NO850535L - Fremgangsmaate for innkapsling av et kjernemateriale - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen vedrører hovedsakelig innkapsling av kjernematerialer, inkludert levende celler, i et intrakapsulært volum avgrenset av en semipermeabel membran. Mer spesielt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for å produsere store mengder kapsler som har ensartede membraner med forbedret porøsitetskontroll tilpasset til å fremme cellevekst inne i

•kapslene.

US-patent nr. 4 352 883,bevilget 5. oktober 1982, etter søknad av Dr. Franklin Lim, beskriver en grunnfremgangsmåte for innkapsling av kjernematerialer, inkludert levende celler,

i kapsler som har semipermeable membraner. Levende celler innkapslet med Lim-fremgangsmåten er i stand til fortsatt metabol-isme, inkludert mitose, og til å skille ut materialer som de normalt ville skille ut i sin uinnkapslede form. Kapsler, laget med Lim-teknikken kan bli utformet til å ha membraner som er permeable for molekyler under en bestemt molekylvekt, men impermeable for molekyler med høyere molekylvekt og for celler. Man tror at porene i membranene inneholder snirklete veier avgrenset av mellomrommene i membranstrukturen. Gjennomgang av molekyler over en bestemt molekylvekt blir forhindret ved porene i disse snirklete veiene, og over en bestemt høyere molekylvekt og tilsvarende effektiv molekylstørrelse er hindringen til-strekkelig stor til at membranen er impermeabel for disse mole-kylene .

Porøsitetskontroll er en viktig faktor i et stort antall viktige anvendelser av slike mikrokapsler. Mikrokapselmembran-en kan anvendes til differensial-seleksjon, dvs. for å separere molekyler på molekylvektbasis. For eksempel omhandler US-patent nr. 4 409 331, bevilget 11. oktober 1983, en metode hvor stoffer utskilt av cellene i kapselen, kan gå gjennom membranen, mens andre stoffer med høyere molekylvekt blir holdt fanget inne i kapslene. Slike kapsler kan sterkt forenkle oppsamling av et stoff av interesse. Lavmolekylvektstoffer av interesse kan diffundere over membranen inn i det ekstrakapsulære medium, mens cellevekster og stoffer med høyere molekylvekt og forurensende stoffer, for eksempel pyrogener, blir fanget inne i det intrakapsulære volum.

De selektive seleksjonsegenskaper av kapselmembranen tillater også kapslene å anvendes til in vivo krysningsvekst av hybridomer. Kapselmembranene tillater krysningsdannete hybridomer å bli dyrket inne i en kroppshule av et dyr, hvis immun-system normalt ville angripe hybridomene. Skarpsindig utarbeid-ing av membran-permeabilitetsegenskaper tillater oppsamling av høy spesifisitet av det utskilte stoff.

Effektiv membran-permeabilitetskontroll tillater også anvendelse av implanterte kapsler som inneholder celler som utskiller et antigen som immuniserende stoff. Seleksjonsegenskapene av membranen produserer relativt rent antigen som det immuniserende stoff uten behov for noen vidløftig fremgangsmåte for rensing av antistoff, og kan føre til stimulering av en spesifikk antistoffproduksjon.

Kapsler med slike membraner kan også anvendes som del av

en fremgangsmåte for seleksjon av celler. Ekstra-kapsulært medium blir testet for et stoff utskilt gjennom membranen. Kontaminanter som har molekylvekt større enn stoffet, blir

holdt inne i kapselen, og reduserer derved falske positive resultater.

En foretrukket utgave av Lim-innkapslingsmetoden involve-rer dannelsen av formbevarende gelmasser som inneholder materialet som skal innkapsles, fulgt av avsetning av en membran på overflaten av gelmassene. Membranen blir dannet idet stoffer med relativt høy molekylvekt kontakter gelmassene og danner ioniske kryssbindinger med gelen. Lim beskriver at kryssbindende polymerer med lavere molekylvekt trenger videre inn i strukturen av gelmassene og resulterer i en reduksjon av pore-størrelse. Lim beskriver også at varigheten av membrandannelse påvirker porestørrelse. Gitt et par reaktanter, jo lenger den kryssbindende polymerløsning er i kontakt med gelmassen, desto tykkere og mindre permeabel blir membranen.

Mens teknikkene for porøsitetskontroll og membrandannelse beskrevet i Lim-patentet kan danne akseptable membraner, kunne mange av de foregående anvendelser av kapselteknologi forbedres hvis membraner som har forbedret porøsitetskontroll og bedre ensartethet bli produsert. Lim-porøsitetskontrollteknikkene tillater ikke fininnstilling av membranporøsiteten, men setter heller grove differensielle filtreringsgrenser.

I tillegg til forbedret porøsitet er det for kommersielle formål også viktig å være i stand til på en konsekvent måte å produsere mikrokapsler i store antall, som har defekt-frie membraner. I denne henseende har membraner dannet ved Lim-metodene av og til fremstående deler av celler eller har celler festet på kapslene. Lim-metodene kan også produsere kapsler som inneholder åpninger som tillater celler, stoffet av interesse eller uønskede forurensende stoffer å komme ut fra kapselen. Hvis en liten fraksjon av mikrokapslene laget med et spesielt formål for øye, har åpninger i membranen, vil mange av formål-ene og fordelene ved fremgangsmåtene bli borte. Følgelig er modifikasjoner av innkapslingsprosessene som fremmer ensartethet av membraner og unngår tilfeldige membrandefekter, fordelaktige for kommersiell praksis for mange av de foregående fremgangsmåtene .

Følgelig er et mål for denne oppfinnelse å forbedre porøsi-tetskontrollen av mikrokapselmembraner. Et annet mål er å fremme mer ensartet membrandannelse. Et videre mål er å utvikle en fremgangsmåte som tillater dannelse av membraner som optima-liserer cellevekst og utskillelse av stoffer produsert av cellene. Et enda annet mål for oppfinnelsen er å fremme en fremgangsmåte for å produsere permeable kapselmembraner som har mere presise permeabilitetsgrenser og for på en reproduserbar måte å utforme slike grenser. Andre mål og vesentlige momenter ved oppfinnelsen vil vise seg i det følgende.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse utgjør en forbedring av Lim-metoden for innkapsling av et kjernemateriale i et intrakapsulært volum avgrenset av en membran. Praktisering av oppfinnelsen kan gi forbedret ensartethet av membraner og porøsitets-kontroll og kan gjøre kapslene mere egnet for celledyrking.

Som inneholdt i Lim-patentet blir kjernemateriale som er suspendert i en løsning av en vannløselig polyanionisk polymer i stand til å bli geldannet, og den polymere kjernematerial-suspensjon dannet til dråper eller andre adskilte former. Dråpene blir så øyeblikkelig utsatt for en løsning av polyvalente kationer til å produsere bløte, formbevarende, hydratiserte gelmasser. I henhold til denne oppfinnelse blir gelmassene, for formål som blir fremsatt senere, så ekspandert og videre hyd-rert ved kontroll av en vandig løsning som fjerner en del av de polyvalente kationer, f.eks. saltløsning. Deretter blir en membran dannet rundt hver av de ekspanderte gelmasser ved reaksjon mellom anioniske grupper på den polyanioniske polymer-hydrogel og kationiske grupper på en polykationisk polymer som har en molekylvekt fortrinnsvis større enn omtrent 3000 dalton. De foretrukne polyanioniske polymerer er sure polysakkarider, fortrinnsvis alginatsalter. Anvendbare polykationiske kryssbindende polymerer inkluderer proteiner og polypeptider som har mange reaktive nitrogeninneholdende kationiske grupper, f.eks. primære aminer, polyvinylaminer, aminerte polysakkarider, vann-løselige salter av disse og blandinger av disse. Den vanlig foretrukne polykationiske polymer er polylysin. Polyglutamin og polyornitin kan også virke godt. Et membranlag nummer to kan bli dannet rundt det første ved reaksjon med en annen polykationisk polymer. Et hvilket som helst av de nevnte kationiske materialer kan bli anvendt til å danne den andre membranen. Identiteten av reaktanten og molekylvekten av den anvendte polykationiske polymer eller polymerer blir selektert for å bestemme porøsitetskarakteristikaene av kapslene. Det er også blitt oppdaget at ladningstettheten av de anvendte polykationiske polymerer, kan ha en materiell effekt på porøsitetskontrollen.

Kjernematerialet kan være levende celler, slik som gene-tisk modifiserte celler, f.eks. hybridomer, eukaryotiske celler, inkludert dyrevevceller, eller prokaryotiske celler. Fremgangsmåten kan også inkludere et trinn som består i en etterdekking av membranen med en vannløselig polyanionisk polymer, f.eks. alginat, som reagerer med kationiske reststéder på membranen. Gelmassene kan væskedannes igjen etter membrandannelse ved reaksjon med et chelateringsmiddel. Etylenglykol-bis-(3-aminoetyleter)-N,N-tetra-eddiksyre og salter derav (EGTA) er de valgbare chelateringsmidler når kapslene er ment til anvendelse i voksende celler. I dette henseende er det blitt oppdaget at gjendannete væsker med EGTA har en slik virkning at den på en dyktig måte forøker cellulærproduksjonen av biologiske materialer med kapslene sammenlignet med andre chelater slik

som EDTA eller citrat.

Passende valg av reaktanter og reaksjonsbetingelser tillater dannelse av membraner med relativt spesifikk permeabilitet. For eksempel kan membraner utformes til å være helt impermeable for molekyler som har molekylvekt større enn omtrent 150 000 dalton, og derfor helt impermeable for alle vanlige immunoglobuliner. Membranene kan være permeable for molekyler som har en molekylvekt opp til omtrent 500 000 dalton, mens de utelukker passasje av høyere molekylvektmaterialer. Slike kapsler tillater gjennomgang av igG mens IgM tilbakeholdes. Alter-nativt kan membranene utformes til å være permeable for molekyler som har en vekt større enn 500 000 dalton, men er impermeable for celler.

Hvis for eksempel en molekylvekt-avskjæring ved eller under 150 000 dalton søkes, kan en annen membran bli dannet rundt kapslene med en polykationisk polymer som har den samme eller fortrinnsvis en høyere ladningstetthet enn en første polykationisk polymer, f.eks. kan en polylysin-membran bli etterbehand-let ved neddypping i en polyornitin- eller polyvinylaminløsning. Hvis membranen skal være permeabel for molekyler av vekt større enn 500 000 .dalton, kan en kryssbindende polymer med høy molekylvekt slik som et polylysin som har en molekylvekt større enn 200000 dalton, bli anvendt. Praktisering av gelekspansjonstrinnet i henhold til oppfinnelsen forbedrer ensartethet av kapselmembranene på riktig måte og forsterker effektiviteten av porøsi-tetskontroll-metodene.

Beskrivelse

Som bemerket tidligere, tillater den foreliggende oppfinnelse forbedret kontroll av membranporøsitet og fremmer dannelsen av mere uniforme membraner. Oppfinnelsen er basert delvis på den observasjonen at gelmasser som inneholder polyanioniske polymerer, f.eks. alginat, kan bli ekspandert eller kontrahert ved å forandre graden av hydrering av polymeren. Gelmassene inneholder mere enn 98 % vann, og er hovedsakelig bløte, formbevarende baller som har et kryssbundet gelgitter. Det er blitt oppdaget at utvidelse av gelmassene etter geldannelse og før membranavsetning tillater en bedre kontroll av permeabilitets-egenskapene og ensartetheten av membranene. Neddypping av gelmassen i en løsning av monovalente kationer, f.eks. saltvann, en eller flere ganger vil fjerne en del av de kryssbindende polyvalente kationer fra gelen og øke hydratiseringen, og derved ekspandere gelgitteret. En slik behandling resulterer i dannelse av uniformt hydratiserte gelmasser vel egnet for det videre membranavsetningstrinnet. I fravær av en slik behandling varierer gelmassene i størrelse og egenskaper fordi de først dannede masser er blitt neddyppet i gelløsningen lenger enn de sist dannede massene. En annen viktig observasjon er at ekvilibrering av gelmassen med en løsning som inneholder polyvalente kationer slik som en kalsiumkloridløsning, vil kontrahere den geldannede masse. Et videre fenomen som er blitt oppdaget, er at med én gang en membran er blitt dannet rundt en gelmasse, vil neddypping av kapselen i en monovalent kationløsning strekke membranen, og øke porestørrelsen. Disse fenomener koblet sammen med observasjonen at kryssbindende stoffer med høyere ladningstetthet tenderer til å redusere porestørrelse, gjør det mulig å kontrollere membranpermeabiliteten mere nøyaktig. Når disse observasjonene blir koblet sammen med permeabilitetskontroll-metodene beskrevet i det forannevnte Lim-patent, er det til de som er dyktige på området, gitt et sett av parametere som er i stand til å produsere ensartede kapsler med konsistente og mere nøyaktige permeabilitetsegenskaper.

Som beskrevet i Lim-patentet blir kjernematerialet suspendert i en løsning som inneholder en vannløselig, reversibelt geldannende polyanionisk polymer, fortrinnsvis natriumalginat, og polymerkjernemateriale-suspensjonen blir dannet til dråper ved å bruke konvensjonelle midler, f.eks. et jet-hodedråpedannen-de apparat. Jet-hodeapparatet består av en beholder som har en øvre luftinntaksdyse og en forlenget hul del friksjonstilpasset inn i en stopper. En sprøyte, f.eks. en 10 cc sprøyte, utstyrt med en trinnvis pumpe, er montert på toppen av beholderen med en nål, f.eks. en 0,01 inch I.D. teflon-dekket nål, som passe-rer gjennom lengden av beholderen. Det indre av beholderen er utformet slik at toppen av nålen er utsatt for en konstant lami-nær luftstrøm som virker som en luftkniv. I anvendelse blir sprøyten full av løsningen som inneholder materialet som skal bli innkapslet, montert på toppen av beholderen, og den trinn-vise pumpe blir aktivert til trinnvis å tvinge dråper av løsningen til toppen av nålen. Hver dråpe blir kuttet av ved hjelp av luftstrømmen og faller omtrent 2,5-3,5 cm ned i en geldannende løsning, hvor den øyeblikkelig blir geldannet ved absorpsjon av kryssbindende ioner. Den foretrukne geldannende løsning er en kalsiumioneløsning, f.eks. 1,2 % (vekt/volum) kalsiumklorid. Avstanden mellom toppen av nålen og kalsiumklorid-løsningen blir fortrinnsvis satt til å tillate polymerkjernema-terial-løsningen til å anta den mest fysisk fordelaktige form, en kule (maksimum volum/overflateareal). Luft i tuben lekker gjennom en åpning i stopperen. De geldannete, formbevarende sfæroidale masser eller midlertidige kapsler, som fortrinnsvis er mellom 50 mikron og noen få millimeter i diameter, samler seg i løsningen som en separat fase og kan fjernes ved aspirering.

I henhold til oppfinnelsen blir gelmassene så ekspandert ved en eller flere separate immersjoner eller vaskinger i en monovalent kationløsning, f.eks. saltvann. Denne immersjon fjerner en del av de kryssbindende kalsiumioner, og hydrerer videre gelen. Gelmassene utvider seg således til å gi bedre dekning av kjernematerialet, dvs. fastfasekjernematerialet trenger ikke gjennom overflaten av gelmassene. Fastfasekjernematerialet som er festet til det ytre av gelen, blir fjernet ved vasking i saltvann. Derfor blir bare kjernematerialet i det indre av gelen innkapslet.

Vaskingen med saltvann fremmer også mere uniforme kapselmembraner ved ekvilibrering av mengden av kalsiumioner som kryssbinder alginatgitteret av gelmassene. Gelmassene blir ikke alle dannet samtidig; dråpene som kommer ned i kalsiumba-det tidlig i cyklusen, tilbringer lengre tid i badet og beholder derfor flere kalsiumioner i gelstrukturen enn de som kommer sent i cyklusen. Vaskingen med saltvann fjerner flere kalsiumioner fra massene med høyere tetthet (de tidlige geldannete dråper) enn fra gelmassene med mindre tetthet og ekvilibrerer derved kalsiuminnholdet av gelmassene.

Membraner dannet rundt ekspanderte gelmasser har også mindre tendens til rupturering på grunn av spenninger forårsaket av gelnedbrytning. Det viser seg at det ekspanderte gitternett-verk kan ha mere elastisitet som tillater bedre kompensering for gelnedbrytningsspenning.

En membran blir så dannet rundt den ekspanderte geldannete masse ved reaksjon mellom kationiske grupper på den ekspanderte geldannete polyanioniske polymer, og anioniske grupper på en polykationisk polymer, f.eks. polylysin. Den polykationiske polymer kan ha en molekylvekt som er så lav som 3000 dalton,

men polylysin på 35 000 dalton eller høyere molekylvekt er foretrukket. Etter at membranen er dannet rundt de ekspanderte gelmassene blir andre trinn anvendt for å finjustere porøsiteten av membranen. For eksempel vil en rekke vaskinger i saltløsning ekspandere porene i membranen, mens en rekke vaskinger i kalsium-kloridløsning vil kontrahere porene. Et membranlag nummer to kan bli dannet rundt kapslene ved å bruke en tilleggspolykation-isk polymer, f.eks. ved kontakt med en polyornitinløsning eller kontakt med en polymer med høyere ladningstetthet slik som poly-vinylamin. Denne teknikken kan bli anvendt til å minke pore-størrelse.

Som beskrevet i Lim-patentet, blir det intrakapsulære volum fortrinnsvis væskedannet igjen ved neddypping av kapslene i en løsning av et chelateringsmiddel. Chelateringsmidler som er blitt anvendt med hell inkluderer etylendiamin-tetraeddiksyre (EDTA), natriumcitrat, natriumsufecinat og mest foretrukket etylenglykol-bis- (/3-aminoetyleter) -N,N-tetraeddiksyre (EGTA) . Hvis natriumcitrat blir anvendt som det chelaterende stoff, kan åpninger dannes i kapselbanene idet membranene inntar en irregu-lær form som svar på citrattrykket. Membranen går tilbake til sin opprinnelige form når citratet nærmer seg likevekt med det intrakapsulære volum, men hvis kjernematerialet er en levende celle fælsom for citrat, kan cellevekst eller cellenes evne til å produsere biologisk materiale bli svekket. I motsetning viser neddypping av en kapsel i EGTA-løsning seg å gjøre at membranen folder seg innover og forblir i denne forandrete form inntil EGTA er fjernet. Som beskrevet i eksempel 4, infra, viser det seg at celler gror bedre og er metabolsk mere aktive i kapsler behandlet med EGTA i motsetning til citrat eller andre testede chelateringsmidler.

Som beskrevet i Lim-patentet, fjerner etterdekking av kapslene med en løsning av en polyanionisk polymer, f.eks. natriumalginat, kapslenes tendens til å klumpe seg sammen. Den anioniske polymer reagerer med kationiske reststeder på membranen som forårsaker negativ overflatepolaritet. Som kjent i tidligere arbeider innen området, kan negative overflater in-hibere vekst og tilfesting av cellene. Slik vekst kan hindre intrakapsulær cellevekst eller affisere permeabiliteten på en skadelig måte. I tillegg kan neddypping av kapselen i et nøy-traliserende stoff slik som 2-N-cykloheksylaminoetansulfonsyre (CHES) eller en annen zwitterionbuffer redusere reaktiviteten av og forbedre kapselmembranen.

De følgende ikke-begrensende eksempler vil videre illustre-re fremgangsmåtene av oppfinnelsen og deres fordeler.

Eksempel 1

Den følgende fremgangsmåte kan anvendes til å produsere kapsler impermeable for molekyler som har en. molekylvekt større enn omtrent 150 000 dalton. Et hybridom som produserer IgG (molekylvekt omtrent 160 000 dalton) ble anvendt i dette forsøk.

Omtrent 2,1 liter av en suspensjon som inneholdt omtrent

2,2 x 10 celler/ml i 1 % (vekt/volum) natriumalginat (NaG-Kelco LV) ble overført til et jet-hodeapparat, som tidligere beskrevet, og dråper ble dannet ved å tvinge suspensjonen gjennom seksten nåler med målnummer 22 i en hastighet på omtrent 50 ml/ minutt. Dråpene falt omtrent 3 cm ned i 5 liter 1,2 % (vekt/volum) kalsiumkloridløsning, og dannet gelmasser som ble oppsam-let ved aspirering og overført til en 10 liters kolbe som inneholdt omtrent 5 liter isotont saltvann for gelekspansjon. Salt-vannet ble fjernet og etterfylt to ganger. Totalt tok salt-vannsekspansjonen omtrent 11 minutter. Deretter ble en membran dannet rundt gelmassene ved kontakt med 5 liter av en 750 mg/l poly-L-lysin (Sigma Chemical Company, 6 5 000 dalton molekylvekt) i isoton saltvannsløsning. Etter 12 minutters reaksjon ble de resulterende kapsler vasket i 10 minutter med 5 liter av en 1,4 g/l løsning av CHES-buffer (Sigma) som inneholdt 0,2 %

(vekt/volum) kalsiumklorid i saltvann. Kapslene ble vasket i omtrent 8 minutter med 5 liter 0,3 % (vekt/volum) kalsiumklorid i saltvann, en membran nummer to ble dannet rundt kapslene ved en 10 minuters reaksjon i 5 liter av et 150 mg/l polyvinyl-amin (Polyscience, 50 000 - 150 000 dalton molekylvekt) i saltvann. Kapslene ble vasket igjen med to 5 liters volumer av isotont saltvann, over 7 minutter og etterdekket med en 7 minutters neddypping i 5 liter 5 x 10 _2% (volum/vekt) NaG i salt-

løsning. Kapslene ble vasket i ytterligere 4 minutter i 5 liter saltvann, så ble de intrakapsulære volumer gjendannet til væske med to neddyppinger i 5 liters volumer av 55 mM natriumcitrat i saltløsning, den første i 10 minutter og den andre i 6 minutter. Som beskrevet i eksempel 4, infra, ville en erstat-ning av natriumcitratløsningen med en EGTA-løsning forbedre antistoff-utbyttet. Kapslene ble vasket to ganger i 5 liter saltvann og vasket én gang i 4 minutter i RPMI-medium. Kapslene ble så tillatt å vokse i vekstmedium, RPMI pluss 10 % fetalt kalveserum. IgG samler seg inne i kapslene og bare spormengder kan bli påvist i det ekstrakapsulære medium. Kapsler fremstilt i henhold til denne fremgangsmåte er følgelig impermeable for IgG, men tillater fri gjennomgang av nødvendige næringsstoffer, og tillater derved cellevekst og antistoff-produksjon i det intrakapsulære volum.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer en fremgangsmåte for å danne kapsler som er pemeable for IgG (molekylvekt omtrent 160 000 dalton) men er impermeable for igM (molekylvekt omtrent 900 000 dalton). Cellen som ble anvendt, var et human-human-hybridom 77 fra National Institute of Health som produserer og utskiller human IgM.

400 ml av en løsning som inneholdt 1 x 10 celler /ml i

1 % NaG (vekt/volum) ble dannet til dråper ved å bruke en bundt av åtte nåler med nålnummer 22 i et jet-hodeapparat som tidligere beskrevet. Tilføringshastigheten var omtrent 30 ml/minutt og avstanden fra spissen av nålen til gelløsningen, 1 liter 1,2 % (vekt/volum) kalsiumklorid, var omtrent 3 cm. Gelmassene ble vasket tre ganger med 1 liters volumer av isotont saltvann over en periode på 8 minutter og nedsenket i 10 minutter i 1 liter 750 mg/ml poly-L-lysin (Sigma, 65 000 dalton molekylvekt) til å danne en permanent membran. De resulterende kapsler ble vasket i 5 minutter i 1 liter 1,4 g/l CHES som inneholdt 0,2 % (volum/vekt) kalsiumklorid i saltvann, derpå vasket i 5 minutter med 1 liter 0,3 % (volum/vekt) kalsiumklorid i saltløsning. Kapslene ble ekspandert i 4 minutter med 1 liter

-2 saltvann, så etterdekket i 7 minutter i 1 liter 3 x 10 %

(vekt/volum) NaG i saltvann. De etterdekkede kapsler ble vasket

i 5 minutter i 1 liter saltløsning, så ble de intrakapsulære volumer gjendannet til væske ved to neddykkinger på 6 minutter i 1 liter 55 mM natriumcitrat i saltløsning. Citratet ble fjernet ved to vaskinger med saltvann, 1 liter hver, og de resulterende kapsler ble vasket i 5 minutter i RPMI-medium. Kapslene ble så suspendert i 1 liter medium (RPMI pluss 20 % fetalt kalveserum og antibiotika), og cellene deri ble tillatt å vokse. Det ble tatt prøve av det ekstrakapsulære medium. Ved assay

ble det bestemt at det ekstrakapsulære medium ikke inneholdt noe IgM, hvilket viser at kapslene var impermeable for molekyler som hadde molekylvekt på 900 000 dalton.

Eksempel 3

Dette eksempel beskriver en fremgangsmåte for å danne kapsler som er permeable for IgM(molekylvekt omtrent 900 000 dalton) men impermeable for celler. 200 ml av en 1 % (vekt/volum) løsning av NaG (Kelco LV) og hybridom-cellene av eksempel 2 ble dannet til dråper gjennom fem nåler med målnummer 26 i et jet-hodeapparat som tidligere beskrevet. De resulterende dråpene falt omtrent 2,5 cm ned i den geldannende løsning, 1 liter 1,2 %

(vekt/volum) kalsiumklorid, i en hastighet på 9,5 ml/m. De resulterende geldannende masser ble ekspandert ved tre neddyppinger i 0,5 liters volumer av saltvann og en permanent membran ble dannet ved en 10 minutters reaksjon med 0,5 liter av 1 g/l poly-L-lysin (Sigma, gjennomsnittsmolekylvekt omtrent 260 000 dalton). Kapslene ble vasket i 5 minutter i 0,5 liter av en 1,4 g/l CHES-saltløsning som inneholdt 0,6 % (vekt/volum) kalsiumklorid og i et tillegg på 5 minutter i 0,5 liter 0,8 % (vekt/volum) kalsiumklorid i saltløsning. Kapslene ble så vasket én gang i 0,5 liter saltvann og etterdekket med 0,5 liter 0,03 % (vekt/ volum) NaG. De etterdekkede kapsler ble vasket i 5 minutter i 0,5 liter saltvann, og det intrakapsulære volum ble gjendannet til væske ved to 5 minutters vaskinger, 0,5 liter hver, med 55 mM natriumcitrat. Kapslene ble vasket én gang i saltvann,

én gang i basalmedium og suspendert i basalmedium som inneholdt

20 % fetalt kalveserum pluss antibiotika. IgM ble funnet å

gå gjennom kapselmembranen, men celler ble tilbakeholdt hvilket viste at membranen er permeabel for molekyler med molekylvekt på minst 900 000,men er impermeabel for celler.

Eksempel 4

Dette eksempel demonstrerer at den metabolske aktivitet

av innkapslede celler kan bli sterkt forøket ved passende seleksjon av chelateringsmidlet anvendt til å gjendanne det intrakapsulære volum til væske. Fire forskjellige chelateringsmidler ble testet: EDTA, EGTA, natriumcitrat og natriumsucsinat, idet man brukte innkapslet IgG-produserende Li8-hybridom som testsystem. Kapslene ble laget ved å følge fremgangsmåten fremsatt i eksempel 1, med unntak av at natriumcitrat i eksempel 1 ble erstattet av konsentrasjonene av chelateringsmidlene satt opp nedenfor.

Tabell 1 viser at EGTA er det beste chelateringsmiddel for cellevekst og resulterer i forbedret antistoffproduksjon sammenlignet med citrat med en faktor på omtrent 2.

De gjenværende opplysninger i tabell 1 illustrerer forsøk for å bestemme optimums EGTA-konsentrasjon for gelnedbryting og antistoffdannelse. Som det fremgår av data viser det seg at 36 mM og 55 mM konsentrasjoner av EGTA er omtrent likeverdige i å fremme antistoffdannelse, mens lavere konsentrasjoner avEGTA gir lavere antistoffkonsentrasjoner på tross av at de har noenlunne identisk cellevekst.

Eksempel 5

Dette eksempel illustrerer virkningen av anvendelse av multiple vaskinger i saltvann for å ekspandere gelmassene før membrandannelse. Den samme fremgangsmåte for kapseldannelse og hybridom som beskrevet i eksempel 1 ble anvendt bortsett fra at antall vaskinger i saltvann utført før membrandannelse ble modi-fisert. Etter kapseldannelse ble de innkapslede hybridomer dyrket i 20 dager i kulturmediet, og det totale celletall og intrakapsulær antistoffkonsentrasjon ble målt. Tabell 1 gir resul-tatene av dette forsøk.

Som det kan sees fra dataene inneholdt i tabell 1 produ-serte 2 eller 3 vaskinger i saltvann det høyeste celletall og den høyeste intrakapsulære antistoffkonsentrasjon. Mere spesi-fikt, etter 3 vaskinger med saltvann før membrandannelse vokste det i kulturen omtrent 50 % mere celler og det ble produsert nesten dobbelt av den intrakapsulære antistoffkonsentrasjonen i forhold til kulturen som ikke ble vasket i saltvann. Dette for-søk illustrerer at vasking med saltvann før membrandannelse forbedrer kapslene slik at de innkapslede hybridomer er friskere og produserer mer antistoff.

Fra det foregående vil det vise seg at i lys av dette inn-holdet vil de som er dyktige på området være i stand til å utforme spesifikke innkapslingsmetoder som konsekvent vil produsere enhetlige kapselmembraner som har permeabilitetsegenskaper skreddersydde til spesifikke anvendelser ved å bruke empiriske fremgangsmåter. Således, ved skarpsindig utnyttelse av inn-kapslingsparameterne beskrevet her, kan fagmannen på, området produsere kapsler som vil tillate fri transport igjennom membranen av molekyler opp til en selektert molekylvekt, tillate forhindret transport av molekyler i et område over den vekt-en, og utelukke gjennomgang av molekyler av en molekylvekt og beslektede effektive molekyldimensjoner over det området.

Med en gang fremgangsmåten er blitt utviklet kan den bli prak-tisert til å produsere så mange kapsler som ønsket for det øns-kede formål.

I utforming av en fremgangsmåte til å fremstille kapsler med en spesifikk permeabilitetsoppførsel bør det følgende bli anvendt som generelle veiledende prinsipper. Gel-ekspansjonstrinnet forbedrer ensartetheten av kapselmembranene og øker effektiviteten av porøsitetskontrollteknikkene. Økning i ladningstetthet av den polykationiske membran som danner polymerer, produserer generelt mindre porer. Økning i molekylvekt av den polykationiske polymer produserer generelt større porer og tyn-nere membraner. Økning i varigheten av kontakten med den polykationiske polymer med gelmassene produserer en tykkere, mindre permeabel membran. Avsetningen av en annen polykationisk polymer over den første reduserer porestørrelsen. Utryddelse av gelen ved hydrering etter membrandannelse øker porøsiteten og kontraksjon minker porøsiteten. Når man utformer kapsler for implantering, er en etterdekking med en polyanionisk polymer ønskelig, og fysiologisk uforenlige membrandannende materialer som forårsaker inflammasjon eller fibroblastisk overvekst bør unngås. Når man utformer kapsler for celledyrking, er gjendannelse til væske ønskelig og blir best utført ved å bruke EGTA.

Følgelig kan oppfinnelsen utformes i andre spesifikke former uten å fjerne seg fra dennes mål, og alle de foregående utgaver bør betraktes som illustrative. Andre utgaver er innen de følgende krav.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte for innkapsling av et kjernemateriale i et intrakapsulært volum avgrenset av en permeabel membran, idet nevnte fremgangsmåte er tilpasset til å forbedre membran-enes ensartethet og porøsitetskontroll, karakterisert ved følgende trinn: A. geldanning av en vannlø selig polyanionisk polymer som inneholder et kjernemateriale med en vandig lø sning som innbefatter polyvalente kationer til å danne hydratiserte, atskilte, formbevarende geldannete masser; B. ekspandering av de nevnte geldannete masser med en vandig løsning som fjerner en del av de nevnte polyvalente kationer og videre hydratiserer de nevnte geldannede masser; C. å danne en membran rundt nevnte ekspanderte geldannete masser for å danne kapsler ved reaksjon mellom anioniske grupper på nevnte polyanioniske polymer og kationiske grupper på en polykationisk polymer som har en molekylvekt større enn 3000 dalton.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved følgende tilleggstrinn: etterdekking av membranen dannet i trinn C med en vann-løselig polyanionisk polymer ved reaksjon med kationiske reststeder på nevnte membran.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved følgende tilleggstrinn: gjendanning til væske av nevnte gelmasse etter membrandannelse .

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte væskedannende trinn innbefatter å bringe kapslene i kontakt med et chelateringsmiddel.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at chelateringsmidlet omfatter etylenglykol-bis-(/3-aminoetyleter)-N,N-tetraeddiksyre eller et salt derav.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved følgende tilleggstrinn: dannelse av et membranlag nummer to rundt membranen dannet i trinn C ved reaksjon med en annen polykationisk polymer.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6 , karakterisert ved at den innbefatter følgende tilleggstrinn: etterdekking av nevnte membran med en vannløselig polyanionisk polymer ved reaksjon med kationiske reststeder på minst én av nevnte polykationiske polymerer.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved følgende tilleggstrinn: gjendannelse til væske av nevnte gelmasser etter membrandannelse .

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at det væskedannende trinn innbefatter å bringe nevnte kapsler i kontakt med et chelateringsmiddel.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at chelateringsmidlet er etylenglykol-bis-(/3-aminoetyleter) -N ,N-tetra-eddiksyre eller et salt av denne.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den polyanioniske polymer er valgt fra en gruppe som består av sure polysakkarider.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11, karakterisert ved at det sure polysakkarid er et alginatsalt.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte polykationiske polymer er valgt fra en gruppe som består av proteiner som inneholder mange reaktive nitrogeninneholdende kationiske grupper, polypeptider som inneholder mange reaktive nitrogeninneholdende kationiske grupper, polyvinylaminer, aminerte polysakkarider, salter av disse og blandinger derav.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at den polykationiske polymer er valgt fra en gruppe bestående av polylysin, polyglutamin og polyornitin.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakte- r i s e r t ved at den andre polykationiske polymer er valgt fra en gruppe som består av proteiner som inneholder mange reaktive nitrogeninneholdende kationiske grupper, polypeptider som omfatter mange reaktive nitrogen-inneholdende kationiske grupper, polyvinylaminer, polyetylenaminer, aminerte polysakkarider, blandinger av disse og salter av disse.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert ved at den andre polykationiske polymer er valgt fra en gruppe bestående av polylysin, polyglutamin og polyornitin.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det i trinn B anvendes en vandig løsning som omfatter monovalente kationer.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at det i trinn B anvendes en vandig løsning som omfatter saltvann.