NO842015L - Immunstimulator - Google Patents

Description

Pattedyr og fugler, spesielt kommersielle fjærfefarmer,

kan ofte risikere eksponering til forskjellige eller fungale infeksjoner. En slik eksponering kan oppstå i de naturlige omgivelser, spesielt i meierier eller fjærfefarmer eller fra uvanlige situasjoner slik som kirurgi, ulykker eller sår. Pattedyrlegemet forsvarer seg mot de virale og fungale infeksjoner ved en immunologisk sekvens av forhold som stimuleres av nærværet av de inntrengende elementer, slik som virus, bakterier eller sopp, der sluttresultatet er fremstilling av T-celler som bevirker i konjugasjon med makrofager for å fremme fagosytose.

Noen pattedyr mangler denne immunologiske respons,

enten p.g.a. visse metabolske mangler, eller p.g.a. medisinsk behandling slik som kjemoterapi eller miltektomi. Mange husdyr, spesielt fjærfe, synes konstant å være følsomme overfor slike infeksjoner og svarer ikke immunologisk med tilstrekkelig hurtighet til å forhindre et stort tap. Kalkunflokker er spesielt følsomme i denne henseende. Dette fører til betydelig økning av omkost-ningene ved kalkunoppdrettet.

En mulighet for økning av den immunologiske respons for pattedyr overfor infeksjoner ville være et viktig tillegg til de våpen en lege eller veterinær har. Et slikt stoff kunne benyttes profylaktisk på subjekter som konstant eksponeres til infeksjon, på defensiv måte i forbindelse med subjekter som skal opereres, eller som en støtte for å forbedre den immunologiske respons hos subjekter som allerede lider av en aktiv infeksjon, eller som er under rekonvalesens etter kirurgi eller annet.

Det er nå oppdaget at en immunostimulerende faktor som kan benyttes for å oppnå disse resultater, kan oppnås fra storfetymusvev.

Denne faktor har et antall karakteriserende faktorer ved hjelp av hvilken den kan identifiseres og skilles fra andre stimulerende faktorer som er beskrevet, inkludert noen som er funnet i tymusvev. Blant disse karakteristika er de følgende: 1. Den er amfotær og adherer sterkt til Sephadex og Biogel-P ved både nøytral og noe sur pH-verdi.

2. Det isoelektriske punkt er fra 7,0 til 7,8.

3. Den stimulerer den DNA-synteti ske respons av både murin og humanlymfocy11er til al1oanti genstimuler ing i blandet lymfocyttkultur (MLC). 4. Den øker ikke vesentlig stimuleringen av milt-murinlymfocytter med lipopolysakkarid fra Salmonella typhosa (LPS). 5. Det er ingen reduksjon i dens immunostimulerende aktivitet i nærvær av 2-merkaptoetanol• 6. Den stimulerende aktivitet er helt utreversibel. 7. Den virker mer effektivt i MLC-medium inneholdende humanserura enn i et slikt medium som inneholder fetalserum. 8. Dens stimulerende virkning i MLC er ikke påvirket av nærvær av museserum. 9. Den vil akselerere avvisning av histoinkompatible hudinnpodinger hos mus. 10. Ved dialyse gjennom dialyserør med 3500 Dalton-grense går den gjennom rørnettet. 11. Ved gelfiltrering ved pH 10,2 i 0,05 M ammoniumhydroksyd spaltes den i to immunostimulerende fraksjoner hvorav en har en molekylvekt på ca. 1400 Dalton og den andre mindre enn 1400 Dalton, men mer enn 100 Dalton.

Den immunostimu1erende faktor ifølge oppfinnelsen er

brukbar for stimulering av resistensen i pattedyr- eller fuglelegemer mot infeksjon, enten som et preventivt middel eller som et helbredende middel.

Oppfinnelsen vil forstås bedre under henvisning til tegningene, der: Fig. 1 er en Sephadex G-25 kolonnepr of i 1 av et kalve-tymusekstrakt-acetonpresipitat . Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorpsjon ved 280 nm ( ) og for aktivitet i en murin MLC ( ). Pilen A antyder alueringsposisjonen for storfeserunralbumin; B, bacitracin; og C, natriumklorid. Fig. 2 er en Sephadex G-50 kolonneprof il av en G-25 stimulator"poo1". Sephadex G-50 kolonnen ble bragt i like-

vekt med en fosfatbufret sa1toppløsning (PBS). En 5 mg prøve av G-25 s t imula t o r poo 1 en ble innført i 1 ml PBS.

Pilene er A, storfeserumalbumin, B, cytokrom C, og C, basitracin. Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorbans ved 250 nm ( ) og med henblikk på aktivitet i

MLC ( ).

Fig. 3 er en BioGel P-10 ko1onneprof i 1 av en G-25 stimulatorpoo1 . BioGel P-10 kolonnen ble bragt i likevekt med 0,5 M ammoniubikarbonat , pH 8,0. En 2,7 mg prøve av G-25 stimulatorpoolen ble innført i 1 ml elueringsbuffer.

Pilene er A lik stor feserumalbumin og B lik bacitracin. Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorbans ved

250 nm ( ) og med henblikk på aktivitet i MLC ( ).

Fig. 4 viser virkningen av passasjen av en kalvetymus-ekstrakt-acetonpresi pitatf raks jon gjennom anion (Ag-1) eller cation (AG-50) byttekolonner på evnen til å inhibere MLC. ASG-1 (o—o) viser den virkning som observeres med den fraksjon som ikke holdes tilbake av AG-1 kolonnen; AG-50 (0--0) viser inhiberingen som observeres ved den fraksjon som ikke holdes tilbake av AG-50 kolonnen. Kontrollen ( — ) viser den inhibering som observeres med den ubehandlede prøve. Fig. 5 viser ionebyttingskromatografi for G-25 stimulaor-poolen. En prøve av G-25 stimulat orpoolen på 4,5 mg ble innført i og eluert fra en kolonne av BioGel Ag-50 ione-by ttekarpiks . Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorbans ved 250 nm ( ) og med henblikk på aktivitet i MLC ( ). Fig. 6 viser virkningen av 2-merkaptoetanoIkons entrasjonen på aktiviteten av G-25 stimulatorpoolen. En murin MLC ble satt opp ved forskjellige konsentrasjoner av 2-merkaptoetanol og en konstant mengde G-25 stimulatorpool , nemlig 20 yg/ml. Innarbeiding av H-tymidin i kontroll-kulturene (o—o) og G-25 stmulatorholdige kulturer (0--0) ble bestemt. Fig. 7 viser ko1onneprofi 1en for G-25 stimulatorenpoolen på en BioGel P-2 kolonne. En 10 mg prøve av den akive pool ble innført i en 1 x 45 cm kolonne av BioGel P-2 som var bragt i likevekt i 0.05 M NH40H, ved pH 10,2 og eluert med det samme middel. Fraksjonene ble undersøkt med henblikk på absorbans ved 250 nm ( ) og med henblikk på aktivitet i MLC ( ). Pilene er A lik s t o r f e s e r uma lbumin , og B lik natriumklorid•

Den immunosti mulerende faktor ifølge oppfinnelsen er isolert fra storfetymusvev, spesielt frossen kalvetymus eller tørket avfettet kalvetymus. Det sistnevnte materiale

oppnås fra Viobin Corporation i Monticello, Illiois.

I det første trinn i isolereringsprosedyren blir vev fra en av kildene skåo ret i små o stykker, - f.eks. 1 cm 2 og homogenisert i 3 til 4 volumer iskald buffer ved ca. 0° til ca. 5°C ved pH 7 til 9, f.eks. 50 mM aramonium-karbonat, pH 8,5, i en Polytron homogenisator i to minutter ved lav hastighet og to minutter ved høy hastighet. Homogenatet sentrifugeres ved 26.000 til 30.000 x G i 20 til 40 minutter ved ca. 0°C til 5°C, fortrinnsvis 28.000 x G i 30 minutter, og den resulterende overstående oppløsning fjernes. Pelleten ekstraheres igjen som ovenfor, og de oppsamlede supernatanter lyof i liseres• Det lyofiliserte pulver suspenderes i vann ved ca. 0 til 5°C og en konsentrasjon på 0,2 til 0,3 g pr. ml, og absolutt etanol tilsettes langsomt ved samme temperatur under omrøring til en s lu 11 kons en t r a s j on på 50 til 60%

(volum/volum). Oppløsningen omrøres i 16 til 18 timer ved 0 til 5°C fulgt av sentrifugering ved de samme hastigheter og tidsrom som nevnt ovenfor. Den resulterende klare supernatant tilsettes langsomt til 5 til 6 volumer aceton som på forhånd er avkjølt til -5 til -10°C og holdes ved -5 til -10°C i tre til seks dager. Presipitatet isoleres, f.eks. ved sentrifugering eller filtrering, suspenderes igjen i 100 til 100 ml destillert vann eller i den samme mengde 20 nM eddiksyre og lyofiliseres ved 0 til 5°C.

Det materiale som isoleres ved denne prosedyre, er vanligvis et lysebrunt klebrig pulver som inneholder den stimulerende faktor ifølge oppfinnelsen så vel som et antall inhiberende faktorer og andre stoffer. Den ønskede faktor kan isoleres fra denne fraksjon ved ge1 f i 11rering eller ved ioneby11ekromatogra f i . For enkelhetens skyld kalles det her CTE-acetonpresipitatet .

De forskjellige prosedyrer som benyttes ved isolering, karakterisering og påvisning av brukbarheten av den stimulerende faktor ifølge oppfinnelsen skal diskuteres nærmere.

Gelfiltrering

I en ge1 fi 11reringsprosedyre føres CTE-acetonpresipitatet over Sephadex G-25 i en 90 x 2,2 cm kolonne bragt i likevekt med en sur lyofi 1iserbar buffer ved pH 4 til 5, slik som 0,1 M eddiksyre, 100 nM pyridinacetat , pH 4,5 eller 0,1 M ammoniumacetat, pH 5,0. To milliliters fraksjoner samles og undersøkes ved MLC. Resultatene med pyridin-acetatet er vist i fig. 1.

En annen ge1fi1treringsprosedyre gjennomføres på en 1 x 45 cm kolonne av Sephadex G-50 i fosfatbuf ferets salt-oppløsning, (PBS) 0,02 M fosfat,, 0,15 natriumklorid, pH 7,4, og en 1 x 45 cm kolonne av BioGel P-10 i 0,5 M ammoniumbikarbonat, pH 8,0.

For moleky1vektsbestemme1se ble de oppsamlede stimulator-fraskjoner fra G-25 kolonnen ført over en valgt BioGel kolonne med samme dimensjoner ved pH 10,2 i 0,05 M NH^OH og eluert med det samme middel.

Sphadex-produktene er en velkjent serie kryssbundne

dekstraner som er tilgjengelig fra Pharmacia Fine i Chemicals, Inc. i Piscataway, New Jersey. De finner vid anvendelse for separering av naturlige stoffer. Som vanligvis benyttet er den utvalgte Sephadex pakket i en kolonne, en oppløsning inneholdende det oppløste materiale

som skal analyseres, føres over kolonnen og elueres med et utvalgt oppløsningsmiddel eller en serie slike. Hver spesielle Sephadex separerer stoffer med spesielle molekylvektsområder. Oppløste materialer over dette

moleky1vektsområdet vil gå gjennom kolonnen i oppløsning i opp 1øsningsmiddelfronten, det såkalte "void"-volumet. Stoffer som holdes tilbake, elueres suksessivt etter hvert som mer og mer oppløsningsmiddel passeres gjennom kolonnen. De elueres etter progressivt synkende molekylvekter.

Sephadex G-10 separerer stoffer med molekylvekter fra 200 til 700 Dalton.

Sephadex G-25 separerer stoffer med molekylvekter fra 5000 til 1000 Dalton.

Sephadex G-50 separerer stoffer med molekylvekter fra 30.000 til 1500 Dalton.

BioGel P er en serie porøse polyacrylamider som benyttes for høyoppløsnings-gelfiltrering på en måte tilsvarende Sphadex-gelene. Stoffet er kommersielt tilgjengelig fra Bio-Rad Labortories i Richmond, California.

Områdene for de forskjellige typer er som følger:

BioGel P-10 separerer 20.000 til 1.500 Dalton;

BioGel P-4 separerer 4.000 til 800 Dalton;

Biogel P-2 separerer 1.800 til 100 Dalton.

Alle gelfiltreringskolonner er kalibrert med med standar-der med kjent molekylvekt og med natriumklorid. De stan-darder som benyttes i de heri beskrevne prosedyrer, er:

Standardene påvises enten ved absorbans ved 280 nm eller

ved reaksjon med ninhydrin. Elueringsposisjonen for natriumklorid bestemmes ved utfelling med surt sølvnitrat. Natriumklorid gir posisjonen for de minste molekyler

som elueres fra kolonnen. Ved vanlig bruk vil alle fraksjoner under det laveste fraksjoneringsområdet elueres ut sammen med natriumklorid.

Ionebytt ekroma t o graf i

Små ionebyttekolonner prepareres ved bruk av Bio-Rad,

AG-50 VX8 og AG-1-X8 harpikser, av ammonium- henholdsvis acetatformene. Harpiksene vaskes godt og bringes i likevekt med 10 mM ammoniumacetat ved pH 7,0. Små kolonner med et volum på ca. 8 ml prepareres i 10 ml plastsprøyter utstyrt med Luer-lokk ventiler. For analyse av den ioniske type av den stimulerende faktor blir 150 mg aceton utfelt produkt som beskrevet ovenfor, oppløst i destillert vann,

slik at ledningsevnen er mindre enn den til 10 nM ammoniumacetat, og pH-verdien justeres til 7 til 7,5. En tredjedel av denne oppløsning bringes i hver kolonne mens resten tjener som kontroll. Prøven føres langsomt gjennom kolonnen, og kolonnen vaskes med 5 kolonnevolumer 10 nM ammoniumacetat ved pH 7,0. Den ikke-tilbakeho1dte fraksjon 1yofi 1iseres, oppløses igjen i destillert vann, lyofiliseres igjen og underkastes MLC-prøving.

Bio-Rad AG-harpiksene er kryssbundne polystyrenkuler der

noen av fenyldelene er blitt substituert med ionisk funksjonelle grupper. AG-50 er en sterk kationbytteharpiks med sulfoniske grupper. AG-1 er en sterk anionbytteharpiks med kvaternære ammoniumsubstituenter. De er tilgjengelige

fra Bio-Rad Laboratoriene.

i

Storskala-ionebyttekromatografi gjennomføres på en 1 x 30 cm kolonne av AG-50 VX8 harpiks i ammoniakkform,

bragt i likevekt med destillert vann. Samlede prøver av stimulatorpreparatet fra en G-25 kolonne oppløses i destillert vann og justeres til lav ledningsevne og en pH på 5 til 6 med 0,01 acetatbuffer. Kolonnen elueres med en gradient som oppnås ved blanding av 90 ml hver av destillert vann og en 1 M ammoniumhydroksyd. Fraksjoner på ca. 2 ml samles, lyofiliseres og aktivitetsprøves ved hjelp av MLC.

Dialyse

Dialyse gjennomføres ved bruk av Spectrapor-3 dialyserør (Spectrum Medical Industries, Inc., 60916 Terminal Annex, Los Angeles 90054) med en produsentbestemt molekylvekts-grense på 3.500 Dalton. Ved likevekt holdes molekyler med en molekylvekt på over 3.500 Dalton tilbake i dialyseposen (retentatet), og de med molekylvekt mindre enn 3.500 vil gå gjennom posen, (dialysatet) . De relative mengder av aktivitet ved likevekt vil være i orhold til de relative volumer av hver fraksjon, i disse forsøk 30 ml retentat til 300 ml dialysat. For en komponent med en molekylvekt på mindre enn 3.500 vil ca. 10% forventes å bli funnet i retentatet og 90% i dialysatet.

Blandet lymfocyttkultur ( MLC)

)

Milten fjernes sterilt fra C57/BL og Balb/C-mus og anbringes i en Petri skål inneholdende celle-samlingsmedia (Earl's Balanserte Saltoppløsning inneholdende 2,5% va rmeinakti ve rt fetalkalve- eller

- humanserum, 100 U/ml penicillin, 100 yg/ml streptomycin og 100 IU/ml heparin). Milten perfuseres kort ved bruk av en 22- eller 25-nål for å fjerne røde blodceller, anbringes i

en andre skål og irriteres mildt for å fjerne mi 11lymfocy11er. De store stykker fjernes gjennom en 50-mesh duk, og lymfocyttene gjenvinnes ved sent rifugering ved 200 G i 10 min. Cellene vaskes en gang med celle-samlingsmedia og suspenderes igjen i fullprøveraedia (Minimum Essential Media, Giboco) 5% eller 10% varmeinaktivert human- eller fetalkalveserum og 5 x 10"<4>M 2-merkaptoetanol. Humanperiferblodlymfocytter oppnås fra blod gitt av frisk laboratoriepersonale. Blodet defibrineres ved risting med glasskuler og lymfocytter oppnådd ved sentrifugering gjennomen Ficole-Hypaque pute. Lymfocyttene samler seg i interfasen, vaskes ved sentrifugering med Earl's Balanserte Saltopp løsning (Gibco) og suspenderes i totalprøvemedia uten tilsatt 2-merkaptoetanol.

Toveis MLC settes opp ved tilsetning av 1,25 x 10^ celler pr. brønn fra hver rase eller donor på mikrobrønnplater (Falcon No. 30400 eller Linbro No. IS-FB-96). Platene inkuberes ved 37°C i 4 dager. Tritiert tymidin (0,5 yCi, 2 Ci/nmol) tilsettes i de siste 6 timer av dyrkningsperioden. Ved slutten av dyrkningsperioden blir utstrek-ningen av "blast"-celledannelse fastslått ved mikroskopisk undersøkelse av platene. Cellene høstes ved bruk av en Satron cellehøster, og mengden radioaktiv merkelapp som er innarbeidet, bestemmes. Innarbeiding av H-tymidin i kontrollmurin MLC i 10% humanserum er 30.000 cpm pr. brønn med et midlere standardavvik i alle prøver på 10% eller

mindre av den bestemte totale innarbeiding. Innarbeidingen i av H-tymidin er et mål på blast celledannelse og derfor et mål på immonulogisk response.

Mitogens t imule r in g

For stimulering av forskjellige lymfocytt sub-populasjoner med lektiner ble det preparert miltcellesuspensjoner som ovenfor og 2.500.000 celler av en stamme ble anbragt i hver brønn. Eksperimentelt bestemte optimale mengder mitogener ble tilsatt og inkuberingen fortsatt i 72 timer. De benyttede lektiner Con A (Difco, 0,1<y>g pr. brønn), Phytohemaglutini-M (PHA-M, Difco, 20 yg pr. brønn). og lipopolysakkarid fra Salmonella typhosa (LPS, Sigma, 1,5 g pr. brønn). Graden av blast celledannelse og merkelappinnarbeiding måles ved den samme prosedyren som er beskrevet for MLC.

Utpodinger

For dette in vivo studium av immunresponsen, ble C75/BL mottagere podet med ful1tykke1sestransplantat oppnådd fra histoinkompativ Balb/C mus. Transplantater på ca. 1 cm oppnås fra Balb/C donorer og sutureres til hjørnene av de preparerte steder på ryggen av grupper på seks C57/B1

mottagere under Halothan-anestesi. Transplantatene under-I søkes daglig både visuelt og ved beføling fra 6. dag etter poding. Et sett dyr preimmuniseres ved poding og avvisning av et tilsvarende transplantat en måned før det endelige forsøk. Statistisk analyse skjer i henhold til Students'

T-prøve for parrede populasjoner.

)

Resultatene av de ovenfor angitte studier skal beskrives i detalj slik at fagmannen vil erkjenne de karakteriserende trekk ved den immunostimulerende faktor ifølge oppfinnelsen.

ji

De biologiske aktiviteter som er til stede i CTE-acetonpresipitatet ble fastslått ved ge1fi 11rering

på kolonner av Sephadex G-25. Hele avløpet fra kolonnen undersøkes ved bestemmelse av virkningen av de forskjel-

lige fraksjoner om murin MLC i humanserum. Bruken av humanserum for å dyrke lymfoidce1ler ble observert å være vesentlig for å unngå de sterke inhiberende virkninger av polyaminer som er til stede i vevekstrakt ene.

Resultatene av undersøkelsene med pyridinacetatbuffer ved

pH 4,5 er vist i fig. 1, hvorfra det ses at den inhibe-

rende faktor elueres akkurat etter bacitracinpi len ved en<K>AVE På °»<76->

Den stimulerende faktor elueres umiddelbart bak saltet ved

en K^V£på 1,33 nær en stor 280 nm absorps jontopp. Utbyttet av stimulerende materiale som oppnås ved denne prosedyre, er ca. 1.5 mg pr. 1000 mg CTE-acetonpresipitat som ble tilført til kolonnen.

Tilsvarende resultater oppnås med kommesielt avfettet kalvetymus.

Fra elueringsposisjonen for den stimulerende faktor er det

klart at den må virke sterkt sammen med eller absorberes sterkt på Cephadex G-25 under de elueringsbetingelser som er beskrevet ovenfor.

Som vist i fig. 2 er den stimulerende faktor også sterkt

bundet til Sephadex G-50 som er bragt i likevekt med PBS

ved ph 7,4. Det ble observert i dette studium at den stimulerende faktor elueres godt ut over den molekylvekt som settes for andre tymusfaktorer. som er rapportert, og som gjelder for Interleukin-2 . Faktoren skiller seg også

fra disse aktorer fordi disse ikke er angitt å absorbere til Sephadex under disse betingelser. Disse rapporter finnes i: Goldstein, G.: Nature 247: 11-14 (1974);

Kook, A.I., Yakir, Y., and Trainin, H.:

Cell Immunol. 19: 151-157 (1975);

Dardenne, M., Pleau, J.M., Man, N.K., and Bach,

J.F.: J. Biol. Chem 252: 8040-8044,

(1977);

Low, T.L.K., Thurman, G.B., Chincanini, C.;

McClure, J.E., Marshall, G.D., Hu, S.K., and Goldstein, A.L.: Ann. N.Y. Acad. Sei. 332: 33-48 (1979);

Mier, J.W. and Gallow, R.C.: Proe. Nati. Acad.

Sei. U.S.A. 77: 6134-6138 (1980);

Gillis, J., Snith, K.A., and Watson, J.:

J. Immunol. 124: 1954-1962 (1980);

Disabato, G.: Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 79: 3020-3023 (1982); Watson, J., Gillis, S., Marbrook, J . ,Mochizuki , D., and Smith, K. A.: J. Exp. Med. 150: 849-858.

Ved pH 4,5 til 7,4 viser således den stimulerende faktor en kromatograf isk oppførsel på Sephadex-geler som distinkt er forskjellig fra tidligere beskrevne tymiske eller lymfokinfaktorer.

Et antall peptider har egenskapen kjemabsorbans på Sephadex-geler. En av teknikkene for å minimalisere dette er å benytte en polyakrylamid-geImatriks slik som BioGel ved en alikalisk pH-verdi som beskrevet av Chin og Wold: "Anal. Biochem." 16: 585 (1972). En prøve på G-25 absorbert materiale ble underkastet kromatografi på BioGel P-10 under anvendelse av 0,5 M ammoniumbikarbonat ved pH 8,0. Elueringsmønsteret er vist i fig. 3. Det 280 nm absorberende materiale ble holdt tilbake under disse betingelser på samme måte som med resultatene med Sephadex G-25- og Sephadex G-50 kolonnene. Den stimulerende aktivitet ble også holdt tilbake, noe som antydet den sterkt absorberende evne for den stimulerende faktor.

Ut fra det ovenfor anførte kan det konkluderes med at den stimulerende faktor ifølge oppfinnelsen sterkt adherer til enhver Sephadex ved pH 4,5 til 8,0 og til enhver BioGel ved ved pH 8,0.

Når Chin og Wold's teknikk ble benyttet under sterkt basiske betingelser, ble den stimulerende faktor eluert ut før saltet på en BioGel P-2 kolonne som vist i fig. 7. I dette forsøk ble 10 mg av en G-25 stimulerende pool ført over en 1 x 45 cm kolonne med BioGel P-2 som var bragt i likevekt med 0.05 M NH^OH ved pH 10,2. Fraksjonen ble eluert med den samme reagens. Et resultat av denne behandling er at faktoren er spaltet i to fraksjoner. Mønsteret i fig. 7 antydet at en av disse fraksjoner har en molekylvekt på ca. 1400 Dalton og den andre en molekylvekt på mindre enn 1400 Dalton, men ikke mer enn 100 Dalton. Betydningen av opptreden av to fraksjoner under disse sterkt basiske betingelser er ikke helt forstått. Det kan være at faktoren ifølge oppfinnelsen virkelig inneholder to fraksjoner eller at den spaltes i to fraksjoner ved sterk alkalisk behandling.

Uttrykket "adherer sterkt" slik det benyttes i beskrivelse og krav betyr at faktoren eluerer etter en natrium-kloridmarkør på en Sephadex-kolonne ved pH 4 til 8.

For dialysestudie ble en prøve G-25 pool tatt opp i 0,1 M ammoniumacetat, pH 5,0. Retentatet og dialysatet ble frysetørket og prøvet med MLC. Det ble funnet at 13% av aktiviteten var i retentatet og 87% av aktiviteten idialysatet. Dette påviser klart av den immunostimulerende faktor passerer gjennom dialyserøret med en 3.500 Dalton sperregrense.

Arten av den stimulerende aktivitet er undersøkt ved forskjellige forsøk. I det første ble CTE-aceton presipitert materiale underkastet analyse på små kolonner av ionebytteharpikser . Den CTE-acetonpresipiterte fraksjon ble bragt på små kolonner enten av en anion (AG-1)- eller en kation (AG-50) bytteharpiks ved pH 7. Fraksjonen som ikke ble tilbakeholdt av kolonnen, ble undersøkt for sin virkning på MLC. Som vist i fig. 4 stimulerte fraksjonen som ikke ble holdt tilbake av AG-1 harpiksen i betydelig grad<3>H-tymidin innarbeiding i MLC. Mikroskopisk under-søkelse viste åpenbar økning i antallet blast-celler ved slutten av dyrkningsperioden sammenlignet med kontroll-prøven. Fraksjonen som ikke ble holdt tilbake av AG-50 kolonnen viste en så å si tre gangers økning av den totale inhiberende aktivitet. Dette var åpenbart resultatet av fjerning av stimulerende aktivitet til stede i den urene CTE-acetonprecipitatf raksjon. Med dette bekreftes også resultatene med G-25 kolonnene som antyder nærvær av både stimulerende og inhiberende aktivitet i ekstraktene.

Den G-25 stimulerende pool ble også underkastet behandling på ionebytteharpiks, AG-50, bragt i likevekt med destillert vann. Elueringsprofi len er vist i fig. 5. Den stimulerende aktivitet ble klart separert fra resten av det 280 nm absorberende materiale som ikke ble forsinket av kolonnen under disse betingelser. Resultatene antyder at den stimulerende faktor ikke binder seg til en anione-bytteharpiks og holdes tilbake kun i lett grad av en kationby11eharpiks . Fra disse resultater kan det konkluderes at den stimulerende faktor har et nøytralt eller lett basisk isoelektrisk punkt, dvs. ca. 7,0 til 7,8.

Den G-25 stimulerende pool øker DNA-synteti ske respons både for murin- og humanlymfocytter overfor antigener i toveis MLC. Stimuleringen kan være signifikant, opp til fem ganger, avhengig av dyrkningsbetingelsene. Den midlere to gangers stimulerende dose ved G-25 trinnet er 10 til 20 y g/ml for en murin MLC i 10% humanserum. Som vist i tabell 1 blir responsen for murin og humanlymfocytter i MLC og murinlymfocytter til en suboptimal dose av Con A signifikant stimulert. Stimulering av mur inlymf ocyt ter ved LPS ble ikke signifikant øket ved nærvær av stimulatoren. Det er åpenbart at stimulatoren kun virker ved T-celle medierte responser.

Den G-25 stimulerende pol har også en virkning på prolife-rering av murinelukemia, L1210, slik som vist i tabell 10. Dette antyder at faktoren kan ha en direkte mitogen virkning på kontinuerlig delende celler.

Det er vist at murinlymfocytter krever tiolforbindelser

for maksimal reponse, (Broome et al> J. Exp. Med. 138: 574

(1973). En måte en stimulerende faktor kunne virke på,

kunne være på noen måte å modifisere disse nødvendige tioler. For å undersøke denne mulighet bleen murin MLC

satt opp med forskjellige konsentrasjoner av 2-merkaptoetanol og sammenlignet med en konsentrasjon av G-25 stimulatorpool som på forhånd var vist å gi en to

gangers stimulering under standard prøvebetinge1ser. Disse resultater er vist i fig. 6 som antyder at ved enhver 2-merkaptoetanol-konsentrasjon ved hvilken- det er en<3>H-tymidinarbeidning signifikant over bakgrunnen, dvs. en signifikant response på alloantigener av miltcellene, øket stimulatoren responsen. Stimulaoren var altså aktiv over et vidt område 2-merkaptoetanolkonsentrasjoner. Dette viser at endring av tiolnivåene ikke er involvert i stimulator-virkningen. Det bekrefter også resultatene med human MLC som ikke krever 2-merkaptoetanol i mediet for reaktivitet.

Forsøk med forskjellige mengder G-25 stimulatorpool

ble tilsatt ved forskjellige tidsrom eller fjernet på forskjellige tidsrom etter initiering av MLC er vist i tabell 2, 3 og 4. Resultatene viser at virkningen av stimulatoren var reversibel opp inntil det punkt der mikroskopisk synlige lymfoblastcelier er til stede i kulturene, 72 timer (tabellene 2 og 3), og at denne stimulator kun behøvde å være til stede de siste 24 timer eller mindre av dyrkningsperioden (tabell 4). Alle disse resultater er konsistente med at målecellen for den stimulerende faktor er lymfoblasten selv. Dette skiller denne faktor klart fra andre tymiske faktorer som hovedsakelig stimulerer maturering av umodne T-celler.

Det er observert at G-25 stimulatorpoolen syntes å virke

mindre bra ved toveis MLC imediainneholdende 10% fetalkalveserum enn i mediainneholde 10% humanserum. Når

en toveis MLC av murinlymfocytter ble gjennomført i 5% fetalkalveserum, under hvilke betingelser det totale tymidinopptak er ca. 60% av det som kan vises ved 10% fetalkalveserum, kunne nå stimulatoren øke det totale tymidinopptak av disse kulturer til det som ble observert ved 10% serum. I 1% FCS kunne G-25 stimulatorpoolen ved en konsentrasjon av 40 Pg/ml øke responsen til det som ble observert 20% FCS. På denne måte kan stimulatoren partielt erstatte serumbehovet ved MLC.

Det er vist at museserum inhiberer efektiviteten for T-cellevekstfaktoren, Interleukin-2, Hardt et al: 42: 363

(1982). Forskjellige konsentrasjoner av samlet museserum sammen med forskjellige konsentrasjoner av G-25 stimulatorpool ble tilsatt til toveis murinblandet lymfocyttkultur i 5% humanserum. Det er ingen tegn på at dette museserum ved noen konsentrasjon hadde en inhiberende virkning mot den stimulerende evne ved enhver konsentrasjon av den stimulerende faktor. Dette tjener ytterligere til å skille den tymiske stimulator ifølge oppfinnelsen fra Interleukin-2.

Et viktig trekk ved den immunstimulerende faktor er virkningen in vivo. Evnen for G-25 stimulatorpoo1 en til å akselerere avvisning av histoinkompati ble hudpodinger hos mus er undersøkt. Resultatene er vist i tabell 5. Ved to forskjellige doser akselererte den partielt rensede stimulator i vesentlig grad avvisningen av transplantatet. I det andre forsøket avviste de behandlede muse-transplantatene i en grad sammenlignbar med for immuniserte kontroller. Ved de benyttede doser var det ingen synlige toksiske virkninger.

Reverserbarheten ble bestemt ved inkubering av 1 x 10^ miltceller av hver type i 1,6 ml standard kulturmedium pluss elle minus den antydede konsentrasjon av G-25 stimulatorpool i 3 ml piastkulturrør. Etter 24 timer ble alle rør sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter for å oppnå pellets av cellene, og mediet ble sugd av fra et sett av rør og erstattet med et likt volum på forhånd oppvarmet medium uten stimulator. Diosse rør ble sentrifugert og mediet erstattet igjen. Etter denne prosedyre ble rørene bragt tilbake til inkubatoren i ytterligere 72 timer. Ved slutten av inkuberingen ble cellene suspendert igjen og 0,2 ml andeler anbragt i mikrotiter-brønner for mikroskopisk undersøkelse, merking og høsting på vanlig måte.

4-1

4-1 I rrj H

UJ -H

i—I4-1

•H

-P CU

4J CU 01 iH -H

h a o0)

O TJ

Pu

U U

0 CU +J 4-<1>4-> rH CU g 4J

•H CU

4-<>>10

CU

in g

(N

1 CU O rH 0)

TJ CU C CU

CU iH e -H

a)

<D CJ

TJ

0)

TJ G

>h <D 4J U C 3 rrj4-1

i—I C 3 cu

TJ

en td o

Cn a c di o u

CU

-P -H

4- 1 4J rrj -H cn c

•H

cu

XI CU

4-1 M4-1

CU CU

-8. g u o Dj S-i

00

U TJ

S4-1

C CU

•H4-1 5- I4-1 g en

cTJ ra i-i Cn rrj 4-) C

TJ CU -H C TJ C

rrj4-1 4-) orfl 0) CO Qjcn

Hudpoding ble gjennomført som beskrevet ovenfor. Behand-

lede mus fikk de angitte mengder G-25 stimulatorpool.

f

Signifikansen ble bestemt ved bruk av Students' T-prøve.

Isoleringen og den biologiske karakterisering av en ny immunostimulerende faktor fra storfetymus er beskrevet. I den i dag foretrukne isolasjonsprosedyre ekstraheres denne faktor fra frisk eller kommersielt avfettet og tørket tymuspreparat med en basisk buffer fulgt av oppløsning i 60% etanol og utfelling med kald aceton. Rensingen kan skje på Sephadex- eller BioGel kolonraner ved valgte hydrogenionekonsentrasjoner. Den biologiske aktivitet for faktoren, selv når den kun er partielt renset, ligger i dens evne til å stimulere den DNA-syntetiske respons og antall resulterende blast celler både av murin og human T-lymfocytter som gir response på alloanti genstimulering. G-25 stimulatoren hadde ingen synlig virkning av murin B-lymfocyttresponsen til polyklonalmitogen LPS. Rever-sibi litetsforsøkene som er beskrevet ovenfor, viser at faktoren virker meget sent i MLC, etter eller under dannelsen av morfologisk erkjennbare lymfoblaster i kulturene. Den stimulerende virkning er totalt reversibel hvis, faktoren fjernes før utløp av 72 timer MLC, men ikke etter 96 timer. I tillegg vil faktoren stimulere MLC hvis den tilsettes så sent som 72 timer etter oppstarting. Den stimulering som oppnås, er lik nivået av stimulering som oppnås hvis faktoren er til stede kontinuerlig.

Den viktigste biologiske virkning av faktoren er evnen til å stimulere en in vivo immun response. I det benyttede modellsystem avviste de behandlede mus allogentransplanta-ter i en grad sammenlignbar med den for f or immuni s e r t e dyr. Dette er muligens den maksimale grad som kan oppnås i denne type sterkt histoinkompatible system. Det skal bemerkes at disse resultater ble oppnådd hos helt immunokomponente, voksne mus med respons på en sterk antigenisk stimulus.

De heri beskrevne kjemiske og biologiske resultater viser at den stimulerende faktor ifølge oppfinnelsen skiller seg fra andre kjente tymiske hormoner og fra Interleukin-2. Den følgende tabell 6 oppsummerer de mest betydelige av disse distinksjoner. Den immunostimulerende faktor ifølge oppfinnelsen kan oppnås i meget renset form i henhold til den heri beskrevne prosedyre. Imidlertid er det ikke vesentlig at det er total renhet for å oppnå den ønskede terapeutiske virkning. Preparater inneholdende faktoren kan isoleres og benyttes alene eller i forskjellige farmasøytiske sammen-setninger for å oppnå et terapeutisk nivå for faktoren i pattedyr- eller fugleblod eller vev som er effektivt med henblikk på å gi en immunostimulerende respons.

Flere forskjellige kommersielt tilgjengelige faktorer med immunostimulerende aktivitet ble prøvet i MLC systemet. Resultatet av disse prøver er vist i tabell 7. Dosen ble valgt for å dekke det området som syntes å være optimalt basert på studier av de publikasjoner som vises i tabellen og andre standa rdbetraktninger. a) kontroll MLC verdi med kun saltoppiøsningsti 1setning.

b) standard G-25 aktiv immunostimulatorpool.

c) Interleukin-2, Collaborative Research, oppnådd fra

Con A stimulerte "rat-table" supernatant ved ammonium-su1fatutfe11ing og DEAE-Sephadex. Enheter som definert ved aktivitet mot rausesytotoksisk T-lyrafocytt1inje.

(Rascett et all Blood 57, 399 (1981); Mier et al Proe Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77, 6134 (1980); Di Sabato

Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 79, 3020 (1982)).

d) Epidermisk vekstfaktor, Collaraborative Research. Ingen angitt immunomodulerende aktivitet, men adborbe-rer til BioGel P-10, Savage et al, J. Biol, Chem. 247,

7609 (1972).

e) Thymopoietin II aktiv peptidfragment, United States Biochemica1s, syntetisk peptid (Goldstine Nature

(London) 274, 11 (1974); Schlesinger et al, Cell 5,

367 (1974)).

f&g) Facteur Thymique Serique, syntetisk peptid, Pen-ninsula Labs. Komplekset med Zn er den rapporterte aktive form for det syntetiske peptid (Dardenna et al,

Trans, Proe. XIV 509 (1982)).

h) Tufsin, Vega Biocheraicals, syntetisk tetrapeptid,

vist å stimulere makrofager, Nishioka et al, Bio-

chem. Biophys. Res. Comm. 47, 172 (1972).

i) Levamisole, Sigma Chemical Co., syntetisk forbindelse med immunomodulerende egenskaper, Hadden, J.W. i The Pharraacology of Immunoregulation. Eds. Werner, G.H.

og Floch/h, F. Academis Press, (1978) side 369 og f ølgende.

Slik det fremgår av tabellen viste kun lymfokin IL-2 noen økende virkning. Således var det, slik det fremgår av den neste tabell, en meget sterk synergistisk virkning av de to faktorer. Det er åpenbart at preparater inneholdende både den immunostimulerende faktor ifølge oppfinnelsen og IL-2 er verdifulle ved behandling av pasienter som har bevhov for immunostimulering. Slike preparater vil karakteristisk inneholde fra 10 til 90 vekt-% IL-2, beregnet på den totale vekt av de immunostimulerende faktorer. Preparatene kan inneholde hvilken som helst av de vanlige farmasøytiske midler.

Produktene ifølge oppfinnelsen, dvs. faktoren i meget ren form, salter av faktoren eller isolerte fraksjoner inneholdende faktoren, er brukbare terapeutiske midler for pattedyr og fugler og er effektive med henblikk på stimulering av en immunrespons hos pasienter som trenger slik behandling.

Den immunostimulerende faktor ifølge oppfinnelsen er brukbar ved behandling av enhver fjærfe- eller pattedyr-sykdom forbundet med depresjon av cellemediert immunitet. Alvorlige virale, bakterielle eller fungale infeksjoner henger ofte sammen med slike depresjoner. Faktoren kan benyttes for å øke virkningene av standard terapi som vanligvis benyttes for slike infeksjoner.

Faktoren er spesielt verdifull for å understøtte stimulering av immunresponsen hos pasienter som får stråle-behandling eller kjemoterapi for behandling av alvorlige sykdommer.

Den er også brukbar med henblikk på å beskytte subjekter under slike belastninger at de kan få infeksjoner som de vanligvis er i stand til å motstå. Karakteristiske eksempler på en slik anvendelse er beskyttelse av dyr mot trans portfeber, eller beskyttelse av mennesker etter kirurgi.

Legen eller veterinæren vil bestemme den dosering som vil være mest egnet i et spesielt tilfelle. Den kan variere fra pasient til pasient, avhengig av pasientens størrelse, behand1ingsti1standen og andre faktorer som lett bedømmes av disse fagmenn. For kontinuerlig administrering i lengre tidsrom til individer med alvorlige eller mindre metabolske abnormaliteter eller mi 11ektomiserte individer, vil produktene vanligvis foreligge i forskjellige doseringsformer som varierer fra relativt store for å bygge opp et øyeblikkelig blodnivå til relativt små for å opprettholde et effektivt nivå. For intermitterende behandling for å bekjemte akutte eller kroniske infeksjoner kan det være varierende doser.

Vanligvis vil dosen være innen området 0,1 til 0,5 mg pr. kilo kropsvekt. For å tilveiebringe disse nivåer kan det fremstilles doseringsenhetsformer inneholdende fra 0,05 til 0,25 mg aktivt produkt. Doseenhetsformen kan som antydet ovenfor i tillegg inneholde fra 0,005 til 0,225 mg IL-2.

Produktene ifølge oppfinnelsen kan inngis alene, men vil vanligvis inngis sammen med farmasøytisk aksepterbare, ikke-toksiske bærere, hvis andeler bestemmes av egnetheten og den kjemiske arten av den spesielle bærer, den valgte inngivelsesvei og standard farmasøytisk praksis. Ved bekjempelse av forskjellige infeksjoner eller ved opprett-holdelse av terapeutisk effektive nivåer i blodet eller vevet, kan intravenøs eller intramuskulær inngivelse gjennomføres.

Claims (6)

1. Immunostimulatorfaktor som kan isoleres fra storfetymus og i form av et peptid, karakterisert ved a) sterk adhesjon til Sephadex og BioGel-P ved pH 4,5 til 8, b) et isoelektrisk punkt på ca. 7,0 til 7,8, c) stimulering av DNA-syntetisk respons av både murin- og humanlymfocytter til al1oanti genstimuler ing i en toveis MLC, d) ikke signifikant økning av stimulering av murinmi1tlymfocytter ved beta-lipopolysakkarider, e) evne til å øke immunostimulatorisk respons sogar i nærvær av 2-merkaptoetanol, f) totalt reversibel MLC hvis den fjernes opptil 78 timer fra begynnelsen av MLC, g) virker mer effektivt i MLC inneholdende 10% humanserum enn i MLC medium inneholdende 10% fetal-ka1ve s e rum, h) evnen til å øke immunostimulatorisk respons i MLC, sogar i nærvær av museserum, i) evnen til å akselerere avvisning av histoinkompatible hudtransplantater i mus, j) evnen til å gå gjennom dialyserør med en sperregrense på 3.500 Dalton, k) spalting i to immunostimulator i ske fraksjoner der den ene molekylvekt er ca. 1400 Dalton og den andre er mindre enn 1400 Dalton ved ge1f iltrering ved en pH-verdi på 10,2 i 0,05 M ammoniumhydroksyd.

2 . Fremgangsmåte for fremstilling av en immunostimulatorisk faktor fra storfetymus, karakterisert ved at den omfatter: a) å ekstrahere tymusvev med vandig buffer ved pH 8,5 og ca. 0 til 5°C, b) sentrifugering av homogenatet ved 26.000 til 30.000 x g i 20 til 40 minutter ved ca. 0 til 5°C, c) reekstrahering av pellets opphold fra trinn b) som i trinn a) og sentri fugering av homogenatet som i trinn c ) , d) samling supernatanter fra trinnnene b) og c) og lyofilisering, e) suspendering av lyofilisert pulver i vann fra ca. 0 til 5°C og en konsentrasjon fra 0,25 til 0,3 g/ml og langsom tilsetning av absolutt etanol under omrøring til en slu11kons entrasjon på 50 til 60% (volum/volum), f) omrøring i 16 til 18 timer ved 0 til 5°C og sentrifugering ved 26.000 til 30.000 x g i 20 til 40 rainu 11 er, g) tilsetning av supernatant til 5 til 6 volumer aceton ved ca. -10 til -5°C og henstand i 3 til 6 dager ved ca. -10 til -5°C, h) separat utfelling, suspendering i ca. 100 til ca. 100 ml destillert vann eller den samme mengde av ca.

20 mM eddiksyre og lyofilisering ved 0 til 5°C, i) opplø sning av lyofilisert pulver i en buffer ved pH 4,5 til 8 og separering over Sephadex eller BioGel, bragt i likevekt med den samme buffer, j) samling av fraksjoner og prøving ved MLC for å velge de fraksjoner som har immunostimulatorisk aktivitet.

3. Farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk aksep-tabel bærer og en mengde som er effektiv til å danne en immunostimulatorisk response av en immunostimulatorisk faktor isolerbar fra storfetymus i form av et peptid, karakterisert ved : a) sterk adhesjon til Sephadex og BioGel-P ved pH 4,5 til 8, b) et isoelektrisk punkt på ca. 7,0 til 7,8, c) stimulering av DNA-syntetisk respons av både murin- og humanlymfocytter til a 11oanti genstimu1ering i en toveis MLC, d) ikke signifikant økning av stimulering av murinmi11lymfocy11er ved beta-1 i popolysakkari der , e) evne til å øke immunostimulatorisk respons sogar i nærvær av 2-merkaptoetanol, f) totalt reversibel MLC hvis den fjernes opptil 78 timer fra begynnelsen av MLC, g) virker mer effektivt i MLC inneholdende 10% humanserum enn i MLC medium inneholdende 10% fetalkalveserum, h) evnen til å øke immunostimulatorisk respons i MLC, sogar i nærvær av museserum, i) evnen til å akselerere avvisning av histoinkompatible hudtransplantater i mus, j) evnen til å gå gjennom dialyserør med en sperregrense på 3.500 Dalton, k) spalting i to immunostimulatoriske fraksjoner der den ene molekylvekt er ca. 1400 Dalton og den andre er mindre enn 1400 Dalton ved ge1f i 11rering ved en pH-verdi på 10,2 i 0,05 M ammoniumhydroksyd.

4 . Farmasøytisk preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at det foreligger i enhetsdoseform.

5 . Farmasøytisk preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at den videre inneholder IL-2.

6. Doseenhetsform som i krav 4, karakterisert ved at den i tillegg inneholder IL-2