NO851160L - Fremgangsmaate for fremstilling av cyklosporiner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et cyklosporin, hvor aminosyreresten i 8-stillingen er en (D)-acyloksy-a-aminosyrerest, og fremgangsmåten erkarakterisert vedat enten a) et cyklosporin, hvori aminosyreresten i 8-stillingen er en (D)-hydroksy-a-aminosyrerest,

acyleres eller

b) et cyklosporin, hvori aminosyreresten i 1-stillingen er -MeBmt- og resten i 8-stillingen

er en (D)-acyloksy-a-aminosyrerest, reduseres, hvorved man erholder det tilsvarende cyklosporin hvori resten i 1-stillingen er -dihydro-MeBmt-.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Formålet for den foreliggende oppfinnelse er således fremstilling av nye cyklosporiner med terapeutiske egenskaper.

Som cyklosporiner betegnes en rekke av strukturelt egenartede cykliske poly-N-metylerte undekapeptider som vanligvis fremviser farmakologiske virkninger, spesielt immunsuppressive, betennelseshemmende og antiparasitære virkninger. Det først isolerte cyklosporin, og også stam-forbindelsen av denne rekke, er den naturlige sopp-metabolitt cyklosporin med formel A,

hvori -MeBmt- betyr resten N-metyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-metyl-(L)treonyl med formel B.

hVori -x-y- står for -CH=CH- (trans).

Siden den opprinnelige oppdagelse av cyklosporin A ble tallrike naturlige cyklosporiner isolert og identifisert og

■det ble fremstilt ytterligere cyklosporiner som ikke ■.forekommer i naturen ved totalsyntese eller halvsyntese ..eller også fremstilt ved modifiserte dyrkningsmetoder. Av denne vgrunn har cyklosporin-rekken fått øket betydning og inneholder nå f.eks. de naturlige cyklosporiner A til Z ■ (ser. Kobel. et al., European Jorunal of applied Microbiology 1 and Biotechnology 14, 237 - 240 (1982) og den artikkel som ble,presentert avTraber et al., 24. Interschience ..Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, (8. - 10.10.1984),), videre forskjellige .cyklosporiner av ikke naturlig opprinnelse, inneholdende dihydrocyklospriner (hvori -x-y-gruppen i -MeBmt-resten - se. den foregående formel B-er mettet, f.eks. som beskrevet

i US patentskrifter nr. 4.108.985, 4.210.581 og 4.220.641), cyklosporiner hvori -MeBmt-resten foreligger i isomerisert eller N-demetylert form (se europeisk patentskrift nr. 0.034.567 og "Cyclosporin A", Proe. Internat. Conference on Cyclosporin A, Cambridge (U.K.), september 1981, utgiver D.J.G. White, Elsevier Press (1982) - som begge inneholder den av R. Wenger utviklede totalsyntetiske fremstillings-metode for cyklosporiner ) og cyklosporiner hvori forskjellige aminosyrer ble innebygget på bestemte steder i peptidsekvensen (se europeisk patentskrift nr. 0.056.782). Som eksempler på cyklosporiner beskrevet i den ovennevnte litteratur kan f.eks. nevnes: [Thr] 2 -, [Val] 2 -, [Nva] 2- og [Nva] 2 -[Nva] 5-cyklosporin (også kjent som cyklosporin C, D, G henhv. M), [dihydro-MeBmt] 1 -[Val] 2-cyklosporin (også kjent som dihydro-cyklosporin D) og [(D)Ser] g- og [dihydro-1 8

MeBmt] -[(D)Ser] -cyklosporin.

Etter nå vanlig anvendt nomenklatur for cyklosporiner betegnes disse i den foreliggende fremstilling og krav med hensyn til cyklosporin A. Dette skjer ved at man først angir den del av molekylet som avviker fra delene i cyklosporin A og deretter ved angivelse av ordet "Cyklosporin" karakteriserer de øvrige deler som tilsvarer delene i cyklosporin A. For dette anvendes uttrykket dihydro-MeBmt-for betegnelse av den ovennevnte rest med formel B, hvori

-x-y- står for -CH9-CH„. Således betegnes med [dihydro-MeBmt] 1 -[Val] 2-cyklosporin det cyklosporin som fremviser sekvensen i henhold til formel A, men hvori -MeBmt- formel B, -x-y- = -CH=CH- (trans) i stilling 1 er erstattet med -dihydro -MeBmt-[formel B, -x-y- = -Cf^Cf^] og -aAbu- i stilling 2 er erstattet med -Val-. På lignende måte betegnes med [(D)Ser] g-cyklosporin det cyklosporin med sekvens i henhold til formel A, men hvori -(D)Ala- i 8-stillingen er erstattet med -(D)Ser-.

Videre og i henhold til vanlig praksis fremviser aminosyrene som er definert ved forkortelsene, f.eks.-Ala- , -MeVal-osv., (L)-konfigurasjon, i den utstrekning ikke annet er

angitt. Rester med forstavelsen "Me" som f.eks. i

-MeLeu- er N-metylerte rester. De forskjellige rester av cyklosporiner-molekylet nummereres som i litteraturen, dvs. i retning med urviserne og ved å gå ut fra -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-resten i 1-stillingen. I den foreliggende beskrivelse og i kravene anvendes hele tiden den samme tallsekvens.

Den erkjennelse som ligger til grunn for den foreliggende oppfinnelse er at man kan fremstille nye cyklosporiner med farmasøytisk anvendelse hvori resten i 8-stillingen består av en acyloksy-a-aminosyre med (D)-konfigurasjon.

Følgelig vedrører den foreliggende oppfinnelse fremstilling av et cyklosporin hvori aminosyreresten i 8-stillingen er en (D)-acyloksy-a-aminosyrerest, dvs. resten av en aminosyre av (D)-rekken, hvori sidekjeden på a-karbonatomet er substituert med acyloksy.

Foretrukket er aminosyre-resten i 8-stillingen en

(D)-3-acyloksy-a-aminosyrerest, dvs. en rest av en aminosyre av (D)-rekken med en acyloksy-gruppe som er bundet til

aminosyren over 3-karbonatomet.

Foretrukne (D)-3-acyloksy-a-aminosyrerester tilsvarer formel II

hvori

R betyr hydrogen, alkyl med 1 til 4 karbonatomer eller fenyl og

R2står for hydrogen eller metyl.

Spesielt foretrukne cyklosporiner som fremstilles ved den foreliggende oppfinnelse er dem hvori aminosyreresten i 8-stillingen er en 0-acyl-(D)-seryl- eller 0-acyl-(D)-treonylrest, spesielt en 0-acyl-(D)-seryl- eller 0-åcyl-(D)-treonylrest med den ovennevnte formel II.

I en gruppe av de ved oppfinnelsen fremstillbare

■• ,^c<*>ykl"dsp6riner er aminosyreresten i 8-stillingen en

>0-a'cyl-(D)'-serylrest, spesielt en 0-acyl-(D)-serylrest,

hvori acyl-gruppen tilsvarer formelen R^-CO-, hvori R^har den ovennevnte betydning.

• 1 eri ytterligere gruppe av ved oppfinnelsen fremstillbare '] 'cyklosporiner er aminosyreresten i 8-stillingen en

(D)_-3-acyloksy-a-aminosyrerest, spesielt en 0-acyl-(D)-seryl-; rest, spesielt en D -acyl-(D)-serylrest, hvori acyl-gruppen

' '" tilsvarer formelen R^-CO, hvori R.^ står for hydrogen eller

■.alkyl. med 1 til 4 karbonatomer og resten i 5-stillingen er

v én (L) -npr.valylrest.

'-V'He-i't;\.fpr.e^tirukne cyklosporiner er dem med formel I

.'- hvori

'y• ■ ••

, X ' betyr. ^MéBmt-: eller -dihydro-MeBmt,

Y Betyr -aAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- eller -Nva-,

Z'-Betyr■-Vai-.-"'eller -Nva- og

;; Qrbetyr<$n■ i. déjtv f oregående definert rest med formel II.

I formel I er Q foretrukket en 0-acyl-(D)-seryl- eller 0-acyl-(D)-threonylrest, hvori acyl-gruppen tilsvarer formelen R^-CO-, hvori R^har den ovennevnte betydning. Y står foretrukket for -aAbu-, -Thr-, -Val- eller -Nva-.

En gruppe av ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner utgjør gruppen med formel I hvori Y betyr -aAbu- eller

-Nva-, Z betyr -Val- og R2betyr hydrogen.

En ytterligere gruppe av ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner utgjør gruppen med formel I hvori Y betyr -aAbu- eller -Nva-, Z betyr -Nva-, R^ betyr hydrogen eller alkyl med 1 til 4 karbonatomer og R2betyr hydrogen.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av et cyklosporin hvori aminosyreresten i 8-stillingen er en (D)-acyloksy- -aminosyrerest, f.eks. en

(D)-3-acyloksy-a-aminosyrerest, f.eks. for fremstilling av , et cyklosporin med formel I, og denne fremgangsmåte er

karakterisertenten ved at

a) et cyklosporin, hvori aminosyreresten i 8-stillingen er en (D)-hydroksy-a-aminosyrerest, f.eks. en

(D)-3-hydroksy-a-aminosyrerest, acyleres, f.eks. ved at et cyklosporin med formel III

: hvori X, Y og Z har den ovennevnte betydning og W står 'for en rest med formel IV

hvori R2har den ovennevnte betydning, acyleres idet en R^-CO-gruppe hvori R^har den ovennevnte betydning innføres i 3-stillingen, eller

b) at et cyklosporin, hvori aminosyreresten i 1-stillingen er -MeBmt- og resten i 8-stillingen er

en (D)-acyloksy-a-aminosyrerest, f.eks. en

(D)-3-acyloksy-a-aminosyrerest, reduseres, hvorved man erholder det tilsvarende cyklosporin hvori resten

i 1-stillingen er dihydro-MeBmt-, f.eks. ved at et cyklosporin med formel I, hvori X står for -MeBmt-, reduseres, hvorved man erholder det tilsvarende cyklosporin, hvori X betyr dihydr-MeBmt-.

Fremgangsmåten a) kan gjennomføres etter i og for seg kjente

metoder for acylering av hydroksy-grupper, f.eks. ved

omsetning med foretrukket to ekvivalenter eller, hvis Y =-Thr-,

en ekvivalent av et egnet acyl, f.eks. (C1_5)alkanoyl- eller

benzyl-halogenid, eller tilsvarende anhydrid eller, for fqfmylering, ved omsetning med f.eks. eddiksyre, maursyre-.anhydrid, ved en temperatur av f.eks. ca. -10 til 5 0°C.

Omsetningen skjer under vannfri betingelser, hensiktsmessig i et, under peaksjonsbetingelsene inert løsningsmiddel som metylenklorid og i nærvær av et kondensasjonsmiddel som ,.. f. eks?. -. 4;-,dimetyl-amino-pyridin. Under disse betingelser foregår acyleringen på hydrogry-gruppen av aminosyreresten i 8-stillingen snarere enn på på hydroksy-gruppen av aminosyre-resten i 1-stillingen.

Fremgangsmåten b) kan gjennomføres på måte i og for seg kjent for reduksjon av naturlige cyklosporiner til de tilsvarende dihydrocyklosporiner, f.eks. ved katalytisk hydrogenering, f.eks. etter de i det engelske patentskrift nr. 1.567.201 beskrevne generelle metoder.

Hydrogeneringen foregår hensiktsmessig i det nøytrale området, ved temperaturer mellom omtrent 20 og 30°C og under atmosfæretrykk eller svakt forhøyet trykk. Som hydrogeneringskatalysator egner seg f.eks. platinaoksyd eller palladiumkatalysatorer, f.eks. palladium på kull. Hydrogeneringen kan f.eks. gjennomføres i et under reaksjonsbetingelsene inert løsningsmiddel som metylacetat eller en lavere alifatisk alkanol som metanol eller isopropanol.

Cyklosporiner med en 3-hydroksy-\/-aminosyrerest i 8-stillingen, spesielt [(D)Ser] g-cyklosporiner og [dihydro-MeBmt] 1 -[(D)Ser] 8-cyklosporiner som egner seg som utgangsprodukter for fremgangsmåten a) er f.eks. kjent fra det ovennevnte europeiske patentskrift nr. 0.056.782, hvori likeledes fremgangsmåter for deres fremstilling er beskrevet. Ytterligere som utgangsprodukter for fremgangsmåten a) egnede cyklosporiner med en hydroksy-a-aminosyrerest i 8-stillingen kan fremstilles på analog måte eller etter de i det europeiske patentskrift nr. 0.034.567 (som det er vist til i offentliggjøring 0.056.782) beskrevne generelle metoder for cyklosporin totalsyntese eller kan også fremstilles etter de i det etterfølgende, spesielt i eksemplene beskrevne metoder.

Cyklosporinene som er egnet som utgangsforbindelser for fremgangsmåten b) kan fremstilles etter den under a)

angitte metode.

Selv om utgangsforbindelsene med den ovenstående formel III, som er beskrevet spesifikt i de etterfølgende eksempler, faller under det vide omfang av det ovennevnte europeiske patentskrift nr. 0.056.782, er visse av utgangsforbindelsene formelt nye, dvs. at de ikke hittil er blitt spesifikt beskrevet. I oppfinnelsens sammenheng ble det nå også

funnet at disse cyklosporiner fremviser et ganske spesielt interessant eller fordelaktig virkningsspektrum, spesielt med hensyn til deres immunsuppressive virkning, og ganske - spesielt med hensyn til hemming av de med transplantasjoner, f.eks. organtransplantasjoner, forbundne uønskede virkninger

(avstøtning), f.eks. i sammenligning med de kjent cyklosporiner med formel III, dvs. med de cyklosporiner med formel III som er spesifikt beskrevet i det europeiske patentskrift nr. 0.056.782.

Følgelig vedrører den foreliggende oppfinnelse ved et ytterligere aspekt en fremgangsmåte for fremstilling av et cyklosporin med formel Illa-,

hvori

Y' betyr - Abu-, -Thr-, -Val- eller -Nva-,

Z' betyr -Val- eller hvis Y' betyr - Abu- eller -Nva-,

står for -Nva-,

W' betyr -(D)Ser- eller, hvis y' betyr - Abu- og Z' betyr

-Val-, står for:(D).Thr-, og

X' betyr -MeBmt- eller, hvis Y' betyr -Thr-, -Val- eller \-Nva-, Z' betyr -Val- ogW' betyr - (D) Ser-, står i :. •. ■-dihydro-MeBmt- .

Spesifikke cyklosporiner med formel Illa er:

a) [(D)Thr] g<->cyklosporin

b) [Thr]2-[ (D)Ser]8-cyklosporin

1 2 8

c) [Dihydro-MebMt] -[Thr] -[(D)Ser] -cyklosporin

2 8

d) [ Val] -[(D)Ser] -cyklosporin

12 8

e) [ Dihydro-MeBmt] -[Val] [(D)Ser] -cyklosporin

f) i[ Nva] 5 -[f('D)Ser] 8-cyklosporin .

12 8

g) [Dihydro-MeBmt] -[Nva] -[(D)Ser] -cyklosporin

h) [ Nva] 5 -[(D)Ser] 8-cyklosporin og

2 5 8

i [ Nva] -[Nva] -[(D)Ser] -cyklosporin

Av de ovennevnte cyklosporiner er forbindelsen a), b), e) ,

f) og i), spesielt a), f) og i), med hensyn til deres virkning og virkningsspektrum, f.eks. deres immumsuppressive

virkning, av spesiell interesse, f.eks. i sammenligning med de i det eutropeiske patentskrift nr. 0.056.782 spesifikt beskrevne cyklosporiner.

Fremgangsmåten for fremstilling av et av de ovenfor definerte cyklosporiner med formel Illa erkarakterisertved at man enten

e)' i et i 0-beskyttet form foreliggende, ovenfor definert cyklosporin med formel III avspalter

beskyttelses-gruppen, eller

d) at man ringslutter et rettkjedet undekapeptid inneholdende sekvensen

hvori Y', Z', W' og X' har den ovennevnte betydning, • hvorved undekapeptidet kan foreligge i ubeskyttet eller 0-beskyttet form og om nødvendig avspalter beskyttelses-gruppen, eller e) at man for fremstilling av et cyklosporin med formel Illa ,

hvori

Y' betyr -Thr-, -Val- eller -Nva,

Z' betyr -Val- eller hvis Y' betyr -Nva-, står for

-Nva-,

W'betyr -(D)Ser- og

X' betyr -MeBmt-,

dyrker en [Thr] 2 -cyklosporin,[Val] 2-cyklosporin, [Nva] 2 -cyklosporin eller [Nva] 2 -[Nva] 5-cyklosporin-produserende soppstamme i nærvær av et (D)-Serin-holdig næringsmedium og isolerer cyklosporinet med formel Illa fra den erholdte dyrkingsvæske, eller f) At man for fremstilling av et cyklosporin med formel Illa, hvori X' betyr -dihydro-MeMmt-,

reduserer det tilsvarende cyklosporin med formel Illa hvori X' betyr -MeBmt-.

Undekapeptider for anvendelse ved fremgangsmåten d) kan fremstilles analogt med de i det ovennevnte europeiske patentskrift nr. 0.056.782 generelle metoder, f.eks. med hensyn til skjemaet i eksempel la i dette patentskrift, idet peptidsekvensen bestående av restene 8 til 11 i cyklosporin-molekylet kombineres med sekvensen bestående av restene 1 til 7, med den nødvendige substitusjon av restene i 2-stillingen og/eller 5-stillingen og/eller 8-stillingen. -(D)Ser- eller -(D)Thr-resten i 8-stillingen er hensiktsmessig i 0-beskyttet form, f.eks. i form av 0-t-butyl-derivatet. Ringslutningen gjennomføres under anvendelse av de i det nevnte europeiske patentskrift spesielle metoder, med etterfølgende avspaltning av O-beskyttelses-gruppene, om nødvendig fremgangsmåte c) etter de innen peptidkjemien i og for seg kjente metoder.

Den foretrukne stamme for anvendelse ved fremgangsmåten e) er stammen NRRL 8044 av soppslekten Tolypocladium inflatum (Gams). En kultur av denne ble deponert i United States

Department of Agriculture (Northern Research and

Development Division), Peoria, 111., USA og står til forføyning for offentligheten. En annen kultur derav ble deponert ved Fermentation Research Linstitue, Inage,

Chiba City, Japan under kulturnummer FRI FERM-P nr. 2 796.

De morfologiske trekk av denn stamme, som ble tilordnet soppslekten Trichoderme polysporum (Link ex Pers.) såvel som metoder for fremstilling og oppnåelse av for- og etter-kulturer, er utførlig beskrevet i litteraturen, f.eks. i det engelske patentskrift nr. 1.491.509.

Etter fremgangsmåte e) dyrkes den utvalgte stamme, f.eks. slekten Tolypocladium inflatum (Gams), hensiktsmessig i omtrent 2 uker i et næringsmedium som beskrevet i de etterfølgende eksempler og i nærvær av tilsatt (D)- eller (D,L)-serin ved 27°C. Aminosyreforløperen tilsettes hensiktsmessig en mengde på ca. 1 til ca. 15 g, foretrukket ca. 4 til ca. 10 g/liter dyrkingsmedium. Hensiktsmessig inneholder dyrkingsmediet likeledes tilsatt aminosyreforløper for resten i 2-stillingen av det ønskede cyklosporin, f.eks. i mengder på ca. 6,0 til ca. 10,0, foretrukket ca. 8,0 g/l dyrkingsmedium. Etter inkubasjonstiden utvinnes det erholdte cyklosporin med formel Illa etter i og for seg kjente metoder fra dyrkingsvæsken, f.eks. ved separering av væsken i mycel og dyrkingsfiltrat, ekstraksjon av mycelet under homogenisering og frasentrifugering av cellematerialet.

Det erholdte rå cyklosporin kan renses f.eks. 'kromatografisk og/eller ved omkrystallisering. Derved fjernes spesielt de ytterligere cyklosporiner, spesielt de naturlige cyklosporiner .

Fremgangsmåten f) kan f.eks. gjennomføres ved at man anvender de under b) beskrevne metoder.

De etterfølgende eksempler illustrerer utførelsen av oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Syntese av [ ( O- acetyl)-( D) Ser3 - cyklosporin [ formel I:

X = - MeBmt-, Y = - otAbuu, Z = - Val-, Q = - 0- acetyl- ( D) Ser- ] :

20 mg 4-dimetylaminopyridin tilføyes til 47 mg [(D)Ser] Q-cyklosporin (fremstilt i overensstemmelse med den i eksempel 1 eller 3 av det ovennevnte europeiske patentskrift nr. 0.056.782 beskrevne metode) oppløst i 3 ml metylenklorid. Deretter tilføyes 6,1 mg nydestillert acetylklorid i 1 ml metylenklorid og den erholdte reaksjonsblanding omrøres i 1 time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen fortynnes med 50 ml metylenklorid og rystes med 30 ml vann. Den organiske fase fraskilles, tørkes over natriumsulfat, frafiltreres og inndampes. Resten filtreres på 60 g silikagel (0,062 -

0,20 mm) hvorved metylenklorid/5% metanol anvendes som elueringsmiddel og samles i 25 ml fraksjoner. Den i overskriften nevnte forbindelse utvinnes ved hjelp av tynnskiktkromatografering under anvendelse av CHCl3/5% metanol som bærefase fra fraksjonene 4 til 8.

[a]^°= -202° (c = 0,92 i CHCl3).

EKSEMPEL 2

Analogt med eksempel 1 fremstilles de følgende forbindelser ved å gå ut fra tilsvarende ikke-acylert cyklosporin:

2.1 [ (0-benzoyl-(D)Ser] g-cyklosporin [formel I:

X=-MeBmt-, Y=-cxAbu-, Z=-Val-, Q=-0-benzoyl- (D) Ser-}: [a]<20>= -219° (c = 1,0 iCHC13).

2.2 [0-acetyl-(D)Thr] g-cyklosporin [formel 1:

X= -MeBmt-, Y= - Abu-, Z= -Val-, Q= -0-acetyl-(D)Ser-]: [a]<20>= -219° (c - 1,0 i CHC13). 2.3 [Nva 2 - 0-acetyl-(D)Ser] 8-cyklosporin [formel 1: X= -MeBmt, Y= -Nva-, Z= -Val-, Q= -0-acetyl-(D)Ser-]: [a]p° = -240° (c= 1,0 i CHCl3/-233° (c= 0,8 iCHC13/-177° (c= 0,76 i CH30H): Smp. = 143-147°C.

2.4 [Val 2 - 0-acetyl-(D)Ser] 8-cyklosporin [formell:

X= -MeBmt, Y= -Val-, Z= -Val-, Q= -0-acetyl-(D)Ser-]: [a]<20>= -219° (c= 0,9 i CHCl3). 2.5 [Nva] 5 -[0-acetyl-(D)Ser] 8-cyklosporin [formel I: X= -MeBmt-, Y= -aAbu-, Z= -Nva-, Q= -0-acetyl-(D)Ser-]:

[a]p° = -215° (c = 1,0 i CHC13).

2.6 [Nva 2 - Nva] 5 -[0-acetyl-(D)Ser] 8-cyklosporin [formel I: X= -MeBmt-, Y= -Nva, Z= -Nva-, Q= -0-acetyl-(D)Ser-]:

[a]<20>= -196,9° (c = 1,0 i CHCl3), og

2 8

2.7 [Thr] -[0-acetyl-(D)Ser] -cyklosporin [formel I: X= -MeBmt-, Y=-Thr-, Z=-Val-, Q=-0-acetyl-(D)Ser-]: [a]<20>= -251° (c = 0,86 i CHCl3)/-174° (c = 0,81 i CH3OH).: Smp. 143 - 146°C.

EKSEMPEL 3

./^ yjrLe, s;é^. ayJ[ Dihydro- MeBmt]^-[ 0- acety1-( D) Ser] 8- C, yk1osporin

; [ FormeV- 1: X = - dihydro- MeBmt-, Y = - aAbu-, Z = - Val-, Q =

- 0- acetyl-( D) Ser-] :

54 mg ,.(0-.acétyl) - (D) Ser -cyklosporin i 10 ml etanol ''.hyarpgéneres, unaer.anvendelse av 10 mg palladium/dyrekull . (••10%). ved romtemperatur og normaltrykk. Etter 20 timer

.filtreres den erholdte reaksjonsløsning gjennom et tynt

' .talgskikt og etanblen avdampes i vakuum. Etter ytterligere

-ptø^ki-ng i ^héy-yaXu-urt erholdes den i overskriften nevnte f of bindélsé. '••

EKSEMPEL 4

De følgende forbindelser fremstilles, enten analogt med eksempel 1, ved å gå ut fra tilsvarende ikke-acylert cyklosporin eller analogt med eksempel 3, ved hydrogenering av det tilsvarende i eksempel 2 beskrevne cyklosporin:

4.1 [Dihydro-MeBmt]<l->[Nva]<2->[0-acetyl-(D)Ser]<8->Cyklosporin

[Formel I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Val-, Q =

-0-acetyl-(D)Ser-]: Smp. = 139 - 141<*>C; [a]20 = - 225 °

(c = 0,88 in CHCI3)/- 163<0>(c = 0,76 in CH3OH);

4.2 [Dihydro-MeBmt]l-[Va1]2-[0-acetyl-(D)Ser]<8->Cyk1osporin

[Formel I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Val-, Z = -Val-, Q =

-0-acetyl-(D)Ser-]: [a]<20>= - 210 (c = 0,85 in CHCI3); und

4.3 [Dihydro-MeBmt]<l->[Thr]2-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyklosporin

. [Formel I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Thr-, Z = -Val-, Q =

-0-acetyl-(D)Ser-]: [o]20 = - 241<0>(c = 1,0 in CHC13)/

- 162<0>(c = 1,0 in CH3OH): Smp. = 148 - 150<0>C.

Fremstilling av utgangsmaterial:

EKSEMPEL 5

De følgende for fremstilling av forbindelsene i eksemplene 2.2 til 2.7 nødvendige utgangsforbindelser fremstilles analogt med den kjente forbindelse [(D)Ser] -cyklosporin. Fremstilling av den sistnevnte er beskrevet i eksempel 1 i det europeiske patentskrift nr. 0.056.782, med substitusjon av de tilsvarende rester i 2-stillingen og/eller 5-stillingen og/eller 8-stillingen i fremgangsmåtesekvensen, som oppført i reaksjonsskjemaet for eksempel la i det nevnte patentskrift.

I 5.1 [(D)Thr]8-Cyklosporin [Formel Ula: X' = -MeBmt-, Y' -aAbu-, V - -Val-, W - -(D)Thr-]: [a]20 = -248,7 ' (c

1,0 in CHCI3);

5.2 [Nva]2-[(D)Ser]8-Cyklosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-,

Y' = -Nva-, V = -Val-, W = -(D)Ser-]: Smp. = 150 -

153 ° C; [a]20 = - 262<0>(c = 0,71 in CHC13)/- 191<0>(c =

0,73 in CH3OH);

5.3 [Val]<2->[(D)Ser38-Cyklosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-,

Y' = -Val-, V = -Val-, W = -(D)Ser-]: [a]20 = -257<0>(c =

1,0 in CHCI3)/- 255<0>(c = 0,45 in CHCI3)/- 189 ° (c 0,42 in CH3OH): Smp. = 136 - 140<0>C.

5.4 [Nva]5-[(D)Ser]8-Cyklosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-,

Y1 = -aAbu-, V = -Nva-, W = -(D)Ser-]: [a]20 -212<0>

(c = 1,0 in.CHCl3);

5.5 [Nva]2-[Nva]5-[(D)Ser]8-Cyklosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -Nva-, V = -Nva-, W = -(D)Ser-H: [a]<2>0 =

-217 0 (c = 1,0 in CHCI3); und

5.6 [Thr]2-[(D)Ser]8-Cyklosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-,

I- V = -Thr-, V = -Val-, W = -(D)Ser-]: [a]20 = - 258<0>(c 0,39 in CHCI3)/- 178<0>(c = 0,40 in CH3OH): Smp. = 147 - 152<0>C.

6

Forbindelsen 1 eksempel 5.2 kan fremstilles mikrobiologisk på^annen måte som-vfølger:-a) 10 liter av et næringsmedium inneholdende 5,0 g maltose, 5 g (DL)-Norvalin, 8 g (D)-Serin, 0,75 g

KH2P04, 0,5 g MgS04.7H20; 0,1 CaCl2.6H20 og 8 g k asempepton pr. liter ble podet med 1 liter av en konodie- og mycel-suspensjon av soppstammen NRRL 8044 som ble tatt ut fra en 3 døgn gammel forkultur. Det podede produksjonsmedium ble fylt i 100 ml porsjoner i 100 ERlenmeyer-kolber som ble inkubert i 14 døgn ved 27°C på en rundrystemaskin med 180 omdr. pr. min. Mycelet ble separert fra dyrkingsmediet og ble ekstrahert ved knusing i en "Turrax"-mølle og omrøring med 3x3 liter 90% metanol. Det knuste mycel ble separert fra løsningsmidlet ved sugefiltrering og de samlede filtrater konsentrert ved inndamping i vakuum ved en temperatur på 40°C, inntil dampen hovedsakelig besto av vann. Den erholdte blanding ble ekstrahert 4 ganger under anvendelse av 0,5 liter 1,2-dikloretan ved hver ekstråksjon. De samlede 1,2-dikloretan-løsninger ble konsentrert ved inndamping under vakuum ved en temperatur på 40°C.

Den erholdte rest ble underkastet en gelfiltrering på "Sephadex LH-20" (1,4 kg; Pharmacia) med metanol og deretter samlet i 280 ml fraksjoner. Fraksjonene 9-11, inneholdende av en cyklosporinblanding, ble samlet og separert ved hjelp av silikagel-kolonne-kromatografering (1 kg silikagel, kornstørrelse

0,063 - 0,2 mm, "Merck") under anvendelse av med vann mettet etylacetat som elueringsmiddel (fraksjoner på 500 ml). I overensstemmelse med deres polaritet ble først [Nva 2]- cyklosporin (fraksjoner 7-9)

eluert, etterfulgt av en blanding inneholdende [Nva 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin og cyklosporin.

Separeringen av [Nva 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin og cyklosporin skjer ved hjelp av silikagel-kromatografering (280 g, "Merck", 0,63 - 0,2 mm) under anvendelse av kloroform/metanol (98:2) som elueringsmiddel (fraksjoner på 100 ml). Fraksjonene 2 8 20 - 30, inneholdende rått [Nva ]-[(D)Ser ]-cyklosporin ble renset ytterligere ved trykk-kromatografering på en faseomvendt silikagelkolonne ("Merck" LiChropep RP 18, 260 g, kornstørrelse 0,04 - 0,063 mm) under anvendelse av metanol/vann (85:15) som elueringsmiddel og samlet i 25 ml fraksjoner. De samlede fraksjoner 45 - 55 gir rent [Nva 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin som amorft hvitt pulver.

Den for den ovennevnte fremgangsmåte nødvendige forkultur kan erholdes som følger: b) Den for podingen anvendte spore- og mycel-suspensjon, fremstilt fra en kultur av den opprinnelig isolerte stamme NRRL 8044, ble dyrket i 21 døgn ved 27°C på følgende agarmedium: 20 g maltekstrakt, 20 g agar, 4 g gjærekstrakt pr. liter avmineralisert vann. Sporene fra denne kultur ble opptatt i en fysiologisk koksalt-løsning, hvorved en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 spore/ml erholdes. 10 ml av denne suspensjon

anvendes for podingen av 1 liter av en nærings-løsning med den samme sammensetning som dyrkingsmediet i eksempel 6a, med unntagelse av serin- og (DL)-Norvalin-komponentene. Forkulturen skjer i 3 døgn ved 27°C på en rundrystemaskin (200 omdr. pr. min.). Denne kultur anvendes for poding av produksjonskulturen. [Nva 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin kan fremstilles i gjæringsbeholderen som følger:

c) Ca.10 9 sporer av en skrå agar-kultur av stammen

NRRL 8044 ble innført i en rustfri stålgjærings-beholder inneholdende 20 liter av et forkulturmedium med følgende sammensetning:

Først foretas sterilisering i 20 min. ved 120°C. Gunstige inkubasjonsbetingelser er en temperatur på 27°C, en lufttakt på 16 liter pr. min. ved et overtrykk på 0,5 bar og et omdreiningstall på

200 omdr. pr. min.

Den forkultur som utvikles dyrkes i 6 døgn og

15 liter innføres deretter i en rustfri stål-gjæringsbeholder inneholdende 300 liter av et produksjonsmedium med følgende sammensetning:

Først skjer sterilisering i 20 min. ved 120°C. Kulturen holdes ved en temperatur på 27°C, luftes

med en lufttakt på 120 liter luft pr. min., ved et overtrykk på 0,5 bar og omrøres ved et omdreiningstall på 70 omdr. pr. min. Skumkontrollen gjennomføres ved tilsetning av en silikonemulsjon.

Etter dyrkingen i 14 døgn avkjøles kulturen, som fremviser et totalt volum på 275 liter til 10°C og mycelet fjernes under anvendelse av en Westfalia-separator. Filtratet ekstraheres ved 2 gangers omrøring med etylacetat. Ekstraktene vaskes med litt vann, forenes og tørkes i vakuum. Mycelet tilsettes metanol, homogeniseres og filtreres. Denne ekstraksjon gjentas to ganger under anvendelse av 90% metanol. De metanoliske ekstrakter forenes og konsentreres i vakuum under tilsetning av vann. Det resterende vandige konsentrat ekstraheres to ganger med etylacetat, ekstraktene vaskes med litt vann, forenes og konsentreres i vakuum. Den ekstraherte vandige fase ekstraheres ytterligere to ganger med etylacetat/isopropanol (8:2). Disse ekstrakter samles og inndampes på nytt i vakuum.

Mycel- og filtrat-ekstraktene filtreres under anvendelse av 50 ganger mengden av "Sephadex LH-20" med metanol som elueringsmiddel. Spissfraksjonene renses deretter kromatografisk hvorved det anvendes 100 ganger mengden av silikagel 60 (kornstørrelse = 0,04 - 0,063 mm) og med vann mettet etylacetat som elueringsmiddel. Først elueres [Nva 2]-cyklosporin etterfulgt av cyklosporin og [Nva 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin. Disse senere fraksjoner underkastes en ytterligere kromatografisk rensing hvorved 140 ganger mengden av silikagel 60 (kornstørrelse 0,063 - 0,20 mm) og kloroform/metanol (98:2) anvendes som elueringsmiddel. Det erholdes rent [Nva 2 ]-[(D)Ser 83-cyklosporin.

EKSEMPEL 7

Forbindelsen fra eksempel 5.3 kan også fremstilles mikrobiologisk idet man går frem analogt med eksempel 6a, dog med følgende endringer: a) I næringsmediet erstattes (DL)-Norvalin med 10 g (L)-Valin. Etter separering av mycelet fra

dyrkingsmediet ekstraheres som følger:

Det rå mycel separeres fra løsningsmidlet ved sugefiltrering og de samlede filtrater konsentreres under tilsetning av vann ved avdamping i vakuum ved en temperatur på 40°C inntil dampen hovedsakelig består av vann. Den erholdte blanding ekstraheres tre ganger under anvendelse av 5 liter etylacetat ved hver ekstraksjon. De samlede etylacetatløsninger konsentreres ved inndamping under vakuum ved en

temperatur på 40°C.

Den erholdte rest underkastes en gelfiltrering på "Sephadex LH-20" (1,4 kg; Pharmacia) med metanol.

De fraksjoner som inneholder en cyklosporin-blanding forenes og separeres så ved hjelp av silikagel-kolonnekromatografering (3 kg silikagel, kornstørrelse 0,020 - 0,045 mm, "Grace") under anvendelse av med vann mettet etylacetat som elueringsmiddel. I overensstemmelse med deres polaritet elueres først [Val 2]-cyklosporin, etterfulgt av en blanding inneholdende [Val 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin som hoved-komponent. Den ytterligere rensing av [Val 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin skjer ved hjelp av silikagel-kromatografering (80 g, "Grace", 0,020 - 0,0045 mm) under anvendelse av aceton/heksan (1:1) som elueringsmiddel. De fraksjoner som inneholder rått [Val 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin renses videre ved trykk-kromatografering på en fase omvendt silikagelkolonne ("Merck" LiChropep PR 18, 160 g, korn-størrelse 0,04 - 0,063 mm) under anvendelse av metanol/vann (80:20) som elueringsmiddel, idet rent [Val 2 ]-[(D)Ser 8]- cyklosporin erholdes som amorft hvitt pulver. b) Den nødvendige forkultur erholdes som i eksempel 6b). [Val 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin kan fremstilles på gjæringsbeholderplaten, idet man går frem analogt med eksempel 6c) dog med følgende endringer: c) I sammensetningen av produksj onsmediet erstattes . 0. (DL)-Norvalin med 10 g (L)-Valin. Etter tilsetning av metanol til mycelet, homogeniseringen og filtreringen (2 gager med 90% metanol) går man frem på følgende måte: De metanoliske ekstrakter renses og konsentreres under tilsetning av vann i vakuum. Det resterende vandige konsentrat ekstraheres tre ganger med etylacetat, ekstraktene vaskes med litt vann, forenes og inndampes i vakuum.

Mycelet og filtratekstraktene filtreres, hvorved

50 ganger mengden av "Sephadex LH-20" med metanol som

elueringsmiddel anvendes. Spissfraksjonene renses deretter kromatografisk hvorved 40 ganger mengden av "Silicagel 60" (kornstørrelse = 0,04 - 0,063 mm) og med vann mettet etylacetat anvendes som elueringsmiddel. Først elueres [Val 2]-cyklosporin, etterfulgt av cyklosporin og[Val 2 ]- [(D)Ser 8]-cyklosporin. Disse senere fraksjoner underkastes en ytterligere kromatografisk rensing, hvorved 100 ganger mengden av 'Silikagel 60" og aceton/heksan (1:1) anvendes og en trykk-kromatografering på faseomvendt silikagel "Merck" LiChropep RP 18, kornstørrelse 0,04 - 0,063 mm) under anvendelse av metanol/vann (80:20) som elueringsmiddel, hvorved rent [Val 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin erholdes.

EKSEMPEL 8

Forbindelsen i eksempel 5, 6 kan også fremstilles mikrobiologisk, idet man går frem analogt med eksempel 6a), men med følgende endringer: a) I næringsmediet erstattes (DL)-Norvalin med 5 g (L)-Threonin. Etter inkubasjonen ekstraheres som

følger:

Mycelet separeres fra dyrkingsmediet og ekstraheres i en "Turrax"-mølle ved knusing og omrøring med 3x9 liter 90% metanol. Det knuste mycel separeres fra løsningsmidlet ved sugefiltrering og de samlede filtrater konsentreres under tilsetning av vann ved inndamping under vakuum ved en temperatur på 40°C inntil dampen hovedsakelig består av vann. Den erholdte blanding ekstraheres tre ganger under anvendelse av 5 liter etylacetat ved hver eks tråksjon. De samlede etylacetatløsninger konsentreres ved inndamping under vakuum ved en temperatur på 40°C.

Den erholdte rest underkastes en gelfiltrering på "Sephadex LH-20" (2 kg; Pharmacia) med metanol. Fraksjonene inneholdende en cyklosporin-blanding samles og separeres så ved hjelp av silikagel-kolonnekromatografering (2 kg silikagel, kornstørrelse 0,02 - 0,045 mm, "Grace") under anvendelse av med vann mettet etylacetat som elueringsmiddel. I overensstemmelse med deres polaritet elueres først cyklosporin, deretter [(D)Ser g]-cyklosporin etterfulgt av

2 2 8 [Thr ]-cyklosporin og til slutt [Thr ]-[(D)Ser ]-cyklosporin i rå form. Den ytterligere rensing av [Thr 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin skjer ved hjelp av silikagel-kromatografering (50 g; "Grace", 0,02 - 0,45 mm) under anvendelse av aceton/heksan (2:1) som elueringsmiddel, hvorved rent [Thr 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin erholdes som amorft hvitt pulver. b) Den nødvendige forkultur erholdes som i eksempel 6b). [Thr 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin kan fremstilles på gjæringsbeholderplaten, idet man går frem analogt med eksempel 6c), dog med følgende endringer: c) I sammensetningen av produksjonsmediet erstattes (DL)-Norvalin med 5 g (L)-Threonin. Etter inkubasjon og fjernelse av mycelet under anvendelse av Westfalia-separatorer går man frem på følgende måte: Mycelet tilsettes metanol, homogeniseres og filtreres. Denne ekstraksjon gjentas to ganger under anvendelse av 90% metanol. De metanoliske ekstrakter

slås sammen og konsentreres under vakuum under tilsetning av vann. Det resterende vandige konsentrat ekstraheres to ganger med metylacetat, ekstrakten vaskes med litt vann, forenes og konsentreres i vakuum.

Mycelekstraktene filtreres, hvorved 50 ganger mengden av "Sephadex LH-20" med metanol anvendes som elueringsmiddel. Spissfraksjonene renses deretter kromatografisk, hvorved 30 ganger mengden av silikagel 60 (kornstørrelse = 0,04 - 0,063 mm) og med vann mettet etylacetat anvendes som elueringsmiddel. Først elueres cyklosporin, deretter [(D)Ser g]-cyklosporin etterfulgt av [Thr ~ 2]-cyklosporin og til slutt [Thr 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin. Disse senere fraksjoner underkastes en ytterligere kromatografisk rensing, hvorved 250 ganger mengde av silikagel 60 (kornstørrelse 0,02 - 0,045 mm) og aceton/heksan (2:1) anvendes som elueringsmiddel. Det erholdes rent [Thr 2 ]-[(D)Ser 8]-cyklosporin.

EKSEMPEL 9

Følgende forbindelser, som kan anvendes som utgangsmaterial for fremstilling av de i eksemplene 4.1 til 4.3 oppførte forbindelser, kan fremstilles fra de i eksemplene 5 til 7 angitte cyklosporiner, idet man går frem analogt med eksempel 3.

9.1 [Dihydro-MeBmt]l-[Nva]2-[(D)Ser]8-Cyklosporin [Formel Illa:

X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Nva-, V = -Val-, W = -(Q)Ser-]

- hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.2 oder 6:

[a]20 = - 251 (c = 1,23 in CHC13)/- 179<0>(c = 1,16 in CH3OH): Smp. = 155 - 157<0>C.

9.2 [Dihydro-MeBmt]<l->[Val]<2_>[(D)Ser]<8->Cyklosporin [Formel Illa:

X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Val-, V = -Val-, W = -(D)Ser-]

- hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.3 oder 7:

[a]20 = - 224<0>(c = 1,0 in CHCI3). 9.3 [Dihydro-MeBmt]l-[Thr]2-[(D)Ser]8-Cyklpsporin [Formel Illa: X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Thr-, V = -Val-, W = -(D)Ser-] - hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.6 oder 8: [a]<20>= - 262<0>(c = 0,73 in CHC13)/- 173 ° (c = 0,79 in CH3OH): Smp. = 156 - 158<0>C. •.py^los^prinérie, hvori aminosyreresten i 8-stillingen er vieft ^IX^^léyi^Ksy-a-aminosyrerest, som definert og beskrevet i det forégåeride, i det følgende betegnet som ved p^påinnelsen Æremstillbare cyklosporiner, har som det '.' £' fåffcg& r ?av.'de etterfølgende testmetoder, farmakologisk

. aktivitet.

1 i':■ Immunosuppressive virkninger:

1.1 Lokal hemolyse in vitro i Gel (R.I. Mishell og : r. R:. W.\, Dutton, , J.- .Exp:*, Medicine, 126, 423 - 442 ,(1976)).

De ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner hemmer hemolysesoner i sammenligning med ubehandlede kontroller i konsentrasjoner fra 0,01 til 10,0 ^lg/rnl.

1.2 Lymfocytt-simulasjonstest etter Janossy og Greaves (Clin. Exp. Immunol., 9, 483 (1971) og 10, 525

(1972)): De ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner hemmer den ved Concanavalin A stimulerte DNA-syntese (hemming av H 3-Thymidin-innbygningen), celle-formering og plastogenese ved musemiltceller i sammenligning med ubehandlede kontroller i konsentrasjoner fra 0,001 til 10,0 ug/ml.

1.3 Blandet lymfocyttreaksjon (Bach et al., J. Exp.

Med. 136, 1430 (1972)) : Reaksjonen (dvs. formering og differensiering) av lymfocytter (mus (Balb/c) miltceller) ved Co-inkubasjon i 5 døgn med allogeniske miltceller av bestrålte mus (CBA ff ) måles i nærvær og i fravær av testsubstansen. Reaksjonen i fravær uttrykkes i den prosentvise endring av reaksjonen, sammenlignet med 100% for kontrollreaksjonen. Ved anvendelse av de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner iakttas en hemming av reaksjonen ved en konsentrasjon på 0,001 til 10,0 |jg/ml.

1.4 Undertrykkelse av organ-avstøtning:

Nyrer av Geber-rotter (F 344,£ ) transplanteres i mottager-rotter (Wistar-Furth, £> ). Test-substansen tilføres mottager-rottene i 14 døgn. Deretter avbrytes behandlingen. 7 døgn etter transplantasjonen underkastes testdyrene en bilateral nephrectomie. Da levedyktigheten av testdyrene avhenger av akseptering og funksjonering av det overførte organ tjener forhøyelsen av overlevelsestiden, sammenlignet med overlevelsestiden for kontrolldyrene, som bare mottar Placebo, som parameter for virkningen av testsubstansen. Dyr som inneholder de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner, fremviser ved dose på 2,5 til 10 mg/kg p.o. en overlevelsestid på 60 til 250 døgn, sammenlignet med ubehandlede kontroller som alle som følge av organavstøtning dør i løpet av ca. 9 til 10 døgn.

2. Betennelseshemmende virkning

Den betennelseshemmende virkning kan vises med Adjuvans-Arthritis-testen i rotter. Ved denne test induseres Adjuvans-Arthritis etter metoden til Pearson og Wood, "Arthr. Rheum." 2, 440 (1959). De ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner viser seg ved denne test som virksomme ved Arthritis som utvikler seg og ved etablert Arthritis i doser på 10 til 30 mg/kg/døgn p.o.

3. Antiparasitær virkning

Anti-malaria-test etter L. Rane, "Chemotherapie and Drug Resistance in Malaria" utgitt av W. Peters, Academic Press, New York, 1970. Mus (OF1: hanmus) infiseres ved dag 0 med 0,2 ml av en suspensjon

_7

inneholdende 10 parasittiske celler av slekten Plasmodium berghei (Stamm NK 65). Tilførselen skjer i.p. på den 3. dag med testsubstansen ved foranderlige doser under anvendelse av 5 til 10 mus pr. dose tilført s.c. Overlevelsestiden bestemmes og den minimale effektive dose (MED) beregnes ved sammenligning av overlevelsestiden med tilsvarende for ubehandlede kontrolldyr. Ved kontrolldyrene utgjør overlevelsestiden ca. 7 døgn. MED er den dosering hvor overlevelsestiden er doblet. De ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner viser seg ved denne test som virksomme i doser på 25 til 100 mg/kg/døgn, s.c.

På grunn av deres immunosuppressive virkning kan de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner anvendes for profylakse og behandling av tilstander og sykdommer som

nødvendiggjør en nedsettelse av immunoresponsen. Således kan de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner finne anvendelse ved undertrykkelse av formering av lymfocytter og immunocytter, således f.eks. ved behandling av

autoimmunsykdommer, for forhindring av vevavstøtning ved transplantasjoner, f.eks. ved hud, lunge, hjerte, hjerte-lunge, benmarg, nyrer, milt og horhud-transplantasjoner. Spesifikke autoimmunsykdommer, hvor de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner kan finne anvendelse, er sådanne hvor cyklosporin A allerede er foreslått eller tidligere anvendt for behandling, f.eks. aplastiske anemier, "ren røde blodlegeme-anemi", idiopatisk trombocyttopeni, systemisk lupus erythematode, poly-chondritis, sklerodermie, Wegener-granulomatose, kronisk aktiv hepatitt, myasthenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson syndrom, idiopatisk hals, Morbus Chron, Graves

Opthalmapathie, Sarcoidose, multiple Sklerose, primær billiær Zirrhose, primær juvenil diabetes, Uveitis posterior, interstitiell lungefibrose og psoriasis arthritis.

På grunn av deres betennelseshemmende virkning kan de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner finne anvendelse ved behandling av betennelsestilstander, spesielt betennelsestilstander med en aetiologi som inneslutter en autoimmun-komponent, f.eks. behandling av arthritis og reumatiske sykdommer som artritis chronica progrediens.

På grunn av deres anti-parasittære virkning kan de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner finne anvendelse som anti-parasittære legemidler, f.eks. for behandling av parasittære infeksjoner av forskjellig type, spesielt ved protozoer som også trematode- og nematode-infeksjoner. Spesifikke typer av parasittære infeksjoner, hvor de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner kan finne anvendelse, er dem hvor behandling med cyklosporiner er allerede foreslått i litteraturen, f.eks. Schistomosomiasis, Filariasis, Leishmania, Coccidioido-mycose og spesielt malaria.

For den ovennevnte indikasjoner ligger den daglige dose

ved omtrent 75 til omtrent 5.000, foretrukket ved omtrent 2.000, ganske foretrukket ved omtrent 1.500 mg. Ved anvendelse av en enhetsdose, f.eks. for oral tilførsel,

er en dose på omtrent 25 til omtrent 2.500, foretrukket omtrent 1.000, helt foretrukket omtrent 800 mg av et ved oppfinnelsen fremstillbart cyklosporin egnet, blandet med et farmasøytisk tålbart fortynningsmiddel eller bærer.

De ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner kan

tilføres på hvilken som helst konvensjonell måte, spesielt i overensstemmelse med vanlige metoder ved tilførsel av cyklosporin A, spesielt ved intravenøs infusjon, f.eks. i tilfellet av en organ-transplantasjon, før og med en gang etter transplantasjonen, og også ved opptreden av en

gastrointestinal forstyrrelse, som ellers kunne forringe absorbsjonen eller oralt, f.eks. i form av en oral løsning.

Som tidligere nevnt er også cyklosporinene med formel Illa nye. I tillegg til deres anvendelse som mellomprodukt viser de også en farmakologisk virkning og/eller profil, spesielt i forhold til den immunosuppressive aktivitet og spesielt i forhold til deres anvendelse ved forhindring av transplantatavstøtning. Dette gjør den spesielt interessant i forhold til andre cyklosporiner som spesifikt åpenbart i europeisk patentskrift nr. 0.056.782. Den farmakologiske virkning av cyklosporiner med formel Illa kan f.eks. vises ved de ovenfor beskrevne testmetoder 1.1, 1.2, 1.3, 2 eller 3. Cyklosporinene med formel Illa er i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse aktive: I test 1.1 ved konsentrasjoner fra 0,01 til 10fag/ml; i test 1.2 ved konsentrasjoner fra 0,001 til 10 ug/ml; i test 1.3 ved konsentrasjoner fra 0,001 til 10 ug/ml; i test 2 i doser fra 10 til 30 mg/kg/døgn p.o., og i test 3 i doser fra 50 til 100 mg/kg/døgn s.c.

I betraktning av deres immunosuppressive virkning er cyklosporinene med formel Illa nyttige for profylakse og behandling av sykdommer og tilstander som krever en reduksjon av immunresponsen, f.eks. for undertrykkelse av formering av lymfozytter og immunozytter, f.eks. ved behandling av autoimmunsykdommer, f.eks. ved behandling av spesifikke autoimmunsykdommer som oppført i det foregående i sammenheng med anvendelsen av de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner eller ved forebyggelse av transplantatavstøtning, f.eks. ved de i det foregående nevnte forskjellige spesifikke områder i sammenheng med anvendelsen av de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner.

Med hensyn til deres betennelseshemmende virkning er cyklosporiner med formel Illa også nyttige for behandling av betennelsestilstander, spesielt av betennelsestilstander med en etiologi omfattende eller innesluttende en auto-immunkomponent, f.eks. for behandling av Arthritis og reumatiske sykdommer som polyarthritis chronica progrediens.

Med hensyn til deres antiparasittære virkning er cyklosporiner med formel Illa også nyttige som antiparasittære midler, f.eks. for behandling av parasittære infeksjoner av forskjellige typer, spesielt som beskrevet i det foregående i sammenheng ved anvendelse av de ved oppfinnelsen fremstillbare cyklosporiner.

For de ovennevnte indikasjoner utgjør den daglige dose

i området fra omtrent 75 til omtrent 5.000 mg og ved anvendelse av en enhetsdose, f.eks. for oral tilførsel, er en dose på omtrent 25 til omtrent 2.500 mg cyklosporin med formel Illa egnet, blandet med et farmasøytisk tålbart fortynningsmiddel eller bærer.

Cyklosporinene med formel Illa kan tilføres på hvilken som helst konvensjonell måte, spesielt i overensstemmelse med vanlige metoder ved tilførsel av cyklosporin, spesielt ved intravenøs infusjon, f.eks. i tilfellet av en organ-transplantasjon, før og umiddelbart etter transplantasjonen, som også ved opptreden av en gastrointestonal forstyrrelse, som ellers kunne forstyrre absorbsjonen eller oralt, f.eks. i form av en oral løsning.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et cyklosporin, hvori aminosyreresten i 8-stillingen er en (D)-acyloksy-a-aminosyrerest , karakterisert ved at enten a) et cyklosporin, hvori aminosyreresten i 8-stillingen er en (D)-hydroksy-a-aminosyrerest, acyleres, eller b) at et cyklosporin, hvori aminosyreresten i u 1-stillingen er -MeBmt- og resten i 8-stillingen er en (D)-acyloksyd-a-aminosyrerest, reduseres, hvormed man erholder det tilsvarende cyklosporin hvori resten i 1-stillingen er dihydro-MeBmt..

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et cyklosporin med formel 1,

i hvori X betyr -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-, Y betyr -aAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z betyr -Val- eller -Nva- og ' Q betyr en rest med formel II

hvori betyr hydrogen, alkyl med 1 til 4 karbonatomer eller fenyl, og R2'.står for hydrogen eller metyl, karakterisert ved at entena) et cyklosporin med formel III,

hvori. ■ X betyr -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-, Y betyr -aAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z betyr -Val- eller -Nva- og W står for en rest med formel IV

hvori R2 betyr hydrogen eller metyl, acyleres idet en R^ CO-gruppe, hvori R1 betyr ^hydrogen, alkyl med 1 til 4 karbonatomer eller .fenyl, innføres i 3-stillingen, eller b) at et cyklosporin med formel 1, hvori X står for -MeBmt-, reduseres, hvorved man erholder det tilsvarende cyklosporin hvori X betyr -dihydro-MeBmt-.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av et cyklosporin med formel I Ha

hvori . Y' betyr —Abu-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z'- betyr -Val- eller hvis Y' betyr -aAbu- eller -Nva-, står for -Nva-, ■ W' .betyr -(D)Ser- eller hvis Y' betyr -aAbu- eller Z' -Val-, står for -(D)Thr-, og --X •••betyr -MeBmt- eller, hvis Y' betyr -Thr-, -Val- eller -Nva-, /-Z' betyr -Val og W' betyr -(D)Ser-, står for -dihydro-MeBmt, karakterisert ved at ■;c) i et i .O-beskyttet form foreliggende cyklosporin ti:'}',"med. formel- III som angitt i krav 2 avspaltes •r- : beskyttelses-gruppen, eller~d) et ret,tkje4et undekapeptid inneholdende sekvensen

hvori - Y' bet <y> r -aAbu-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z' betyr -Val- eller hvis Y' betyr -aAbu- eller -Nva-, står for' -Nva-, „ W' betyr -(D)Ser- eller hvis Y' betyr -aAbu- og Z' -Val-, står for -(D)Thr-, og X' betyr -MeBmt- eller hvis Y' betyr -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z' betyr -Val- og W' betyr -(D)Ser-, står for -dihydro-MeBmt, ringsluttes hvorved undekapeptidet kan foreligge i ubeskyttet eller 0-beskyttet form, o om nødvendig avspaltes beskyttelses-gruppen, eller e) at man for fremstilling av et cyklosporin med formel Illa, hvori Y' betyr -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z' betyr -Val- eller hvis Y' betyr -Nva-, står for -Nva-, W' betyr -(D)Ser- og X' betyr -MeBmt-, dyrker en [Thr] 2 -cyklosporin, [Val] 2-cyklosporin, [Nva] 2 -cyklosporin eller [Nva] 2 -[Nva] 5-cyklosporin-produserende soppstamme i nærvær av et (D)-Serin-holdig næringsmedium og isolerer cyklosporinet med formel Illa fra den erholdte dyrkingsvæske, eller f) at man for fremstilling av et cyklosporin med formel Illa, hvori X' betyr -dihydro-MeBmt-, reduserer det tilsvarende cyklosporin med formel Illa, hvori X'betyr -MeBmt-.