NO843816L - Fremgangsmaate ved fremstilling av basiske heptapeptid-vasopressinantagonister - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter ved fremstilling av bestemte basiske cykliske heptapeptider og heksapeptider som er vasopressin-antagonister. Mere spe-

sielt har strukturene til disse cykliske peptider en l-(3~merkapto-3 i3-cykloalkylen)-propionsyre og fem aminosyreen-heter cyklisert til en 6-enheters ring ved hjelp av et svovel som stammer fra cystein-enheten og et svovel fra propion-syreenheten, idet ringen videre har en karakteristisk ba-

sisk amino-alkyl- eller guanidinoalkylhale som er knyttet ved en amidbinding til 6-cystein-enheten til ringen, enten direkte eller gjennom en annen aminosyre.

Bakgrunn for Oppfinnelsen

M. Manning, W.H. Sawyer og medarbeidere har publisert en

rekke artikler som beskriver forskjellige [1-(3-merkapto~3,3-cyklopentametylenpropionsyre), 4-valin]-arginin-vasopressin-typer som har anti-vasopressin*-aktivitet. Blant disse er Nature, 308 652 (1984), såvel som US-patentene nr. 4.367.225 og 4.399.125.

Alle Manning-forbindelsene har en peptidhale knyttet til di-sulEidringens 6-enhet. De foreliggende forbindelser adskiller seg fra disse ved at de er heksapeptider som har en basisk hale knyttet til 6-enheten og som også har sterk vasopres-

sin antagonisk-aktivitet.

I foreliggende beskrivelse og krav anvendes den vanlige no-menklatur på området peptid- og vasopressin-kjemi. Når ingen konfigurasjon er angitt, foreligger aminosyreenheten i L-form, dvs. naturlig forekommende form. I bestemte struktur-formler tilføyes for klarhetens skyld tio-elementene til Cap og Cys enhetene.

Visse av peptidtypeangivelsene som brukes her er de følgende: Cap, 3~nierkapto-3/ 3_cyklo-alkylenpropionsyre; Pmp, 3-merkapto-3 i3-cyklopentametylenpropionsyre; Tyr(Alk), O-Alktyrosin; Abu, a-amino-n-smørsyre; Cad, cadaverin; Put, putrescin; Put(G), l-amino-4-guanidinobutan; Chg, cykloheksylglycin;

Cha, cykloheksylalanin; Pba, a-aminofenylsmørsyre; Gin, glut- aminsyreamid eller glutamin; Gly, glycin; Tyr, tyrosin; Phe fenylalanin; Phe(4'-Alk), 4<1->alkylfenylalanin; N-MeAla, N-me-tylalanin; Val, valin; Ile, isoleucin; Nie, norleucin; Leu, leucin; Ala, alanin, Lys, lysin; Arg, arginin; Met, metionin; Asn, asparagin; Sar, sarkosin; Tos, tosylat; BHA, benzhy-drylamin; DIEA, diisopropyletylamin; 4-MeBzl, 4-metylbenzyl; TFA, trifluoreddiksyre; DCC, dicykloheksylkarbodiimid; Boe, t-butyloksykarbonyl; Z, benzyloksykarbonyl; VSP, vasopressin; HBT, hydroksybenzotriazol; ACM, acetamidometyl.

"Alk" betegner en laverealkyl med 1-4 karbonatomer. F.eks. kan disse eventuelt være knyttet til oksygensubstituenten til en tyrosin-enhet i 2-stilling eller til 4<1->stillingen til en Phe-enhet i 3-stilling. Slike alkylsubstituenter innbefat-ter metyl, etyl, n-propyl, isopropyl eller butyl, Etyl er foretrukket. Når uttrykket "vasopressin" brukes, betyr det L-arginin-vasopressin (AVP) med mindre annet er angitt. l-((3-merkaptocykloalkylen)propionsyre-enheten (Cap) i 1-stilling kalles ofte her Pmp for letthets skyld, da den pentametylen-holdige enheter er foretrukket.

Beskrivelse av Oppfinnelsen

De basiske vasopressin-lignende forbindelser fremstilt under anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er illu-strert ved følgende strukturformel:

hvor NH

A er -NR-(CH l -) n -NR 2„ . eller -NR-(CH 20. ) n -NH-C(/-NR 2,';

Z er Phe, Phe(4'-Alk) eller Tyr(Alk):

X er D-Phe, D-Phe(4<1->Alk), D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Pba, D-Nle, D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D-Tyr, L-Tyr, D-Tyr(Alk) eller L-Tyr(Alk);

P er D-prov, L-Pro, A.-Pro, L-Ala, N-L-MeAla, L-

Gly, L-Sar eller en enkeltbinding;

Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Nie,

Phe, Leu eller Gly;

R er i hvert tilfelle hydrogen eller C^_^-alkyl;

n er et heltall fra 2-8, og

m er et heltall fra 0-2;

eller et farmasøytisk fordragelig syreaddisjonssalt derav.

En undergruppe av produktene fremsliltifølge foreliggende oppfinnelse omfatter forbindelser med formel I , hvori n er 5

og hver R er hydrogen som er av cadaverin-typene innenfor foreliggende oppfinnelse.

Innenfor oppfinnelsen ligger også fremstilling av addisjons-salter og komplekser av produktene, spesielt de ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable salter. Syreaddisjonssaltene fremstilles på vanlige måter i et egnet løsningsmiddel ut fra stamforbindelsen og et overskudd av en syre, såsom saltsyre', hydrogenbromid, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, malein-syre, ravsyre, etandisulfonsyre eller metansulfonsyre. Sluttproduktene med formel I har en ytterligere sterk basisk gruppe i deres strukturer, og derfor er det lett å fremstille deres syreaddisjonssaltderivater.

Forbindelsene med formel I fremstilles ved følgende reaksjon:

hvor X, A, Y, n, P og R er som foran angitt for struktur I. Cap betyr selvfølgelig enheten i 1-stilling i strukturene med formel I.

De dibasiske forbindelser (III) brukes i den kjemiske omsetning i en beskyttet form ved ett av de to basiske sentra, om nødvendig. F.eks. omsettes en forbindelse hvis struktur har en amino (-NH2) eller en sekundær amino (-NHR), hensiktsmessig som Boc-derivatet. Når guanidino foreligger i strukturen, omsettes reaktant III som et tosylatderivat som i og for seg kjent. Andre aminobeskyttende grupper, som er i og for seg kjente, kan alternativt brukes.

Omsetningen av utgangsmaterial-karboksylsyren (II) med basen (III) utføres ved bruk av enhver vanlig amid-dannende reaksjon innenfor peptidkjemien. F.eks. omsettes i det vesentlige ekvi-molare mengder av de to utgangsmaterialer i nærvær av et karbodiimid, slik som dicykloheksylkarbodiimid, pluss 1-hydroksybenzotriazol i et organisk løsningsmiddel ved romtemperatur inntil reaksjonen er fullstendig.

Beskyttelsesgruppene fjernes deretter ved i og for seg kjente metoder såsom reaksjon i nærvær av trifluormetansulfonsyre eller, trifluoreddiksyre/anisol ved romtemperatur for tosy-latet (guanidin) eller reaksjon ved bruk av trifluoreddiksyre under kolde betingelser for de Boe (amin) beskyttende grupper.

Guanidino-typene kan også fremstilles fra de tilsvarende aminoderivater direkte ved omsetning av sistnevnte med en forbindelse slik som O-metylisourea. Reaksjonen utføres normalt ved en moderat basisk pH kaldt i en vandig løsning inntil reaksjonen er fullstendig.

Utgangsmaterialene (II) for reaksjonen som er beskrevet ovenfor er en del av foreliggende oppfinnelse fordi de er nye forbindelser som også har VSP->antagonisk-aktivitet, omenn ved en meget høyere dose enn forbindelsene med formel I. Disse forbindelser fremstilles, i likhet med sluttproduktene med formel I, ved oksydasjon av det følgende lineære heptapeptid; hvor X, Z, Y, Cap og P er som definert under formel I foran, og A er OH eller som definert under formel I foran. Merkapto-gruppene er deler av Cap og Cys enhetene. Hvert Q er hydrogen eller en utskiftbar gruppe såsom acetamidometyl (ACM). Ditiolet med formel IV kan også oksyderes i form av en ester eller amidderivat av enheten i 6- eller 7-stilling. F.eks. kan amidet være -NHR, -NH2eller et A-holdig amidderivat. Sistnevnte gir, som angitt for struktur I, sluttproduktene direkte etter syklisering, som beskrevet i nærmere detalj senere, og etter fjerning av alle beskyttelsesgrupper.

Denne oksydasjon utføres ved bruk av et overskudd av et alka-limetallferricyanid, slik som kalium- eller natriumferricya-nid, med lineært mellomprodukt IV. Et passende ureaktivt løsningsmiddel, fortrinnsvis et vannblandbart løsningsmiddel ved en nøytral pH, ca. 7-7,5, anvendes. Reaksjonen utføres ved romtemperatur eller lavere inntil reaksjonen i det vesentlige er ferdig. Fortrinnsvis er konsentrasjonene av det lineære peptiddimerkaptan og oksydasjonsmidlet lave, f.eks. 0,01-0,1 molar konsentrasjon av oksydasjonsmiddel i flere liter vandig løsning for å syklisere 1-5 g dimerkaptan.

Andre milde oksyadasjonsmidler med et oksydasjonspotensial omtrent likt med ferricyanid kan også brukes for ringslut-ningsreaksjonen. Oksygen-innledning gjennom reaksjonsoppløs-ningen i flere dager eller jod i metanol er slike alterna-tiver. Syklisering forekommer også når en utskiftbar, triol-beskyttet gruppe, slik som den ved merkaptangruppen til Pmp-enheten utskiftes intramolekulært. En spesielt anvendelig tio-beskyttende gruppe er acetamidometyl (ACM). Jod/alkohol brukes for direkte, én-sats cyklisering av bis-ACM-S-lineært peptid. Selvfølgelig vil en fagmannen finne at visse cykliseringsmetoder ikke er hensiktsmessig hvis et interfe-rerende reaksjonspunkt foreligger i strukturen til utgangs-materialet med formel IV. Det lineære merkaptan-utgangsmateriale kan ha; felles beskyttelsesgrupper som temporært foreligger i de forskjellige lineære enheter. Mellomproduktene med formel IV er lett å fremstille ved bruk av fast-fase-eller flytende metoder for peptidsyntesen.

Peptid —kjeden i de lineære peptider bygges normalt opp trinnvis, med start fra P-enheten og arbeider seg mot Cap-enheten. Hver enhet beskyttes på riktig måte som kjent innenfor peptidkjemien som beskrevet nedenfor. Rekkefølgen av trinn-reaksjonene er lett å utføre i en Beckman 990B peptid-syntetisator uten isolering av hver mellomprodukt peptid. Detaljene ved fremgangsmåten ligger i utførelseseksemplene som følger senere.

De forskjellige aminosyrer (AA), som i rekkefølge tilsettes den harpiks-bårete kjede er beskyttet på kjent måte. F.eks. brukes Boc-beskyttelsesgruppen for en aminogruppe, spesielt i a-stillingen; en eventuel substituert benzyl for merkapto-gruppene ved Cap- og Cys-enhetene; tosyl for Arg-enheten; og en eventuelt substituert karbobenzoksy (B) for Tyr- eller Lys-enhetene. Beskyttelsesgruppene bør helst være slike som er lette å fjerne, dvs. ved bruk av syrebehandling for Boc-gruppen, natrium-flytende ammoniakk eller katalytisk hydro-genering for benzyl- eller karbobenzoksy-gruppene.

Det harpiksbårete peptid behandles med et overskudd av vann-fri hydrogenfluorid med en passende spaltningsforbindelse, slik som anisol, og gir det lineære peptidmellomprodukt med for IV i godt utbytte.

Sluttforbindelsene i foreliggende oppfinnelse har vasopressin antagonistaktivitet. Vasopressin er kjent for å bidra til den anti-diuretiske virkningsmekanisme i nyren. Når virkningen av disse forbindelser antagoniserer virkningen til det naturlige anti-diuretiske hormon (ADH), utskiller kroppen vann på grunn av en øket permeabilitet i endedelene av renalkanalen. Man antar at virkningsmekanismen er på vasopressinreseptorene (V2-reseptorer) som befinner seg på plasmamembranen til bestemte renal-epiteliale celler. Den mest bemerkelsesverdige farmakodynamiske virkning av ADH antagonistene i foreliggende oppfinnelse er som et vanndiure-tikum i stedet for et natriuretikum slik som hydroklorotia-zid.

Alle pasienter som lider av syndromet feilaktig antidiuretisk hormonsekresjon (SIADH) eller av en uønsket ødemtilstand kan bruke de foreliggende forbindelser. Eksempler på kliniske til-stander som krever forbindelsene i foreliggende oppfinnelse er hypertensjon, hepatisk cirrhosis, kongestiv hjertesvikt eller en del av enhver traumatisk stillling som følger av al-vorlig skade eller sykdom.

Den andre gruppe vasopressinreseptorpunkter er de vaskulære pressorpunkter (V^-reseptorer) i selve;det kardiovaskulære sy-stem. Disse kan også antagoniseres av forbindelsene i foreliggende oppfinnelse. Tyr<2->Gln^-typene med formel I er ster-ke V^-antagonister.

Forbindelsene fremstilt i foreliggende oppfinnelse brukes derfor spesielt til å behandle ødemer eller utskille vann hos pasienter med behov for slik behandling ved å gi parenteralt eller ved insufflasjon en ikke-toksisk, men effektiv mengde av den valgte forbindelse, fortrinnsvis kombinert med en farmasøytisk bærer. Doseringsenheter for den aktive bestand-del velges fra området 0,05 til 10 mg/kg, fortrinnsvis 0,1 til 5 mg/kg, base basert på en 70 kg's pasient. Doseenhetene påføres fra 1 til 5 ganger daglig.

Den farmasøytiske blanding som inneholder en aktiv antago-nistbestanddel med formel I omfatter en doseringsenhet som oppløses eller oppslemmes i en standard bærevæske,slik som isotonisk saltvann, og inneholdes i en ampulle eller et mul-tiple doseglass egnet for parenteral injeksjon slik som for intravenøs, subkutant eller intramuskulær administrasjon.

En blanding for insufflasjon kan være lignende, men admini-streres vanligvis i en måldoseapplikator eller inhalator. Pulveriserte pulverblandinger kan også brukes sammen med oljeaktige preparater, geler, puffere for isotoniske preparater, emulsjoner eller aerosoler.

Antagonistisk aktivitet mot det naturlige anti-diuretiske hormon (anti-ADH aktivitet) måles in vitro i ryggmargsvevet til svin eller menneskenyrer og in vivo i hydropenisk rotte. In vitro-målemetodene for vasopressin stimulert adenylat-cyklaseaktivering eller vasopressin-bindingsaktivitet er beskrevet av F. Stassen et al., J. Pharmacology and Experi-mental Therapeutics, 223, 50-54 (1982).

I forsøksmetoden for måling av adenylat-cyklaseaktivitet be-32

stemmes mengden av P/cAMP som dannes uten ryggmargsmem-bran (blindprøven). Blindprøveverdien trekkes fra alle eks-perimentielle data. Forbindelsens virkning undersøkes på ba-sal adenylat-cyklaseaktivitet og/eller vasopressin-stimulert aktivitet. Hver måling utføres in triplo. Ka-verdien utle-des fra en Lineweaver-Burke plotting. Rel. V , = (V ,

c3 maks. maks. dr<oge/V>"maksvasopressin) x 100. Ki = 1/ [Ka1 /Ka)-1 ] , hvor I er konsentrasjonen av antagonisten, og Ka' og Ka er konsentrasjonene av vasopressin som kreves for å gi den halve maksimale aktivitet av adenylat-cyklase i nærvær og fravær av antagonist, henholdsvis.

I prøvemetoden for bindingsmålinger, måles in triplo mengden av<3>H-vasopressin bundet uten og med et overskudd av vasopressin (7,5 x 10 — 6M) . Disse verdier representerer total og ikke-spesifikk binding henholdsvis. KB for en forbindelse ut-ledes fra ligningen for kompetitiv inhibering: KB - ICg0</>(<l><+>L/KrO , hvor ICr. er den nødvendige konsentrasjon for 50% 3 -9

inhibering av H-vasopressin (I<D= 3,6 x 10 M; 1 SD = 0,4

x 10 ^M). Dette er den gjennomsnittlige KD-verdi målt på 3 preparater av svinenyremembraner.

Målingen av anti-ADH aktivitet in vivo er hydropenisk rotte-forskrift beskrevet nedenfor:

Hydropenisk Rotteundersøkelse

Mat og vann tas vekk fra hannrotter ca. 18. timer før utprøv-ningen. Dyrene holdes 4 pr. metabolismebur. Ved 0 timer gis forsøksforbindelsen intraperitonealt til forsøksgruppen og et ekvivalent volum bærer gis til begge kontrollarupper (fa stede og ikke-fastede). Urinvolum og osmolalitet måles hver time i 4 timer. Forsøksverdier registreres som ml utskilt urin (kumultativ), milliekvivalenter/rotte-elektrolytt ut-'skilt, mg/rotte-urea utskilt, og osmolalitet i milli-osmol/ kg H^O. En toleranseprøve brukes for å bestemme signifikan-sen. Ed^QQer definert som den dose av forbindelsene (jug/kg) som er nødvendig for å senke urin-osmolalitet til 300 m-osmol/ kg.

De følgende eksempler er bare ment for å beskrive fremstil-lingen av forbindelsene. Temperaturene er angitt i grader Celsius.

EKSEMPEL 1

Fremgangsmåte for generell syntese av de cykliske mellom-produktsyrer (II) : Boc-Pro-Merrifield harpiks ble fremstilt ved kobling av Boc-Pro til Merrifield harpiks ved bruk av cesiumsaltmetoden som gir Boc-Pro-OCr^CgH^-harpiks som ble brukt som utgangsmateriale for syntesen. Syntesen ble utført på Beckman 990B peptid-synteseapparat ved bruk av følgende forskrift. Tre ekvi-valenter av aminosyrene ble oppløst i passende løsningsmid-ler [Boc-derivater av 4MeBzl-Cys, Val, Phe og 4-MeBzl-Pmp i metylenklorid, Asn i dimetylformamid, X slik gom D-Tyr (Et) eller BrZ-D-Tyr i 1:1 metylenklorid/dimetylformamid og ble koblet ved bruk, aven ekvimolar mengde av dicykloheksylkarbodiimid (DCC) og 1-hydroksybenzotriazol (HBT) bortsett fra koblingen av 4MeBzl Pmp, hvor 1,0 ekvivalent dimetylamino-pyridin ble brukt som katalysator. Koblingsgraden ble be-stemt ved kvalitativ ninhydrinanalyse av hver alikvot prøve og koblingene ble gjentatt om nødvendig. Boc-gruppene ble fjernet ved bruk av 1:1 trifluoreddiksyre/metylenklorid og etter vask ble det frie amin dannet ved bruk av 5% diisopropyletylamin/metylenklorid. Peptidsekvensen ble undersøkt ved bruk av fastfase-sekvensering før koblingen av 4MeBzl-Pmp og dets homogenitet bekreftet. Etter sluttkoblingen ble peptidet tørket hvilket ga 2,24 g peptidharpiks i tilfellet D-Tyr(Et) ? -Pro 7-forbindelsen.

1,1 g (0,5 mmol) av D-Tyr(Et) 2 peptid-harpiksen med 3 ml anisol ble rørt 60 minutter ved 0°C (isbad) i 25 ml vannfritt flytende hydrogenfluorid (HF). HF ble så fjernet under redusert trykk ved 0°C.Resten ble vasket med etyleter (4 x 20 ml, kastet) og peptidet eluert med dimetylformamid (3 x 10 ml), 20% eddiksyre (3 x 10 ml) og 0,3 N ammoniumhydroksyd (3 x 10 ml) .

Filtratet ble satt til 2 liter gassfritt vann og pH justert til 8,1 med konsentrert ammoniumhydroksyd. En 0,01 M oppløs-ning av kaliumferricyanid ble deretter tilsatt dråpevis under røring inntil man fikk en konstant svak gulfarge (41 ml). Den resulterende oppløsning ble så ført gjennom en flash-kolonne (5 x 15 cm) med en pakning av kiselgel belagt med et C-18 silan. Kolonnen ble så vasket med 350 ml vann og peptidet eluert med 500 ml 1:1 acetonitril/vann (0,25 % trifluoreddiksyre) i 20 ml's fraksjoner.

Fraksjonene 11-17 ble slått sammen og konsentrert. Resten ble oppløst i konsentrert eddiksyre, fortynnet med vann og 2 7 frysetørket, hvilket ga 189 mg av D-Tyr(Et) -Pro peptidet, som ble brukt for syntesen for de halemodifiserte peptider uten ytterligere rensning.

Identlfisering av:

P mp- D- Tyr(Et)-Phe-Va l- Asn- Cys-Pro(OH)

Aminosyreanalyse: Peptidinnhold 55%

Aps, 1,00; Pro, 1,23; Cys, 0,35; Val, 1,04; Tyr (Et),

1,43; Phe, 1,51.

HPLC: Tilfredsstillende. (40% CH3CN i H20 med 0,25% TFA).

Prap-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro(OH)

Aminosyreanalyse: Peptidinnhold 82%

Asp, 0,97; Pro, 1,10; Cys, 0,39; Val, 1,05; Tyr, 0,99;

Phe, 0,99

HPLC: Tilfredsstillende (30% CH3CN/70% 0,05 m KH2P04, 2 ml/min., 5 juC-18, K'=6,14).

EKSEMPEL 2

1,5-diaminopentan (14,0 ml), 120 mmol) ble oppløst i tert.-butanol (70 ml) og ble behandlet dråpevis i løpet av 10 minutter med di-tert-butyldikarbonat (9,2 ml, 40 mmol). Etter tilsetningen var ferdig ble reaksjonsblandingen rørt ved romtemperatur i 16,5 timer. Reaksjonen ble så behandlet med IN natriumhydroksydløsning (vandig) (90 ml), rørt i 1 time og til slutt ekstrahert med kloroform. Kloroformekstraktene ble tørket (MgSO^) og konsentrert under vakuum. Resten ble opp-løst i vann, surgjort (pH=2) ved dråpevis tilsetning av 3N saltsyre ved 0°C, og ble vasket med eter for å fjerne det

blottlagte diamin. Den vandige del ble gjort basis (pH 10) med 5% natriumkarbonatløsning og ble ekstrahert med etylacetat og ga 1,6 g (20%) mono-Boc 1,5-diaminopentan. Strukturen ble bekreftet av lH NMR og CI-MS.

Til en løsning av D-Tyr"9-prolin-he<p>ta<p>e<p>tid<,>fremstilt som beskrevet i eksempel 1 satte man(29,7 mg, 0,0331 mmol) og mono-Boc-1,5-diaminopentan (20,2 mg, 0,0996 mmol) i dimetylformamid (400/al), dicykloheksylkarbodiimid (10,3 mg, 0,05 mmol) og 1-hydroksybenzotriazolhydrat (6,7 mg, 0,05 mmol). Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 19 timer. Dimetylformamidet ble så fjernet under vakuum. Resten ble behandlet med trifluoreddiksyre ved 0°C i 2 timer. Etter denne tid ble trifluoreddiksyren fjernet under vakuum og resten i 1%'ig eddiksyre ble ført over en"BioRex"70 (H<+>) ionebytterkolonne. De basiske produkter ble vasket av ionebytterkolonnen med pyridinpuffer (H20/pyridin/HOAc, 66:30:4) og inndampet. Sluttrensningen ved preparativ HPLC (5u ultrasfære ODS) ga 5,4 mg (17%) rent [l-(3-merkapto~3,3-cyklopentametylen-propionsyre)-2-D-tyrosin-4-valin-8-(1,5-diaminopentan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin. Strukturen til produktet ble bekreftet ved FAB-MS [(M+H) +=9 80] og aminosyreanalyse (Asp=l,00, Pro=l,37, Cys=0,37, Val=0,83, Tyr=0,83, Phe =0,86). Renheten ble kreftet ved HPLC (5p ultrasfære ODS, 4,6x250 mm; 0,05 M KH2P04(H20)/CH3CN (70:30); strømning = 1,5 ml/min.; K' = 13,7 min.

EKSEMPEL 3

Guanidering av monobeskyttet diamin (III).

Mono-Boc-1,4-diaminobutan (1,25 g, 6,6 mmol), fremstilt fra putrescin som i eksempel 2, i dioksan (2 ml) og vann (6,5 ml) ble behandlet med O-metylisourea-hydrogensulfat (<1>,25

g, 7,26 mmol) og 2N natriumhydroksyd (vandig) (3,75 ml)

ved romtemperatur. Den resulterende løsning ble rørt i 6 dager. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og resten ble gjort basisk (pH=12) ved tilsetningen av 2N natriumhydroksyd. Resten ble igjen inndampet, tatt opp i

etylacetat, filtrert og inndampet. Det rå guanidin ble tør-ket ved fordampning fra toluen og brukt uten ytterligere rensning.

Det rå guanidin (410 mg, 1,78 mmol) i 2N natriumhydroksyd (vandig) (2 ml) og vann (2 ml) ble behandlet ved romtemperatur med p-toluensulfonylklorid (340 mg, 1,78 mmol) i 18 timer. pH ble justert til 8 med 5% natriumkarbonatoppløsning. Blandingen ble ekstrahert med etylacetat og ga, etter fordampning 4 37 mg rått produkt. Rensning ved flash-kromatografi (3x15

cm kiselgelfylling 80% etylacetat/heksan) ga 265 mg (39%)

av det ønskete tosylerte produkt, hvis identitet ble bekreftet ved 1H NMR og CI-masse-spektroskopi.

Tosyl-guanidinodiaminet (108 mg, 0,281 mmol) i metylenklorid (1 ml) ble behandlet med trifluoreddiksyre (1 ml) ved 0°C i 40 minutter. Reaksjonsblandingen ble inndampet under vakuum, restens pH justert til 8 med 5% natriumkarbonatløs-ning og inndampet til tørrhet. Resten ble tatt opp i etylacetat, filtrert og inndampet. Det rå des-Boc produkt ble tørket ved fordampning fra toluen, hvilket ga 6 6 mg (82%). Identiteten ble bekreftet ved 1H NMR og brukt uten ytterligere rensning.

[1-(3-merkapto-3,3-cyklopentametylenpropionsyre)-2D-(0-etyl)-tyrosin-4-valin-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin (35 mg, 0,038 mmol) fremstilt som i eksempel 1, i dimetylformamid (0,5 ml) ble behandlet ved romtemperatur med tosyl-guanidinoamin (33 mg, 0,114 mmol), DCC (12 mg, 0,057 mmol)

og HBT (8 mg, 0,057 mmol). Blandingen ble rørt i 43 timer. Løsningsmidlet ble fjernet ved redusert trykk og resten ble oppløst i trifluoreddiksyre (2 ml), deretter behandlet ved romtemperatur med trifluormetansulfonsyre (150 pl, 1,7 mmol) og anisol (37 pl) under røring i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet, oppløst i 10%'ig eddiksyre, filtrert og ført gjennom en "BioRex"-70 kolonne. Det rå guanidin ble eluert av kolonnen med pyridinpuffer (pyridin/ vann/eddiksyre, 30:66:4), inndampet og resten renset ved preparativ HPLC (5p, ODS, CH3CN/H20/TFA 40:60; 0,25%) og

ga 6,9 mg 85% 1 ig rent [1- (3-merkapto-3, (3-cyklopentametylen-propionsyre)-2-D-(O-etyl)-tyrosin-4-valin-8-(l-amino-4-gua-nidinobutan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin. Pre-parativt HPLC av halvparten av denne rå prøve, først ved bruk av 60% 0,05 M KH2P04(vandig):40% CH3CN, og deretter ved bruk av 60% H20:40% CH3CN:0,25% TFA ga 1 mg produkt som var homogent ved HPLC og TLC og hvis struktur ble bekreftet ved FAB-MS [(M+H = 1036, (M-H)~ = 1034]. HPLC: (60% 0,05 m KH2P04:40% CH3CN), IBM 5p C-18, 4,6x250 mm, Flow 1,5 ml/min. K'=14,2 min.

EKSEMPEL 4

En oppløsning av 40 mg (0,043 mmol) D-Tyr(Et) 2-prolin, fremstilt som i eksempel 1, og mono-Boo-1,5-diaminopentan (26 mg, 0,129 mmol) i dimetylf ormamid (900 jul) ble behandlet med dicykloheksylkarbodiimid (13 mg, 0,065 mmol) og 1-hydroksybenzotriazolhydrat (9 mg, 0,065 mmol) under røring ved romtemperatur i 4 3 timer. Dimetylformamidet ble deretter fjernet under vakuum. Resten ble behandling med trifluoreddiksyre ved 0°C i 1 time. Etter denne tid ble trifluoreddiksyre fjernet under vakuum og resten i 1 % eddiksyre ble ført gjennom en "BioRex" 70 (H<+>) ionebytterkolonne. De basiske produkter ble vasket av kolonnen med pyridinpuffer (H20/pyridin/ eddiksyre, 66:30:4) og inndampet. Sluttrensning ved preperativ HPLC (5p ultrasfære ODS) ga 13 mg (30%) rent [1(3-merkapto-3,3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-valin-8-(1,5-diaminopentan)-8-desarginin-9-desgly-cinamid]-vasopressin. Strukturen av produktet ble bekreftet ved FAB-MS [(M+H)<+>=1008] og dets renhet bekreftet ved HPLC (5p ultrasfære ODS, 4,6x250 mm, 60% H20, 40% CH3CN (0,25% TFA tilsatt), K<1>= 17,9 minn).

EKSEMPEL 5

En oppløsning av 1,4-diaminobutan (10 ml, 99,5 mmol) i metylenklorid (70 ml) ble behandlet med di-tert-butyldikarbonat (7,24 g, 33,2 mmol) ved 0°C og den resulterende løsning

rørt ved romtemperatur i 71 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med kloroform (75 ml), vasket med 5% natriumkar-bonat (vandig), tørket (MgS04) og inndampet. Den rå rest ble

oppløst i et minimum av IN saltsyre (vandig) (10 ml) og vasket med eter (2x). Den vandige fraksjon ble gjort basisk (pH=10) med 2N natriumhydroksyd (vandig) og ekstrahert med etylacetat. Ekstraktet ble tørket (MgSO^) og inndampet hvilket ga 821 mg (13%) rent t-Boc-putrescin-(1,4-diaminobutan) hvis struktur ble bekreftet av 1H NMR og CI-MS [(M+H)<+>=189].

En oppløsning av 48,6 mg (0,0526 mmol) av D-Tyr(Et)<2->proli-net, fremstilt som i eksempel 1, og mono-t-Boc 1,4-diaminobutan (30 mg, 0,158 mmol) i dimetylf ormamid (500/al) ble behandlet med dicykloheksylkarbodiimid (16 mg, 0,079 mmol) og 1- hydroksybenzotriazolhydrat (11 mg, 0,079 mmol), deretter rørt ved romtemperatur i 114 timer. Dimetylformamidet ble fjernet under vakuum. Resten ble behandlet med trifluoreddiksyre ved 0°C i 2 timer. Trifluoreddiksyren ble fjernet under vakuum og resten i 1%'ig eddiksyre ble ført gjennom en "BioRex" 70 (H<+>) ionebytterkolonne. De basiske produkter ble vasket av ionebytterkolonnen med pyridinpuffer (H^O/pyridin/eddiksyre, 66:30:4) og inndampet og ga [1-(3~merkapto-3,3_cyklo-pentametylenpropionsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-valin-8-(1,4-diaminobutan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin. Sluttrensning med prep HPLC (5/i ultrasfære ODS) ga 19 mg

(36%) rent produkt. Produktets struktur ble bekreftet ved FAB-MS [(M+H)<+>=994, (M-H)~=992] og aminosyreanalyse (Asp= 1,00, Pro=0,98, Cys=0,73, Val=0,94, Tyr=0,86, Phe=0,94). Renheten ble bekreftet med HPLC (5/a ultrasfære ODS, 4,6x250; 60:40, 0,05 MKH2P04:CH3CN, k'=ll,2 min; gradient 80:20 til 60:40, 0,05 MKH2<P>04:CH3CN; k'=41,3 min).

Ved å anvende O-metyl-L-tyrosin i den kjemiske fremgangsmåte ovenfor får man (1-(3-merkapto-3,3-cyklopentametylenpropion-syre)-2-(O-metyl-L-tyrosin)-4-valin-8-(1,4-diaminobutan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin. Under bruk av lignende beskyttet 3_(S-benzyl-merkapto-3,3-cyklotetrametylen)-propionsyre i stedet for Pmp i metoden fra eksemplene 1 og 2 får man [1-(3~merkapto-3,3-cyklotetrametylenpropionsyre)-2- D-tyrosin-4-valin-8-(1,5-diaminopentan)-8-desarginin-9-desglycinamidj-vasopressin. Ved å anvende dimetylaminoetyl-amin i stedet for Boc-putrescin i eksempel 4 får man [l-(3~merkapto-3f3-cyklopenta-metylenpropionsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-valin-8-(2-dimetylaminoetan)-8-desarginin-9-des-glycinamid]-vasopressin. Ved å anvende monoformylkadaverin ovenfor etterfulgt av reduksjon av formylgruppen får man N-metylkadaverinderivatet.

EKSEMPEL 6

O-metylisoureahydrogensulfat (88 mg, 0,511 mmol) ble oppløst

i vann (3 ml) og pH justert til 10 ved bruk av 3N NaOH (vandig) . Deretter ble [1-(3-merkapto-3/3-cyklopentametylenpro-pionsyre) -2-D- (0-etyl) tyrosin-4-valin-8-desarginin-9-desglycin-amid-8-(1,4-diaminobutan]-vasopressin fra foran (8,3 mg, 0,00835 mmol) ble tilsatt i vann (2 ml). pH ble korrigert til 10 og oppløsningen ble holdt i kjøleskap i 17 dager. pH for oppløsningen ble justert til 4,5 med 1% HOAc (vandig). Oppløsningen ble strippet, tatt opp i 1:1 H^O-.CH^CN og renset ved preperativ HPLC (5ju ODS) hvilket ga 5,5 mg (64%)

[1-(3-merkapto-3,3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-(0-etyl-D-tyrosin)-4-valin-8-(l-amino-4-guanidinobutan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin. Strukturen ble bekreftet ved FAB-MS [(M+H) = 1036]. Renheten ble bekreftet ved HPLC

(5ja ODS, IBM, 4,6 x 250 mm; 60:40, 0,05 M KH2P04: CH3CH, k'

= 17,2 min.; gradient 80:20 til 50:50, 0,05 M KH2P04:CH3CN,

K' = 32,3 min..

EKSEMPEL 7

Syntese av Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(OH):

i

Tittelforbindelsen ble fremstilt ved hjelp av fast fase som beskrevet i eksempel 1, men ved brukav Boc-Cys-Merrifield harpiks som utgangsmateriale, hvilken så kobles med den rik-tige Boc-aminosyre i rekkefølge, etterfulgt av fjerning av beskyttelsesgrupper med hydrogenfluorid, idet avspaltning fra harpiksen finner sted samtidig, og deretter ble oksyda-tiv cyklisering utført som beskrevet.

Rensning:

1) C^g flash-kolonnekromatografi

2) Preparativ HPLC

Utbytte:

65 mg fra 0,5 mmol (molekylvekt 827) 65/827 x 100% = 16%

A.A. innhold: 85% basert på N analyse

FAB MS: 82 7 positivt iakttatt

825 negativt iakttatt

A.A. analyse: Asp 1 Tyr 0,98

Cys 0,4 7 Phe 0,9 4

Val 0,9 6

HPLC analyse: Én topp ved bruk av 40% CH-jCN en 0,1%' ig vandig TFA oppløsning med 5ja C^g kolonne

EKSEMPEL 8

En oppløsning av 32,6 mg (0,0394 mmol) D-Tyr(Et)-cysteinsyre, fremstilt som i eksempel 7, og mono-t-Boc-1,5-diaminopentan-(24 mg, 0,118 mmol) i dimetylformamid (1 ml) ble behandlet med dicykloheksylkarbodiimid (12 mg, 0,059 mmol) og 1-hydroksybenzotriazolhydrat (8 mg, 0,059 mmol) og ble rørt ved romtemperatur i 90 timer. Dimetylformamidet ble deretter fjernet under vakuum. Resten ble behandlet med trifluoreddiksyre (5 ml) ved 0°C i 3 timer. Etter denne tid ble trifluoreddiksyren fjernet under vakuum og resten oppløst i 10% eddiksyre, så ført gjennom en "BioRex" 70 (H<+>) ionebytterkolonne. De basiske produkter ble vasket av ionebytterkolonnen med pyridinpuffer (vann/pyridin/eddiksyre, 66:30:4) og inndampet til tørrhet og ga [1-(3_merkapto-3,3-cyklo-pentamety-lenpropionsyre), 2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-valin, 7-(l,5-diaminopentan) , 7-desprolin, 8-desarginin, 9-desglycinamid]-vasopressin. Sluttrensning ved preparativ HPLC (ved bruk av 5p ultrasfære ODS) (2 ganger) ga 4,7 mg (13%) rent produkt. Produktets struktur ble bekreftet ved FAB-MS [(M+H)<+>= 911] og aminosyreanalyse (Asp = 1,00, Cys=0,46, Val=l,01, Tyr= 0,90, Phe=0,99). Renheten ble bekreftet ved HPLC (5p ultrasfære ODS, 4,6 x 250 mm, 60:40, 0,05 M KH2P04/CH3CN, K<1>= 16,7 min., gradient 80:20 til 50:50, 0,05 M KH2P04/CH3CN,

K"^ = 32,3 min.) .

EKSEMPEL 9

Diaminoheptan (13,0 g, 100 mmol) ble oppløst i 100 ml metylenklorid.Til dette ble tilsatt 8,72 g di-t-butyldikarbonat (40 mmol) i 10 ml metylenklorid i løpet av 1 time. Etter røring ved romtemperatur over natten ble en hvit felling dannet som ble isolert ved filtrering. Den ble oppløst i IN ammoniumhydroksyd og ekstrahert med etylacetat. Etylacetatet ble vasket med vann og inndampet til tørrhet. Resten ble oppløst i 1 N natriumbisulfat, ekstrahert med etylacetat og derpå gjort basisk (pH 8-9) med ammoniumhydroksyd. Denne løsning ble ekstrahert med etylacetat. Etylacetatet ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet til tørrhet, hvilket ga en svak gul olje som størknet ved henstand. Det faste stoff ble revet med heksan, isolert ved filtrering og lufttørket, hvilket ga 350 mg (2%) , smp. 55-58°C, FAB-MS og hadde.-.proton NMR i overensstemmelse med strukturen for Boc-diaminoheptan.

25 mg Pro-OH peptid fra eksempel 1 (27 pmol) ble oppløst i

5 ml dimetylformamid. Til dette satte man 31 mg Box-diaminoheptan (135 pmol, 5 ekvi.), 18,3 mg HBT (135 pmol) og 21 pl di-isopropylkarbodiimid (135 umol). Etter røring ved romtemperatur over natten ble oppløsningsmidlet fjernet under vakuum. Resten ble oppløst i kloroform, hvilken løsning ble vasket med 1 N natriumbisulfat fulgt av mettet saltvann og deretter inndampet til tørrhet flere ganger fra kloroform. Resten ble oppløst i 4 N HCl/dioksan og rørt ved romtemperatur i 30 minutter. Etter fordampning av løsningsmidlet ble resten inndampet flere ganger fra kloroform, oppløst i vann, justert til pH 3,5 med iseddik og satt på en "BioRex" 70 kolonne (H+). Kolonnen ble vakset med vann og så eluert med pyridinacetatpuffer (30% pyridin, 6% eddiksyre). Pufferet ble inndampet til tørrhet og resten frysetørket ut av vann. Peptidet, [1-(3_merkapto-3/3_cyklopentametylenpropionsyre)-2-(O-etytD-tyrosin)-4-valin-8-desarginin-9-desglycinamid-8-(1,7-diaminoheptan)]-vasopressin ble renset ved gelfiltre-ringskromatografi på P-2 i 1% eddiksyre etterfulgt av preparativ HPLC.

EKSEMPEL 10

Fremgangsmåte for fastfasesyntese av cykliske heksapeptider med formel II: Boc-S-acetamidometyl-L-cystein knyttes til klormetylert poly-styren via cesiumsaltmetoden som forut beskrevet. Fjerning av Boe utføres med 50% TFA/metylenklorid, nøytralisering med 10% trieylamin/metylenklorid. Kobling utføres med dicykloheksylkarbodiimid/hydroksybenzotriazol (eller DCC/dimetyl-aminopyridin (DMAP) i tilfellet Pmp-rest) ifølge standard-forskrift for fastfase. Boc-L-asparagin kobles i DMF. B©c-L-valin, Boc-L-fenyl-alanin, Boc-O-etyl-D-tyrosin og S-acet-amido-metylpentametylenmerkaptopropionsyre kobles så i rekke-følge i metylenklorid. Det lineære peptid (IV) spaltes fra harpiksen med vannfritt flytende HF ved 0°C, og harpiksen vaskes med etyleter og ekstraheres deretter med 50% vandig acetonitril/1% TFA, DMF, og 0,3 N ammoniumhydroksyd. De for-enete ekstrakter inndampes til tørrhet. Resten oppløses i metanol og behandles med et overskudd av metanolisk jod ved romtemperatur for å bevirke blottlegning av sulfhydrylgruppe-ne og oksydasjon til disulfidet. Etter inndampning av løs-ningsmidlet oppløses resten i 0,3 N ammoniumhydroksyd, fortynnet med vann og frysetørkes hvilket gir det rå cykloheksa-peptid fra eksempel 7, som renses ved motstrømsfordeling etterfulgt av gelfiltrering.

EKSEMPEL 11

Fremgangsmåte for fastfasesyntese av de basisk sluttprodukter med formel I: Boc-S-(p_-metylbenzyl)-L-cystein kondenseres med karbobenzok-sykadaverin i metylenklorid under anvendelse av DCC/HOBT.

Boe fjernes med 4N HCl/dioksan og HCl-saltet nøytraliseres

med trietylamin. S- (p_-metylbenzyl) -L-cysteinyl-karbobenzok-sykadaverin kondenseres deretter med fluorenylmetyloksykar-bonyl-beta-t-butyl-L-aspartinsyre i DMF ved bruk åv DCC/HBT. t-butylesteren fjernes med 50% TFA/metylenklorid og det resulterende Fmoc-Asp-Cys (MeBz.l)-Cad-Z kobles til benzhy-drylaminharpiks ved bruk av DCC/DMAP. Etter fjerning av Fmoc-

gruppen med piperidin forlenges peptidet ifølge standard fastfasemetoden som i eksempel 1. Behandling av peptidyl-harpiksen med vannfritt flytende HF ved 0°C gir det fullstendig blottlagte 7-(1,5-diaminopentan)-heksapeptid (IV), som så oksyderes til det cykliske disulfidsluttprodukt med kaliumferricyanid i fortynnet vandig løsning som eksemplifisert tidligere.

EKSEMPEL 12

Fremgangsmåte for syntese i løsning av basiske sluttprodukter med formel I: En ekvivalent mono-karboksybenzyldiamin (n=2-8) kobles til én ekvivalent Boc-prolin i metylenklorid ved brukav 1,0 ekvivalent 1-hydroksybenzotriazolhydrat og 1,1 ekvivalent dicykloheksylkarbodiimid ved romtemperatur i 18 timer. Reaksjonsblandingen filtreres og inndampes. Det rå produkt renses ved flash-kromatografi (kiselgel) og gir rent Boc-Pro-A.

Boc-beskyttelsesgruppen fjernes fra denne bis-enhetforbin-delse ved bruk av 4N HC1 i dioksan ved romtemperatur i 1,5 timer etterfulgt av fordampning av reaksjonsblandingen til tørrhet. Hydrokloridsaltet overføres så i det frie amin ved bruk av trietylamin (1 ekvivalent) i metylenklorid eller dimetylformamid avhengig av oppløselighet. Peptidet forlenges ved koblinger i rekkefølge med Boc-cystein (S-Acm), Boc-asparagin og Boc-valin og gir tetrapeptidet, Boc-Val-Asn-Cys(S-Acm)-Pro-A. Etter fjerning av Boc-gruppen kondenseres dette tetrapeptidet med Pmp(S-Acm)-D-Tyr(Et)-Phe-OH, fremstilt ved suksessive koblinger av Boe D-Tyr(Et) og Pmp(S-acm) med Phe-OMe, fulgt av forsåpning av metylesteren med 1 N NaOH (vandig)/dioksan. Denne sluttkobling gir det fullstendig beskyttede lineære heptapeptid Pmp(S-Acm)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(S-Acm)-Pro-A.

Heptapeptidet eller heksapeptidet med formel IV cykliseres så oksydativt ved bruk av jod i metanol og gir, etter inndampning, det rå cykliske peptid, hvis terminale aminobeskyt-telsesgruppe fjernes ved behandling med vannfritt hydrogen fluorid. Sluttrensning fullføres ved motstrømsfordeling og ved kromatografi gjennom G-15 og gir sluttproduktene slik som eksemplifisert ovenfor.

EKSEMPEL 13

Ved å erstatte de tilsvarende beskyttede aminosyrer i oven-nevnte syntetiske rekkefølge får man de respektive cystein-eller prolinsyrer, de basiske peptidsluttprodukter eller et salt derav som følger: a. [1-(3~merkapto-3,3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-3-(4'-metylfenyl-alanin)-7-D-prolin-8-(1,5-diaminopentan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin

b. [1-(3~merkapto-3,3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-(0-etyl-D -tyrosin) -4- (ct-aminosmørsyre) -7- (N-metyl-alanin) - 8-(1,6-diaminoheptan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin

c. [1- (3-merkapto-3/3-cykloheksametylenpropionsyre)-2-(0-etyl-D-tyrosin)-4-cykloheksylglycin-7-L-sarkosin-8-(1,5-diaminoheptan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin d. [1-(3-merkapto-3, 3-cyklopentametylenpropionsyre)-4-glutamin-8-(1,5-diaminopentan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin

e. [1- (3-merkapto-3 1 3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-D-fenylalanin-4-valin-7-(l-amino-5-guanidinopentan)-7-desprolin-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin

f. [1- (3-merkapto-3/3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-D-a-aminofenylsmørsyre-4-isoleucin-7-D-prolin-8-(l-amino-4-metylaminobutan)-8desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin

g. [1-(3-merkapto-3/3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-D-fenylalanin-4-glutamin-7-(l-metylamino-5-propylaminopen-tan)-7-desprolin-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin .

EKSEMPEL 14

Parenteral Doseringsenhetblandinger :

Et preparat som inneholder 0,10 mg av heptapeptidet i eksempel 3, 4 eller 5 som et sterilt tørrpulver for parenteral injeksjon fremstilles som følger: 0,5 mg av peptidet opp-løses i 1 ml av en vandig oppløsning av 20 mg mannitol. Løsningen filtreres under sterile betingelser i en 2 ml am pulle og frysetørkes. Pulveret rekonstitueres før enten intramuskulær eller intravenøs injeksjon til en pasient som lider avødem mistenkt for anti-ADH virkningsmekanisme. Injeksjonen gjentas om nødvendig fra 1-5 ganger daglig eller i kontinuerlig i.v. dråpeinjeksjon.

Nasale Doseringsenhetsammensetninger:

25 mg finmalt heptapeptid fremstilt ifølge oppfinnelsen, slik som produktet fra eksempel 4, oppslemmes i en blanding av 75 mg benzylalkohol og 1,39 5 g av et suspensjonsmiddel såsom en handelsblanding av halvsyntetiske glycerider av høyere fettsyrer. Suspensjonen plasseres i en aerosol 10 ml beholder som er lukket med en målerventil og fylt med aerosol-drivmidlet. Innholdene omfatter 100 enhetsdoser som gis intranasalt til en pasient med ødem fra 1-6 ganger om dagen.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formelen (I)

hvor NH A er -NR-(CH-) -NR- eller -NR-(CH-) -NH-C-NR„; Z er Phe, Phe(4'-AlkX eller Tyr(Alk); X er D-Phe, D-Phe(4'-Alk), D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Pba, D-Nle, D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D-Tyr, L-Tyr, D-Tyr(Alk) eller L-Tyr(Alk); P er D-Pro, L-Pro,^<3-> Pro, L-Ala, L-N-MeAla, L-Gly, L-Sar eller en enkeltbinding; Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Nie, Phe, Leu eller Gly; R er, i hvert tilfelle, hydrogen eller C^ _^ -alkyl; n er et heltall fra 2-8; og m er et heltall fra 0-2; eller et farmasøytisk fordragelig syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at man cykliserer en eventuelt beskyttet forbindelse med formelen (II);

hvor: X, Z, Y og P er som foran definert;

1 2 Q og Q er hver hydrogen eller en avspaltbar gruppe; A er OH eller som ovenfor angitt; og Cap er en 3, 3-cykloalkylenpropionsyre med S-Q <1> knyttet til 3-stillingen og med 5-7 enheter i cykloalkylenkjeden, og eventuelt deretter, i enhver rekkefølge, (a) fjerner alle beskyttelsesgrupper, fi 7 (b) omsetter Cys(OH) ellerP (OH ) forbindelsene når slike foreligger, med et diamin, H-A, eventuelt i beskyttet form, og (c) danner et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbindelser med formel I, hvor Q 1 og ? begge er hydrogen, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbindelser med formel I, hvor Q 1 og Q 2 begge er acetamidometyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3, karakterisert ved at man utfører oksydati cyklisering.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at man utfører den med jod som oksyderingsmiddel.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at man utfører den med et ferricyanid som oksyderingsmiddel.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en Cys(OH) g forbindelse med formel I omsettes med H-A i nærvær av et karbodiimid, hvoretter man' eventuelt fjerner alle beskyttelsesgrupper.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man omsetter en Pro(OH) <7> forbindelse med formel I med H-A i nærvær av et karbodiimid, hvoretter man eventuelt fjerner alle beskyttelsesgrupper.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8.ved fremstilling av forbindelser med formel I, hvori A er -NHC^ H^ qNH2 ; Z er Phe, X er D-Tyr(Et) ; Y er Val; P er Pro; og m er 1, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 7 ved fremstilling av forbindelser med formel I, hvori A er -NHC^H-^QNr^; Z er Phe; X er D-Tyr(Et); Y er Val; P er en enkeltbinding, og m er 1, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbindelser med formel I, hvori X er D- eller L-Tyr, eller D- eller L-Tyr(Alk); Z er Phe; Y er Val; P er Pro eller Pro og A er som angitt i krav 1, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1-6 eller 11 ved fremstilling av forbindelser med formel I, hvori A er OH, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbindelser med formel I, hvori X er L-Tyr og Y er Gin, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.