment and other factors that are easily assessed by these professionals. For continuous administration over extended periods of time to individuals with severe or minor metabolic abnormalities or myectomized individuals, the products will usually be in different dosage forms ranging from relatively large to build up an immediate blood level to relatively small to maintain an effective level. For intermittent treatment to combat acute or chronic infections, there may be varying doses.

Vanligvis vil dosen være innen området 0,1 til 0,5 mg pr. kilo kropsvekt. For å tilveiebringe disse nivåer kan det fremstilles doseringsenhetsformer inneholdende fra 0,05 til 0,25 mg aktivt produkt. Doseenhetsformen kan som antydet ovenfor i tillegg inneholde fra 0,005 til 0,225 mg IL-2. Usually the dose will be in the range of 0.1 to 0.5 mg per kilos of body weight. To provide these levels, dosage unit forms containing from 0.05 to 0.25 mg of active product can be prepared. As indicated above, the dosage unit form can additionally contain from 0.005 to 0.225 mg of IL-2.

Produktene ifølge oppfinnelsen kan inngis alene, men vil vanligvis inngis sammen med farmasøytisk aksepterbare, ikke-toksiske bærere, hvis andeler bestemmes av egnetheten og den kjemiske arten av den spesielle bærer, den valgte inngivelsesvei og standard farmasøytisk praksis. Ved bekjempelse av forskjellige infeksjoner eller ved opprett-holdelse av terapeutisk effektive nivåer i blodet eller vevet, kan intravenøs eller intramuskulær inngivelse gjennomføres. The products of the invention may be administered alone, but will usually be administered with pharmaceutically acceptable, non-toxic carriers, the proportions of which are determined by the suitability and chemical nature of the particular carrier, the chosen route of administration, and standard pharmaceutical practice. In combating various infections or in maintaining therapeutically effective levels in the blood or tissue, intravenous or intramuscular administration can be carried out.

Claims

1. Immunostimulatory factor that can be isolated from bovine thymus and in the form of a peptide, characterized by a) strong adhesion to Sephadex and BioGel-P at pH 4.5 to 8, b) an isoelectric point of approx. 7.0 to 7.8, c) stimulation of DNA synthetic response of both murine and human lymphocytes to alloantigen stimulation in a two-way MLC, d) no significant increase in stimulation of murine lymphocytes by beta-lipopolysaccharides, e) ability to increase immunostimulatory response even in the presence of 2-mercaptoethanol, f) totally reversible MLC if removed up to 78 hours from the onset of MLC, g) works more effectively in MLC containing 10% human serum than in MLC medium containing 10% fetal-cave s e rum, h) the ability to increase the immunostimulatory response in MLC, even in the presence of mouse serum, i) the ability to accelerate rejection of histoincompatible skin grafts in mice, j) the ability to pass through dialysis tubing with a barrier limit of 3,500 Dalton, k) splitting the immunostimulator into two fractions where the molecular weight of one is approx. 1400 Dalton and the other is less than 1400 Dalton by gel filtration at a pH of 10.2 in 0.05 M ammonium hydroxide.

2. Method for producing an immunostimulatory factor from bovine thymus, characterized in that it includes: a) to extract thymus tissue with aqueous buffer at pH 8.5 and approx. 0 to 5°C, b) centrifugation of the homogenate at 26,000 to 30,000 x g for 20 to 40 minutes at approx. 0 to 5°C, c) re-extraction of the pellet's stay from step b) as in step a) and centrifugation of the homogenate as in step c), d) collecting supernatants from steps b) and c) and lyophilization, e) suspension of lyophilized powder in water from approx. 0 to 5°C and a concentration of 0.25 to 0.3 g/ml and slow addition of absolute ethanol with stirring to a final concentration of 50 to 60% (v/v), f) stirring for 16 to 18 hours at 0 to 5°C and centrifugation at 26,000 to 30,000 x g for 20 to 40 hours; g) addition of supernatant to 5 to 6 volumes of acetone at approx. -10 to -5°C and rest for 3 to 6 days at approx. -10 to -5°C, h) separate precipitation, suspension for approx. 100 to approx. 100 ml of distilled water or the same amount of approx.

20 mM acetic acid and lyophilization at 0 to 5°C, i) dissolution of lyophilized powder in a buffer at pH 4.5 to 8 and separation over Sephadex or BioGel, brought to equilibrium with the same buffer, j) collection of fractions and testing by MLC to select those fractions that have immunostimulatory activity.

3. Pharmaceutical preparation comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an amount effective to produce an immunostimulatory response of an immunostimulatory factor isolable from bovine thymus in the form of a peptide, characterized by: a) strong adhesion to Sephadex and BioGel-P at pH 4.5 to 8, b) an isoelectric point of approx. 7.0 to 7.8, c) stimulation of DNA synthetic response of both murine and human lymphocytes to a 11oantigen stimulation in a two-way MLC, d) no significant increase of stimulation of murine lymphocytes by beta-1 in popolysacchari where , e) ability to increase immunostimulatory response even in the presence of 2-mercaptoethanol, f) totally reversible MLC if removed up to 78 hours from the onset of MLC, g) works more effectively in MLC containing 10% human serum than in MLC medium containing 10% fetal calf serum, h) the ability to increase the immunostimulatory response in MLC, even in the presence of mouse serum, i) the ability to accelerate rejection of histoincompatible skin grafts in mice, j) the ability to pass through dialysis tubing with a barrier limit of 3,500 Dalton, k) cleavage into two immunostimulatory fractions where one molecular weight is approx. 1400 Dalton and the other is less than 1400 Dalton when gelled at a pH of 10.2 in 0.05 M ammonium hydroxide.

4. Pharmaceutical preparation according to claim 3, characterized in that it is available in unit dose form.

5 . Pharmaceutical preparation according to claim 3, characterized in that it further contains IL-2.

6. Dosage unit form as in claim 4, characterized in that it also contains IL-2